CN108315350B - 过表达cox5a/低表达bdnf转基因鼠模型及其构建方法与应用 - Google Patents
过表达cox5a/低表达bdnf转基因鼠模型及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型及其构建方法与应用,该构建方法包括以下步骤:构建过表达COX5A转基因鼠模型;构建低表达BDNF转基因鼠模型;将COX5A过表达最高品系以及BDNF低表达最低品系代合笼,从子代鼠中获得过表达COX5A/低表达BDNF双杂交鼠。本发明首次获得过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型,为制备预防或者治疗脑老化、老化相关疾病药物提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域,具体地说,涉及一种过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型及其构建方法与应用。
背景技术
脑老化,是一种机体为适应随年龄加剧的衰老状态做出的适应性的、不可逆的改变,这一过程通常会导致学习能力的下降与部分记忆的丧失。脑老化朝着恶性方向发展到一定阶段有可能会演变成一些常见而棘手的疾病,如阿尔茨海默病(AD)、帕金森综合症(PD)以及其他的一系列老化相关的临床疾病。这样的状况也引起了越来越多国家和社会机构的重视,并投入了大量的人力、财力、物力,在神经科学相关领域开展了大量的研究工作。过去的1990-1999年曾被美国政府誉为“脑研究的十年”,就是各方投入的真实写照。但是这样高成本的投入却收效甚微,尽管花费了无数的心力,到目前为止,用于预防和治疗脑老化及其相关疾病的措施仍然十分有限,远远不能满足日益壮大的老龄化社会的需求。
快速老化小鼠(Senescence-Accelerated Mouse,SAM)是一种研究老化的国际公认动物模型,是通过多代近亲杂交得到的自然衰老动物,其遗传背景是AKR/J小鼠。SAM主要包括两大类,即快速老化系(SAM-prone,SAMP)以及抗快速老化系(SAM-resistant,SAMR)。而作为自然老化品系中的代表,快速老化系中的P8系(SAMP8),因其早期就表现出认知功能的缺损以及与年龄相关的学习记忆能力的丢失而被广泛运用于脑老化相关学习记忆机制的研究,成为实验研究主要的老化动物研究模型。
脑老化过程进展会引发一系列的病理改变,其中最引人注意的就是引发学习记忆功能障碍,而这也正是AD对患者的主要危害之一,严重影响患者生活质量和尊严。有学者通过对人类病例分析及实验动物模型的研究发现,记忆力的衰退早在老化的最初阶段就开始了。大量的临床和实验室的研究资料均显示海马在学习、记忆及认知过程中都发挥了重要的作用,是一个重要的学习记忆功能中枢。因此,海马细胞的突触长时程增强(LTP)记录被广泛用作研究记忆的细胞和分子模型,特别是运用于AD发病机制与治疗的相关研究中。
而有关AD的发病机制,可以说是众说纷纭、百家争鸣,在神经科学领域仍然是一个悬而未决之谜,综合研究报道,目前为止,大家较为公认的发病学说主要集中在以下几个方面:1)β-淀粉样蛋白的异常沉淀;2)tau蛋白异常磷酸化所是所致的神经元纤维缠结(NFTs);3)AD发病相关基因学说,包括β-淀粉样前体蛋白(APP)基因、早老素1(PS1)基因、早老素2(PS2)基因、载脂蛋白E(ApoE)基因出现异常等等;4)胆碱能损伤学说;5)细胞内钙离子超载学说;6)自由基损伤学说;7)免疫反应学说等等。其中,β-淀粉样蛋白在学习记忆相关脑区的异常沉淀被公认为所有病因导致AD发病的最终环节,而β-淀粉样蛋白的异常沉积形成的老年斑(SP)也成为了AD确诊的重要病理诊断依据。
而最新的研究认为,几乎每一种神经退行性疾病及相关病变发展到一定阶段都会出现线粒体功能障碍。线粒体功能障碍似乎成为神经退行性病变的相关事件,伴随发生,AD也不例外。线粒体在细胞中行使着极其重要的生理功能,是生物体内供能的重要细胞器,细胞所需总能量的都由线粒体产生,与细胞的生存和死亡息息相关,因此在那些长寿命的细胞,如神经元中,保持一定数量的健康的线粒体就更为重要同时也更加困难,且神经元进行糖酵解的能力十分有限,高度依赖需氧的氧化磷酸化作用供能,因此这种生物能的供应在大脑中就显得尤为重要。线粒体产能的过程中电子从线粒体呼吸链复合物I依次传递至复合物IV,它们组成的电子传递链(Electron Transport Chain,ETC)可以将电子从低电位的供体传递至高电位的受体,传递链的最后,氧分子接受电子并被还原成水分子,此过程中造成的电势差就是线粒体产能的来源。由此可见,电子传递链对线粒体正常功能的维持起到了重要作用。
近年来,随着研究的深入,线粒体缺陷与功能障碍在AD发病中的作用日益引起人们的关注,其中,作为线粒体电子传递链中重要成员,呼吸链复合体IV(即细胞色素C氧化酶,cytochrome C oxidase,简称COX)的功能缺陷被认为可能是AD的最早、最主要的特异改变,可以通过一系列机制引发脑内病理改变和行为异常。AD与脑内线粒体氧化磷酸化异常有关,这一观点已逐渐得到广泛认同。研究发现,在AD患者中均发现了不同程度的线粒体功能障碍,包括线粒体细胞器功能失调、氧化磷酸化功能缺陷、氧化应激及有害的β样淀粉蛋白(Aβ)在病变脑区沉积等等,而COX的缺陷可导致细胞氧代谢和能量代谢障碍、微管系统损伤从而引起海马神经元细胞活性下降甚至死亡;研究报道,长期、缓慢地给予NaN3(COX的特异性抑制剂),可导致动物脑内COX活性下降并引发学习记忆障碍。COX由13个亚基复合而成,其中,编码COXI、II、III亚基的mRNAs在AD患者颞叶、海马等脑区的表达显著下降;而AD患者脑中也发现了线粒体基因编码COX I、II亚基的COX1和COX2基因发生高频点突变。最近的研究表明,COX Va亚基(COX5A)作为一种核编码的COX亚基,在脑老化相关的氧化磷酸化过程中起到至关重要的作用。但目前为止,线粒体缺陷在AD发病中的作用机制尚不清楚,COX5A在脑老化、老化相关疾病中所扮演的角色以及其涉及到的相关信号通路尚未阐明,未见报道。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型及其构建方法与应用。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
步骤1、构建过表达COX5A转基因鼠模型;
步骤2、构建低表达BDNF转基因鼠模型;
步骤3、构建过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型:两种品系转基因鼠合笼后获得子代鼠,对子代鼠进行基因型检测,PCR法在鼠尾基因组DNA中同时检测到COX5A过表达转基因鼠基因型以及BDNF低表达转基因鼠基因型片段的小鼠,即为过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠。
可选地,所述构建过表达COX5A转基因鼠模型具体为:
步骤1.1、PCR克隆扩增目的基因COX5A(GeneID:12858)的开放读码框,扩增引物序列如下:
上游引物为5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
下游引物为5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;目的片段386bp;
步骤1.2、pcDNA3.1(+)-m-COX5A质粒构建:经过酶切、DNA片段回收、连接反应用内切酶EcoRI与XhoI酶切pcDNA3.1(+/-)Vector载体和插入的目的片段COX5A的ORF;
步骤1.3、将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取,通过大量制备质粒DNA,电泳、用QiagenDNA凝胶回收试剂盒回收DNA片断;
步骤1.4、用SephedexG50的凝胶柱纯化DNA,用TE溶液对DNA进行溶解回收;
步骤1.5、回收片断,用于显微注射,用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释DNA样品,12000g,离心2小时,上清液的2/3进行分装;
步骤1.6、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠;
步骤1.7、PCR法鉴定阳性转基因鼠,转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记,收集剪下的组织,用碱裂解法提取基因组DNA,利用特异引物通过PCR法进行检测,检测引物序列如下:
上游引物为5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
下游引物为5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
PCR鉴定阳性者作为实验组,阴性者作为同窝野生型对照;获得表达386bp目的片段的COX5A过表达转基因小鼠,共4个品系,根据脚趾编号分别命名为Founder N;
步骤1.8、运用RT-PCR及Western blot技术筛选出COX5A表达水平最高的品系,建立稳定的COX5A过表达小鼠模型;一般首建鼠合笼后可以得到数只F0代鼠,为排除不同插入位点对PDGF-BB表达的影响,运用RT-PCR及WB技术对F0代鼠产下的子代进行COX5A的基因和蛋白表达检测,筛选出最高表达的品系,留种繁殖;获得COX5A过表达转基因F0代鼠。
可选地,所述显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤:
a、超数促排卵操作,即第一天注射孕马血清促性腺激素10IU/只,48小时后注射人绒毛膜促性腺激素10IU/只;同时,选取健康雄性6周C57BL/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配,观察阴栓情况,有阴栓的小鼠提出待用,即为供卵小鼠,备用;
b、取卵:将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置,备皮暴露腹部,用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉,暴露卵巢、输卵管和子宫,分离输卵管,用镊子将输卵管放置到M2培养基中,解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部,使卵流到培养液里;向培养液里加入1mg/ml的透明质酸酶,并用M2培养基冲洗3-4遍,去除颗粒细胞;在显微镜下进行观察,对受精卵与其他细胞进行鉴别,因受精卵排出第二极体,而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别;选好的受精卵,移到盛着M2培养基液滴的塑料皿中,移至二氧化碳孵箱中培养直到受精卵适合注射为止;
c.显微注射:显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到C57BL/6小鼠的受精卵雄性原核中,在显微镜下观察,挑选细胞饱满,透明带清晰,雄原核清晰可见的受精卵待用;在载物玻片上作成有20个受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴,固定到载物台上,用持卵吸管将受精卵加以固定,玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴,将其缓慢地注入雄性原核,注射完毕后收集受精卵,37℃二氧化碳培养箱中培养一夜;
d.移植:将假孕小鼠麻醉,手术取出卵巢连接输卵管,用脂肪镊固定,在显微镜下找到输卵管开口,显微镜下,挑出分裂为两细胞的受精卵,备用;吸取上述受精卵,将移植管口插入输卵管口,轻轻将移植管内的液体吹入,看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡,即移植成功;将卵巢连同输卵管放回腹腔,逐层缝合。
可选地,所述的二氧化碳孵箱的温度为37℃,含有5%二氧化碳,95%空气。
可选地,所述构建低表达BDNF转基因鼠模型具体为:
步骤2.1、CMV-EmGFP-siRNA-BDNF低表达转基因片段的构建:沉默表达载体CMV-EmGFP-siRNA-BDNF购买自Invitrogen公司,并用该公司网站提供的软件针对目的基因BDNF(GeneID:12064)的靶位点,其中,靶位点为CCAAGTGTAATCCCATGGGTT,设计沉默的质粒,然后由中美泰和公司完成质粒构建;
步骤2.2、构建好的沉默质粒转染293T细胞,然后用RT-PCR的方法筛选出沉默效果最好的构建;
步骤2.3、用AvrII将干扰效率最高的沉默质粒线形化,获得转基因片段,调整浓度至5ng/μL,用于显微注射;
步骤2.4、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠;PCR鉴定阳性转基因鼠。
可选地,所述显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤:
a、超数促排卵操作,即第一天注射孕马血清促性腺激素10IU/只,48小时后注射人绒毛膜促性腺激素10IU/只;同时,选取健康雄性6周C57BL/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配,观察阴栓情况,有阴栓的小鼠提出待用,即为供卵小鼠,备用;
b、取卵:将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置,备皮暴露腹部,用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉,暴露卵巢、输卵管和子宫,分离输卵管,用镊子将输卵管放置到M2培养基中,解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部,使卵流到培养液里;向培养液里加入1mg/ml的透明质酸酶,并用M2培养基冲洗3-4遍,去除颗粒细胞;在显微镜下进行观察,对受精卵与其他细胞进行鉴别,因受精卵排出第二极体,而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别;选好的受精卵,移到盛着M2培养基液滴的塑料皿中,移至二氧化碳孵箱中培养直到受精卵适合注射为止;
c.显微注射:显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到C57BL/6小鼠的受精卵雄性原核中,在显微镜下观察,挑选细胞饱满,透明带清晰,雄原核清晰可见的受精卵待用;在载物玻片上作成有20个受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴,固定到载物台上,用持卵吸管将受精卵加以固定,玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴,将其缓慢地注入雄性原核,注射完毕后收集受精卵,37℃二氧化碳培养箱中培养一夜;
d.移植:将假孕小鼠麻醉,手术取出卵巢连接输卵管,用脂肪镊固定,在显微镜下找到输卵管开口,显微镜下,挑出分裂为两细胞的受精卵,备用;吸取上述受精卵,将移植管口插入输卵管口,轻轻将移植管内的液体吹入,看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡,即移植成功;将卵巢连同输卵管放回腹腔,逐层缝合。
可选地,所述的二氧化碳孵箱的温度为37℃,含有5%二氧化碳,95%空气。
可选地,所述的步骤4中的PCR鉴定阳性转基因鼠具体为:
i)PCR法鉴定F1代阳性转基因鼠,阳性者作为实验组,阴性者作为同窝野生型对照;
ii)取材:每个品系首建鼠的F1代阳性转基因鼠雌雄不限,每个品系7只,麻醉后迅速取出大脑皮质及海马,每个部位分成两份,一份用于RT-PCR检测,另一份用于蛋白表达检测,预冷生理盐水冲洗干净后,分别放入干净EP管中-80℃冻存或立即进行实验检测。
iii)RT-PCR法检测F1代阳性BDNF低表达转基因鼠:取组织后,按150mg/1.5mlTRIZOL的比例,放入预加了预冷的TRIZOL试剂的匀浆器中,冰浴下匀浆至不粘无颗粒,逐步离心分离、提取RNA;新提取的RNA用DEPC处理过的双蒸水溶解后,紫外分光光度计检测RNA样品的纯度和浓度;取2μg RNA用于逆转录反应,用逆转录试剂盒以RNA为模板合成cDNA链,使用的是RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase酶体系,合成的cDNA可直接用于PCR检测反应。每个样本取cDNA模板1.5μl,加入2×PCR Master Mix(Fermentals)12.5μl、上、下游引物各0.5μl,引物序列为:
上游引物:5'TGTGACAGTATTAGCGAGTGGGT 3',其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
下游引物:5'TACGATTGGGTAGTTCGGCATT 3',其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
加去离子水补足25μl反应体系,94℃ 5分钟,94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟共35个循环,最后72℃ 5分钟,完成PCR检测反应;PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测;以GAPDH为参照基因,电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行,用BIO-RAD公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析,计算各组BDNF基因条带与GAPDH积分光密度值的比值,得出每个样本BDNF基因的相对表达量。
iv)Elisa法检测F1代阳性BDNF低表达转基因鼠皮质和海马BDNF的表达水平。取组织后,将各组织放入含有pH 7.4、0.05M Tris-HCl,0.5M EDTA,30%TritonX-100,NaCl,10%SDS和1mM PMSF的裂解液中冰浴下匀浆,直到无肉眼可见组织块;离心、取上清液,BCA试剂盒检测蛋白含量;BDNF-ELISA kit试剂盒检测各样品的BDNF含量;
取不同品系小鼠皮质和海马进行BDNF的表达检测,最终确定出BDNF表达率抑制率最高的品系,大量繁殖备用;挑选其作为种鼠品系繁殖双杂交鼠。与COX5A过表达最高的品系Founder 35繁殖杂交,构建双杂交鼠。
本发明还公开了一种上述的构建方法得到的过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型。
本发明还公开了一种上述的过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型在制备预防或者治疗脑老化药物中的应用。
与现有技术相比,本发明可以获得包括以下技术效果:
1)本发明首次获得全身过表达COX5A转基因小鼠新品系,为研究COX5A的基因功能在全身各个器官系统疾病提供了研究模式工具;
2)本发明首次获得过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型,初步探究了COX5A在脑老化认知功能障碍中的可能作用及机制,为阐明脑老化发病分子机制开辟了新思路。
3)本发明首次获得过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型,为制备预防或者治疗脑老化、老化相关疾病药物提供了新的策略。
当然,实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明COX5A过表达载体示意图以及COX5A转基因小鼠PCR检测结果;其中,a和b为COX5A过表达载体示意图;c为COX5A转基因小鼠PCR检测结果;
图2是本发明COX5A在转基因鼠大脑组织中的表达检测;其中,a,COX5A在转基因小鼠大脑组织中的基因表达水平;b,COX5A蛋白在转基因小鼠大脑组织中的表达水平;
图3是本发明BDNF沉默构建细胞水平筛选电泳图;在体外运用293T细胞鉴定BDNF低表达转基因片段对BDNF的表达抑制效率;
图4是本发明BDNF低表达转基因鼠(BDNF-DO)构建图;其中,a,低表达BDNF载体构建示意图;b,低表达BDNF转基因小鼠基因组DNA检测PCR电泳图;M,DNA 2000分子量标准;9、39、34、21分别为首建鼠编号Founder 9,39,34,21;WT,野生型小鼠;
图5是本发明BDNF在BDNF-DO转基因鼠脑中的表达检测;其中,a,BDNF基因在BDNF-DO转基因鼠大脑皮质中的表达水平;b,BDNF蛋白在BDNF-DO转基因鼠大脑皮质中的表达水平;9、39、34、21分别为首建鼠编号Founder 9,39,34,21;WT,野生型小鼠;*vs WT,P<0.05;
图6是本发明双杂交COX5A-UP/BDNF-DO鼠PCR鉴定图;M,DNA2000分子量标准;B+,低表达BDNF转基因鼠;C+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠;WT,野生型小鼠;
图7是本发明双杂交转基因小鼠水迷宫评价结果;其中,a,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠逃避潜伏期测定结果;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组;B+,低表达BDNF转基因组;COX+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交组;b,各组转基因鼠在撤出平台后在目标象限的停留时间检测结果;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组;B+,低表达BDNF转基因组;COX+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交组;O,相反象限;R,右侧象限;T,目标象限;L,左侧象限;*vs WT,P<0.05;#vs过表达COX5A转基因组,P<0.05;
图8是本发明过表达COX5A/低表达BDNF转基因小鼠LTP检测结果;其中,a,为开始记录时的输入-输出曲线;b,WT、过表达COX5A转基因小鼠、低表达BDNF转基因小鼠以及双杂交转基因小鼠海马脑片fEPSP波代表性图示;c和d,给予连续串刺激后WT、过表达COX5A转基因小鼠、低表达BDNF转基因小鼠以及双杂交转基因小鼠海马脑片fEPSP的改变及定量分析;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组;B+,低表达BDNF转基因组;COX+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交组;*vs WT,P<0.05;**vs过表达COX5A转基因组,P<0.05;
图9是本发明COX5A与BDNF在转基因鼠海马细胞内的共定位;其中,a-d,海马中COX5A与神经元共定位图;e-h,海马中COX5A与BDNF共定位图;a和e,COX5A免疫荧光染色(红色);b,NeuN免疫荧光染色(绿色);c和g,DAPI免疫荧光染色(蓝色);f,BDNF免疫荧光染色(绿色);d和h,合并后的图片。放大倍数400倍;标尺:5μm;
图10是本发明过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠海马神经元及棘突的改变;其中,a-d,a1-d1,野生型、过表达COX5A转基因组、低表达BDNF转基因组以及过表达COX5A/低表达BDNF双杂交转基因鼠海马高尔基染色图;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组;B+,低表达BDNF转基因组;COX+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交组;e,海马神经元胞体面积、突起远端分枝数、近端分枝数、树突复杂性的定量分析;其中,树突复杂性:树突末梢数量与一级分枝数量的比值,即突起远端分枝数/近端分枝数,比值越高,说明树突分枝越多;*vs WT,P<0.05;**vs过表达COX5A转基因组,P<0.05;放大倍数:a-d,200倍;a1-d1,400倍;
图11是本发明过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠海马线粒体活性及ATP含量,其中,a,过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠海马线粒体活性Cco测定结果;b,过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠海马ATP含量测定结果;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组;B+,低表达BDNF转基因组;COX+/B+,过表达COX5A与低表达BDNF双杂交组;*vs WT,P<0.05;**vs过表达COX5A转基因组,P<0.05;
图12是本发明COX5A通过BDNF/ERK通路发挥作用,其中,a、c,BDNF及其相关信号通路分子ERK1/2的基因(a)和蛋白(c)在不同月龄(6月龄和18月龄)转基因鼠皮质和海马中的表达变化;b、d,BDNF及其相关信号通路分子ERK1/2的基因(b)和蛋白(d)在不同月龄(6月龄和18月龄)转基因鼠海马中表达的定量分析;WT,野生型小鼠;COX+,过表达COX5A转基因组。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式,藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1过表达COX5A转基因鼠模型的构建:
该构建方法包括以下步骤:
步骤1、PCR克隆扩增目的基因COX5A(GeneID:12858)的开放读码框(ORF),扩增引物序列如下:
上游引物为5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
下游引物为5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;目的片段386bp。
步骤2、pcDNA3.1(+)-m-COX5A质粒构建。经过酶切、DNA片段回收、连接反应用内切酶EcoRI与XhoI酶切pcDNA3.1(+/-)Vector载体和插入的目的片段COX5A的ORF。如图1a-b所示。
步骤3、将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取,通过大量制备质粒DNA,电泳、用QiagenDNA凝胶回收试剂盒回收DNA片断;
步骤4、用SephedexG50的凝胶柱纯化DNA,用TE溶液对DNA进行溶解回收;
步骤5、回收片断,用于显微注射。用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释DNA样品,12000g,离心2小时,上清液的2/3进行分装,用于显微注射。
步骤6、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠;PCR鉴定阳性转基因鼠;如图1-a、b所示为COX5A过表达载体示意图;
其中,显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤:
a.超数促排卵操作,即第一天注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU/只(0.2ml/只),48小时后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10IU/只(0.2ml/只);同时,选取健康雄性6周左右C57BL/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配,观察阴栓情况,有阴栓的小鼠提出待用,即为供卵小鼠,备用。
b.取卵。将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置,备皮暴露腹部,用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉,暴露卵巢、输卵管和子宫,分离输卵管,用镊子将输卵管放置到M2培养基中,解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部,使卵流到培养液里。向培养液里加入l mg/ml的透明质酸酶,并用M2培养基冲洗3-4遍,去除颗粒细胞。在显微镜下进行观察,对受精卵与其他细胞进行鉴别,因受精卵排出第二极体,而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别。选好的受精卵,移到盛着M2培养基液滴的塑料皿(直径35mm)中,移至二氧化碳孵箱(37℃,5%二氧化碳,95%空气)中培养直到受精卵适合注射为止。
c.显微注射。显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到C57BL/6小鼠的受精卵雄性原核中。在显微镜下观察,挑选细胞饱满,透明带清晰,雄原核清晰可见的受精卵待用。在载物玻片上作成约有20个左右受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴,固定到载物台上,用持卵吸管将受精卵加以固定,玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴,将其缓慢地注入雄性原核。注射完毕后收集受精卵,37℃二氧化碳培养箱中培养一夜。
d.移植。将假孕小鼠麻醉,手术取出卵巢连接输卵管,用脂肪镊固定,在显微镜下找到输卵管开口。显微镜下,挑出分裂为两细胞的受精卵,备用。吸取上述受精卵,将移植管口插入输卵管口,轻轻将移植管内的液体吹入,看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡,即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔,逐层缝合。
步骤7、PCR法鉴定阳性转基因鼠,转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记,收集剪下的组织,用碱裂解法提取基因组DNA,利用特异引物通过PCR法进行检测,检测引物序列如下:
上游引物为5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG′3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
下游引物为5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
PCR鉴定阳性者作为实验组,阴性者作为同窝野生型对照;从图1-c可知,成功获得表达386bp目的片段的COX5A过表达转基因小鼠,共4个品系,根据脚趾编号分别命名为Founder N(Founder35,22,26,28),与野生型(WT)相比,均可以在鼠尾DNA基因组检测中检测到386bp的插入片段;说明成功获得预期插入片段,即成功获得COX5A过表达转基因小鼠。
步骤8、运用RT-PCR及Western blot技术筛选出COX5A表达水平最高的品系,建立稳定的COX5A过表达小鼠模型;一般首建鼠合笼后可以得到数只F0代鼠,为排除不同插入位点对PDGF-BB表达的影响,运用RT-PCR及WB技术对F0代鼠产下的子代(F1代鼠)进行COX5A的基因和蛋白表达检测,筛选出最高表达的品系,留种繁殖。本发明共获得4个品系的COX5A过表达转基因F0代鼠,分别为Founder 35、22、26、28号。
如图2a所示,与WT组相比,COX5A的mRNA在四个首建鼠中均显著表达增加;如图2b所示,与WT组相比,COX5A蛋白在四个首建鼠中均显著表达增加,*,P<0.05;
实施例2低表达BDNF转基因鼠模型的构建:
包括以下实验步骤:
步骤1、CMV-EmGFP-siRNA-BDNF低表达转基因片段的构建:沉默表达载体CMV-EmGFP-siRNA-BDNF购买自Invitrogen公司,并用该公司网站提供的软件针对目的基因BDNF[BDNF brain derived neurotrophic factor(Mus musculus),GeneID:12064]的靶位点为(CCAAGTGTAATCCCATGGGTT),设计沉默的质粒,然后由中美泰和公司完成质粒构建。
步骤2、构建好的沉默质粒转染293T细胞,然后用RT-PCR的方法筛选出沉默效果好的构建,如图3所示,与对照组及其他3个干扰质粒相比,转染了47号BDNF低表达转基因质粒的细胞BDNF的表达显著降低了,留作后续使用;C为对照组,16、26、46、47为4个BDNF低表达沉默质粒的编号;其中,47号质粒干扰BDNF表达的效率最高,留作后续使用;
步骤3、用AvrII将干扰效率最高的47号沉默质粒线形化,获得转基因片段(图4),调整浓度至5ng/μL,用于显微注射。
步骤4、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠,方法如前述;PCR鉴定阳性转基因鼠:运用RT-PCR及Elisa技术筛选出BDNF表达抑制率最高的品系,建立稳定的BDNF低表达小鼠模型;一般首建鼠合笼后可以得到数只F0代鼠,为排除不同插入位点对BDNF表达的影响,运用RT-PCR及Elisa技术对F0代鼠产下的子代(F1代鼠)进行BDNF的基因和蛋白表达检测,筛选出最低表达的品系,留种繁殖。本发明共获得4个品系的BDNF低表达转基因F0代鼠,脚趾编号分别为9号、39号、34号、21号,如图4-b所示;包含以下实验步骤:
A.PCR法鉴定F1代阳性转基因鼠,阳性者作为实验组,阴性者作为同窝野生型对照;
B.取材。每个品系首建鼠的F1代阳性转基因鼠雌雄不限,每个品系7只,麻醉后迅速取出大脑皮质及海马,每个部位分成两份(一份用于RT-PCR检测,另一份用于蛋白表达检测),预冷生理盐水冲洗干净后,分别放入干净EP管中-80℃冻存或立即进行实验检测。
C.RT-PCR法检测F1代阳性BDNF低表达转基因鼠。取组织后,按150mg/1.5mlTRIZOL的比例,放入预加了预冷的TRIZOL试剂的匀浆器中,冰浴下匀浆至不粘无颗粒,逐步离心分离、提取RNA;新提取的RNA用DEPC处理过的双蒸水溶解后,紫外分光光度计检测RNA样品的纯度和浓度;取2μg RNA用于逆转录反应,用逆转录试剂盒以RNA为模板合成cDNA链,使用的是RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase酶体系,合成的cDNA可直接用于PCR检测反应。每个样本取cDNA模板1.5μl,加入2×PCR Master Mix(Fermentals)12.5μl、上、下游引物各0.5μl,引物序列为:
上游引物:5'TGTGACAGTATTAGCGAGTGGGT 3',其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
下游引物:5'TACGATTGGGTAGTTCGGCATT 3',其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,
加去离子水补足25μl反应体系,94℃ 5分钟,94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟共35个循环,最后72℃ 5分钟,完成PCR检测反应;PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测;以GAPDH为参照基因,电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行,用BIO-RAD公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析,计算各组BDNF基因条带与GAPDH积分光密度值的比值,得出每个样本BDNF基因的相对表达量,如图5a所示。
D.Elisa法检测F1代阳性BDNF低表达转基因鼠皮质和海马BDNF的表达水平。取组织后,将各组织放入含有0.05M Tris-HCl(pH 7.4,Amresco),0.5M EDTA(Amresco),30%TritonX-100(Amresco),NaCl(Amresco),10%SDS(Sigma)和1mM PMSF(Amresco)的裂解液中冰浴下匀浆,直到无肉眼可见组织块;离心、取上清液,BCA(Sigma,St.Louis,MO,USA)试剂盒检测蛋白含量;BDNF-ELISA kit(B&D)试剂盒检测各样品的BDNF含量,如图5b所示。
取不同品系小鼠皮质和海马进行BDNF的表达检测,最终确定出BDNF表达率抑制率最高的品系为Founder 39,大量繁殖备用。挑选其作为种鼠品系繁殖双杂交鼠。与COX5A过表达最高的品系Founder 35繁殖杂交,构建双杂交鼠。
如图5所示,BDNF在BDNF低表达转基因小鼠4个品系(Founder 39,Founder 9,Founder 21,Founder 34)皮质和海马的表达检测结果,BDNF(基因/蛋白)的表达抑制率计算公式:BDNF表达抑制率=O.D.(WT-Founder)/O.D.WT X 100%(O.D.means opticaldensity),Founder为具体某一品系,WT为野生型,O.D.为积分光密度值。由此公式计算得出:相较于其他品系,BDNF在Founder 39的表达抑制率最高,平均为55.23%,故确定BDNF表达抑制率最高的品系为Founder 39,留作后续实验研究。其余各品系PDGF-BB过表达率分别为Founder 9 41.05%,Founder 21 53.55%,Founder 34 1.2%。
实施例3过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型(COX5A-UP/BDNF-DO)的构建
将COX5A过表达最高品系Founder 35以及BDNF低表达最低品系Founder 39F1代合笼,从子代鼠中获得过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠,具体步骤为两种品系转基因鼠合笼后获得子代鼠,对子代鼠进行基因型检测,PCR法在鼠尾基因组DNA中同时检测到COX5A过表达转基因鼠基因型以及BDNF低表达转基因鼠基因型片段的小鼠,即为过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠。
由图6可知,在转基因鼠尾DNA中同时检测到以上两片段,说明构建过表达COX5A与低表达BDNF双杂交鼠成功。
实施例4Morris水迷宫评价双杂交转基因小鼠的学习记忆功能改变
由图7可知,与野生型相比,过表达COX5A/低表达BDNF双杂交转基因鼠、低表达BDNF转基因小鼠要花费更多的时间寻找平台,且其在撤出平台后目标象限停留的时间显著减少,而低表达BDNF转基因小鼠更为严重,逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短;与过表达COX5A组相比,过表达COX5A/低表达BDNF双杂交转基因鼠逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短。以上结果说明,BDNF低表达后由COX5A过表达介导的学习记忆能力的改善作用削弱了,侧面说明COX5A改善转基因小鼠学习记忆能力的作用与BDNF密切相关(实验方法参照以下文献:①Hebda-Bauer EK,Luo J,Watson SJ,Akil H(2007)Female CREBalphadelta-deficient mice show earlier age-related cognitive deficits thanmales.Neuroscience 150:260-272;②Pouzet B,Zhang WN,Feldon J,Rawlins JN(2002)Hippocampal lesioned rats are able to learn a spatial position using non-spatial strategies.Behav Brain Res 133(2):279-291)。
实施例5神经电生理技术检测海马LTP:
由图8a可知,在记录脑片的海马CA1区域随着电刺激强度的增加,记录到的兴奋性突触后电位(fEPSP)信号也成比例的加大,说明记录区脑片的细胞活力良好,细胞状态稳定,可以完成后续实验;由图8b-8d可知,在经过20分钟静息状态记录后给予连续高强度电刺激(60分钟),过表达COX5A转基因小鼠脑片呈现出较高的突触后电位(fEPSP),与野生型相比,差异具有显著性,说明COX5A过表达后小鼠海马的神经可兴奋性增加,间接反映了学习记忆能力的提高,与之前的实验结果一致;而低表达BDNF转基因小鼠以及双杂交转基因小鼠海马脑片突触后电位(fEPSP)显著下降,尤其是低表达BDNF转基因小鼠组,双杂交转基因小鼠组与低表达BDNF转基因小鼠组相比,fEPSP有所提高;说明:COX5A介导的小鼠神经可兴奋性增加与BDNF密切相关,可能通过对BDNF通路的调节而实现(实验方法参照以下文献:①Hebda-Bauer EK,Luo J,Watson SJ,Akil H(2007)Female CREBalphadelta-deficientmice show earlier age-related cognitive deficits than males.Neuroscience 150:260-272;②Pouzet B,Zhang WN,Feldon J,Rawlins JN(2002)Hippocampal lesionedrats are able to learn a spatial position using non-spatialstrategies.BehavBrain Res 133(2):279-291)。
实施例6免疫荧光染色评价转基因小鼠海马的形态学改变检测COX5A与BDNF在细胞内的亚定位:
取COX5A高表达/BDNF低表达双杂交F1代转基因鼠,常规麻醉、灌注取材,取材部位为整个中枢神经系统及脊髓,取出组织置于4%多聚甲醛中固定24小时,梯度蔗糖脱水,制作20-μm冰冻切片,按下列步骤完成免疫组化检测:0.01M PBS漂洗5min,共3次;加入含有5%羊血清和0.3%Triton X-100的封闭37℃孵育30min;分别用一抗COX5A(1:200,SantaCruz)、NeuN(1:500,Chemicon)、GFAP(1:500,Santa Cruz)、NF-100(1:4,000,Immunostar),以及BDNF(1:1,000,Chemicon),4℃孵育过夜;0.01M PBS漂洗3次,每次5min;荧光二抗37℃孵育2h;用含有DAPI的Antifade Mounting Medium(Beyotime)复染细胞核。显微镜下观察,拍照。
由图9可知,COX5A与BDNF共同存在于神经元中,主要为胞浆内,即COX5A通过对BDNF的调节参与到了小鼠学习记忆改善的过程中。
实施例7Golgi染色检测转基因小鼠海马神经元及棘突的改变
具体操作步骤为:随机取各组转基因鼠及同窝对照野生型鼠,每组各3只,常规麻醉动物;经左心用预冷得生理盐水灌注冲洗三次,每次30ml,冲洗净血液直至澄清;即刻取出脑组织,用无菌手术刀将脑组织切成0.3厘米厚的组织块;使用FD Rapid Golgi stainkits(FD Neuro Technologies,Baltimore,MD,USA)试剂盒进行染色检测。Golji染色的神经元评价方法参照文献报道的标准(A.N.Hoffman,A.Krigbaum,J.B.Ortiz,A.Mika,K.M.Hutchinson,H.A.Bimonte-Nelson and C.D.(2011)Conrad Recovery after chronicstress within spatial reference and working memory domains:correspondencewith hippocampal morphology.European Journal of Neuroscience,34;1023-1030.),只有符合以下条件的海马神经元才可以被选择作为评价对象:i)整个神经元胞体及突起均被染料浸透并着色,无截断的;ii)被选择的神经元与周围的神经元相隔一定的距离,相对独立;iii)被选择的神经元位于海马CA1区。每例动物必须拥有至少三个符合以上条件的神经元,才能用于评价。测量每一神经元顶端(远端)及近端树突的长度并对分支的数量进行计数。
由图10可知,COX5A过表达可以显著增加转基因小鼠海马的神经元长度和棘突的数量,此为学习记忆的物质基础,也解释了COX5A过表达转基因小鼠优于同月龄野生型小鼠的学习记忆认知表现;而在过表达COX5A的背景下BDNF低表达以后,双转基因鼠海马神经元突起的数量明显减少,与双转基因小鼠的水迷宫测试结果一致,说明COX5A可能通过调节BDNF实现改善小鼠海马神经元的突起数量,进而影响使用动物的认知功能。
实施例8提取各品系转基因小鼠海马线粒体,进行线粒体活性及ATP含量的测定:
使用Mitochondria preparation kit(Sigma,Saint Louis,Missouri,USA)试剂盒制备转基因小鼠海马线粒体,Cytochrome c Oxidase kit(Sigma,Saint Louis,Missouri,USA)试剂盒用于检测线粒体细胞色素C氧化酶的活性;ATP Colorimetric/Luminescence Assay kit(BioVision Incorporated,Milpitas,South MilpitasBlvd.Milpitas,CA)用于检测线粒体中ATP含量,操作步骤均按照试剂商提供的说明书指示进行。
由图11可知,COX5A过表达显著增加了转基因鼠海马线粒体活性及ATP含量,而在过表达COX5A的背景下低表达BDNF以后,双转基因鼠海马线粒体活性降低、ATP含量减少,说明COX5A发挥作用可能依赖于对BDNF的调控。
实施例9COX5A发挥作用是依赖于BDNF信号通路的验证
取6月龄、18月龄COX5A过表达转基因鼠海马,用Western blot法检测海马中BDNF、BDNF相关信号通路分子ERK1/2及其磷酸化水平的改变,具体步骤为:将各组海马组织放入含有0.05M Tris-HCl(pH 7.4,Amresco),0.5M EDTA(Amresco),30%TritonX-100(Amresco),NaCl(Amresco),10%SDS(Sigma)和1mM PMSF(Amresco)的裂解液中冰浴下匀浆,直到无肉眼可见组织块;离心、取上清液,BCA(Sigma,St.Louis,MO,USA)试剂盒检测蛋白含量;每个样品取50μg蛋白检测BDNF、ERK1/2以及p-ERK1/2的蛋白表达,12%SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗抗体孵育包括BDNF(1:800,Abcam)、ERK1/2(1:500,Abcam)和p-ERK1/2(1:1000,Abcam)、二抗孵育、化学发光法检测BDNF、ERK1/2和p-ERK1/2相对表达量,GAPDH作为内参,计算各组目的蛋白印迹条带与GAPDH积分光密度值的比值,得出每个样本BDNF、ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白的相对表达量。
由图12可知,COX5A过表达后(6月龄、18月龄)转基因鼠海马中BDNF、BDNF相关信号通路分子ERK1/2及其磷酸化水平与野生型组相比均显著增加,尤其以18月龄组更为显著,可以理解成为COX5A过表达后可以显著减少岁月龄增加而降低的BDNF信号通路的活性,从而发挥其改善认知、抗老化的作用。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例,但如前所述,应当理解发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围,则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (3)
1.一种过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、构建过表达COX5A转基因鼠模型;
步骤2、构建低表达BDNF转基因鼠模型;
步骤3、构建过表达COX5A/低表达BDNF转基因鼠模型:两种品系转基因鼠合笼后获得子代鼠,对子代鼠进行基因型检测,PCR法在鼠尾基因组DNA中同时检测到COX5A过表达转基因鼠基因型以及BDNF低表达转基因鼠基因型片段的小鼠,即为过表达COX5A 与低表达BDNF双杂交鼠。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述构建过表达COX5A转基因鼠模型具体为:
步骤1.1、PCR克隆扩增目的基因COX5A的开放读码框,其中,基因COX5A的登录号为:GeneID: 12858;扩增引物序列如下:
上游引物为 5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′;
下游引物为 5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′;目的片段 386bp;
步骤1.2、 pcDNA3.1(+)-m-COX5A质粒构建:经过酶切、DNA片段回收、连接反应用内切酶EcoRI与XhoI酶切pcDNA3.1(+/-) Vector载体和插入的目的片段COX5A的ORF;
步骤1.3、将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取,通过大量制备质粒DNA,电泳、用 Qiagen DNA凝胶回收试剂盒回收DNA片段;
步骤1.4、用SephedexG 50的凝胶柱纯化DNA,用TE溶液对DNA进行溶解回收;
步骤1.5、回收片段,用于显微注射,用0.22µm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释DNA样品,12000g,离心2小时,上清液的2/3进行分装;
步骤1.6、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠;
步骤1.7、PCR法鉴定阳性转基因鼠,转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记,收集剪下的组织,用碱裂解法提取基因组DNA,利用特异引物通过PCR法进行检测,检测引物序列如下:
上游引物为 5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′;
下游引物为 5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′;
PCR鉴定阳性者作为实验组,阴性者作为同窝野生型对照;获得表达386bp目的片段的COX5A过表达转基因小鼠,共4个品系,根据脚趾编号分别命名为Founder35,Founder22,Founder26和Founder28;
步骤1.8、运用RT-PCR及Western blot技术筛选出COX5A表达水平最高的品系,建立稳定的COX5A过表达小鼠模型;首建鼠合笼后得到数只F0代鼠,为排除不同插入位点对PDGF-BB表达的影响,运用RT-PCR及WB技术对F0代鼠产下的子代进行COX5A的基因和蛋白表达检测,筛选出最高表达的品系,留种繁殖;获得COX5A过表达转基因F0代鼠。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述构建低表达BDNF转基因鼠模型具体为:
步骤2.1、CMV-EmGFP-siRNA-BDNF低表达转基因片段的构建:沉默表达载体CMV-EmGFP-siRNA-BDNF购买自Invitrogen公司,并用该公司网站提供的软件针对目的基因BDNF的靶位点,其中,目的基因BDNF的登录号为GeneID:12064;靶位点为CCAAGTGTAATCCCATGGGTT,设计沉默的质粒,然后由中美泰和公司完成质粒构建;
步骤2.2、构建好的沉默质粒转染293T细胞,然后用RT-PCR的方法筛选出沉默效果最好的构建;
步骤2.3、用AvrII将干扰效率最高的沉默质粒线形化,获得转基因片段,调整浓度至5ng/µL,用于显微注射;
步骤2.4、将构建好的转基因片段线性化,用显微注射法制作转基因小鼠;PCR鉴定阳性转基因鼠。
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