WO2004005512A1 - 新規タンパク質およびその用途 - Google Patents

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WO2004005512A1
WO2004005512A1 PCT/JP2003/008666 JP0308666W WO2004005512A1 WO 2004005512 A1 WO2004005512 A1 WO 2004005512A1 JP 0308666 W JP0308666 W JP 0308666W WO 2004005512 A1 WO2004005512 A1 WO 2004005512A1
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protein
seq
present
salt
dna
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PCT/JP2003/008666
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English (en)
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Inventor
Nobuyuki Koyama
Kenichi Noguchi
Atsushi Nishimura
Masayuki Takizawa
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to genes related to diseases such as heart diseases and uses thereof. More specifically, a method for screening a drug (eg, a prophylactic or therapeutic agent for heart disease, etc.) using the disease-related gene or gene product, an antisense polypeptide against a disease-related gene useful as a diagnostic marker for heart disease A nucleotide; an antibody against the disease-related gene product; Background art
  • Heart failure is considered to be inadequate contraction of the heart muscle.
  • the mechanism of the onset may be as follows. Myocardial damage, mechanical and functional abnormalities of the heart pump, pressure overload due to high blood pressure and pulmonary hypertension, volume overload such as anemia and acute nephritis can cause the heart to pump out blood volume according to the demands of the organism A state of disappearance occurs.
  • compensatory mechanisms such as the sympathetic nervous system and the nervous system endocrine system operate to maintain the homeostasis of the living body.
  • the compensatory mechanisms of heart failure include: 1) the above-mentioned load increases, the heart's contractile force increases, and the heart expands as the length of the sarcomer increases.2) The contraction unit of the myocardium increases, and as a result, Hypertrophy occurs. 3) Neurohumoral factors are activated to compensate for the inability to excrete the necessary blood throughout the body, and myocardial fibrosis progresses locally. Basically, the mechanism is to adapt to a given load.However, insufficient operation may promote heart failure, while excessive operation may lead to myocardial injury and exacerbate heart failure In some cases. As a result of activation of the compensatory mechanism, myocardial cells are enlarged and cardiac hypertrophy occurs.
  • ischemia occurs when a sufficient amount of blood is not supplied to the enlarged cardiomyocytes, which results in myocardial damage such as myocardial contraction dysfunction, resulting in decreased cardiac output, organ circulatory disorders, venous congestion, Heart failure symptoms with fluid retention A group will come.
  • Treatment for this requires improvement of myocardial cell damage, enhancement of cardioprotective effects, recovery of cardiac dysfunction due to myocardial systolic insufficiency, and suppression of the decompensation of the living body, which is the cause, or improvement of excessive compensation mechanisms. Become.
  • inotropic drugs such as 1) cardiac glycosides such as digoxin, 2) sympathomimetics such as dobutamine, 3) phosphodiesterase inhibitors such as amrinone, and vascular Hydralazine, calcium antagonists, angiotensin I converting enzyme inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, and the like have been used as extenders.
  • cardiac glycosides such as digoxin
  • sympathomimetics such as dobutamine
  • phosphodiesterase inhibitors such as amrinone
  • vascular Hydralazine calcium antagonists
  • angiotensin I converting enzyme inhibitors angiotensin II receptor antagonists, and the like
  • zero blockers and the like are used.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, obtained a novel gene whose expression fluctuates at the onset of heart failure in a myocardial infarction model rat due to coronary artery ligation, and further studied. As a result, the present invention has been completed. That is, the present invention
  • an antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the protein according to (1) or the partial peptide according to (5) or a part thereof,
  • kits for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein or its partial peptide or a salt thereof characterized by comprising:
  • SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36 which can be obtained using the screening method described in (20) or the screening kit described in (21).
  • SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36 which can be obtained using the screening method described in (24) or the screening kit described in (25).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18 which can be obtained by using the screening method described in (36) or the screening kit described in (38).
  • (40) a medicament comprising the compound according to (39) or a salt thereof, (41) a medicament according to (40), which is a prophylactic or therapeutic agent for heart disease,
  • a heart disease characterized by administering to a mammal an effective amount of the compound or the salt thereof according to (22), (23), (26), (27) or (39).
  • the present invention provides (44) DNA encoding the protein of (1) above or a mutant DN thereof
  • a non-human DNA transgenic animal having A having A,
  • test compound is administered to the non-human mammal according to (54), wherein the rodent is a mouse; and (56) the animal according to (53), wherein expression of the reporter gene is detected.
  • a protein or partial peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36, or a salt thereof (protein B of the present invention) ) Is produced by culturing cells having the ability to produce the protein B of the present invention in the presence of the test compound, and (ii) culturing cells having the ability to produce the protein B of the present invention in the presence of the test compound.
  • a method of screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of protein B of the present invention which comprises measuring and comparing each of them.
  • (61) (i) when cells having the ability to produce the protein A of the present invention were cultured, and (ii) when cells having the ability to produce the protein A of the present invention were cultured in the presence of the test compound.
  • the protein A of the present invention is characterized in that the expression level of the gene of the protein A of the present invention when cells having the ability to produce Inhibition of evening protein A gene expression A method for screening a compound or a salt thereof,
  • the present invention is characterized in that the expression level of the gene of the protein B of the present invention is measured and compared when cells having the ability to produce B are cultured under hypoxic conditions with extension stimulation. Screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of protein B gene
  • the cells into which the DNA encoding the protein A of the present invention and the DNA encoding the protein that interacts with the protein A of the present invention have been introduced are subjected to extension stimulation under low oxygen conditions.
  • the cells into which the DNA encoding the protein A of the present invention and the DNA encoding the protein interacting with the protein A of the present invention have been introduced are subjected to hypoxic conditions.
  • the expression of the protein A gene of the present invention which is characterized by measuring and comparing the expression levels of the protein A gene of the present invention when cultured with extension stimulation under A method for screening a compound to be inhibited or a salt thereof,
  • the cells into which the DNA encoding the protein B of the present invention and the DNA encoding the protein interacting with the protein B of the present invention have been introduced are subjected to extension stimulation under low oxygen conditions. And (ii) in the presence of the test compound, the cells into which the DNA encoding the protein B of the present invention and the DNA encoding the protein interacting with the protein B of the present invention have been introduced, and the cells are introduced under hypoxic conditions.
  • a compound that promotes or inhibits the expression of the protein B gene of the present invention characterized by measuring and comparing the expression levels of the protein B gene of the present invention when cultured with a stretching stimulus in Or a method of screening for a salt thereof,
  • a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein A gene of the present invention
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36 (hereinafter referred to as the protein of the present invention) May be) human or other Cells of warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, pigs, hidges, magpies, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, glands / 3 cells, Bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B Cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocyte
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably Amino acid sequences having a homology of about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 is preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 includes about 70% or more, preferably about 8% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34.
  • amino acid sequence having 0% or more, more preferably about 90% or more, and more preferably about 95% or more homology is exemplified.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 For example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, and a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 substantially Proteins having the same activity are preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 includes about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably Amino acid sequences having about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology, and the like.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 is preferable.
  • As the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably Amino acid sequences having about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology, and the like.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 is preferred.
  • Amino acid sequence homology is calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National
  • substantially equivalent activities include, for example, cardiac function promoting or inhibiting activity, cardiomyocyte functional activity or inactivating activity, and the like. Specific examples include cardiac function-promoting activity as one of the compensatory mechanisms of cardiac function, and cardiac function-suppressing activity due to compensatory failure caused by excessive activation of the compensatory mechanism. Cardiomyocyte function activation also includes cytoprotection. The activity of promoting or suppressing cardiac function and the activity of activating or inactivating cardiomyocyte function of the protein of the present invention are measured by measuring cardiac function.
  • the measurement of cardiac function can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
  • the measurement is performed by an echocardiograph (Cell, Vol. 97, pp. 189-198, 1999) or cardiac function measurement using a cardiac catheter (circulation research, Vol. 69, pp. 370-377, 1991).
  • the enhancement of renin-angiotensin system (RAS) such as angiotensin I converting enzyme (ACE) can be measured using a commercially available measurement kit (eg, manufactured by Peninsula I, Phoenix, etc.).
  • Cardiac function is measured using the index of increasing activity of catecholamine in blood (Tosoichi Co., Ltd., fully automatic catecholamine analyzer).
  • cardiomyocyte function When measuring the activation or inactivation of cardiomyocyte function using cells having the ability to produce the protein of the present invention, for example, measuring the respiratory activity of the cells, or a heart failure marker gene (eg, ANP (atrial sodium Diuretic peptide), BNP (brain natriuretic peptide), etc.], or measure the production of heart failure marker gene product.
  • a heart failure marker gene eg, ANP (atrial sodium Diuretic peptide), BNP (brain natriuretic peptide), etc.
  • the respiratory activity of a cell can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
  • MTT (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-di heny 1 -2H-tetrazolium
  • trypan blue staining method TUN NEL staining method (Terminal deoxytransferase-mediated dUTP-X Nick end labeling, Cell, Vol. 97, pp. 189-198, 1999).
  • Substantially identical indicates that the activity is qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, the activity of promoting or suppressing cardiac function and the activity of activating or inactivating cardiac myocyte function are equivalent (e.g., about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.1 to 10 times. (5 to 2 times), but quantitative factors such as the degree of this activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein of the present invention include: (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 (eg, about 1 to 100, preferably 1 to 50) Degree, preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10 (Ii) more than one or two (for example, about 1 to 100 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33; Preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5 amino acids; (iii) SEQ ID NO: : 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 33 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 1 An amino acid sequence into which about 0, more preferably 1 to 5 amino acids have been inserted; (iv) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 (eg, 1 to 100 About, preferably about 1 to 50, preferably: about! To about 30, more preferably
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, and preferably 1 to 30) (Preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids, and (ii) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34.
  • amino acids (Iii) 1 or 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 34 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably 1 to 50) (Iv) about 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably 1 to 5 amino acids, No .: 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 34 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30) So-called muteins such as proteins containing an amino acid sequence in which about 10 (more preferably 1 to 5) amino acids have been substituted with other amino acids, or (V) an amino acid sequence combining them;
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 eg, For example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5 amino acids are deleted.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, and preferably 1 to 30) (Preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acid sequence; (iii) 1 or 2 amino acid sequences in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35
  • the above amino acids for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5)
  • amino acids for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5
  • amino acids for example, 1 to 100
  • muteins such as proteins containing a sequence or (V) an amino acid sequence combining them;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, and preferably 1 to 30
  • Degree more preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids
  • 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5 amino acids.
  • (Iii) 1 or 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 36 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, and preferably 1 to 3) An amino acid sequence having about 0, more preferably about 1 to 10 and more preferably 1 to 5) amino acids, and (iv) a sequence.
  • No .: 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by 36 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30)
  • (About 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids) are substituted with other amino acids, or
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • Proteins of the present invention C-terminal, carboxyl group (-C00H), Karupokishireto (- C00-), amide (-C0NH 2) or ester - may be either (C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, C, such as n- butyl, _ 6 alkyl groups, for example, C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclohexyl cyclopentyl, to cyclo, for example, phenyl, alpha-naphthyl ⁇ / Les of any ⁇ 6 _ 12
  • Ariru group e.g., benzyl, Fei one Nafuchiru C Bok 2 alkyl group such as phenylene Lou C doctor 2 ⁇ alkyl group or alpha-naphthylmethyl, such as phenethyl C 7 _ 14
  • Ararukiru group such as, such as Viva Roy Ruo carboxymethyl group is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., C, such as formyl group, Asechiru group, - 6 alkanol C, such as I-le
  • a protecting _ like 6 Ashiru group which glutamine residue N-terminal region is cleaved in vivo to form pyroglutamic acid, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule
  • a suitable protecting group e.g., formyl groups, C such Asechiru group is protected with a ⁇ like Bok 6 Ashiru group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • protein of the present invention examples include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 3 A protein containing the amino acid sequence represented by 5 And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36.
  • the partial peptide of the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the partial peptide of the present invention) is the partial peptide of the protein of the present invention described above, and is preferably the same as the protein of the present invention described above. Any substance may be used as long as it has the following activities.
  • the partial peptide of the present invention lacks one or more (preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5)) of amino acids in its amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence; or One or two or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence, or the amino acid sequence One or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids therein may be substituted with another amino acid.
  • examples of the partial peptide of the present invention include: A partial peptide having an amino acid sequence having the Nth amino acid residue, (2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, 1st to 20th, 21st to 40th, 41st to 60th, A partial peptide having an amino acid sequence having an amino acid residue at positions 61-80, 245-265, 355-375, or 514-527; (3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 A partial peptide having an amino acid sequence having the 1st to 20th, the 112th to 133th or the 270th to 284th amino acid residues from the N-terminus; (4) SEQ ID NO: 36 In the amino acid sequence represented by 36, from the N-terminus, the 1st to 20th, the 21st to 40th, the 41st to 60th, the 61st to 80th, Partial peptides having an amino acid sequence having the 24th to 260th, the 32nd to 37th second or the 51s
  • the C-terminus force Rupokishiru group (- C00H), carboxy Shireto (-C00-), or may be filed in any amide (_C0NH 2) or ester (-C00R).
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) in which the amino group is protected by a protecting group, and a N-terminal side having the same structure as the protein of the present invention described above.
  • Glutamine residues generated by cleavage in the body are oxidized by pyroglutamine, substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected by appropriate protecting groups, or so-called glycopeptides with attached sugar chains Complex peptides and the like are also included.
  • the partial peptides of the present invention can also be used as antigens for producing antibodies.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • Preferred acid addition salts are: Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof can be produced by the above-mentioned method for purifying a protein from human or other warm-blooded animal cells or tissues, or transformed with a DNA encoding the protein. It can be produced by culturing the body. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • human or other warm-blooded animal tissues or cells When producing from human or other warm-blooded animal tissues or cells, human or other warm-blooded animal tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like. The obtained extract can be purified and isolated by combining chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin,
  • the condensation of the above protected amino acids various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the carpoimides DCC, N, ⁇ '-diisopropylcarpo- imide, and N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carboimide are used.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HOOB t), or may be pre-protected as a symmetric anhydride or HOB t ester or H ⁇ B t ester
  • the amino acid can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone, and halogenated carbons such as methylene chloride and chloroform.
  • Hydrogens alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about -2O: to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t_pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl) Alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxy It can be protected by carbonylation, t-butoxycarbonylhydrazide, tritylhydrazide, etc.
  • a linear, branched or cyclic alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cycl
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups appropriately used for the esterification for example, low-grade, such as Asechiru group (C,. 6)
  • Arukanoiru group, Aroiru group such Benzoiru group, Benjiruokishika Groups derived from carbonic acid such as a luponyl group and an ethoxycarbonyl group are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 - B zl, 2_ nitrobenzyl, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ Bt).
  • active esters eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ Bt.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd_carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, or the like.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120: to 40.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethylsulfide, 1, It is effective to add a force-thione scavenger such as 4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributophane is 1,2-ethanedithiol, 1,2 4 Desorption by acid treatment in the presence of 1-butanedithiol In addition to protection, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side with a desired chain length. After removing the peptide chain, the protein or partial peptide from which only the amino-terminal protecting group of the peptide chain is removed and the protein or partial peptide from which only the C-terminal carboxyl protecting group is removed And condensing these proteins or peptides in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain the desired protein or peptide amide.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein is prepared in the same manner as the amide of a protein or peptide. Alternatively, an ester of the peptide can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the desired peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protective group, removing the protective group to produce the desired peptide. it can.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, those described in (i) to (V) below. Law.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide containing a base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the protein of the present invention.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. If single-stranded, it may be the sense strand (ie, the coding strand) or the antisense strand (ie, the non-coding strand).
  • the method of the present invention can be performed by a known method, for example, the method described in “Experimental Medicine Special Edition,“ New PCR and Its Applications ”15 (7), 1997, or a method analogous thereto.
  • MRNA of the protein can be quantified.
  • the DNA encoding the protein of the present invention includes the aforementioned protein of the present invention. Any substance may be used as long as it contains a nucleotide sequence encoding a quality. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells and tissues described above, cDNA library derived from the cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include: (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 which is highly stringent; A DNA containing a base sequence that hybridizes under the conditions, and encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33;
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and high stringency examples include, for example, about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 17. More preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18. % Or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, and preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the DNA that can hybridize with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and more preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • the high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and the temperature is about 50 to 70, preferably about 60 to 65. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 is represented by SEQ ID NO: 34.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35.
  • A a DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • a base represented by SEQ ID NO: 32 is used as a DNA encoding a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 is used. DNA containing a sequence is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • Genomic DNA, genomic DNA library Any of the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32, or SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32, containing a nucleotide sequence that hybridizes under high stringency conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, a DNA containing a part of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36, and the like are used.
  • the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32 has the same significance as described above.
  • Hybridization methods and high stringency conditions are the same as described above.
  • a DNA encoding a protein of the present invention or a partial peptide of the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention).
  • the DNA of the present invention is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector.
  • the method of hybridization is, for example,
  • the DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM- K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method. It can be carried out according to a known method such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon on its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention can be prepared by, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by linking.
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), pacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA IN eo is used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH19, pSH15
  • pacteriophages such
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is suitable for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, it is preferable to use the CMV (cytomegalovirus) promoter, SRa Promo overnight, and the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, such as trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ ⁇ promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Can be used.
  • the selection marker examples include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp) ), Neomycin resistance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance).
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp ampicillin resistance gene
  • Ne o r, G418 resistance Neomycin resistance Gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the PhoA ′ signal sequence, the OmpA signal sequence, etc. is used.
  • insulin 'signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used, respectively. .
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24, 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used. .
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD—5D, 20 ⁇ 12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris K M71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, or egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • SmNPV a silkworm-derived cell line (Bombyx mori cell; BmN cell) or the like is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chinini—zhamster cell CHO (hereinafter, CHO (dh fr ”) cell Abbreviations), mouse L cells, mouse At T_20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, H9c2 cells, etc. are used.
  • Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene., 17, 107 (1982). it can.
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
  • Transformation of yeast is performed according to the method described in, for example, Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, 1929 (1978). Can be.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to the law.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chipperica, peptone, power zein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • the inorganic or organic substance such as a liquid and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Mi Her, Journal of Experiments in Molecular
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 "for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • a medium for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) )] And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 to 35 t for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [3 616, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
  • the protein of the present invention can be produced in the cytoplasm or extracellularly of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1100 TM .
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method utilizing the difference in ion exchange chromatography -A method that uses a difference in charge such as, a method that uses a specific affinity such as affinity chromatography, a method that uses a difference in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and an isoelectric point.
  • a method utilizing the difference between isoelectric points such as electrophoresis is used.
  • the protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a known method or It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. .
  • Antibodies against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof can be obtained by using the protein of the present invention as an antigen.
  • the antibody or antiserum can be produced according to the following method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration by itself or together with a carrier or diluent.
  • Antibody production ability upon administration Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be given to increase the level.
  • Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the warm-blooded animals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and included in them.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and included in them.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and 'AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37, for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which the protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse
  • protein A protein A
  • Detection method Add the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and release A method of adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, and detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase can be used.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, and GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40: preferably about 37.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain antibody) Can be done.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein and separating and purifying the antibody.
  • the types of carrier-protein and the mixture of carrier-hapten may be any ratio as long as the antibody can be efficiently cross-linked to the hapten immunized by cross-linking with the carrier.
  • ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ thyroglobulin , Hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 hapten.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the dose is usually given about every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the antisense nucleotide containing a nucleotide sequence complementary to or a part thereof includes a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA of the present invention or a part thereof. Any antisense nucleotide may be used as long as it has an effect of suppressing the expression of DNA, but antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). Approximately 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more nucleotide sequences having homology. It is. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the complementary strand of the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention (for example, the base sequence near the start codon) is about 0.70. Antisense nucleotides having homology of at least about 80%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% are suitable.
  • nucleotide sequence of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 32 is complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 32.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32 is preferably a nucleotide sequence complementary to, or an antisense nucleotide containing a part thereof.
  • a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing, or an antisense nucleotide containing a part thereof is complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 32.
  • it contains a base sequence complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32, or a part thereof.
  • Antisense nucleotides and the like are particularly preferred.
  • An antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense polynucleotide are, for example, phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. May be substituted with a chemically modified phosphate residue.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or the nucleotide sequence of a DNA encoding a protein whose amino acid sequence has been determined. Can be designed and synthesized based on information.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or bind to the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled through the interaction.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention, include the protein of the present invention in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling gene expression, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a particular sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes.
  • the “correspondence” between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. I have.
  • 5'-end to 5'-end loop of protein gene 5'-end 6—base pair repeat, 5'-end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3'-end untranslated region
  • the 3 'end palindrome region and the 3' end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region, and the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide capable of hybridizing with the target can be said to be “antisense”.
  • the antisense polynucleotide may be a polynucleotide containing 2-deoxy D-report, a polynucleotide containing D-report, another type of polynucleotide that is an N-glycoside of a purine or pyrimidine base, or Other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that such polymers are found in DNA or RNA) Base pairing and nucleotides having a configuration that allows base attachment).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • Anoma first die nucleic acid may be used.
  • “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • the modified nucleotide may have a sugar moiety modified, for example, one or more hydroxyl groups may be replaced with a halogen, an aliphatic group, or the like, or may be converted to a functional group such as an ether or an amine. .
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acid is more stable in the cell, the cell permeability of the antisense nucleic acid is greater, the affinity for the target sense strand is greater, and if toxic, the Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake.
  • polycations such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone
  • lipids which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake.
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. . Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • a protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention
  • a DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention hereinafter, a DNA of the present invention
  • Antibodies against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • antisense polynucleotides of the DNA of the present invention The use of the peptide (hereinafter sometimes abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention) will be described.
  • Protein A of the present invention a protein or a partial peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35, or a salt thereof is designated as Protein A of the present invention.
  • a protein or partial peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36, or a salt thereof may be abbreviated as protein B of the present invention. .
  • the protein of the present invention can be used as a disease marker because its expression is increased in the heart at the stage of heart failure transition (heart failure decompensation period and heart failure decompensation period) after myocardial infarction. That is, it is useful as a marker for early diagnosis of heart disease (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.), determination of symptom severity, and prediction of disease progression.
  • heart disease eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.
  • Antisense nucleotide of a gene encoding the protein of the present invention (protein gene of the present invention), a compound or its salt that regulates the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that regulates the expression of the protein gene of the present invention
  • a medicament containing an antibody against the protein of the present invention may be used for preventing diseases such as heart disease (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.). It can be used as a therapeutic agent and the like.
  • the expression of the protein A of the present invention increases as the cardiac function decreases after myocardial infarction (heart failure decompensation phase heart failure decompensation).
  • myocardial infarction heart failure decompensation phase heart failure decompensation
  • the protein A gene sense strand of the present invention into animals, the rate of change in heart rate and left ventricular pressure is reduced. Therefore, the overexpression of the protein A gene in the stage of heart failure, and the accompanying enhancement of the function, leads to a decrease in cardiac function.
  • Prognosis of diseases characterized by decline eg, heart failure after myocardial infarction; angina; cardiomyopathy; Can be used as an anti-therapeutic agent.
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of the protein of the present invention can be used as a preventive and therapeutic agent.
  • the present invention provides (1) an activity of the protein of the present invention characterized by using the protein of the present invention (for example, activity for promoting or suppressing cardiac function, activating or inactivating cardiomyocyte function).
  • a method of screening for a compound that regulates (promotes or inhibits) or a salt thereof (2) regulates (promotes or inhibits) the expression of the protein gene of the present invention, which comprises using a polynucleotide encoding the protein of the present invention.
  • a method for screening eg, a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the expression of the protein of the present invention, which comprises using the antibody of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of protein A of the present invention characterized by using (d) the activity of protein B of the present invention characterized by using protein B of the present invention (for example, a screen of a compound or a salt thereof that promotes or inhibits cardiac function promoting or inhibiting activity, cardiac muscle cell function activating or inactivating activity, etc.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein B gene of the present invention which comprises using a polynucleotide encoding the protein B of the present invention; Promotes or inhibits the expression of protein B of the present invention, characterized by using the antibody of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • screening method examples include (i) culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention, and ( ⁇ ) culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention in the presence of the test compound.
  • a screening method for a modulator (promoting or inhibiting) characterized by performing a comparison with the case of culturing may be mentioned.
  • the activity of the protein of the present invention for promoting or suppressing cardiac function, the activity for activating or inactivating cardiomyocyte function, and the like are measured and compared. .
  • the activity of promoting or suppressing cardiac function and the activity of activating or inactivating cardiomyocyte function of the protein of the present invention are measured by measuring cardiac function.
  • the measurement of cardiac function can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
  • the measurement is performed by an echocardiograph (Cell, Vol. 97, pp. 189-198, 1999) or cardiac function measurement using a cardiac catheter (Circulation Research, Vol. 69, pp. 370-377, 1991).
  • the enhancement of renin-angiotensin system (RAS) such as angiotensin I converting enzyme (ACE) can be measured using a commercially available measurement kit (eg, manufactured by Peninsula I, Phoenix, etc.).
  • Cardiac function is measured using the index of increasing activity of catecholamine in blood (Tosoichi Co., Ltd., fully automatic catecholamine analyzer).
  • the respiratory activity of the cells is measured, or a heart failure marker gene [eg, ANP (atrial sodium diuretic peptide), BNP (brain natriuretic peptide), etc. ] Or the production of a heart failure marker gene product is measured.
  • ANP atrial sodium diuretic peptide
  • BNP brain natriuretic peptide
  • the respiratory activity of a cell can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any of a phosphate buffer and a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably about 1 to about 6 to 8).
  • the host (transformant) transformed with the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as H9c2 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • screening method include (iii) culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and (iv) cells having the ability to produce the protein of the present invention in the presence of the test compound.
  • Expression level of the protein gene of the present invention in the case of culturing specifically, the amount of the protein of the present invention or Measure the amount of mRNA encoded and compare.
  • the low oxygen conditions for example, 20% 0 2 or less of oxygen concentration, preferably 2% oxygen concentration (Neichiya, 394, pp. 485-490, 1998) Ru are like conditions.
  • the stretching stimulus is, for example, a stimulus in which a target cell is cultured on a stretchable silicon membrane and a mechanical load is applied by pulling the silicon membrane (JB, Vol. 271, pp. 33592-33597, 1996 , Circulation, Vol. 89, pp. 2204-2221, 1994, JB, Vol. 271, pp. 3221-3228, 1996)##
  • (iii '') a cell capable of producing the protein of the present invention when cultured under lethal conditions
  • the expression level of the protein gene of the present invention is measured and compared. .
  • the culturing under the above lethal conditions includes, for example, culturing in the absence of serum or adding an anticancer agent (eg, adoriamycin which is relatively toxic to cardiomyocytes).
  • an anticancer agent eg, adoriamycin which is relatively toxic to cardiomyocytes.
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured according to a method according to it.
  • the expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, Northern blotte ink, reverse transcription-polymerase chain react ion (RT-PCR), It can be measured according to a method such as a real-time PCR analysis system (TaqMan polymerase chain reaction, manufactured by ABI) or a method analogous thereto.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain react ion
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
  • a host transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as H9c2 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv), () ⁇ ') or (iv' ') is determined by the expression in the case of the above (iii), ( ⁇ ') or (iii '').
  • a test compound that promotes about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound that promotes expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
  • the expression level of the protein gene of the present invention is determined by the above (iii), (iii') or
  • test compound that inhibits about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more of the case of (iii "), is a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or It can be selected as its salt.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) expression of the protein of the present invention using the antibody of the present invention includes (V) culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and (vi) culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention in the presence of the test compound. Comparison with the case of culturing is performed.
  • the expression level of the protein of the present invention (specifically, the protein level of the present invention) in the cases (V) and (vi) is measured using the antibody of the present invention (eg, expression level). Detection, quantification of expression level, etc.) and compare.
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like, using a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • a host transformed with a vector containing DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as H9c2 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • a test compound that promotes about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of (V) is selected as a compound or its salt that promotes expression of the protein of the present invention. can do.
  • the compound can be selected as a compound that inhibits expression of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention relates to a method for measuring the enzymatic activity of a reporter gene in a reporter gene using a promoter of a gene encoding the protein of the present invention.
  • the present invention also provides a method for screening a compound or a salt thereof, which regulates the expression of the gene of the protein of the present invention. This utilizes the fact that the enzyme activity of a reporter gene increases depending on the expression level and activation of the protein of the present invention.
  • the promoter for example, a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
  • the repo overnight gene Atsushi is, for example, a repo overnight gene downstream of the promoter region of the gene encoding the protein of the present invention (eg, ⁇ galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, luciferase ) Is constructed, and the plasmid is introduced into a host cell or the like by a known method.
  • Construction of the plasmid, introduction of the plasmid, and the like can be performed by known methods, for example, a recombinant vector containing the DNA encoding the protein of the present invention, and a method for producing a transformant transformed with the recombinant vector.
  • the host cell include primary cardiac myocytes, H9c2 cell line (ATCC No. CRL-1446), or primary cardiac myocytes or H9c2 cells into which a gene encoding the protein of the present invention has been introduced. Stocks are used.
  • the present invention is characterized in that the enzyme activity of a reporter gene is compared with that in a case where a cell into which a plasmid in which a reporter gene is ligated downstream of a promoter region of a gene is introduced in the presence of a test compound and cultured. And a method for screening a compound or a salt thereof that regulates the expression of a protein gene. The enzyme activity of the reporter gene is measured according to a known method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the screening method may be a compound of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds derived from living organisms (such as carbohydrates and lipids), synthetic compounds, microorganism cultures, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts.
  • the compound may be a novel compound or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are cultured in a medium suitable for screening.
  • the medium may be any medium as long as it does not affect the gene expression of the protein of the present invention.
  • the above cells the above host cells and the like are used.
  • animal cells such as H9c2 cells (ATCC No. CRL-1446) are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in the cytoplasm by culturing by the method described above is preferably used.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the expression of the gene of the protein of the present invention using the expression of the gene that interacts with the protein of the present invention as an index.
  • the enhanced expression of the protein of the present invention directly causes a decrease in cardiac function.
  • the action of the protein A of the present invention (cardiac function exacerbating action) is achieved by suppressing the action of factors related to the maintenance of cardiac function homeostasis. Is estimated to occur.
  • the factor include a cardiac-specific transcription factor (eg, NkX2.5 (heart-specific transcription factor; Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, pp.
  • GATA — 4 cell-specific transcription factors; The EMB0 Journal, 19, 2046-2055, 2000
  • MLP cell-specific transcription factors
  • FHL-2 cell-specific transcription factors
  • MNF cell-specific transcription factors
  • Sp-1 cell-specific transcription factors
  • myocardial protective signals eg, gp130 signal, IGF-1 signal, etc.
  • cell adhesion factors eg, Connexin 43 etc.
  • a compound or a salt thereof that regulates the expression of the protein gene of the present invention can be obtained by the screening method using the binding activity of the protein of the present invention to a protein that interacts with the protein as an index.
  • the screening method include (ix) culturing cells into which the DNA of the present invention and DNA encoding a protein interacting with the protein of the present invention have been introduced, and (X) the DN of the present invention.
  • a and the expression level of the gene of the protein of the present invention when cells into which the DNA encoding the protein interacting with the protein of the present invention has been introduced in the presence of a test compound specifically, The amount of protein or the amount of mRNA encoding the protein is measured and compared.
  • (ix ′) a case in which cells transfected with DNA of the present invention and a DNA encoding a protein interacting with the protein of the present invention are cultured under hypoxic conditions with extension stimulation
  • ( ⁇ ′) test The method according to the present invention, wherein the cells into which the DNA of the present invention and the DNA encoding the protein interacting with the protein of the present invention have been introduced in the presence of a compound and cultured under low oxygen conditions with extension stimulation applied thereto.
  • the expression level of the protein gene (specifically, the level of the protein of the present invention or the level of the mRNA encoding the protein) is measured and compared.
  • Examples of the protein that interacts with the protein of the present invention include a cardiac-specific transcription factor (eg, Nkx2.5, GATA-4, MLP, MNF, Sp-1 and the like).
  • a cardiac-specific transcription factor eg, Nkx2.5, GATA-4, MLP, MNF, Sp-1 and the like.
  • the cells, the hypoxia condition, the stretching stimulation, the measurement of the amount of the protein of the present invention or the expression of the protein gene of the present invention, and the test compound are the same as those described in (2) above. Use the same one.
  • the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (X) or ( ⁇ ′) is about 20% or more, preferably 30% or more as compared with the case of the above (ix) or (ix ′). More preferably, a test compound that promotes about 50% or more can be selected as a compound or a salt thereof that promotes the expression of the protein gene of the present invention. In the case of the above (X) or ( ⁇ ′), the expression level of the protein gene of the present invention is about 20% or more, preferably 30% or more, compared with the case of the above (ix) or (ix ′). A test compound that preferably inhibits about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof. (6) A method for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the expression of the protein gene of the present invention, using the expression of the gene controlled by the protein of the present invention as an index.
  • the binding activities of the “protein of the present invention” and the “protein that interacts with the protein of the present invention” are compared.
  • the “protein that interacts with the protein of the present invention” may be new or known.
  • the binding activity is measured according to a known method, for example, a yeast or mammalian two-hybrid method, a SPA method, an ELISA method, or the like.
  • specific examples include (i ′) a) a plasmid that expresses a fusion protein of the protein of the present invention and the DNA-binding domain of the GAL4 gene, and b) a plasmid of the present invention.
  • a plasmid that expresses a fusion protein of the protein that interacts with the protein and the transcription activation domain of the VP16 gene, and c) a reporter gene eg, A method for comparing the case where cells into which a plasmid to which luciferase or the like has been introduced is cultured and the case where the above-mentioned cells ( ⁇ ′) are cultured in the presence of a test compound ( ⁇ ′).
  • the expression levels of repo overnight genes in (xi ′) and (xii ′) are measured and compared.
  • the cells used here may be any cells, and may be cultured in a medium suitable for screening.
  • the protein of the present invention used in the SPA method and the ELISA method is, for example, labeled with a radioisotope such as [
  • the activity of the protein of the present invention in the above (xii) or (xii ') is about 20% or more, preferably 30% or more, compared to the above (xi) or ()).
  • a test compound that promotes about 50% or more can be selected as a compound that promotes the activity of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the activity of the protein of the present invention in the case of the above (xii) or (xii ') is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably as compared with the case of the above (xi) or (xi').
  • a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention preferably the protein ⁇ of the present invention
  • a compound which promotes or inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention preferably the protein ⁇ of the present invention
  • a salt thereof, and promote or inhibit expression of the protein of the present invention preferably, protein ⁇ of the present invention
  • the compound or a salt thereof is administered during cardiac incomplete chronic phase (heart failure compensation phase) in which the expression of the protein gene of the present invention is enhanced, thereby suppressing excessive compensation mechanism and protecting cardiomyocytes by protecting cardiomyocytes.
  • An effect can be expected.
  • the screening kit of the present invention may be a protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention, a polypeptide encoding the protein or partial peptide of the present invention, an antibody of the present invention, or a kit for use in the present invention. And cells having the ability to produce the protein or partial peptide to be obtained.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds of biological origin (eg, carbohydrates, lipids, etc.), synthetic compounds, A compound selected from a microorganism culture, a fermentation product, a cell extract, a plant extract, an animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof.
  • test compounds described above for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds of biological origin (eg, carbohydrates, lipids, etc.), synthetic compounds, A compound selected from a microorganism culture, a fermentation product, a cell extract, a plant extract, an animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention has excellent cardiac function promoting activity and cardiomyocyte function activating activity.
  • cytoprotective action is useful as a medicament for preventing and treating heart diseases (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, cardiac failure, angina, etc.).
  • heart diseases eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, cardiac failure, angina, etc.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention can be safely administered as it is or as an appropriate drug.
  • the medicament used for the above administration comprises the above compound or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient, and is provided as a pharmaceutical composition suitable for oral or parenteral administration. You.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method, and is commonly used in the field of pharmaceuticals. Containing a carrier, diluent or excipient.
  • a carrier diluent or excipient.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxythylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)], and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol
  • a nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxythylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used as a
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit examples include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg / dosage unit for each dosage unit. It is preferred that the drug contains 5 to 100 mg of the above compound, and other dosage forms contain 10 to 25 mg of the above compound.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pests, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pests, birds, cats, dogs, monkeys.
  • Chimpanzees, etc. can be administered orally or parenterally.
  • the dose of the compound or its salt that regulates the activity of the protein of the present invention depends on its production.
  • a compound or a salt thereof that modulates the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating heart failure preferably, the activity of the protein A of the present invention
  • the compound or a salt thereof may be administered in an amount of about 0.1 to 10 mg / day, preferably about 1.0 mg / day. 5050 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention is regulated.
  • a compound or a salt thereof preferably a compound of the present invention which inhibits the activity of protein A or a salt thereof
  • the compound or a salt thereof is usually administered daily. It is convenient to administer the salt by intravenous injection in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 6 O kg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention. It can be used for quantification by sandwich immunoassay.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. . For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • Radioisotopes if example embodiment, [i25 i], (I3i n, [], as.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the sandwich method the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the mass of the protein of the present invention in the test wave can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at a time interval.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competitive method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody ( BZF separation), measure the amount of labeling in either B or F, and quantify the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the raw material is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • label either phase The amount is measured and the amount of antigen in the test wave is determined.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test wave is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the protein measuring system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, documents, etc.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detecting the protein of the present invention in each fraction at the time of purification analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, pears, pomas, cats, dogs, Abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide in monkeys, chimpanzees, etc.), for example, damage or sudden mutation of the DNA or mRNA. Les is useful as a diagnostic agent for genes such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the well-known Northern Hybridization and the PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, +86, 2766-2770 (1989)) Can be implemented.
  • overexpression is detected by Northern hybridization or DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, heart disease (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure) , Angina pectoris, etc.).
  • heart disease eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure
  • Angina pectoris etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention capable of binding to the DNA of the present invention complementarily and suppressing the expression of the DNA preferably, the protein A of the present invention is Antisense polynucleotides against the polynucleotides that it exerts
  • the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo eg, cardiac function inhibitory activity, cardiomyocyte function inactivating effect, etc.
  • It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for, for example, heart diseases (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.).
  • the above-mentioned antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a known method.
  • the antisense polynucleotide when used, the antisense polynucleotide is used, the antisense polynucleotide is used alone or after being inserted into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. Or orally to humans or other warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) It can be administered parenterally.
  • a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like.
  • a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like.
  • a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a gel for Hyde mouth gel.
  • a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting ingestion
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is orally administered for the purpose of treating heart failure, it is generally used. In an adult (body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in a tissue or a cell and the state of expression thereof.
  • the present invention further provides
  • RNAs, ribozymes and the like can suppress the expression of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in the same manner as the antisense polynucleotide, and Can regulate (inhibit) the activity or function of a polynucleotide (eg, DNA) in a patient (eg, cardiac dysfunction-promoting activity, etc.).
  • a patient eg, cardiac dysfunction-promoting activity, etc.
  • heart disease eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, stenosis
  • It can be used as a preventive and therapeutic agent for heart disease.
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the ribozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the peptide of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the peptide of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known lipozyme.
  • RNA or ribozyme When the above-described double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • the antibody of the present invention which has the effect of neutralizing the activity of the protein of the present invention (preferably, the protein A of the present invention), is useful for treating heart diseases (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.) It can be used as a prophylactic 'therapeutic.
  • heart diseases eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.
  • the agent for preventing or treating the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or other warm-blooded animals (for example, mice, rats, It can be administered orally or parenterally to egrets, sheep, sheep, bush, horses, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dosage varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, and the like. For example, treatment of heart failure in adults.
  • the invention of the antibody in a single dose, usually about 0.01 to 2 OmgZkg body weight, preferably 0.1 to about 1 OmgZkg body weight, more preferably 0.:! It is convenient to administer about 5 mgZkg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or vehicle.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and tablets for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, and the like, are used.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially injections, for each dosage unit dosage form.
  • the antibody contains 5 to 10 O mg, and other dosage forms contain 10 to 25 O mg of the above antibody.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the protein of the present invention or the DNA encoding the protein of the present invention includes heart diseases (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.) and the like. It is also useful as a medicament such as a prophylactic or therapeutic agent. Further, the protein of the present invention is used as a vaccine or the like for producing the antibody of the present invention.
  • heart diseases eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.
  • the protein of the present invention is used as a vaccine or the like for producing the antibody of the present invention.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above drug, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, the DNA of the present invention is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. After that, it can be carried out according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as Hyde-mouth gel power catheter.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention is orally acceptable as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, or water or other pharmaceutically acceptable, if necessary.
  • Sterile solution with liquid, or suspended It can be used parenterally in the form of injections, such as suspensions.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention is required to perform a generally accepted formulation with known carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., which are physiologically recognized. Can be prepared by mixing them in unit dosage forms. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • the dosage of the protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like, in the case of oral administration, in general, for example, in a heart failure patient (with a body weight of 6 O kg), It is about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually, for example, a heart failure patient (body weight 6 O kg )
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a heart failure patient (as 6 O kg), one day About 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in heart failure patients (as 6 O kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • a non-human mammal having the foreign DNA) or its mutant DNA (sometimes abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • a calcium phosphate method, an electric pulse method, a Lipofection can be produced by introducing the target DNA by a method such as a coagulation method, a coagulation method, a microinjection method, a particle gun method, or a DEAE-dextran method.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, etc. can be introduced by the DNA introduction method and used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method to produce the DNA-introduced animal of the present invention.
  • mice for example, red sea lions, bushes, hidge, goats, blue egrets, dogs, cats, guinea pigs, eight musters, mice, rats and the like are used.
  • mice for example, pure strains such as C57B LZ6 and DBA2
  • rat eg, Wistar, SD, etc.
  • “Mammals” in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition, deletion, or substitution of another base DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal which is the same or different from the target animal.
  • a mammal which is the same or different from the target animal.
  • the human DNA of the present invention when introduced, it is derived from various mammals having the DNA of the present invention, which are highly homologous thereto (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • Downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention by microinjecting the DNA construct (eg, vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. It is possible to create a DNA-introduced mammal that highly expresses the DNA of the present invention.
  • the DNA construct eg, vector, etc.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus.
  • animal viruses such as Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the expression of DN ⁇ include, for example, virus
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of a target messenger RN ⁇ in a DNA-transfected mammal (generally referred to as terminator), and is, for example, derived from viruses and various mammals.
  • terminator a DNA-transfected mammal
  • the sequence of each DNA can be used, and preferably, SV40 terminator of Simian virus or the like is used.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is DNA derived from the liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.).
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a DNA-transduced animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • exogenous DNA of the present invention is provided to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer indicates that the progeny of the transgenic animal retains the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells Means to do.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • exogenous DNA of the present invention is provided to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal carry the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. It means having extra.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally enhanced by promoting the function of endogenous normal DNA.
  • the disease may develop and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-introduced animal of the present invention, elucidation of the pathological mechanism of the protein hyperactivity of the present invention and the disease associated with the protein of the present invention, and examination of a method for treating these diseases. Can be performed.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. It is possible.
  • a non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. I can do it. Further, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately reduced by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur and can be used as a model animal for the disease.
  • using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to treat this disease A study of the method is possible.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. ) Is a model for elucidating.
  • the mammal into which the exogenous abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used in a therapeutic drug screening test for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease thereof. Available.
  • the protein-producing cell of the present invention may be specified, associated with apoptosis, differentiation or proliferation, or They can examine the signal transduction mechanism of them, and investigate their abnormalities, etc., and are useful research materials for elucidating the protein of the present invention and its action.
  • a test compound is administered to the animal into which the DNA of the present invention has been introduced, and the heart function, electrocardiogram, heart weight, and the like of the animal are measured.
  • Heart weight is the parameter of hypertrophy.
  • the heart structure can be examined by calculating the heart weight per body weight, the left ventricular weight per body weight, and the left ventricular weight per right ventricle weight.
  • the test compound can be evaluated using the suppression of this increase as an index.
  • a myocardial infarction is performed, and the heart function, electrocardiogram, heart weight, and the like of the animal are measured.
  • the infarct growth inhibitory activity of the test compound can be examined by weighing the infarct layer. Administration of the test compound may be post-infarct surgery.
  • the animal can be bred with a genetically hypertensive model rat such as an SHR rat to create a new heart failure model. The compound is administered to the heart failure model prepared as described above, and the animal is examined for cardiac function, electrocardiogram, heart weight, infarct progression inhibitory activity and the like.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is a reporter gene (eg, from E. coli) 3-galactosidase
  • the reporter gene can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits (preferably inhibits) the promoter activity of DNA of the present invention.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression of the DNA, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells of the present invention in which DNA is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, lacZ (3-galactosidase gene), cat (clo DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo allele, represented by the ramphenicol acetyltransferase gene), or terminates gene transcription in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, lacZ (3-galactosidase gene), cat (clo DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo allele, represented by the ramphenicol acetyltransferase gene), or terminates gene transcription in the intron between exons
  • ES cells are subjected to Southern hybridization analysis or targeting vector analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, for example, by the homologous recombination method.
  • the above DNA sequence and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector were analyzed by PCR using primers as primers, and the knockout ES cells of the present invention were selected. Obtainable.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used. It may be newly established according to the method described above. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunogenic genetic background is used.
  • BDFi mice C57BL / 6 and DBA / 2 BDF 1 mice can be used satisfactorily because they have a high number of eggs collected and their eggs are robust, and they have C57BLZ6 mice as their background.
  • the ES cells obtained by using the method described above can be advantageously used when a pathological model mouse is produced, because the genetic background can be replaced with a C57BLZ6 mouse by backcrossing with a C57BLZ6 mouse.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used.However, it is more efficient to collect embryos at the 8-cell stage and culture them until blastocysts are used. Many early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. With this method, the number of ES cells in a colony was about 1 (about 50), compared to about 10 6 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the initial culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth potential, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate individuals.
  • LIF (1-10000) on a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH MJ Evans and MH
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell.
  • a cell in which the DNA of the present invention has been knocked out is a DNA sequence on or near the DNA of the present invention, which is used as a probe for Southern hybridization analysis or the DNA sequence on the evening getter vector, and the evening getter vector. Can be determined by PCR analysis using the DNA derived from the mouse and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention as a primer.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human cells.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. in this way
  • the individual obtained is a heterozygous expression of the protein of the present invention is deficient in the heterozygous expression of the protein of the present invention.
  • An expression-deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a getter vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method. Compared to these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where one normal individual and plural homozygous animals are obtained. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and observing and measuring a change in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the disease is provided.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method includes the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the test compound when screening for a compound having a prophylactic or therapeutic effect on a heart disease (eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.), the test compound is used in a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention. And the heart function, electrocardiogram, heart weight, etc. of the animal are measured. Heart weight is the parameter of hypertrophy. Specifically, the heart structure can be examined by calculating the heart weight per body weight, the left ventricular weight per body weight, and the left ventricular weight per right ventricle weight. When cardiac hypertrophy occurs, the above parameters increase all the time. Therefore, test compounds can be evaluated using the suppression of this increase as an index.
  • a heart disease eg, cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, angina pectoris, etc.
  • Heart weight is the parameter of hypertrophy.
  • the heart structure can be examined by calculating the heart weight per body weight, the left ventricular weight per body weight, and the left
  • a new heart failure model can be prepared by breeding the animal with a genetically hypertensive model rat such as an SHR rat. The compound is administered to the heart failure model prepared as described above, and the animal is examined for cardiac function, electrocardiogram, heart weight, activity for suppressing infarction progression, and the like.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkalis). Salts with metals and the like are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) And succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or non-human mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, horses, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, generally the heart failure of an adult (assuming a body weight of 6 O kg) is performed.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc., but, for example, the compound is usually in the form of an injection and is usually administered to an adult (assuming a body weight of 60 kg) of heart failure.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detects or inhibits the expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention introduces a repo allele gene.
  • a reporter gene which can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is present under the control of the promoter for the DNA of the present invention because the reporter overnight gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the tissue originally expressing the protein of the present invention may Instead of the protein of the present invention, 3) -galactosidase is expressed. Therefore, for example, staining with a reagent that is a substrate for / 3_galactosidase, such as 5-bromo-4-monocloth-3-indolyl-) 3-galactovyranoside (X-gal)
  • a reagent that is a substrate for / 3_galactosidase such as 5-bromo-4-monocloth-3-indolyl-) 3-galactovyranoside (X-gal)
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. Near After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the 0-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with an ImM ED TAZ PBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). Are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • physiologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tarta
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the activity of a promoter for DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein.
  • heart disease eg, cardiomyopathy, It is useful as a drug for prophylactic and therapeutic agents such as myocardial infarction, heart failure, and angina.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or non-human mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, horses, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • non-human mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, horses, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound When administered orally, it is generally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 mg of the compound per day in an adult (assuming a body weight of 60 kg) heart failure patient. Administer ⁇ 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to a patient with heart failure (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.:! To 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of the compound per day is administered. It is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) heart failure patients, the compound is administered in an amount of about 0.1 to: Preferably, about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • the compound When administered to a patient with heart failure (assuming a body weight of 6 O kg), the compound may be administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter of the DNA of the present invention. Investigating or preventing the causes of various diseases caused by inadequate expression of DNA. It can greatly contribute to the development of therapeutic drugs.
  • transgenic animal In addition, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). ) Makes it possible to specifically synthesize the polypeptide and examine its action in living organisms. Further, an appropriate reporter gene is linked to the above promoter, By establishing a cell line that expresses the protein, it can be used as a search system for low-molecular compounds having an action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein itself of the present invention to produce in the body.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and examples thereof are described below.
  • an amino acid can have an optical isomer
  • the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of primer 98 used in Example 1.
  • [SEQ ID NO: 6] 1 shows the nucleotide sequence of Primer-100 used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a reverse primer used in Example 1.
  • 1 shows the nucleotide sequence of human 187_2A intron.
  • [SEQ ID NO: 20] Shows the nucleotide sequence of the human 187-2B intron.
  • the nucleotide sequence of the mouse 187_2B5 'region is shown.
  • Example 3 shows the base sequence of the forward primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a reverse primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the base sequence of the forward primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a reverse primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the base sequence obtained in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • [SEQ ID NO: 34] 2 shows the amino acid sequence of human 187-2B protein.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of rat 187-2A protein.
  • 1 shows the amino acid sequence of rat 187_2B protein.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • the transformant Escherichia coli DH5a / pR187B obtained in Example 6 described below has been used since August 30, 2002, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture 1 Central It has been deposited with the 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal Code 305-8566) Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8172.
  • the transformant Escherichia coli (DH5a / pH187B) obtained in Example 6 described below has been used since August 30, 2002, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8173.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • the method of genetic manipulation using Escherichia coli was in accordance with the method described in Molecular cloning.
  • the reaction was carried out using the TaKaRa La Taq with GC buf fer (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in the PCR system 9700 (manufactured by PerkinElmer) using the PCR system 9700 (PerkinElmer) and 30 seconds at 95: and 30 at 62: 33 cycles were repeated, with 3 minutes as one cycle at 72 seconds.
  • the gene fragment PCR-PCR with Primer 100 and Primer 102 and the reverse primer was cloned into pT7-T vector (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • human 187-2 has two splicing variants, Human 187-2A (SEQ ID NO: 17) which is an ortholog of 187-2 (hereinafter sometimes referred to as rat 187-2A) (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 25 of W002 / 36763)
  • the human 187-2B gene which is large 5 'upstream (the N-terminal region is large as a protein), could be cloned (SEQ ID NO: 18). Therefore, the human 187-2B cDNA completely contains the human 187-2A cDNA.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 is an intron in human 187-2A and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 is human in 187-2B. This is because it is spliced out as an intron.
  • the protein having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 33) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a human 187-2A protein, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18
  • the protein having (SEQ ID NO: 34) is designated as human 187-2B protein.
  • the nucleotide sequence encoding rat 187-2A protein is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the human 187-2A protein and the human 187-2B protein had 53% homology at the amino acid level.
  • Human 187-2A protein and AW755252 had 36% homology at the nucleic acid level.
  • the human 187-2B protein and AW755252 had 66% homology at the nucleic acid level.
  • the reaction is performed by adding 2 ⁇ L of SYBER Green Master Mix 10 // 1 of QuantiTect SYBR Green PCR kit (QIAGEN), 0.4 ⁇ l of each primer, and 71 of sterile distilled water to Type I DNA l. After 95t ⁇ 15 minutes, a cycle of 95 ⁇ 20 seconds, 55 ⁇ 20 seconds, 72 ⁇ 1 minute is repeated 50 times using a thermal cycler gene amp PCR system 9700 (manufactured by PerkinElmer) 50 times, and finally 72 ⁇ The extension reaction was performed for 4 minutes. The sequence of the 5 ′ region of rat 187-2B was obtained by directly sequencing the resulting DNA fragment (SEQ ID NO: 24).
  • SEQ ID NO: 24 and rat 187-28 are one gene
  • a forward primer SEQ ID NO: 25
  • a reverse primer SEQ ID NO: 26
  • PCR was performed with PFU polymerase, and the sequence of the obtained fragment was confirmed.
  • a cloning primer SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28
  • Cloning was performed by PCR.
  • the reaction was performed using a marathon lady rat heart cDNA library (Clontech) as type III, and using a QuantiTect SYBR Green PCR kit (QIAGEN) 2X SYBER Green Master Mix 101 and each primer at 0.4 M for type I DNA 1/1. , Sterile distilled water to make a volume of 20 ⁇ 1, and after 95 ⁇ 15 minutes with a thermocycler gene amp PCR system 9700 (PerkinElmer), 95t ⁇ 20 seconds, 5 (TC ⁇ 20 The cycle was repeated 50 times for 2 seconds and 1 minute, and the extension reaction was performed for 72 and 4 minutes at the end.As a result, a band was observed at the expected position. The nucleotide sequence was determined after cloning (SEQ ID NO: 29).
  • rat 187 was obtained by using each primer represented by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31. A fragment containing the base sequence of the latter half of -2B was obtained. After recovering these two fragments, PCR was carried out using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 31 using the type I, and a fragment of about 1.6 kb was obtained. .
  • the reaction was carried out using a cycle sequence kit of PE Applied Biosystems, and a fluorescent DNA sequencer (ABI PRI SM 377, PerkinElmer) was used. And the base sequence was decoded.
  • rat 187-2B homologous to human 187-2B was cloned (SEQ ID NO: 32).
  • the protein having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 is named rat 187-2B protein.
  • the rat 187-2B protein and the rat 187-2A protein had 54% homology at the amino acid level.
  • the N-terminal region (Nos. 1-70) of the human 187-2B and rat 187-2B proteins has a motif called LIM involved in protein-protein interactions (Mech. Dev. Vol. 91, pp. 5-17, 2000) existed.
  • rat 187-2A cDNA SEQ ID NO: 1
  • Adeno Custom Service of Takara Shuzo Co., Ltd.
  • adenov i rus express ion on vec tor kit (6150) manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the rat was cloned according to the attached method to express rat 187-2A sense and antisense strand adenovirus.
  • titer of highly purified virus a known method (Experimental Medicine Supplement New Genetic Engineering Handbook, pp.
  • a 14G indwelling needle outer tube (Termo) was introduced into the trachea from the oral cavity and connected to a ventilator.
  • the lips and the indwelling needle outer tube were tied using surgical silk (Natsume, braided silk suture 3-0) so that the ventilator would not come off.
  • the skin and trunk muscle approximately 5 mm to the left of the rat sternum were incised approximately 4 cm in the median direction.
  • an incision was made near the sternum of the second to fifth costal cartilage just below the incision.
  • the intercostal muscle was dissected with surgical scissors, and after hemostasis, the thoracic cavity was opened about 3 cm with a thoracotomy device.
  • the pericardium was bluntly peeled off with a cotton swab and opened to expose the heart.
  • High purity rat 187- 2A sense and antisense expression viral vector solution prepared in Example 3 was diluted with physiological saline to prepare a solution of 2xl0 8 pfu / ml concentration, it gave a 27G injection needle Weighed into lml syringe (Terumo). The virus was administered at 2xl0 fu per kilodalton body weight. As a control, the same amount of null virus without insert was administered.
  • an injection needle was attached to the left ventricle, avoiding the coronary arteries and veins, and then the thoracic aorta was stenotic by tightening the Teflon tube. After confirming the stenosis, the virus solution was slowly administered into the left ventricle and allowed to flow back into the left ventricle. Since the left ventricle dilated with administration, the Teflon tube was loosened once every about 10 seconds to allow the virus solution to return to the whole body and prevent the secondary effects of left ventricular dilatation. This administration and the operation of loosening the Teflon tube were repeated three times in total, and the entire amount of the virus solution was refluxed into the left ventricle.
  • One of the loops of the thoracic aortic stenosis silk thread was cut off, and the other thread was pulled out to remove the silk thread.
  • the chest wall and the skin were sutured with a suture silk thread at intervals of about 5 millimeters.
  • the skin incised at the time of the cervical duct and the muscle immediately below it were sutured in the same manner.
  • the subject was forced to breath for at least 1 hour using a mechanical respirator. After confirming the spontaneous respiration of the animal while the animal was awake from anesthesia, the conduit was removed. Post-operative animals were housed in breeding cages.
  • the heart function was measured as follows. One week after the operation, male Wistar rats (Jcl Wistar rats, 12 weeks old, weighing 350 g to 450 g) were weighed and anesthetized with sodium pentobarbital (25 mg / kg, ip). The abdominal coat of the chest and neck was shaved with a clipper and laid on the operating table in a supine position. An incision is made in the ventral neck with surgical scissors, the muscle immediately below is incised with forceps, and the cervical aorta right next to the trachea is peeled off from the connective tissue.
  • Thread 3-0 was applied, the head was tied, and the abdomen was stopped with arterial cleansing.
  • the blood vessel was incised with surgical scissors, a mirror catheter (2F, 140 cm, Catalog No. 800-0509, manufactured by Mira Co., Ltd.) was inserted into the blood vessel, and the tip was attached to the left ventricle.
  • the mirror catheter was connected to a Polygraph manufactured by NEC, and the pressure fluctuation was monitored with a horoscope to confirm that the mirror catheter was attached to the left ventricle, and the left ventricular pressure was measured.
  • MBP mean blood presure
  • the measured values of (LVSP: left ventricular sistronic presure), (HR: heart rate), and left ventricular pressure change rate (LV + dp / dt and LV-dp / dt) are measured by MacLab (a waveform analysis software manufactured by NEC). And was calculated. The calibration of the mirror catheter was performed at two points, OmmHg and lOOmmHg, immediately before the start of the experiment using a carrier.
  • the chest was opened, the heart was pinched with tweezers, blood vessels and connective tissues were removed, and the heart was excised.
  • the heart was washed in saline. Further, a syringe was inserted into the aorta attached to the extracted heart, and physiological saline was perfused throughout the heart to remove blood. Thereafter, the atrium was removed, the ventricular tissue alone was weighed, and the heart weight was measured by correcting for body weight.
  • Null (n S) 112 ⁇ 8 442 ⁇ 8 138 ⁇ 9 12.3 ⁇ 1.0 -10.6 ⁇ 0.7 2.67 ⁇ 0.06 Normal rat #
  • the virus was administered to the heart of a heart failure rat, and the heart function and the heart weight were measured. Rats 23 weeks after myocardial infarction were administered antisense virus and null virus at pfu / kg. As a result of measuring cardiac function one week later, the antisense group showed significant improvement in heart rate and contractile force (LV + dp / dt) as compared to the null group. (table 1 )
  • peptide-recognizing antibody Three types of peptide sequences were extracted from the amino acid sequence of rat 187-2A, and a peptide-recognizing antibody was prepared by Kurabo Industries' custom peptide antibody preparation service.
  • the peptide used as the antigen is a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 in the N-terminal region, SEQ ID NO: 38 in the central region, and SEQ ID NO: 39 in the C-terminal region.
  • Western blotting was performed using the rat primary cardiomyocyte extract 3 days after infection with the rat 1872-sense-chain-expressing adenovirus described in Example 3 of WO 02/36763. As a result, it was found that each antibody recognizing the peptides of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 39 can recognize rat 187-2A protein.
  • the normal rats and the heart failure model rats obtained in Example 4 were laparotomized under ether anesthesia, killed by exsanguination by transection of the vena cava, and the heart was quickly removed. Phosphate buffer and 4% paraformaldehyde solution were injected in 20 ml portions from the aorta to the left ventricle, and fixed by perfusion. The heart was sliced transversely and fixed at 4 overnight.
  • paraffin-embedded blocks were prepared in accordance with the usual method (Histology, Yutaka Sano, Nanzando, 1985).
  • the produced block was sliced to a thickness of 4 l ⁇ with a rotating microtome. After slicing, the sections were stretched in a warm bath, mounted on glass slides, and thoroughly dried with a 37 drier. The prepared sections were deparaffinized, stained with hematoxylin and eosin according to a standard method, and mounted (Histology Research, Yutaka Sano, Nanzando, 1985).
  • peptide recognition having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 ⁇ Sagi polyclonal antibody and peptide recognition having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 ⁇ Sagi polyclonal antibody was used for immunostaining.
  • the immunostaining used the indirect fluorescent antibody method. Immunostaining and instu tu hybrid izat ion were performed according to the method described in Soichi Iijima et al., Pathology and Clinical Extra Edition, 2000. Alexafluor 488 goat anti-Peagle IgG antibody was used as a secondary antibody. Immunostaining was also performed on primary cardiomyocytes prepared from fetal hearts. After completion of the culture, the primary cardiomyocytes cultured in the 4-well culture chamber are fixed with 4% paraformaldehyde solution, and immunostaining is completed using the same antibody as above.
  • rat 187-2 ⁇ protein and rat 187-2B protein were expressed in the cytoplasm of cardiomyocytes.
  • cardiomyocytes remaining in the infarct transition region of the heart failure model rat their expression is normal in myocardial cells. It was clearly increased compared to the vesicle. Therefore, it was assumed that rat 187-2A protein and rat 187-2B protein were expressed in large amounts in the infarct transition region.
  • the positive sites of rat 187-2A protein and rat 187-2B protein in the infarct transition region were alpha-actinin-positive cardiomyocytes, vascular smooth muscle cells such as coronary arteries, and peripheral residual cells.
  • the high expression of the gene of rat 187-2 (including both A and B) at the lesion site indicates that the gene of 187-2 is strongly involved in the development of heart failure.
  • rat 187-2A protein and rat 187-2B protein were stained using a peptide-recognizing ⁇ sagi polyclonal antibody having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37.
  • SEQ ID NO: 39 When the cells were stained with cell nuclei of primary cardiomyocytes and using a peptide-recognizing Egret polyclonal antibody having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, an image was observed that was localized in the cytoplasm. Therefore, it is considered that the rat 187-2A protein and the rat 187-2B protein translocate not only to the cytoplasm but also to the nucleus and are functionally expressed.
  • the plasmid (containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18) cloned into the PT7-T vector obtained in Example 1 was named PH187B, and this was named Escherichia coli DH5H.
  • Escherichia coli DH5 By transformation, a transformant Escherichia coli DH5 «/ pH187B was obtained.
  • Example 7 Production of rat 187-2A transgenic rat and rat 187-2B transgenic rat
  • PCR was performed using PFU polymerase, and the obtained fragment was cloned into pCRII T0P0 vector (manufactured by Invitrogen), and the nucleotide sequence was confirmed.
  • a Hindi II cleavage site was introduced into the forward primer, and an Xhol cleavage site was introduced into the reverse primer.
  • the subcloned rat 187-2A cDNA or rat 187-2B cDNA is excised with HindII and XhoI, the target gene fragment is recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and GFX PCR DNA and Gel Band Purification was performed using a purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc).
  • PCR was performed using two types of primers (SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43). That is, PCR was performed using PFU polymerase, and the obtained approximately 220 bp fragment was cloned into pCRII T0P0 vector (manufactured by Invitrogen), and the nucleotide sequence was confirmed.
  • mice ⁇ -myosin heavy chain promoter gene 5.4 kpb described in The Journal of Biological Chemistry, 266, 24613 to 24620, 1991 was used.
  • two primers SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 were synthesized from a BAC plasmid (# 22386, Cosmo Bio) containing this region.
  • a Hindlll cleavage site was added as a cloning site to the primer represented by SEQ ID NO: 45.
  • PCR was carried out using the BAC plasmid (# 22386, Cosmo Bio) using PFU polymerase with PFU polymerase, and the obtained about 1.
  • lkbp fragment which is a part of the mouse ⁇ -myosin heavy chain promoter gene, was transformed into invitrogen).
  • the 1.lkbp fragment was excised from this plasmid using Ndel and 3 ⁇ 4indIII, recovered by 2% agarose gel electrophoresis, and purified using GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc). This is called fragment A.
  • a 4.3 kbp fragment of the mouse ⁇ -myosin heavy chain promoter gene region other than this 1.lkbp was excised from BAC plasmid (# 22386, Cosmo Bio) using BamHI and Ndel, and recovered by 1% agarose gel electrophoresis. And purified using GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc). This is called fragment B.
  • Fragment A and Fragment B were inserted into the BamHI and Hindlll cloning sites of pBluescriptll SK (+) (Yukara Bio) to construct the pMHC8 plasmid.
  • the PMHC8 plasmid containing the mouse ⁇ -myosin heavy chain promoter gene thus prepared was digested with BamHI and Hindlll, and the obtained approximately 5.4 kbp mouse ⁇ -myosin heavy chain promoter gene fragment was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. It was recovered and purified using GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc).
  • Digest pCRII T0P0 vector (manufactured by invitrogen) with BamHI and Xhol, recover by 1% agarose gel electrophoresis, and use GFX PCR DNA and Gel Band purification kit. (Amersham Pharmacia Biotech Inc).
  • the mouse ⁇ -myosin heavy chain promoter-one gene fragment (having BamHI and Hind111 cleavage sites) obtained in (3) above and the rat 187-2A or rat 187-2A obtained in (1) above were added.
  • the 187-2B cDNA gene fragment (having Hindlll and Xhol cleavage sites) was cloned.
  • this vector is digested with BamHI and Xhol, and the obtained gene fragment
  • PUC118 (Yukakara Bio) was digested with BamHI and EcoRI, recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and purified using GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc). Next, the gene fragment prepared in (4) above (having BamHI and Xhol cleavage sites) and the gene fragment containing the poly A-added signal sequence prepared in (2) above (having Xhol and "EcoRI cleavage sites") were used. Was cloned into the BamHI and EcoRI sites of pUC118 to prepare a rat 187-2A expression plasmid and a rat 187-2B expression plasmid.
  • transgenic rats were produced by Oriental Yeast Co., Ltd. according to a known method.
  • the expression unit was excised from the rat 187-2A expression plasmid or the rat 187-2B expression plasmid by digestion with BamHI, and microinjected into fertilized rat eggs (collected from Wistar rats purchased with Jcl).
  • pseudopregnant rats were fertilized by inserting fertilized eggs to give birth.
  • Recombinant animals were selected by PCR.
  • blood was collected from the rat tail vein, from which genomic DNA was recovered.
  • primers SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 4'3 (exogenous poly A-added signal) The primer was used to amplify the null sequence. Individuals showing a band of about 220 bp after electrophoresis were selected as recombinants to obtain rat 187-2A transgenic individuals and rat 187-2B transgenic individuals. The obtained individual was transferred from Oriental Yeast Co., Ltd., and the following analysis was performed.
  • RNA derived from the cardiac left ventricle of an F1 heterozygous individual the gene expression level was examined according to the method described in Example 7 of WO 02/36763.
  • Compounds or salts thereof that regulate the activity of the protein of the present invention preferably compounds or salts thereof that inhibit the activity of protein A of the present invention
  • compounds or salts thereof that regulate the expression of the protein gene of the present invention this
  • the compound of the present invention that inhibits the expression of the gene for protein A or a salt thereof), the antibody of the present invention, the antisense polynucleotide of the present invention, and the like can be safely used, for example, as a prophylactic or therapeutic agent for heart disease and the like. it can.

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Abstract

　本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩、該タンパク質に対する抗体などは、例えば心疾患などの予防・治療剤として有用である。本発明のタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心疾患などの予防・治療剤のスクリーニングとして有用である。

Description

明 細書 新規タンパク質およびその用途 技術分野
本発明は、 心疾患などの疾患に関連する遺伝子およびその用途に関する。 さら に詳しくは、 該疾患関連遺伝子または遺伝子産物を用いる薬剤 （例、 心疾患の予 防 ·治療剤など） のスクリーニング方法、 心疾患の診断マ一カーとして有用な疾 患関連遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチド、 該疾患関連遺伝子産物に 対する抗体などに関する。 背景技術
心不全とは、 心筋の収縮不全と考えられている。 発症の機序としては、 次のよ うなものが考えられる。 心筋の障害、 心臓ポンプの機械的、 機能的異常、 高血圧 及び肺高血圧による圧負荷、 貧血、 急性腎炎など容量負荷などが原因となり、 生 体の需要に応じた血液量を心臓が拍出し得なくなる状態が生じる。 これに対して、 交感神経系、 神経一体液一内分泌系などの代償機序が作動し、 生体の恒常性の維 持に向かう。 心不全の代償機序では、 1 ) 前述の負荷が増大して心臓の収縮力が 増し、 サルコメァの長さの増大に伴って心拡大が生じる、 2 ) 心筋の収縮単位が 増し、 その結果として心筋肥大が生じる、 3 ) 全身に必要な血液を駆出できない 状態を補うため神経液性因子が活性化され、 局所的には心筋繊維化が進展する。 基本的には与えられた負荷に、 適応しょうとする機序であるが、 不十分な作動に よって心不全が促進する場合もあれば、 逆に過剰な作動によって心筋傷害を生じ、 心不全を悪化させる場合もある。 代償機序が作動した結果として、 心筋細胞が肥 犬し、 心肥大が生じる。 しかしながら、 前述の障害あるいは負荷が慢性的に継続 された場合、 その代償機序が破綻する。 つまり、 肥大した心筋細胞に十分な量の 血液が供給されずに虚血に陥り、 これが原因で心筋収縮不全などの心筋障害が生 じ、 心拍出量の低下、 臓器循環障害、 静脈鬱血、 体液貯留などを伴う心不全症候 群を来すことになる。 これに対する治療としては、 心筋細胞障害の改善、 心保護 作用の強化、 心筋収縮不全による心機能低下の回復及びその原因である生体の代 償破綻の抑制あるいは過剰な代償機序の改善が必要となる。 現在、 該心不全症候 群の治療には、 臨床的には強心薬として 1 ) ジゴキシンなどの強心配糖体、 2 ) ドブタミンなどの交感神経作動薬、 3 ) アムリノンなどのホスホジエステラーゼ 阻害薬が、 また血管拡張薬としてはヒドララジン、 カルシウム拮抗薬及びアンジ ォテンシン I変換酵素阻害薬、 アンジォテンシン I I受容体拮抗薬などが使用さ れている。 また、 他拡張型心筋症の治療には、 0ブロッカーなどが使用されてい る。
冠動脈結紮による心筋梗塞モデルラットの心不全発症時において発現が変動す る遺伝子は、 例えば WO 0 2 3 6 7 6 3で報告されている。
過剰な代償機序または代償破綻の抑制という観点からの、 副作用の少ない優れ た心不全治療薬の開発が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 冠動脈結 紮による心筋梗塞モデルラッ卜の心不全発症時において発現が変動するような新 規遺伝子を取得し、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4または配列番号： 3 6で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその塩、
( 2 ) 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩、
( 3 ) 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその
( 4 ) 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその ί &、 (5) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(6) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （5) 記載の部分ペプチドをコ ―ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(7) DN Aである上記 （6) 記載のポリヌクレオチド、
(8) 配列番号： 17、 配列番号： 18または配列番号： 32で表される塩基 配列からなるポリヌクレオチド、
(9) 上記 （6) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(10) 上記 （9) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(1 1) 上記 （10) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク 質もしくはその塩または上記 （5) 記載の部分ペプチドもしくはその塩を生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もし くはその塩または上記 （5) 記載の部分ペプチドもしくはその塩の製造方法、
(12) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上記 （5) 記載の 部分べプチドもしくはその塩を含有してなる医薬、
(13) 上記 （6) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(14) 上記 （6) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(15) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上記 （5) 記載の 部分べプチドもしくはその塩に対する抗体、
(16) 上記 （15) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(17) 上記 （15) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(18) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （5) 記載の部分ペプチドを コードする DN Aに相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分 を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(19) 上記 （18) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医 薬、
(20) 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす る、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
(21) 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴と する、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を調節する化 合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(22) 上記 （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （21) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を調節する化合物またはその塩、
(23) 上記 （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （2 1) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま たはその塩、
(23 a) 上記 （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （21) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33または配列番号： 35で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、
(24) 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコ一ドするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(25) 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレ ォチドを含有することを特徴とする、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドま たはその塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キ ッ卜、
(26) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法または上記 （25) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩、
(27) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法または上記 （25) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33または配列番号： 3 5で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する 化合物またはその塩、
(27 a) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法または上記 （25) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 33または配列番号： 35で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、
(28) 上記 （22) 、 （23) 、 （26) または （27) 記載の化合物また はその塩を含有してなる医薬、
(29) 心疾患の予防 ·治療剤である上記 （12) 、 （13) 、 （16) 、 (19) または （28) 記載の医薬、
(30) 心疾患の診断薬である上記 （14) または （17) 記載の診断薬、 (31) 配列番号： 2で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配 列を含有する DNA、
(32) 配列番号： 17または配列番号： 18で表される塩基配列と同一また は実質的に同一の塩基配列を含有する DN Aのプロモーター領域である上記 （3 1) 記載の DNA、 (33) 上記 （31) 記載の DNAを含有する組換えベクター、
(34) 配列番号： 2で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配 列を含有する DN Aのプロモーター領域の下流にレポ一夕一遺伝子を有する DN
Aを含有する上記 （33) 記載の組換えベクター、
(35) 上記 （34) 記載の組換えベクターを含有する形質転換体、
(36) 上記 （31) 記載の DNAを用いることを特徴とする、 配列番号： 1
7または配列番号： 18で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配 列を含有する DN Aのプロモー夕一活性を促進または阻害する化合物またはその 塩のスクリーニング方法、
(37) 上記 （35) 記載の形質転換体を用いる上記 （36) 記載のスクリ一 ニング方法、
(38) 上記 （31) 記載の DNAを含有することを特徴とする、 配列番号： 17または配列番号： 18で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基 配列を含有する DN Aのプロモー夕一活性を促進または阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング用キット、
(39) 上記 （36) 記載のスクリーニング方法または上記 （38) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 17または配列番号： 1 8で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する DN Aの プロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
(40) 上記 （39) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (41) 心疾患の予防 ·治療剤である上記 （40) 記載の医薬、
(42) 哺乳動物に対して、 上記 （22) 、 （23) 、 （26) 、 （27) ま たは （39) 記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする心 疾患の予防 ·治療方法、
(43) 心疾患の予防 ·治療剤の製造のための、 上記 （22) 、 （23) 、
(26) 、 (27) または （39) 記載の化合物またはその塩の使用などを提供 する。
さらに、 本発明は、 (44) 上記 （1) 記載のタンパク質をコードする DNAまたはその変異 DN
Aを有する非ヒト DNA導入動物、
(45) 非ヒ卜動物がゲッ歯動物である上記 （44) 記載の動物、
(46) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記 （45) 記載の動物、 (47) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(48) 該 D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化された上 記 （47) 記載の胚幹細胞、
(49) ネオマイシン耐性である上記 （47) 記載の胚幹細胞、
(50) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （47) 記載の胚幹細胞、 (51) ゲッ歯動物がマウスである上記 （50) 記載の胚幹細胞、
(52) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、 (53) 該 DNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該 レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモータ一の制御下で発現しうる 上記 （52) 記載の非ヒト哺乳動物、
(54) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （53) 記載の非ヒト哺乳動 物、
(55) ゲッ歯動物がマウスである上記 （54) 記載の非ヒト哺乳動物、 (56) 上記 （53) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、. レポーター遺伝子 の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(57) (i) 配列番号： 33または配列番号： 35で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩 （本発明のタン パク質 A) を産生する能力を有する細胞を培養した場合と （ii) 試験化合物の存 在下、 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を培養した場合におい て、 本発明のタンパク質 Aの活性をそれぞれ測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 ( 5 8 ) 本発明のタンパク質 Aの活性が、 活性心機能促進または抑制活性、 心 筋細胞機能活性化および （または） 不活性化作用である上記 （5 7 ) 記載のスク リーニング方法、
( 5 9 ) ( 0 配列番号： 3 4または配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは部分 ペプチドまたはその塩 （本発明のタンパク質 B ) を産生する能力を有する細胞を 培養した場合と （i i) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bを産生する能 力を有する細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク質 Bの活性をそれぞ れ測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの活性を促進また は阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 0 ) 本発明のタンパク質 Bの活性が、 活性心機能促進または抑制活性、 心 筋細胞機能活性化および （または） 不活性化作用である上記 （5 9 ) 記載のスク リーニング方法、
( 6 1 ) (i) 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を培養した 場合と （i i) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有す る細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現量をそれ ぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発 現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 2 ) (i) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞を培養した 場合と （i i) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有す る細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現量をそれ ぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発 現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 3 ) ( 0 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を低酸素条 件下で伸展刺激を加えて培養した場合と （i i) 試験化合物の存在下、 本発明の夕 ンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加えて培養 した場合における、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明の夕ンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 4 ) (i) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞を低酸素条 件下で伸展刺激を加えて培養した場合と （i i) 試験化合物の存在下、 本発明の夕 ンパク質 Bを産生する能力を有する細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加えて培養 した場合における、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明の夕ンパク質 Bの遺伝子の発現を促進または 阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 5 ) (i) 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を培養した 場合と （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有す る細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク質 Aの発現量をそれぞれ測定 して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの発現を阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 6 ) 本発明のタンパク質 Aに対する抗体を用いて本発明のタンパク質 Aの 発現量を測定する上記 （6 5 ) 記載のスクリーニング方法、
( 6 7 ) ( i) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞を培養した 場合と （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有す る細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク質 Bの発現量をそれぞれ測定 して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの発現を促進または阻 害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 6 8 ) 本発明のタンパク質 Bに対する抗体を用いて本発明のタンパク質 Bの 発現量を測定する上記 （6 7 ) 記載のスクリーニング方法、
( 6 9 ) ( i) 本発明のタンパク質 Aの遺伝子のプロモーター領域の下流にレ ポーター遺伝子を連結させたプラスミドを導入した細胞を培養させた場合と、
(i i) 本発明のタンパク質 Aをコードする遺伝子のプロモータ一領域の下流にレ ポー夕一遺伝子を連結させたプラスミドを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養させた場合における、 レポーター遺伝子の酵素活性をそれぞれ測定し、 比較 することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する化合物 またはその塩のスクリーニング方法、 (70) (i) 本発明のタンパク質 Bの遺伝子のプロモーター領域の下流にレ ポーター遺伝子を連結させたプラスミドを導入した細胞を培養させた場合と、
(ii) 本発明のタンパク質 Bをコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレ ポーター遺伝子を連結させたプラスミドを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養させた場合における、 レポーター遺伝子の酵素活性をそれぞれ測定し、 比較 することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(71) (i) 本発明のタンパク質 Aをコードする DNAおよび本発明のタン パク質 Aと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を培養 させた場合と、 （ii) 本発明のタンパク質 Aをコードする DNAおよび本発明の タンパク質 Aと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養させた場合における、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の 発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 A の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(72) (i) 本発明のタンパク質 Bをコードする DNAおよび本発明のタン パク質 Bと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を培養 させた場合と、 （ii) 本発明のタンパク質 Bをコードする DNAおよび本発明の タンパク質 Bと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養させた場合における、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の 発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 B の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(73) (i) 本発明のタンパク質 Aをコードする DNAおよび本発明のタン パク質 Aと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を低酸 素条件下で伸展刺激を加えて培養した場合と （ii) 試験化合物の存在下、 本発明 のタンパク質 Aをコ一ドする DNAおよび本発明のタンパク質 Aと相互作用をす るタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加 えて培養した場合における、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現量をそれぞれ 測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(74) (i) 本発明のタンパク質 Bをコードする DN Aおよび本発明のタン パク質 Bと相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を低酸 素条件下で伸展刺激を加えて培養した場合と （ii) 試験化合物の存在下、 本発明 のタンパク質 Bをコードする DNAおよび本発明のタンパク質 Bと相互作用をす るタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加 えて培養した場合における、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現量をそれぞれ 測定して、 比較することを特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(75) 相互作用をするタンパク質が、 Nkx2. 5、 GATA-4, MLP、 MNFまたは S p_ 1である上記 （71) 〜 （74) 記載のスクリーニング方法、 (76) (i) (a) 本発明のタンパク質 Aおよび （b) 本発明のタンパク質 A と相互作用するタンパク質を接触させた場合と （ii) (a) 試験化合物、 （b) 本 発明のタンパク質 Aおよび （c) 本発明のタンパク質 Aと相互作用するタンパク 質を接触させた場合における、 「本発明のタンパク質 A」 と 「本発明のタンパク 質 Aと相互作用するタンパク質」 との結合活性をそれぞれ測定し、 比較すること を特徴とする、 本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(77) (i) (a) 本発明のタンパク質 Bおよび （b) 本発明のタンパク質 B と相互作用するタンパク質を接触させた場合と （ii) (a) 試験化合物、 （b) 本 発明のタンパク質 Bおよび （c) 本発明のタンパク質 Bと相互作用するタンパク 質を接触させた場合における、 「本発明のタンパク質 B」 と 「本発明のタンパク 質 Bと相互作用するタンパク質」 との結合活性をそれぞれ測定し、 比較すること を特徴とする、 本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現を促進または阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
(78) (i) (a) 本発明のタンパク質 Aと GAL4遺伝子の DNA結合ドメ インとの融合タンパク質を発現するプラスミド、 （b) 本発明のタンパク質 Aと 相互作用するタンパク質と VP 16遺伝子の転写活性化ドメインとの融合タンパ ク質を発現するプラスミド、 および （c) GAL 4遺伝子のプロモーターにレポ 一夕一遺伝子を結合したプラスミドを導入した細胞を培養した場合と、 （ii) 試 験化合物の存在下、 （a) 本発明のタンパク質 Aと GAL 4遺伝子の DNA結合 ドメインとの融合タンパク質を発現するプラスミド、 （b) 本発明のタンパク質 Aと相互作用するタンパク質と VP 16遺伝子の転写活性化ドメインとの融合夕 ンパク質を発現するプラスミド、 および （c) GAL 4遺伝子のプロモーターに レポ一夕一遺伝子を結合したプラスミドを導入した細胞を培養した場合における、 レポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本 発明のタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(79) (i) (a) 本発明のタンパク質 Bと GAL4遺伝子の DNA結合ドメ インとの融合タンパク質を発現するプラスミド、 （b) 本発明のタンパク質 Bと 相互作用するタンパク質と VP 16遺伝子の転写活性化ドメインとの融合タンパ ク質を発現するプラスミド、 および （c) GAL 4遺伝子のプロモーターにレポ —夕一遺伝子を結合したプラスミドを導入した細胞を培養した場合と、 （H) 試 験化合物の存在下、 （a) 本発明のタンパク質 Bと GAL 4遺伝子の DNA結合 ドメインとの融合タンパク質を発現するプラスミド、 （b) 本発明のタンパク質 Bと相互作用するタンパク質と VP 16遺伝子の転写活性化ドメインとの融合夕 ンパク質を発現するプラスミド、 および （c) GAL 4遺伝子のプロモーターに レポーター遺伝子を結合したプラスミドを導入した細胞を培養した場合における、 レポ一夕一遺伝子の発現量をそれぞれ測定して、 比較することを特徴とする、 本 発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリ一ニング方法なども提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質 （以下、 本発明のタンパク質と称することもある） は、 ヒトまたはその他 の温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア 細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細 胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一 細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨 細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 また はこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれらの細胞 が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基 底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍 臓、 腎齓 肝齓 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化 管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾 丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質であっても よく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列と約 4 0 %以上、 好ましくは約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ま しくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8
0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上の相同 性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 より好ま しくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 より好ま しくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat i onal
Center for B i o technol ogy Informat i on Bas i c Local Al ignmen t Search Too l) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；マトリクス =BL0SUM62；フ ィル夕リング =0FF) にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 心機能促進または抑制活性、 心筋細胞 機能活性または不活性化作用などが挙げられる。 具体的には、 心機能の代償機序 のひとつとしての心機能促進活性、 過剰な代償機序の作動によって生じる代償破 綻による心機能抑制活性などが挙げられる。 心筋細胞機能活性化作用には、 細胞 保護作用も含まれる。 上記の本発明のタンパク質の心機能促進または抑制活性、 および心筋細胞機能 活性化または不活性化作用は、 心機能を測定することにより、 測定する。
心機能の測定は、 公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することが できる。 例えば、 心エコー測定装置 （セル、 第 97巻、 189- 198頁、 1999年） また は心臓カテーテルによる心機能測定 （サーキュレーションリサーチ、 第 69巻、 370- 377頁、 1991年） によって行う。 更に、 例えばアンジォテンシン I変換酵素 (ACE) などのレニンアンジォテンシン系 （RAS) の亢進を市販の測定キッ ト （例、 ぺニンスラ一社製、 フェニックス社製など） を用いて測定したり、 血中 カテコラミンの増加活性 （東ソ一社製、 全自動カテコールアミン分析計） などを 指標に心機能を測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を用いて心筋細胞機能活性化 または不活性化作用を測定する場合、 例えば細胞の呼吸活性を測定する、 または 心不全マーカー遺伝子 〔例、 ANP (心房性ナトリウム利尿ペプチド） 、 BNP (脳性ナトリウム利尿ペプチド） など〕 の発現変化を測定または心不全マーカー 遺伝子産物の産生量を測定する。 細胞の呼吸活性は、 公知の方法またはこれに準 じる方法に従って測定することができる。 例えば、 MTT (3-(4,5-Dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-di heny 1 -2H- tetrazolium) 法やトリパンブルー染色法、 TUN N EL染色法 (Terminal deoxytransferase- mediated dUTP-X nick end labeling, セル、 第 97巻、 189 - 198頁、 1999年) などを用いる。
実質的に同質とは、 その活性が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的 に） 同質であることを示す。 したがって、 心機能促進または抑制活性、 および心 筋細胞機能活性化または不活性化作用などが同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜10倍、 より好ましくは 0. 5〜2倍） であることが好ま しいが、 この活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていても よい。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 （1) (i) 配列番号： 33で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好まし くは 1〜50個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 さらに好ましくは 1〜10個 程度、 より好ましくは 1〜 5個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配 列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個 程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましく は 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配 列、 （i i i) 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例え ば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が挿入 されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 3 3で表されるアミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは ：!〜 3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティン、
( 2 ) (i) 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜 1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配 列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 3 4で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜 1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのい わゆるムテイン、
( 3 ) (i) 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配 列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 3 5で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜 5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのい わゆるムテイン、
( 4 ) (0 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜 1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配 列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 3 6で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 さらに好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1 ~ 5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのい わゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置としては、 特に限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端) である。 本発明のタンパク 質は、 C末端がカルボキシル基 （-C00H) 、 カルポキシレート（- C00—) 、 アミド (-C0NH2) またはエステル （- C00R) のいずれであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの C ,_6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シ クロへキシルなどの C 3-8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチ^/レな どの〇6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー Cい 2ァ ルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー C卜2アルキル基など の C 7_14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレー ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されている ものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上 記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のダンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C ,-6アルカノ ィルなどの C ,_6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成 する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 （例えば- 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C ,_6アルカノィル基などの < 卜6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖 鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 3 3で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列を含 有するタンパク質、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質、 配列番号： 36で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげら れる。
本発明のタンパク質の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと称するこ ともある） としては、 前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、 好 ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の活性を有するものであればいず れのものでもよい。
例えば、 本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 さらに好ましくは 70個以上、 より好ましくは 100個 以上、 最も好ましくは 150個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用い られる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠 失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜20個 程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のァ ミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜20個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜10個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
より具体的には、 本発明の部分ペプチドとして、 例えば （1) 配列番号： 33 で表されるアミノ酸配列中、 N末端から第 1〜22番目、 第 1 1 1〜132番目 または第 270〜283番目のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する部分 ペプチド、 （2) 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列中、 N末端から第 1〜 20番目、 第 21〜40番目、 第 41〜60番目、 第 61〜80番目、 第 245 〜265番目、 第 355〜375番目または第 514〜527番目のアミノ酸残 基を有するアミノ酸配列を有する部分ペプチド、 （3) 配列番号： 35で表され るアミノ酸配列中、 N末端から第 1〜20番目、 第 1 12〜133番目または第 270〜284番目のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する部分ペプチド、 ( 4 ) 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列中、 N末端から第 1〜2 0番目、 第 2 1〜4 0番目、 第 4 1〜 6 0番目、 第 6 1〜 8 0番目、 第 2 4 1〜 2 6 0番 目、 第 3 5 2〜 3 7 2番目または第 5 1 0〜5 2 3番目のアミノ酸残基を有する アミノ酸配列を有する部分ペプチドなどがあげられる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルボキ シレート（-C00—) 、 アミド （_C0NH2) またはエステル （-C00R) のいずれであつ てもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質と同様に、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で保護されて いるもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン 酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなど も含まれる。
本発明の部分べプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。 本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される 酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例え ば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機 酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスル ホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩は、 前述したヒト またはその他の温血動物の細胞または組織より公知のタンパク質の精製方法によ り製造、 またはタンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養する ことにより製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造す ることもできる。
ヒトまたはその他の温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトまたは その他の温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行な レ 、 得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそのアミド体 の合成には、 通常市販のタンパク質合成用榭脂を用いることができる。 そのよう な樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジルォキシベンジルアルコール 樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM榭脂、 4—ヒドロキシメチ ルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一
( 2 ', 4，ージメトキシフエ二ル―ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一
( 2 ', 4 '—ジメトキシフエニル— F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂など を挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適 当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合 方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出す と同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形 成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド 体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, Ν'—ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν—ェチ ル— N'— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H〇〇B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約— 2 O ：〜 5 0での範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与え いよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t _ペンチルォキシ 力ルポニル、 イソボルニルォキシカルポニル、 4 _メトキシベンジルォキシカル ポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—プチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4—クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t —ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 ( C ,.6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ルポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ピラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12- B z l、 2_ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシ —2， 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 H〇B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd_炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 ：〜 40 の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイド、 1， 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 —エタンジチオール、 1, 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチ ド鎖の Ν末端のひ—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分べプチ ドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺプ チドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒 中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得ら れた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護 基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗夕 ンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍 結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができ る。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成法に従って、 あ るいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造す ることができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法 のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成し得る部分べ プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合 は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の 縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （i ) 〜 （V) に記載された方 法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. Ondetti, ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publ ishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ぺプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験， 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換する ことができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記した本発明 のタンパク質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好ましくは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌクレオチドとし ては、 本発明のタンパク質をコードする DNA、 mRNA等の RNAであり、 二 本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本 鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 セン ス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （すなわち、 非コード 鎖） であってもよい。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 公知の方法、 例 えば、 実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15 (7) 、 1997記載の方法ま たはそれに準じた方法により、 本発明のタンパク質の mRN Aを定量することが できる。
本発明のタンパク質をコードする DN Aとしては、 前述した本発明のタンパク 質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれ でもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする DN Aとしては、 例えば、 （1) 配列番号： 17で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 17で表される塩 基配列とハイス卜リンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 配列番号： 33で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の 性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(2) 配列番号： 18で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(3) 配列番号： 1で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 1 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 35で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と 実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、 または
(4) 配列番号： 32で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 32で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 36で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 17で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 17で表 される塩基配列と約 40%以上、 好ましくは約 50%以上、 好ましくは約 60% 以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特に好ま しくは約 90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられ る。
配列番号： 18で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 18で表 される塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 1で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン卜な 条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1で表され る塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有する 塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 32で表される塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 32で表 される塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 好ましくは約 80% 以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et aし， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ —を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜70 、 好ましくは約 60 〜65 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 33で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 17で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコー ドする DNAとしては、 配列番号： 18で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 35で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DN Aとしては、 配列番号： 1で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 36で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 32で表される塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前記した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有する DN Aであればいかなるものであっても よい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由 来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAの いずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのい ずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 1または配列番号： 32で表される塩基配列を含有 する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 1または配列番号： 32で表される塩基配列とハイストリンジ工ント な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 33、 配列番号： 34、 配列番号： 35または配列番号： 36で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一部 分を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 1または配列番号： 32で表さ れる塩基配列とハイブリダィズできる DN Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダィゼーシヨンの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明のタンパク質または本発明の部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタン パク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの手段 としては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマ一を用いて PCR法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組 み込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部または全領域をコードする DNA断 片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによつ て選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、
Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 0DA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法などの公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。
クローンィ匕された夕ンパク質をコ一ドする DNAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加して使用することができる。 該 DN Aはその 5'末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3'末端 側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用 いて付加することもできる。 本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， pBR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10, pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 15) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 p R c/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモータ一、 LTRプ 口モー夕—、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロモ 一夕一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモ一夕一、 r e cAプロモータ一、 λ Ρ^プロモー 夕一、 l ppプロモーター、 T 7プロモータ一などが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SP〇 1プロモーター、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモータ —など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモータ一などが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。 '
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA 'シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α— アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MF a ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物 細胞である場合には、 インシュリン 'シグナル配列、 α—インターフェロン ·シ グナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 12 · DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160(1968)〕 ， JM103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309(1981)〕 ， J A 221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)] , HB 101 (Journal of Molecular Biology,41巻， 459(1969)〕 , C 600 [Genetics, 39 巻, 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔Gene， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 [Journal of Biochemistry, 95卷， 87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ 87 - 1 1 A, DKD— 5D, 20 Β— 12、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1913, NCYC 2036、 ピキア ·パストリス （Pichia pastoris) K M7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T_20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3， ヒト FL 細胞、 H9 c 2細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻, 2110(1972)、 Gene., 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうこ とができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182 - 187(1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47- 55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子などを添 加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Mi Her, Journal of Experiments in Molecular
Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好まし レ^ ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 /3_ インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43でで約 3〜24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40" で約6〜24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一 (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330(1984)〕 が挙げられる。 培地の pH は約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20〜35tで約 24〜72 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788(1962)) に非動化し た 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは 約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27でで約 3〜 5日間 行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔3 611 6，122巻，501(1952)〕 ， DME M培地 [Virology, 8巻， 396(1959)〕 ， RPM I 1640培地 [The Journal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 , 199培地
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜4 0 で約15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞質内または細胞外に本発明のタンパク質 を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X 一 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質が 分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分 離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これら の公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィ —などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水性の差 を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用い られる。
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法 あるいはそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で得られた 場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変 換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェン ザィムィムノアツセィゃウェスタンプロッティングなどにより測定することがで さる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明に おいては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対する抗 体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法 に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化夕 ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975)] に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、' AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37で で 1〜 10分間ィンキュベ一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、' タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培 地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいは ハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用 いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 ：、 好ましくは約 3 7 である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通 常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができ る。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のタンパク質等の抗原） とキヤリ ァ一タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様 に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含 有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリア一タンパク質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする D N A (以下、 アンチセ ンスヌクレオチドの説明においては、 これらの D N Aを本発明の D NAと略記す る場合がある） の塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列または その一部を含有するアンチセンスヌクレオチドとしては、 本発明の D NAの塩基 配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスヌ クレオチドであってもよいが、 アンチセンス D NAが好ましい。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げら れる。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列な ど） の相補鎖と約.7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオ チドが好適である。
具体的には、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1または配列番 号： 3 2で表される塩基配列を含有する D NAの塩基配列に相補的な、 もしくは 実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を含有するアンチセンスヌクレオ チドなどが、 好ましくは配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1または 配列番号： 3 2で表される塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補的な塩基 配列、 またはその一部分を含有するアンチセンスヌクレオチドなどが挙げられる。 好ましくは、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1または配列番号： 3 2で表される塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補的な塩基配列、 または その一部分を含有するアンチセンスヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレア一ゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンスポリ ヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 （ホスフェート） は、 例え ば、 ホスホロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネー卜などの化 学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオ チドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいは アミノ酸配列が決定されたタンパク質をコードする D NAの塩基配列情報に基づ き設計し、 合成しうる。 このようなポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタン パク質遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または 機能を阻害することができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相 互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパク質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明のタンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダィズすることができ るポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現 を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特 定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌク レオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド (タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 '端へアビ ンループ、 5 '端 6—ベースペア · リピート、 5 '端非翻訳領域、 ポリペプチド翻 訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 '端非翻訳領 域、 3 '端パリンドローム領域、 および 3 '端ヘアピンループは好ましい対象領域 として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しう る。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「アン チセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2— デォキシー D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを含有 しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであ るその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するそ の他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポ リマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配 置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D N A、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さらに D N A： R NAハイブリツ ドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌク レオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた 標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然 のヌクレオチドを類緣物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホ ルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含 有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗 体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァ クリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活 性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含 有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマ一型の核酸など） で あってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環 型塩基を持つようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化された プリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはそ の他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドは糖部分が修飾 されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置 換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計 されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァ ンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性 をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et aし， Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vo l . 8， pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl i cat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 '端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着さ せることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端または 5 '端に特異的に 配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌクレア —ゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基と しては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグリコール をはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定 されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用 できる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べプチ ドをコードする D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） 、 および本発明の D N Aのアンチセンスポリヌクレ ォチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。
さらに、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは部分べプチ ドまたはその塩を、 本発明のタンパク質 Aと、 配列番号： 3 4または配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を、 本発明のタンパク質 Bと 略記する場合がある。
本発明のタンパク質は、 心筋梗塞後の心不全移行期 （心不全代償期 心不全非 代償期） の心臓に発現が上昇するので、 疾患マーカ一として利用することができ る。 すなわち、 例えば心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） な どの早期診断、 症状の重症度の判定、 疾患進行の予測のためのマーカーとして有 用である。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子 （本発明のタンパク質遺伝子） のアン チセンスヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を調節する化合物もしくはそ の塩、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物もしくはその塩、 また は本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、 例えば心機能の低下を特 徵とする疾病、 例えば心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） な どの予防 ·治療剤などとして使用することができる。
〔1〕 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質 Aは心筋梗塞後の心機能低下とともに （心不全代償期 心 不全非代償） 発現が増加する。 また、 本発明のタンパク質 A遺伝子のセンス鎖を 動物に導入することにより、 心拍数および左室内圧変化率は減少する。 従って心 不全期でのタンパク質 A遺伝子の過剰発現、 それに伴う機能の増強は、 心機能低 下を来すため、 本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 心機能の低下を特徴とする疾病 （例、 心筋梗塞後の心不全；狭心症；心 筋症；狭心症、 心筋症などの疾患に由来する心不全などの心疾患など） などの予 防 ·治療剤として使用できる。
本発明の夕ンパク質 Bは心筋梗塞後の心機能低下とともに （心不全代償期 心 不全非代償） 発現が増加するので、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進また は阻害） する化合物またはその塩は、 例えば、 心機能の低下を特徴とする疾病 (例、 心筋梗塞後の心不全；狭心症；心筋症；狭心症、 心筋症などの疾患に由来 する心不全などの心疾患など） などの予防 ·治療剤として使用できる。
すなわち、 本発明は、 （1 ) 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本 発明のタンパク質の活性 （例えば、 心機能促進または抑制活性、 心筋細胞機能活 性化または不活性化作用など） を調節 （促進または阻害） する化合物またはその 塩のスクリーニング方法、 （2 ) 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 （促進ま たは阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （3 ) 本発明の抗体 を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
さらに詳しくは、
(a) 本発明のタンパク質 Aを用いることを特徴とする本発明のタンパク質 Aの 活性 （例えば、 心機能抑制活性、 心筋細胞機能不活性化作用など） を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、 （b) 本発明のタンパク質 Aをコード するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質 Aの遺伝子 の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （c) 本発明の抗 体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質 Aの発現を阻害する化合物また はその塩のスクリーニング方法、 （d) 本発明のタンパク質 Bを用いることを特 徴とする本発明のタンパク質 Bの活性 （例えば、 心機能促進または抑制活性、 心 筋細胞機能活性化または不活性化作用など） を促進または阻害する化合物または その塩のスクリーニング方法、 （e) 本発明のタンパク質 Bをコードするポリヌ クレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質 Bの遺伝子の発現を促 進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （f) 本発明の抗 体を用いることを特徴とする本発明の夕ンパク質 Bの発現を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
(1) 本発明のタンパク質を用いる本発明のタンパク質の活性を調節 （促進また は阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法
スクリーニング方法の具体例としては、 （i) 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞を培養した場合と （Π) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパ ク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とす る調節 （促進または阻害） 剤のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i) と （ii) の場合における、 本発明の夕ンパク質の心機能促進または抑制活性、 心筋細胞機能活性化または不 活性化作用などを測定し、 比較する。
上記の本発明のタンパク質の心機能促進または抑制活性、 および心筋細胞機能 活性化または不活性化作用は、 心機能を測定することにより、 測定する。
心機能の測定は、 公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することが できる。 例えば、 心エコー測定装置 （セル、 第 97巻、 189-198頁、 1999年） また は心臓カテーテルによる心機能測定 （サーキュレーションリサーチ、 第 69巻、 370- 377頁、 1991年） によって行う。 更に、 例えばアンジォテンシン I変換酵素 (ACE) などのレニンアンジォテンシン系 （RAS) の亢進を市販の測定キッ ト （例、 ぺニンスラ一社製、 フェニックス社製など） を用いて測定したり、 血中 カテコラミンの増加活性 （東ソ一社製、 全自動カテコールアミン分析計） などを 指標に心機能を測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を用いる場合、 例えば細胞の 呼吸活性を測定する、 または心不全マーカー遺伝子 〔例、 ANP (心房性ナトリ ゥム利尿ペプチド） 、 BNP (脳性ナトリウム利尿ペプチド） など〕 の発現変化 を測定または心不全マーカー遺伝子産物の産生量を測定する。 細胞の呼吸活性は、 公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することができる。 例えば、 M TT (3- (4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazol ium) 法やトリ パンブルー染色法、 TUNNEL染色法 (Terminal deoxy trans ferase- mediated dUTP-X nick end labeling, セル、 第 97巻、 189- 198頁、 1999年) などを用いる。 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する能 力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ一に浮遊して調製する。 バッ ファーには、 pH¾4〜10 (望ましくは、 ^1約6〜8) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファ一などであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した 本発明の夕ンパク質をコードする D N Aを含有するべク夕一で形質転換された宿 主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 H9 c 2細胞などの動 物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培 養することによって、 本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好 ましく用いられる。
例えば、 上記 （ii) の場合における心筋細胞機能活性化作用を、 上記 （i) の 場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50% 以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはそ の塩として選択することができる。 上記 （ii) の場合における心筋細胞機能不活 性化作用を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を 阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
(2) 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる本発明のタン パク質遺伝子の発現を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法
スクリーニング方法の具体例としては、 （iii) 本発明のタンパク質を産生す る能力を有する細胞を培養した場合と （iv) 試験化合物の存在下、 本発明のタン パク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合における、 本発明のタンパク 質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質を コードする mRNA量） を測定して、 比較する。
例えば、 （iii') 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を低酸素条 件下で伸展刺激を加えて培養した場合と （iv') 試験化合物の存在下、 本発明の タンパク質を産生する能力を有する細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加えて培養 した場合における、 本発明のタンパク質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明の タンパク質量または前記タンパク質をコードする mRNA量） を測定して、 比較 する。
上記低酸素条件下とは、 例えば 20% 02以下の酸素濃度、 好ましくは 2% の酸素濃度 （ネイチヤー、 第 394巻、 485-490頁、 1998年） の条件などが挙げられ る。
上記伸展刺激とは、 例えば、 目的細胞を伸展可能なシリコン膜上に培養し、 シ リコン膜を引っ張ることで機械的負荷を加える刺激である （J.B. 、 第 271巻、 33592- 33597頁、 1996年、 サーキュレーション、 第 89巻、 2204- 2211頁、 1994年、 J.B. 、 第 271巻、 3221- 3228頁、 1996年） „
例えば、 （iii'') 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を、 致死 的な条件下培養した場合と （iv'') 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質を 産生する能力を有する細胞を、 致死的な条件下培養した場合における、 本発明の タンパク質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タン パク質をコードする mRNA量） を測定して、 比較する。
上記致死的な条件下で培養とは、 例えば、 血清除去下で培養または抗癌剤 （例、 心筋細胞に比較的毒性の強いァドリァマイシンなど） を加えて培養することが挙 げられる。
本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を 認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェス タン解析、 EL I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定すること ができる。
本発明のタンパク質遺伝子発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザンブロッテ インクや Reverse transcription - polymerase chain react ion (RT-PCR) 、 リア ルタイム PC R解析システム (ABI社製、 TaqMan polymerase chain reaction) などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する能 力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。 バッ ファーには、 pH約4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファーで あればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した 本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべクターで形質転換された宿 主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 H9 c 2細胞などの動 物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培 養することによって、 本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好 ましく用いられる。
例えば、 上記 （iv) 、 (ίν') または （iv'') の場合における本発明のタンパ ク質遺伝子の発現量を、 上記 （iii) 、 (ΐϋ') または （iii'') の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上促進する試 験化合物を、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩と して選択することができる。 上記 （iv) 、 (ΐν') または （iv'') の場合におけ る本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、 上記 （iii) 、 （iii') または
(iii") の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好まし くは約 50 %以上阻害する試験化合物を、 本発明の夕ンパク質遺伝子の発現を阻 害する化合物またはその塩として選択することができる。
(3) 本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の発現を調節 （促進または阻 害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法 スクリーニング方法の具体例としては、 （V) 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞を培養した場合と （v i ) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパ ク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行う。 上記スクリー ニング方法においては、 本発明の抗体を用いて （V) と （v i ) の場合における、 本発明のタンパク質の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量） を測定 （例、 発現の検出、 発現量の定量など） して、 比較する。
本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を 認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェス タン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定すること ができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した 本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換された宿 主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 H 9 c 2細胞などの動 物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培 養することによって、 本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好 ましく用いられる。
例えば、 上記 （v i ) の場合における本発明のタンパク質の発現量を、 上記
(V) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは 約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物 またはその塩として選択することができる。 上記 （v i ) の場合における本発明の タンパク質の発現量を、 上記 （V) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明のタンパ ク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
( 4 ) レポ一夕一遺伝子 ·アツセィ方法を用いる本発明のタンパク質の遺伝子の 発現を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法 本発明は、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを用いるレ ポー夕一遺伝子.アツセィにおいて、 レポーター遺伝子の酵素活性を測定するこ とを特徴とする、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはそ の塩のスクリーニング法も提供する。 これは、 本発明のタンパク質の発現量およ び活性化に依存してレポーター遺伝子の酵素活性が上昇することを利用するもの である。 該プロモーターとしては、 例えば配列番号： 2で表される塩基配列を含 有する塩基配列が用いられる。
レポ一夕一遺伝子 ·アツセィは、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺 伝子のプロモータ一領域の下流にレポ一夕一遺伝子 （例、 ^ガラクトシダ一ゼ、 クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ、 ルシフェラーゼなど） を連 結させたプラスミドを構築し、 該プラスミドを宿主細胞等に公知の方法により導 入した細胞を用いて行う。 該プラスミドの構築、 プラスミドの導入などは、 公知 の方法、 例えば、 上記の本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有する組み 換えベクター、 および該組み換えベクターで形質転換された形質転換体の製造方 法と同様の方法に従って行うことができる。 宿主細胞としては、 例えば、 初代心 筋細胞、 H 9 c 2細胞株 （A T C C N o . C R L - 1 4 4 6 ) または本発明の タンパク質をコードする遺伝子を導入した初代心筋細胞もしくは H 9 c 2細胞株 などが用いられる。
スクリーニング方法の具体例としては、
(vi i) 本発明の夕ンパク質の遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺 伝子を連結させたプラスミドを導入した細胞を培養させた場合と、 （vi i i) 本発 明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝 子を連結させたプラスミドを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養させた場 合との、 レポーター遺伝子の酵素活性の比較を行うことを特徴とする本発明の夕 ンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。 レポーター遺伝子の酵素活性は公知の方法に従って測定する。
該スクリーニング方法によって得られる化合物またはその塩は、 本発明のタン パク質をコードする DNA (遺伝子） の発現を促進または阻害する化合物または その塩である。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 生体由来非ペプチド性 化合物 （糖質、 脂質など） 、 合成化合物、 微生物培養物、 細胞抽出液、 植物抽出 液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は新規化合物であってもよい し、 公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する能 力を有する細胞をスクリーニングに適した培地を用いて培養する。 培地は、 本発 明のタンパク質の遺伝子発現に影響を与えないものであればいずれでもよい。 上記細胞としては、 上記の宿主細胞などが用いられる。 宿主としては、 例えば、 H9 c 2細胞 （ATCC No. CRL— 1446) などの動物細胞が好ましく 用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによつ て、 本発明の夕ンパク質を細胞質内に発現させた形質転換体が好ましく用いられ る。
例えば、 上記 （viii) の場合におけるレポーター遺伝子の酵素活性を、 上記 (vii) の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましく は約 50 %以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進す る化合物またはその塩として選択することができる。 上記 （viii) の場合におけ るレポーター遺伝子の酵素活性を、 上記 （vii) の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害する試験化合物を本発 明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択すること ができる。
(5) 本発明のタンパク質と相互作用する遺伝子の発現を指標とする、 本発明の タンパク質の遺伝子の発現を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩の スクリーニング方法
本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 A) は、 その発現増強が、 直接的に心機能の低下をきたしている。 この本発明のタンパク質 Aの作用 （心機 能増悪作用） は、 心臓機能の恒常性維持に関わる因子の作用を抑制することによ り生じると推定される。 該因子としては、 例えば、 心筋特異的な転写因子 （例、 Nk X 2. 5 (心特異的転写因子； Journal of Biological Chemistry, 第 273卷、 第 34904- 34910頁、 1998年）、 G AT A— 4 (細胞特異的転写因子； The EMB0 Journal, 19巻、 2046-2055頁、 2000年） 、 MLP、 FHL— 2、 MNF、 S p— 1など） 、 心筋保護シグナル （例、 gp 130シグナル、 I GF— 1シグナルな ど） 、 細胞接着因子 （例、 コネクシン 43など） などが挙げられる。
従って、 本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質との結合活性を指標と するスクリ一二ング方法により、 本発明の夕ンパク質の遺伝子の発現を調節する 化合物またはその塩を得ることができる。
スクリーニング方法の具体例としては、 （ix) 本発明の DNAおよび本発明の タンパク質と相互作用をするタンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を培 養させた場合と、 （X) 本発明の DN Aおよび本発明のタンパク質と相互作用を するタンパク質をコードする DNAを導入した細胞を、 試験化合物存在下、 培養 させた場合における、 本発明のタンパク質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明 のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mRNA量） を測定して、 比 較する。
例えば、 （ix') 本発明の DNAおよび本発明のタンパク質と相互作用をする タンパク質をコードする DN Aを導入した細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加え て培養した場合と （χ') 試験化合物の存在下、 本発明の DNAおよび本発明の夕 ンパク質と相互作用をするタンパク質をコードする DNAを導入した細胞を低酸 素条件下で伸展刺激を加えて培養した場合における、 本発明のタンパク質遺伝子 の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードす る mRNA量） を測定して、 比較する。
上記本発明のタンパク質と相互作用をするタンパク質としては、 心筋特異的な 転写因子 （例、 Nkx 2. 5、 GATA— 4、 MLP、 MNF、 S p— 1など） などが挙げられる。
上記細胞、 低酸素条件下、 伸展刺激、 本発明のタンパク質量の測定または本発 明のタンパク質遺伝子発現量の測定、 試験化合物などは、 上記 （2) に記載に同 様のものを用いる。
例えば、 上記 （X) または （χ' ) の場合における本発明のタンパク質遺伝子の 発現量を、 上記 （ix) または （ix') の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましく は 30%以上、 より好ましくは約 50%以上促進する試験化合物を、 本発明の夕 ンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができ る。 上記 （X) または （χ') の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量 を、 上記 （ix) または （ix') の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 3 0%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害する試験化合物を、 本発明のタンパ ク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 (6) 本発明のタンパク質が制御する遺伝子の発現を指標とする、 本発明のタン パク質の遺伝子の発現を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスク リーニング方法
スクリ一ニングの具体例としては、
(xi) a) 本発明のタンパク質および b) 本発明のタンパク質と相互作用するタン パク質を接触させた場合と （xii) a) 試験化合物、 b) 本発明のタンパク質およ び c) 本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質を接触させた場合との、
「本発明のタンパク質」 と 「本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質」 と の結合活性の比較を行う。 「本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質」 は、 新規でも公知でもよい。
上記本発明のタンパク質と相互作用をするタンパク質としては、 上記 （5) に 記載したものと同様のものが用いられる。
該結合活性は、 公知の方法、 例えば、 酵母または哺乳動物ツーハイブリッド法、 SPA法、 EL I S A法などに従い測定する。
該酵母または哺乳動物ツーハイプリッド法を用いる場合の具体例としては、 ( i') a) 本発明のタンパク質と GAL 4遺伝子の DNA結合ドメインとの融合 タンパク質を発現するプラスミド、 b) 本発明のタンパク質と相互作用するタン パク質と V P 16遺伝子の転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現するプ ラスミド、 および c) GAL 4遺伝子のプロモーターにレポーター遺伝子 （例、 ルシフェラーゼなど） を結合したプラスミドを導入した細胞を培養した場合と、 (χϋ') 試験化合物の存在下、 上記 （χί') の細胞を培養した場合との比較を行 う方法が挙げられる。
上記方法においては、 例えば （xi') と （xii') の場合における、 レポ一夕一 遺伝子の発現量を測定して、 比較する。 ここで用いる細胞はいずれの細胞でもよ く、 スクリーニングに適した培地で培養すればよい。
該 SPA法および該 EL I S A法で使用される本発明のタンパク質は、 例えば、 〔|251〕 、 〔|311〕 、 〔 〕 、 C14C) などの放射性同位元素で標識化されていても よく、 また、 GSTとの融合タンパク質であってもよい。
例えば、 上記スクリーニング法において、 上記 （xii) または （xii') の場合 における本発明のタンパク質の活性を、 上記 （xi) または （χΓ) の場合に比べ て、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50 %以上促進す る試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として 選択することができる。 上記 （xii) または （xii') の場合における本発明の夕 ンパク質の活性を、 上記 （xi) または （xi') の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害する試験化合物を本発 明の夕ンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができ る。
本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 Α) の活性を阻害する化 合物またはその塩、 本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 Α) 遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 および本発明のタンパク質 （好まし くは本発明のタンパク質 Α) の発現を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の タンパク質の遺伝子の発現促進が認められる心不全急性期および心不全末期 （心 不全非代償期） に投与することにより心機能回復効果が期待できる。
本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 Β) の活性を促進または 阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパ ク質 Β) 遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、 および本発明 のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 Β) の発現を促進または阻害する 化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質遺伝子の発現増強が認められる心不 全慢性期 （心不全代償期） に投与することにより過剰な代償機序を抑制し、 心筋 細胞を保護することによる心保護効果 （hear t pro t ec t i ve e f f ec t ) が期待でき る。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分べプチドまたはその塩、 本発明の夕ンパク質もしくは部分べプチドをコ一ド するポリペプチド、 本発明の抗体、 または本発明で用いられるタンパク質もしく は部分ペプチドを産生する能力を有する細胞などを含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 生体由来非ペプチド性化合物 （例、 糖質、 脂質など） 、 合成化合物、 微生物培養 物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ば れた化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 優れた心機能促進活性および心筋細胞機能活性化作用
(細胞保護作用など） などを有し、 例えば心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不 全、 狭心症などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 それ自体または適当な医薬として、 安全に投与すること ができる。 上記投与に用いられる医薬は、 上記化合物またはその塩と薬理学的に 許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであり、 経口または非経 口投与に適する医薬組成物として提供される。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いら れる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが用い られる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (po lyoxye thyl ene (50mo l) adduc t of hydrogenated cas tor o i l ) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油など が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併 用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸 投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合する ことによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記化合物が含有されていることが好まし い。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。
本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩の投与量は、 その作 用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば、 心不全 治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩 （好まし くは本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩） を経口投与す る場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物 またはその塩を約 0.1〜： I 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好 ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物ま たはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 心不全治療の目的で、 本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩 (好ましくは本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩） を注 射剤の形で通常成人 （体重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合 物またはその塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 体重 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。 〔2〕 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検波中の 本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用 することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(ii) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。 上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノ クローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗 体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b') 2、 F a b'、 あるい は F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィム ノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔i25i〕 、 (I3i n 、 〔 〕 、 〔i4c〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ）3—ガラクトシダ一ゼ、 /3—グ ルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素 酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォ レツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ル ミノ一ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さ らに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系を用いること もできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。 サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検波中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の夕ンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し ( B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレング リコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体と して固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体 として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検波中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築 すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同 書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays))、 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することに よって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 心疾患
(例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） などの疾病である、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質 の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用 することができる。
〔3〕 遺伝子診断薬
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク 質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは mRNAの異常 （遺伝子異 常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突 然変異あるレ ^は発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多な どの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや PC R— SS CP法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー 'ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ュ一エスエー （Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ,+第 86卷， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノ一ザンハイブリダイゼ一シヨンにより発現過多が検出された場合や PCR— SSCP法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例えば、 心疾 患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） などの疾病である可能性が高 いと診断することができる。
〔4〕 アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができる本 発明のアンチセンスポリヌクレオチド （好ましくは本発明のタンパク質 Aをコー ドするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド） は低毒性であ り、 生体内における本発明のタンパク質または本発明の D N Aの機能'活性 （例、 心機能抑制活性、 心筋細胞機能不活性化作用など） を調節 （阻害） することがで きるので、 例えば、 心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） など の予防 ·治療剤として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
例えば、 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、 該アンチセンスポリ ヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入 した後、 常套手段に従って、 ヒトまたはその他の温血動物 （例えば、 マウス、 ラ ット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパン ジーなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチセ ンスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの 生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲル力テーテ ルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 心不全の治療の目的で本発明のアンチセン スポリヌクレオチドを経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g ) におい ては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . l〜 1 0 0 m g投与 する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。
本発明は、 さらに
①本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA、
②前記二重鎖 R N Aを含有してなる医薬、
③本発明のタンパク質をコ一ドする R N Aの一部を含有するリボザィム、 ④前記リポザィムを含有してなる医薬を提供する。
これらの二重鎖 R N A、 リボザィムなどは、 上記アンチセンスポリヌクレオチ ドと同様に、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) の発現を抑制することが でき、 生体内における本発明のペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の活性や機能 （例、 心機能低下促進活性など） を調節 （阻害） すること ができるので、 例えば、 心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medic ine, 7巻， 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明のペプチドをコードする R N Aの一部に公知のリポ ザィムを連結することによって製造することができる。 本発明のペプチドをコー ドする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R NAまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
〔5〕 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質 （好ましくは本発明のタンパク質 A) の活性を中和する作 用を有する本発明の抗体は、 例えば心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭 心症など） などの予防'治療剤として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾病の予防'治療剤は低毒性であり、 そのまま液 剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたはその他の温血動物 (例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的または非経口的に投与すること ができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異 なるが、 例えば、 成人の心不全の治療。予防のために使用する場合には、 本発明 の抗体を 1回量として、 通常 0.01〜2 OmgZk g体重程度、 好ましくは 0. 1〜： 1 OmgZk g体重程度、 さらに好ましくは 0.：！〜 5mgZkg体重程度 を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与する のが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投 与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよ い。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは陚形剤とを含むものである。 このような組成物 は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散 剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などが あげられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 陚形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシ ゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 このような注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁 または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレ ングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソル ベー卜 80、 HCO— 50 (,polyoxyethylene(50mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合 することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 O m g , その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記抗体が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔6〕 本発明のタンパク質または D NAを含有する医薬
本発明のタンパク質または本発明のタンパク質をコードする D N A (以下、 本 発明の D N Aと略記する場合がある） は、 心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不 全、 狭心症など） などの予防 ·治療剤などの医薬としても有用である。 さらに、 本発明のタンパク質は、 本発明の抗体を産生するためのワクチン等として用いら れる。
本発明の夕ンパク質を上記医薬として使用する場合は、 常套手段に従って製剤 化することができる。 本発明の D N Aを上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ ―、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクターに 挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 その ままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲル力 テ一テルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 本発明のタンパク質または本発明の D N Aは、 必要に応じて糖衣を施 した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸 濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質 または本発明の DNAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 ベ ヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求 される単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするもので ある。
本発明のタンパク質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに より差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 心不全患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0 〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 心不全患者 （体重 6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. 1〜20 mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 心不全患者 （6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 心不全患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔7〕 本発明の DN Aを有する動物の作出
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DN A (以下、 本発明の 外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと 略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 (2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の動物，
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物 （以下、 本発明の DNA導入動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DNAを導入することによって作出することがで きる。 また、 該 DNA導入方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを導入し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合 させることにより本発明の DN A導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57B LZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6C 3 F,系統， BDF,系統， B 6D2F,系統， BALB/c系統， I CR系統など） またはラット （例えば、 W i s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に導入させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを導入させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモー夕一の下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A導入哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス
(例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー 夕一、 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラ ット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレア チンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン s_トランスフェラ ーゼ、 血小板由来成長因子) 3、 ケラチン K l， Κ 1 0および Κ 14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ) 3 Iサブュニッ ト、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム 利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 二 ユーロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ —ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニ ン、 ドーパミン/ —水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ポリぺプ チド鎖延長因子 l a (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミ オシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミ オダロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バ ソプレシンなどのプロモー夕一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現する ことが可能なサイトメガロウィルスプロモー夕一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 (EF— 1 α) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ ]3ァクチンプロモー夕 一などが好適である。
上記べクタ一は、 DNA導入哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Αの転写を終結する配列 （一般にターミネ夕一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネ夕一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 '上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3，下流 に連結することも目的により可能である。 正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DN Aを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により 変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は DNA導入動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA導入後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DNAを保持 することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A導入後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D N Aが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A導入動物を用いて、 本発明 の夕ンパク質の機能亢進症や、 本発明の夕ンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを導入させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A導入後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A導入動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DNA高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来性異常 DNAを導入させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質またはその機能不 活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の DNA導入動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
(0 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の DNA導入動物の組織中の DNAもしくは RNAを直接分析する、 または DN Aにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、 本発明 のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性につ いての解析、
(iii) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の DNA導入動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA導入動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DNA導入細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
具体例としては、 本発明の DNA導入動物に試験化合物を投与し、 該動物の心 機能、 心電図、 心重量などを測定する。 心重量は心肥大のパラメ一夕一である。 具体的には体重当たりの心臓重量、 体重当たりの左心室重量、 右心室重量当たり の左心室重量を算出することによって心臓構造を調べることができる。 心肥大が 生じると上記パラメ一夕一は増加するため、 この増加を抑制することを指標とし て試験化合物を評価することができる。 本発明の DNA導入動物に試験化合物を 投与した後、 心筋梗塞形成手術を行い、 該動物の心機能、 心電図、 心重量などを 測定する。 また心筋梗塞手術を行った後、 梗塞層を抨量することによって試験化 合物の梗塞進展抑制活性を調べることができる。 試験化合物の投与は、 梗塞形成 手術後であってもよい。 また該動物と例えば SHRラットなど遺伝的高血圧モデ ルラッ卜と交配させ、 新しい心不全モデルを作成することができる。 このように して作成した心不全モデルに化合物を投与し、 該動物の心機能、 心電図、 心重量、 梗塞進展抑制活性などを調べる。
〔8〕 ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである上記 （4) 記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記 （6) 記載の非ヒト哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （6) 記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである上記 （8) 記載の非ヒト哺乳動物、 および (10) 上記 （7) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害 （好ましくは阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 あるいは該 DN Aがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (3—ガラクトシダーゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代 表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 (例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について 本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブ リダィゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクタ一上の DNA配列とター ゲッティングベクター作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配 列をプライマーとした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知な E V an sと Kau f m aの方法に準じて新しく榭立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されてい るが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に 遺伝的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6 マウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAZ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BL/6と DBA/2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDF 1マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であ るという利点に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて 得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ6マウスと バッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代えることが 可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクロ一ニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜10000
U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気また は 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 t:で培養するなどの方法で培 養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZED T A溶液 （通常 0.001〜0.5%トリ プシン/ 0.1〜5mM EDTA、 好ましくは約 0.1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単 細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 こ のような継代は、 通常 1〜3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態 的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H.
Kaufman, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 1 54頁、 1 98 1年； G. R.
Martin プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン ス ·ュ一エスェ一 （Pro atl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； 1\ C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ'ェンブリオロジ一 ·ァ ンド 'ェクスペリメンタル 'モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビ トロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の DNAが不活性化された DNA配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の DN Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DN Aを ノックアウトさせることができる。
本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または夕一 ゲッティングベクター上の DN A配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列とをプライマ一とした PCR法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の DNAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の DN A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の DN A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の DNA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の DN A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明の夕ンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D NA溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
〔8 a〕 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など があげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であ つてもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） などに対して 予防 ·治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA発現 不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 該動物の心機能、 心電図、 心重量な どを測定する。 心重量は心肥大のパラメ一夕一である。 具体的には体重当たりの 心臓重量、 体重当たりの左心室重量、 右心室重量当たりの左心室重量を算出する ことによって心臓構造を調べることができる。 心肥大が生じると上記パラメ一夕 一は増加するため、 この増加を抑制することを指標として試験化合物を評価する ことができる。 本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物に試験化合物を投与した 後、 心筋梗塞形成手術を行い、 該動物の心機能、 心電図、 心重量などを測定する。 また心筋梗塞手術を行った後、 梗塞層を秤量することによって試験化合物の梗塞 進展抑制活性を調べることができる。 試験化合物の投与は、 梗塞形成手術後であ つてもよい。 また該動物と例えば SHRラットなど遺伝的高血圧モデルラットと 交配させ、 新しい心不全モデルを作成することができる。 このようにして作成し た心不全モデルに化合物を投与し、 該動物の心機能、 心電図、 心重量、 梗塞進展 抑制活性などを調べる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は非ヒト哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） の心不全患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜10 0mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 6 0 kgとして） の心不全患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01 〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1 〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 〔8 b〕 本発明の DN Aに対するプロモー夕一の活性を促進または阻害する化合 物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリ一ニング方法において、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポ一ター遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコ一ドする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 3 —ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （ 1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明の夕 ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに )3 _ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4一クロ口—3—インドリル—) 3 —ガラクトビラノシド （X— g a l) のような /3_ガラクトシダ一ゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 37で付近 で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TAZ P B S 溶液で洗浄することによって、 0—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
また、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはその 塩は、 本発明のタンパク質の発現を阻害し、 該タンパク質の機能を阻害すること ができるので、 例えば心疾患 （例、 心筋症、 心筋梗塞、 心不全、 狭心症など） な どの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は非ヒト哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） の心不全患者 においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜 100mg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する 場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の 形で通常成人 （体重 60 kgとして） の心不全患者に投与する場合、 一日につき 該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. ：!〜 20mg、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） の心不全患者において は、 一日につき該化合物を約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常 成人 （体重 6 O kgとして） の心不全患者に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子導入動物） を作成すれば、 特 異的にそのポリぺプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能と なる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これ が発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での 産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系とし て使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分 野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
Le u
I 1 e S e r セリン
Th r スレオニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプ卜ファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミド基
T o s P-トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1 ベンジル
C 12— B z 1 2, 6—ジクロロべンジル Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C 1 -z ： 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z ： 2 _ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c ： t一ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエニル
T r t ： 卜リチル
Bum ： t—ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3， 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2, 3 _ベンゾ卜リアジン
HONB 1—ヒドロキシ— 5—ノルポルネンー 2， 3—ジカルポ キシイミド
DCC N, N'—ジシクロへキシルカルポジイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ラット 187— 2 Aタンパク質をコードする cDN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 2〕
ヒト 187— 2遺伝子のプロモーター配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 1で用いられたプライマー 97の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いられたプライマ一 98の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1で用いられたプライマー 99の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕 実施例 1で用いられたプライマ一 100の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられたプライマー 101の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1で用いられたプライマ一 102の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 1で用いられたプライマー 103の塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
実施例 1で用いられたプライマー 104の塩基配列を示す。
〔配列番号： 11〕
実施例 1で用いられたプライマー 105の塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
実施例 1で用いられたプライマー 106の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 1で用いられたプライマー 107の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 1で用いられたプライマー 108の塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
実施例 1で用いられたプライマー 109の塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
実施例 1で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
ヒト 187— 2 Aタンパク質をコ一ドする c DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 18〕
ヒト 187— 2 Bタンパク質をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 19〕
ヒト 187 _ 2 Aのィントロンの塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕 · ヒト 1 87— 2 Bのイントロンの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
マウス 187 _ 2 B 5'領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 2で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 2で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 2で得られたラット 187— 2 Bの 5 '領域の塩基配列を示す。 〔配列番号： 25〕
実施例 2で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
実施例 2で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
実施例 2で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 1〕
実施例 2および実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
ラット 187— 2 Bタンパク質をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 33〕
ヒト 1 87— 2 Aタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 34〕 ヒト 187— 2 Bタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 35〕
ラット 187— 2 Aタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 36〕
ラット 187 _ 2 Bタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 37〕
ラット 187— 2 Aタンパク質の N末端領域の部分ペプチドのアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 38〕
ラット 187— 2 Aタンパク質の中央領域の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 39〕
ラット 187— 2 Aタンパク質の C末端領域の部分ペプチドのアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 40〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 41〕
実施例 7で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 42〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 43〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 44〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 45〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 後述の実施例 6で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) DH5a/pR187Bは、 2002年 8月 30日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央 第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンターに受託番号 FERM BP-8172として寄託されている。
後述の実施例 6で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escher ich i a col i) DH5 a/pH187Bは、 2002年 8月 30日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央 第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンターに受託番号 FERM BP-8173として寄託されている。 以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれに 限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキユラ 一 ·クローニング （Mol ecul ar c loning) に記載されている方法に従った。
実施例 1
ヒト 187- 2遺伝子のクロ一ニング
ヒト 187-2遺伝子のクロ一ニングを以下のようにして行った。 フォーワードプ ライマー 〔 （プライマ一 9 7〜： L 0 9 (配列番号： 3〜： 1 5 ) ) およびリバース プライマー （配列番号： 1 6 ) (ヒト 187-2想定 0RFの 3'UTRに位置する配列） を 用いて、 マラソンレディヒト心臓 cDNAライブラリ一 （クロンテック社製） を铸型 として PCRを行った。 反応は TaKaRa La Taq wi th GC buf fer (宝酒造社製） を用 いてサ一マルサイクラ一 gene a即 PCR sys tem 9700 (パーキンエルマ一社製） に て行い、 95 :で 30秒、 62 :で 30秒、 72 で 3分を 1サイクルとして 33サイクルを繰 り返した。 その結果、 プライマー 100、 プライマー 101、 プライマー 102およびプ ラィマー 109に想定される位置にバンドを認めた。 そこでプライマ一 100およびプ ライマー 102とリバースプライマー （配列番号： 1 6 ) とで PCRされた遺伝子断片 を pT7- Tベクター （宝酒造社製） にクローニングした後、 さらに公知の合成ブラ イマ一 0 プライマーと U-19プライマー） （宝酒造社製） を用い、 ΡΕアプライ ドバイオシステムズ社のサイクルシーケンスキットによって反応を行い、 蛍光 DNAシーケンサ一 （ABI PRISM 377, パーキンエルマ一社製） で分析し塩基配列を 解読した。
その結果、 ヒト 187-2には 2種のスプライシングバリアントが存在し、 ラット 187-2 (以下、 ラット 187- 2Aと称することもある） （W0 02/36763の配列番号： 1 3および配列番号： 2 5 ) のォーソログであるヒト 187-2A (配列番号： 1 7 ) と、 これより 5'上流に大きい （タンパク質としては N末端領域が大きい） ヒト 187-2B 遺伝子がクローニングできた （配列番号： 1 8 ) 。 従ってヒト 187-2Bの cDNAは、 ヒト 187- 2Aの cDNAを完全に含んでいる。 このように 2種の mRNAが出来る原因は、 ヒト 187-2Aでは、 配列番号： 1 9で表される塩基配列がイントロンとして、 ヒト 187- 2Bでは配列番号： 2 0で表される塩基配列がイントロンとしてスプライシン グアウトされるためである。
配列番号： 1 7で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 3 3 ) を有するタンパク質をヒト 187-2Aタンパク質と、 配列番号： 1 8で表される 塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 3 4 ) を有するタンパク質をヒ ト 187- 2Bタンパク質とそれぞれ命名する。 また、 ラッ卜 187- 2Aタンパク質をコー ドする塩基配列を配列番号： 1に、 アミノ酸配列を配列番号： 3 5に示す。 ヒト 187- 2Aおよびヒト 187-2Bをクエリーとして公共のデ一夕ベースである NCBIを用い てブラスト検索した結果、 相同性を有する ESTとして Genbank Access ion No.
AW755252がヒッ卜した。
ヒト 187-2Aタンパク質とヒト 187- 2Bタンパク質とは、 アミノ酸レベルで 53%の 相同性を有していた。
ヒト 187-2Aタンパク質と AW755252とは、 核酸レベルで 36%の相同性を有してい た。
ヒト 187-2Bタンパク質と AW755252とは、 核酸レベルで 66%の相同性を有してい た。
さらに、 ヒト 187- 2遺伝子のプロモーター配列 （コアプロモーター配列） を、 配列番号： 2に示す。 実施例 2
ラット 187-2Bのクローニング
ヒト 187- 2Bの遺伝子配列 （配列番号： 1 8 ) を基にセレラデー夕ベースを用い てマウス ESTを検索し、 得られた ESTをアセンブルし、 マウス 187-2Bの 5'領域の部 分配列を得た （配列番号： 2 1) 。 配列番号： 2 1で表される配列を基に作製し たフォワードプライマー （配列番号： 2 2) およびリバースプライマー （配列番 号： 2 3) を用いて、 マラソンレディラット心臓 cDNAライブラリー （クロンテツ ク社製） およびマラソンレディラット筋肉 cDNAライブラリ一 （クロンテック社 製） を铸型として PCRを行った。 反応は铸型 DNA l に QuantiTect SYBR Green PCR kit (QIAGEN社）の 2X SYBER Green Master Mix 10// 1、 各プライマ一をそ れぞれ 0.4 ίΜ、 滅菌蒸留水 7 1を加え、 の液量とし、 サーマルサイクラ一 gene amp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製） にて 95t · 15分の後、 95 · 20秒、 55 · 20秒、 72 · 1分のサイクルを 50回繰り返し、 最後に 72 · 4 分の伸長反応を行った。 その結果得られた DNA断片を直接シークェンスすること によりラット 187-2Bの 5'領域の配列を得た （配列番号： 24) 。
ここで配列番号： 24とラット187-2八 （配列番号： 1) とが一つの遺伝子であ ることを確認する目的で、 配列番号： 24よりフォワードプライマー （配列番 号： 2 5) を、 配列番号： 1よりリバースプライマ一 （配列番号： 26) を合成 し、 PFUポリメラーゼによって PCRを行い、 得られたフラグメントの配列を確認し た。 その結果、 両配列は一つの遺伝子由来であることが判明した。 次に配列番 号： 1および配列番号： 24を基に作成した、 ラット 187-2Bの 0RFを一部含む遺 伝子のクローニング用プライマー （配列番号： 2 7および配列番号： 2 8) を用 い PCRにてクロ一ニングを行った。 反応はマラソンレディラット心臓 cDNAライブ ラリー （クロンテック社製） を铸型として、 铸型 DNA1 /1に QuantiTect SYBR Green PCR kit (QIAGEN社）の 2X SYBER Green Master Mix 10 1、 各プライマ 一をそれぞれ 0.4 M、 滅菌蒸留水を加え、 20^1の液量とし、 サ一マルサイクラ 一 gene amp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製） にて 95 · 15分の後、 95t · 20秒、 5(TC · 20秒、 ΊΤΟ · 1分のサイクルを 50回繰り返し、 最後に 72 · 4 分の伸長反応を行った。 その結果、 想定される位置にバンドを認めたため、 その 遺伝子断片を pCRII T0P0ベクター （invitrogen社製） にクローニングした後、 塩 基配列を決定した （配列番号： 2 9) 。 配列番号： 2 9の塩基配列には、 配列番 号： 1および配列番号： 2 4の配列がともに含まれていたので、 そのプラスミド を铸型に TaKaRa Premi x Taq (Ex Taq vers i on) (宝酒造社製） で、 配列番号： 2 5および配列番号： 2 8のプライマ一を用いて遺伝子断片を増幅させ、 ラット 187- 2Bの前半部の塩基配列を含む断片を得た。
また配列番号： 1で示される塩基配列を含むプラスミド PTB2167 (W0 02/36763 の実施例 4記載） から配列番号： 3 0および配列番号： 3 1で示される各プライ マ一を用いて、 ラット 187-2Bの後半部の塩基配列を含む断片を得た。 これら 2つ の断片を回収後、 铸型に用いて、 配列番号： 2 5および配列番号： 3 1で示され る各プライマ一を用いて、 PCRを行い、 約 1. 6kbの断片を得た。 その遺伝子断片を pCRI I T0P0ベクター （invi t rogen社製） にクローニングした後、 PEアプライドバ ィォシステムズ社のサイクルシーケンスキッ卜によって反応を行い、 蛍光 DNAシ 一ケンサ一 （ABI PRI SM 377, パーキンエルマ一社製) で分析し塩基配列を解読 した。
その結果、 ヒト 187-2Bに相同するラット 187- 2Bがクローニングできた （配列番 号： 3 2 ) 。 配列番号： 3 2で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配 列番号： 3 6 ) を有するタンパク質をラット 187-2Bタンパク質と命名する。
ラット 187-2Bタンパク質と、 ラット 187- 2Aタンパク質とは、 アミノ酸レベルで 54%の相同性を有していた。
ヒト 187-2Bおよびラット 187-2Bタンパク質の N末端領域 （1番- 70番） には、 LIMと呼ばれるタンパク質—タンパク質相互作用に関与するモチーフ （Mech. Dev. 第 91巻、 5〜17頁、 2000年） が存在した。 実施例 3
ラット 187- 2Aセンスおよびアンチセンス発現アデノウイルスの作製
ラット 187- 2Aの cDNA (配列番号： 1 ) のウィルスベクタ一へのクローニングは、 宝酒造株式会社のアデノカスタムサービスにて作製した。 宝酒造社製 adenov i rus express i on vec tor ki t (6150) を用い、 その添付されている方法に従ってクロ 一二ングを行い、 ラット 187-2Aセンス鎖およびアンチセンス鎖発現アデノウィル スを作製した。 高純度精製ウィルスの調製および力価の測定は、 公知の方法 （実 験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック、 238〜244頁） を用いて行い、 未精製ゥ ィルスはセンス 2.2xl09pfu/n 濃度、 アンチセンス 0.8xl09pfu/nd濃度であった。 最終的にセンス UxlOHpfu/mけ農度、 およびアンチセンス l.OxlO^pfu/ml濃度の 精製ウィルス原液を調製した。 ヌルウィルス （インサートを含まないウィルス） の調製も上記に従い作製し、 最終的に 1.3xl09pfu/nU濃度の精製ウィルス原液を 調製した。 実施例 4
(I) 正常ラットの心臓へのラット 187-2Aセンスおよびアンチセンス発現アデノ ウィルス投与
(1) 手術の準備
渡邊らの報告 （サーキュレーションリサーチ、 第 69巻、 370-377頁、 1991年） に従い雄性ウィスターラット （Jclウィスターラット雄 11週齢：体重 300g-400g) をベントバルビタ一ルナトリウム （50mg/kg, i.p.) で麻酔した。 バリカンにて胸 部および頸部の腹側被毛を削毛し、 仰臥位に手術台に寝かせた。 四肢および上顎 切歯にたこ糸をかけ手術台に固定し、 80%エタノール溶液にて術部を消毒した。 頸部皮膚およびその直下の筋肉を切開し、 気管を露出させた。 肉眼で確認しなが ら 14Gの留置針外筒 （テルモ社） を口腔より気管内に導管し、 人工呼吸器に接続 した。 人工呼吸器がはずれないように手術用絹糸 （夏目、 ブレード絹製縫合糸 3- 0) を用いて口唇と留置針外筒を結びつけた。
(2) 胸腔の切開と心臓の露出
ラット胸骨より約 5ミリメートル左側付近の皮膚および体幹皮筋を正中方向に 約 4センチメートル切開した。 次に切開部直下にある第 2から第 5肋軟骨の胸骨付 近を切開した。 外科バサミにて肋間筋を剥離し、 止血後、 開胸器により胸腔を約 3センチメート開口した。 さらに、 心嚢膜を綿棒にて鈍性剥離、 開口し、 心臓を 露出させた。
(3) 胸部大動脈狭窄用絹糸の設置 胸腺を持ち上げ、 心臓より出ている胸部大動脈の心臓付近の結合組織を綿棒に て剥離した。 手術用絹糸 （夏目、 ブレード絹製縫合糸 5-0) を先曲がり虹彩無鈎 ピンセットにてつまみ、 胸部大動脈左側から右側にかけて背部を回して通し、 ル 一プ上にして胸部大動脈に狭窄用の絹糸を設置した。 設置した絹糸を内径約 1ミ リメ一トルの狭窄用のテフロン製チューブに通し、 この絹糸をテフロンチューブ にて引き締めるようにしてはさみ、 胸部大動脈が狭窄出来るようにした。
( 4 ) 左心室へのウィルス溶液の投与
綿棒を用いて心耳を軸に心尖側より心臓を反転させ、 左心室を腹側へ移動させ た。 実施例 3で調製した高純度ラット 187- 2Aセンスおよびアンチセンス発現ウイ ルスベクター水溶液を生理食塩水にて希釈し、 2xl08pfu/ml濃度の溶液を調製し、 それを 27G注射針をつけた lmlシリンジ （テルモ） に計り取った。 体重 1キロダラ ムあたり 2xl0 fuのウィルスを投与した。 コントロールとしてィンサートを持た ないヌルウィルスを同量投与した。 その方法は、 冠動 ·静脈を避けて左心室へ注 射針をつきさし、 その後テフロンチューブを引き締めることによって胸部大動脈 を狭窄した。 狭窄確認後、 ウィルス溶液を左心室内へゆっくりと投与し、 左心室 内に還流させた。 投与に伴って左心室が拡張するため、 約 10秒間に一度、 テフ口 ンチューブの引き締めをゆるめ、 ウィルス溶液を全身に還流させ、 左心室の拡張 による 2次的な影響を防いだ。 この投与とテフロンチューブの引き締めをゆるめ る操作を合計 3回繰り返して、 ウィルス溶液を左心室内へ全量還流させた。
( 5 ) 胸部大動脈狭窄用絹糸の撤去と閉胸
胸部大動脈狭窄用絹糸のループの一方を切除し、 もう一方を引き抜くことで絹 糸を撤去した。 胸腔内の血液を綿棒にて吸収排除後、 縫合用絹糸にて胸壁および 皮膚を約 5ミリメ一トルの間隔で縫合した。 頸部の導管時に切開した皮膚および その直下の筋肉も同様の方法にて縫合した。 手術直後から 1時間以上、 人工呼吸 器にて強制呼吸をさせた後、 動物が麻酔より覚めた状態で動物の自発呼吸を確認 した後、 導管を撤去した。 手術後の動物は飼育用ケージに収容した。
( 6 ) 心機能の測定
渡邊らの報告 （サーキュレーションリサーチ、 第 69巻、 370-377頁、 1991年） に従い次のようにして心機能を測定した。 術後 1週間経過した雄性ウィスターラ ット （Jclウィスターラット雄 12週齢：体重 350g- 450g) を秤量した後、 ペントバ ルビタールナトリウム （25mg/kg， i.p.) で麻酔した。 バリカンにて胸部および頸 部の腹側被毛を削毛し、 仰臥位に手術台に寝かせた。 腹側頸部を外科用ハサミで 切開し、 直下の筋肉をピンセットで切開し、 気管直横の頸部大動脈を結合組織か ら剥離した後、 その血管に縫合用絹糸 （夏目、 ブレード絹製縫合糸 3-0) をかけ、 頭部側を結び、 腹部側を動脈クレンメで止血した。 その後、 外科用ハサミで血管 を切開し、 血管内にミラーカテーテル （ミラ一社製、 2F， 140cm,カタログナンパ 一 800-0509) を挿入し、 左心室にその先端を装着した。 ミラーカテーテルは NEC 社製ポリグラフに接続し、 ホロスコープにて圧変動をモニタ一することによって、 ミラ一カテーテルの左心室への装着を確認し、 左心室内圧を測定した。 平均血圧
(MBP:mean blood presure)は血管に挿入した時点で測定した。 左心室内圧
(LVSP: lef t ventricular sistronic presure) , (HR: heart rate) , 左室内圧 変化率 (LV+dp/dtおよび LV-dp/dt)の測定値はマックラボ （NEC社製、 波形解析ソ フト） で計算し、 算出した。 なお、 ミラーカテーテルの較正は、 キヤリバ一を用 いて実験開始直前に OmmHg、 lOOmmHgの 2点で行った。
その結果、 ラット 187- 2Aセンス発現ウィルスを導入した群ではヌルウィルスお よびアンチセンス発現アデノウイルス投与群と比較して、 有意に心拍数と左室内 圧変化率 （LV+dp/dt) が減少した。 その他のパラメ一夕一には有意な変化は認め られなかった。 （表 1)
(7) 左心室重量の測定
心機能の測定を終了した後、 開胸し、 心臓をピンセットでつまみ血管、 結合組 織を取り除き、 心臓を摘出した。 心臓は生理食塩水中で洗浄した。 更に摘出した 心臓に付着している大動脈にシリンジを挿入し、 生理食塩水を心臓全体に灌流さ せて血液を除去した。 その後、 心房を取り除き、 心室組織のみを秤量し、 体重で 補正することによって心臓重量を測定した。
その結果、 ラット 187-2Aセンス発現ウィルス投与群とヌルウィルスおよびアン チセンス投与群間で有意な差は認められなかった。 （表 1) 表 1 左室内圧変化率
動物 導入ウィルス 平均血圧 心拍数 左室内圧 （mmHg sec^lO3) 心贜重量ノ体重
(mg/g)
(mmHg) (bpm) (mmHg) Max LVdp/dt Min LVdp/dt ヌル （η=9) 103 ± 6 372 ±10 124 ±5 7.2 ±0.6 -5.9 ±0.5 2.69 ±0.08 心不全ラット «
アンチセンス (η=9) 108±6 416±9 130±4 9.7±0.8 -7.2 ±0.6 2.70 ±0.11 ヌル （n=S) 112±8 442±8 138±9 12.3±1.0 -10.6±0.7 2.67 ±0.06 正常ラッ卜 #
センス (n=5) 95士 7 402 ±14 126 ±8 8.8 ±0.8 -9.1 ±1.0 2.67 ±0.06 アンチセンス (n=4) 116±6 447±9 146±8 12.7±0.9 -12.2±0.7 2.64±0.13
**: p<0.001 versus null， *: p<0.05 versus null
# ： p<0.05 versus null and antisense
( I I) 心筋梗塞後心不全モデルラットにおけるラット 1 8 7— 2 Aアンチセンス 発現アデノウイルス投与による病態改善効果
( 1 ) 心筋梗塞モデルラッ卜の作製
渡邊らの報告 （サーキュレーションリサーチ、 第 69巻、 370- 377頁、 1991年） に従い雄性ウイス夕一ラット （11週齢：体重 300-400 g ) をベントバルピタール (50mg/kg, i . p. ) で麻酔し、 人工呼吸下で正中にて開胸した。 心嚢膜を切開後、 心臓を露出させた。 冠動脈の左前下行枝起始部で、 糸付き縫合針 （エルプ社、 5- 0シルク） にて心筋ごと冠動脈を絹糸で縛った後閉胸した。 麻酔から回復後、 通 常飼育した。
( 2 ) アンチセンス発現アデノウイルスの投与
上記 （I) に記載の方法に準じて、 心不全ラッ卜の心臓へウィルスを投与し、 心機能および心重量を測定した。 心筋梗塞形成術後 23週経過したラッ卜にアンチ センスウィルスおよびヌルウィルスを pfu/kgで投与した。 1週間後の心機能を 測定した結果、 アンチセンス投与群は、 ヌル投与群と比較して、 有意な心拍数お よび収縮力（LV+dp/d t)の改善が認められた。 （表 1 )
表 1の結果より、 ラット 187- 2Aセンス鎖導入によって心機能が低下し、 ラット 187-2Aァンチセンス鎖導入によつて心機能が改善したことがわかる。 実施例 5
心臓組織におけるラット 187- 2の発現 （免疫染色）
( 1 ) 抗体の作製
ラット 187-2Aのアミノ酸配列から 3種のペプチド配列を抽出し、 クラボウ社の カスタムペプチド抗体作製サービスにてペプチド認識抗体を作製した。 抗原とし て用いたペプチドは、 N末端領域の配列番号： 3 7、 中央領域の配列番号： 3 8 および C末端領域の配列番号： 3 9で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで ある。 次に、 W0 02/36763の実施例 3に記載の、 ラッ卜 187- 2センス鎖発現アデノ ウィルス感染 3日後のラット初代心筋細胞抽出液を用いて、 ウェスタンブロッテ ィングを行った。 その結果、 配列番号： 3 7および配列番号： 3 9のペプチドを認識する各抗体 が、 ラット 187- 2Aタンパク質を認識することができることが判明した。
( 2 ) 心臓組織の摘出
正常ラットおよび実施例 4で得られた心不全モデルラットをエーテル麻酔下で 開腹し、 後大静脈の切断により放血致死させ、 手早く心臓を摘出した。 大動脈か ら左心室に向かってリン酸バッファーおよび 4 %パラホルムアルデヒド溶液をそ れぞれ 20ミリリットルづっ注入し灌流固定した。 心臓を横断状にスライスし、 4でにて一晩固定した。
( 3 ) 免疫染色
固定後、 組織を水洗し、 定法に従ってパラフィン包埋ブロックを作製した （組 織学研究法、 佐野豊、 南山堂、 1985年） 。 作製されたブロックを回転式ミクロト ームにて 4 ιηの厚さに薄切した。 薄切後切片を温浴伸展させ、 スライドグラス上 にマウントし、 37 乾燥機にて十分乾燥させた。 作製された切片は脱パラフィン 後、 定法に従ってへマトキシリンェォジン染色を行い封入した （組織学研究法、 佐野豊、 南山堂、 1985年） 。 さらに作製した切片を脱パラフィン後、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を有するぺプチド認識ゥサギポリク口一ナル抗体お よび配列番号： 3 9で表されるアミノ酸配列を有するペプチド認識ゥサギポリク ローナル抗体を用いて免疫染色した。 免疫染色は間接蛍光抗体法を用いた。 免疫 染色および i n s i tu hybr i d i zat i onは、 飯島宗一ら、 病理と臨床臨時増刊号、 2000年に記載の方法に準じて行った。 2次抗体にはァレキサフルオール 488ャギ抗 ゥサギ IgG抗体を用いた。 免疫染色は胎仔心臓から調整した初代心筋細胞につい ても行った。 4ゥエル培養チェンバ一内にて培養した初代心筋細胞を、 培養終了 後 4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定後、 上記と同様の抗体を用いて免疫染 色を ίί了つ/こ。
( 4 ) 結果
正常ラットおよび心不全ラット心臓の正常部で、 ラット 187- 2Αタンパク質およ びラット 187-2Bタンパク質は心筋細胞の細胞質に発現していた。 また心不全モデ ルラッ卜の梗塞移行領域に残存する心筋細胞では、 その発現が正常部分の心筋細 胞に比較して明らかに増加していた。 従って、 梗塞移行領域ではラット 187- 2A夕 ンパク質およびラット 187- 2B夕ンパク質が多量に発現していることが想定された。 また梗塞移行領域でのラット 187-2Aタンパク質およびラット 187-2Bタンパク質の 陽性部位は、 アルファァクチニン陽性心筋細胞、 冠動脈などの血管平滑筋細胞お よび周辺の残存細胞であった。
ラット 187- 2 (Aも Bも含む） の遺伝子の病変部位での高発現は、 187- 2の遺伝子 が、 心不全発症に強く関与することを示している。
さらに初代心筋細胞を用いた染色結果から、 ラット 187- 2Aタンパク質およびラ ッ卜 187-2Bタンパク質は、 配列番号： 37で表されるアミノ酸配列を有するぺプ チド認識ゥサギポリクローナル抗体を用いて染色した時には初代心筋細胞の細胞 核に、 また配列番号： 39で表されるアミノ酸配列を有するペプチド認識ゥサギ ポリクローナル抗体を用いて染色した時には、 細胞質に局在するような像が観察 された。 従って、 ラット 187-2Aタンパク質およびラット 187- 2Bタンパク質は細胞 質のみならず、 核へ移行して機能発現していると考えられる。 実施例 6
(1) ヒト 187- 2B形質転換体の取得
実施例 1で得られた PT7-Tベクターにクローニングされたプラスミド （配列番 号： 1 8で表される塩基配列を含む） を PH187Bと命名し、 これをェシエリヒア · コリ （Escherichia coli) DH5ひに形質転換することで、 形質転換体ェシエリヒ 7 ·コリ (Escherichia coli) DH5 «/pH187Bを得た。
(2) ラット 187- 2B形質転換体の取得
実施例 2で得られた pCRII T0P0ベクタ一にクローニングされたプラスミド （配 列番号： 32で表される塩基配列を含む） を PR187Bと命名し、 これをェシエリヒ ァ 'コリ （Escherichia coli) DH5ひに形質転換することで、 形質転換体ェシェ リヒア ·コリ (Escherichia coli) DH5 a/pR187Bを得た。 実施例 7 ラット 187-2Aトランスジエニックラットおよびラット 187-2Bトランスジェニッ クラットの作製
(1) ラット 187-2Aおよびラット 187-2B cDNAへのリンカーサイ卜の導入 上記実施例 6で得られた PR187Bを铸型として、 PCRにより、 ラット 187- 2Aまた はラット 187-2Bの cDNAへ、 リンカーサイトをそれぞれ導入した。 ラット 187- 2Aは、 配列番号： 32の配列をもとに、 フォワードプライマー （配列番号： 40) およ びリバースプライマー （配列番号： 3 1) を合成した。 ラット 187- 2Bは、 配列番 号： 32をもとに、 フォワードプライマ一 （配列番号： 41) およびリバースプ ライマー （配列番号： 3 1) を合成した。 次に PFUポリメラ一ゼを用いて PCRを行 レ 得られたフラグメントを pCRII T0P0ベクター （invitrogen社製） にクロ一二 ングした後、 塩基配列を確認した。 それぞれフォワードプライマーには Hindi II 切断サイトを導入し、 リバースプライマーには Xhol切断サイトを導入した。 この ようにしてサブクロ一ニングしたラット 187-2A cDNAまたはラット 187-2B cDNAを、 Hi nd I IIおよび Xho Iで切り出し、 1 %ァガロースゲル電気泳動で目的遺伝子断片を 回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。
(2) ポリ A付加シグナル配列を含む遺伝子断片の調製
SV40ポリ A付加シグナル配列を含む pTARGEプラスミドベクター （promega) を铸 型として、 2種のプライマー （配列番号： 42および配列番号： 43) を用いて PCRを行った。 すなわち、 PFUポリメラーゼを用いて PCRを行い、 得られた約 220bp フラグメントを pCRII T0P0ベクター （invitrogen社製） にクローニングした後、 塩基配列を確認した。 フォワードプライマーには Xhol切断サイトが、 またリバ一 スプライマーには BamHI切断サイトが導入されており、 更にクローニングされた ラット 187-2遺伝子断片の 3'下流のベクター配列中にはユニークな EvoRI切断サイ 卜があるため、 プラスミドから目的とした SV40ポリ A付加シグナル配列を含む遺 伝子断片を Xholおよび EcoRIで切り出し、 2%ァガロースゲル電気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。 (3) マウス αミオシン重鎖プロモーター遺伝子断片の調製
マウス αミオシン重鎖プロモーター遺伝子は、 The Journal of Biological Chemistry, 266巻、 24613〜24620頁、 1991年に記載されている 5.4kpbを用いた。 まず、 この領域を含む BACプラスミド （#22386、 コスモバイオ） から 2種のプライ マー （配列番号： 44および配列番号： 45) を合成した。 配列番号： 45で示 されるプライマーにはクローニングサイトとして Hindlll切断サイトを付加した。 まず、 BACプラスミド （#22386、 コスモバイオ） を铸型として PFUポリメラーゼに よって PCRを行い、 得られたマウス αミオシン重鎖プロモータ一遺伝子の一部で ある約 1. lkbpフラグメントを pCRII T0P0ベクタ一 （invi trogen社製） にクロー二 ングした。 このプラスミドから、 Ndelおよび ¾indIIIを用いて本 1. lkbpフラグメ ントを切り出し、 2%ァガロースゲル電気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。 これ をフラグメント Aとする。 次に BACプラスミド （#22386、 コスモバイオ） から BamHIおよび Ndelを用いて本 1. lkbp以外のマウス αミオシン重鎖プロモーター遺 伝子領域である.4.3kbpフラグメントを切り出し、 1%ァガロースゲル電気泳動で 回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。 これをフラグメント Bとする。 最終的に
pBluescriptll SK (+) (夕カラバイオ） の BamHIおよび Hindlllクロ一ニングサイ トにフラグメント Aおよびフラグメント Bを挿入し、 pMHC8プラスミドを構築した。 このようにして調製したマウス αミオシン重鎖プロモー夕一遺伝子を含む PMHC8 プラスミドを BamHIおよび Hindlllで消化し、 得られた約 5.4kbpのマウス αミオシ ン重鎖プロモーター遺伝子断片を 1%ァガロースゲル電気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精 製した。
(4) ラット 187-2Aまたはラット 187- 2B cDNAとマウス αミオシン重鎖プロモー ター遺伝子断片の連結
pCRII T0P0ベクター (invitrogen社製) を BamHIおよび Xholで消化し、 1%ァガ ロースゲル電気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。 このベクターに、 上記 （3) で得られたマウス αミオシン重鎖プロモータ一遺伝子断片 （BamH Iおよび H i nd 111 切断サイトを有する） と、 上記 （1) で得られたラット 187- 2Aまたはラット 187- 2B cDNA遺伝子断片 （Hindlllおよび Xhol切断サイトを有する） をクローニングし た。 次にこのベクターから BamHIおよび Xholで消化し、 得られた遺伝子断片断片
(マウス αミオシン重鎖プロモーター遺伝子の下流にラット 187- 2Αまたはラット 187-2B cDNAが連結した遺伝子） を 1 %ァガロースゲル電気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc で 精製した。
(5) ラット 187-2Aおよびラット 187-2B発現プラスミドの作製
PUC118 (夕カラバイオ） を BamHIおよび EcoRIで消化し、 1%ァガロースゲル電 気泳動で回収し、 GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc) で精製した。 次に上記 （4) で調製した遺伝子断片 (BamHIおよび Xhol切断サイトを有する） と上記 （2) で調製したポリ A付加シグ ナル配列を含む遺伝子断片 （Xholおよび "EcoRI切断サイ卜を有する） を、 pUC118 の BamHIおよび EcoRIサイトにクローニングして、 ラット 187- 2A発現プラスミドぉ よびラット 187-2B発現プラスミドを作製した。
(6) ラット 187- 2Aトランスジエニックラットおよびラット 187- 2Bトランスジ エニックラッ卜の作製
上記 （5) で作製したラット 187-2A発現プラスミドおよびラット 187-2B発現プ ラスミドを用い、 公知の方法に従い、 オリエンタル酵母工業 （株） にてトランス ジエニックラットを作製した。 まず、 ラット 187-2A発現プラスミドまたはラット 187- 2B発現プラスミドから BamHI消化により、 その発現ユニットを切り出し、 こ れをラット受精卵 （Jclで購入したウィスターラットから採取） にマイクロイン ジヱクシヨンした。 次に偽妊娠ラットに受精卵を挿入することにより妊娠させ、 出産させた。 組み換え動物の選別は PCRによって行った。 まず、 ラット尾静脈よ り採血し、 これよりゲノム DNAを回収した。 続いてこの DNAを铸型として、 2種の プライマー （配列番号： 42および配列番号： 4'3) (外来性のポリ A付加シグ ナル配列を増幅することができるプライマー） で PCRを行った。 電気泳動後に約 220bpのバンドを認める個体を組み換え体として選別を行い、 ラット 187- 2Aトラ ンスジェニック個体およびラット 187- 2Bトランスジェニック個体をそれぞれ得た。 得られた個体をオリエンタル酵母工業 （株） から移管し、 以下の解析を行った。
F1ヘテロ個体の心臓左心室由来の RNAを用いて、 W0 02/36763号公報の実施例 7に 記載の方法に準じて遺伝子発現量を調べた。
その結果、 野生型ウィスターラット （GAPDHのコピー数で補正した 187- 2のコピ —数； 0. 05±0. 005, n=4) に対し、 ラット 187-2Aトランスジエニック個体は
0. 59 (n= l) ， 0. 36 (n= l) 、 ラット 187- 2Bトランスジエニック個体は 0. 60 (n = 1) , 0. 56 (n= l) と高値であった。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩 （好ましくは本発明 のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩） 、 本発明のタンパク質遺 伝子の発現を調節する化合物またはその塩 （本発明のタンパク質 Aの遺伝子の発 現を阻害する化合物またはその塩） 、 本発明の抗体、 本発明のアンチセンスポリ ヌクレオチドなどは、 例えば、 心疾患などの予防 ·治療剤として安全に使用する ことができる。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4または配列番号： 3 6で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩。
2 . 配列番号 3 3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
3 . 配列番号 3 4で表されるァミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
4. 配列番号 3 6で表されるァミノ酸配列からなる夕ンパク質またはその塩。
5 . 請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
6 . 請求項 1記載のタンパク質または請求項 5記載の部分べプチドをコードす るポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
7 . D NAである請求項 6記載のポリヌクレオチド。
8 . 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 8または配列番号： 3 2で表される塩基配 列からなるポリヌクレオチド。
9 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
1 0 . 請求項 9記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
1 1 . 請求項 1 0記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質もし くはその塩または請求項 5記載の部分べプチドもしくはその塩を生成、 蓄積せし め、 これを採取することを特徴とする請求項 1記載の夕ンパク質もしくはその塩 または請求項 5記載の部分べプチドもしくはその塩の製造方法。
1 2 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩または請求項 5記載の部分べ プチドもしくはその塩を含有してなる医薬。
1 3 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 4 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
1 5 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩または請求項 5記載の部分べ プチドもしくはその塩に対する抗体。
1 6 . 請求項 1 5記載の抗体を含有してなる医薬。
1 7 . 請求項 1 5記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 8 . 請求項 1記載のタンパク質または請求項 5記載の部分ペプチドをコード する D NAに相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有 するアンチセンスポリヌクレオチド。
1 9 . 請求項 1 8記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
2 0 . 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番号： 3 5または配列番号： 3
6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を調節する化合物ま たはその塩のスクリ一ニング方法。
2 1 . 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番号： 3 5または配列番号： 3 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とす る、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合 物またはその塩のスクリーニング用キット。
2 2 . 請求項 2 0記載のスクリーニング方法または請求項 2 1記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番 号： 3 5または配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を調節する化合物またはその塩。
2 3 . 請求項 2 0記載のスクリーニング方法または請求項 2 1記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはそ の塩。
2 4 . 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番号： 3 5または配列番号： 3 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2 5 . 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番号： 3 5または配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオ チドを含有することを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜。
2 6 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法または請求項 2 5記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 4、 配列番 号： 3 5または配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩。
2 7 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法または請求項 2 5記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物 またはその塩。
2 8 . 請求項 2 2、 請求項 2 3、 請求項 2 6または請求項 2 7記載の化合物ま たはその塩を含有してなる医薬。
2 9 . 心疾患の予防 ·治療剤である請求項 1 2、 請求項 1 3、 請求項 1 6、 請 求項 1 9または請求項 2 8記載の医薬。
3 0 . 心疾患の診断薬である請求項 1 4または請求項 1 7記載の診断薬。
3 1 . 配列番号： 2で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列 を含有する D NA。
3 2 . 配列番号： 1 7または配列番号： 1 8で表される塩基配列と同一または 実質的に同一の塩基配列を含有する D NAのプロモーター領域である請求項 3 1 記載の D N A。
3 3 . 請求項 3 1記載の D N Aを含有する組換えベクター。
34. 配列番号： 2で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列 を含有する DN Aのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を有する DN A を含有する請求項 33記載の組換えベクター。
35. 請求項 34記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
36. 請求項 31記載の DNAを用いることを特徴とする、 配列番号： 17ま たは配列番号： 18で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を 含有する DN Aのプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
37. 請求項 35記載の形質転換体を用いる請求項 36記載のスクリーニング 方法。
38. 請求項 31記載の DNAを含有することを特徴とする、 配列番号： 17 または配列番号： 18で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列 を含有する DN Aのプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩 のスクリーニング用キッ卜。
39. 請求項 36記載のスクリーニング方法または請求項 38記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 17または配列番号： 18で表 される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する DN Aのプロモ —夕一活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
40. 請求項 39記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
41. 心疾患の予防 ·治療剤である請求項 40記載の医薬。
42. 哺乳動物に対して、 請求項 22、 請求項 23、 請求項 26、 請求項 27 または請求項 39記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とす る心疾患の予防 ·治療方法。
43. 心疾患の予防 ·治療剤の製造のための、 請求項 22、 請求項 23、 請求 項 26、 請求項 27または請求項 39記載の化合物またはその塩の使用。 -
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