CN105112448B - Stch基因敲除动物模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及STCH基因敲除动物模型的构建方法及应用。本发明的STCH基因敲除动物模型可作为抑郁和/或痴呆发病研究的动物模型，本发明采用基因敲除技术制备STCH基因敲除动物模型，通过动物行为学检测，该小鼠出现随着年龄增长抑郁样症状(强迫游泳、悬尾实验)和记忆功能障碍(水迷宫)，具有抑郁症和痴呆样症状，可用于抗抑郁和痴呆药物的筛选。

Description

STCH基因敲除动物模型的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其是涉及STCH基因敲除动物模型的构建方法及应用。

背景技术

热休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)是机体在应激条件下迅速合成的一种蛋白质，又被称为应激蛋白。该家族成员作为分子伴侣参与到生物体内蛋白质的折叠、组装和转运等过程，但不参与最后蛋白的组装。热休克蛋白除了以非特异性分子伴侣发挥作用外，也参与到细胞的保护系统。它们一方面通过快速清除细胞内失去功能的蛋白质来实现细胞结构的稳定，还可以使细胞产生热耐受的能力。该蛋白家族种类很多，功能上也有细微的差别。科学工作者在蛋白分子量的基础上将热休克蛋白分为4个大家族：HSP90家族(分子量主要在在83-90kDa)、HSP70家族(分子量主要在66-78kDa)、HSP60家族及小分子量热休克蛋白家族。这四大家族中最保守的一类热休克蛋白是HSP70，它之所以成为现今研究的热点是由于其广泛的生物学功能。

应激与分子伴侣蛋白(Stress and chaperone，STCH)为热休克蛋白家族70的成员之一。1994年STCH基因被科学家克隆出来并将其定位在人类染色体21q11.1。它编码一个60kD大小的蛋白。目前证明STCH在内质网腔内(ER)，但缺少一个一致性的羧基端的驻留序列，这是该基因的亚细胞结构定位；应激与热休克蛋白的N末端含有特有的疏水前导肽序列，该序列由22个氨基酸残基构成，但是与其他热休克蛋白不同的是它缺少羧基端肽的结合域。这种独特的结构使它与其它Hsp70家族成员在氨基酸水平只具有33％的同源性。同时与其它Hsp70家族所不同的是STCH对热刺激无应激反应，却被钙离子成功应激诱导。而钙离子稳态破坏是引起神经退行性疾病的一个重要原因。因此，对该基因的研究可以进一步深入探讨神经退行性疾病的发病机制，对寻找有效的治疗靶向有重要的作用。

神经退行性疾病是一种慢性、多因素诱导的疾病。它以运动系统、感觉系统或者认知系统中神经元的死亡及减少为典型特征，诸如帕金森病(Parkinsondisease，PD)、阿尔兹海默氏病(Alzheimers disease，AD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateralsclerosis,ALS)、亨廷顿舞蹈症(Huntington disease,HD)、朊病毒病(Prion disease)、聚谷氨酰胺病(Polyglutamine disease)等。这些疾病的主要形成原因是在遗传或者环境因素的诱导下，使细胞内外的蛋白质出现错误折叠而异常聚集成团块样不溶结构，这些团块样无功能的蛋白凝聚体并没有及时被机体的溶酶体系统、泛素-蛋白酶系统的蛋白清理系统所及时降解，而使其产生对神经系统的危害作用。因此，上述的神经退行性疾病又被学者们称为蛋白质错误折叠疾病。

对于上述神经退行性疾病的研究以及相应药物的开发需要依赖有效的动物模型的建立，并且有效的动物模型的建立有利于相关疾病的机制研究及药物筛选。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种STCH基因敲除动物模型的构建方法及应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：提供一种STCH基因敲除动物模型的构建方法，STCH条件性基因剔除小鼠是通过基因打靶的策略，在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点，当该小鼠在导入Cre重组酶的情况下，Cre重组酶通过识别LoxP位点，切除LoxP位点间的序列，达到在特定细胞中条件性剔除STCH基因的目的。

具体包括以下步骤：

1)在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎干细胞，收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎干细胞，

2)制备小鼠供体囊胚，

3)将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，

4)将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，

5)该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，

6)获得进入种系的嵌合体小鼠，

7)得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。

所述的STCH基因与STCH基因外显子2的序列均可从基因库查询得到。

优选地是，所述的动物为STCH基因杂合敲除小鼠。

本发明第二方面：提供STCH基因敲除动物模型的应用。

首先，STCH基因敲除动物模型作为抑郁和/或痴呆发病研究的动物模型。进行抑郁和/或痴呆发病研究包括以下内容中的一种或几种：

(1)基因型鉴定：通过普通PCR技术对STCH基因敲除动物进行基因型鉴定，并在蛋白水平采用Western blot进行验证；

(2)行为学实验筛查：分别对不同年龄段的STCH基因敲除动物与对比动物进行转棒行为学、悬尾行为学、强迫游泳行为学、旷场行为学及水迷宫行为学检测；

(3)在mRNA水平采用RT-PCR技术对不同年龄段STCH基因敲除动物与对比动物的皮层进行抑郁相关基因BDNF、TPH2、FKBP5、GAD1、GAD2、HTR2a、Creb1的表达进行检测；

(4)在蛋白水平采用Western Blot技术对STCH基因敲除动物与对比动物进行自噬相关抗体、记忆相关抗体和抑郁相关抗体的检测；

(5)通过免疫荧光检测GFAP、CD11b、STCH、F4/80在STCH基因敲除动物与对比动物黑质脑区的表达；

(6)采用HPLC-MS技术从递质水平检测STCH基因敲除动物与对比动物整个脑组织内多巴胺及其代谢产物二羟苯乙酸的含量。

其次，STCH基因敲除动物模型用于抗抑郁和/或痴呆的药物筛选，此时其包括以下步骤：

(1)给STCH基因敲除动物模型施用待筛选的测试药物；

(2)观察STCH基因敲除动物模型中的抑郁和/或痴呆的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；

其中，所述STCH基因敲除动物模型中抑郁和/或痴呆的相关症状有显著改善，则表示该测试物是潜在的抗抑郁和/或痴呆的药物。

本发明第三方面：提供STCH基因的应用，其用于制备预防和/或治疗抑郁和/或痴呆的药物。

所述的药物包括过表达STCH基因的药物。

与现有技术相比，本发明采用基因敲除技术制备STCH基因敲除动物模型，通过动物行为学检测，该小鼠出现随着年龄增长抑郁症状(强迫游泳、悬尾实验)和记忆功能障碍(水迷宫)，具有抑郁症和痴呆的病理特征，可用于抗抑郁和痴呆药物的筛选。

附图说明

图1为利用PCR扩增技术鉴定新生小鼠的基因型结果。

图2为STCH+/-与STCH+/+小鼠STCH蛋白水平表达量分析，A图为western blot实验结果；B图为蛋白定量结果。

图3为不同年龄段STCH+/-小鼠与STCH+/+小鼠的转棒行为结果。横坐标1m表示鼠龄一月，依此类推。纵坐标表示小鼠停留在转棒上的时间，单位为秒。

图4为不同年龄段STCH+/-与STCH+/+小鼠的悬尾实验结果。横坐标1m表示鼠龄为一月，其余依次类推。纵坐标表示小鼠头部向下非正常体位悬挂时停止挣扎的总静止时间，单位为秒。

图5为STCH+/-与STCH+/+小鼠强迫游泳行为实验结果。横坐标m表示月，其余依次类推。纵坐标表示小鼠在水环境中时停止挣扎的总时间，单位为秒。

图6为STCH+/-与STCH+/+小鼠旷场实验中穿越中间位置的频率结果图。

图7为旷场实验中STCH+/-与STCH+/+小鼠的运动总距离结果示意图。

图8为旷场实验中STCH+/-与STCH+/+小鼠在探索中平均速度结果示意图。

图9为水迷宫行为学实验中STCH+/-及STCH+/+小鼠训练时的结果示意图。横坐标day1表示训练第一天，其余依次类推。纵坐标表示训练时小鼠从入水到找到平台的潜伏期，单位秒。

图10为水迷宫行为学实验中不同年龄段STCH+/-及STCH+/+小鼠测试时的结果示意图。

图11为六个月鼠龄的STCH+/-及STCH+/+小鼠的皮层部位抑郁及记忆相关基因筛查结果。

图12为六个月鼠龄两组小鼠皮层各个神经营养因子的表达结果。

图13为六个月鼠龄两组小鼠整个半脑各个神经营养因子的表达结果。

图14为六个月鼠龄两组小鼠黑质各个神经营养因子的表达结果。

图15为SDS-PAGE凝胶电泳所使用的抗体列表。

图16为STCH+/-与STCH+/+小鼠整个脑区内自噬相关蛋白的表达及定量。

图17为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层内自噬相关蛋白的表达及定量。

图18为STCH+/-与STCH+/+小鼠半脑脑区自噬相关的磷酸化蛋白的表达及定量。

图19为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层自噬相关的磷酸化蛋白的表达及定量。

图20为STCH+/-与STCH+/+小鼠半脑脑区记忆相关蛋白的表达及定量。

图21为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层脑区记忆相关蛋白的表达及定量。

图22为STCH+/-与STCH+/+小鼠不同鼠龄皮层内抑郁相关蛋白表达情况。

图23为不同年龄段两组小鼠的神经递质检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

STCH基因敲除动物模型的构建方法，STCH条件性基因剔除小鼠是通过基因打靶的策略，在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点，当该小鼠在导入Cre重组酶的情况下，Cre重组酶通过识别LoxP位点，切除LoxP位点间的序列，达到在特定细胞中条件性剔除STCH基因的目的。包括以下步骤：

1)在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎干细胞，收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎干细胞，

2)制备小鼠供体囊胚，

3)将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，

4)将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，

5)该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，

6)获得进入种系的嵌合体小鼠，

7)得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。

具体采用以下步骤：

步骤1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备及培养

滋养层细胞培养液成分：500ml DMEM，6ml L-Glutamine，6ml非必需氨基酸，6ml青链霉素溶液.4ulβ-巯基乙醇，90ml胎牛血清。用一次性滤器过滤，4℃保存。

细胞冻存液：30％胎牛血清，63％DMEM，7％DMSO，现用现配并且预冷。上述所有试剂均购自小鼠原代胚胎成纤维细胞制备：引颈处死妊娠13.5d的雌鼠(129)。75％酒精喷湿消毒，在超净台打开腹腔，取出有胚胎的雌鼠子宫；在无菌PBS中分离胚胎，去除卵黄囊、羊膜和胎盘；将胎鼠移入另一装有无菌PBS的培养皿中，去除内脏、头；在无菌PBS中洗净，用无菌的眼科剪将胎鼠剪碎后移入15mL离心管中，加2mL PBS，1000rpm离心，2min，弃上清。加入5mL 0.25％胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，37℃消化15min后，加入适量滋养层细胞培养液终止反应，1000rpm离心，2min，弃上清。加入适量培养液，吹打成细胞悬液，转移到10cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养。

一般在第3天细胞长满培养皿，经传4代后，此细胞即原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast，MEF)。

小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备：将丝裂霉素C(Roche公司)按20mg/L的浓度添加到培养的MEF细胞中，37℃继续培养2h，MEF细胞停止增殖，此时即可用作ES细胞培养的滋养层。经丝裂霉素C处理得到的滋养层细胞也可冻存备用。

步骤2胚胎干细胞(ES细胞)的培养

ES细胞培养液：DMEM高糖培养基，添加15％胎牛血清，1000u/ml的LIF，2mM的L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，lmM丙酮酸钠，1000×β-巯基乙醇。

ES细胞的复苏及传代培养：本领域技术人员都可以直接从南方模式基因中心获得SCR012细胞株。购买网站http://www.biomodel.com.cn/。取出冻存的ES细胞，将其迅速置于37℃水浴中，使细胞悬液尽快融化；将融化的细胞悬液吸到已预先加入5mL ES细胞培养液的无菌离心管中，吹打混匀，1000rpm，2min，弃上清。加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液，移入已预先铺好经实施例1得到滋养层细胞的100mm培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为10mL，将培养皿放入37℃，5％CO₂培养。ES细胞的传代，吸去原培养液，加入10mLPBS洗涤2次。加入2mL 0.25％胰蛋白酶，37℃消化5min；加入5mL ES细胞培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，移入无菌离心管中，1000rpm，2min，弃上清。加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液。按1:3比例移入已预先铺好滋养层细胞的10cm培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为10ml将培养皿放入37℃，5％CO₂培养，每天更换新鲜的ES细胞培养液。

囊胚注射：生长在滋养层上的ES细胞，从一个ES细胞，迅速生长为一个小集落，在倒置显微镜下，ES细胞集落呈岛状或巢状，向四周生长，细胞集落与周围滋养层细胞存在明显界限，集落内部细胞之间连接致密，相差显微镜下细胞表面有折光较强的脂状小滴，而单个细胞体积较小，细胞核大。ES细胞生长迅速，且易分化，隔天培养后即进行囊胚注射。Gene-Trap方法获得的是高通量基因突变ES细胞，故注射前一定要将待注射的突变ES细胞再鉴定，首先通过PCR来确定所用的细胞株是否是STCH突变。

ES细胞阳性克隆PCR鉴定

打靶(打靶载体用NotI线性化)，共挑取抗性ES细胞克隆96个，分别用P1+P2，P3+P4进行PCR阳性克隆筛选，结果：双侧臂均发生正确同源的克隆(9，24，26，33，36，50，53，57，58，62，75，79，95)共13个ES细胞阳性克隆。

步骤3供体囊胚的制备

很多因素都可以影响囊胚的数量，如小鼠的品系、小鼠的健康状况、适应性、超排卵和实验时所处的季节等等。本发明采用3-5周龄(12g-14g)，C57BL/6J的雌鼠。超排卵供体小鼠的准备：

挑选12-14g的C57BL/6J的不动情雌鼠，在第一天下午，腹腔注射5IU的孕马血清(PMS)。距前次注射PMS的时间不超过48h，腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素(HCG)，并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。第四天9:00前检查有阴栓者为供体雌鼠，单笼放置，此天记作0.5天。同天下午再挑选26-33g左右的昆明白动情雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配。第五天9:00前检查有阴栓者为受体雌鼠，单笼放置。第七天，即在交配后的第四天，收集供体雌鼠子宫中的囊胚。囊胚的收集和培养：引颈处死3.5dpc的超排卵供体C57BL/6J雌鼠，70％的酒精棉球消毒腹部，在腹中线处做一横向切口。剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。将肠组织向上提到翻转的腹膜上，找到子宫，用剪刀将左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接剪下，然后小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。再用剪刀分别在子宫头与子宫尾剪去输卵管及子宫角部分，使得两根单独的子宫通畅。用5ml的一次性注射器吸取足量的M2，套上5号针头，在体视解剖镜下插入子宫腔，推动注射针栓，正反方向冲洗子宫腔，子宫在冲洗时会轻度膨胀，小鼠胚胎将迅速沉至培养皿底部。取一个35mm的培养皿，滴上数滴Brinster’s BMOC-3培养液(Sigma)，每滴约200ul，上面覆盖上矿物油(Sigma)。在体视解剖镜下用移卵管收集胚胎，并转移至石蜡油密封的培养液滴中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2小时。

步骤4囊胚注射操作步骤

将持卵管、注射针的针管和操作平皿充满石蜡油。用显微镜的微调将其调至相同的聚焦平面。注射用的ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES培养液，1-2小时后胰酶处理，做成单细胞悬液保存在Brinster’s BMOC-3培养液中。从35mm培养皿中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移至安装好持卵管和注射针的注射槽内，用移卵管吸取少量的ES细胞放入其中。在10倍镜下用注射针吸取10-15枚小而圆的ES细胞。40倍镜下用持卵管吸附囊胚的一侧，将注射针调整至对准囊胚的中心并使他们处于同一水平面。转动注射针的操纵杆，使注射针快速刺破囊胚的壁，进入囊胚腔，推动注射泵使ES细胞(10-15个)顺序进入囊胚腔，小心拔出注射针。将注射过的囊胚放置在操作视野的另一侧，继续下一个囊胚的注射。

步骤4胚胎的子宫移植

将移卵管接上口控管，在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、注射后的囊胚、气泡、少量培养液。麻醉受体雌鼠，用75％酒精消毒受体鼠背部，在右侧靠近第一腰锥的部位做一个1cm的横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕一个3mm的小口。左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁，右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖显微镜下，针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将实施例3得到的胚胎缓慢吹入子宫中。子宫和肠系膜送回腹腔，如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生，

其中获得进入种系的嵌合体与C57BL/6J交配，获得STCH杂合子。

实施例2

对实施例1制得的STCH+/-小鼠(即STCH基因杂合敲除小鼠)表型进行鉴定。STCH+/-小鼠(即STCH基因杂合敲除小鼠)，实施例1方法制得；STCH-/-小鼠(即STCH基因纯合敲除小鼠)，为胚胎致死型。STCH+/+小鼠：正常对照小鼠。

1、PCR检测新生小鼠基因型(采用常规操作手段进行)

引物序列，PAGE纯化(表1)。

表1小鼠的STCH基因序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		KO P1	GGATGATCTGGACGAAGAGC
Common P2	GGGGGTAAGGTCTGGAATGT
		STCH+/+ P3	AAAACGGGCATATCAGCATC

电泳条带大小：STCH+/+：904bp,STCH+/-:1372bp,CKO 2000bp

PCR试剂盒购自Takala(Code:D333)

2、Western Blot检测STCH+/-及正常鼠脑中STCH基因的表达量(采用常规操作手段进行)

新生小鼠的基因型鉴定及子一代畸形率

为了明确STCH+/-小鼠后代的基因型并为后续实验提供样本基础，我们通过PCR扩增技术来鉴定新生小鼠的基因型(图1所示)，并通过Western Blot验证STCH+/-小鼠体内的STCH基因的蛋白表达量明显低于STCH+/+小鼠，且表达减少量接近一半(图2所示)。能够得到这样的预期结果就可以说明我们的杂合小鼠模型是成功的、可靠的。

图1中空白无条带泳道分别对应无模板对照，后四个泳道分别对应两只新生小鼠样本。其中，左边第一、第二泳道来源一只样本，三、四泳道来源一只样本。第一个样本的第二泳道的条带明显比第二个样本的第二条泳道条带小，根据表1的引物设计原理可得知第一个样本来源为STCH+/-小鼠，第二个样本来源于STCH+/小鼠。由图2的结果分析得出，在STCH+/-小鼠体内STCH蛋白表达量较STCH+/+小鼠明显下降，从定量结果图B分析可得出其下降程度约为一半。

对于STCH+/-小鼠出生近200只小鼠子代进行基因型分析，未获得纯合缺失的基因型的PCR产物，提示STCH纯合敲出表型为胚胎致死，后续实验采用STCH+/-小鼠。从出生一周至一年的小鼠体重曲线中得出，STCH基因敲除可引起全身体重的减轻且这一现象在小鼠生命早期尤为显著，且STCH+/-小鼠后代伴有畸形，畸形率为1.5％。

实施例3

STCH+/+小鼠与STCH+/-小鼠的行为学实验检测

包括以下实验：转棒行为学实验、悬尾行为学实验、强迫游泳行为学实验、旷场行为学实验、水迷宫行为学实验。实验方法采用常规方法或标准方法。

从图3的结果分析，STCH+/-小鼠的运动协调能力在任何鼠龄时期与STCH+/+小鼠相比均较差。且这种显著差异在鼠龄为两个月时才开始出现，此后随着月份的增加两组小鼠的运动协调能力逐渐增强并在六月鼠龄时达到峰值，之后又随着鼠龄的增长，该能力呈逐渐下降趋势。

从图4的结果分析，STCH+/-小鼠的抑郁程度在幼年到成年、老年鼠龄时期与STCH+/+小鼠相比明显较强。且随着鼠龄的增加抑郁程度逐渐增强，在鼠龄为12个月时STCH+/-小鼠的抑郁程度与STCH+/+小鼠相比依然较强。

图5的结果表明，STCH+/-小鼠的抑郁程度在任何鼠龄时期与STCH+/+小鼠相比明显较强。且这种显著差异在鼠龄为两个月时具有明显的统计学差异，此后随着月份的增加STCH+/-小鼠的抑郁程度明显增强并在六月鼠龄时达到峰值，之后又随着鼠龄的增长逐渐下降趋势。而STCH+/+小鼠并没有表现出较为明显的抑郁症状。

从图6的结果分析，STCH+/-小鼠的抑郁程度在幼年、成年、老年时期与STCH+/+小鼠相比明显较强。且这种显著差异呈现出一定的年龄相关性，在六月鼠龄时达到峰值。

从图7的结果分析，STCH+/-小鼠的运动能力在幼年、成年、老年鼠龄时期与STCH+/+小鼠相比均较差。且这种显著差异在鼠龄为两个月时具有明显统计学差异，随着月份的增加差异也逐渐增强并在六月鼠龄时达到峰值，之后又随着鼠龄的增长，运动能力下降。

从图8的结果分析，STCH+/-小鼠的运动能力在幼年、成年鼠龄时期与STCH+/+小鼠相比均较差。且这种显著差异在鼠龄为两个月时具有明显统计学差异，随着月份的增加差异也逐渐增强并在六月鼠龄时达到峰值，之后又随着鼠龄的增长，两组小鼠的运动能力均下降。

经过五天的水迷宫平台训练之后，得到图9。从图9中可明显得出随着训练时间的增加，STCH+/+小鼠找到平台的时间显著缩短，而STCH+/-小鼠找到平台的时间却没有发生较明显的变化。从图10的结果分析，测试时不同鼠龄的STCH+/+小鼠找到平台的时间均较STCH+/-小鼠少，且在二个月及十个月鼠龄出现显著差异。

结果经统计学分析后，说明敲除STCH+/-小鼠在运动协调能力、学习记忆能力方面与STCH+/+小鼠比较有显著性差异，且在情绪方面出现严重抑郁症状。此外，上述表型呈现出年龄正相关性，在6个月鼠龄的时候表型症状达到峰值。

实施例4

STCH+/+与STCH+/-小鼠相关基因表达情况的鉴定

首先，RT-PCR技术检测敲除动物模型中STCH及其他基因的表达量

包括不同脑区总RNA提取、总RNA逆转录(试剂盒Cat no：DRR036A)以及qRT-RCR，上述操作步骤均采用常规技术手段进行。

在敲除动物模型中检测抑郁及记忆相关基因的表达变化

抑郁相关基因脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、色氨酸羟化酶2(Tryptophan Hydroxylase,TPH2)、钙调神经磷酸酶抑制剂结合蛋白五(FK506-binding protein 5,FKbp5)、谷氨酸脱羧酶1(Glutamatedecarboxylase 1,GAD1)、谷氨酸脱羧酶2(Glutamate decarboxylase 2，GAD2)Necab1等表达均在一定程度内上调、记忆痴呆方面的相关的基因载脂蛋白(Apolipoprotein E，APOE)、淀粉样蛋白前体(amyloid precursor-like protein 1，APLP1)、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursorprotein，APP)、淀粉样前体蛋白裂解酶1(beta-site amyloid precursor proteincleaving enzyme 1，BACE1)、淀粉样前体蛋白裂解酶2(beta-site amyloid precursorprotein cleaving enzyme2，BACE2)舞蹈症蛋白(Huntington,HTT)表达上调，使得STCH+/-更易出现痴呆样表型，与前面所得的行为学结果数据相吻合。

分析图11的结果可得出在鼠龄为六个月时，STCH+/-小鼠皮层内痴呆相关的Apoe、Psen1、Psen2、Aplp1、Aplp2、Bace1基因表达量与STCH+/+小鼠相比明显升高，这在分子水平支持了上述行为实验中小鼠出现的记忆障碍现象。抑制抑郁相关基因GAD1、GAD2、Creb1及BDNF、5-Htr2a表达量在STCH+/-小鼠皮层内与STCH+/+小鼠相比出现显著下降，这在分子水平验证了上述行为实验中STCH+/-小鼠出现的情绪抑郁现象。

六个月鼠龄的两组小鼠检测神经生长因子相关基因的表达变化

在对六月份小鼠皮层的抑郁相关基因、记忆相关基因筛查后我们发现在六月份各个基因的表达量较高且差异最为明显，并结合以上所得转棒行为学、悬尾行为学及强迫游泳行为学的结果我们推断出六个月的时候STCH+/-小鼠的抑郁程度到达最高、学习能力下降明显、运动能力最差，因此，我们用六个月的小鼠的皮层、黑质及整个半脑三个脑区进行进一步筛查神经营养因子如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GroSTCH+/+hFactor,VEGF)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)、睫状神经生长因子(Ciliaryneurotrophic factor，CNTF)、神经胶质细胞来源的神经生长因子(Glialcell-derivedneurotrophic factor，GDNF)的表达情况，旨在结合已经得到的行为学结果得出分子水平的证据。

在皮层中，我们发现STCH+/-小鼠中GFAP表达明显升高，这表示在STCH+/-小鼠内其高度活化。同时，如图12-图14，炎症因子MCP-1、IL-6等也出现高表达。在STCH+/-小鼠黑质脑区内，TH的表达明显下调，炎症因子表达也出现上调。在半脑检测中，神经生长因子NGF及BDNF均下调，这说明敲除STCH基因使整个脑区出现了变化。

通过本实施例可以看出，STCH+/-小鼠在记忆学习能力、抑郁程度方面较STCH+/+小鼠都有所下降，且随着年龄的增长该差异更为明显，在六月份差异最大，之后差异下降。皮层部位GFAP高度活化、炎症因子表达上调；纹状体部位酪氨酸羟化酶表达下降，炎症因子表达上调；整个脑区内神经营养因子、脑源神经生长因子等表达均出现显著性差异。

实施例5

STCH+/-与STCH+/+小鼠相关蛋白表达的鉴定

样品总蛋白提取方法：小鼠用10％水合氯醛以1g体重4ul的剂量麻醉，断头，将头部毛皮剪开后用解剖剪轻轻将颅骨打开，完整的剥离脑组织并立即将脑组织置于冰上。在冰上用刀片准确将大脑分为两半，一半保留完整另一半分离皮层、黑质，完成后立即置于液氮中。根据组织大小加入相应体积的RIPA和PMSF，用匀浆器打碎组织。在冰上静置30min，4℃，12,000rpm，离心30min，转移上清至干净的1.5ml离心管中。

蛋白定量：采用BCA蛋白定量法定量。

SDS-PAGE凝胶电泳：采用图15所示抗体。

图16Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其半脑脑区内的翻译调控因子核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal Protein S6Kinase，PS6K1)表达与对照STCH+/+小鼠相比明显下调，凋亡相关蛋白雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target Of Rapamycin，MTOR)表达显著增加。其它增殖分化相关蛋白如MAP激酶相互作用丝/苏氨酸激酶1(MAPKinase-interactingserine/threonine-protein Kinase 1，MKNK1)MKNK1、MAP激酶相互作用丝/苏氨酸激酶1(MAP Kinase-interacting serine/threonine-protein Kinase 2、MKNK2)、蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB,also known as Akt)及自噬蛋白自体吞噬相关蛋白5(Autophagy Protein 5，ATG5)表达暂无明显统计学差异。

图17Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区内的定量结果显示STCH+/-小鼠的翻译调控因子PS6K1表达与对照相比明显下调、凋亡相关蛋白MTOR表达显著增加且二者均与年龄呈正相关；转录、分化调控因子MAPKAP1在STCH+/-小鼠内3的发病早期表达明显升高。其他蛋白MKNK1、MKNK2、AKT的表达暂无明显统计学差异。

图18 Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其半脑脑区内的磷酸化蛋白的定量结果显示信号转导和转录激活子3(Signal transducerand activatorof transcription 3,also known as STAT3)、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinase，ERK)表达与对照相比明显上调，其中STAT3表达变化发生在发病初期而ERK表达变化发生在病症最严重时期。转录调控因子S6K1在发病初期表达急剧升高而蛋白磷酸化酶PP2A在相对晚期表达明显上调。Tuberin蛋白表达暂无明显统计学差异。

图19 Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区内的磷酸化蛋白定量结果显示定量翻译调控因子S6K1、Tuberin表达明显下调，而信号转导因子ERK在发病早期及病症最严重时期均高度表达。其他蛋白STAT3、PP2a暂无明显统计学差异。

图20 Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其半脑脑区淀粉样蛋白前体APP、载脂蛋白APOE、及早老素Psen1表达均上调，其中APP和Psen1在STCH+/-小鼠晚期表达明显上调，其他蛋白表达量暂无明显统计学差异。

图21 Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区淀粉样蛋白前体APP及早老素Psen2在发病晚期表达均上调，其中Psen2在STCH+/-小鼠早期表达亦明显上调，其他蛋白表达量暂无明显统计学差异。

图22 Western Blot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其大脑皮层GAD、BDNF、Creb1蛋白的表达显著下调。THP2、FKBP5蛋白的表达出现下降但并未出现统计学差异。

敲除STCH基因后整个脑区、皮层的蛋白翻译因子表达下调，机体许多与该信号通路相关蛋白表达关闭且蛋白凋亡通路激活，体内蛋白水平的变化使得小鼠出现上述诸如体重减轻、情绪抑郁、协调能力及记忆能力下降等外在表型。此外，敲除该基因使得痴呆相关蛋白大量表达，这些蛋白过度表达到一定程度可引起痴呆，在未达到此种程度之前必然引起记忆能力的下降。这与我们前面的行为学检测结果相吻合，STCH+/-小鼠的记忆、学习能力明显差于STCH+/+小鼠。不同年龄阶段小鼠的皮层内BDNF表达存在差异，在发病晚期，该差异极为明显。该蛋白在STCH+/-小鼠内的低表达与情绪抑郁相关。该结果亦可从行为学上得到证实，STCH+/-小鼠的抑郁程度明显比STCH+/+小鼠剧烈。

实施例6

STCH+/-与STCH+/+小鼠的组织形态学差异鉴定及神经递质检测

由递质检测结果图23分析可得出总体上各种检测的递质含量在STCH+/-小鼠普遍低于STCH+/+小鼠。在两月、六月鼠龄时期的STCH+/-小鼠体内其DA的含量与STCH+/+小鼠相比含量明显减少。而DA的甲基化代谢产物3-MT递质在STCH+/-小鼠内的含量在六月、十二月鼠龄时才出现显著减少。递质5-HT的含量在二月、六月鼠龄的STCH+/-小鼠体内含量也明显比STCH+/+小鼠低。

通过实验对比发现，在多巴胺神经元胞体聚集区并在大脑中发挥重要作用的黑质部位，STCH+/-小鼠的星型胶质细胞高度活化。这可能是由于在生物体内发挥重要作用的STCH基因的敲除引起生物自身的抵抗该恶劣环境的一种自我保护机制。然而小胶质细胞程度CD11b没有明显活化。而且随着鼠龄的增长，在小鼠达到八个月、十二月时并没有发现STCH+/-及STCH+/+在星型胶质细胞、小角质细胞相关染色上的明显差别。这一结果可能提示在小鼠生命晚期，STCH+/-与STCH+/+小鼠间的差异逐渐变小。

神经递质的结果显示，敲除STCH基因后多巴胺神经元及其甲基化代谢产物3-甲基化色胺盐酸盐含量明显降低。这些重要神经元的减少从递质水平上说明了STCH+/-小鼠外在行为能力降低的原因。而与情绪有关的神经递质5-HT在STCH+/-小鼠内含量明显下降，这在递质水平再次证明了STCH+/-小鼠表现出的情绪方面的抑郁。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种STCH基因敲除动物模型用于抗抑郁药物筛选的应用，其特征在于，

所述STCH基因敲除动物模型为STCH条件性基因剔除小鼠，通过基因打靶的策略，在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点，当该小鼠在导入Cre重组酶的情况下，Cre重组酶通过识别LoxP位点，切除LoxP位点间的序列，达到在特定细胞中条件性剔除STCH基因的目的；

所述的STCH基因敲除动物模型的构建方法包括以下步骤：

1)在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎干细胞，收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎干细胞，

2)制备小鼠供体囊胚，

3)将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，

4)将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，

5)该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，

6)获得进入种系的嵌合体小鼠，

7)得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。

2.根据权利要求1所述一种STCH基因敲除动物模型用于抗抑郁药物筛选的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)给STCH基因敲除动物模型施用待筛选的测试药物；

(2)观察STCH基因敲除动物模型中的抑郁相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；

其中，所述STCH基因敲除动物模型中抑郁相关症状有显著改善，则表示该测试物是潜在的抗抑郁药物。

Images