JPH10500842A - ユビキチン結合酵素をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、変性疾患またはガンの素因を決定し、そしてその存在を診断する方法、ならびにまた、このような変性疾患またはガンの処置および処置を得るための産物およびプロセスに関する。本発明は、ヒトおよびマウスユビキチン結合酵素についてのDNAおよびアミノ酸配列構造の解明に関する情報の使用における特定の適用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ユビキチン結合酵素をコードするDNA 本発明は、変性疾患（特にアルツハイマー病（AD）であるがそれに限定されな い）の疾病素因を決定し、そして変性疾患の存在を診断する方法に関し、そして また、このような変性疾患を処置し、そしてこの処置を得るための産物およびプ ロセスに関する。１つの発明の概念はまた、ダウン症候群の処置および処置を得 るための産物およびプロセスに関する。さらに、１つの発明の概念はまた、ガン （特に、これに限定されないが、パピローマウイルス誘導性ガン）の疾病素因を 決定するか、またはガンの存在を診断する方法に関し、そしてこのようなガンを 処置し、そして処置を得るための産物およびプロセスにも関する。 以下の出願において、変性疾患という用語は、ユビキチン化経路の異常および ／またはパーキンソン病、ピック病、アルツハイマー病に見い出される封入体の ような種々のタイプの中間フィラメント封入体、ならびに小脳星状細胞腫のロー ゼンタール線維、筋肉の細胞質体（Cytoplasmic bodies）およびアルコール性肝 疾患のマロリー体を特徴とする疾患を意味するものとする。 変性神経性疾患であるアルツハイマー病は、現在の最も挑戦的な医学上の課題 の１つである。ADは慢性、進行性、不可逆性、および致死性の老人性痴呆症であ る。これは、全人口における高齢者の割合が継続的に増加していることを示す現 在の人口統計的データにより、最近ますます注目されている。この疾患は、ヒト および加齢霊長類動物のみに特異的であると思われ、そしてその原因は十分には 知られていない。この疾患により、痴呆症患者のケアに関する主な公衆衛生上の 問題が、特にヘルスケアの財源を過大に要求することが明らかにされている。 この疾患の研究は、信頼できる診断が脳組織の分析に依存するという事実によ り困難である。このような診断は、通常、死後行われるため、関与する患者には 役に立たないからである。主に、痴呆症の他の原因（主に不十分な状況）を排除 することより、推定上の臨床診断がなされる。 研究は、有用な動物または細胞モデルがまだ研究に利用可能でないという事実 によって、さらに妨げられている。従って、この疾患を処置するための治療剤の 開発はまだ可能ではない。 この疾患を理解することは、ある場合はADが家族性であるが、他の場合は散発 性であるという事実により、さらに困難である。しかし、すべての場合において 、死後の診断が、この疾患の特有な神経学的特徴により決定される。これらの特 徴は、２つの顕著なタイプの沈着物；アミロイドプラークおよび神経原線維変化 （neurofibrillary tangle）（NFT）を包含する。プラークは、アミロイド前駆 体の貫膜タンパク質（APP）由来のペプチドの凝集物からなる。プラークは、異 常なタンパク質の代謝により生成される。NFTおよびそれらの構築物（対になっ たらせんフィラメント（PHF））は、主としてリン酸化のさまざまな異常な状態 ある微小管関連タンパク質（タウとして知られる）からなる。PHFは、極めて難 溶性であり、そしてこのことがPHFの分析と特徴付けを極めて困難にしているこ とが知られている。さらに、NFTがタンパク質のユビキチンと会合することが知 られている；しかし、この会合の重要性は知られていない。ユビキチンは対にな ったらせんフィラメントの成分であり、このことは1987年に初めて開示された。 ユビキチンは、パーキンソン病、ピック病、アルツハイマー病に見い出される封 入体のようなヒトの種々のタイプの中間フィラメント封入体、ならびに小脳星状 細胞腫のローゼンタール線維、筋肉の細胞質体およびアルコール性肝疾患のマロ リー体の共通因子であることもまた知られている。しかし、これらの会合の重要 性は知られていない。 ADの病状がダウン症候群の罹患者にも見い出されることに注目することもまた 、興味深い。このことの重要性について、以下により詳細に記載する。 しかし、ユビキチン化経路は、変性のために細胞タンパク質を標的にする機能 を果たすことが知られている。この経路は、すべての細胞のタイプにおいて作動 し、細胞の生命活動に必要であると思われる。ユビキチン化は、増殖および分化 ；DNA修復；熱ショック応答；およびオルガネラ形成の制御において特に重要で ある。機能性脱ユビキチン化システムはまた、細胞の生命活動に必要である。短 い半減期のタンパク質（例えば、細胞周期の間、進行を制御するタンパク質）は 、ユビキチン化による分解の標的となる。異常タンパク質および変異タンパク 質は、同様にプロセスされる。多くのタンパク質が、ユビキチン化の非存在下で タンパク質分解に耐性であることは注目される。変性疾患の病状にユビキチンが 関与している可能性およびタンパク質のプロセッシングにおけるユビキチンの重 要性にもかかわらず、ユビキチン会合性酵素、特に変性疾患、特にADにおけるユ ビキチン結合酵素の役割について記載した先行技術はない。 さらに、４種類のヒトユビキチン結合酵素が発見されているが、これらの酵素 のすべてが、変性疾患、特にアルツハイマー病においてこれまで関与している染 色体領域にマップ化されていないことは注目される（5,6,7）。 ユビキチン化経路は、４つの工程のサイクルプロセスを包含する。このプロセ スは、多くの酵素（例えば、ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素 （E2またはUBC）、ユビキチンタンパク質リガーゼ（E3）およびプロテオソーム ）を含むが、上記のようにこれらのどの酵素も変性疾患、特にアルツハイマー病 において役割を果たすことは先行技術で示唆されていない。 本発明が理解され得るように、ユビキチン化経路についてより詳細に記載する 。 以下の説明において、例えば、HUBC4のように前に文字Hを付した酵素E1、E2（ またはUBC）およびE3は、ヒト型の関連酵素（例えば、ヒトユビキチン結合酵素 ）を表し、そして例えば、UBC4のようにこの接頭辞を伴わない酵素E1、E2（また はUBC）およびE3は、酵母型の関連酵素（例えば、酵母ユビキチン結合酵素）を 表す。 ユビキチン化経路が、少なくとも、正常タンパク質および短い存在期間のタン パク質（例えば、細胞周期の間、進行を制御するタンパク質、例えばp53(8)）の 選択的分解において重要な役割を果たすことが知られている。この経路は、最初 に、ATP依存性の様式で、酵素E1によるユビキチンの活性化を包含する。活性化 は、E1の活性型システイン残基とユビキチンのC-末端グリシンとの間のチオエス テルの形成を包含する。一旦活性化されると、ユビキチンは、ユビキチン結合酵 素（例えば、UBC4またはHUBC4）のシステイン残基にトランスファーされる。次 に、このユビキチン結合酵素は、ユビキチンのC-末端グリシンと標的タンパク質 上のリジン残基のE-アミノ基との間のイソペプチド結合の形成を触媒する。この ことは、標的タンパク質に特異的に結合するE3ユビキチンリガーゼにより行われ るが、そうでなければ、これらのタンパク質は、E2群によって認識されない。さ らに、ユビキチンはまた、ユビキチンの48位のリジン残基を介してユビキチン自 体と結合し、マルチユビキチン鎖の形成を生じるようになる。マルチユビキチン 化タンパク質は、ATP依存性プロテアーゼ複合体により認識され、かつ分解され る標的として用いられる。 ユビキチン結合酵素、すなわちE2は、高度に保存された触媒部位により特徴付 けられるタンパク質のファミリーを包含する。酵母において、少なくとも10の異 なるE2が同定されている。これらのE2（例えば、UBC1、UBC4、およびUBC5）の多 くは、異常なタンパク質および短い存在期間のタンパク質の特異的に標的とした 分解において重要な役割を果たす。 他のE2画分は、E3を必要としない反応において、ユビキチンの低分子タンパク 質（例えば、ヒストン）へのトランスファーを触媒する。これらの反応は、タン パク質分解中間体として用いられない１分子ユビキチン誘導体を生じる。 酵母において、ユビキチン結合酵素（E2）UBC4およびUBC5が、92%のタンパク 質配列のホモロジーを示し、そしてこれらの両遺伝子の変異が、増殖速度の実質 的な減少のために必要であることは注目される。さらに、UBCIの過剰発現は、酵 母におけるUBC4およびUBC5変異を補う。従って、これらの酵素は、重要な構造的 および機能的類似性を有し、そしてこれらの事実を考慮すると、機能的に等価な ヒトユビキチン結合酵素のHUBC5およびHUBC1の両方は、同様に、本明細書に記載 の疾患の診断および処置に重要な役割を果たすと思われる。例えば、HUBC4の変 異または多形性が、HUBC5の変異または多形性および／または過剰発現、および ／または同様に、HUBC1の変異または多形性および／または過剰発現によって補 われることであり得る。 ヒトユビキチン結合酵素のいずれか１つに異常があると、本明細書に記載の疾 患が生じることがあり得る。 ユビキチン経路はまた、細胞の増殖または細胞の分裂の制御に関連し、従って 、この制御の異常は代表的にはガン性の増殖、特にパピローマウイルス誘導性ガ ン性増殖を特徴とする。このことは、以下の情報の結果として理解されている。 ユビキチン結合酵素が、p53のユビキチン化に関与していることが最近報告さ れている（1,2,3）。 p53は細胞周期に関与しており、さらに詳細には、p53はＧ₁-Ｓチェックポイン トタンパク質である。細胞周期の間、細胞は多くの定義されたステージに入り、 Ｇ₁（細胞が複製のための準備をする）、Ｓ（細胞のDNAが複製される）、Ｇ₂（ 細胞分離の前のインターバル）、およびＭ（細胞が分裂する）と呼ばれる。Ｇ₁ の間、p53は、本質的に細胞の完全性を確認し、そしてDNAの変異が同定されてい る場合は、p53は、S期の開始を妨げて、細胞の複製を防止する。このように、p5 3は、細胞DNAの異常が細胞分裂によって進行しないことを確実にする。従って、 p53は、重要な細胞タンパク質ということであり、実際、腫瘍抑制タンパク質と 呼ばれている。従って、このタンパク質のマルチユビキチン化は、破壊のために p53を標的として、そして細胞から重要な制御因子を除去する。 p53のユビキチン化の原因である因子が、ユビキチン結合酵素であるので、p53 の細胞レベルに有害な影響を及ぼすこの酵素の変異は、腫瘍形成に役割を果たす 。 さらに、p53に対して活性なヒトユビキチン結合酵素の過剰発現は、有害な結 果をもたらす。 p53制御の異常は、ヒトパピローマウイルス（HPV）、詳細にはp53腫瘍抑制タ ンパク質のユビキチン依存性変性を刺激すると思われるタイプ16および18によっ て引き起こされるガンと関連することが知られている。 HPV-16およびHPV-18は、代表的には、頚部（cervical）ガンならびに頭部およ び頚（neck）ガンのような悪性病巣と関連する。これらの２つのHPVタイプは、 高リスクのHPVといい、一般的に良性病巣と関連する低リスクのHPVとは対照的で ある。高リスクHPVの両方はE6およびE7と呼ばれるタンパク質をコードし、これ らのタンパク質は細胞調節タンパク質に結合する。詳細には、E6は、E6会合タン パク質（E6-AP）と呼ばれる100KDaの細胞タンパク質に結合する。このE6-E6-AP 複合体は、p53に結合するため、ユビキチン結合酵素はp53をユビキチン化し得る 。従って、E6会合タンパク質に結合する場合、E6はユビキチンタンパク質リガー ゼまたはE3として作用するようである。 従って、ヒトパピローマウイルスが、細胞のユビキチン化経路を使用するため に適応されて、異常DNAの複製を防止するＧ₁-Ｓチェックポイントを克服するよ うである。 E6非存在下でp53をユビキチン化することが可能であることが最近報告されて いる。確かに、新規のウサギユビキチン結合タンパク質（E2-F1と命名されてい る）は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよびp53のような非「 Ｎ端則」基質のユビキチン化について記載されている（4）。 従って、本発明者らは、HUBC4が、HPV16または18の影響を受けた細胞中のE6-E 6-AP/p53複合体によって回復され、その結果p53は正常細胞中よりも迅速にユビ キチン化され、従ってより迅速に分解されると考えている。 このことにより、p53の機能を消失したかのように挙動する感染細胞が生じる 。機能性p53の消失をもたらすp53遺伝子の変異は、悪性の表現型を生じることが 周知である。従って、本発明者らは、E6-E6-APとHUBC4との間の相互作用を妨害 するか、またはE6-E6-A6/HUBC4複合体とp53との間の相互作用を妨害する因子が 、HPV誘導性ガン（例えば、頚部ガン）に対する処置として機能すると考えてい る。本発明者らはまた、HUBC4酵素のアンタゴニストもまた、HPV感染細胞および HPV誘導性ガンに対する処置として機能すると考えている。 本発明者らはまた、HUBC4遺伝子の異常、多形性、または変異は、p53の不適切 なまたは過剰なユビキチン化に、従って細胞制御の重要な手段の最終的な除去、 および調節されていない細胞分裂の発達に役割を果たし得ると考えている。 ある場合、例えばアルツハイマー病のような変性疾患は家族性である。従って 、アルツハイマー病のようなこれらの家族性疾患に関連する１つまたは複数の遺 伝子が特定の染色体に位置すると考えることは合理的である。この目的に対して 、多くの遺伝子調査が行われてきた。ADに関する調査が、現在要約されている。 家族性ADが常染色体優勢特性として分離されるようであることが見出された。 幾つかの家系で、アミロイド前駆体タンパク質(APP)の変異が記載されている。 例えば、このタンパク質のアミノ酸670、671、692、693または771での変異が時 々見出され、家族におけるADを分離している。APP遺伝子は、ヒト第21染色体上 の位置21q21.3に位置し、そしてアルツハイマー病を生じる特に誘引的な候補遺 伝子として最初に考えられた。なぜなら、脳を剖検で調査した場合、ダウン症候 群（第21染色体トリソミー機能障害）の患者はしばしばADの病理学的特徴を示 すからである。しかし、第21染色体上のAPP遺伝子における変異を伴う家族性AD 症例の割合は小さい。一般的に、現在までに記載されているAPP変異は、保存的 なアミノ酸変化を包含し、それは、生成タンパク質の挙動に対して大きな効果を 及ぼすとは予想されない。 他の研究者は、高齢で発病する家族性アルツハイマー病を分離する家系を記載 し、染色体19q上の遺伝子マーカーとの関連を示唆した。しかし、再度、このカ テゴリーに分けられる家族の数は、比較的少ない。 多数の遺伝子研究により、最近、家族性ADの原因となる遺伝子がヒトの第14染 色体そして特に14q24.3にマップされることが示唆されている。確かに、ヒトの 第14染色体上の遺伝子がまた実際に家族において役割を果たし得、その場合第21 染色体との連関が疑われるという幾つかの示唆もある。この遺伝子連関を確立し ている個体は、ヒトの第14染色体上に存在することが知られている遺伝子および ADの病理学におけるそれらの潜在的な関わりが推定される。このような遺伝子は 、プロテアーゼ阻害剤（AACT、PI）、プロテアーゼ（カテプシンＧ）およびTGF β3を包含する。さらに、転写因子（c-FOS）が第14染色体の14q24領域にマップ される。c-FOSの可能な役割について推定がなされている。なぜなら、この転写 因子は、APP遺伝子の転写調節において関連し得るからである。しかし、アルツ ハイマー病におけるこの因子の重要性は確立されていないままである。さらに、 70KDa熱ショックタンパク質（HSPA2）はまた、第14染色体の14q24領域にマップ される。この遺伝子の産物は、タンパク質の折りたたみ(folding)および組み立 て(assembly)において潜在的に関連する分子シャペロンであり、それ故APPプロ セッシングにおいて理論的に作用し得、その結果変異により後のアミロイド沈着 を引き起こす可能性がある。しかし、再度、ADにおいてこの仮説が正しいと示唆 する証拠はない。 結果として、先行技術は、家族性ADの発現において多くの遺伝子的影響が存在 するという点で混乱している。しかし、現在まで当該分野の当業者は、ADおよび 特に家族性ADに関連する遺伝子を速やかに単離することはできないということが 明らかである。 さらに、変性疾患およびガンとして本明細書で引用される他の疾患に関連する 遺伝子もまた単離されていない。 本発明者らの研究により本発明者らが同定したことは、驚くべき数の遺伝子が 多くの染色体上に位置し、しかしそれは、ほとんど同一、または少なくとも非常 に類似するタンパク質をコードすることである。そのようなタンパク質は、ユビ キチン結合酵素であると考えられる。１つの遺伝子が、14q24.3の位置でヒト第1 4染色体にマップされる。この遺伝子は、以前には全く記載されていない。本発 明者らは、この遺伝子およびそれがコードするタンパク質を、ヒトユビキチン結 合酵素４（HUBC4、およびより詳細にはHUBC4a）と名付けた。本発明者らの研究 によりまた、ヒトユビキチン結合酵素をコードする他の遺伝子を同定した。これ らの遺伝子は、以下のようにマップされる：22q12-13の位置のヒト第22染色体、 12pの位置の第12染色体および第19染色体および第13染色体。これらの遺伝子は 、以前には全く記載されていない。驚くべきことに、すべてのこれらの遺伝子は 、ヒトユビキチン化酵素、詳細にはHUBC4aと同一の酵素かまたはその変異体をコ ードする。本発明者らは、これらの遺伝子を、それぞれHUBC4b、HUBC4c、HUBC4d およびHUBC4eと名付けた。 実験は、ウサギのタンパク質がウサギ網状赤血球溶解物においてユビキチンキ ャリアタンパク質として活性であることを示した(4)。このタンパク質由来のト リプシン消化フラグメントの部分配列決定により、それらは、本発明者らのHUBC 4b遺伝子によりコードされるタンパク質のフラグメントと相同である。従って、 本発明者らのHUBC4b遺伝子産物と関連するウサギタンパク質が、その動物種にお いて細胞のユビキチン化経路において作用する一部分を有することが示唆され得 、そしてHUBC4b遺伝子産物および本明細書に記載されるそれらの変異体は、ヒト 細胞のユビキチン化経路において作用する一部分を等しく有すると思われる。 従って、本発明者らが首尾良く同定した遺伝子は、細胞のユビキチン化経路一 部を形成するようであり、そして代表的には、変性に対して細胞のタンパク質の 標的化に関連するようである。タンパク質がユビキチン化の非存在下でのタンパ ク質分解消化に抵抗性であることが知られているため、ユビキチン化プロセスの 一部である酵素をコードする遺伝子における変異は、細胞内のタンパク質の半減 期の増加および正常な細胞周期を完全にすることを不能にするような対応する有 害な結果を導き得る。確かに、本発明者らは、ヒト組織においてユビキチン化経 路またはユビキチン化の標的タンパク質のいずれかにおける変異が、病理学的結 果をもたらすと考える。ユビキチン化酵素および特に本明細書に記載されるクラ スのHUBC4酵素おける変異は、タンパク質のユビキチン化の減少または増強を導 く。前者の変異体は、細胞増殖に影響し得、そしてまた幾つかの主要なヒトの疾 患においておよび特にアルツハイマー病において、異なる型の中間フィラメント 封入体の生成に関連し得る。後者の変異体は、細胞増殖制御に影響し得、そして ガン性増殖を導き得る。 遺伝子のHUBC4クラスを同定することにより、本発明者らは今、HUBC4bと名付 けたヒトcDNAを提供する。このcDNAは、154のアミノ酸残基のタンパク質をコー ドし、その分子量は17.9KDaである。そして、そのタンパク質は、酵母E2遺伝子U BC4の産物に対して、一次配列において55％の相同性を示し、そしてまた同様の 疎水性プロフィルを示す。チオエステル結合形成に関連すると考えられる重要な システイン残基および特定の隣接するアミノ酸は保存されている。注目すべきこ とに、酵母UBC4遺伝子のヒトの相同体または対応するタンパク質が、変性疾患に おいて特にADにおいて何らかの役割または関連性を有し得ることを教示する先行 技術はない。確かに、酵母UBC遺伝子のヒト相同体は、DNA修復、DNA複製、G1-S 細胞周期進行およびG2チェックポイント進行において果たす役割を有すると言わ れてきた。従って、この先行技術の教示することは、クラスとしてのユビキチン 結合酵素がADまたは他の疾患において果たす重要な役割を有し得るという仮説か らそれる傾向があり、そして本発明者らに、HUBC4クラスの遺伝子が、変性疾患 に、特にAD、さらに予期されないすべてに関連することを示唆する。 任意のHUBC4クラスの遺伝子のcDNA、または遺伝子制御エレメントおよびイン トロンを含むこれらの遺伝子のうちの任意の１つの遺伝子は、核酸送達ベクター (ウイルス、リポソームなど)を用いる遺伝子治療アプローチおよび当業者に公知 の組織特異的発現を達成するための方法に用いられ得る。任意の上記遺伝子およ びゲノム遺伝子配列由来のcDNAクローンならびに遺伝子全体のうちのいずれか一 つを含む酵母人工染色体の提供により、イントロン-エキソン境界でのイントロ ンの配列を当業者に周知の方法により決定することができる。本データの利用に より、多くの周知の技術を用いて、例えば、SSCP(しかし、これに限定されない) に適用される変異の検出が可能になる(5)。従って、本発明者らは、ヒトHUBC4遺 伝子のクラスにおける多形性および/または変異の同定を可能にし、それゆえ、 家族性ADおよび/または散発性ADのような変性疾患の診断、さらに少なくともヒ トパピローマウイルス誘導性ガンに対する脆弱性の診断を補助するDNA配列デー タを提供する。本明細書で初めて定義される配列は、例えば「ARMS」技術(6)を 用いるPCRのような当業者に公知の方法を再度用いて、DNAまたはRNAレベルのい ずれかでの変異についての診断テストの開発を可能にする。 それ故、要約すると、本発明は、HUBC4a、HUBC4b、HUBC4c、HUBC4dおよびHUBC 4eと呼ぶ遺伝子の同定に関する。本発明者が考えるこれらの遺伝子における変異 は、少なくとも本明細書中に記載の変性疾患およびガン(特にパピローマウイル ス誘導性ガン)に関与する。 本発明は以下のような先行技術においてなされた観察と一致する：家族性ADが 第14染色体の位置14q24.3上の遺伝子に関連すると考えられ、そして本発明者ら の遺伝子の１つがこの位置にマップされる事実；この遺伝子座での変異が家族性 アルツハイマー病での分離(segregate)で常に見られるという事実；およびユビ キチンがタンパク質変性に関係することが周知であり、それゆえユビキチン結合 酵素の異常により不適切なタンパク質沈着の蓄積および疾患および/または細胞 増殖制御の欠損を生じ得るという事実。 本発明者らは、変異体形態のユビキチン結合酵素は、ユビキチン結合酵素とし て機能する場合、様々な活性を示すと推測する。長年にわたって、このことが、 特にCNSにおけるタンパク質プロセッシングの速度の変化を導き、そして最終的 には、NFTのような中間封入体および/またはアミロイドプラークの蓄積(build u p)を導く。 本発明者らはまた、マウスのユビキチン結合酵素(mUBC4b)のcDNA配列を提供す る。この配列の利用は、周知の方法も用いて、対応するマウスユビキチン結合酵 素のゲノムクローンを単離することを可能にする。このようなマウス配列の利用 は、確立された技術を使用してトランスジェニックマウスを調製することを可能 にする。ここで、この酵素の機能は、遺伝子ノックアウトにより破壊されるかま たは特定の変異の導入により改変されるかのいずれかである。この様式において 、ヒトにおける病状に一致する(homologous)、ADのような変性疾患の特徴を有す る症状を発現するマウス動物モデルを作成する；そして/またはガンおよび特に パピローマウイルス誘導性ガンに罹患しやすいモデルを作成する。このようなト ランスジェニック動物においてこれらの疾患の病理学的特徴の出現を遅らせるか または防ぐいかなる化合物も、ヒトにおいて治療上の利益を有するようである。 本発明者らはまた、本明細書において、それぞれヒト第14染色体14q24.3；ヒ ト染色体22q；およびヒト染色体12pに由来するヒトユビキチン結合酵素HUBC4a、 HUBC4bおよびHUBC4cの予想されるタンパク質配列を提供する。これらのタンパク 質自体が治療上使用され得る。 標準的な技術を使用して、タンパク質全体、そのエピトープまたはフラグメン ト、その短縮型改変体(truncated variant)、そのスプライシング改変体、およ び変異およびアミノ酸変化を示すタンパク質改変体のいずれかに対して惹起され たモノクローナルまたはポリクローナル抗体は特別の価値がある。このような改 変体は、例えば(しかし、これに限定されない)、罹患した患者由来のDNAのSSCP 分析(５)によって上記のように同定される。これらのような抗体は、例えば、死 後サンプルにおけるADのような(しかし、これに限定されない)変性疾患の診断の 確立において有用性を有し、そして神経学的生検の分析を容易にし得る。 さらに、これらの抗体は、p53分解を防ぐかまたは少なくとも軽減するために 、選択されたHUBC4酵素をブロックするのに有用に用いられ得る。 本発明者らはまた、本発明がダウン症候群の処置に重要な意味を有すると考え る。本発明者らは、以下の事実に基づいてこのように考える。１つのHUBC4およ び/またはAPPの遺伝子の変異体または多形性改変体のいずれかを有する個体は、 ADを示す。この状況において、機能的HUBC4およびAPP間の均衡が損なわれる。本 発明者らは、HUBC4およびAPP遺伝子産物間の均衡が、疾患を防ぐために必要であ ると考える。 例えば、正常な二倍体個体において、遺伝子相補(gene complement)は以下の 通りである： HUBC4 APP HUBC4 APP 一方、ADを患う個体において、１つまたはそれ以上の上記遺伝子が欠損しており 、不十分に機能的なHUBC4遺伝子産物、および/またはAPP遺伝子産物の沈着を生 じる。同様に、ダウン症候群の罹患者において、異なる理由のためではあるが、 この均衡は損なわれる。ダウン症候群の罹患者は余分の第21染色体を有し、その 個体の遺伝子相補は以下の通りである： HUBC4 APP HUBC4 APP APP この不均衡は、ダウン症候群の罹患者において、ADに特徴的な、病理学的な特徴 を生じる。従って、均衡を是正する１つの方法は、ダウン症候群の罹患者に、本 発明の技術を介して、別のHUBC4遺伝子または遺伝子産物を提供することである ということになる。 従って、本発明の目的は、ADのような変性疾患の疾病素質の決定および診断を 可能にする方法；ADのような変性疾患およびダウン症候群を処置するため、およ びこれらの疾患の処置を得るための産物およびプロセス；およびガン、特にパピ ローマウイルス誘導性ガン(しかし、これに限定されない)の疾病素質の決定を可 能にする方法、およびこのようなガンを処置するため、およびまたこのようなガ ンの処置を得るための産物およびプロセスを提供することである。 従って、本発明の第１の局面によると、実質的に、図１に示される遺伝子配列 構造、またはその部分、あるいは機能的に等価なまたは機能的に関係または関連 するヌクレオチド配列を有し、これを含み、またはこれに由来する遺伝物質を提 供する。 本発明の別の実施態様において、遺伝子配列構造は、ヌクレオチド320にヌク レオチド置換を含み、そして理想的には、チミンからシトシンへの塩基置換を含 む。 本発明のなおさらに別の実施態様において、この遺伝子配列構造は、ヌクレオ チド605にヌクレオチド置換を含み、そして理想的には、アデニンからグアニン への置換を含む。 本発明者らは、前記置換を１つも含まない上記遺伝子配列構造は、ユビキチン 結合遺伝子HUBC4aの遺伝子配列構造を表すと考える。上記置換を含む遺伝子配列 構造は、ユビキチン結合遺伝子HUBC4bのコード配列構造を表す。 本発明のなおさらに好適な実施態様において、上記遺伝子配列構造は、表１に 示される１つまたはそれ以上の改変体を包含し得る。 本発明の第２の局面によれば、図１に示されるアミノ酸配列構造を実質的に有 するタンパク質、理想的にはユビキチン結合酵素、またはその部分、または機能 的に等価なまたは機能的に関係または関連するアミノ酸配列構造が提供される。 本発明の別の実施態様において、上記アミノ酸配列構造は、23位にアミノ酸置 換を含み、そして理想的には、システインからアルギニンへの置換を含む。 本発明のなおさらに別の実施態様において、上記アミノ酸配列構造は、118位 に置換を含み、そして理想的には、リジンからグルタミン酸への置換を含む。 本発明者らは、前記置換を１つも含まない上記アミノ酸配列構造は、遺伝子HU BC4aによりコードされるタンパク質の配列構造を表し、そして前記置換を含むア ミノ酸配列構造は、遺伝子HUBC4bによりコードされるアミノ酸配列構造を表すと 考える。 本発明のなお別の実施態様において、上記アミノ酸配列構造は、表１に示され る１つまたはそれ以上の改変体を含み得る。 疑義を避けるために、本発明のDNA配列は、上記で定義したようなポリペプチ ドの原核または真核宿主細胞における発現を確実にすることに有用な配列を含む 。本発明のDNA配列は、詳細には以下を妥協することがわかる： ａ）図１に記載のDNA配列およびそのフラグメントまたは改変体、および特に図 １のポリペプチドをコードするフラグメント、またはその相補鎖； ｂ）図１に記載のDNA配列またはそのフラグメントまたは改変体にハイブリダイ ズするDNA配列；この配列は、暗に(by implication)、上記図１の配列またはフ ラグメントと少なくとも30％、そして好ましくは50％の相同性を示す；このよう な配列は、本明細書に記載されるプライマーを含むがそれに限定されない。 ｃ）遺伝コードの縮重を別にして、図１に記載のDNA配列またはそのフラグメン トまたは改変体、特に図１のポリヌクレオチドをコードするフラグメントまたは 改変体にハイブリダイズするDNA配列。 詳細には、図１のポリペプチドの対立遺伝子改変体形態をコードするゲノムDN A配列はｂ）に包含される。詳細には、製造されたDNA配列はｃ）に包含される。 製造された配列は、例えば、Edgeら、Noture，292，756-762(1981)の方法に従っ て容易に製造され得る。 遺伝コードの縮重は、本発明の適切なポリペプチドの遺伝子を構築するために 使用され得るコドンの選択を実質的に自由にする。宿主によって好適なコドンが 通常選択される。 前記のDNA配列または対応するRNAまたはcDNA配列のいずれかの部分にハイブリ ダイズし得るポリヌクレオチドプローブが構築され得る。ヌクレオチドプローブ は、このプローブが目的の配列を明確に検出することを確実にするように決定さ れるに十分な長さの配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことが 認識される。一般には、プローブは、決定される配列の少なくとも８個の連続す るヌクレオチドにハイブリダイズし得る。 本発明の第３の局面によると、前記に定義したようなDNA配列またはそのフラ グメント、または対応するRNA配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を 含むポリヌクレオチドが提供される。上記プローブは、必要に応じて、標識され た成分またはマーカー成分を有する。好ましくは、上記プローブは、図13に示さ れるような少なくとも１つのプローブ、またはこのプローブが上記DNA配列にハ イブリダイズするのを妨げない欠失または付加を有する、実質的に類似するプロ ーブを含む。 本発明の第４の局面によると、図１に示されるDNA配列構造またはアミノ酸配 列構造の全体または一部分に対して惹起された少なくとも１つの抗体(モノクロ ーナルまたはその他)が提供される。 本発明の好ましい実施態様において、上記抗体は、図１に示されるアミノ酸60 位〜90位またはより好ましくは72位〜88位をコードするDNA配列構造の高度に保 存される領域、あるいは図１に示されるアミノ酸60位〜90位またはより好ましく は72位〜88位に対して惹起される。 理想的には、上記抗体は、C末端アミノ酸、より好ましくはアミノ酸137位〜1 54位に対して惹起される。 このような抗体またはプローブは、前記で定義したようなポリペプチドまたは 適切に対応するDNAまたはRNAの存在を検出するかまたはこれらが存在しないこと を示すため、従ってユビキチン結合酵素活性をプロセッシングする物質の存在ま たは非存在を示すために使用され得る。従って、プローブまたは抗体は、改変さ れたユビキチン結合酵素が媒介する状態が、少なくとも部分的に、ユビキチン結 合酵素HUBC4活性が存在しないことによって引き起こされ得るかどうかを示すた めに使用され得る。 本発明の第５の局面によると、図１、2aまたは14に示されるDNA配列構造およ び/またはアミノ酸配列構造の全体または部分を含む送達手段が提供される。 本発明の第６の局面によると、実質的に、図３に示されるマウス遺伝子配列構 造、またはその部分、あるいは機能的に等価なまたは機能的に関連するヌクレオ チド配列を有し、これを含み、またはこれに由来する遺伝物質を提供する。 本発明の第７の局面によると、図４に示されるアミノ酸配列構造、またはその 部分、あるいは図４に示されるタンパク質に機能的に同一または類似のタンパク 質をコードする配列構造を実質的に有するタンパク質が提供される。 本発明の第８の局面によると、それぞれ、図３および４に示されるDNA配列構 造またはアミノ酸配列構造の全体または一部分に対して惹起される少なくとも１ つの抗体(モノクローナルまたはその他)が提供される。 本発明の第９の局面によると、それぞれ、図３および４に示されるDNA配列構 造および/またはアミノ酸配列構造の全体または一部分を含む送達手段が提供さ れる。 本発明の好ましい実施態様において、上記の送達手段は、ベクター、理想的に は複製可能なベクターを包含する。あるいは、本発明の他の実施態様において、 この送達手段はリポソームを包含する。あるいは、上記送達手段はプラスミドで ある。 本発明の好ましい実施態様において、上記送達手段は、遺伝子治療のためにDN A配列構造を組織に特異的に送達することを可能にするレトロウイルスベクター である。 本発明のなおさらに好ましい実施態様において、この送達手段はアデノウイル スベクターである。 本発明のなおさらに好ましい実施態様において、この送達手段はヘルペスウイ ルスベクターである。 標準的な技術を用いて、本明細書中に記載されるHUBC4タンパク質のいずれか １つをコードするタンパク質全体またはそのエピトープまたはフラグメント、そ の短縮型改変体、そのスプライシング改変体、および変異またはアミノ酸変化を 示すタンパク質改変体のいずれかに対して惹起されたモノクローナルまたはポリ クローナル抗体が生成され得ることもまた、当業者に明らかである。さらに、好 ましくは抗体の結合領域を含む抗体フラグメントおよびキメラ抗体(例えば、英 国特許第2188638号に記載のようなキメラ抗体)もまた使用され得る。フラグメン トが使用される場合、そのようなフラグメントは、Fabタイプフラグメント、す なわち、インタクトな抗体のＨ鎖を結合するジスルフィド結合の還元的切断によ り得られる、Fc部分を欠くフラグメント(例えば、Fab、Fab1およびF(ab1)₂フラ グメント)またはいわゆる「半分子」フラグメントであり得る。 さらに、２次抗体もまた、上記抗体に対して惹起され得る。 上記のような抗体は、死後サンプルにおけるADの診断の確立において有用性を 有し、そして神経学的生検または他の体液/組織サンプルの解析を容易にし得る 。さらに、種々の他のヒト疾患におけるユビキチン化(ubiquitination)の公知の 関与(implication)が与えられると、これらの抗体は、パーキンソン病、アルコ ール性肝疾患、ピック病および小脳性星状細胞腫の診断において有益であり得る 。 上記のような抗体はまた、少なくとも１つの選択されたユビキチン結合酵素の 活性をブロックすることにおいて有用性を有し、従って、特に、HPV感染細胞お よびガン(しかし、これらに限定されない)において、少なくとも、p53の有害な ユビキチン化に対して保護し得る。 理想的には、前記の送達手段は、HUBC4、特に(しかし、これらに限定されない )、HUBC4bおよび/またはHUBC4b複合体の活性をブロックする抗体のような因子を 包含する。 さらに、上記抗体は、本明細書に記載されるいずれかの疾患を処置するために 、 本発明に従う遺伝子置換治療を受ける個体におけるHUBC4発現のレベルをモニタ ーすることにおいて有益であり得る。本明細書に記載されるHUBC4クラスを形成 する異なる種類のHUBC4の選択的モニターは、HUBC4遺伝子によってコードされる タンパク質の違いを認識する抗体を製造することにより行われ得る。 HUBC4タンパク質の合成をブロックするかまたは減少させる別の方法は、図１ 、２または14に示されるDNA配列の全体または一部分に関連するアンチセンス配 列の使用を包含する。 本発明の第10の局面によると、その遺伝物質が、図１、２または14に示される DNA配列構造の少なくとも１つのコピー、および/または図１または２または14に 示されるDNA配列構造の少なくとも１つの変異または多形性改変体を含む非ヒト トランスジェニック動物、あるいはその遺伝物質が、図３に示されるDNA配列構 造の一部分を含まず、従ってこの配列構造によりコードされるタンパク質が機能 的でないかまたは発現されないかのいずれかである非ヒトトランスジェニック動 物が提供される。 あるいは、その生殖細胞および体細胞が、図１、２または14に示されるDNA配 列構造の少なくとも１つのコピー、および/または図１または２または14に示さ れるDNA配列構造の少なくとも１つの変異または多形性改変体；および/または図 １または２または14に示されるDNA配列構造の組換え活性化変異体形態(胚段階の 上記動物において提供される)を含み、および/または図３に示されるDNA配列構 造を含まず、従ってこの配列構造によりコードされるタンパク質が機能的でない かまたは発現されないかのいずれかである非ヒトトランスジェニック動物、およ び同じ遺伝子配列を有するその子孫が提供される。 好ましくは、上記トランスジェニックは、上記配列構造の複数のコピー、およ び/または上記配列構造の、上記配列構造の増強された発現を提供するプロモー ター(誘導可能またはその他)への接着を含む。より好ましくは、上記トランスジ ェニックはリポーター遺伝子を含み、従って上記配列の時間的および/または空 間的発現がモニターされ得る。理想的には、上記リポーター遺伝子は、目で見え るマーカーをコードする。 本発明の好ましい実施態様において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、 以下に記載されるYACを使用して提供される。 本発明の好ましい実施態様において、上記動物はマウスまたはラットのような 齧歯類である。 本発明の第11の局面によると、上記トランスジェニック動物の子孫が提供され る。 トランスジェニック動物の利用により、ヒトにおける病状に一致する、ADのよ うな変性疾患を発現する動物モデルが可能になること、およびガン、特にパピロ ーマウイルス誘導性ガンに罹患しやすい動物モデルも可能になることは当業者に 明らかである。これらのモデルは、トランスジェニック動物においてADのような 変性疾患の開始または継続を防ぐ処置、およびそのためにヒトADにおいて治療上 の利益を有する可能性のある処置、およびガン、例えば、パピローマウイルスが 誘導性するガンのようなガンを遅らせ、防ぎ、または処置し得る処置を同定する ために使用され得る。 本発明の第12の局面によると、アルツハイマー病のような変性疾患の疾病素因 または存在を診断する方法であって、テストされる個体由来のテストDNA配列構 造を図１、２または14に示される配列構造またはその部分と比較することを包含 する方法が提供される。 本発明の好ましい方法において、この方法は、テストされる個体由来のヒト第 14染色体、理想的にはヒト第14染色体の4q24.3位置由来のテストDNA配列構造を 、図１に示されるDNA配列構造またはその部分と比較すること、および/またはそ れぞれ、上記置換を含むこと/排除することを包含する。 本発明の第13の局面によると、ガン、特にパピローマウイルス誘導性ガンの疾 病素因またはこれらに対する罹患しやすさを診断するための方法であって、テス トされる個体由来のテストDNA配列構造を図１、２または14に示されるDNA配列構 造またはその部分と比較することを包含する方法が提供される。 好ましい方法において、テストされる個体由来のヒト第22染色体、理想的には ヒト第22染色体の22q位置由来のテストDNA配列構造を、図１に示されるDNA配列 構造またはその部分と比較すること、および/またはそれぞれ、上記置換を含む こと/排除することを包含する。 好ましくは、HUBC4 cDNA配列のタイプおよび対応するタイプのHUBC4ゲノム配 列は、個体由来のサンプルにおいて改変(variation)を同定するために共同して 使用されて、サンプルが異なるHUBC4配列の変異体形態を含むかどうかを確立す る。本発明の好ましい局面において、変異または多形性改変の存在が、一本鎖コ ンホメーション多形解析によって決定される。本発明のより好ましい局面におい て、変異または多形性改変は、DNA配列における変異または多形性改変の同定の ための、当該分野において公知の任意の方法(直接DNA配列決定(７および８)を含 む)によって検出される。 本発明のさらなる局面において、HUBC4遺伝子における特定の１つまたは複数 の変異の存在の診断は、好都合には、点変異の存在を評価するためのPCRに基づ く技術(例えば、ARMS法(６))によって行われ得る。このような点変異は、上記の アプローチによって同定される。 診断の方法が、個体由来のサンプルにおける変異体HUBC4対立遺伝子(対立遺伝 子は、遺伝子座の改変体として定義され、そして遺伝的分離の一般原理に従って 遺伝する)の存在または非存在の検出を本質的に包含することはまた、当業者に 明らかである。 遺伝子座の改変は、DNA配列改変または遺伝子座の改変を検出するための当該 分野において公知の任意の他の方法(マイクロサテライト領域またはミニサテラ イト領域または制限断片長多形(RFLP)の解析を含む)を使用して同定され得る。 本発明の方法はまた、HUBC4タンパク質のような任意の発現された遺伝子産物ま たはRNAを使用して実施され得る。 配列構造が図１、２または14に示されるタンパク質を、原核生物または真核生 物ヘテロロガス発現系のいずれかにおいて発現させることもまた、本発明の範囲 内である。 本発明の第14の局面によると、図１または３に示される配列またはその任意の 部分と同一または実質的に類似の組換えDNA配列が提供される。理想的には、図 １に示される上記配列は前記置換を含む。 本発明の第15の局面によると、本発明の遺伝子およびタンパク質産物を、それ ぞれ発現および理想的には輸出もし得る発現系、および理想的には輸出系(例え は、酵母、細菌または哺乳動物細胞)が提供される。 本発明の好ましい実施態様では、上記系は、複数コピーの上記遺伝子および/ または増強されたプロモーターを含み、それによって、上記遺伝子産物の発現が 増強される。このような系が、重要な座、好ましくはニューロン座中への細胞の 外科的移植に基づく治療に用いられ得ることは当業者に明らかである。 所望の生産物が宿主細胞から商業的に有用な速度で出ない場合、宿主細胞は培 養され、そしてインタクトな細胞として回収され、そして所望のポリペプチドが 、次いで、例えば、宿主細胞の増殖に必要な栄養素を含む培地からの分離後、細 胞を抽出することにより回収され得ることが理解され得る。生産物が宿主細胞か ら周辺の培養溶液中に出る場合、次いでポリペプチドは通常の方法で抽出するこ とにより回収され得る。 従って、本発明の第16番目の特徴によれば、先に定義されたようなポリペプチ ドを発現し得る形質転換宿主が提供され、この宿主は複製可能なプラスミド由来 の発現ビヒクルを含み、このビヒクルは上記ポリペプチドをコードする遺伝物質 を含む。 本発明の第17番目の局面によれば、本発明の発現系で形質転換された組換え宿 主細胞が提供される。この組換え宿主は、胚幹細胞または哺乳類細胞のような原 核性宿主または真核性宿主であり得る。 本発明の第18番目の局面は、本発明のヒトユビキチン結合酵素を生産する方法 が提供され、この方法は、本発明のHUBC4発現系の１つで形質転換された組換え 宿主細胞を培養する工程を包含する。 本発明の第19番目の局面によれば、図１、２または14に示されるDNA配列構造 およびタンパク質配列構造、またはそれらの任意の部分が、アルツハイマー病、 またはダウン症候群のような変性疾患の処置のために提供される。 本発明の好ましい実施態様では、図１、２または14に示される上記アミノ酸配 列構造は、薬学的賦形剤またはキャリアと組み合わせて薬学的組成物中に提供さ れる。 本発明の第20番目の局面によれば、図１、２または14に示される、DNAおよび/ またはタンパク質配列構造、またはそれらの任意の部分を用いるアルツハイマー 病のような変性疾患の処置方法が提供される。 本発明の第21番目の局面によれば、図１、２または14に示される、DNAおよび/ またはタンパク質配列構造を用いるダウン症候群の処置方法が提供される。 本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは、生物学的に純粋なおよび 均質な形態で得られ得る。本発明はまた、本明細書で結合性の天然のグリコシル 化を伴わないと定義されるポリペプチドを提供する。先に定義されたようなポリ ペプチドに加えて、本発明はまた、HUBC4に置換し得る、またはインビボまたは インビトロで、図１、２または14のポリペプチドと作用し得る、ポリペプチドア ナログまたは他のメンバーまたはヒトユビキチン結合酵素のファミリーのような ヒトユビキチン結合酵素としての酵素活性を有する他の生産物を含む。 これらのポリペプチドアナログは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の同一 性または位置の見地から先に定義されたポリペプチドとは異なるポリペプチドを 含む。例えは、そのようなアナログは、そのような残基の置換、または末端また は中間付加、または欠失を含み得る。そのようなアナログは、ユビキチン結合酵 素活性を共有し得る。例として、本発明に含まれるプロジェクトされた生産物は 、加水分解に対してより安定である(そしてそれゆえ、天然に存在するより明ら かにまたは長く持続する効果を有し得る)生産物；または１つまたはそれ以上の 、欠失したまたは例えばアラニンまたはセリン残基により置換されたシステイン 残基を有し、そして潜在的に微生物系から活性形態でより容易に単離される生産 物を含む。 本発明の第22番目の局面によれば、図１、２、14または３に示される配列構造 を有するタンパク質またはポリペプチド、またはそれらの部分、またはホモログ またはアナログが提供される。 本発明のポリペプチドは、簡便には、遺伝子工学技術により調製され得る。本 発明のアナログは、そのようなアナログをコードする遺伝子の発現により調製さ れ得る。そのような遺伝子は、周知の部位特異的変異誘発技術によるcDNAおよび ゲノム遺伝子の改変により容易に得られ得る。 本発明のなおさらなる局面によれば、本明細書で記載されるHUB4遺伝子のクラ ス、およびプロモーターおよびエンハンサーを含むそれらの遺伝子制御エレメン トを含む酵母人工染色体(YAC)クローンおよび/またはコスミドクローンが提供さ れる。 本発明のさらなる局面では、高度に多形性のミクロサテライトリピート(highl y polymorphic microsatellite repeats)が、これらYAC内および/またはコスミ ドクローン内から、ファミリーにおけるADのような変性疾患の診断で使用するた めに単離される。 ADは齧歯類では天然に存在せず、そして実際本発明者ら自身の調査で本発明者 らはUBC4発現が広範な種類の齧歯類組織中で起こることを示したことは注目すべ きである。本発明者らは、対照的に、ヒトでは、特に正常個体においては、他の 組織に比べて脳組織でHUBC4発現の顕著な減少があり、HUBC4発現における異常は 、脳組織で最も顕著であるらしいことを示唆するということを示した。このデー タは、疾患のニューロン障害特性と良く相関する。 次に、本発明を、添付の図面を参照して、実施例のみにより記載する； 図１は、ヒト第14染色体上に見出されるHUBC4a遺伝子のDNA配列構造および対 応するアミノ酸配列構造を示す。 図２は、HUBC4b cDNAのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。H UBC4b遺伝子の3'領域のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列が示される。H UBC4内に存在するイントロンの3'末端のヌクレオチド配列を小文字で詳細に示す 。3'イントロン/エキソン結合スプライス部位転換イントロン分枝点配列に下線 を付してある； 図３は、マウスUBC4の部分cDNA配列を示し；そして図４はマウスUBC4の対応す るアミノ酸配列構造を示す； 図５は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を示し、(a)YACLMM- YAC1を用いるヒト染色体14q24.3に対するHUBC4aの染色体局在化。(b)YACLMM-YAC 4を用いるヒト染色体12qに対するHUBC4cの局在化。(c)コスミドLMM-COS1を用い るヒト染色体22qに対するHUBC4bの局在化を表す。 図６は、NIGMSヒト/齧歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネル＃２第２版を 用いるHUBC4a、HUBC4b、HUBC4、HUBC4dおよびHUBC4eの染色体位置を示す。 を用いたヒト第14染色体に対するHUBC4aの局在化 を用いたヒト第22染色体に対するHUBC4bの局在化 を用いたHUBC4aおよびHUBC4bの同時増幅 を用いたヒト第14、12、19、および13染色体のそれぞれに対するHUBC4a、HUBC4c 、HUBC4dおよびHUBC4eの局在化 PCR基質として用いたヒト染色体DNAを、各ライン(１−22、Ｘ、およびＹ)の上に 示す。「Ｈ」は総ヒトDNAポジティブコントロール。「Mo」はマウスDNAネガティ ブコントロール。「Ha」はハムスターDNAネガティブコントロール。「Ｃ」DNAな しのコントロール。「Ｍ」DNAマーカー(φx174DNA/HaeIII消化物)。 図７は、組織発現分布を示す、HUBC4aプローブとハイブリダイズしたマウスお よびヒトmRNAのノーザンブロットを示す。 図８は、４つのYACクローン、LMM-YAC１、２、３および４のパルスフィールド ゲル電気泳動を示す。ゲルをサザンブロットし、そして後に記載するように、HU BC4b由来フラグメントをプローブとして用いた。 図９は、酵母UBC4およびヒトHUBC4aまたはHUBC4bの疎水性プロフィールの比較 を示しそれらの類似性を示す； 図10は、HUBC4bの一次アミノ酸配列の、多くの酵母、ヒトおよびショウジョウ バエユビキチン結合酵素の一次アミノ酸配列との、そしてより特定すればUbcH2 、UbcH5、UBC4、UbcD1、BENおよびUbcD-2の一次アミノ酸配列との比較を示す。 この配列データは、対応するタンパク質間の配列および推定され得る機能的類似 性間の類似性を示す； 図11は、同定されたヒト遺伝子(HUBC4a、HUBC4b、HUBC4c)およびマウス遺伝子 (mUBC4)によりコードされる予想アミノ酸配列のアライメントを示す。HUBC4aに よりコードされるタンパク質の全配列が参照配列として示されている。HUBC4b、 HUBC4c、およびMUBC4によりコードされる参照配列と同一の残基をアスタリスク( ＊)で示す。「−」はアライメントを維持するためのアミノ酸配列のシフトを示 す。「・」は未知のアミノ酸組成を示す； 図12は、同定されたヒトHUBC4a遺伝子、HUBC4b cDNA、HUBC4c遺伝子、および マウスHUBC4遺伝子のヌクレオチド配列のならびを示す。HUBC4aのヌクレオチド 配列を参照配列として詳細に示す。HUBC4b、HUBC4c、およびmUBC4によりコード される参照配列と同一のヌクレオチドをアスタリスク(＊)で示す。「−」はアラ イメントを維持するためのヌクレオチド配列のシフトを示す。「・」は未知のヌ クレオチドを示す； 図13は、ヒトおよびマウスUBC4遺伝子を増幅するために使用されたプライマー を示す。図１−３に詳細に示される配列でプライマー(1)、(3)、(5)、(7)、(8) 、(9)、および(11)は5'-3'プライマーであり、そして(2)、(4)、(6)、(10)およ び(12)は3'-5'プライマーであった。プライマーの組み合わせ。プライマー(5)、 (6)、(7)、(8)、(9)および(10)を、ヒトHUBC4遺伝子またはその領域を、mUBC4の 存在下でさえ特異的に増幅するために用いた。PCRは、５分間95℃の予備変性工 程を用い、次いでTaqポリメラーゼ酵素を添加する前に90℃に冷却して行った。 次いで35サイクルのPCRを62℃で15秒間、72℃で20秒間、および94℃で15秒間で 行った。 図14は、HUBC4cをコードするヒト遺伝子の特徴付けた領域のヌクレオチド配列 および予想アミノ酸配列を示す。 表１は、HUBC4aについてHUBC4遺伝子および予想アミノ酸配列の変動を示す。好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、本明細書に記載される疾患に関連し、そして図、特に図２に示され る新規ヌクレオチド配列に関する。図２の遺伝子は新規タンパク質HUBC4bをコー ドする。相当するcDNAクローンはLMM-cDNA1と称され、そして1994年５月10日にN ational Collection of Industrial and Marine Bacteria，23 St Macher Drive ，Aberdeen，AB2 1RY，Scotlandに寄託された。その寄託番号はNC IMB 40626で ある。本発明はまた新規マウスタンパク質mUBC4に関する。相当するcDNAクロー ンはLMM-cDNA2と称され、そして1994年５月10日にNational Collection of Indu strial and Marine Bacteria，23 St Macher Drive，Aberdeen，AB2 1RY，Scotl andに寄託された。その寄託番号はNC IMB 40637である。本発明はまたヒトcDNA およびそれらの転写制御エレメントをコードする本明細書に記載される全遺伝子 に関する。遺伝子HUBC4aおよびHUBC4cは、酵母人工染色体LMM-YAC1(HUBC4a)、LM M-YAC2、LMM-YAC3およびLMM-YAC4(HUBC4c)内に含まれる。これら４つのYACもま た、1994年３月31日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteri a，23 St Macher Drive，Aberdeen，AB2 1RY，Scotlandに寄託された。それらの 寄託番号はそれぞれNC IMB 40627、NC IMB 40628、NC IMB 40629およびNC IMB 4 0630である。コスミドLMM-COS1、LMM-COS2、LMM-COS3もまた1995年３月28日に上 記のように寄託され、そしてそれらの寄託番号は、それぞれ、40711、40712、40 713である。それらはHUBC4bを含む。HUBC4a 、HUBC4b、HUBC4c、HUBC4dおよびHUBC4eの単離および特徴付け(図１、２ および14を参照のこと） この方法を特にHUBC4bについて記載する。HUBC4bクローンは、λGEM2バクテテ リオファージベクター中に調製された正常口蓋粘膜およびオクトントゲニック(o ctontogenic)角化嚢腫cDNAライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼー ションスクリーニングの間で単離された。釣り上げたプラークのcDNA挿入片を、 ベクターに特異的なプライマー(T7プロモータープライマーおよびSP6プロモータ ープライマー)を用いるPCR-１分94℃、２分50℃、３分72℃の30サイクルにより 増幅した。これらの挿入片を次いでアガロースゲル電気泳動により精製した。 精製した挿入片を、二本鎖dsDNAサイクル配列決定システム(Life Technologie s，Paisley，Scotland)を用いて配列決定した。さらに、挿入片を、Boehringer Mannheim Ltdにより製造されたランダムプライミングラベリングキットおよび[ α-³²P]dCTPを用いて放射性標識し、そして次いで正常口腔口蓋粘膜から抽出さ れたRNAから調製されたλZAP cDNAライブラリーをスクリーニングするために用 いた。高いストリンジェンシーの洗浄後にポジティブシグナルを与えるプラーク を単離し、ファージミドを切除し、そしてSequenase Version 2.0配列決定テス ト(USB)を用いて配列決定した。cDNA配列および推定されるタンパク質配列を図 ２aに示す。 HUBC4b遺伝子をコードするコスミドの単離方法は以下の通りである： ベクターpWE15(Clontech，Cambridge Bioscience，Cambridge，UK)中のヒト胎 盤DNAから調製された、ヒトコスミドゲノムDNAライブラリーの500,000コロニー 形成単位(cfu)を、[³²P]標識HUBC4b cDNAプローブを用いてスクニーングした。 ポジティブクローンを選択し、低密度でプレート化し、そして再スクリーニング した。必要であれば、第３ラウンドのスクリーニングを実施し、個々のクローン を単離した。プローブとハイブリダイズするクローンを培養し、そしてDNAを標 準法に従って調製した。コスミドDNAを制限消化し、そして配列決定のためにpBl uescript IIベクター(Stratagene Ltd，Cambridge，UK)中にサブクローン化した 。マウスUBC4の単離と特徴付け(図３および４を参照のこと) 以下に記載するヒトPCRプライマー(1)および(4)を用いて、マウスゲノムDNAか らマウスmUBC4を直接増幅した。次いでこのDNAを上記のようにds DNAサイクル配 列決定キットを用いて配列決定した。cDNA配列および推定されるタンパク質配列 を図３および図４に示す。マウス配列とヒト配列との間の高い程度の相同性に注 目した(図１および２と、図３および４とを比較のこと)。HUBC4 、即ちHUBC4a、HUBC4b、HUBC4c、HUBC4d、およびHUBC4eの染色体局在化(図 ５、６および13を参照のこと) PCRプライマーを、ヒトHUBC4およびマウスmUBC4遺伝子の増幅のために設計し た。 cDNA配列に関して、プライマー(1)、(3)および(5)は5-3'プライマーであり、そ して(2)、(4)および(6)は3-5'プライマーであった。プライマー(5)および(6)は 、マウスmUBC40の存在下でさえ、ヒトHUBC4aを特異的に増幅するために用いた。 標準のPCR条件は、初期の７分間の96℃でのインキュベーション後のホットスタ ート、次いでポリメラーゼ酵素の添加前の80℃への冷却、その後94℃で45秒間、 55℃で30秒間そして72℃で２分間の40サイクルのPCR反応を用いた。増幅された 生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。Taqポリメラーゼおよび/また は緩衝液はPromega Biotechから得た。デオキシヌクレオチドを200μmの最終濃 度で、そしてプライマーは20pmol/100μl PCR反応で用いた。 NIGMS体細胞ハイブリッドパネル第２番(Coriell Cell Repository，401 Haddo n Avenue，Camden，New Jersey 08103，USAから得たNational Institute of Gen eral Medical Services USA)から抽出されたDNAを用いて、HUBC4aの染色体上の 位置を決定した。この目的のためにプライマーペア５および６を用い、体細胞ハ イブリッドに存在するマウスDNAからのマウスmUBC4の増幅を防いだ(図６参照)。 第14染色体に対応するレーンで、ヒトゲノムDNAのコントロールと同じサイズの 唯一のバンドが観察された(図６参照)。 ヒト染色体を用いて調製された中期スプレッド(spread)の蛍光インサイチュハ イブリダイゼーションを、LMM-YAC1由来の総HUBC4a YAC DNAのランダムプライミ ングにより調製されたビオチン化プローブを用いて実施した。14q24.3に相当す る染色体上のバンド位置でシグナルが得られた(図５参照)。HUBC4a 、HUBC4bおよびUBC4の比較(図９および10参照) HUBC4aおよびHUBC4bおよびUBC4タンパク質配列の比較を図９に示す。62%の相 同性が見出される。ヒトHUBC4bと酵母UBC4タンパク質配列の疎水性プロフィール のさらなる比較はまた、顕著な類似プロフィールを示した(図10を参照のこと)。 例えば、ほぼアミノ酸位置40、70、85、100、120にあるピークと谷は、両タンパ ク質で一致している。種々のマウスおよびヒト組織から抽出されたRNAのノーザンブロットを用いるHUB C4bおよびMUBC4のヒトおよびマウス発現分布の比較(図７を参照のこと) マウスおよびヒトから抽出されたRNAのClontechの複数組織ノーザンブロット( それぞれカタログ番号7762-1および7760-1)を、ヒトHUBC4b DNAプローブ(上記の ように調製した)を用いて製造者の指示に従って実施した。HUBC4bに対応するバ ンドを示す。上部バンドの性質は未知である。HUBC4 RNA転写物は検査したすべ ての組織で見出された。マウス脳中における高レベルの発現、その一方ヒト脳に おける比較的低レベルの発現に注目のこと(図７)。HUB4 配列を含む酵母人工染色体の単離(図８を参照のこと) ベクターPYAC4中およびS．cerevisiae AB1380株中のヒトゲノムDNAを用いて調 製されたLeeds University Molecular Medicine Unit YACライブラリーを、標準 的な様式でPCRスクリーニングのために構成した。第１のDNAプールをPCRプライ マーペア11および12を用いてスクリーニングした(図13)。４つのポジティブを同 定した。次いで第２および第３のDNAプールをスクリーニングし、HUBC4配列を含 む個々のYACを同定した。次いでこれらのYACを、他のHUBC4プライマーペア３と ４、および５と６を用いたPCRにより試験した。ポジティブPCRシグナルパターン をアガロースゲル電気泳動上の分析により得た。コントロールYACではポジティ ブシグナルは観察されなかった。次いでPCRから判断された４つのポジティブHUB C4-YAC(LMM1−4)をパルスフィールドゲル電気泳動にかけた。これらの泳動のサ ザンブロット分析を、上記のように調製されたHUBC4b³²P-放射性標識DNAプロー ブとのハイブリダイゼーションにより実施した。ポジティブなオートラジオグラ フシグナルが４つすべてのYAC(図８参照)、LMM(1−4)を用いて達成された。これ ら別のYACにおけるヒトゲノムDNA挿入片のサイジングを、エチジウムブロミド染 色パルスフィールドゲル上で、それらの移動位置を正常のS.cerevisia染色体の 移動位置と比較することにより行った。ポリクローナル抗血清の調製 ペプチドCKNAEEFTKKYGEKRPVDを、ヘテロ二官能性試薬MBS(m-マレイミドベンゾ イル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を用いてヘモシアニン（キーホール リムペット)に結合させた。２匹のウサギ(MAK-1およびMAK-2)をこの結合体を用 いて免疫した。ウサギから規則的な間隔(３、５、７、９および11週)で採血し、 そして抗体力価をELISAにより測定した(最終力価約１：1000）。11週間後抗血清 を集め、そして抗体をアフィニティー精製した。アフィニティー精製した抗体溶 液の力価は、両者とも約１：3000であった。バキュロウイルス発現によるHUBC4遺伝子産物の産生 HUBC4b cDNA、およびHUBC4a遺伝子によりコードされる大量のタンパク質の発 現は、バキュロウイルス系を用いて達成された。転移ベクターの構築 HUBC4b cDNAを、ベクター特異的プライマー(T7プロモータープライマーおよび SP6プロモーターブライマー)を用いて、精製λGEM-2バクテリオファージcDNAク ローンからPCR増幅した。cDNAは、XbaIおよびEcoRIを用いる制限消化により、隣 接ベクター配列から切断した。挿入片をゲル精製し、そして同様に消化した転移 ベクターpBacPAK９(Clontech)中に連結した。連結混合物をコンピテントE.coli DH5α細胞中に形質転換し、そして組換え体を配列決定し、クローン化cDNAの組 み込みを確認した。 HUBC4aオープンリーディングフレーム領域をコードするDNAを、「アンチセン スHUBC4遺伝子をコードするベクターの生成」中で記載したように生成した。PCR 生成物をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、次いでpBacPAK９のSmaI部 位中にクローン化した。オープンリーディングフレームの転写について正しい方 向の挿入片を含む組換え体を選択した。線状化ウイルスDNAの調製 Bsu361線状化BacPAK６DNAをClontechから、または本質的にKittsおよびPossee (1993)に記載のようにBsu361を用いた制限消化により環状ウイルスDNAから生成 した。２μmのウルイスDNAを、37℃で一晩、制限酵素緩衝液中のBsu361で消化し 、次いで65℃で10分間のインキュベーションにより熱不活性化した。次いでこの DNAを４℃で貯蔵した。ウイルスDNAと組換え転移ベクターとの同時トランスフェクション 同時トランスフェクションは、KingおよびPossee(1992)の手順に従って行った 。35mmのペトリ皿に1.5×10⁶のSpodoptera frugiperda細胞を接種し、次いで28 ℃で２時間インキュベートした。2.5μgの組換え転移ベクターDNAおよび0.5μg の線状化ウイルスDNAを殺菌５mlガラス管(bijou)中25μlの容量で混合した。2.5 μlのリポフェクチン(殺菌水で２：１希釈)(Gibco-BRL)をDNAに添加し、そして 混合物を室温で15分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、細 胞単層を２mlの無血清TCI00培地で洗浄し、その後、単層をDNA/リポフェクチン 混合物を添加した1.5mlの培地で覆った。プレートを28℃で８時間インキュベー トし、次いで培地を10%(v/v)のウシ胎児血清を補填したTC100培地で置き換えた 。皿をさらに２日間インキュベートし、その後上清液をウイルス精製のために回 収した。ウイルスの精製 35mmのペトリ皿に1.5×10⁶のSpodoptera frugiperda細胞を接種し、次いで28 ℃で２時間インキュベートした。培地を除去し、そして0.1mlの希釈ウイルス懸 濁液(10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、および10^-4希釈)を各皿の中央に穏やかにピペットで 入れた。ウイルスを１時間室温で吸着させ、その後接種物を除去しそして細胞層 を２mlの37重層[１%(w/v)低ゲル化温度アガロース、50%(v/v)TC100培地、および 2.5%(v/v)ウシ胎児血清]で覆った。重層が固まった後、１mlのTC100/2.5%ウシ胎 児血清を添加して培地を補填し、そしてプレートを３日間28℃で湿潤雰囲気下で インキュベートした。組換えウイルスプラークをニュートラルレッドの存在下X- galで染色して同定した。推定の組換えプラークは、白色プラークとして同定さ れた。ポジティブのプラークを0.5mlのTC100/ウシ胎児血清中に釣り上げそして 再度力価検定した。２ラウンドのプラーク精製を行い組換えウイルスの純粋スト ックを生成した。HUBC4 遺伝子産物の単離 大量の発現されたHUBC4遺伝子産物を生成するために、Spodoptera frugiperda 細胞を、50mlのTC100/2.5%ウシ胎児血清を含むスピナーフラスコ中、約10⁶/mlの 密度まで増殖させた。細胞を感染多重度３〜５で感染し、次いで28℃で３日間イ ンキュベートした。タンパク質を回収するために、細胞を、培地から、5000gで1 0分間の遠心分離によりペレット化した。次いで細胞をリン酸緩衝化生理食塩水 中で洗浄し、そして次いで１mM NEMおよび１mM PMSFを含むTENT緩衝液[100mM Tr is-Cl、pH7.5、0.1M NaCl、１%(v/v)Triton X-100、１mM EDTA]の存在下音波処 理により溶解した。放出されたタンパク質は、硫酸アンモニウムを用いて沈殿さ せ、次いでFPLCにより精製した。参考文献 King，L.A.およびPossee，R.D.(1992)．「バキュロウイルス発現系、実験室ガイ ド」、１〜229頁、Chapman and Hall、London． Kitts，P.A.およびPossess，R.D.(1993)．「高頻度で組換えウイルス発現ベクタ ーを生成する方法」、Biotechniques 14，810〜817．アンチセンスHUBC4遺伝子をコードするベクターの生成 HUBC4 アンチセンスRNA発現ベクターの構築 HUBC4b cDNAを、ベクター特異的プライマー(T7プロモータープライマーおよび SP6プロモータープライマー)を用いて精製λGEM２バクテリオファージHUBC4b cD NAクローンからPCR増幅した。cDNAを、XbaIおよびEcoRIを用いた制限消化により 隣接ベクター配列から切断した。挿入片をXbaI、EcoRI消化原核/真核生物発現ベ クターpBK-CMV(Stratagene)中にクローン化した。プラスミドをコンピテントE. ｃoli XLI-Blue MRF中に形質転換し、配列決定分析のために挿入片を含むコロニ ー を選択し、正しい挿入方向および配列組み込みを確認した。アンチセンスHUBC4b 構築物(pLMM-AS1)のCMV即時初期プロモーターからの転写は、HUBC4bc DNAのアン チセンス鎖の転写を生じる。 HUBC4aアンチセンス発現ベクターの構築には、遺伝子は、最初、オリゴデオキ シヌクレオチドプライマー(5'd-ATGGCGGCCAGCAGGAGGCTG3'および5'd-CTTTACAGGT TACCTAGACCAC3')を用いてヒトゲノムDNAからPCR増幅した。PCR生成物は、T4DNA ポリメラーゼを用いて平滑末端とし、そしてpBK-CMVベクターのSmaI部位中に連 結した。連結生成物をE.coliXLI-Blue MRF中に形質転換した。クローン化された 挿入片を含むコロニーを配列決定し、アンチセンス方向に挿入片を含むコロニー を選択した(pLMM-AS2と呼ぶ)。細胞培養 HeLa細胞は、10%ウシ胎児血清、10μg/mlストレプトマイシン、および50μg/m lペニシリンを補填したDMEM中に維持した。アンチセンス細胞株を構築するため に、細胞を、「真核生物細胞への核酸およびタンパク質のリポソーム-仲介送達 」に詳細に記載したように、カチオン性-リポソームDOTAPを用いてpLMM-AS1また はpLMM-AS2でトランスフェクトした。ベクター維持のための選択は、細胞培養培 地中に薬剤G418を含めることにより達成した。真核生物細胞への核酸およびタンパク質のリポソーム-仲介送達 HUBC4/mUBC4、若しくはその部分に相補的な配列を含む遺伝子、cDNA、オリゴ ヌクレオチドをコードする配列を含む核酸、またはHUBC4/mUBC4遺伝子、若しく はその部分によりコードされるタンパク質の核酸を用いた細胞のトランスフェク ションは、DOTAP、N-[1-2,3-ジオルコイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル アンモニウムメチルスルフェート(Boehringer Mannheim)、カチオン性-リポソー ムトランスフェクション試薬を用いて行った。細胞のトランスフェクション方法 細胞調製 接着組織培養細胞の１〜３×10⁵アリコートを、トランスフェクションに先立 つ日に５〜６mlの組織培養培地を含む60mm直径組織培養皿中で継代した。核酸/リポソーム複合体の調製 ５μgのDNAを、殺菌反応チューブ中のHEPES緩衝液[20mM HEPES(細胞培養グレ ード)、pH7.4]中に0.1μg/mlまで希釈した。第２番目のチューブで、30μlのDOT APをHEPES緩衝液で100μlに希釈した。50μlの核酸溶液を、DOTAP懸濁液と混合 し、ピペッティングにより穏やかに混合し、次いで室温で15分間インキュベート した。細胞トランスフェクション トランスフェクションの直前に、DOTAP/核酸混合物を、５〜６mlの殺菌組織培 養培地と混合した。細胞を覆う培地を注ぎ出し、そしてDOTAP/核酸を含む培地を 細胞に添加した。細胞を37℃で６時間インキュベートし、その後、培地を新鮮培 養培地で置き換えた。原核生物細胞におけるHUBC4の発現 平滑末端HUBC4挿入片(10ng)を、ゲノムDNAのRT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖 反応)そしてまたPCRの両方により生成し、そしてpGEX-3X(100ng)のSmaI制限エン ドヌクレアーゼ部位中にサブクローン化した。次いでこのDNA構築物を用いてコ ンピテントE.coli DH５α細胞(100μl)を形質転換した。形質転換細胞を、50μg /mlアンピシリンを含むLB寒天平板上の増殖により選択した。 プラスミドDNAを選択したコロニーの一晩培養から単離し、そしてグルタチオ ンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質生成物の発現のために正しいリーディン グフレームにある挿入片の存在を確立するために配列決定した。 挿入片を含む形質転換細胞の一晩培養の１：100希釈を、光学密度0.5(波長600 nmで)まで増殖させた。次いで、イソプロピル-β-D-チオガラクトシドを１mMの 濃度に添加し、そして細胞をさらに５時間増殖させた。 細胞抽出物を以下のように調製した。ブロスを遠心分離し(2000g10分間)そし て細胞ペレットを集めた。次いでこれらの細胞をPBS(140mM塩化ナトリウム、2.7 mM塩化カリウム、10mMオルトリン酸二ナトリウムおよび1.8mMリン酸二水素カリ ウムpH7.3)に再懸濁した。細胞を音波処理し、そしてTriton X100を最終濃度１% に添加し、そして30分間混合した。次いで抽出物を遠心分離した。上清液を融合 タンパク質のアフィニティー精製に用いた。 上清液を１%Trionを含むPBSで30分間平衡化したグルタチオン-セファロース4B と混合した。次いでこの懸濁液を、500gで５分間の遠心分離により沈降させた。 セファロースペレットをPBSで３回洗浄した。次いで融合タンパク質を、10mMグ ルタチオンを含む50mM Tris/HCl緩衝液、pH8.0を用いて20℃で10分間、セファロ ースビーズとインキュベートすることにより溶出した。この溶出手順をさらに２ 回繰り返した。マイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の生成 DNAマイクロインジェクションおよびトランスジェニック動物の生成は、本質 的に、Transgenic animal technology; A laboratory handbook、Carl A．Pinke rt編集；Academic Press Inc．1994の第２章に記載されるように実施した。簡単 に述べれば、これは以下を包含する： １．５単位の妊娠成熟雌の血清ゴナドトロピン(PMSG)の腹腔内注射、次いで47時 間後の５単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)による６週齢の雌F1ハイブリッ ドマウス(CBA/J×C57B1/6)の過剰排卵。 ２．過剰排卵するドナーの母体をHCG注射後の繁殖性雄マウスとともにケージに 入れた。翌朝、雌の交尾プラグをチェックし、その存在を交尾のサインとした。 ３．交尾した雌をスケジュール１法を用いて屠殺しそして輸卵管を取り出した。 卵を輸卵管からヒアルロニダーゼM2培地中に、鉗子を用いて裂くことにより放出 した。M2培地で洗浄した後、卵を、DNAマイクロインジェクションの前にM16培地 中、37℃、５%CO₂でインキュベートした。 ４．マイクロインジェクションのプラスミドDNA構築物は、標準のクローニング 技術を用いて調製し、そしてセシウムクロライドグラジエント(２回行った)から スーパーコイルDNAを単離することにより高度に精製した。プラスミド構築物を 線状化し、フェノール/クロロホルムエタノール沈殿を用いる精製の前に、ベク ター配列を取り除いた。YAC DNAを、Schedlら、1993、Nature 362，258-261の方 法に従って注射用に調製した。 ５．マイクロマニピュレーター(Narashige)に取り付けた専用顕微鏡(Zeiss)を用 いて２〜４ng/μlの濃度でDNAを注入した。保持および注入ピペット用の針の調 製は、Pinkert 1944に記載される方法に従ってSutter model P-87ピペットプラ ーを用いて行った。 ６．注入卵母細胞を、精管切除した雄との交尾により偽妊娠させた偽妊娠受容母 体の輸卵管中に移入した。受容母体を全身麻酔下に置き、そして５mmの外科切開 を卵巣脂肪パッド上に作成した。卵巣および輸卵管に沿った脂肪パッドを体外に 露出させ、そしてセラフィンクリップで適当な位置に保持した。卵巣の周囲の嚢 を鉗子で引き裂き卵管漏斗を表示した。ガラスキャピラリー針を用いて注入した 卵母細胞(15〜20)を口によるピペッティングおよび立体解像顕微鏡の補助により 卵管漏斗中に吹き込んだ。生殖管を注意深く腹腔中のもとの位置に置き、そして 体壁および皮膚を縫合により閉じた。 ７．受容母体を回復させそして出産させた。乳離れした子孫を、ゲノム尾(genom ic tail)DNAのサザンブロッティングまたはPCR分析により導入遺伝子の存在につ いて分析した。胎芽幹(ES)細胞における相同組み換えを用いるトランスジェニック動物の作製 mUBC4およびHUBC4遺伝子への変異の導入および無変異の発生をES細胞における 相同組み換えを用いて行った。標準のクローニング手順を用いてターゲッティン グベクターを構築した。置換型ベクター（Dengら、1993；Mol．Cell．Biol．13( 4)、2134-2140）を用いて、遺伝子のコーディング領域をneo^r遺伝子で置き換え ることによって、ネオマイシン抵抗性をターゲット細胞に付与した。ランダムな 組込み事象に対抗して選択するためにネガティブ選択マーカー（単純ヘルペスウ ィルスのチミジンキナーゼ(HSV-TK)）をターゲッティング構築物の3'末端に含ま せた。変異をUBCコーディングおよびフランキング配列に導入するために、挿入 型ベクターもまた作製した（Dengら1993、上記）。さらに、遺伝子ターゲッ ティングおよび条件的にターゲットされた変異体の作製を、バクテリオファージ P1のCre-loxP組み換え系（Guら、1993、Cells 73、1155-1164により記載される ように）を用いて行った。異なる型のターゲッティング構築物をES細胞に導入し 、それを用いてトランスジェニックマウスを作製したが、それは、Gene Targeti ng-A Practical Approach（A.L.Joyner編）IRL Press Oxford 1993に記載される のと同様の方法で行った。簡潔に述べると、これは以下を含む： １．37℃で、DMEM＋20％ウシ胎児血清中で初代マウス胚芽繊維芽細胞の分裂期に 停止させたneo^rフィーダー(feeder)層でのES細胞（マウス129系由来）の培養。 ２．500μF、240Ｖで６ミリ秒間、Bioradのジーンパルサーにおいてエレクロポ レーションによるES細胞へのターゲッティング構築物のトランスフェクション。 細胞を回収し、ES細胞で分裂期に停止させたフィーダー層を含むペトリ皿に播種 する。24時間後、350〜400μm/mlのG418を添加してポジティブ選抜を開始し、そ して２μmガンシクロビルまたは0.2μm FIAUでネガティブ選抜を行う。培地を毎 日交換し、そして９〜11日後に抵抗性コロニーを同定する。 ３．生存するES細胞コロニーを、ターゲット部位での相同組み換えのためにPCR を用いて個々にスクリーニングし、そしてES細胞由来のゲノムDNAを用いるサザ ンブロットを用いて確認する。 ４．ターゲットされたES細胞クローンを増殖し、アリコートを凍結した後、胚盤 胞(blastocysts)へ注入した。注入のために、細胞を、PBSで２回洗浄し、その後 培養皿の細胞のトリプシン処理により調製した。ピペッティングを繰り返すこと により培養培地中にES細胞を分離し、細胞懸濁液を培養皿に移し、そして37℃で １時間インキュベートして、ES細胞をフィーダー層から分離させた。上清を除い た後、ES細胞を、培養培地でピペッティングの繰り返しにより培養皿から分離し 、遠心分離によりペレット化し、次いで100〜500μlの培養培地で再懸濁した後 、胚盤胞注入を行った。 ５．C57B1/6胚盤胞を、交尾後3.5日の交配したメスの子宮からフラッシュし、37 ℃でM16培地中でインキュベートして、注入に使用した。 ６．倒立型顕微鏡（Zeise）およびトランスジェニック動物作製用に設計された 特製のマイクロマニピュレーター（ナラシゲ）を用いて、胚盤胞にES細胞を注入 した。10-15個のES細胞を各胚盤胞に注入し、そして注入された胚盤胞を、１〜 ２時間M16培地中でインキュベートした後、偽妊娠の仮の母親に移植した。 ７．注入された胚盤胞を、交尾後2.5日の偽妊娠メスの子宮に移植した。偽妊娠 のメスは、正常なメスを精管切除したオスと交配することにより作製した。生ま れたオスのキメラな子孫（毛の色より決定される）を、C57VL/6と交配し、導入 遺伝子の生殖系列転移について試験した。生殖系列キメラの子孫を用いて、繁殖 コロニーを樹立し、遺伝子背景が異なる実験動物を作製した。アルツハイマー病の診断 図１、２また14に開示するDNAおよびタンパク質の配列構造を用いて、診断目 的のためのポリヌクレオチドプローブ（例えば図13参照）を、所望により、構築 し得、それは、DNAタンパク質またはRNA配列の任意の部分とハイブリダイゼーシ ョン可能であり、その部分がポリペプチドに翻訳され得るか、されないかは無関 係である。さらに、所望するHUBC4なるタンパク質は、RNA配列の形態であれば、 対応するcDNA配列に、例えば逆転写酵素を用いて転写され得、そのcDNA配列の任 意の部分に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブの使用により 決定されるタンパク質である。ポリヌクレオチドプローブは、決定すべき充分な 長さの配列に対してハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を包含し得ることが 理解され得る。確実にするためには、プローブは、決定すべき少なくとも８個の 連続するヌクレオチドに対してハイブリダイゼーション可能であり、好ましくは 少なくとも10個の連続するヌクレオチドに対して、より好ましくは少なくとも12 個の連続するヌクレオチドに対してそして特に少なくとも14個のヌクレオチドに 対してハイブリダイゼーション可能である。本発明のヌクレオチドプロセスは、 当該分野で公知の技術に従って、標識またはマークされ得る。例えば、従来方法 における^[32]P放射性標識、または代わりにハイブリダイゼーション技術におけ る周知の他の方法による放射性標識（例えば、^[32]S放射性標識プローブを与え る）である。プローブは、所望すれば、蛍光マーカーを有し得る。それらは、代 わりに、ビオチンまたは同様の化学種を用いてD C Wardらの方法により標識され 得る。それは、1981 ICN/UCLA Symposium on Development Biology Using Purif ied Ge nes（Keystone(Colorado)にて、３月15-20日(1981)開催）のプロシーディング（ xxiii巻、19891、647-658頁、Academic Press；編者Donald E Brownら）に記載 される。あるいは、A D B Malcolmらの方法（the 604th Biochemical Society M eeting(Cambridge，England、1983年７月１日の会合)の要約集）により酵素標識 され得る。前述のHUBC4なるタンパク質は、抗体を用いて決定され得、抗体は、 ポリクローナルであり得るが、好ましくはモノクローナルであり、前述のゲノム DNA配列または対応するRNA配列の少なくとも１部分にコードされるポリペプチド 配列に対して惹起される。それ故、抗体は、前述の染色体DNA配列または対応す るRNA配列によりコードされるタンパク質に対して結合し得るか、またはタンパ ク質の任意のフラグメントに対して結合し得る。さらに、抗体フラグメントもま た、前述のように、本目的のために使用し得る。 本発明の前記抗体は、所望すれば、標識またはマーカー成分を有し得る。それ は、例えば、既に記載されたように本発明のポリヌクレオチドプローブに関連し てである。従って、抗体は、例えば、蛍光マーカーを有し得る。しかし、本発明 の抗体が標識またはマーカー成分を有することは必要でない。それ故、例えば、 本発明の抗体は、本発明の抗体に対する抗体、例えば、ヤギ抗マウス免疫グロブ リンなどの２次抗体により同定され得る。この場合、２次抗体は、標識またはマ ーカー成分を有し得る。 アルツハイマー病の素質の診断のために、本発明は以下の様式で都合良く実施 し得る。mRNAを、調査対象の被験者の末梢血の白血球細胞より標準技術で単離す る。これを、プライマーとしてオリゴ-dTおよび、例えば、逆転写酵素を用いて １本鎖のcDNAにコピーする。１本鎖cDNAを２本鎖型に変換し、そしてプラスミド 、バクテリオファージまたはコスミドベクターにクローン化し得る。HUBC4配列 を有するクローンを同定するために、上記で定義されるHUBC4遺伝子配列内に由 来するポリヌクレオチドプローブを使用し得る。そのようなクローンにおけるcD NA配列は、標準技術、例えば、Applied Biosystems 373A-01型DNAシーケンサー を用いて決定し得る。このようにして得られた配列は、本明細書のHUBC4につい て提供される正常配列と比較され得る。このようにして、調査中の個体における HUBC4 mRNA中に存在する任意の変異を検出し得る。患者サンプル中のmRNAの分析 の 代わりの方法が本発明の実施において使用され得ることは、当業者により理解さ れ得る。例えば、RT-PCR（逆転写ポリメラーゼチェーン反応）の技術を適応し得 る。この場合、PCR反応で使用される２つのオリゴヌクレオチドの１つは、本明 細書で提供されるHUBC4コーディング配列内から誘導され得る（図13参照）。 本発明を実施するための代わりの方法は、個体からのDNAの分析を含み得る。 このような分析はHUBC4遺伝子のPCR増幅により都合良く行われるが、それはHUBC 4 cDNAの任意の部分に対してまたはHUBC4遺伝子の任意の部分に対してまたは酵 母人工染色体、LMM-YAC1、LMM-YAC2、LMM-YAC3あるいはLMM-YAC4またはコスミド LMM-COS1、LMM-COS2およびLMM-COS3内に含まれるDNA配列の任意の部分に対して ハイブリダイズできるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いて行わ れる。このようにして得られるPCR産物について、当該分野で周知の方法により 直接都合良く配列決定を行い、個体の配列とHUBC4遺伝子の正常配列との間の差 異を確立する。 本発明は、HUBC4 cDNAまたは遺伝子配列を遺伝子ターゲッティングベクターに 挿入し、外来性のターゲッティングDNAと内在性の標的遺伝子（例えば、培養中 のマウスの胚芽幹細胞において）との間の相同組み換えを可能とすることにより 、さらに実施され得る。相同組み換えは、正常または特定の変異配列のいずれか を有する種々のヒトまたはマウスUBC4遺伝子を用いて行い得る。遺伝子ノックア ウト技術を用いて、マウスまたは他の動物種におけるUBC遺伝子および特にそれ に由来する胚芽幹細胞におけるUBC遺伝子との間の相同組み換えを、本明細書に 開示するタイプの改変されたUBC4遺伝子を用いて実行し得る。その場合、そのよ うなUBC4遺伝子のコード配列は、外来性の核酸配列の挿入により故意に破壊され る。そのような外来性核酸配列は、例えば、それ自体タンパク質をコードし得る 。例えば、ネオマイシン抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をUBC4 コーディング配列に挿入し得、その結果、相同組み換え後、UBC機能を破壊する 一方で、トランスフェクションされた細胞株は、大量のネオマイシンまたはG418 中で増殖可能となる。トランスジェニック動物作製のために当該分野の周知の種 々の他の技術は、本発明の実施に等しく適用され得る。このことは、UBC4核酸配 列の前核への直接注入または胚芽幹細胞のトランスフェクションによるそのよう な変異の導入、胚盤胞への再導入およびキメラ動物の育種を包含し得る。 本発明の方法はまた、上記のように誘導されるHUBC4タンパク質内にある抗体 を認識するエピトープを使用して実施し得る。タンパク質が短縮された形態で産 生されることになるHUBC4対立遺伝子を有する個体は、例えば、その末梢血白血 球または脳脊髄液由来の腰椎穿刺により得られる細胞に由来するタンパク質のウ ェスタンブロット分析により同定され得る。HUBC4変異に対するヘテロ接合体（ および疾患が常染色体優勢であるとすれば、それ故ADの危険性を有する個体）は 、本発明の抗体を用いるウェスタンブロットにより分析する場合、２つの大きさ のタンパク質を示す。そのような個体は、正常タンパク質＋短く切断された変形 物を産生し得る。同様の様式で、HUBC4タンパク質のスプライス変異体を検出し 得る。それは、正常体より大きい変異型HUBC4を実際に産生し得る。変性疾患の処置 DNAおよび／またはタンパク質配列構造、または図１、２、または14に示すそ れらの任意の部分を、疾患の処置のために使用し得る。それは、HUBC4の非変異 体が従来技術を用いて製造され、およびその後に送達されるが、再び従来の送達 手段（上記の「核酸およびタンパク質の真核細胞へのリポソームを介する送達」 の項参照）を使用して、標的部位に送達しアルツハイマー病のような変性疾患の 進行を阻止する、または代わりに、アルツハイマー病またはダウン症候群のよう な変性疾患の影響を緩和する観点を有し得る場合である。 図１、２または14に示すDNA配列構造、またはその任意の部分は、宿主細胞に 組み換え的に導入し得（「原核細胞におけるHUBC４の発現」の項参照）、そして 引き続いて対応するタンパク質の供給を目的で発現され得る。このタンパク質は 、リポソーム内にパッケージされ、注入などにより直接CNSに送達し得る。 代わりとして、従来の組み換えベクターを使用して、遺伝子配列構造、または その部分（標的部位に対して図１、２または14に示す）を有し得、そしてまた当 該配列構造を発現し、標的部位で非変異型のユビキチン結合酵素を提供し得る。治療の開発 従来技術を用いて、非ヒトのトランスジェニック動物を作製し得、その動物は 、図１、２、３、４および14に示す遺伝子および対応するタンパク質の変異型を 供給し得る。さらに、これらの動物を改変してこれらの遺伝子、または１部は、 欠失しているかまたは発現しないようにし得る。そのような動物は、アルツハイ マー病またはガンのような変性疾患に対する素質を有し得、そして、アルツハイ マー病またはガンのような変性疾患に対して活性な治療剤の開発および試験のた めのその後の調査において有用であり得る。参考文献 １．Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91巻 8797-8801頁(1994)p53のE6-AP-依存性ユビ キチン化に介在するヒトユビキチン結合酵素の同定。 ２．Journal of Biological Chemistry 269巻 13号 9582-9589頁(1994)ユビキチ ン介在性タンパク質分解系による腫瘍抑制タンパク質p53の分解は新規な種のユ ビキチン-キャリアタンパク質、E2を必要とする。 ３．Cell 75巻、495 505(11月 1993)HPV 16 E6およびE6-AP複合体はp53のユビキ チン化においてユビキチン-タンパク質リガーゼとして機能する。 ４．Journal of Biological Chemistry 269巻 13号 9574-9581頁(1994)新種のユ ビキチン-キャリアタンパク質E2の精製および特徴付け、それは非「Ｎ端則」タ ンパク質基質の分解に関与する。 ５．Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90巻 10484-10488頁。 ６．J.Biolog Chem 269巻 8797-8802頁。 ７．Genomics 12 447-453。 ８．Rogers S.ら Science 234 364-368 1986。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/47 9359−4Ｂ 9/10 16/18 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/21 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＡＭ 9/10 9051−4Ｃ ＡＡＢ Ｃ１２Ｑ 1/68 9051−4Ｃ ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ９４２３７０２．１ (32)優先日 1994年11月24日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ユビキチン結合酵素をコードする核酸またはその一部であって、該核酸の相 補配列がストリンジェントな条件下で図１のヌクレオチド配列にハイブリダイズ する、核酸。 ２．遺伝子配列構造がヌクレオチド３２０でのヌクレオチド置換を包含する、請 求項１に記載の核酸。 ３．前記置換がチミンからシトシンへの置換である、請求項２に記載の核酸。 ４．前記遺伝子配列がヌクレオチド６０５でのヌクレオチド置換を包含する、請 求項１〜３のいずれかに記載の核酸。 ５．前記置換がアデニンからグアニンへの置換である、請求項４に記載の核酸。 ６．前記遺伝子配列構造が表１に示される１つまたはそれ以上の改変体のいずれ かを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。 ７．請求項１に記載の核酸によりコードされるタンパク質、またはその一部。 ８．前記アミノ酸配列構造が２３位でのアミノ酸置換を包含する、請求項７に記 載のタンパク質。 ９．前記置換がシステインからアルギニンへの置換である、請求項８に記載のタ ンパク質。 １０．前記アミノ酸配列構造が１１８位での置換を包含する、請求項７、８、ま たは９に記載のタンパク質。 １１．前記置換がリジンからグルタミン酸への置換である、請求項１０に記載の タンパク質。 １２．前記アミノ酸配列構造が表１に示される１つまたはそれ以上の改変体を含 む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。 １３．ストリンジェントな条件下で請求項１〜６に記載のDNA配列構造にハイブ リダイズし得るヌクレオチド配列、または対応するRNA配列構造を含む、ポリヌ クレオチド。 １４．標識またはマーカーをさらに含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド 。 １５．図１３に示される少なくとも１つのプローブあるいは該プローブが前記DN A配列構造にハイブリダイズすることを妨害しない欠失または付加を有する実質 的に同様のプローブを含む、請求項１３または1４に記載のポリヌクレオチド。 １６．図１、２、または１４に示されるDNA配列構造の全体または一部に相補的 なアンチセンス配列。 １７．請求項７〜１２に記載のアミノ酸配列構造の全体または一部にそれぞれ特 異的な抗体。 １８．前記抗体が請求項７〜１２に記載のアミノ酸配列構造のアミノ酸６０〜９ ０に対して惹起される、請求項１７に記載の抗体。 １９．前記抗体が前記アミノ酸配列構造のアミノ酸７２〜８８に対して惹起され る、請求項１７または１８に記載の抗体。 ２０．前記抗体が請求項７〜１２に記載のアミノ酸配列構造のＣ末端アミノ酸に 対して惹起される、請求項１７に記載の抗体。 ２１．前記抗体がアミノ酸１３７〜１５４に対して惹起される、請求項２０に記 載の抗体。 ２２．請求項１〜６のいずれかに記載のDNA配列構造の全体または一部、および ／または、請求項７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列構造の全体または一 部を包含する、送達手段。 ２３．マウスユビキチン結合酵素をコードする核酸またはその一部であって、該 核酸の相補配列がストリンジェントな条件下で図３に示されるヌクレオチド配列 にハイブリダイズする、核酸。 ２４．請求項２３に記載の核酸によりコードされるタンパク質、またはその一部 。 ２５．請求項２４に記載のアミノ酸配列構造の全体または一部に対して惹起され る抗体。 ２６．請求項２３に記載のDNA配列構造の全体または一部、および／または、請 求項２４に記載のアミノ酸配列構造の全体または一部を包含する、送達手段。 ２７．請求項７〜１２に記載のタンパク質の活性をブロックする因子を包含する 、送達手段。 ２８．前記因子が抗体である、請求項２７に記載の送達手段。 ２９．遺伝子物質が、図１、２、または１４に示されるDNA配列構造の少なくと も１つのコピー、および／または、請求項１〜６に記載のDNA配列構造の少なく とも１つの変異または多形性改変体を含む、非ヒトトランスジェニック動物、あ るいは、遺伝子材料が、図３に示されるDNA配列構造によりコードされるタンパ ク質が非機能的であるかまたは発現されないかのいずれかであるように該DNA配 列構造の一部を含まない、非ヒトトランスジェニック動物。 ３０．非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物の生殖細胞および体細胞 が、図１、２、または１４のDNA配列構造の少なくとも１つのコピー、および／ または、請求項１〜６に記載のDNA配列構造の少なくとも１つの変異または多形 性改変体、またはその機能的関連部分、および／または、請求項１〜６のいずれ かに記載のDNA配列構造の組換え活性化変異形態、および／または、図３に示さ れるDNA配列構造によりコードされるタンパク質が非機能的であるかまたは発現 されないかのいずれかであるような該DNA配列構造の非存在を含む、非ヒトトラ ンスジェニック動物；および同じ遺伝子配列を有するその子孫。 ３１．前記動物が齧歯類である、請求項２９または３０に記載の非ヒトトランス ジェニック動物。 ３２．請求項３０に記載の非ヒトトランスジェニック動物により生産される、ト ランスジェニック子孫。 ３３．変性疾患の素因または存在を診断する方法であって、テストすべき個体か らのテストDNA配列構造と、図１、２、または１４に示される配列構造またはそ のいすれかの一部との比較を包含する、方法。 ３４．請求項３３に記載の方法であって、テストすべき個体からのヒト染色体14 q24.3由来のテストDNA配列構造と、図１および／または図２および／または図１ ４に示されるDNA配列構造またはその一部との比較を包含する、方法。 ３５．ガンの素因またはかかりやすさを診断する方法であって、テストすべき個 体からのテストDNA配列構造と、図１、２、または１４に示されるDNA配列構造ま たはその一部との比較を包含する、方法。 ３６．請求項３５に記載の方法であって、テストすべき個体からのヒト染色体22 q由来のテストDNA配列構造と、図２および／または図１および／または図１４に 示されるDNA配列構造またはその一部との比較を包含する、方法。 ３７．図１、２、１４、または３に示されるDNA配列と全体または一部のいずれ かが同一の組換えDNA配列、またはそのいすれかの一部。 ３８．図１、２、１４、または４に示される１つまたはそれより多いタンパク質 のいずれかを発現し得る、発現システム。 ３９．前記システムがまた前記タンパク質を輸出し得る、請求項３８に記載の発 現システム。 ４０．前記タンパク質をコードする遺伝子のマルチコピーを含む、請求項３８ま たは３９に記載の発現システム。 ４１．前記システムが増強されたプロモーターを含み、それにより前記タンパク 質の発現が増強される、請求項３８、３９、または４０に記載の発現システム。 ４２．図１、２、１４、または４に示されるいすれか１つまたはそれより多いタ ンパク質を発現し得る、形質転換された宿主細胞。 ４３．請求項３８〜４１に記載のいずれか１つまたはそれより多い発現システム で形質転換された、組換え宿主細胞。 ４４．ヒトユビキチン結合酵素を生成する方法であって、請求項３８〜４１に記 載の１つまたはそれより多い発現システムて形質転換された組換え宿主細胞を培 養する工程を包含する、方法。 ４５．図１、２、または１４に示されるDNA配列構造および／またはタンパク質 配列構造またはそのいずれか一部の、変性疾患またはガンの処置への使用。 ４６．図１、２、または１４に示されるDNAおよび／またはタンパク質配列構造 またはそのいずれか一部を用いる、変性疾患の処置方法。 ４７．図１、２、１４、または４に示される配列構造を有するタンパク質または ポリペプチド、あるいはそのいずれか一部、あるいはそのホモログ。 ４８．図１に示される配列と全体または一部のいすれかが同一のヌクレオチド配 列を有するHUBC4遺伝子のクラスを含む、酵母人工的染色体。 ４９．図１に示される配列と全体または一部のいずれかが同一のヌクレオチド配 列を有するHUBC4遺伝子のクラス、ならびにプロモーターおよびエンハンサーを 包含するそれらの遺伝子制御エレメントを含む、コスミドクローン。