CN116042619B - 用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其应用。该gRNA组合的应用包括将供体DNA和合理设计的gRNA组合引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，从而在所述gRNA组合引导下通过所述Cas9蛋白靶向敲除所述果蝇受精卵中的caz基因并通过同源重组获得所述供体DNA敲入的工程化改造的果蝇受精卵。该模型能够使人源FUS蛋白表达具有和果蝇caz基因同样的组织特异性且表达量维持在正常生理水平，有利于反映病人体内的真实情况，为发病期较晚的神经退行性疾病的发病机制研究和药物靶点筛选提供了更优越的选择。

Description

用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其 应用

技术领域

本申请涉及生物医学领域，更具体地，涉及一种用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其应用。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种运动神经元退行性疾病，由遗传和环境等多因素引发，其中约5％的家族性ALS和1％的散发性ALS是由FUS基因突变引起。FUS蛋白是一种RNA结合蛋白，参与RNA代谢的多个方面，包括剪接、运输和翻译。传统的转基因模型常因致病基因的过量表达引起非生理人工表型，由此在药效验证和病理机制研究中的应用具有争议。因此，需要一种构建突变致病模型的方法，用于探索FUS突变而不是过量表达在ALS发病机制中扮演的角色及ALS治疗方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明的实施例提出了一种用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的分离的核酸集及其应用。

一方面，本发明的实施方案提供了一种分离的核酸集，该核酸集为具有SEQ IDNO:1所示序列的核酸与具有SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4所示序列的核酸的至少一个的组合。

在一些实施方案中，所述核酸集为具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示序列的核酸的组合。

另一方面，本发明的实施方案提供了所述的分离的核酸集在构建构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型中的用途，包括将供体DNA和gRNA组合引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，从而在所述gRNA组合引导下通过所述Cas9蛋白靶向敲除所述果蝇受精卵中的caz基因并通过同源重组获得所述供体DNA敲入的工程化改造的果蝇受精卵，其中所述供体DNA包含第一同源臂、所述人源FUS基因和第二同源臂；所述gRNA组合为SEQ ID NO:1与SEQ IDNO:2至SEQ ID NO:4的至少一个的组合，SEQ ID NO:1指导所述Cas9蛋白在所述caz基因的上游进行敲除；SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4的至少一个指导所述Cas9蛋白在所述caz基因的下游进行敲除，优选地SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4共同指导所述Cas9蛋白在所述caz基因的下游进行敲除。

在一些实施方案中，供体DNA和gRNA组合以4:1-1:1，优选4:1的质量比引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中。

在一些实施方案中，人源FUS基因为野生型FUS基因、FUS-R521C突变体、FUS-R524S突变体或FUS-P525L突变体。

在一些实施方案中，供体DNA构建在第一载体中，优选地第一载体还包含筛选标记和酶切位点，优选地第一载体为表达载体，该表达载体为慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、piggyBac表达载体或Sleeping Beauty转座载体。

在一些实施方案中，gRNA构建在第二载体中，优选地第二载体还包含启动子和终止子，优选地第二载体为pCFD5质粒，所述启动子是U6。

在一些实施方案中，第一载体从5'端至3'端依次包含1500bp的第一同源臂、3×FLAG-EGFP标记、人源FUS基因、DsRed标记盒和1500bp的第二同源臂，优选地，第一载体在DsRed标记盒两侧还包含LoxP位点。

在一些实施方案中，构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的方法还包括使工程化改造的受精卵发育为FUS基因敲入的初代果蝇个体，并将FUS基因敲入的初代果蝇个体与w1118果蝇杂交并与初代果蝇个体回交至少1代、优选6代，以获得FUS基因敲入的纯合果蝇个体。

在一些实施方案中，人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型为各个发育阶段的果蝇和/或分离自果蝇的组织或细胞。

在一些实施方案中，人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型表现为寿命缩短、年龄依赖性运动和协调能力障碍和生殖能力下降。

在一些实施方案中，所述人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型或其品系用于筛选ALS相关疾病的药物。

利用本发明实施方案中提供的核酸集构建的人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型，具有以下有益效果：制备出的模型能够利用内源caz基因的启动子驱动导入的人源FUS基因的内源性表达，从而使FUS蛋白表达具有组织特异性且表达量维持在正常生理水平，解决了之前转基因模型中因过量表达而带来的剂量毒性效应。同时，与转基因动物中的全身组成型表达对比，更能反映病人体内的真实情况。给发病期较晚的神经退行性疾病，如ALS的发病机制研究和药物靶点筛选提供了更优越的选择。

附图说明

图1显示了根据本发明实施例的构建FUS基因敲入的ALS果蝇模型的方法示意图和基因型鉴定结果示意图，其中(a)图上半部分示出了野生型果蝇X染色体上caz基因附近的片段，下半部分为donor质粒的图谱，包含左右两个各1500个碱基长度的同源片；3×FLAG标签和EGFP在N端融合表达的FUS基因(包含WT或R521C)的中间片段；以及被两个LoxP位点包围的红色荧光蛋白DsRed表达单元；另标记了所用到的4对引物分别对应的结合位点，其中(b)图根据本发明实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型的基因型鉴定结果示意图，(c)图示出了FUS第521位氨基酸位点附近的PCR产物片段测序结果，高亮区域为编码第521位氨基酸的DNA序列。

图2显示了根据本发明实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中为基因敲入而设计的Cas9切割靶点位置示意图，图中所示为果蝇X染色体上caz基因，其中深色区域为蛋白编码区，图中还示出了实施例中用到的4条gRNA结合位点以及其对应的On-Target Score(通过计算预测的打靶指数)(Doench et al.,2016)，并且标记出了左右长度各1500碱基的同源臂。

图3显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中多gRNAs表达载体的构建流程示意图，图中上半部分展示了pCFD5载体包含的序列结构，在U6启动子后面紧接的是包含两个BbsI酶切位点的gRNA-tRNA重复序列；图中下半部分显示了通过PCR扩增核无缝克隆构建目的载体的方法。

图4显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中荧光蛋白整体表达示意图，在相同曝光时间下获得的三种不同基因型果蝇的明场，红色荧光蛋白DsRed信号和绿色荧光蛋白EGFP-FUS信号的图像，(a)图中的白色箭头指示出有明显EGFP信号高表达的果蝇幼虫中枢神经系统区域。图中两个比例尺长度都为500um。

图5显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中FUS-WT和FUS-R521C两个品系的蛋白表达量示意图，(a)中示出了用成年雄性果蝇全身组织提取的蛋白做免疫印迹的实验结果，分别使用了人源的FUS抗体和FLAG抗体进行检测，同时用Tubulin抗体作为内参；(b)中示出了FUS蛋白表达量的定量分析结果，3次独立重复实验，统计方法为“Unpaired t test”，N.S.表示p>0.05。

图6显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中基因敲入果蝇的FUS在体内组织特异性表达示意图，图为FUS-R521C基因敲入品系幼虫固定在载玻片上用激光共聚焦显微镜扫描的图像，黑白通道为明场，绿色通道为EGFP信号，比例尺长度为100um。

图7显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中FUS蛋白在成蝇和幼虫的中枢神经系统的表达示意图，(a)中示出了羽化3天的成年果蝇全脑免疫荧光染色结果，比例尺长度为100um；(b)图中示出了三龄幼虫中枢神经系统(包含脑和腹侧神经节)的免疫荧光染色结果，比例尺长度为50um，红色通道为人源的FUS抗体信号，绿色通道为EGFP自身的荧光信号。

图8显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中子代胚胎致死表型统计示意图，图中示出了羽化后子代雄蝇中正常眼睛果蝇的只数除以所有雄蝇只数计算百分比的统计结果，统计方法为单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验重复次数为:caz-KO/FM7，n＝5；FUS-WT/FM7，n＝7；FUS-R521C/FM7，n＝4；***表示p<0.001，N.S.表示p>0.05。

图9显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中FUS突变体果蝇寿命表型示意图，图中示出了每管20只新羽化的雄蝇每三天死亡只数统计图，最终统计的每个基因型总为:caz/Y,n＝107,FUS-WT/Y,n＝70,FUS-R521C/Y,n＝116，统计方法Log-rank(Mantel-Cox)test；N.S.，p>0.05；****，p<0.0001。

图10显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中FUS-R521C果蝇飞行能力分析结果示意图，图中示出了羽化5天雄性果蝇在气流刺激下，caz/Y，FUS-WT/Y，FUS-R521C/Y果蝇的飞行时间，统计方法为单因素方差分析(One-way ANOVA)，n＝10，N.S.表示p>0.05。

图11显示了根据本发明一个实施例的FUS基因敲入的ALS果蝇模型中果蝇步态分析结果示意图，其中上半部分图示出了6条腿的运动幅度随时间变化的曲线，下半部分图示出了爬行步态轨迹图，6种颜色分别对应果蝇的6条腿，果蝇日龄为caz/Y果蝇羽化68天，FUS-WT/Y羽化68天和FUS-R521C/Y羽化53天。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：

ALS由遗传和环境等多因素引发，其中约5％的家族性ALS和1％的散发性ALS由FUS基因突变引起。一方面，传统转基因模型由于致病基因的过量表达经常会引起很多非生理的人工表型(artifacts)。另一方面，在果蝇中过表达人源野生型FUS和ALS相关突变体FUS时，突变体FUS部分定位于胞浆，而野生型FUS只定位在细胞核中。因此，传统转基因模型中的基因过表达在药效验证和病理机制研究中的影响引起了越来越多的争议。

FUS属于FET蛋白家族成员，该家族中还包括EWS、TAF15和caz，而在果蝇中仅存在一种FET家族蛋白caz。在果蝇中将caz敲除后会导致成蝇生存能力降低、寿命变短、运动神经元终末分支缩短以及幼虫和成年阶段的运动障碍。因此果蝇基因组中与FUS基因同源的是caz基因，在进化过程中FUS和caz的功能也具有保守性。

caz基因是果蝇基因组中FUS的同源基因，通过基因定点敲入的方法将人源FUS的正常cDNA和R521C突变体分别替换掉果蝇体内的caz基因的编码区，并利用内源caz基因的启动子驱动FUS蛋白的表达，可以使FUS蛋白表达具有组织特异性且表达量维持在正常生理水平。通过表型分析证明本申请实施例中的果蝇模型可以部分模拟ALS疾病的发病过程，为开展遗传和药物筛选提供了非常有价值的研究工具。

实施例1

1.1基因敲入的供体载体设计和构建

基因敲入需要提供同源重组所需供体DNA，该供体DNA载体包含第一同源臂、人源FUS基因、第二同源臂以及辅助筛选阳性标记盒。76#PHD-DsRed是带有DsRed标记盒的供体载体，DsRed标记盒两侧有LoxP位点。该载体可用于构建有针对性的插入、缺失、SNP或任何其他修饰，并且对位点的干扰最小。在通过DsRed标记的红色荧光蛋白信号筛选鉴定到正确品系之后，标记盒可以通过与表达Cre转座酶的品系杂交移除，从而只留下敲入的基因。

(1)通过PCR反应从野生型果蝇的基因组中扩增得到1500碱基的第一同源重组臂；

(2)人工合成序列N端标记有3×FLAG-EGFP的人源FUS基因正常cDNA和编码R521C突变的DNA序列以及1500碱基的第二同源重组臂，并扩增；

(3)将设计好的三个片段和用NotI/PstI酶切线性化的76#PHD-DsRed质粒通过Gibson无缝克隆技术构建到作为基因一起敲入donor质粒获得目标供体载体(图1(a))。

1.2gRNA设计与构建

DNA双链断裂(DNAdouble-strand break,DSB)可以显著提升同源重组效率。增加基因敲入同源重组发生的概率。基于采用CRISPR/Cas9技术在果蝇的caz基因上设计的靶向切割位点，Cas9蛋白可以识别靶向位点并进行切割产生DNA双链断裂。此外，pCFD5载体表达系统在U6启动子控制下，可以同时表达一个或多个gRNAs，通过将gRNA识别序列构建到引物上，以pCFD5为模板用PCR的方法扩增出完整gRNA-tRNA片段，再与线性化的pCFD5骨架通过无缝克隆的方式组装到一起即可构建出多gRNAs表达载体。

(1)确定gRNA序列

a.根据gRNA结合位点、对应的计算预测的中靶效率指数(Efficiency Score)和特异性指数(Specificity Score)，设计引导RNA(Guide RNA，gRNA)，如表1所示。

表1gRNA序列信息

b.基于敲入携带R521C突变的人源FUS基因到果蝇中需要双gRNA的指导，发明人选择SEQ ID NO:1指导Cas9蛋白在caz基因的上游进行酶切，并选择SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4的任一个或它们的组合指导Cas9蛋白在caz基因的下游进行酶切。

c.将相应gRNAs的分别与供体DNA引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵，产生红色荧光信号的果蝇表明获得了正确基因敲入。

d.统计正确敲入的果蝇数以及总果蝇数，计算基因敲入成功率。

由下表2可见在不同gRNAs的组合指导下获得的基因敲入果蝇中，获得正确基因敲入的果蝇数量相差明显，其中当使用SEQ ID NO:1指导Cas9蛋白在caz基因的上游进行酶切，并使用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4三者共同指导Cas9蛋白在caz基因的下游进行酶切，然后通过同源重组后获得的正确基因敲入果蝇数量最多，其基因敲入成功率高达18.4％，明显高于使用SEQ ID NO:1指导Cas9蛋白在caz基因的上游进行酶切，并使用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的任一个共同指导Cas9蛋白在caz基因的下游进行酶切低于2％的基因敲入成功率。因此，最终采用了如图3所示的将多个gRNA同时装入一个gRNA载体的设计，以用于高效地实现长片段的替换。多个gRNA的具体位置如图2所示，从5’端至3’端的方向，以gRNA1、gRNA4、gRNA3和gRNA2的顺序排列。其中，以caz基因为中心，gRNA1能够在其上游互补配对，gRNA4、gRNA3和gRNA2以上述顺序在其下游互补配对。

表2不同gRNA组合指导下的果蝇基因敲入成功率

(2)准备载体骨架：用BbsI限制性内切酶(NEB)对pCFD5质粒进行酶切。反应体系为1uL酶(10u)和3uL 10x缓冲液配成30uL反应体系用来消化8ug DNA，在37℃条件下反应4hour。将消化后的质粒用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切下载体骨架条带(9.6kb)，用试剂盒回收纯化DNA，洗脱于25uL无菌水中，并测定DNA浓度。

(3)准备gRNA插入片段：以pCFD5为模板，用含有gRNA序列的引物分别进行PCR扩增。使用Q5高保真聚合酶(NEB)，退火温度为61℃，每个循环增加0.5℃，直到达到72℃的温度(总循环数为32)。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中分离。切下正确的目的条带，使用试剂盒回收纯化DNA。

(4)连接反应：使用50ng消化的pCFD5骨架和2倍摩尔量的每个插入片段配制15uLGibson组装反应。50℃孵育1小时。

(5)转化：反应结束后取2uL转化到70uL感受态细胞，在氨苄青霉素平板上培养37℃培养过夜。

(6)菌落PCR鉴定:用接种针挑取单个菌落，溶解在10uL含有氨苄青霉素的细菌培养基中。取1uL使用Taq聚合酶(NEB)做PCR菌落鉴定反应。

(7)将鉴定为阳性菌落药菌提取质粒并用上面相同的引物测序获得目标的gRNA表达载体(图3)，其中包含核酸序列如SEQ ID NO:1所示的gRNA1、序列如SEQ ID NO:2所示的gRNA2、序列如SEQ ID NO:3所示的gRNA3、序列如SEQ ID NO:4所示的gRNA4中的至少一个，优选的，包含gRNA组合4中的序列。

1.3初代FUS敲入果蝇的获得

(1)将不同比例的供体载体以及合理设计的多gRNA表达载体组合到一起以固定比例引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，以获得工程化改造的受精卵，并获得两个正确的基因敲入品系及其所对应的引入比例。

a.将不同比例的供体载体以及上述组合的gRNA表达载体组合到一起以固定比例引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，产生红色荧光信号的果蝇表明获得了正确基因敲入。

b.统计正确敲入的果蝇数以及总果蝇数，计算基因敲入成功率。

由表3可知，供体载体的引入比例对基因敲入成功率的影响较大。将供体DNA和gRNA以4:1、1.9:1、1:1的比例引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中时，4:1的比例能够获得高达20％的基因敲入成功率。

表3引入比例对基因敲入成功率的影响

序号	供体DNA模板质粒	gRNA表达质粒	基因敲入成功率(％)
				1	1.6μg	0.4μg	20
2	1.3μg	0.7μg	5
				3	1μg	1μg	1

(2)荧光标记筛选：FUS敲入果蝇同时表达DsRed蛋白表达的红色荧光信号与EGFP的绿色荧光信号。在上述引入比例下获得的幼虫和成蝇都有很强的DsRed蛋白表达的红色荧光信号(图4)，EGFP的绿色荧光信号因为是在内源基因caz的启动子控制下，所以表达量相对较低，但在体式显微镜下高放大倍数仔细辨认后也可以看出和对照组的明显差别。图4(a)中箭头所指的结构正是幼虫的中枢神经系统，包含脑和腹部神经节(ventralnervecord,VNC)，这些组织的信号明显强于周边其他组织，这说明FUS基因在中枢神经系统具有相对较高的表达量；

(3)基因型鉴定和测序：针对明显表达荧光标记的FUS敲入果蝇进基因型测定与测序。具体步骤如下所示：

a.按照如下配方配制抽提缓冲液(squishing buffer)；

表4抽提缓冲液配方

成分	终浓度
		Tris-Cl EDTA pH 8.0	10mM
EDTA pH 8.0	1mM
		NaCl	25mM
蛋白酶K	0.2mg/mL

b.每只果蝇用50uL抽提缓冲液研磨；

c.将研磨液转移到PCR仪里运行如下程序裂解组织提取DNA；

表5提取果蝇基因组DNA程序

温度	时间
		37℃	30min
95℃	2min
		4℃	保持

d.反应结束后取1uL做模板，按照下表配制反应体系；

表6基因型鉴定反应体系

试剂	体积(ul)
		2x Taq DNA聚合酶	10
去离子水	7
		正向引物	1
反向引物	1
		基因组DNA	1
总体积	20

e.将反应液混匀后稍作离心转移到PCR仪器里运行如下程序；

表7基因型鉴定PCR程序

步骤	温度	时间
			1	94℃	3min
2	94℃	30s
			3	55℃	30s
4	72℃	30s
			重复	步骤2～4	35个循环
6	72℃	10min
			7	4℃	保持

f.取5uL反应液加入到琼脂糖凝胶电泳中分析结果。

g.获得两个品系的初代FUS敲入果蝇个体,其鉴定结果与设计一致，而且测序结果也表明R521C品系在正确的位点存在正确的氨基酸突变(图1(b)，(c))。

1.4获得二代FUS敲入果蝇个体

初代FUS敲入果蝇与w¹¹¹⁸品系果蝇回交6代，并与X染色体表达Cre蛋白的果蝇进行杂交，以获得去除DsRed标记盒的新品系二代FUS敲入果蝇个体。

1.5获得人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型

使二代FUS敲入果蝇个体与w¹¹¹⁸品系再次回交6代后得到纯合品系保种，将该两种品系命名为FUS-WT和FUS-R521C，最终获得人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型。

实施例2

2.1FUS蛋白表达模式分析

(1)FUS蛋白表达量分析：利用免疫印迹实验分析了两种果蝇品系中FUS蛋白表达量的差异，统计结果表明两者之间的FUS表达总量并没有显著差异。ALS病人中出现的R521C点突变可能会通过影响FUS蛋白表达总量发生变化从而影响其正常功能，而本实施例的人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型未出现这种情况(图5)。

(2)FUS蛋白表达组织特异性分析

用激光共聚焦显微镜局部放大扫描，如图6所示FUS-R521C品系幼虫口器的局部放大扫描图像，几乎所有细胞都有不同程度的EGFP信号说明这些细胞中都有FUS蛋白的表达。

对两个品系的果蝇进行全脑免疫荧光染色。如图7中所示，无论是在成蝇还是在幼虫中，FUS蛋白在神经系统中都是广泛表达的，而且表达模式和表达量在FUS-WT和FUS-R521C之间都没有明显差异。此外，FUS抗体的信号和EGFP的自发荧光信号能够很好的共定位，进一步验证了用融合EGFP标签来标记FUS蛋白的可靠性。

对FUS蛋白表达模式的分析结果说明，基因敲入策略成功实现了利用果蝇内源caz的启动子驱动人源FUS基因的表达，在保证了组织特异性表达的同时也规避了传统转基因方法过量表达而带来的剂量毒性效应等弊端，能更好的模拟生理病理过程。

2.2致死与寿命表型分析

果蝇内源caz基因敲除会使成虫存活率降低、运动速度减慢和寿命缩短。在本申请的实施例中构建的人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型也相当于敲除了内源的caz基因，因此分析了相关表型。

(1)所构建的基因敲入品系，无论是FUS-WT果蝇还是FUS-R521C果蝇都没有表现出纯合致死的表型。而另一个caz基因敲除品系(J82#caz1/FM7(actin::GFP)；+/+；+/+)则表现为纯合胚胎致死。

(2)将带有X染色体平衡子FM7的三个品系caz-KO(即caz1)、FUS-WT或FUS-R521C的处女蝇与caz/Y(即w1118)的雄蝇杂交，然后统计子代雄性果蝇中正常复眼和桃心形复眼果蝇的比例。如图8所示，caz-KO/Y的比例几乎为零，而FUS-W/Y或FUS-R521C/Y的比例都接近孟德尔遗传的分离比50％。说明FUS和caz在影响果蝇胚胎发育方面具有功能上的保守性。

(3)对本申请的实施例中的人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型进行寿命统计，如图9所示，FUS-R521C突变体果蝇的存活寿命显著下降，然而与之仅有一个氨基酸差别的FUS-WT果蝇的寿命和对照组并没有显著差异。图9中显示，一个氨基酸的变化导致果蝇的最长寿命从80天降到了60天，而通过整个曲线可以看出在羽化20天后突变体品系已经开始出现陆续死亡的现象，说明R521C突变导致FUS部分功能缺失，从而影响到成蝇的寿命。

因此在本申请的实施例中的人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型中，FUS基因敲入虽然造成了caz基因的敲除，但并没有胚胎致死表型的出现，因此认为模型中的FUS蛋白能够补偿caz敲除导致的功能缺失，从而避免纯合品系胚胎致死。同时，FUS-R521C突变体果蝇的存活寿命显著下降，强调了该突变位点的对于FUS的重要性。

2.3运动能力分析

ALS，以及其他神经退行性疾病，如帕金森氏病(PD)和脊髓小脑性共济失调3(SCA3)，都伴随着明显的步态改变或震颤表型，这些行为的变化反映了潜在的疾病病因。然而，目前尚不清楚突变体果蝇疾病模型中是否也会出现果蝇的运动行为的改变、特定的步态变化和震颤功能障碍。

(1)评估果蝇的运动行为：首先在成蝇羽化5日龄进行了飞行能力分析实验。将果蝇头部固定，在静息状态下，果蝇翅膀处于停止状态，当给予气流刺激，果蝇将开始煽动翅膀，处于飞行状态。在气流刺激后的30秒内，caz/Y和FUS-WT/Y果蝇绝大部分时间处于飞行状态，而FUS-R521C/Y的飞行时间显著减少(图10)。

(2)运动协调性障碍观察：使用开源的机器学习图像分析程序(FLLIT)(Wu etal.,2019)，该程序可以基于特征学习对果蝇的肢体进行精确跟踪，自动跟踪高速视频中自由爬行的果蝇的腿爪的位置，并产生一系列步态测量结果。如图11所示，高龄的FUS-R521C突变体的果蝇模型表现出明显不同的运动步态和震颤特征，这与ALS病人早期的疾病症状相呼应。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1. 一种用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合，其特征在于，所述gRNA组合由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示序列的gRNA组成。

2.根据权利要求1所述的gRNA组合在构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型中的用途，其特征在于，包括：

将供体DNA和所述gRNA组合引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，从而在所述gRNA组合引导下通过所述Cas9蛋白靶向敲除所述果蝇受精卵中的caz基因并通过同源重组获得所述供体DNA敲入的工程化改造的果蝇受精卵，

其中所述供体DNA包含第一同源臂、所述人源FUS基因和第二同源臂；

其中SEQ ID NO:1指导所述Cas9蛋白在所述caz基因的上游进行敲除；

其中SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4的至少一个指导所述Cas9蛋白在所述caz基因的下游进行敲除。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，将所述供体DNA和所述gRNA组合以4:1-1:1的质量比引入所述表达Cas9蛋白的所述果蝇受精卵中。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人源FUS基因为野生型FUS基因、FUS-R521C突变体、FUS-R524S突变体或FUS-P525L突变体。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述供体DNA构建在第一载体中，所述第一载体还包含筛选标记和酶切位点，所述第一载体为表达载体。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述gRNA组合构建在第二载体中，所述第二载体还包含启动子和终止子。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述第一载体从5'端至3'端依次包含1500bp的所述第一同源臂、3×FLAG-EGFP标记、所述人源FUS基因、DsRed标记盒、1500bp的所述第二同源臂和位于所述DsRed标记盒两侧的LoxP位点。

8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型为各个发育阶段的果蝇和/或分离自果蝇的组织或细胞。

9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型或其品系用于筛选ALS相关疾病的药物。