KR100770550B1 - Ｎ형 칼슘 채널 녹아웃 동물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N형 칼슘 채널을 암호화하는 유전자를 파괴하여, 기능성 N형 칼슘 채널을 결실시킨 비사람 동물, 및 당해 동물을 이용한, 혈압의 제어, 통증 전달, 혈당치의 제어 등에 관한 약리 작용을 갖는 물질의 스크리닝법에 관한 것이다.

N형 칼슘 채널, 녹아웃 마우스, 유전자 파괴, 혈압 강하제, 진통제, 혈당치 저하제, 스크리닝법

Description

Ｎ형 칼슘 채널 녹아웃 동물{N-Calcium channel knockout animal}

본 발명은, N형 칼슘 채널을 결실시킨 동물 및 이의 이용에 관한 것이다.

칼슘 채널(Ca 채널)은, 세포내로의 Ca²⁺의 유입을 조절함으로써 세포내로의 정보 전달을 수행하는 막 단백질이다. 이 중에서도 신경 세포·근육 세포 등의 흥분성 세포에 존재하는 전위 의존성 Ca 채널은, 막 전위의 변화를 통해서 전달된 정보를, Ca²⁺ 농도의 상승이라는 세포내 정보로 변환하는 중요한 역할을 하는 단백질이다.

신경 세포 및 근육 세포로부터는 각종 전위 의존성 Ca 채널이 동정되어 있고[참조: Bean, B.P. et al., Ann. Rev. Physiol., 51:367-384, 1989, Hess P., Ann. Rev. Neurosci., 56:337, 1990], 전기 생리학적 성질, 및 길항제에 대한 감수성에 따라, 6개의 형태(L, N, P, Q, R 및 T)로 분류된 다.

이 중 N형 Ca 채널은, 청자 고둥(cone shell)으로부터 분리된 펩타이드 독소 ω-코노톡신 GVIA에 의해 Ca²⁺의 유입이 저해됨으로써 특징지워지는 Ca 채널이다.

칼슘 길항약은, 항협심증약, 항부정맥약 및 고혈압증 치료약으로서 빈번하게 사용되고 있는데, 이의 작용 메카니즘은 세포막에 있는 L형 Ca 채널과 특이적으로 결합하여 세포내로의 Ca²⁺ 유입의 저해에 의한 혈관 평활근 이완 또는 심근 수축력 억제이다. 한편, 신경에 있어서는 Ca²⁺는, 신경 전달 물질 유리, 발화 패턴의 형성, 신경 돌기의 신전 등 정상적인 여러 기능에 중요한 인자인 반면, Ca²⁺ 동태의 변조가 뇌허혈 후에 발생하는 지발성 신경 세포사 또는 특정한 종류의 간질 등의 질환에 깊게 관여하고 있는 것으로 밝혀져 있다[참조: Siesjo, 1986, Mayo Clin Proc 61:299]. 최근 수년동안, L형 및 T형 이외에 신경에 특이적으로 존재하는 P형, N형, Q형 및 R형의 존재가 확인되고, 이러한 Ca 채널의 신경 기능에 대한 역할이 주목받으면서 동시에, 이들을 표적으로 하는 신규한 칼슘 길항약의 개발이 활발히 이루어지려 하고 있다.

특히, N형 Ca 채널은 자율 신경계의 신경 종말에서 발현하는 것으로 보고되어 있고, 자율 신경을 통한 조절에서의 역할이 주목받고 있다[참조: Lane D.H. et al., Science, 239:57-61, 1988, Diane L, et al., Nature 340:639-642, 1989].

종래, N형 Ca 채널에 대한 기능 평가는, 1) 시나프토좀 또는 배양 신경 세포를 사용한 시험관내 실험 또는 2) ω-코노톡신 GVIA를 투여한 생체내 실험에 의해 이루어져 왔다. 1)은 시험관내 실험으로, 생체내의 정확한 N형 Ca 채널에 대한 기능 평가에는 적당하지 않다. 한편, 2)는 생체내 실험이기는 하지만, (1) ω-코노톡신 GVIA의 선택성이 완전히는 해명되어 있지 않고, (2) ω-코노톡신 GVIA는 펩타 이드이므로 신경 세포로의 투과성이 충분하지 않으며, (3) ω-코노톡신 GVIA 투여에서는 만성기 실험은 곤란하다는 등의 점에서 생체내의 정확한 N형 Ca 채널에 대한 기능 평가에는 적당하지 않다.

발명의 개시

상기한 결점을 극복하기 위해, N형 Ca 채널만이 결손되어 만성기 실험이 가능한 N형 Ca 채널 녹아웃 마우스의 제작이 강력히 요망되고 있다.

본 발명의 과제는, N형 Ca 채널의 α_1B 서브유니트를 결실시킨 녹아웃 마우스(이하, N-KO 마우스)를 제작하는 것이다. 이에 따라, 중추 신경계 및 말초 신경계의 신경 종말에서 발현하여, 생체의 호메오스타시스(homeostasis) 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 N형 Ca 채널이, 생체내에서 실제로 어떠한 기능을 담당하여 있는지를 밝힐 수가 있다.

N-KO 마우스는, 자율 신경계를 통한 항상성의 유지, 특히 혈압 제어가 가능하지 않아, 정상적으로는 생존할 가능성이 없었다. 그러나, 정상적으로 생존할 수 없다고 해도, N-KO 마우스에서 보여지는 이상으로부터 N형 Ca 채널의 기능을 추정할 수 있지 않을까라고 생각하여, N형 Ca 채널의 α_1B 서브유니트를 암호화하는 유전자를, 표적화 파괴(targeted disruption)에 의해 파괴한 N-KO 마우스를 제작하는 것을 시도하였다.

그 결과, N-KO 마우스는 개체 발생하고, 발육하여, 또한 자손을 남길 수 있 는 것으로 판명되었다. 또한, N-KO 마우스로부터 절제한 후근 신경절의 신경 세포에서, ω-코노톡신 GVIA에 의해 저해되는 Ca²⁺의 유입이 관찰되지 않는다는 것이 전기 생리학적으로 증명되고, N-KO 마우스에서는 기능성 N형 Ca 채널을 결실하고 있는 것이 확인되었다.

거듭 연구한 결과, N-KO 마우스는, 신경계를 통한 혈압 반사가 없어, 야생형 마우스와 비교하여 통증에 대하여 둔감하며, 혈당치가 낮은 등, N형 Ca 채널의 결실을 원인으로 하는 특유의 성질을 갖는다는 것이 밝혀지고, N-KO 마우스가 N형 Ca 채널의 생체내에서의 기능 해석에 유용하다는 것이 밝혀져, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자를 파괴하여, 기능성 N형 Ca 채널을 결실시킨 비사람 동물(이하, 「본 발명의 동물」이라고 한다)을 제공한다. 바람직하게는 비사람 동물은 설치류이고, 더욱 바람직하게는 마우스이다.

N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자는, 바람직하게는, N형 Ca 채널의 α_1B 서브유니트를 암호화하는 유전자이다. 보다 구체적으로는, 유전자가 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 유전자를 들 수 있다:

(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 구성되는 DNA 또는

(b) 서열 1에 제시된 염기 서열로 구성되는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있으며, 기능성 N형 칼슘 채널의 α_1B 서브유니트를 암호화하는 DNA.

또한, 본 발명은, 본 발명의 동물에게 물질을 투여하고, 당해 물질의 당해 동물에 대한 작용을 측정함을 포함하여, 물질의 작용을 측정하는 방법(이하, 「본 발명의 측정 방법」이라고 한다)을 제공한다.

본 발명의 측정 방법은, 본 발명의 동물 및 야생형의 동물에게 물질을 투여하고, 본 발명의 동물과 야생형의 동물에 대한 당해 물질의 작용을 비교하여, 당해 물질의 N형 칼슘 채널에 관련하는 작용을 측정함을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 측정 방법에 의해, 물질의 약리 작용을 측정함을 포함하여, 약리 작용을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법, 당해 스크리닝 방법에 의해 수득되는, 약리 작용을 갖는 물질, 및 당해 스크리닝 방법에 의해, 약리 작용을 갖는 물질을 스크리닝하고, 수득된 물질을 유효 성분으로서 포함하는 의약을 제조함을 포함하여, 의약을 제조하는 방법을 제공한다.

약리 작용으로서는, 혈압을 강하시키는 작용, 진통 작용 및 혈당치를 저하시키는 작용을 들 수 있다. 이러한 약리 작용을 갖는 물질로부터, 이러한 물질을 유효 성분으로 하는 혈압 강하제, 진통제 또는 혈당치 저하제를 제조할 수 있다.

도 1은, 파아지 DNA 클론의 제한 효소 지도와 pBS59/63/58n.

도 2는, 표적화 벡터의 제작.

도 3은, 표적화 벡터의 제작.

도 4는, 표적화 벡터의 제작.

도 5는, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 N형 Ca 채널을 통과시킨 전류량의 비교.

도 6은, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 심박수와 혈압의 비교.

도 7은, ω-코노톡신을 투여한 N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 혈압 변동의 비교.

도 8은, 양측 경동맥 폐색(BCO: bilateral carotid occlusion)을 수행한 N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 혈압 변동의 비교.

도 9는, 포르말린 시험에 의한 N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 통증에 대한 감수성의 비교.

도 10은, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 혈당치의 비교.

도 11은, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 당 투여 후의 혈당치의 비교.

도 12는, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 당 투여 후의 혈중 인슐린의 비교.

도 13은, N-KO 마우스 및 야생형 마우스의 심방근 수축력에 대한 자율 신경 지배의 비교.

이하에 본 발명의 실시 형태에 대하여 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은, 기능성 N형 Ca 채널을 결실한 마우스가, 개체 발생하고 발육하여 자손을 남긴다는 것을 발견하고, 생체에서의 N형 Ca 채널의 기능의 해석에 유용하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 동물은, 이러한 발견을 바탕으로 하는 것으로, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자를 파괴하여, 기능성 N형 Ca 채널을 결실시킨 비사람 동물임을 특징으로 한다.

유전자를 파괴한다는 것은, 유전자에 변이를 도입하고, 이의 유전자 산물의 기능을 상실하게 하는 것을 의미한다. 유전자의 파괴 방법으로서는, 표적화 파괴를 들 수 있다. 표적화 파괴는, 유전자 표적화에 의해 유전자를 파괴하는 방법으로, 표적이 되는 유전자의 염기 서열에, 유전자 산물의 기능을 상실하게 되는 변이를 도입한 DNA, 바람직하게는 선택 마커, 더욱 바람직하게는 약제에 대한 내성 유전자를, 유전자 산물의 기능을 상실하게 되도록 삽입한 DNA를 세포에 도입하고, 도입한 DNA와 표적 유전자 사이에서 상동성 재조합을 야기시킨 세포를 선택하고, 표적 유전자에 변이를 도입하는 기술을 가리킨다[참조: Suzanne L. et. al., Nature, 336, 348, 1988]. 여기에서 표적화 파괴는, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자의 염기 서열의 정보에 기초하여 당해 유전자를 파괴하는 기술의 예시이고, 당해 유전자의 염기 서열의 정보에 기초하여 파괴한 것이면 본 발명에 포함되는 것이다.

또한, 기능성 N형 Ca 채널을 결실시켰다는 것은 N형 Ca 채널을 통과시킨 Ca²⁺의 유입이 실질적으로 더 이상 일어나지 않는다는 것을 의미하고, ω-코노톡신 GVIA에 의해 저해되는 Ca²⁺의 유입의 실질적 부재에 의해 검증할 수가 있다. 여기에서 ω-코노톡신 GVIA는, 청자 고둥 독(Conus geographus)으로부터 정제되는 펩타이드로[참조: Baldomero M.O. et al., Biochemistry 23, 5087, 1984], 서열 3에 제시된 아미노산 서열에 의해 특징지워진다.

N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자란, N형 Ca 채널에만 포함되는 구성 서브유니트, 예를 들면, α_1B 서브유니트를 암호화하는 유전자를 의미한다.

α_1B 서브유니트를 암호화하는 유전자의 구체예는 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 유전자이다:

(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 구성되는 DNA 또는

(b) 서열 1에 제시된 염기 서열로 구성되는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있으며, 기능성 N형 Ca 채널의 α_1B 서브유니트를 암호화하는 DNA.

또한, 여기에서 엄격한 조건의 예로서는, 65℃ 4x SSC에서의 하이브리드화, 이어서 65℃에서 1시간 동안 0.1x SSC 중에서의 세정이다. 또한 다른 방법으로서 엄격한 조건은 50% 포름아미드 중 42℃ 4x SSC이다.

바람직하게는 비사람 동물은 설치류이고, 더욱 바람직하게는 마우스이다.

본 발명의 동물은, 표적 유전자를, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자로 하는 것 이외에는, 통상의 유전자 표적화에 의한 녹아웃 동물의 제작법에 따라 제작할 수가 있다.

이하, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자의 표적화 파괴를 예로 하여, N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자의 클로닝, 표적화 파괴에 사용하는 표적화 벡터의 구축, 상동성 재조합을 야기시킨 배성 간세포(ES 세포)의 취득의 순서로 설명한다.

1. N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자의 일부를 포함하는 DNA의 클로닝

N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트를 암호화하는 DNA는 문헌[참조: Thlerry C. et. al, FEBS Letters, 338, 1, 1994]에 기재된 염기 서열을 기초로 프라이머를 설정하고, 비사람 동물의 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 PCR에 의해, 또는 비사람 동물의 RNA로부터 RT-PCR에 의해 수득할 수 있다. 또한 다른 방법으로서는, 전술한 인용 문헌에 기재된 염기 서열을 기초로 프로브를 합성하고, 비사람 동물의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, 프로브와 하이브리드화하는 클론을 선택하고, 염기 서열을 결정하여, N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자 또는 이의 일부, 바람직하게는 500bp 이상, 더욱 바람직하게는 1kbp 이상의 염기 서열을 포함하는 클론을 선택할 수 있다.

클로닝된 DNA에 포함되는 제한 효소 부위를 확인하여 제한 효소 지도를 제작한다. 상동성 재조합하기에 충분한 길이의 DNA, 바람직하게는 7kbp 이상, 더욱 바람직하게는 10kbp 이상의 클론이 수득되지 않은 경우는, 복수의 클론으로부터 적절한 제한 효소 부위에서 DNA를 절단하여 연결할 수도 있다.

2. 표적화 벡터의 구축

수득된 상동성 재조합에 충분한 길이의 DNA 중의 엑손 영역의 제한 효소 부위에, 약제 내성 유전자 등의 포지티브 선택 마커, 바람직하게는 네오마이신 내성 유전자를 도입한다. 또한, 엑손의 일부를 제거하고, 대신에 약제 내성 유전자로 대체할 수 있다. 적당한 제한 효소 부위가 없는 경우에는, 제한 효소 부위를 포함하도록 설계한 프라이머를 사용하는 PCR, 제한 효소 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 연결 등에 의해, 적당한 제한 효소 부위를 도입할 수도 있다.

바람직하게는, 도입된 DNA와 N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어나지 않아, 도입된 DNA가 N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자 이외의 부위에 삽입되어 버린 ES 세포를 제거하기 위해, 벡터내에는 네가티브 선택 마커, 예를 들면, 티미딘 키나제 유전자, 디프테리아 독소 유전자 등을 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 DNA의 염기 서열을 조작하는 재조합 DNA 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambruck, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있는데, 적당한 재조합 DNA를 수득할 수 있으면, 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.

3. 상동성 재조합을 야기시킨 배성 간세포(ES 세포)의 취득

제작한 표적화 벡터를 제한 효소로 절단하여 직쇄상 DNA로 하고, 예를 들면, 페놀·클로로포름 추출, 아가로스 전기 영동, 초원심 등에 의해 정제하고, ES 세포, 예를 들면, TT2로 형질감염시킨다. 형질감염의 방법으로서는, 전기천공법, 리포펙션 등을 들 수 있는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

형질감염된 세포는 적당한 선택 배지 중, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자와 티미딘 키나제 유전자를 도입한 표적화 벡터를 구축한 경우에는, 배지 중에 네오마이신과 간시클로비르를 포함하는 선택 배지 중에서 배양한다.

2가지 약제에 대하여 약제 내성을 나타내어 증식하는 ES 세포에, 도입 유전자, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자가 삽입된 것은, PCR 등으로 용이하게 확인할 수가 있다. 또한, 표적화 벡터 외측의 5' 상류 또는 3' 하류의 DNA 일부를 프로브로서 서던 블롯팅 해석함으로써, 상동성 재조합을 야기시켰는지 여부를 확인할 수도 있다. 또한, 표적화 벡터가 랜덤하게 삽입되어 있지 않은 것은, 표적화 벡터내의 DNA를 프로브로 하여 서던 블롯팅 해석함으로써 확인할 수 있다. 이러한 방법을 조합함으로써, 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포를 취득할 수가 있다.

이어서, 녹아웃 마우스 제작법의 예에 대하여 기술하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

녹아웃 마우스는, 수정 후 8-세포기 배 또는 배반포의 채취, 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포의 미세주입, 위임신(僞姙娠) 마우스로의 조작란의 이식, 위임신 마우스의 출산과 산아의 육성, PCR법 및 서던 블롯팅법에 의한 유전자 도입 마우스의 선발, 도입 유전자를 갖는 마우스의 계통 수립의 단계를 거쳐 제작한다[참조: Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993].

1. 8-세포기 배 또는 배반포의 채취

수정란은, 암컷 마우스에게 과잉 배란을 유발시키기 때문에, 임신한 암말 혈 청성 생식선 자극 호르몬 5IU와 사람 섬모성 생식선 자극 호르몬 2.5IU를 복강내 투여하고, 수정 후 2.5일째의 암컷 마우스로부터 난관-자궁 환류법에 의해 8-세포기 배를 획득한다. 배반포를 사용하는 경우는 수정 후 3.5일째, 암컷 마우스의 자궁을 절제하여, 자궁 환류에 의해 배를 수득한다.

2. 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포의 미세주입

수득된 8세포기 배 또는 배반포에, 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포를 미세주입한다. 미세주입은, 예를 들면, 문헌[참조: Hogan, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986 또는 Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993]의 기재에 기초하여, 도립 현미경하에, 미세조작기, 미세주입기, 주입 피펫 및 홀딩 피펫을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 주입용 디쉬에는, 예를 들면, Falcon 3002(Becton Dickinson Labware)에, 배지 5㎕의 액적 및 ES 세포를 부유시킨 액적을 만들고, 유동 파라핀을 중층한 것을 사용한다. 이하 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포를 미세주입한 8-세포기 배 또는 배반포를 조작란이라고 칭한다.

3. 위임신 마우스에의 조작란의 이식

정관 결찰 수컷 마우스와 정상 암컷 마우스를 교배시켜 위임신 마우스를 작제하여, 조작란을 이식한다. 조작란의 이식은, 예를 들면, 문헌[참조: Hogan, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986 또는 Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993]의 기재에 기초하여 수행할 수 있다. 이하에 구체적 조작의 예를 기재하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

위임신 마우스를, 예를 들면, 50mg/kg 체중의 펜토바르비탈 나트륨으로 전신 마취하고, 양측 복부를 약 1cm 절개하여 난소 및 난관을 노출시키고, 실체 현미경하에 난소낭을 핀셋으로 절개하여 난관채를 노출시킨다. 이어서, 난관당 7 내지 8개의 조작란을 난관채에 송입한다. 이때, 조작란과 동시에 도입한 미소 기포에 의해, 난관내에 이식되었다는 것을 확인한다. 이후 난관 및 난소를 복강에 복귀시켜 양쪽 절개부를 봉합하고, 마우스를 마취로부터 각성시킨다. 경우에 따라서는, 조작란을 다음날까지 배양하고, 배반포에 발생시키고 나서 자궁에 이식할 수 있다.

4. 위임신 마우스의 출산과 산아의 육성

대부분의 경우, 이식 후 17일째에는 새끼 마우스가 수득된다. 새끼 마우스는 통상, 상동성 재조합을 야기시킨 ES 세포와, 수정란을 채취한 마우스 세포의 키메라로 된다. 예를 들면, ES 세포로서 TT2를 사용하고, ICR로부터 채취한 8-세포기 배에 주입했을 경우, 키메라율이 높은 새끼 마우스는 체모색이 아구티(agouti)-우위가 되고, 키메라율이 낮은 마우스는 체모색이 백색 우위가 된다.

5. PCR법 및 서던 블롯팅법에 의한 유전자 도입 마우스의 선발

도입 유전자가 생식 세포에 도입되었는지의 여부는 체모색이 백색인 마우스, 예를 들면, ICR과 교배하여 수득된 새끼 마우스의 체모색에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 또는 키메라율이 높은 마우스는 생식 세포도 도입 유전자를 포함하고 있는 것으로 기대되므로, 가능한 한 키메라율이 높은 마우스를 교배하고, 수득된 새끼 마우스의 꼬리로부터 DNA를 절단하여 PCR에 제공함으로써, 도입 유전자의 유무를 확인할 수 있다. 또한, PCR 대신에 서던 블롯팅 해석을 수행함으로써, 보다 확실하게 유전자형을 동정할 수 있다.

6. 도입 유전자를 갖는 마우스의 계통 수립

이종접합성 마우스(이하, He 마우스)끼리를 교배함으로써, 수득된 새끼 마우스 중에 도입 유전자가 동종접합성으로 존재하는 N-KO 마우스를 수득할 수 있다. N-KO 마우스는, He 마우스끼리, He 마우스와 N-KO 마우스, N-KO 마우스끼리의 어느 쪽의 교배에서도 수득할 수 있다.

N-KO 마우스의 α_1B 서브유니트 mRNA의 발현 유무는 노던 블롯팅 해석, RT-PCR, RNase 보호 검정법, 동일 반응계내 하이브리드화 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, α_1B 서브유니트의 단백질의 발현을 면역 조직 염색, 표지 ω-코노톡신 등에 의해 확인할 수가 있다. 또한, α_1B 서브유니트를 포함하여 구성되는 N형 Ca 채널의 기능을 전기 생리학적인 수법 등에 의해 확인하는 것도 가능하다.

또한, 상술한 바와 같이, 본 발명자들은, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자를 결실시킨 동물에게, 자율 신경계를 통한 혈압의 제어가 결여되어 있고, 통증, 특히 지발성으로 나타나는 제2상의 통증 전달 메카니즘에 결함이 있고, 혈당치의 제어에 이상이 있다는 것을 발견하고, 당해 동물이, N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자의 결실에 기초하는 특유의 성질을 갖는다는 것을 발견하였다. 본 발명의 측정 방법은, 이러한 발견에 기초하는 것이고, 본 발명의 동물에게 화합물 등의 물질을 투여하여, 당해 물질의 당해 동물에 대한 작용을 측정함을 포함하여, 물질의 작용을 측정하는 방법이다.

본 발명의 측정 방법은, 본 발명의 동물 및 야생형의 동물에게 물질을 투여하고, 본 발명의 동물과 야생형의 동물에 대한 당해 물질의 작용을 비교하여, 당해 물질의 N형 Ca 채널에 관련하는 작용을 측정함을 포함하는 것이 바람직하다. N형 Ca 채널에 관련되는 작용을 측정함으로써, 당해 물질이 N형 Ca 채널에 제공하는 영향을 조사할 수가 있다.

작용이란, 당해 동물이 갖는 특유의 성질에 대한 작용, 예를 들면, 당해 동물에게 혈압 제어, 통증 전달 또는 혈당치의 제어에 이상이 있다는 것에 주목했을 경우, 각각 혈압, 통증 또는 혈당치에 대한 작용을 가리키는데, 당해 동물이 갖는 특유의 성질에 관련하는 작용이면, 이러한 예로 한정되는 것은 아니다. 이러한 작용은 물질의 활성으로서 측정할 수 있다.

또한, 야생형이란, 기능성 N형 Ca 채널이 결실되지 않은 것을 의미한다.

또한 본 발명은, 본 발명의 동물(N형 Ca 채널을 결실시킨 비사람 동물)을 이용한, 약리 작용을 갖는 물질의 스크리닝법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 측정 방법을 이용하여, 약리 작용을 갖는 물질, 예를 들면, 상기 동물의 혈압, 통 증 전달 또는 혈당치에 작용하는 물질(즉, 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질, 진통 작용을 갖는 물질 또는 혈당치를 저하시키는 작용을 갖는 물질)을 스크리닝하는 방법, 이러한 스크리닝에 의해 수득된 물질, 및 본 발명의 측정 방법을 이용하여, 약리 작용을 갖는 물질을 스크리닝하여, 수득된 물질을 유효 성분으로서 포함하는 의약(예를 들면, 혈압 강하제, 진통제 또는 혈당치 저하제)을 제조함을 포함하여, 의약을 제조하는 방법도 제공한다.

이하에, 예로서, 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질, 진통 작용을 갖는 물질, 혈당치를 저하시키는 작용을 갖는 물질의 순서로 설명하지만, 본 발명의 동물을 사용한 스크리닝계를 이용하는 것이면, 본 발명에 포함되는 것이다.

1. 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질(혈압 강하약)의 스크리닝법

N형 Ca 채널을 결실시킨 비사람 동물(N-KO 동물)과, 결실시키지 않은 야생형 동물(Wt 동물)에 후보 물질을 투여하고, Wt 동물로서는 혈압을 강하시키는데, N-KO 동물로서는 강하시키지 않는 약제를 선택함으로써, N형 Ca 채널을 통과시킨 Ca²⁺의 유입을 차단하여 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수가 있다.

또한, 역으로, N-KO에서 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질을 선택함으로써, N형 Ca 채널을 통과시킨 Ca²⁺의 유입을 차단을 통하지 않고 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질을 스크리닝하는 것이 가능하다. 본 발명의 N-KO 마우스에서는, 신경계를 통한 혈압 제어를 상실하게 되는 것으로 예상되었으나, 평균 혈압이 Wt 동물보다도 높은 값을 나타내었기 때문에, N-KO 동물에서 내재성 인자를 통한 혈압 제어계가 강하게 작용하고 있을 가능성이 시사되어 있다. 따라서 N-KO 동물은, 내재성 인자를 통한 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝에 특히 유용하다.

구체적으로는, 예를 들면, N-KO 마우스 및 야생형 마우스(이하, Wt 마우스)를 이용하는 경우에는, 마우스를 마취, 기관 삽관한 후, 동물용 환기장치(animal ventilator)로 환기량 0.2ml 및 호흡 횟수 140회/분으로 인공 호흡을 수행하고, 우측 총경동맥에 헤파린을 포함하는 생리 식염수를 충전한 폴리에틸렌 튜브를 삽입하고, 이를 압력 변환기에 접속하여 혈압을 측정한다. 스크리닝에 공급하는 후보 물질은, 좌측 총경동맥에 유치한 카테터에 의해 투여하여 혈압을 강하시키는 작용을 갖는 물질을 선택한다.

2. 진통 작용을 갖는 물질(진통약)의 스크리닝법

N-KO 동물 및 Wt 동물에게 후보 물질을 투여하여, 진통 작용을 비교함으로써, N형 Ca 채널을 통과시킨 Ca²⁺ 유입의 차단을 통해, 또는 통하지 않고서, 진통 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수가 있다. 진통 작용은, 예를 들면, 포르말린 시험, 핫 플레이트 시험, 아세트산 라이딩(writhing) 시험, 테일-플릭(tail-flick) 시험, 테일-핀치(tail-pinch) 시험 등에 의해 판정할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, N-KO 마우스 및 Wt 마우스를 이용한 포르말린 시 험의 경우에서는, 3% 포르말린 20㎕를 N-KO 마우스 또는 Wt 마우스의 좌측 후지의 발바닥에 피하 투여하여, 마우스가 좌측 후지를 핥는(licking) 행동의 지속 시간을 30분간 측정하여 통증 지표로 삼는다. 스크리닝에 공급하는 물질을 투여함으로써, 통증의 지표를 경감하는 물질을 선택한다.

3. 혈당치를 저하시키는 작용을 갖는 물질(혈당 강하약)의 스크리닝법

N-KO 동물 및 Wt 동물에 후보 물질을 투여하여, 혈당치 강하 작용을 비교함으로써, N형 Ca 채널을 통과시킨 Ca²⁺ 유입의 차단을 통해, 또는 통하지 않고서, 혈당치를 저하시키는 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, N-KO 마우스를 이용하는 경우, 섭식하(채혈전 2시간 절식) 또는 절식하(18시간 절식)의 N-KO 마우스 및 Wt 마우스 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하여 혈액 중의 혈당치를 측정한다. 혈당치는, 예를 들면, 혈액 10㎕와 0.6N 과염소산 90㎕를 혼화하여 원심분리(7,000rpm, 2분)하고, 상청액 20㎕와 글루코스 CII-Test Wako(Wako Pure Chemical Industries)의 발색액 300㎕를 혼화하여, 37℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 505nm의 흡광도를 측정함으로써 측정할 수가 있다.

약리 작용을 갖는 물질을 유효 성분으로서 포함하는 의약의 제조는, 통상의 약물 제조법에 따라서 수행할 수 있다. 의약은, 약리 작용을 갖는 물질과 의약적으로 허용되는 담체와의 의약 조성물로 할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 유전자 표적화에 의한 N형 Ca 채널을 암호화하는 유전자의 파괴

(1) N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자의 클로닝

문헌[참조: FEBS Letters, 338, 1-5, 1994]에 기재된 마우스 α_1B 서브유니트 유전자의 염기 서열을 기초로, 프라이머(서열 4 및 서열 5)를 설계하여, 마우스 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR에 의해 서열 6의 염기 서열을 갖는 DNA를 수득하였다. 이것을 프로브로 하여, 129SVJ 유래의 마우스 게놈 라이브러리(λ FIXII)로부터, N형 Ca 채널 α_1B 서브유니트 유전자의 일부를 포함하는 파아지 DNA 클론을 분리하였다. 수득된 파아지 DNA 클론의 제한 효소 지도를 도 1에 도시한다.

(2) 표적화 벡터의 구축

표적화 벡터는, α_1B 서브유니트 유전자의 엑손 B를 포함하는 영역을 상동성 유전자 영역으로서 사용하고, 당해 엑손 B에 네오마이신 내성 유전자를 도입하여(도 1), 네가티브 선별 유전자로서 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자를 도입하는 방법으로 제작하였다[참조: Suzanne L. et. al., Nature, 336, 348, 1988].

구축의 개략을 도 2 내지 4에 도시한다. (1)에서 수득된 파아지 DNA 클론을 BamHI로 절단하고, pBluescript II SK+에 서브클로닝하여, 도 2 및 3에 도시된 단편을 갖는 pBS59 및 pBS58을 수득하였다. 또한, 파아지 DNA 클론을 HindIII으로 절단하고, pBluescript II SK+에 서브클로닝하여, 도 2에 도시된 단편을 갖는 pBS63을 수득하였다. pBS59를 AatII과 EcoRI로 절단하고, pBS63으로부터 AatII와 HindIII에서 절단한 단편을 도입하여 pBS59/63을 제작하였다. pBS59/63을 AatII로 절단하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 단편을 도입하고, pBS59/63n을 제작하고, 다시 EcoRV로 절단하고, pBS58로부터 EcoRV로 절단하여 수득한 단편을 도입하여, pBS59/63/58n을 제작하였다. 선택 유전자인 티미딘 키나제 유전자를 pBS59/63/58n의 멀티클로닝 부위인 SalI-XhoI 부위에 도입하여 표적화 벡터를 제작하였다.

(3) 상동성 재조합 배성 간세포(ES 세포)의 취득

(2)에서 수득된 표적화 벡터를 NotI로 절단하여 직쇄상의 DNA(1mg/ml)를 형성하였다. 마우스 ES 세포는 TT2를 사용하고[참조: Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993], 직쇄 표적화 벡터(200㎍/ml)를 ES 세포(1x10⁷개 세포/ml)에 전기천공법(250V, 975μF, 실온)에 의해 형질감염시키고, 배양 2일 후부터 G418(250㎍/ml) 및 간시클로비르(0.2μM)를 포함한 배지에서 3일간 배양하고, 그 후, G418(250㎍/ml)을 포함한 배지에서 3일간 배양하였다. 발생한 ES 세포 콜로니의 일부에서 DNA를 절단하고, 이것을 주형으로 하고, 표적화 벡터 밖의 염기 서열(서열 7), 및 도입 유전자(네오마이신 내성 유전자) 중에 포함되는 염기 서열(서열 8)을 갖는 DNA를 프라이머로서 PCR를 수행하고, 3.7kb의 PCR 산물을 발생시키는 클론을, 상동성 재조합을 야기시킬 가능성이 있는 후보로 하였다.

후보 클론 중에서 상동성 재조합만이 일어나고 있는 클론을 서던 블롯팅 해석에 의해 동정하였다. 절단한 게놈을 ApaLI 및 BalI로 절단하여, 표적화 벡터 밖의 프로브 Pro9P(상동성 재조합을 야기시킨 영역의 5' 상류 약 0.9kbp의 DNA를 PCR에 의해 취득, 도 1 참조) 및 표적화 벡터내의 프로브 Pro8(pBS59로부터 SphI와 BamHI에 의해 절단한 약 0.8kbp의 DNA, 도 1 참조)과 하이브리드화시켜, 상동성 재조합이 일어난 클론, 즉 Pro9P를 프로브로 하고, ApaL1 절단물로 6.9kb, BalI 절단물로 4.6kb의 밴드가 검출되고, Pro8을 프로브로 하여 ApaL1 절단물로 6.9kb, BalI 절단물로 2.4kb의 밴드가 검출되는 클론을 선택하였다.

(4) N-KO 마우스의 제작

암컷 마우스에 임신한 암말 혈청성 생식선 자극 호르몬(pregnant mare's serum gonadotropin, PMSG: 세로트로핀, Teikoku Hormone Mfg., Tokyo) 5IU와 사람섬모성 생식선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG: 고나트로핀: Teikoku Hormone Mfg., Tokyo) 2.5IU를 복강내 투여하고, 수정 2.5일째에 난관-자 궁 환류법에 의해 8세포기 배를 수득하였다.

수득된 8세포기 배에, (3)에서 수득된 상동성 재조합 ES 세포를, 도립 현미경(DIAPHOTO TMD: Nippon Kogaku Kogyo, Tokyo)하에, 미세조작기(조동 전동 조작기에 현가식 조이스틱 3차원 유압 미세조작기를 장착: Narishige, Tokyo), 미세주입기(Narishige, Tokyo), 주입 피펫 및 홀딩 피펫을 이용하여 미세주입하였다. 또한, 주입용 디쉬에는, Falcon 3002(Becton Dickinson Labware)에, 배지 5㎕의 액적에 ES 세포를 부유시킨 액적을 만들고, 유동 파라핀을 중층한 것을 사용하였다.

정관 결찰 수컷 마우스와 정상 암컷 마우스를 교배시켜 위임신 마우스를 제조하고, 다른 3개의 상동성 재조합 ES 세포 클론을 미세주입한 조작란을 이식하였다. 위임신 마우스를 50mg/kg 체중의 펜토바르비탈 나트륨(Nembutal: Abbott Laboratories)으로 전신 마취를 수행하고, 양측 복부를 약 1cm 절개하여 난소 및 난관을 노출시키고, 실체 현미경하에 난소낭을 핀셋으로 절개하여 난관채를 노출시키고, 계속해서 난관당 7 내지 8개의 조작란을 난관채에 송입한다. 그 후, 난관 및 난소를 복강에 복귀하여 양쪽 절개부를 봉합하였다.

조작란을 이식하여 임신한 마우스로부터, 체모색이 흑색인 100% 키메라 마우스를 출산시켰다. 수득된 100% 키메라 마우스의 생식 세포가 ES 세포 유래라는 것을 확인하기 위하여, ICR 암컷 마우스와 교배하여 태어난 새끼를 확인하였더니, 모든 출산 새끼의 체모색이 흑색이고, 키메라 마우스의 생식 세포는 ES 세포 유래라는 것이 확인되었다. 키메라 마우스를 C57BL/6과 교배함으로써 He 마우스를 수득하고, He 마우스끼리의 교배에 의해 N-KO 마우스를 수득하였다.

수득된 마우스의 유전자형을, PCR에 의해 발생하는 DNA 단편의 크기 차이에 의해 확인하였다. 마우스의 꼬리를 2-3mm 정도 절단하고, 프로테이나제 K 용액(용해용 완충액(Perkin Elmer)을 PBS(-)로 2배에 희석. 머캅토에탄올 1%, 프로테이나제 K 0.25mg/ml)에 의해 분해(55℃, 2시간)한다. 이후, 게놈 DNA를 통상법에 따라 절단하고, 증류수 100-200㎕에서 용해하여 PCR의 주형으로 하였다. 네오마이신 내성 유전자에 포함되는 서열(서열 8)과, α_1B 서브유니트 유전자의 2개의 부위에 프라이머를 설계하여(서열 9 및 서열 10), PCR을 수행하고, 각 개체의 유전자형을 동정하였다. 변이를 야기시킨 유전자는 520bp, 야생형 유전자는 490bp의 PCR 산물을 발생시킨다.

또한 필요에 따라, 서던 블롯팅 해석에 의해서도 유전자형을 확인하였다. 마우스의 꼬리에서 절단한 게놈 DNA를 BamHI에 의해 절단하고, 표적화 벡터내의 네오마이신 내성 유전자에 인접하는 영역을 프로브 ProN(pBS59를 NcoI에서 절단한 약 1kbp의 DNA, 도 1 참조)과 하이브리드화시키면, N-KO에서는 3.1kb의 밴드만이 검출되었다.

마우스의 뇌에서의 mRNA의 발현량을 노던 블롯팅에 의해 확인하였다. 각 유전자형의 마우스 3마리의 뇌로부터, AGPC법에 의해 전체 RNA를 절단하였다. 전체 RNA로부터 올리고 dT 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 정제하여, mRNA를 수득하였다. 0.5% 겔로 mRNA(5㎍/레인)의 전기 영동을 수행하고, 서열 6의 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브로 하여 하이브리드화시켰다. 노던 블롯팅 해석에 의해, N-KO 마우스에서는 Wt 마우스에서 발현하고 있는 mRNA가 완전히 소실되었다.

(5) N-KO의 N형 Ca 채널을 통한 전류량에 의한 확인

Wt 마우스와 N-KO 마우스의 후근 신경절의 신경 세포를 사용하여, ω-코노톡신 GVIA로 저해되는 Ca²⁺의 유입량의 변화를 전세포 패치 클램프(whole-cell patch clamp)법으로 Ba²⁺를 전하 캐리어(charge carrier)로서 측정하였다.

5 내지 8주령의 마우스를 에테르로 마취하여 후근 신경절을 절제하고, 크레브스(Krebs) 용액 중에서 처음에 프로나제(0.2mg/ml)로 30분 동안, 이어서 서모라이신(0.2mg/ml)로 30분 동안 분해 반응을 수행하여 세포를 분리하였다.

패치 클램프 증폭기(Axopatch 200B)를 전세포 모드에 셋팅하여 실온에서 측정하였다. 패치 피펫(외부 직경 1.5mm, 내부 직경 1.1mm)은, P-87 플레이밍-브라운 미세피펫 풀러(Flaming-Brown micropipette puller, Sutter Instrument)에 의해 제작하였다. 분리한 신경 세포의 외액은, 3mM BaCl₂, 155mM 테트라에틸암모늄 클로라이드, 10mM HEPES, 10mM 글루코스(pH 7.4)로 하고, 패치 피펫내는, 85mM 아스파라긴산세슘염, 40mM CsCl, 2mM MgCl₂, 5mM EGTA, 2mM ATPMg, 5mM HEPES, 10mM 크레아틴 인산(pH 7.4)으로 하였다. 피펫의 전기 저항은 1 내지 2Mohm으로 하고, 100kHz에서 자극했을 때에 수득되는 Ba²⁺의 전류량을 pCLAMP(Axon Instruments)로 해석하였다. Wt 마우스 및 N-KO 각각의 신경 세포의 전체 Ca 채널의 전류량을 측정한 후, ω-코노톡신 GVIA(1μM)를 첨가하여 N형 Ca 채널 이외의 전류량을 측정하였다.

결과를 도 5에 도시한다. 도면 중의 값은 평균값이고, 바는 표준 편차를 나타낸다(Wt(+/+): n=4, N-KO(-/-): n=7). N-KO 마우스로부터 절제한 신경 후근절의 신경 세포에서, ω-코노톡신 GVIA에 의해 저해되는 Ca²⁺의 유입이 관찰되지 않는다는 것이 전기 생리학적으로 증명되고, N-KO 마우스에서는 기능성 N형 Ca 채널을 결실하고 있다는 것이 확인되었다.

(6) 유전자형 사이의 체중, 심박수 및 혈압의 비교

Wt 마우스와 N-KO 마우스의 체중, 심박수 및 평균 혈압에 대하여 비교 검토하였다. Wt 마우스(15 내지 16주령, 수컷, n=4) 및 N-KO 마우스(15 내지 16주령, 수컷, n=4)를 10% 우레탄으로 마취하였다. 기관 삽입 후 동물용 환기장치(Columbs)로 환기량 0.2ml 및 호흡 횟수 140회/분으로 인공 호흡을 수행하였다. 우측 총경동맥에 헤파린을 포함하는 생리 식염수를 충전한 폴리에틸렌 튜브를 삽입하고, 이를 압력 변환기(Millar, Model MPC-500)에 접속하여 혈압을 측정하였다. 심박수는 혈압의 맥동으로부터 구하였다.

결과를 도 6에 도시한다. 도면 중의 값은 평균값이고, 유의차 검정은 t 검정법에 의한 것이다. 체중에 관해서는 양 그룹에 차이는 없었다(28.2±3.2g 대 30.8±4.0g). 심박수와 평균 혈압에 관해서는 Wt 마우스에 대하여 N-KO 마우스가 유의하게 높았다(562±101.9박동수/분 대 742±32.5박동수/분, p<0.05, 73.4±7.7mmHg 대 100.0±6.6mmHg, p<0.05).

이러한 결과는, Wt 마우스에서는 미주 신경 긴장에 의해 심박수 및 혈압이 일정한 수준으로 유지되었는데 이에 대하여, N-KO 마우스에서는 교감 신경 지배 및 부교감 신경 지배가 함께 소실되고 있기 때문에, 미주 신경 긴장 상태가 아니게 되어 심박수 및 혈압이 유의하게 상승하고 있을 가능성을 시사하고 있다고 생각된다. 또한 N-KO 마우스에서는, 항상적으로 노르아드레날린 등의 신경 전달 물질이나 안지오텐신 II, 엔도텔린 등의 승압에 관여하는 인자가 높아져 있을 가능성도 생각된다.

[실시예 2] 마우스에의 ω-코노톡신 GVIA 투여시의 혈압 변동

Wt 마우스와 N-KO 마우스의 ω-코노톡신 GVIA에 의한 심박수 및 혈압의 변동을 평가하였다. Wt 마우스(15 내지 16주령, 수컷, 체중 28.2±3.2g, n=4) 및 N-KO 마우스(15 내지 16주령, 수컷, 체중 30.8±4.0g, n=4)를 10% 우레탄으로 마취하였다. 기관 삽입 후 동물용 환기장치(Columbs)로 환기량 0.2ml 및 호흡 횟수 140회/분으로 인공 호흡을 수행하였다. 우측 총경동맥에 헤파린을 포함하는 생리 식염수를 충전한 폴리에틸렌 튜브를 삽입하고, 이를 압력 변환기(Millar, Model MPC-500)에 접속하여 혈압을 측정하였다. 또한, 좌측 총경동맥에 카테터를 유치하고, ω-코노톡신 GVIA(오메가-CgTx GVIA)(30㎍/kg)를 투여하였다.

결과를 도 7에 도시한다. 도면 중, 값은 평균값이고, 바는 표준 편차를 나 타낸다. Wt 마우스에서는 투여 10분 후부터 유의한 심박수 및 혈압의 저하가 인정되었다. 한편, N-KO 마우스에 있어서는 ω-코노톡신 GVIA 투여 후에도 심박수 및 혈압의 변화는 인정되지 않았다.

이 결과는, N형 Ca 채널이 심박수 및 혈압의 조절에 관여하고 있다는 것을 나타내고 있고, N-KO 마우스는 심박수나 혈압 조절의 메카니즘을 해명하는데 유용한 모델 동물이라고 생각된다.

[실시예 3] 혈압 조절 메카니즘에 관한 실험-양측 경동맥 폐색(bilateral carotid occlusion, 이하 BCO라 칭한다)에 대한 혈압 변화의 검토

Wt 마우스 및 N-KO 마우스의 BCO에 대한 혈압 변동을 평가하였다. Wt 마우스(15 내지 16주령, 체중 28.2±3.2g, n=4) 및 N-KO 마우스(15 내지 16주령, 체중 30.8±4.0g, n=4)를 10% 우레탄으로 마취하였다. 기관 삽입 후 동물용 환기장치(Columbs)로 환기량 0.2ml 및 호흡 횟수 140회/분으로 인공 호흡을 수행하였다. 우측 총경동맥에 헤파린을 포함하는 생리 식염수를 충전한 폴리에틸렌 튜브를 삽입하고, 이를 압력 변환기(Millar, Model MPC-500)에 접속하여 혈압을 측정하였다. 또한, 좌측 총경동맥에 동맥 폐색을 위한 실크사(Natsume, 실꿴 봉합침, Black broad silk No.8-0)를 걸어 두고, 실크사를 상측으로 들어 올림으로써 혈류를 일시 정지시켜 BCO의 상태로 하였다.

30초 동안 BCO를 수행한 결과, Wt 마우스에서는 일과성의 혈압 상승이 인정되었으나, 이러한 혈압 상승 반응은 ω-코노톡신 GVIA(30㎍/kg) 투여에 의해 거의 소실되었다. 한편, N-KO 마우스에서는 BCO에 의해서도 혈압 상승은 볼 수 없었다. 전형적 데이터를 도 8에 도시한다(도 8, 상: 동맥압, 하: 평균 혈압).

이 결과로부터, N-KO 마우스에서는 내경동맥에 존재하는 압력 수용기를 통한 압력 반사 메카니즘이 결여되어 있어, 적어도 교감 신경 절후 섬유의 신경 말단에서 신경 전달 물질이 유리되어 있지 않다고 생각된다.

N-KO 마우스를 이용함으로써, 심장 순환의 제어 메카니즘에 관여하는 자율 신경 종말에서의 각 서브타입의 Ca 채널의 역할을 밝히는 것이 가능하다고 생각된다.

[실시예 4] 포르말린 투여에 대한 진통 효과의 검토

실험에는, Wt 마우스, He 마우스 및 N-KO 마우스(수컷, 6주령)를 사용하였다. 포름알데히드 용액(WAKO, 35.0 내지 38.0%, 1급, Lot No. DLL4284)을 30㎕ 취하여 생리 식염수 970㎕에 첨가하였다. 이것을 3% 포르말린으로 하였다. 마우스 좌측 후지의 발바닥에 3% 포르말린 20㎕를 피하 투여하였다. 포르말린을 투여하고 나서 마우스가 좌측 후지를 핥는 행동의 지속 시간을 30분 동안 측정하여 통증 지표로 하였다. 지속 시간은 5분간마다 집계하여 초수로 나타냈다. 유의차 검정은 파라메트릭 1원 배치 분산 분석을 한 후, 던넷(Dunnet)형 다중 비교를 하였다(*: 0.01(p<0.05, **: p<0.01 대 대조군). 검정에는 SAS 6.12(SAS Institute Japan, Tokyo)를 도입한 통계 해석 지원 시스템을 사용하였다.

그 결과, N-KO 마우스에서는, Wt 마우스 및 He 마우스와 비교하여, 제1상(0 내지 5분)의 통증에 대해서는 차이를 발견하지 못했지만, 제2상(15 내지 30분)의 통증에 대하여 진통 효과를 인정하였다(도 9). 이것은, N형 Ca 채널이 통증 전달에 관여한다는 것을 시사하고 있다. 또한, 통증 전달을 완전히 억제할 수 없었기 때문에, N-KO 마우스는 N형 Ca 채널 이외의 작용점을 통한 진통약의 평가에 유용하다는 것을 나타내고 있다.

[실시예 5] N-KO 마우스의 혈당치

1. N-KO 마우스의 혈당치의 측정

섭식하(채혈전 2시간 절식) 또는 절식하(18시간 절식)의 N-KO 마우스 및 Wt 마우스(Wt(+/+) 수컷: n=9, Wt 암컷: n=10, N-KO(-/-) 수컷: n=10, N-KO 암컷: n=10)의 꼬리 정맥으로부터 혈액 10㎕를 채혈하고, 0.6N 과염소산 90㎕와 혼화하여 원심(7,000rpm, 2분)하였다. 상청액 20㎕와 글루코스 CII-Test Wako(Wako Pure Chemical Industries)의 발색액 300㎕를 96웰 마이크로플레이트상에서 혼화하고, 37℃에서 5분 동안 반응시켜, 505nm에서 측정하였다.

그 결과를 도 10에 도시한다. 도면 중의 값은 평균값이다. 섭식하인 경우에서는, N-KO 마우스는 Wt 마우스에 비교하여 유의하게 낮은 혈당치를 나타낸다(t 검정). 한편, 절식하에서는 양자간에서 혈당치에 유의차는 인정되지 않았다.

이상의 결과는, N형 Ca 채널을 통한 신경 전달의 활성화에 의해 혈당치를 상승시킬 수 있다는 것을 나타내고 있고, N형 Ca 채널이 혈당치의 정상화(항상성의 유지)에 관여할 수 있다는 것을 시사하고 있다.

2. N-KO 마우스의 당 투여 시험

16시간 절식한 Wt 마우스와 N-KO 마우스(수컷, 9 내지 10개월령, 혈당치에 대해서는 Wt: n=9, N-KO: n=9, 인슐린 정량값에 대해서는 Wt: n=8, N-KO: n=9)에 20% 글루코스 용액을 2g/kg 체중으로 경구 투여하고, 0, 0.5, 1, 2, 3, 4시간 후에 꼬리 정맥으로부터 10㎕를 채혈하여, 상기와 동일한 방법으로 혈당치를 측정하였다. 또한, 동일하게 채혈한 10㎕의 혈액을, 10㎕의 헤파린 생리 식염수와 혼화하여, 원심 분리 후, 상청액 중의 인슐린 양을 효소 면역검정 키트(Morinaga Milk Industry Co., Biochemical Research Laboratory)로 정량하였다. 혈당치를 도 11에, 인슐린 정량값을 도 12에 도시한다. 도 11 및 12에서, 값은 평균값이고, 바는 표준 편차를 나타낸다.

도 11에 도시된 바와 같이, N-KO 마우스에서는 공복시 혈당이 Wt 마우스에 비교하여 유의하게 낮고, 당 투여 후에도 혈당치는 유의하게 낮은 값을 추이하였다. 9 내지 10개월령의 Wt 마우스에서는 연령과 관련된(age-related) 인슐린 저항성이 발생하였다고 생각되는데 대하여, N-KO 마우스의 혈당치의 추이는 어린 마우스와 유사하였다.

이것은, 도 12의 인슐린 정량값으로도 표시되고, Wt 마우스에서는 당 투여 전후에 높은 값의 인슐린 농도를 지속하는 것과 비교하여, N-KO 마우스에서는, 인슐린 농도도 낮아 1시간 후에는 투여 전의 수준으로 되돌아갔다. 또한, Wt 마우스의 인슐린 정량값은 개체에 따라 크게 상이하였다.

이러한 실험 결과는, N-KO 마우스가 인슐린 저항성이 되기 어렵다는 것을 나타내고 있고, N형 Ca 채널이 인슐린 저항성에 관여하고 있다는 것이 시사되고, N형 Ca 채널의 활성화가 혈당치의 정상화에 관여한다는 것을 나타내고 있다.

또한, 글루카곤 및 렙틴의 양도 측정하였는데, Wt 마우스와 N-KO 마우스 사이에서 차이가 나타나지 않았다.

3. 비장의 면역 형광 염색

N형 Ca 채널과 인슐린 저항성의 관련성을 다시 확인하기 위하여, Wt 마우스 및 N-KO 마우스의 비장 랑게르한스섬 β 세포를 비교하였다.

Wt 마우스 및 N-KO 마우스(수컷, 11개월령)를, 넴부탈에 의한 마취 후, 개복하고, 우심방의 판 주위를 절개하여 제혈하였다. 좌심실에서 헤파린(4U/ml)을 포함하는 PBS를 주입하여 간장이 백색화된 것을 확인한 후, PBS에 용해한 4% 파라포름알데히드를 계속해서 주입하였다. 개체가 경직화된 것을 확인하고, 비장을 절제하여 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 4℃에서 고정하였다. 고정 후, 30% 슈크로스를 포함하는 PBS 중에 4℃에서 하룻밤 방치하고, OCT 화합물에 매립하여 박절편을 제작하였다.

인슐린을 함유하는 β 세포는, 박절편을, 1차 항체로서 기니아 피그(guinea pig) 항인슐린 혈청(Linco Research) 및 2차 항체로서 로다민 표지한 항-기니아 피그 IgG 항체(Chemicon International)를 사용, 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 마찬가지로 글루카곤을 함유하는 α 세포는, 래빗 항글루카곤 항체(Linco Research) 및 FITC 표지한 항래빗 IgG 항체(Organon Teknika)를 사용, 염색하여, 관찰하였다.

N-KO 마우스에서는 β 세포의 세포 덩어리가 작고, Wt 마우스에서 볼 수 있는 양태와 같이, 연령과 관련된 β 세포수의 증가가 나타나지 않았다. 한편 α 세포는, 양자간에 차이가 인정되지 않았다.

Wt 마우스에서는 연령과 관련된 인슐린 저항성이 발생하였고, β 세포에 있어서의 인슐린 생산이 항진하고 있는데 대하여, N-KO 마우스에서는 인슐린 저항성이 발생하지 않았다는 것을 나타냈다고 생각된다.

[실시예 6] N-KO 마우스 심방근 수축력에 대한 자율 신경 지배

N-KO 마우스 심방근 수축력에 대한 자율 신경 지배에 관하여 검토를 수행하였다. 마우스(Wt 및 N-KO, 각각 n=5)로부터 심방을 분리하고, 2대의 자극 장치로부터 근육 직접 자극 및 신경 자극을 부여함으로써 수축력과 활동 전위를 동시 기록하였다. 자극 조건으로서는, 기본 자극은 빈도 2Hz, 임계치의 바로 위의 전압, 펄스 폭 1msec로 하였다. 신경 자극은 빈도 200Hz, 기본 자극의 1.5배의 전압, 펄스 폭 0.1msec이고, 1 기본 자극당 4발의 신경 자극을 심근 불응기 사이 15초에 가하였다.

도 13에 좌심방 및 우심방 5가지 예의 실험 결과를 나타낸다. 값은 평균값이고, 바는 표준 편차를 나타낸다. 도면 중, w-AgTx는 ω-아가톡신 GIVA를 의미한다.

좌심방에서는, Wt 마우스의 심방근 수축력은 아트로핀의 존재하에서의 신경 자극에 의해 크게 증가하고, 이러한 수축력 증가는 30nM의 ω-코노톡신 GVIA(ω-아가톡신 GlVA)로 거의 완전히 억제되었다. 이에 대하여 N-KO 마우스의 심방근 수축력은, 아트로핀의 존재하에서의 신경 자극에 의해 경도의 증가가 인정되었지만, 이러한 수축력 증가는 100nM까지의 ω-코노톡신 GVIA로 억제되지 않았다. 또한 도면에는 표시하지 않지만, 이들 수축력 증가는 테트로도톡신 0.1μM에서 완전히 억제되었다.

우심방근에서는, 좌심방만큼 현저한 아트로핀의 존재하에서의 신경 자극에 의한 심방근의 수축력 증가는 인정되지 않았지만, 좌심방과 거의 같은 결과가 수득되었다.

이 결과는, Wt 마우스에서는 교감 신경으로부터의 노르에피네프린(NE)의 유리는 거의 N형 Ca 채널에 의존하고 있지만, N-KO 마우스에서는 다른 형태의 Ca 채널이 대상적으로 증가하여 NE의 유리에 기여한 것이라고 생각된다. 우심방에서는, Wt 마우스에서 좌심방과 비교하여 신경 자극에 의한 수축력 증가가 작아 좌우심방에서의 신경 지배의 밀도에 차이가 있는 것으로 예상된다.

본 발명에 의해, N형 Ca 채널이 기능적으로 발현되지 않는 동물이 제공된다. 본 발명의 동물을 이용함으로써, N형 Ca 채널의 기능을 추정할 수 있고, 또한 N-KO 동물과 Wt 동물에게 약제를 투여하여, 그 응답의 차이로부터 약제가 N형 Ca 채널에 작용하는지 여부를 추정할 수가 있다. 또한, 본 발명의 동물을 이용한, 혈압의 제 어, 통증 전달, 혈당치의 제어 등에 관한 약리 작용을 갖는 물질의 스크리닝법, 당해 스크리닝법에 의해 수득된 상기 약리 작용을 갖는 물질, 및 당해 스크리닝법에 의해 약리 작용을 갖는 물질을 스크리닝하여, 수득된 물질을 유효 성분으로 하는 의약을 제조하는 방법이 제공된다.

<110> Eisai Co., Ltd. <120> N-Calcium channel knockout animal <130> 5-1998-074028-3 <150> JP 11-303809 <151> 1999-10-26 <150> JP 2000-037839 <151> 2000-02-16 <150> JP 2000-261979 <151> 2000-08-31 <160> 10 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 7185 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (121)..(6984) <400> 1 ggaattcggc tcgaggggcg aggtccaggc agctcgctgc ggctaggcta ggagcccttg 60 gcgcgccgcg ccctcggtgc cgggccgcgg agcccgggat gctcgcggcg cccgggagtc 120 atg gtc cgc ttc ggg gac gag cta ggc ggc cgc tat ggg ggc acc ggc 168 Met Val Arg Phe Gly Asp Glu Leu Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 ggc ggg gag cgg gct cgg ggc ggc ggg gcc ggc ggg gcg ggt ggc ccg 216 Gly Gly Glu Arg Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Pro 20 25 30 ggc cag ggg ggt ctg ccg ccg ggc cag cgg gtc ctg tac aag cag tcc 264 Gly Gln Gly Gly Leu Pro Pro Gly Gln Arg Val Leu Tyr Lys Gln Ser 35 40 45 att gcg cag cgc gca cgg act atg gcc ctg tac aac ccc atc cca gtc 312 Ile Ala Gln Arg Ala Arg Thr Met Ala Leu Tyr Asn Pro 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4584 Thr Val Val Leu Met Met Lys Phe Tyr Asp Ala Pro Tyr Glu Tyr Glu 1475 1480 1485 ctg atg ctg aaa tgc ctg aac att gtc ttc aca tcc atg ttc tcg atg 4632 Leu Met Leu Lys Cys Leu Asn Ile Val Phe Thr Ser Met Phe Ser Met 1490 1495 1500 gag tgc ata ctg aag atc atc gcc ttt ggg gta ttg aac tac ttc aga 4680 Glu Cys Ile Leu Lys Ile Ile Ala Phe Gly Val Leu Asn Tyr Phe Arg 1505 1510 1515 1520 gat gcc tgg aat gtc ttt gac ttt gtc acg gtt ttg gga agt att act 4728 Asp Ala Trp Asn Val Phe Asp Phe Val Thr Val Leu Gly Ser Ile Thr 1525 1530 1535 gat att tta gta aca gag att gcg gaa acg aac aac ttc atc aac cta 4776 Asp Ile Leu Val Thr Glu Ile Ala Glu Thr Asn Asn Phe Ile Asn Leu 1540 1545 1550 agc ttc ctt cgc ctc ttc cgg gcg gca cgg ctg atc aag ctg ctt cgc 4824 Ser Phe Leu Arg Leu Phe Arg Ala Ala Arg Leu Ile Lys Leu Leu Arg 1555 1560 1565 cag ggc tac acc atc cgc atc cta ttg tgg acc ttc gtc cag tcc ttt 4872 Gln Gly Tyr Thr Ile Arg Ile Leu Leu Trp Thr Phe Val Gln Ser Phe 1570 1575 1580 aag gcg ctg ccc tac gtg tgc ctc ctc att gcc atg ctg ttc ttc atc 4920 Lys Ala Leu Pro Tyr Val Cys Leu Leu Ile Ala Met Leu Phe Phe Ile 1585 1590 1595 1600 tac gcc atc atc gga atg cag gtt ttt gga aac agt gcc ctt gat gat 4968 Tyr Ala Ile Ile Gly Met Gln Val Phe Gly Asn Ser Ala Leu Asp Asp 1605 1610 1615 gac acc agt atc aac cga cac aac aac ttc cgg aca ttt ctg caa gcc 5016 Asp Thr Ser Ile Asn Arg His Asn Asn Phe Arg Thr Phe Leu Gln Ala 1620 1625 1630 ata atg cta ttg ttc agg agt gcc act ggg gag gcc tgg cat gag atc 5064 Ile Met Leu Leu Phe Arg Ser Ala Thr Gly Glu Ala Trp His Glu Ile 1635 1640 1645 atg ctg tca tgt ctg gac aac cgg gcc tgt gac cca cat gcc aac gcc 5112 Met Leu Ser Cys Leu Asp Asn Arg Ala Cys Asp Pro His Ala Asn Ala 1650 1655 1660 agt gag tgc ggg agc gac ttt gcc tat ttt tat ttt gtc tcc ttc atc 5160 Ser Glu Cys Gly Ser Asp Phe Ala Tyr Phe Tyr Phe Val Ser Phe Ile 1665 1670 1675 1680 ttc ctc tgt tcc ttt ctg atg ttg aac ctc ttt gtt gct gta atc atg 5208 Phe Leu Cys Ser Phe Leu Met Leu Asn Leu Phe Val Ala Val Ile Met 1685 1690 1695 gac aat ttt gag tac ctc act cgg gac tct tcc atc cta ggg cct cac 5256 Asp Asn Phe Glu Tyr Leu Thr Arg Asp Ser Ser Ile Leu Gly Pro His 1700 1705 1710 cac tta gac gaa ttc att cga gtc tgg gct gaa tac gac cca gct gcg 5304 His Leu Asp Glu Phe Ile Arg Val Trp Ala Glu Tyr Asp Pro Ala Ala 1715 1720 1725 tgt ggg cgc atc agt tac aat gac atg ttt gag atg ctg aaa cac atg 5352 Cys Gly Arg Ile Ser Tyr Asn Asp Met Phe Glu Met Leu Lys His Met 1730 1735 1740 tcc cca cct ctg ggg ttg ggg aag aaa tgc ccg gct cga gtt gca tac 5400 Ser Pro Pro Leu Gly Leu Gly Lys Lys Cys Pro Ala Arg Val Ala Tyr 1745 1750 1755 1760 aag cgc ctg gtt cgc atg aac atg ccc ata tcc aat gag gac atg acg 5448 Lys Arg Leu Val Arg Met Asn Met Pro Ile Ser Asn Glu Asp Met Thr 1765 1770 1775 gtg cac ttt acg tcc aca ctg atg gcc ctc atc cgg aca gca ctg gag 5496 Val His Phe Thr Ser Thr Leu Met Ala Leu Ile Arg Thr Ala Leu Glu 1780 1785 1790 atc aag ctt gcc cca gct gac gag atg aca gtg ggg aag gtc tat gct 5544 Ile Lys Leu Ala Pro Ala Asp Glu Met Thr Val Gly Lys Val Tyr Ala 1795 1800 1805 gct ctc atg ata ttt gac ttc tac aaa cag aac aaa acc acc aga gat 5592 Ala Leu Met Ile Phe Asp Phe Tyr Lys Gln Asn Lys Thr Thr Arg Asp 1810 1815 1820 cag act cac caa gct ccc gga ggc ctg tcc cag atg ggt ccc gtt tcc 5640 Gln Thr His Gln Ala Pro Gly Gly Leu Ser Gln Met Gly Pro Val Ser 1825 1830 1835 1840 ctg ttc cac cct ctg aag gcc acc ctg gaa cag aca cag ccc gct gtg 5688 Leu Phe His Pro Leu Lys Ala Thr Leu Glu Gln Thr Gln Pro Ala Val 1845 1850 1855 ctt cga gga gct cgg gtt ttc ctt cgg caa aag agt gca act tcc ctc 5736 Leu Arg Gly Ala Arg Val Phe Leu Arg Gln Lys Ser Ala Thr Ser Leu 1860 1865 1870 agc aat ggg ggt gcc ata caa acc cag gaa agt gga tca agg agt cgc 5784 Ser Asn Gly Gly Ala Ile Gln Thr Gln Glu Ser Gly Ser Arg Ser Arg 1875 1880 1885 tgt cct ggg gga cgc aga ggg acc caa gat gca ctt tat gag ggc aga 5832 Cys Pro Gly Gly Arg Arg Gly Thr Gln Asp Ala Leu Tyr Glu Gly Arg 1890 1895 1900 gca cct cta gaa cgt gac cat tct aaa gag atc cct gtg ggg cag tca 5880 Ala Pro Leu Glu Arg Asp His Ser Lys Glu Ile Pro Val Gly Gln Ser 1905 1910 1915 1920 gga aca ctg ctg gtg gat gtc cag atg cag aac atg aca ctg aga gga 5928 Gly Thr Leu Leu Val Asp Val Gln Met Gln Asn Met Thr Leu Arg Gly 1925 1930 1935 cca gat ggg gat ccc cag cct ggc ctg gaa agc caa ggc aga gct gcc 5976 Pro Asp Gly Asp Pro Gln Pro Gly Leu Glu Ser Gln Gly Arg Ala Ala 1940 1945 1950 tct atg cta cgc cta gcg gca gaa aca cag ccg gcc cct aat gcc agc 6024 Ser Met Leu Arg Leu Ala Ala Glu Thr Gln Pro Ala Pro Asn Ala Ser 1955 1960 1965 ccc atg aag cgc tcc atc tcc aca ctg gct cca cgc cca gat ggg act 6072 Pro Met Lys Arg Ser Ile Ser Thr Leu Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr 1970 1975 1980 cag ctt tgc agc aca gtt ctg gac cgg cct cct cct agc cag gca tca 6120 Gln Leu Cys Ser Thr Val Leu Asp Arg Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser 1985 1990 1995 2000 cat cac cac cac cac cgc tgc cac cgg cgc aga gac aag aag caa agg 6168 His His His His His Arg Cys His Arg Arg Arg Asp Lys Lys Gln Arg 2005 2010 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Leu Pro Pro Gly Gln Arg Val Leu Tyr Lys Gln Ser 35 40 45 Ile Ala Gln Arg Ala Arg Thr Met Ala Leu Tyr Asn Pro Ile Pro Val 50 55 60 Lys Gln Asn Cys Phe Thr Val Asn Arg Ser Leu Phe Val Phe Ser Glu 65 70 75 80 Asp Asn Val Val Arg Lys Tyr Ala Lys Arg Ile Thr Glu Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Glu Tyr Met Ile Leu Ala Thr Ile Ile Ala Asn Cys Ile Val Leu 100 105 110 Ala Leu Glu Gln His Leu Pro Asp Gly Asp Lys Thr Pro Met Ser Glu 115 120 125 Arg Leu Asp Asp Thr Glu Pro Tyr Phe Ile Gly Ile Phe Cys Phe Glu 130 135 140 Ala Gly Ile Lys Ile Ile Ala Leu Gly Phe Val Phe His Lys Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Leu Arg Asn Gly Trp Asn Val Met Asp Phe Val Val Val Leu Thr 165 170 175 Gly Ile Leu Ala Thr Ala Gly Thr Asp Phe Asp Leu Arg Thr Leu Arg 180 185 190 Ala Val Arg Val Leu Arg Pro Leu Lys Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 195 200 205 Leu Gln Val Val Leu Lys Ser Ile Met Lys Ala Met Val Pro Leu Leu 210 215 220 Gln Ile Gly Leu Leu Leu Phe Phe Ala Ile Leu Met Phe Gly Ile Ile 225 230 235 240 Gly Leu Glu Phe Tyr Met Gly 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Gly Ala Ile Gln Thr Gln Glu Ser Gly Ser Arg Ser Arg 1875 1880 1885 Cys Pro Gly Gly Arg Arg Gly Thr Gln Asp Ala Leu Tyr Glu Gly Arg 1890 1895 1900 Ala Pro Leu Glu Arg Asp His Ser Lys Glu Ile Pro Val Gly Gln Ser 1905 1910 1915 1920 Gly Thr Leu Leu Val Asp Val Gln Met Gln Asn Met Thr Leu Arg Gly 1925 1930 1935 Pro Asp Gly Asp Pro Gln Pro Gly Leu Glu Ser Gln Gly Arg Ala Ala 1940 1945 1950 Ser Met Leu Arg Leu Ala Ala Glu Thr Gln Pro Ala Pro Asn Ala Ser 1955 1960 1965 Pro Met Lys Arg Ser Ile Ser Thr Leu Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr 1970 1975 1980 Gln Leu Cys Ser Thr Val Leu Asp Arg Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser 1985 1990 1995 2000 His His His His His Arg Cys His Arg Arg Arg Asp Lys Lys Gln Arg 2005 2010 2015 Ser Leu Glu Lys Gly Pro Ser Leu Ser Val Asp Pro Glu Gly Ala Pro 2020 2025 2030 Ser Thr Ala Ala Ala Gly Pro Gly Leu Pro His Gly Glu Gly Ser Thr 2035 2040 2045 Ala Cys Arg Arg Asp Arg Lys Gln Glu Arg Gly Arg Ser Gln Glu Arg 2050 2055 2060 Arg Gln Pro Ser Ser Ser Ser Ser Glu Lys Gln Arg Phe 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Ala Arg Ala Ser Tyr His His Pro Asp Gln Asp His Trp Cys 2275 2280 2285 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Conus geographus <220> <221> MOD_RES <222> 4, 10, 21 <223> Xaa=hydroxyproline <400> 3 Cys Lys Ser Xaa Gly Ser Ser Cys Ser Xaa Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Xaa Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttgtacagtg agatggaccc tgaggagc 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcctccagg tcacagtgag gttccttggg 30 <210> 6 <211> 713 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggcattgtac agcgagatgg accctgagga gcgcctgcgt tatgccagca cgcgccatgt 60 gaggccagac atgaagacac acatggaccg acccctagtg gtggagcctg gtcgagatgg 120 cttgcgggga cccgttggga gcaagtcaaa gcctgaaggc acggaggcca cagaaagcgc 180 ggacctacct cgcaggcacc accggcaccg tgatagggac aagacctcag ccacagcacc 240 tgctggaggc gaacaggaca ggacagaaag caccgagacc ggggcccggg aggaacgtgc 300 gcgccctcgt cgaagtcaca gcaaggagac tccaggggct 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Claims (19)

1. N형 칼슘 채널을 암호화하는 유전자를 파괴하여, 기능성 N형 칼슘 채널을 결실시킨 마우스.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, N형 칼슘 채널의 α_1B 서브유니트를 암호화하는 유전자가 파괴된 마우스.
5. 제4항에 있어서, 유전자가 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA를 포함하는 마우스.
6. 제1항에 기재된 마우스에게 물질을 투여하고, 당해 물질의 당해 마우스에 대한 작용을 측정함을 포함하여, 물질의 작용을 측정하는 방법.
7. 제1항에 기재된 마우스 및 야생형의 마우스에게 물질을 투여하고, 제1항에 기재된 마우스과 야생형의 마우스에 대한 당해 물질의 작용을 비교하여, 당해 물질의 N형 칼슘 채널에 관련되는 작용을 측정함을 포함하여, 물질의 작용을 측정하는 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 기재된 방법에 의해 물질의 약리 작용을 측정함을 포함하여, 약리 작용을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법.
9. 삭제
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11. 제8항에 있어서, 약리 작용이 혈압을 강하시키는 작용인 방법.
12. 삭제
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14. 제8항에 있어서, 약리 작용이 진통 작용인 방법.
15. 삭제
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17. 제8항에 있어서, 약리 작용이 혈당치를 저하시키는 작용인 방법.
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