HU206896B - Process for producing hibride interferons, their intermediates, pharmaceutical compositions containing them, monoclonal antibodies against them and purifying them - Google Patents

Process for producing hibride interferons, their intermediates, pharmaceutical compositions containing them, monoclonal antibodies against them and purifying them Download PDF

Info

Publication number
HU206896B
HU206896B HU87995A HU99587A HU206896B HU 206896 B HU206896 B HU 206896B HU 87995 A HU87995 A HU 87995A HU 99587 A HU99587 A HU 99587A HU 206896 B HU206896 B HU 206896B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
interferon
ser
arg
gin
Prior art date
Application number
HU87995A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44074A (en
Inventor
Edgar Falkner
Rudolf Hauptmann
Ingrid Maurer-Fogy
Peter Meindl
Guenther Adolf
Gerhard Bodo
Peter Swetly
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HUT44074A publication Critical patent/HUT44074A/hu
Publication of HU206896B publication Critical patent/HU206896B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

A Nucleic Acíds Rés. című folyóiratban megjelent egy közlemény [Nucl. Acids Rés., 13, 4739-4749 (1985)], amelyben a szerzők az I típusú interferonok egy új osztályát írták le (lásd még a 0 170204 számú közzétett európai szabadalmi bejelentést), s ezeket omega-interferonoknak nevezték el. Leírták továbbá ezen omegainterferonokat kódoló DNS szekvenciákat, azokat a plazmidokat, amelyek ezeket a DNS szekvenciákat tartalmazzák és az új interferonokat termelő mikroorganizmusokat.
A fenti közleményekben leírt expressziós plazmidokkal, például a pRHWll-gyel vagy a pRHW12-vel transzformált E.coli HB101 segítségével az új omegainterferonok nagyobb mennyiségben való kísérleti előállításánál azonban megmutatkozott, hogy kívánatos lenne az új omega-ínterferonok expresszióját fokozni és ezzel egyidejűleg a kifejeződött új interferonok ezután szükséges tisztítását tökéletesíteni.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az előzőekben említett fogyatékosságok új olyan hibrid interferonokkal, amelyek egy része valamely ct-interferonbó! és egy része valamely ómega-interferonból áll, valamint egy olyan új plazmid szerkezettel, amellyel az omegainterferon kifejeződése megjavítható, kiküszöbölhetők.
Az új hibrid interferonok, ezek N-terminális Metvagy N-formil-Met-szánnazékai és az esetben, ha a hibrid interferon peptid szekvenciája glükozilációs helyet tartalmaz, ezek N-glükozilált származékai általában különb farmakológia! tulajdonságokkal rendelkeznek és különösen jól használhatók új olyan monoklonális antitestek előállítására, amelyek az a- és omegainterferonok tisztítására alkalmasak.
A jelen találmány tárgyát tehát az alábbi (I) általános képletű BglU-hibrid interferonok előállítása képezi.
R,=GlnIle Phe-R2
CAG ATC ne (I)
BglII a képletben BglII az αΐ-, α.2- és ómegái-interferonok közös BglII restrikciós helyét jelenti, az R, egy al- vagy a2-interferon peptid szekvenciáját jelenti, amelyet ennek az interferonnak a BglII hasítási helye előtt lévő DNS szekvenciája kódol, az R2 pedig egy ómegái-interferon peptid szekvenciáját jelenti, amelyet ennek az interferonnak a BglII hasítási helye utáni DNS szekvenciája kódol. A találmány tárgyát képezik továbbá az (I) általános képletű hibrid interferonok N-terminális Met- vagy N-formilMet származékai, és ha a hibrid interferon peptid szekvenciája gükozilációs helyet tartalmaz, úgy ennek Nglükozilált származékai is. További tárgya a találmánynak a fenti hibrid interferonoknak gyógyszerként való alkalmazása és közti termékként, kísérleti állatok immunizálásához való felhasználása. A találmány tárgyát képezik az ezen hibrid interferonokat kódoló DNS szekvenciák és az eljárás előállításukra, továbbá az új monoklonális antitestek és ezek felhasználása ct- és omega-interferonok tisztítására, valamint az ezeket kiválasztó hibrid sejtvonalak, és az eljárás e sejtvonalak előállítására.
A találmány tárgya az a- és omega-interferonok új tisztítási eljárása is, új olyan antitest-affinitás-oszlop segítségével, amely a fent említett monoklonális antitesteket tartalmazza és az eljárás előállítására.
A találmány tárgyát képezik azok az új plazmidok is, amelyek az omega-interferonok expressziójának javítását szolgálják, és ezen új plazmidok előállításához szükséges köztes plazmidok, valamint az eljárás ezen plazmidok előállítására.
Az előbbiekben említettek találmány szerinti előállításánál a következőképpen járunk el:
A jelen találmány elsődleges célja az omega-interferonok tisztításának tökéletesítése, különösen azért, mivel eddig nem sikerült megfelelő anti-omega-interferon-antitest-affinitás oszlopot előállítani az ismert módszerekkel.
Ebből a helyzetből kiutat jelentenek a jelen találmány szerinti új hibrid interferonok, amelyeket részben egy α-interferonból, előnyösen egy al- vagy a2-interferon, például az IFN-a2(Arg) (lásd az EP-A-0095 702 európai közrebocsátási iratot) egy részéből és részben egy omega-interferonból, előnyösen az ómegal(Glu)vagy ómegal(Gly)-interferon (lásd az EP-A-0 170204 számú európai közrebocsátási iratot) egy részéből építünk fel. Például az IFN-a2(Arg)-nál és IFN-omegánál a megfelelő részeket kódoló DNS szekvenciák összekapcsolása a BglII hasítási helynél történik, amely mindkét génben a 191-196 pozícióban található. Itt az α-interferon esetében be kell számítani egy üres helyet a peptid 1-66 aminosavai között, például az IFNa2(Arg)-ban a 45. aminosavnál lévő üres helyet, hogy a két gén szekvenciáit egymással össze lehessen hasonlítani, mint ahogy ez az alábbi képletből kitűnik (beszámítandó az N-terminális Met-csoport is, amely a bakteriális protein szintézis után legtöbbször lehasad):
5 10 15
Met Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr
ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC 45
Met Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr
ATG TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC 45
20 25 30
Leu Met Leu Leu Alá Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys
TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC 90
Leu Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys
TTG GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC. TTG TGT. 90
HU 206 896 B
40 45
Leu TTG Leu CTC Lys AAG Lys AAG Asp GAC Asp GAC Arg Arg Asp AGA CGT GAC Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe TTT Val GTA Lys AAA 135 135
TTT GGA Phe Arg TTC AGG TTT Phe TTC CCC Pro CCC CAG Gin CAG GAG Glu GAG GAG Met ATG
Arg AGA Arg Asp
AGA GAC
50 55 60
Gly Asn Gin Phe Gin Lys Alá Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu
GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG 180
Gly Ser Gin Leu Gin Lys Alá His Val Met Ser Val Leu His Glu
GGG AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG 180
65 70 75
Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT 225
Met Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser
ATG CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT 225
80 85 90
Alá Alá Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC 270
Alá Alá Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu
GCT GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT 270
95 100 105
Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Alá Cys Val Ile Gin Gly Val
TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG 315
His Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val
CAT CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG 315
110 115 120
Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Alá
GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT 360
Gly Glu Gly Glu Ser Alá Gly Alá Ile Ser Ser Pro Alá Leu Thr
GGA GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC 360
125 130 135
Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys
GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG 405
Leu Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys
TTG AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG
405 140 145 150
Lys Tyr Ser Pro Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Alá Glu Ile Met
AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG 450
Lys Tyr Ser Asp Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met
AAA TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG 450
155 160 165
Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser
AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT 495
Lys Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser
AAA TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT 495
170
Lys Glu
AAG GAA TGA 504
Lys ASp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
AAA GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGA 522
HU 206 896 Β
A fenti képletben minden dupla sor első sora az IFNa2(Arg) és második sora az ómegái-interferon megfelelő szekvenciáit tünteti fel, s a 191-196 nukleotid pozícióban található a mindkét génben közös BglII hasítási hely. Egyébként az IFN-a2(Arg) génben a 451-456 pozícióban egy második BglII hasítási hely is van.
Csatoljuk az egyes plazmidok ábráit, melyek nem mérethelyesek és csak a lényeges szekvenciákat és restrikciós enzim felismerő helyeket tartalmazzák. Az ábrákban a következő' rövidítéseket alkalmazzuk:
Restrikciós enzim felismerő szekvenciák:
B: BamHI; Bg: BglII; Bgl: az IFn-a2(Arg) génben lévő egyik BglII hely; Bg2: az IFN-ct2(Arg) génben lévő másik BglII hely; E: EcoRI; H: HindlII; N: Ncol; P: PstI; S: Sphl;
p/o: triptofán promoter/operátor (Serratia marcescens) a hozzá csatlakozó Shine-Dalgarno szekvenciával (riboszóma kötő hely);
pár a pPM31 plazmid partíciós lókusza; őri: replikációs kezdőpont;
Apr: ampicillin rezisztencia gén;
Tcr: tetraciklin rezisztencia gén;
Tcs: tetraciklin érzékeny; kb: 1.000 bázis pár.
Jelen bejelentés a következő ábrákat tartalmazza:
1. ábra: a parpATER33 szerkesztésének vázlata;
2. ábra: a pRHW14 szerkesztésének vázlata;
3. ábra: a maxi-sejtekből (E.coli CSR603) származó 35S-sel jelzett proteinek autoradiogramja;
4. ábra: a pRH72 szerkesztésének vázlata;
5. ábra: a pRH78r és a pRH78f szerkesztésének vázlata;
6. ábra: az IFN-omegal/a2(BglII) MONO-S kromatogramja;
AUFS = abszorpciós egység (full scale);
7. ábra: az IFN-omegal/a2(BglII) gélpermeációsHPLC kromatogramja;
8. ábra: az IFN-omegal MONO-S kromatogramja;
9. ábra: az IFN-omegal révére fázisú HPLC kromatogramja.
Az új Bg 111-hibríd interferonok és ezek N-glükozilált származékai tehát vagy egy al- vagy egy a2-inlerferon
1-66 aminosavából, előnyösen az IFN-ct2(Arg) 1-65 aminosavából és egy ómegái-interferon 67-173 aminosavából állnak, vagy az ómegái-interferon 1-66 aminosavából és egy a-1- vagy egy ct2-interferon 67-167 aminosavából, előnyösen az IFN-a2(Arg) 66-166 aminosa10 vából állnak, amelyeknél az N-terminális Met-csoport a bakteriális protein szintézis után legtöbbször lehasad.
Meglepő, hogy az új hibrid interferonokat az antiIFN-a-antitestek felismerik. Ezáltal válik lehetővé az új hibrid interferonok tisztítása az irodalomból ismert anti15 ΙΕΝ-α-antitestek segítségével (lásd az EP-A-0119476 számú európai közrebocsátási iratot). Ha ezután az így kapott tiszta, új hibrid interferonnal kísérleti állatot immunizálnak, például BALB/c egereket, megfelelő antitestek képződését indukálhatjuk. Ezek az új antitestek nemcsak az új hibrid interferonokat ismerik fel, hanem meglepő módon a hibrid interferonok egyes építőköveit is, például egy ómega-interferont.
A megfelelő hibrid interferon-plazmid szerkesztésének kiindulási alapja tehát az, hogy az αΐ-, α2- és ome25 ga-interferon gén 191-196 pozíciójában közös BglII restrikciós hely van, s mint ahogy az előzőekben említettük, hozzászámítjuk, hogy az IFN-a2(Arg) génben a 45. kodonnál üres hely van, továbbá, hogy az al-, a2-interferont, illetve az ómegái-interferont kódoló plazmidok30 hoz megfelelő gének izolálása szükséges.
A találmány szerint először egy olyan plazmidot állítunk elő, amely az ómegái-interferon kifejeződését javítja. Erre szolgál az irodalomból ismert és a kereskedelemben kapható pAT153 plazmid [Amersham cég; lásd még:
A. J. Twigg és munkatársai, Natúré, 283, 216-218 (1980)], például az IFN-a2(Arg)-ot kódoló parpER33 plazmid (lásd a 0 115 613 számú közzétett európai szabadalmi bejelentést) és egy alábbi képletű ómegái-interferont kódoló plazmid
cys Asp Leu Pro Gin 20 Asn His Gly
Val Leu Leu His Gin 35 Met Arg Arg
Lys Asp Arg Arg Asp 50 Phe Arg Phe
Ser Gin Leu Gin Lys 65 Alá His Val
Leu Gin Gin lle Phe 80 Ser Leu Phe
Alá Trp Asn Met Thr 95 Leu Leu Asp
Gin Gin Leu Gin His 110 Leu Glu Thr
Glu Gly Glu Ser Alá -X- Alá lle
Leu Leu 10 Ser Arg Asn Thr 15 Leu
He Ser 25 Pro Phe Leu Cys 30 Leu
Pro Gin 40 Glu Met Val Lys 45 Gly
Met Ser 55 Val Leu His Glu 60 Met
His Thr 70 Glu Arg Ser Ser 75 Alá
Gin Leu 85 His Thr Gly Leu 90 His
Cys Leu 100 Leu Gin Val Val 105 Gly
Ser Ser 115 Pro Alá Leu Thr 120 Leu
HU 206 896 B
125 130 135
Arg Arg Tyr Phe Gin Gly He Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys
140 145 150
Tyr Ser Asp Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys
155 160 165
Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys
170
Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
A képletben a 111. pozícióban lévő X jel Glu-t vagy A parpER33 plazmidot, amely a par-lókuszt az
Gly-t jelent, s ilyen plazmid a pRHWl 1 vagy 12 (lásd a alábbi képletű szekvenciával tartalmazza 0 170 204 számú közzétett európai szabadalmi bejelentést).
GAATTCCGAC AGTAAGACGG GTAAGCCTGT TGATGATACC GCTGCCTTAC 50
TGGGTGCATT AGCCAGTCTG AATGACCTGT CACGGGATAA TCCGAAGTGG 100
TCAGACTGGA AAATCAGAGG GCAGGAACTG CTGAACAGCA AAAAGTCAGA 150
TAGCACCACA TAGCAGACCC GCCATAAAAC GCCCTGAGAA ZCCGTGACGG 200
GCTTTTCTTG TATTATGGGT AGTTTCCTTG CATGAATCCA TAAAAGGCGC 250
CTGTAGTGCC ATTTACCCCC ATTCACTGCC AGAGCCGTGA GCGCAGCGAA 300
CTGAATGTCA CGAAAAAGAC AWCGACTCAG GTGCCTGATG GTCGGAGACA 350
AAAGGAATAT TCAGCGATTT GCCCGAGGAA TTC 383
- a képletben a Z betű a G vagy C nukleotidot jelenti és a W betű a G nukleotidot jelenti vagy üres helyet jelöl - tartalmazza továbbá a pER103 plazmidból az expresszióhoz szükséges replikon- és szabályozó szekvenciákat (lásd a 17. igénypontot), BamHI-vel és Pstl-vel hasítjuk. Az ekkor keletkező két fragmentumot gél-elektrofoiézissel - például 1%-os agaróz gélben - választjuk el és a kisebbik fragmentumot, amely IFN-cű(Arg) gént tartalmazza, elektroelúcióval izoláljuk. Az így kapott DNS-t ezután etanol hozzáadásával kicsapjuk, lecentrifugáljuk és egy megfelelő pufferben - ilyen a TE puffer: 10 mmól trisz (pH=8,0), 1 mmól EDTA - felvesszük.
A pAT153 plazmidot ugyancsak BamHI-vel és Pstlvel hasítjuk. A kapott két fragmentumot gélelektroforézissel - például 1%-os agaróz gélben - választjuk el, és a nagyobb fragmentumot, amely a replikációs kezdőpontot tartalmazza, izoláljuk. Az így kapott nagyobb fragmentumot ezután a parpER33 plazmidból izolált kis ffagmen' tummal, valamilyen ligáz, például a T4 DNS-ligáz jelenlétében összekapcsoljuk. A kapott plazmid replikálása céljából baktériumokat, előnyösen az E.coli HB101 törzset [genotípusa F, hsd820 (r, in-), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-l, supE44, lambda-] mosunk kalcium-klorid oldattal és az így előállított kompetens E.coli HB101 sejteket összekeverjük a ligázos reakcióeleggyel. A keveréket 0 °C-on inkubáljuk, majd a 2 percig tartó 42 °C-os hősokkolás következtében a plazmid-DNS-t a baktériumok felveszik. Ezután a transzformált baktériumokat ampicillin tartalmú LB-agar lemezekre (LB-táptalaj + 15 g/1 agar) szélesztjük. Ezen az agaron csak olyan E.coli HB101 baktériumok képesek növekedni, amelyek felvették a rekombináns vektor molekulát. Inkubálás következik 37 °C-on, majd a képződött telepekből 12 telepet kiválasztunk és ezekből Bimbóim és munkatársai módszerével [Nucl.
Acids Rés., 7.1513 (1979)] izoláljuk a plazmidokat. A kiválasztott plazmidok kettős restrikciós enzimes emésztésével - Pstl-BamHI-vel, Pstl-PvuII-vel vagy EcoRIBamHI-vel - majd a kapott fragmentumok gélelektroforézisével állapítjuk meg a plazmidok szerkezetének helyességét. Egy ilyen plazmidot kiválasztottunk és parpATER3 3-nak neveztük el (szerkezetének vázlata az 1. ábrán látható). Ez a plazmid E.coli HB101 transzformált sejtben Apr (ampicillin rezisztencia) és Tcr (tetraciklin rezisztencia) fenotípust mutat.
Az így kapott parpATER33 plazmidot (restrikciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be) HindlII-mal és BamHIval hasítjuk, hogy egy olyan plazmidot állítsunk elő, amely az omega-interferon expresszióját javítja (szerkesztésének vázlatát a 2. ábrán mutatjuk be). Az ekkor keletkező három fragmentumot gélelektroforézissel például 1%-os agaróz gélben - választjuk el és a legnagyobb fragmentumot („a” fragmentum), amely a triptofán-promoter/operátor szekvenciát (Serratia marcescens), a replikációs kezdőpontot és az Apr gént tartalmazza, izoláljuk és összekapcsoljuk egy omegal-interferont kódoló DNS-sel. Ezt a DNS-t úgy állítjuk elő, hogy egy omegal-interferont kódoló plazmidot elhasítunk. Előnyösen a pRHWll, illetve a pRHW12 plazmidot BamHl-vel és HindlII-mal hasítjuk, majd ezután a kapott fragmentumokat gélelektroforézissel választjuk el, amikor is a kívánt gént a kisebb, körülbelül 800 bp hosszú fragmentum tartalmazza. A képződött plazmidok replikálása érdekében baktériumokat, előnyösen E.coli HB101 sejteket mosunk kalcium-klorid-oldattal és a kapott kompetens E.coli HB101 sejteket a ligázos reakció-eleggyel keverjük el, a sejteket 0 °C-on inkubáljuk, majd 2 percig 42°C-on tartjuk, amikor is a hősokk következtében a baktériumok felveszik a plazmid DNS-t. Ezután a transzformáit baktériumokat ampicillin tartalmú LB-agar le5
HU 206 896 B mezekre kenjük ki. Ezen az agaron csak azok az E.coli HB101 baktériumok növekednek, amelyek felvettek egy rekombináns vektor molekulát. Inkubálás következik 37 °C-on, majd a képződött telepek közül 6 telepet kiválasztunk és ezekből Bimbóim és munkatársai módszerével [Nucl. AcidsRes.,7,1513 (1979)] izoláljuk a plazmidokat. A kiválasztott plazmidokat EcoRI, HindlII, Ncol és PstI restrikciós enzimekkel emésztjük, ezután gélelektroforézist végzünk és így állapítjuk meg a plazmidok szerkezetének helyességét. Kiválasztottunk egy plazmidot és pRHW 14 jelzéssel láttuk el abban az esetben, ha a kiindulási plazmid az ómegái(Gly)-interferont kódoló pRHW12 plazmid volt. Ez a plazmid E.coli HB101 sejtekben Apr és Tos fenotípust mutat.
Ha kiindulási plazmidként a pRHWll-et használtuk, amely az ómega l(Glu)-interferont kódolja, úgy analóg módon a pRHW13 plazmidhoz jutottunk.
Az így kapott pRHW14 plazmid kifejeződésének a sebessége - az omegal(Gly)-interferont illetően - kétszer ekkora, mint az eddig ismert pRHW12 plazmidé (lásd az EP-A-0 170204 számú közzétett európai szabadalmi bejelentést), maxi-sejt rendszerben végezve a vizsgálatot [J. Bacteriol., 137, 692-693 (1979)]. A vizsgálatban E. coli CSR603 sejteket [genotípusa F-, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, lambda-, supE44] transzformálunk pRHW12 és pRHW14 plazmidokat. Ezek a sejtek reparatórikus rendszerben UV-fény indukálta károsodásra deficiensek. Ha a sugár dózist úgy választjuk meg, hogy inkább a baktérium kromoszómája károsodjon, de a plazmid alig, úgy túlnyomóan a plazmid kódolta gének részéről indul meg a transzkripció és ezt követően a transzláció. Ha tápoldat 35S-metionint tartalmaz, úgy főleg a plazmid-géntermékek jelződnek, amelyek akrilamid gélben való elválasztás után röntgenfilmen (erősítő fólia alkalmazása mellett) közvetlenül kimutathatók (lásd a 3. ábrát). Az ampicillin rezisztencia gén terméke (β-laktamáz, bla) mindkét esetben egyformán erősen jelzett. A pRHW14 esetén az ómega l(Gly)-interferon kétszer olyan erősen jelzett, mint a pRHW12 esetében.
Az (I) általános képlet szerinti hibrid interferont kódoló plazmid előállítása céljából, amely a közös BglII hasítási hely előtt az al- vagy a.2-interferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazza (a szerkesztés vázlata a 4. ábrán látható), úgy járunk el, hogy például a parpATER33 plazmidot és egy ómegái-interferont kódoló plazmidot - ilyen a pRHW14 plazmid - BglIIvel és SphI-vel hasítunk. Az ekkor keletkező fragmentumokat gélelektroforézissel - például 1%-os agaróz gélben - elválasztjuk, eluáljuk és etanolos kicsapással tisztítjuk. A fragmentumokat megfelelő pufferben, például TE-pufferben feloldjuk, majd a parpATER33 plazrnidból származó nagy fragmentumot a pRHW14 plazmádból kapott kisebb fragmentummal kapcsoljuk össze valamely ligáz, például a T4 DNS ligáz jelenlétében. A keletkező plazmidok replikálására baktériumokat, előnyösen az E.coli NB101 törzs sejtjeit [genotípusa F, hsdS20 (r, m-), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44, lambda-] kalciumklorid-oldattal mossuk és az így kapott kompetens E.coli NB101 sejteket összekeverjük a ligázos reakcióeleggyel és 0 °C-on való inkubálás után a plazmid DNS-t 2 perc 42 °C-os hősokkolás után felveszik a baktériumok. Ezután ampicillin tartalmú LB-agar (LB táptalaj + 15 g/1 agar) lemezre szélesztjük a transzformáit baktériumokat. Ezen az agaron csak azok az E.coli HB101 baktériumok növekednek, amelyek felvették a rekombináns vektor molekulát. A sejteket 37 °C-on inkubáljuk és a keletkező telepek közül többet kiválasztunk és izoláljuk belőlük Bimbóim és munkatársai módszerével [Nucl. Acids Rés., 7, 1513 (1979)] a plazmidokat. A kiválasztott plazmidokat BglII és Sphl restrikciós enzimmel megemésztjük, majd a kapott fragmentumok gél-elektroforézises vizsgálatával megállapítjuk e plazmidok szerkezetének helyességét. Egy ilyen plazmidot kiválasztottunk és pRH72 elnevezéssel láttuk el (lásd a 4. ábrát). Ez a plazmid az általa transzformált E.coli HB101 sejtben Apr és Tcs fenotípust mutat, s az alábbi képletű IFN-a2/omegal(Gly) (BglII) hibrid interferont kódolja,
5 Gly 10 Ser Arg Arg Thr 15 Leu
Cys Asp Leu Pro Gin The His Ser Leu
20 25 30
Met Leu Leu Alá Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu
35 40 45
Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn
50 55 60
Gin Phe Gin Lys Alá Glu Thr Ile Pro val Leu His Glu Met Ile
65 70 75
Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Alá Alá
80 : 85 90
Trp Asn Met Thr- Leu Leu. Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His Gin
HU 206 896 B
95 100 105
Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly Glu
110 115 120
Gly Glu Ser Alá Gly Alá Ile Ser Ser Pro Alá Leu Thr Leu Arg
125 130 135
Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr
140 145 150
Ser Asp Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser
155 160 165
Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp
170
Arg Asp Leu Gly Ser Ser továbbá ennek Met- és N-formil-Met származékát, mázzá az ezen peptidet kódoló alábbi képletű nukleotid valamint N-glükozilált származékát, ezenkívül tártál- szekvenciát
ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC 45 TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC 90 TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC 135 AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATC 180 ATC CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 405 TAC AGC GAG TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 495 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGA 519 vagy e szekvencia degenerált változatait.
Egy olyan hibrid interferont kódoló plazmidnak az előállítását, amely a közös BglII hasítási hely előtt egy omegal-interferont kódoló DNS szekvenciát tartalmaz (a szerkesztés folyamatát az 5. ábrán mutatjuk be), abban az esetben, ha az α-interferon DNS szekvenciájában két BglII hasítási hely van, mint például az IFN-a2(Arg) 40 DNS szekvenciájában, két lépésben kell elvégezni.
Az első lépésben a pRHW14 plazmidból a Bglll-vel és SphI-vel való hasítással kapott nagy fragmentumot a parpATER33 plazmidból Bglll-vel és Sphi-vel való emésztéssel nyert azon fragmentummal kapcsoljuk össze 45 - ligáz jelenlétében, például T4 DNS ligáz jelenlétében amely az IEN-a2(Arg) C-tenninálisát tartalmazza. Mint ahogyan az előbbiekben a pRH72 plazmid előállításánál leírtuk, a kapott plazmid replikálása érdekében baktériumokat, előnyösen E.coli HB101 sejteket transzfonná- 50 lünk, a sejteket tenyésztjük és szerkezetüket ellenőrizzük.
Egy ilyen plazmidot kiválasztottunk és pRH77-nek neveztük el (restrikciós térképe az 5. ábrán látható).
A második lépésben ezután, hogy a hibrid interferon gént, például az IFN-omegal/a2(BglII)-t meghatározó 55 gént teljessé tegyük, azt a 192-455 pozíciójú fragmentumot, amelyet a parpATER33 hasításánál eltávolítottunk, újra be kell vigyük a pRH77 plazmidba. Ezért a pRH77 plazmidot Bglll-vel hasítjuk és az 5-terminális foszfátcsoportot borjúbél-foszfatázzal (CIP) eltávolítjuk. A ka- 60 pott linearizált pRH77 plazmidot gélelektroforézissel például 1%-os agaróz gélben - elválasztjuk, izoláljuk és etanolos kicsapással tisztítjuk. A kapott linearizált fragmentumot alkalmas pufferben, például TE pufferben feloldjuk és hozzákapcsoljuk a parpATER33-nak Bglll-vel és Sphi-vel való eredeti emésztésénél kapott 263 bp hosszú fragmentumhoz, ligáz, például T4 DNS ligáz jelenlétében. A kapott plazmid replikálására baktériumokat, előnyösen E. coli HB101 Sejteket transzformálunk és tenyésztünk, ahogyan azt a pRH72 plazmid előállításánál leírtuk, majd Alul és Haell restrikciós endonukleázzal való hasítással ellenőrizzük, hogy szerkezete helyes-e. A 263 bp hosszú fragmentum beépülése mindkét irányban végbemegy az identikus végződések következtében.
Az a plazmid, amelybe a 263 bp hosszú BglII fragmentum az expresszióhoz szükséges helyzetben épült be, a pRH78r elnevezést kapta és annak, amelyikben az expresszíó szempontjából helytelenül épült be, a pRH78f nevet adtuk.
Mindkét plazmid úgy transzformálja az E.coli HB101 sejteket, hogy fenotípusuk egyformán Apr és Tcr lesz. A pRH78r plazmid (restrikciós térképe az 5. ábrán látható) az IFN-omegal/a2(BglII) polipeptid szekvenciát kódolja és a peptidet kódoló alábbi nukleotid szekvenciát tartalmazza:
HU 206 896 Β
Met ATG Cys TGT Asp GAT Leu CTG 5 Pro CCT Gin CAG Asn AAC His CAT Gly GGC Leu CTA 10 Leu CTT Ser AGC Arg AGG Asn AAC 15 Thr ACC 45
Leu Val Leu Leu 20 His Gin Met Arg Arg Ile 25 Ser Pro Phe Leu 30 Cys
TTG GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT 90
Leu Lys Asp Arg 35 Arg Asp Phe Arg Phe Pro 40 Gin Glu Met Val 45 Lys
CTC AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA 135
Gly Ser Gin Leu 50 Gin Lys Alá His Val Met 55 Ser Val Leu His 60 Glu
GGG AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG 180
Met Leu Gin Gin 65 Ile Phe Asn Leu Phe Ser 70 Thr Lys Asp Ser 75 Ser
ATG CTG CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT 225
Alá Alá Trp Asp 80 Glu Thr Leu Leu Asp Lys 85 Phe Tyr Thr Glu 90 Leu
GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC 270
Tyr Gin Gin Leu 95 Asn Asp Leu Glu Alá Cys 100 Val Ile Gin Gly 105 Val
TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG 315
Gly Val Thr Glu 110 Thr Pro Leu Met Lys Glu 115 Asp Ser Ile Leu 120 Alá
GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT 360
Val Arg Lys Tyr 125 Phe Gin Arg He Thr Leu 130 Tyr Leu Lys Glu 135 Lys
GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG 405
Lys Tyr Ser Pro 140 Cys Alá Trp Glu Val Val 145 Arg Alá Glu Ile 150 Met
AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG 450
Arg Ser Phe Ser 155 Leu Ser Thr Asn Leu Gin 160 Glu Ser Leu Arg 165 Ser
AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT 495
Lys Glu '
AAG GAA TGA 504
A pRH78f plazmid (restrikciós térképe az 5. ábrán ezen peptidet meghatározó alábbi nukleotid szekvencilátható) az alábbi polipeptid szekvenciát kódolja és az át tartalmazza:
Met ATG Cys TGT Asp GAT Leu CTG 5 His CAT Gly GGC Leu CTA 10 Leu CTT Ser AGC Arg AGG Asn AAC 15 Thr ACC 45
Pro CCT Gin CAG Asn AAC
20 25 30
Leu Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys
TTG GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT 90
35 40 45
Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys
CTC AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA 135
HU 206 896 Β
50 55 60
Gly Ser Gin Leu Gin Lys Alá His Val Met Ser Val Leu His Glu
GGG AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG 180
Met Leu Gin 65 Gin Ile Ser
ATG CTG CAG CAG ATC TCA TGA TTT CTG CTC TGA CAA CCT CCC AGG 225
CAC AAG GGC TGT ATT TCT TCT CTT TCA GAT AGA GAG TGA TTC TTT 270
GGA AGT ATT TCC TCA CAG CCA GAA TGG AGT CCT CCT TCA TCA GGG 315
GAG TCT CTG TCA CCC CCA CCC CCT GTA TCA CAC AGG CTT CCA GGT 360
CAT TCA GCT GCT GGT AGA GTT CAG TGT AGA ATT TGT CTA GGA GGG 405
TCT CAT CCC AAG CAG CAG ATG AGT CCT TTG TGC TGA AGA GAT TGA 450
AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT 505
AAG GAA TGA 514
A találmány szerinti új plazmidokat, replikációjuk és expressziójuk végett, bevihetjük bakteriális gazdasejtekbe. Erre a célra alkalmasnak bizonyulnak az alábbi prokarióták: E.coli K12 294 jelzésű törzs (ATCC letéti száma: 31446), E.coli XI776 (ATCC letéti száma: 31537), E.coli W3110 (F“, lambda-, prototróf, ATCC letéti száma: 27325), E.coli HB101 (F, hsdS20 (r, m~), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44, lambda-], egyéb bacillusok, így a Bacillus subtilis, más Enterobacteriaceae fajok, mint a Salmonella typhimurium, vagy Serratia marcescens és különböző Pseudomonas fajok.
Az új hibrid interferonok kifejezése céljából például a pRH72, pRH78f és pRH78r plazmiddal mindenkor E.coli sejteket transzformálunk, s a sejteket tenyésztjük. A kifejeződött polipeptidek vírus ellenes aktivitását CPE redukciós módszerrel a sejtfelülúszóból határozzuk meg, amelyhez úgy juthatunk, hogy a sejtfalat elroncsoljuk és a baktérium törmeléket lecentrifugáljuk. (CPE=Cytopathischen Effekt, citopátiás hatás). A pRH72-vel transzformált E.coliból és a pRH78f-vel transzformált E.coliból nyert sejtfelülúszókban ezzel a vizsgálattal nem volt kimutatható antivirális tulajdonság. Meglepő volt azonban, hogy a pRH78r plazmiddal kapott sejtfelülúszóban, amely az IFN-omegal/a2(BglII)-t tartalmazta, mintegy négyszer magasabb volt a specifikus vírus ellenes hatás A549 sejteken, mint az IFN-a2(Arg) esetében.
Az új, találmány szerint előállított plazmidok új, hibrid interferont kódoló DNS szekvenciái megfelelő változtatások után minden más organizmusba bevihetők.
Ilyen esetekben egy ilyen szekvenciának az expressziója és transzlációja más olyan szabályozó rendszerek irányítása alatt megy végbe, amelyek az organizmus transzformálatlan formája szempontjából „homológ”-nak tekinthetők. így például egy laktóz függő E.coli kromoszómális DNS-e laktóz-, illetve lac-operont tartalmaz, amely a β-galaktozidáz enzim létrehozása révén a laktóz lebontását lehetővé teszi.
A lac-szabályozó elemeket az E.coli fertőzni képes lambda-plac5 bakteriofágból kaphatjuk meg. A fág lacoperonja transzdukció révén ugyanabból a baktériumfajból származhat. Azok a szabályozó rendszerek, amelyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazásra ke20 rülnek, szintén származhatnak olyan plazmid-DNSből, amely sajátja az organizmusnak. A lac-promoteroperátor rendszert IPTG-vel (IPTG = izopropil-tio-galaktozid) indukálhatjuk.
Más promoter-operátor rendszereket vagy ezek részeit éppen ilyen jól használhatjuk, például: arabinózpromoter/operátor, kolicin Erpromoter/operátor, galaktóz-promoter/operátor, alkalikus foszfatáz-promoter/operátor, trp-promoter/operátor, xilóz-A-promoter/operátor, tac-promoter és így tovább.
A prokariótákon kívül eukariótákat is - mint például élesztőt — szintén használhatunk. Az eukarióta mikroorganizmusok közül a Saccharomyces cerevisiae-t használják a leggyakrabban, bár általában számos más faj is hozzáférhető. A Saccharomyces-ben való kifejezés céljára rendszerint például az YRp7 plazmidot [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141 (1979); Tschumper és munkatársai, Gene, 10,157 (1980)] és az YEpl3 plazmidot [Bwach és munkatársai, Gene, 8, 121-133 (1979)] használják. Az YRp7 plazmid aTRPl gént tartalmazza, amely egy élesztő mutáns szelekciós markeréül szolgál. Ez a mutáns képtelen triptofánmentes táptalajban növekedni, ilyen például az ATCC 44076 letéti számú mutáns.
Ha TRP1 károsodás van jelen az élesztő-gazda genom jellemzőjeként, ez hatékony segítséget jelent ahhoz, hogy kimutassuk a transzformációt, amikor triptofán nélkül tenyésztünk. Egészen hasonlóan viselkedik az YEpl3 plazmid, amely a LEU-2 élesztő gént tartalmazza, s amely egy LEU-2 mínusz mutáns kiegészítőjeként alkalmazható. Az élesztő vektorok számára alkalmas promoter szekvenciák a következők: az ADHI gén 5’-nél lévő szakasza [G.Ammerer: Methods of Enzymology, 101, 192-201 (1983)], a 3-foszfoglicerát kináz [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)] vagy az egyéb glükózbontó enzimek [Kawasaki és Fraenkel, BBRC, 108, 1107-1112 (1982)], mint enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-frukto-kináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, foszfo-glükóz-izomeráz és -glükokináz promoterei. Megfelelő expressziós plazmidok szerkesztésénél az ezekhez a génekhez tartozó terminátor szekvenciákat szintén be lehet tenni az expressziós vektorba, a kifejezendő szekvencia 3’ végére,
HU 206 896 B hogy a mRNS poliadenilációjáró! és terminációjáról gondoskodjunk.
Vannak más olyan promoterek, amelyeknek még az az előnyük, hogy transzkripciójuk a növekedési körülményekkel szabályozható, ilyen promoter szakasszal rendelkeznek a következő enzimek génjei: alkohol-dehidrogenáz-2, izo-citokróm C, savanyú foszfatáz, a nitrogén anyagcserében résztvevő bontó enzimek, a fenti említett gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és a maltóz és galaktóz lebomlásáért felelős enzimek. Azokat a promotereket, amelyeket az élesztő mating-type lokusza szabályoz, például a BARI, MFal, STE2, STE3 és STE5 gének promotereit, hőmérséklettel szabályozott rendszerekben használhatjuk, hőmérsékletfüggő sir mutációk alkalmazása révén. [Rhine Ph.D. téziseiben, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979); Herskowitz és Oshima: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, I. rész, 181-209. old. (1981) Cold Spring Harbor Laboratory], Ezek a mutációk az élesztők nyugvó mating-type kazettáinak expresszióját befolyásolják és ezáltal indirekt a mating-type függő promotereket. Általában azonban minden olyan vektor alkalmas, amely egy élesztő-kompatibilis promotert, valamint élesztő specifikus replikációs és terminátor szekvenciákat tartalmaz.
A mikroorganizmusokon kívül a többsejtű szervezetek tenyészetei ugyancsak alkalmas gazdaszervezetek. Elvileg minden ilyen tenyészet használható, akár gerinces, akár gerinctelen állat sejt-tenyészetéről van szó. A legfontosabbak azonban a gerincesek sejttenyészetei, így a gerinces állatok sejtjeinek tenyésztéssel (szövet-tenyészet) való szaporítása az utóbbi években rutin módszerré vált [Kruse és Patterson szerkesztésében: Tissue Culture, Academic Press (1973)]. Ilyen fontos gazda-sejtvonalak például a következők: VERO-sejtek, HeLa-sejtek, aranyhörcsög-petefészek (CHO)-sejtek, továbbá a W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezekhez a sejtvonalakhoz szolgáló expressziós vektorok rendszerint egy replikációs kezdőpontot, egy promotert - amely a kifejeződő gén előtt helyezkedik el a szükséges RNS-splicing hellyel együtt - poliadenilációs helyet és transzkripciós terminátor szekvenciákat tartalmaz.
Emlős sejtek használata esetén az expressziós vektor szabályozó funkcióihoz gyakran virális eredetű anyagot alkalmazunk. Például a szokásosan használt promoterek a polyoma adenovírus-2-ből és különösen gyakran a Simian vírus 40-ből származnak. Az SV40 korai és késői génjeinek promoterei különösen hasznosak, mivel mindkettőt könnyen izolálhatjuk a vírusból olyan fragmentum formájában, amely még az SV40 virális replikációs kezdőpontját is tartalmazza [Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113 (1978)]. Az SV40-nek kisebb és nagyobb fragmentumai is használhatók, feltéve, ha azt a megközelítőleg 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely a HindlII hasítási helytől a virális replikációs helynél lévő Bgill hasítási helyig terjed. Ezenkívül az is lehetséges és gyakran ajánlatos, hogy olyan promoter- és szabályozó szekvenciákat alkalmazzunk, amelyek természetszerűen hozzá vannak kötve a kívánt gén-szekvenciákhoz, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák a gazdasejt rendszerrel kompatíbilisek.
A replikációs helyet vagy a megfelelő vektor szerkesztés révén biztosítjuk, amikor is egy exogén helyet építünk be például SV40-ből vagy más virális forrásból (például ilyenek a polyoma- és adeno-vírusok, valamint a VSV, PBV stb.) vagy pedig a gazdasejt kromoszómális replikációs mechanizmusát használjuk fel. Ha a vektort a gazdasejt kromoszómájába integráljuk, úgy az utóbb említett eljárás legtöbbször kielégítő.
A találmány szerinti hibridek - különösen az IFNomegal/a2(BglII) interferon - biológiai hatás-spektrumuk alapján minden olyan jellegű kezelésre alkalmazhatók, amelyeknél az ismert interferonok is felhasználást nyernek. Ide tartoznak például a herpes-vírus, rhino-vírus fertőzések, az AIDS-nél előforduló vírus fertőzések, valamint más vímsos megbetegedések, valamint a különböző rákos megbetegedések és hasonlók. Az új interferonokat egyedül vagy más ismert interferonokkal vagy más biológiai aktivitású termékekkel, például IFN-y-val, IL-2-veI vagy más immunmodulátorokkal és hasonlókkal kombinálva alkalmazhatjuk.
Az IFN-omega/α hidrideket - ilyen az IFN-omegal/a2(BglII) - parenterálisan adhatjuk olyan esetekben, amikor tumor ellenes vagy vírus ellenes kezelés szükséges és amikor az immunszuppresszív kezelésben részesülő betegeknél antivirális profilaxist szükséges alkalmazni. Az adagolás és az adagolási ráta hasonló lehet ahhoz, ami jelenleg az IFN-α készítmények klinikai vizsgálatánál van érvényben, például (l-lO)xlO6 egység naponta és azoknál a készítményeknél, amelyek 1%-nál tisztábbak, például az 5xl07 egységet is elérheti.
Például egy lényegében tiszta, baktériumok által termelt IFN-omegal/a2(BglII) parenterális alkalmazásánál egy célszerű adagolási forma lehet a következő: 3 mg IFN-omegal/a2(BglII) 25 ml 5%-os humán szérum albuminban feloldva. Ezt az oldatot baktériumszűró're visszük és a szűrt oldatot aszeptikusán 100 db üvegcsébe osztjuk szét. Ekkor minden egyes üvegcse 6xl06 egység parenterális beadásra alkalmas tiszta IFN-omegal/a(BglII)-t tartalmaz. Az üvegcséket felhasználásig előnyösen hideg helyen (-20 °C) tároljuk. A találmány szerinti anyagok receptúráját ismert módon alakíthatjuk ki annak érdekében, hogy gyógyászatilag használható szert kapjunk, azaz a találmány szerinti poüpeptidet a gyógyszergyártásban elfogadott hordozó-anyaggal keverjük. A használatos hordozókat és leírásukat a „Remington’s Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin) című kötetben találhatjuk meg, s az itt leírtakra külön figyelemmel kell lenni. Az IFN-omegal/a2(BglII)-t a hordozó arányos mennyiségével kell keverni, hogy olyan megfelelő gyógyszert kapjunk, hogy az a betegnél a hatékony felhasználásra alkalmas legyen. A parenterális alkalmazást helyezzük előnybe.
A hibrid interferonok ezenfelül ezen interferonok, • különösen az IFN-omegal/a2(BglII) elleni antitestek
HU 206 896 B előállítására alkalmasak, amelyek ugyanakkor a szülői IFN-a2-tés IFN-omegal-et is felismerik. Az így előállított antitestek tehát az omega-interferonok immun-affinitás-kromatográfiájára is alkalmazhatók.
A jelen bejelentés további tárgyát képezik az új monoklonális antitesteket termelő hibrid sejtvonalak, az eljárás ezek előállítására és eljárás olyan egér monoklonális antitestek előállítására, amelyek IFN-α és omega-interferonra, különösen omegal-ínterferonra specifikusak.
Tehát az új monoklonális antitestek különösen alkalmasak az omegal(Glu)- vagy az omegal(Gly)-interferonok tisztítására és kimutatására.
Az ehhez szükséges antitest-termelő hibrid sejtvonalakat úgy kapjuk meg, hogy lépsejteket fuzionálunk egy hibrid interferonnal, például IFN-omegal/a2(BglII)-vel immunizált egerek myeloma sejtjeivel, például a P3-X-63Ag8-653 sejtvonal myeloma sejtjeivel [Natúré, 266, 550-552 (1977)]. Egy ilyen módon előállított sejtvonal nagy mennyiségű olyan antitestet választ el, amely mind az immunizálásra használt hibrid interferon vírus ellenes hatását, mind pedig mindkét szülői interferon - az IFN-omegal/a2(BglII) esetében az ómega 1-interferon és az IFN-ct2(Arg) vírus ellenes hatását semlegesíti és alkalmas az ómega 1-interferon affinitás-kromatográfiájára.
Ha az így előállított antitestet kovalens kötéssel egy biológiailag inaktív hordozóhoz kötjük, ezt ómegái-interferonok vagy IFN-a2 tisztításához használhatjuk fel.
Tehát az antitestet kovalens kötéssel rákötjük egy megfelelően aktivált hordozóra, előnyösen egy dextrán alapú hordozóra, például CNBr-mal aktivált Sepharosera vagy CH-aktivált Sepharose-ra (gyártja Pharmacia, Uppsala, Svédország). A nagyfokú tisztaság elérése érdekében az a célszerű, hogy vagy az EP-A-0170204 számú európai közrebocsátási iratban leírt eljárás szerint előállított vagy az ezen találmány szerinti, előbbiekben leírt plazmidok segítségével előállított tisztítandó omegal-interferon oldatát gyengén lúgos pH mellett, például pH = 7-8 között, előnyösen pH = 7,5 mellett, egy így előállított antitest-affínitás-hordozón átszívatjuk és addig mossuk pH = 7,5 mellett, amíg az eluátum protein mentes nem lesz, majd ezután a megkötött interferont savanyú tartományban, például 0,1 mólos citromsav - 25%-os etilénglikolban - segítségével leoldjuk. Az így kapott protein tartalmú frakciókat ezután erősen savas kationcserélőn, például a Pharmacia MONO-S kationcserélőjén kromatografáljuk. Ekkor a fenti eluátumban lévő humán interferont a kationcserélő oszlop azonnal adszorbeálja, ahonnan ezután NaCl-gradiens segítségével oldjuk le.
A jelen bejelentésben szereplő eljárás kivitelezéséhez szükséges alap-plazmidokat a 0115613 számú, illetve 0170204 számú közzétett európai szabadalmi bejelentések kapcsán letétbe helyezték a Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen intézménynél, például
1983. december 20-án a pERl03 plazmidot DMS 2773 letéti szám alatt,
1984. július 4-én az E76E9 plazmidot DMS 3003 letéti szám alatt és a P9A2 plazmidot DMS 3004 letéti szám alatt, ugyanakkor egyidejűleg ezen kiónokra a szükséges felszabadítási nyilatkozatot is leadták. E plazmidok felhasználásával egy ezen a területen dolgozó szakember számára minden további nélkül lehetővé válik, hogy a jelen találmány tárgyát képező eljárást a 0115613 számú és a 0170204 számú közzétett európai szabadalmi bejelentések alapján [lásd még: Nucleic Acids Rés., 13,4739-4749 (1985)] kivitelezze.
A következő példák a találmány közelebbi megvilágítására szolgálnak, anélkül azonban, hogy a példák az oltalmi kört korlátoznák. A példákban szereplő enzim-reakciókat az előállítók által megadott feltételek mellett folytattuk le.
I. példa
A parpATER33 plazmid előállítása gg paipER33-at 200 μΐ reakcióelegyben, 20-20 egység BamHl-gyel és Pstl-gyel hasítunk. Ezután a képződött két fragmentumot 1%-os agaróz gélben elválasztjuk [1% agaróz TBE pufferben: 10,8 g/1 trisz(hidroxi-metil-amino-metán (trisz), 5,5 g/1 bórsav, 0,93 g/1 EDTA és 0,5 mg/1 etidium-bromid (EtBr)]. Futtató-puffer: 1 x TBE; elektroforézis 5 V/cm mellett; a DNS fragmentumokat az agaróz gél UV fénnyel (254 nm) való besugárzásával tesszük láthatóvá. A kisebb fragmentumot, amely az interferon-alfa2-Arg-ot [IFN-a2(Arg)] tartalmazza, izoláljuk. A DNS sávot DE-81 Whatman papíron elektroforetizáljuk, a papírt 200 mM NaCl, 25 mM trisz (pH=7,5) és 1 mM EDTA tartalmú oldattal mossuk, majd a DNS-t 2,5 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. Centrifugálás után a DNS-t megszárítjuk és megfelelő térfogatú TE-pufferben [10 mM trisz (pH=8,0), 1 mM EDTA] vesszük fel.
gg pAT153-at ugyancsak 200 gl reakcióelegyben 20-20 egység BamHI-gyel és Pstl-gyel hasítunk és a kapott két fragmentumot elválasztjuk. A pAT153-ból a replikációs kezdőpontot tartalmazó nagyobb fragmentumot izoláljuk.
A tisztított DNS fragmentumokból 0,5-0,5 gg-ot 20 gl reakcióelegyben [66 mM trisz (pH=7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2,5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM ATP] 5 egység T4 DNS ligáz segítségével összekapcsolunk. Ezután 150 gl-nyi kompetens E.coli HB101 sejthez [F~, hsdS20 (Γ, m~), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xay-5, mtl-1, supE44, lambda-] hozzáadunk 1 gl ligáz-reakcióelegyet, az elegyet 30 percig 0 °C-on inkubáljuk, majd 2 perc 42 °C-on való inkubálással a sejteket a DNS-sel transzformáljuk. Kompetens E.coli baktériumok előállítása: az E.coli sejteket LB-táptalajban (10 g/1 Trypton, 5 g/1 élesztő kivonat, 5 g/1 NaCl, pH=7,5) szaporítunk OD600nm=0,3 értékig, majd lecentrifugáljuk. A baktériumokat 0,5 térfogat jéghideg 50 mM CaCl2 oldatban reszuszpendáljuk és 30 percig inkubáljuk. Újbóli centrifugálás után a baktériumokat a kiindulási térfogat 1/15 részének megfelelő 50 mmólos CaCl2 oldatban reszuszpendáljuk. A baktérium szuszpenziót 50 gg/ml ampicillint tartalmazó LB-agar lemezekre (LB-táptalaj + 15 g/1 agar) szélesztjük. A lemezeket 16 órán át 37 °C-on inkubáljuk és a kifejlődött telepek közül 12
HU 206 896 B telepet kiválasztunk és belőlük mikro-mérctekben izoláljuk a plazmidokat [H. C. Bimbóim és J. Doly, J. Nucl. Acids Rés., 7, 1513 (1979)]. A szerkezet helyességéről kétszeres restrikciós enzimes emésztéssel Pstl-BamHI, Pstl-PvuII, EcoRI-BamHI - és az ezt követő gélelektroforézissel győződünk meg. Egy plazmidot kiválasztottunk és parpATER33 elnevezéssel láttuk el. AparpATER33-al transzformált E.coli Apr (ampicillin rezisztencia) és Tcr (tetraciklin rezisztencia) fenotípust mutat.
2. példa
A pRHW14 plazmid előállítása gg parpATER33-at 150 gl reakcióelegyben HíndlII-mal és BamHI-gyel duplán megemésztünk. A keletkezett három DNS fragmentumot 1%-os agaróz gélben választjuk el és a nagyobb, körülbelül 3.750 bázis pár (bp) hosszú fragmentumot izoláljuk (a fragmentum). Ez a fragmentum hordozza a triptofán promoter/operátort (Serratia marcescens), a replikációs origót, valamint az Apr gént.
A pRHW12-ből ugyancsak 10 gg-ot 150 gl reakcióelegyben emésztünk BamHI-gyel és HindlII-mal. A keletkezett két fragmentumot gél-elektroforézissel választjuk el és a kisebb, mintegy 800 bp hosszú fragmentumot, amely az IFN-omegal (Gly) gént tartalmazza, izoláljuk (b fragmentum).
ng a fragmentumot körülbelül 50 ng b fragmentummal hozunk össze 10 gl reakcióelegyben és a fragmentumokat 5 egység T4 DNS ligáz segítségével öszszekapcsoljuk. A ligázos reakcióelegyhez 200 gl E.coli HB101 szuszpenziót keverünk, a baktériumokat 42 °Con való hősokkolással transzformáljuk és 50 gg/ml ampicillin tartalmú LB-agar lemezekre szélesztjük. A lemezeket 16 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután 6 telepet kiválasztottunk és a baktériumokból mikroeljárással izoláltuk a plazmid DNS-t. A DNS-t EcoRl, HindlII, Ncol, illetve PstI restrikciós endonukleázokkal emésztettük, s a fragmentumok gél-elektroforézissel való analízise azt mutatta, hogy a plazmidok közül egy rendelkezett a kívánt szerkezettel. Ezt a plazmidot pRHWl4 jelzéssel láttuk el. A pRHW14-gyel transzformáit E.coli Apr és Tcs fenotípust mutat.
3. példa
A plazmid-kódolta proteinek kimutatása
A plazmid-kódolta proteineket maxi-sejt rendszerrel mutathatjuk ki [A. Sancar, A. M. Hack és W. D. Rupp, J. BacterioL, 137,692-693 (1979)].
E célból E.coli CSR603 sejteket (F, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-l, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, lambda-, supE44] transzformálunk pRHW12 és pRHW14 plazmiddal és a sejteket expressziós táptalajban [10 g/1 ammónium-foszfát, 3,5 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát (pH=7,3), 0,5 g/1 nátrium-klorid, 21 g/1 kazein-hidrolizátum (savas hidrolizátum, vitaminmentes), 11 g/1 glükóz, 1 mM magnézium-szulfát, 0,1 mM kalcium-klorid, 1 mg/1 tiamin.HCI, 20 mg/1 L-cisztein, 100 mg/1 ampicillin] tenyésztjük 37 °C-on OD600 nm =
0,6 sűrűségig. A tenyészet 10 ml-ét egy nyitott Petricsészében UV-germicid lámpával (15W) világítjuk meg 50 cm távolságról 5 másodpercig, majd 1 órán át tovább inkubáljuk. A tenyészetekhez 100 gg D-cikloszerint adunk, hogy a még szaporodásra képes baktériumokat elöljük. Ezután 16 órán át 37 °C-on inkubálunk, a baktériumokat lecentrifugáljuk, kétszer mossuk 5-5 ml Hershey-só-oldattal [5,4 g/1 NaCl, 3,0 g/1 KC1, 1,1 g/1 NH4C1, 15 mg/1 CaCl2x2H2O, 0,2 g/1 MgCl2x6H2O, 0,2 mg/1 FeCl3x6H2O, 87 mg/1 KH2PO4, 12,1 g/1 trisz (pH=7,4)], majd 5 ml Hershey táptalajban (100 ml Hershey-sóoldathoz 2,0 ml 20%-os glükózt, 0,5 ml 2%-os treonínt, 1,0 ml 1%-os leucint, 1,0 ml 2%-os prolint, 1,0 ml 2%-os arginint és 0,1 ml 0,1%-os tiaminxHCl-t adunk) inkubáljuk, mely még 20 gg/ml indol-akrilsavat (IAA) tartalmaz. Az elegyhez 5 gCi/mI 35S-metionint adunk, tovább inkubálunk 37 °C-on 1 órán át, s az újonnan szintetizálódott proteineket radioaktívan jelezzük. A baktériumokat lecentrifugáljuk és 200 gl SDS-próba-pufferben [6,6 mM nátrium-foszfát, (pH=6,8), 2 mM EDTA, 2% SDS, 3% glicerin, 0,02% brómfenolkék, 0,66% 2-merkapto-etanol] 5 percig 100 °C-on lizáljuk. A próba-anyagokat ezután 15%-os poliakrilamid gélben választjuk el [elválasztó-gél: 15% akrilamid, 0,4% bisz-akrilamid, 375 mM trisz (pH=8,8), 2 mM EDTA, 0,1% SDS; gyűjtő-gél: 6% akrilamid, 0,16% bisz-akrilamid, 375 mM trisz (pH=6,8), 2 mM EDTA, 0,1% SDS; elektród puffer: 3,0 g/1 trisz, 14,24 g/1 glicin, 0,335 g/1 EDTA, 0,5 g/1 SDS; az elektroforézis időtartama: 16 óra konstans 20 mA mellett]. A gélt 1 órán át 20% metanolt és 7,5% ecetsavat tartalmazó oldatban fixáljuk, 30 percig 5% metanol és 1% glicerin tartalmú oldatban inkubáljuk és gél-szárítóban szárítjuk. A gélt erősítő fólia (Kodak) alkalmazásával -80 °C-on Kodak X-Omat S röntgenfilmre exponáljuk.
Az ampicillin rezisztencia gén terméke (β-laktamáz) mindkét esetben erős jelzettséget mutat. Az IFNomegal azonban a pRHW14 esetében kétszer olyan erősen jelzett, mint a pRHW12 esetében (lásd a 3. ábrát).
4. példa
Az IFN-omegal (Gly) kivonása baktériumokból
A pRHWI2-vel, illetve pRHW14-gyel transzformáit E.coli HB101 sejteket 20 gg/ml IAA tartalmú expressziós táptalajban ODmo nm = 20 sűrűségig tenyésztjük. A baktériumokat úgy öljük el, hogy kénsavat adagolunk pH=2-ig és 20 °C-on 60 percig inkubálunk. A baktériumokat ekkor lecentrifugáljuk és a biomasszát -20 °C-ra lefagyasztva tartjuk a feldolgozásig. A baktériumokat 10 térfogat 1%-os ecetsavban reszuszpendáljuk. Az oldat pH-ját 10-re állítjuk be 2 n NaOH hozzáadásával és a szuszpenziót 0 °C-on 2 órán át keverjük. Ezután az anyag pH-ját 7,5-re állítjuk be 2 n HC1 hozzáadásával, majd a sejttörmelékeket lecentrifugáljuk (J2-21 Beckman centrifuga; JAI0 rotor; 4°C; 10 000 ford/perc; 30 perc). A felülúszó (nyers kivonat) interferon aktivitását a citopátiás hatás (CPE) redukciójának vizsgálatával mérjük, encephalomyocar12
HU 206 896 Β ditis (EMC) vírussal fertőzött humán A549 sejteken (emberi tüdő-karcinóma sejtvonal), IFN-a2(Arg) mint standard, használata mellett. ApRHWl2-vel transzformáit E.coli biomasszája 100000 egység/g értékű volt (három egymástól független tenyészet alapján kapott középérték), míg a pRHW14 kiónból 200000 egység/g értékű biomasszát (15 tenyészet) kaptunk.
5. példa
A hibrid interferont kifejező pRH72 klón szerkesztése
130-130 μΐ oldatban 10 μg parpATER33-at, illetve 10 μg pRHW14-et duplán megemésztjük BglH-vel és SphI-gyel. A kapott fragmentumokat 0,8 %-os agaróz gélben választjuk el, a DNS-eket eluáljuk és kicsapással tisztítjuk. Az IFN-a2/omegal(BglII)-t kifejező expressziós plazmidot ligáz reakcióval állítjuk elő úgy, hogy a paprATER33-ból származó nagy fragmentum 1 μΐ-ét a pRHW 14-ből származó kis fragmentum 5 μΐével hozzuk össze összesen 20 μΐ-ben, 5 egység T4 DNS ligáz jelenlétében. E.coli HB101 sejtek transzformálása után néhány ampicillin rezisztens kiónból mikroméretekben izoláljuk a plazmidokat és ezek szerkezetének helyességét BglII/Sphl restrikciós enzimes emésztéssel ellenőrizzük. Egy plazmidot kiválasztottunk és pRH72-nek neveztük el. Az ezzel a plazmiddal transzformált E.coli fenotípusa Apr és Tcs lesz.
6. példa
A pRH78r és pRH78fplazmidok szerkesztése
A pRHWl 4-ből származó nagy fragmentumból 1 μΐ-t és a parpATER33-ból származó, az IFN-ct2(Arg) C-terminusát kódoló BglII(2)-SphI fragmentumból 5 μΐ-t összesen 20 μΐ reakcióelegyben 5 egység T4 DNS ligáz segítségével összekapcsolunk. A kapott plazmiddal E.coli HB101 sejteket transzformálunk és az 5. példában leírtak szerint kikeresünk egy kívánt szerkezetű plazmidot. Ezt a köztes plazmidot pRH77tel jelöltük. Hogy a hibrid interferon-omegal/a2(BglII) génjét teljessé tegyük, a parpATER33nak a BglII-val való hasításakor eltávolított fragmentumát be kell vigyük a pRH77-be. Ebből a célból a pRH77 10 pg-ját 50 μΐ oldatban BglU-vel hasítjuk, az oldat térfogatát 2xCIP-pufferrel [CIP: borjúbél-foszfatáz; 2xCIP-puffer: 100 mM trisz (ph=9,0), 2 mM MgCl2, 0,2 mM ZnCl2] kétszeresére növeljük és az 5’-terminális foszfát csoportot 1 egység CIP (Boehringer-Mannheim) hozzáadásával eltávolítjuk (60 perc, 37 °C). A linearizált pRH77-et agaróz gélben elektroforetizáljuk, a DNS-t eluáljuk, majd kicsapással tisztítjuk. A DNS-t 20 μΐ TE-pufferben vesszük fel, amelyből 1 μΐ-ta parpATER33-nak BglII/SphI-gyel való emésztése révén nyert 263 bp fragmentuma [BglII(l)BglII(2) fragmentum] 5 μΐ-ével hozzuk össze és összesen 10 μΐ reakcióelegyben 5 egység T4 DNS ligáz használatával kapcsoljuk össze e fragmentumokat. A termékkel E.coli HB101 sejteket transzformálunk. A kapott telepek közül 6 telep DNS-ét analizáltuk. Minthogy a 263 bp fragmentum beépülése az identikus végek miatt kétféle irányítottsággal mehet végbe, a plazmidokat a szerkezet helyessége szempontjából Alul és Haell restrikciós endonukleázok segítségével vizsgáljuk meg. Azt a plazmidot, amelybe a BglII fragmentum az expresszió szempontjából megfelelő helyzetbe épült be, a pRHW78r-nek, s azt, amelybe az expresszió szempontjából helytelen irányba épült be, pRHW78fnek neveztük el. A pRH78r-rel, illetve a pRHW78f-fel transzformált E.coli fenotípusa Apr, Tcr.
7. példa
Az inteiferon-(antivirális)-hatás megállapítására szolgáló lizátum-teszt
A különböző plazmidokkal transzformált E.coli sejteket 35 ml 20 pg/ml IAA tartalmú expressziós táptalajban tenyésztjük 37 °C-on ODgoo nm = 0,6 sűrűségig. A baktériumokat 3,5 ml 50 mM trisz (pH=7,6) és 30 mM MgCl2 tartalmú oldatban vesszük fel és jéghűtés mellett ultrahang-dezintegrátorban (MSE; Soniprep 150) maximális teljesítménnyel tárjuk fel a sejteket. A szuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (J2-21 centrifuga; 10000 ford/perc; 4 °C; JA20 rotor) és a felülúszót sterilre szűrjük. Az oldat antivirális aktivitását CPE redukciós vizsgálattal (A549 sejtek, EMC-vírus) határozzuk meg.
A pRH72-vel [IFN-a.2/omegal(BglII)] transzformáit E.coli éppen úgy nem fejt ki antivirális hatást, mint a pRH78f-fel transzformált E.coli. A pRH78f az érett IFN-omegal első 64 aminosavát kódolja, s ezt követően egy szerint.
Ezzel szemben, amikor a pRH78r klón 1 liter tenyészetben ODgoo nm = 1 baktérium-sűrűség mellett, körülbelül 30xl06 interferon egységet [IFN-a2(Arg) standarddal összehasonlítva] termel, az IFN-omegal/<x2(BgIII) négyszer nagyobb specifikus antivirális hatást mutat A549 sejteken, mint az IFN-o2(Arg).
Az alábbi táblázat bemutatja, hogy az IFN-omegal/a2(BglII) hibrid interferon, mely aminosavai változnak meg az IFN-a2(Arg)-hoz képest.
Pozíció IFN-CC2 (Arg) IFN-ome- gal/a2 Változás
7. Thr Asn P P
9. Ser Gly P P
11. Gly Leu P 1
14. Arg Asn b P
17. Met Val (1) 1
20. Alá His 1 b
27. Leu Pro 1 1
29. Ser Leu P 1
38. Gly Arg P b
43. Glu Met a (1)
44. Phe Val ar 1
45. O Lys 0 b
47. Asn Ser P P
49. Phe Leu ar 1
HU 206 896 Β
Pozíció IFN-tt2 (Arg) IFN-omc- gaf/a.2 Változás
53. Glu His a b
54. Thr Val P 1
55. 11c Met 1 (1)
56. Pro Ser 1 P
62. Ile Leu 1 1
Magyarázat:
a - savanyú, ar « aromás, b ~ bázikus, 1 = apoláris, p = poláros, o ·= ebben a pozícióban nincs aminosav.
Töltés különbségek (pozíció):
1) 1 pozitív töltés vezetés: 14 15
2) 4 pozitív töltés nyerés: 20, 38 , 45, 53
3) 2 negatív töltés vezetés: 43, 53
A hibridnek öttel több pozitív töltése van, mint az
IFN-a2(Arg)-nak.
9. példa
Az IFN-ómegáila2(BgJII) tisztítása
Az E.coli HB101/pRH78r klónból származó, savval kezelt és -20 °C-on lefagyasztva tartott anyag 145 g-ját 1450 ml 1%-os sósavban jéghűtés mellett a 25 teljes eloszlásig keverjük (körülbelül 30 perc), majd 2 X 1 percig T 45/6 Ultra-Turrax készülékben (Janke és Kunkel) 10000 ford/perc mellett homogenizáljuk. Ezután Polyamin P-t (Serva, katalógus szám: 3314) adunk a homogenizátumhoz 0,25% koncentrációig és 30 pH-ját 5 M NaOH-val 10,0-ra állítjuk be. Két órás keverés következik jéghűtés mellett, majd a pH-t 5 n HCl-dal 7,5-re állítjuk be és ezután a nyers kivonatot centrifugálással derítjük (Christ Cryofuge 6-6 S;
3000 ford/perc; 1 óra; körülbelül 4 °C). 35
Az interferon kicsapásához a nyers kivonathoz 430 g/1 ammónium-szulfátot adunk és a teljes kicsapódás eléréséhez 16 órán át 4-8 °C-on állni hagyjuk. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze (J2-21 Beckman centrifuga; JA10 rotor; 10000 ford/perc; 40 60 perc; 4-8 °C). Az ammónium-szulfátos üledéket 145 ml 0,01 mólos NaCl-ban vesszük fel és a szuszpenzió pH-ját 5 M NaOH-val 7,5-re állítjuk be. Három órás keverés után (jéghűtés) az oldatot élesre centrifugáljuk (.12-21 Beckman centrifuga; JA 10 rotor; 45
10000 ford/perc; 4 °C; 60 perc) és ezután NephrossAllegro dializáló patron (Organon cég) segítségével 0,01 mólos NaCl-dal szemben addig dializáljuk, amíg az interferon oldat ozmolaritása a 370 mOsm/1 értéket el nem éri.
Tandem-kromatográfia: a kromatográfiás tisztításhoz egy 75 g-os DE-52 cellulóz oszlopot (Whatman) 0,025 M triszxHCl + 0,2 M NaCl tartalmú oldattal (pH = 7,5) kiegyensúlyozunk és ezt egy olyan affinitás oszlop (60 ml) elé iktatjuk be, amely a Sepharose 4Bhez (brómciánnal aktivált Sepharose 4B, előállítja a Pharmacia cég) kötött EBI-1 monoklonális antitestet (lásd az EP-A-0 119476 számú európai közzétett szabadalmi bejelentést) tartalmazza. Az affinitás oszlop 480 mg EBI-1 monoklonális antitestet tartalmaz és az oszlopot ugyancsak triszxHCl + NaCl (pH = 7,5) tartalmú oldattal, mint fent leírtuk, kiegyensúlyozzuk. Az interferon oldatot mindkét oszlopon átnyomatjuk, majd addig mossuk az oszlopokat 0,025 M triszxHCl + 0,2 M NaCl tartalmú oldattal, míg az eluátumban jóval 0,1 extinkció alatti értéket (OD280 nm) nem mérünk. Ezután az előtét oszlopot (DE-52 cellulóz) lekapcsoljuk és az EBI-1 oszlopot tovább mossuk, míg az eluátum protein-mentes nem lesz (OD280 nm értéke az eluátumban 0,01 alatt lesz). Az adszorbeált interferont ekkor 0,1 M citromsavat tartalmazó 25%-os etilénglikollal eluáljuk. A protein csúcs anyagát összegyűjtjük.
Az antitest-oszlop savanyú eluátumát 2 M NaOHval pH=4,5-re állítjuk be és a keletkező csapadékot lecentrifugáljuk.
Az utolsó tisztítási lépésben ioncserélő kromatográfiai alkalmazunk Mono-S (Pharmacia) hordozó alkalmazásával. Egy 1 m töltet-térfogatú oszlopot (HR 5/5)FPLC készülékhez (Pharmacia) csatolunk és 0,1 mólos nátrium-citrát oldattal (pH=4,2) kiegyensúlyozzuk. Az oszlopra felvisszük az interferon-oldatot és az adszorbeálódott interferont pH-gradiens segítségével eluáljuk [A puffer = 0,1 mólos nátrium-citrát (pH=4,2); B puffer = 0,1 mólos nátrium-foszfát (pH=8,0)]. Az ómega 1-interferon pH=7,0-nél eluálódik. Az IFN csúcsot összegyűjtjük (lásd a 6. ábrát).
Az IFN-omegalla2(BgIÍI) tisztításának áttekintése
Kiindulási anyag: 145 g E.coli HB101/pRH78r
Térfogat ml IFN*-egység Protein** mg Egység mg Kitermelés %
Nyers kivonat 1470 16,9xl09 3000 5,6x106 100
Ammónium-szulfátos kicsapás és dialízis után 246 14,0xl09 1970 7, lxlO6 83
Az antitcstoszlop ehiátuma 11,1 10,3x109 12,9 800x106 61
Feliilúszó (pH=4,5) 11,9 7,4x109 9,3 800x106 44
Mono-S utáni pool 6,9 4,6x109 7,0 660x106 27
Az interferon tartalom meghatározását az antivirális aktivitás mérésével végezzük (CPE-redukciós teszt) A549 sejtek és EMC-vírus segítségével, s az IFN-a2(Arg) standardként szolgál.
A protein meghatározásokat a Bio-Rad-féle praiein-assay-vel végezzük. .
HU 206 896 B
A tisztítási eljárás elemzése
A tisztított hibrid interfeiOn-omegal/a2(BglII) homogén anyag (lásd a 7. ábrát-gélpenneációs HPLC). Az elért specifikus aktivitás körülbelül 800xl06 egység/mg protein, amely magasabb, mint ami az IFN-a2(Arg)-vel elérhető (körülbelül 300xl06 egység/mg protein).
10. példa
HuIFN-ómegái elleni monoklonális antitest előállítása
a) Immunizálás
Két nőstény, körülbelül 8 hetes Balb/c egeret nagyfokú tisztaságú IFN-omegal/a2(BglII)-vel [tisztaság >95%; 0,1 mólos nátrium-foszfát/nátrium-citrát (pH=7) oldatban oldva] immunizálunk a következőképpen:
1. immunizáló oltás: komplett Freund adjuvánsban emulgeált 100 gg IFN-omegal/a2(BglII)-t injiciálunk intraperitoneálisan;
2. immunizáló oltás: az első oltás után egy hónappal inkomplett Freund adjuvánsban emulgeált 100 gg IFN-omegal/a2(BglII)-t injiciálunk intraperitoneálisan,
A második oltás után tíz nappal próbavért veszünk. A szérumoknak azon képességét, hogy hogyan neutralizálják a HuIFN-omegal, HuIFN-a2(Arg) és IFNomegal/a2(BglII) antivirális aktivitását, a következőképpen vizsgáljuk:
A próbavér sejt-tápoldattal való hígításainak 100 gl-ét 100 gl IFN oldattal (100 antivirális egység/ml; sejt-tápoldatban) keverjük össze és a keveréket 90 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a próbavérek antivirális hatását biológiai módszerrel (A549 tüdŐkarcinóma sejtek, EMC-vírus) határozzuk meg:
Szérumhígítás egér-l egér-2
ómegái a2 (Arg) ómega 1/α2 ómegái a.2 (Arg) ome- gal/a2
IFN-készítmény
1: 100 + + + - - +
1: 1000 - - + - - +/-
1:10000 - - - - - -
Jelölések: + teljes neutralizáciő +/- részleges neutralizáció - nincs neutralizálló hatás
Négy héttel a második oltás után az egér-1 további 100 gg IFN-omegal/a2(BglII)-t kap intravénás injekcióban. Három nappal később a lépét kivesszük hibridoma előállítás céljára.
Három héttel a második oltás után folytatjuk az egér-2 immunizálását: 100 gg lFN-omegal/a2(BglII)t kap szubkután oltással. Két hét múlva újra próbavért veszünk, s ez a fenti vizsgálatban, 1:100 hígításban, részleges neutralizáló hatást mutatott HuIFN-omegalnél. A harmadik oltás után négy héttel 100 gg IFNomegal/a2(BglII)-t adunk intravénásán injiciálva és négy nap múlva kivesszük a lépét hibridoma előállítás céljára.
b) Hibridomák előállítása és szűrése
A hibridomák előállítása az eredetileg Köhler és Misstein [Natúré, 256, 495 (1975)] által kidolgozott módszer szerint történik, a nem-szekretáló P3X 63 Ag8.653 sejtvonal [Keamey és munkatársai, J. Immunoi., 123,1548 (1979)] alkalmazásával. A fúzióhoz 50%os polietilén-glikolt (4.000) használunk 5% dimetilszulfoxiddal (DMSO). A hibrid sejtek szelektálása HATtáptalajban történik szintén ismert eljárások segítségével [lásd: Monoclonal Antibodies: Production and Maintenance, Lovborg; U. William Heinemann Medical Books, London, (1982); R. H. Kennet, T. J. McKeam és K. B. Bechtol: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press New York és London (1980)]. Két fúzióból összesen 730 hibridoma tenyészetet kaptunk. A szűrést a következőképpen végezzük.
Az összefolyt hibridoma tenyészetek legalább 1020%-ának felülúszóit azonos mennyiségű HuIFN-omegal (20 antivirális egység/ml) oldattal keverjük, a keveréket 90 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd antivirális aktivitásra szűrjük. Minden tenyészetet 1 hetes időközönként legalább kétszer tesztelünk. A 730 hibridoma tenyészet közül minden vizsgálatnál csak egynél mutatkozott rendszeresen az antivirális hatás redukciója. Ezt a tenyészetet a következőkben OMG-2-nek neveztük, határ-hígításos módszerrel szubklónoztuk, majd a szubklónok aktivitását újból vizsgáltuk a leírt teszt módszerrel. Számos szubklónt pristan-nal előkezelt egerekbe oltottunk be. A szubklónok közül egyet találtunk, amely minden egérben antitest tartalmú aszcitesz folyadék képződését idézte elő. Az antitest tartalmat 50%-os telítettségű ammónium-szulfáttal való kicsapással részlegesen tisztítottuk. A kapott tennék mintegy 75%-os tisztaságú antitestet tartalmaz (gélpenneációs HPLC-vel meghatározva). Az aszcitesz folyadék 1 ml-éből körülbelül 10 mg antitest nyerhető. A további tisztítás, mely 95%-os tisztaságot jelent, anioncserélő kromatográfiával érhető el.
c) Az OMG-2 antitest vizsgálata
SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel vizsgálva nem redukáló körülmények között - az OMG-2 molekulasúlya körülbelül 150000-re tehető. Gélszűréses HPLC-vel vizsgálva, az antitest egy IgG-niarker-proteinnel azonos retenciós tulajdonságot mutatott. így tehát az antitest valószínűleg IgG típusú.
Neutralizációs vizsgálatban (10/b példa) az ammónium-szulfáttal részlegesen tisztított antitest a következő eredményeket adta:
Antitest-kon- centráció gg/ml ómegái alfa2 omegal/a2
IFN-készítmény
5000 +/- +/-
1000 - - +
100 - - +
10 - - +/-
1 -
HU 206 896 B
Az antitest erős neutralizáló hatást mutat az egerek immunizálására használt hibrid IFN-omegal/a2(BglII)-vel szemben, és mintegy 500-szor gyengébb hatással van a HuIFN-a2(Arg)-ra és HuIFNomegal-re. A HuIFN-omegal-gyel szembeni nyilván- 5 valóan csekélyebb affinitás ellenére az OMG-2 antitest eredményesen alkalmazható ezen interferon immunaffinitás kromatográfiájánálY (lásd all. példát).
11. példa
a) Extrahálás és CPG-kromatográfia
A pRHW14 klónból származó, savval kicsapott és
-20 °C-on mélyfagyasztott E.coliból 794 g-ot 7.700 ml %-os ecetsavban jéghűtés közben az anyag teljes eloszlásáig keverünk (körülbelül 30 perc), majd 2 M NaOHval a szuszpenzió pH-ját 10-re állítjuk be. A szuszpenziót órán át jéghűtés közben keverjük, pH-ját 7,5-re állítjuk be (2 M HC1) és tisztára centrifugáljuk (1 óra; 10000 ford/perc; 4 °C; J2-21 Beckman centrifuga; JalO rotor). A tiszta felülúszót egy 500 ml-es CPG oszlopon (controlled poré glass, CPG 10-350, 120-200 mesh, Electronucleonics Inc,, USA) nyomatjuk át 50 ml/óra sebességgel, majd az oszlopot 0,025 mól triszxHCl + 1 mól NaCl (pH=7,5) tartalmú oldattal gondosan utánmossuk.
Az oszlopon adszorbeálódott interferont ezután 0,025 mólos triszxHCl + 1 mólos KSCN 50%-os etilénglikolos elegyével eluáljuk (50 ml óránként). Az IFNpoolt ezután 0,025 M triszxHCl + 0,1 M NaCl tartalmú oldattal szemben dializáljuk, ugyanakkor a külső oldathoz 10% polietilénglikol 40000 hozzáadásával egyidejűleg az IFN-pool koncentrálását is elvégezzük. A dializált koncentrátumot centrifugálással derítjük (1 óra;
000 ford/perc; J2-20 Beckman centrifuga; JA-20 rotor).
b) Affinitás kromatográfia OMG-2-Sepharose oszlopon.
A tisztított monoklonális OMG-2 antitestet BrCN-al aktivált Sepharose 4B segítségével, az előállító Pharmacia cég előírása szerint, Sepharose 4B hordozóra kötjük, s 16 mg monoklonális antitestet használunk fel az aktivált Sepharose 4B 1 grammjához. Az elválasztáshoz egy 8 ml térfogatú affinitás oszlopot használunk.
A 11/a példában kapott CPG-oszlop-koncentrátumot 4 ml/perc sebességgel átnyomatjuk az affinitás oszlopon, majd ezután az oszlopot 0,025 M triszxHCl + 0,1 M NaCl (pH=7,5) tartalmú oldattal addig mossuk, amíg az eluátum protein-mentes nem lesz, az eluátum OD2g0 nin értéke azonos lesz a mosópufferével. A megkötött interferont ekkor 2 ml/perc sebességgel,
0,1 mólos citromsavval - 25%-os etilénglikolban - eluáljuk és a protein-csúcsot (OD280 J összegyűjtjük.
c) Ioncserélő kromatográfia Mono-S hordozón
A Mono-S hordozóanyagot tartalmazó 1 ml-es oszlopot (HR 5/5; mindkettő a Pharmacia gyártmánya) FPLC készülékhez (Pharmacia) csatlakoztatjuk. Az ioncserélő oszlopot 0,1 mólos kálium-foszfáttal (pH=6,0) - 25%-os propilén-glikolban - kiegyensúlyozzuk, majd a 11/b példa szerinti affinitás oszlopról kapott eluátumot 0,5 ml/perc sebességgel átnyomatjuk az oszlopon. Az adszorbeált interferont NaCl gradiens segítségével eluáljuk [B puffért 0,1 M kálium-foszfát 0,1 M NaCl (pH=6,0); 25%-os propilénglikolban]. A frakciók (1-1 ml-ek) interferon aktivitását meghatározzuk. A 46% B puffernél megjelenő első csúcs (OD2g0 nm) tartalmazza az interferon-omegát (lásd a 8. ábrát).
d) Reverz-fázisú HPLC
Stacioner fázisul egy Bakerbond WP-RP 18 oszlop szolgál (4x250 mm; részecske-átmérő: 5 p.m: pórus átmérő: 300 A).
A mobil fázis acetonitril gradiens, 0,1%-os trifluorecetsavban.
A puffer = 0,1 %-os trifluor-ecetsav vizes oldata;
B puffer = 0,1%-os trifluor-ecetsav acetonitriles oldata;
Gradiens = 20-68% B puffer 28 perc alatt;
Átfolyási sebesség: 1 ml/perc;
Leolvasás = OD2t4 nm mellett.
A 11/c példa szerint kapott proteinből (Mono-S-ről leoldott IFN-pool) 630 pg-ot vittünk fel az oszlopra. Az eluátumot a 48-65% B-puffer tartományban vizsgáltuk. Az interferon-omegal 24,5 perces retenciós időnél oldódik le 63% B puffernél (lásd a 9. ábrát). A kitermelés 5-10 μg, a specifikus aktivitás >108 egység/mg protein.
e) Az N-terminális aminosav szekvencia meghatározása
A 11/d példa szerint kapott IFN-omegal-csúcsot (RP-HPLC) Speedvac centrifugában szárítjuk és a 470A típusú szekvencia analizátorban (Applied Biosystem) analizáljuk.
A következő aminosav szekvenciát kaptuk:
Xxx-Asp-Leu-Pro-Gln-Asn-Xxxs-Gly-Leu-Leu-Ser1 5 10
Ez a szekvencia igazolja a cDNS-bó'l levezetett aminosav sorrendet (az 1-es helyen lévő cisztein a protein redukciója és alkilezése nélkül nem mutatható ki és a 7-es helyen lévő hisztidint nem lehetett egyértelműen kimutatni).
Az IFN-omegal tisztításának áttekintése
/. Extrakció és CPG-kromatográfia
Menny, ml IFN*-egys. Protein*” mg Egység mg Kitermelés %
Nyers kivonat 7700 190.106 19100 9950 100
CPG utáni pool 425 53.106 % 4600 , 11500... .. 28
Dialízis után 410 45.106 . . 1650 . 27300 / . 24
HU 206 896 B
2. Affinitás kromatográfia OMG-2-Sepharose-on
Menny, ml IFN*-egy. Protein** mg Egység mg Kitermelés %
Felvitt anyag 350 40,6.106 1520 26700 100
Nem abszorbeálódott 440 4,5.106 - - 11
Eluált IFN-omega 1 25,6.106 2,84 9.106 63
3. Ioncserélő kromatográfia Mono-S-en
Menny, ml lFN*-egys. Protein** mg Egység mg Kitermelés %
Felvitt anyag 7 7,14.106 2,84 2,5.106 100
IFN-omega-pool 2 3,04.106 0,72 4,2.106 43
*) Az interferon tartalom meghatározása úgy történik, hogy az antiviráiis aktivitást mérjük (CPE-redukciós teszt) A549 sejtek és EMC-vírus segítségével. Standard: rlFN-a2(Arg). Az adatok három független vizsgálat középértékéi reprezentálják.
**) A protein meghatározások a Bio-Rad-féle protein-assay segítségével történtek. Standard: szérum-albumin.

Claims (39)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű hibrid interferonok, ezek N-terminális Met- vagy N-formil-Met-származékai, valamint, ha a hibrid interferon peptidszekvenciája glükozilációs helyet tartalmaz, ezek N-glükozilált származékai előállítására - az
    Rj-Gln Ile Phe-R2
    CAGATCTTC (I)
    BglII általános képletben
    BglII az ctl-, ct2- és omega-interferon közös BglII restrikciós helye,
    R, az al- vagy a2-interferon peptidszekvenciája, amelyet az illető interferonban levő BglII hasítási hely előtti DNS szekvencia kódol, és
    R2 egy omega-interferon peptidszekvenciája, amelyet egy ilyen interferonban levő BglII hasítási hely utáni DNS szekvencia kódol, vagy pedig
    Rí egy omega-interferon peptidszekvenciája, amelyet az interferonban levő BglII hasítási hely előtti DNS szekvencia kódol, és
    R2 egy al- vagy a2-interferon peptidszekvenciája, amelyet az illető interferonban levő BglII hasítási hely utáni DNS szekvencia kódol azzal jellemezve, hogy egy megfelelő bakteriális gazdaszervezetet a fenti interferonokat kódoló DNS szekvenciákat hordozó expressziós vektorral transzformálunk, a transzformánsokat tenyésztjük, és az így kapott hibrid interferont a gazdaszervezetből izoláljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan hibrid interferonok előállítására, ahol az α-interferon rész az IFN-a2(Arg) és az ω-interferon rész az <nl(Glu)- vagy (úl(Gly)-interferon peptidszekvenciája, azzal jellemezve, hogy egy megfelelően transzformált gazdasejtet tenyésztünk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás
    5 10 15 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 20 25 30 Met Leu Leu Alá Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 35 40 45 Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn 50 55 60 Gin Phe Gin Lys Alá Glu Thr Ile Pro val Leu His Glu Met Ile 65 70 75 Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Alá Alá 80 85 90 Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His Gin
    HU 206 896 B
    Gin Leu Gin His 95 Leu Glu Thr Cys Gly Glu Ser Alá 110 -X- Alá Ile Ser Arg Tyr Phe Gin 125 Gly Ile Arg Val Ser Asp Cys Alá 140 Trp Glu Val Val Leu Phe Leu Ser 155 Thr Asn Met Gin Arg Asp Leu Gly 170 Ser Ser
    Leu 100 Leu Gin Val Val Gly 105 Glu Ser 115 Pro Alá Leu Thr Leu 120 Arg Tyr 130 Leu Lys Glu Lys Lys 135 Tyr Arg 145 Met Glu Ile Met Lys 150 Ser Glu 160 Arg Leu Arg Ser Lys 165 Asp
    képletű-a képletben X jelentése Gly vagy Glu IFN-a2/cűl(BglII)-hibrid interferonok, ezek N-terminális Met- vagy N-formil-Met-származékai és N-glükozilált származékai előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelően transzformált gazdasejtet tenyésztünk.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás
    Cys 5 Leu 10 Leu Ser Arg Asn Thr 15 Leu Asp Leu Pro Gin Thr His Ser 20 25 30 Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu 35 40 45 Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met val Lys Gly 50 55 60 Ser Gin Leu Gin Lys Alá His Val Met Ser Val Leu His Glu Met 65 70 75 Leu Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Alá 80 85 90 Alá Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 95 100 105 Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Alá Cys Val Ile Gin Gly Val Gly 110 115 120 Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Alá Val 125 130 135 Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys GLu Lys Lys 140 145 150 Tyr Ser Pro Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Alá Glu Ile Met Arg 155 16 0 165 Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys
    170
    Glu
    HU 206 896 B képletű IFNwl/a2(BglII)-hibrid interferon, N-terminális Met- vagy N-forrnil-Met-származékai és N-glükozilált származékai előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelően transzformált gazdasejtet tenyésztünk.
  5. 5. Eljárás antivirális hatású gyógyszerkészítmények 5 előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1-4. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű hibrid interferont a gyógyszertechnológiával szokásos hordozó, hígító és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
  6. 6. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított hibrid interferont kódoló rekombináns DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibrid egyes részeinek megfelelő szakaszokat kódoló DNSszekvenciákat izoláljuk és összekapcsoljuk (ligáljuk).
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás IFNa2/ml(BglII)hibrid interferont és ennek degenerált változatait kódoló,
    ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC 45 TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC 90 TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC 135 AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG 180 ATC CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315 GAA GGA GAA TCT GCT GTG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 405 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 495 GAT AGA GAC CTG GGC TCA. TCT TGA
    519 általános képletű a képletben Y jelentése G vagy A nukleotid DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az IFNa2-t kódoló DNS szekvenciát és az ωΐ-interferont kódoló DNS szekvenciát izoláljuk és összekapcsoljuk. 30
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás egy IFNml/a2(BglII)-hibrid interferont és ennek degenerált változatait kódoló,
    ATG TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAG ACC 45 TTG GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TCG TGT 90 CTC AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA ' 135 GGG AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG 180 ATG CTG CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT 225 GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC 270 TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG 315 GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT 360 GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG 405 AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG 450 AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT 495 AAG GAA TGA * 504
    képletű DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az IFNol-et kódoló DNS szekvenciát és az IFNa2-interferont kódoló DNS szekvenciát izoláljuk és 50 összekapcsoljuk.
  9. 9. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított hibrid interferont vagy köztitermékét kódoló vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibrid interferont vagy köztitermékét kódoló, a 6-8. igénypon- 55 tok valamelyike szerint előállított DNS molekulát egy alkalmas vektorba beépítjük.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok valamelyike szerinti DNS molekulát az expresszióhoz szükséges replikon és szabályozó szekvenciákkal, adott esetben egy par-lókusz-szal kapcsoljuk össze.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy replikon és szabályozó szekvenciaként a pER103 plazmidból származó,
    5' AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC
    3 ' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG | <--promoter 19
    HU 206 896 B
    GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGG AGGTTTAAGCT CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA - prompter/operátor->|<—mRNS-start- RBS—linker
    TAAAGATGTGT- -----ATTTCTACACACTAG -- - - --> | <---gén--) képletű szekvenciát vagy ennek egy trp-promoter akti-
  12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, vitásé változatát használjuk. hogy par-lókuszként a pPM31 plazmidból származó,
    GAATTCCGAC AGTAAGACGG GTAAGCCTGT TGATGATACC GCTGCCTTAC 50 TGGGTGCATT AGCCAGTCTG AATGACCTGT CACGGGATAA TCCGAAGTGG 100 TCAGACTGGA AAATCAGAGG GCAGGAACTG CTGAACAGCA AAAAGTCAGA 150 TAGCACCACA TAGCAGACCC GCCATAAAAC GCCCTGAGAA ZCCGTGACGG 200 GCTTTTCTTG TATTATGGGT AGTTTCCTTG CATGAATCCA TAAAAGGCGC 250 CTGTAGTGCC ATTTACCCCC ATTCACTGCC AGAGCCGTGA GCGCAGCGAA 300 CTGAATGTCA CGAAAAAGAC AIVCGACTCAG GTGCCTGATG GTCGGAGACA 350 AAAGGAATAT TCAGCGATTT GCCCGAGGAA TTC 383 képletű a képletben Z helyén G vagy C nukleotid áll, W helyén G nukleotid áll, vagy ezen a helyen nincs nukleotid szekvenciát használjuk.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás a parpATER33 25 jelű plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pAT153 jelű plazmidban a BamHI-PstI fragmentumot a parpER33 jelű plazmidból származó BamHI-PstI fragmen tu mma 1 he ly ettesí tj ü k.
  14. 14. A 9. igénypont szerinti eljárás ωΐ-interferont 30 kifejező plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a parpATER33 plazmid HindlII-BamHI emésztésével kapott nagyobb (körülbelül 3750 bp hosszúságú) fragmentumot egy ωΐ-interferont kódoló plazmid HindlIIBamHI emésztésével kapott kisebb (körülbelül 800 bp hosszúságú) fragmentumával ligáljuk.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás pRHW13 vagy pRHW14 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a paprATER33 plazmid nagyobb HindlII-BamHI fragmentumát egy ωΐ-interferont kódoló plazmid HindlII-BamHI emésztéssel kapott, a
    TGT GAT CTG GCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 45 GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 90 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 135 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 180 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315 GAA GGA GAA TCT GCT GYG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 405 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 495 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT 516
    általános képlettel a képletben Y jelentése A vagy G nukleotid ábrázolt DNS szekvenciajú ωΐ-interferon gént vagy ennek degenerált változatait tartalmazó kisebb fragmentummal ligáljuk.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás a pRHW13 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a parpATER33 plazmid nagyobb HindlII-BamHI fragmentumát a pRHWll plazmidból izolált, az Y helyén A nukleotidot tartalmazó (ül-(GIu)-interferon gént magában foglaló fragmentummal ligáljuk.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás a pRHW14 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a parpATER33 plazmid nagyobb HindlII-BamHI fragmentumát a pRHW12 plazmidból izolált, az Y helyén G nukleotidot tartalmazó ml-(Gly)-interferon gént magában foglaló kisebb fragmentummal ligáljuk.
  18. 18. A 9. igénypont szerinti eljárás a pRH72 jelű expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a parpATER33 plazmid BglII-vel és PphI-gyel végzett emésztésével kapott nagyobb fragmentumot ligáljuk a pRHW14plazmid BglII-vel és SphI-gyel végzett emésztésével kapott kisebbik fragmentummal.
  19. 19. A 9. igénypont szerinti eljárás a pRH77 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pRHW14 plazmid BglII-vel és SphI-gyel végzett emésztésével kapott nagyobb fragmentumot ligáljuk a parpATER33 plazmid BglII(2)-vel és SphI-gyel végzett emésztésével kapott, az IFN-ct2(Arg) C-terminálisát kódoló kisebb fragmentummal.
    HU 206 896 Β
  20. 20. A 9. igénypont szerinti eljárás a pRH78r expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pRH77 plazmidot BglII-vel linearizáljuk, és a paipATER33 BglII/Sphl emésztésekor keletkező 263 bp méretű BglII(l)—BgiII(2) fragmentummal Ii- 5 gáljuk.
  21. 21. Eljárás (I) általános képletű hibrid interferon vagy közti terméke genetikai információit tartalmazó transzformált gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy prokarióta vagy eukarióta sejtet a 10
    9-20. igénypontok valamelyike szerint előállított vektorai transzformálunk.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás transzformált bakteriális gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy enterobaktériumot, például E.coli-t, Bacillus 15 subtilist, Serratia marcescenst vagy egy Pseudomonast transzformálunk.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás transzformált bakteriális gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy E.coli HB101 sejteket transzformálunk. 20
  24. 24. A 21. igénypont szerinti eljárás ωΐ-interferont kifejező transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy prokarióta vagy eukarióta sejtet egy 14-17. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós plazmiddal transzformálunk. 25
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás ωΐ-interferont kifejező transzformált bakteriális gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy E.coli HBlOl-etegy 1417. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós plazmiddal transzformálunk. 30
  26. 26. A 21. igénypont szerinti eljárás
    IFNa2/(ül(BglII) hibrid interferont kifejező transzformáit bakteriális gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy E.coli HBlOl-et pRH72 expressziós plazmiddal transzformálunk. 35
  27. 27. A 21. igénypont szerinti eljárás IFNtúl/a2(BglII) hibrid interferont kifejező transzformáit bakteriális gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy E.coli HBlOl-et pRH78r expressziós plazmiddal transzformálunk.
  28. 28. Eljárás hibrid interferonok, valamint IFN-a2 és ωΐ-interferon ellen antitestet termelő, in vitro és in vivő tenyésztésre alkalmas hibrid sejtvonalak előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított hibridinterferonnal immunizált egér lépsejtjeit mieloma sejtekkel fuzionáljuk.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás hibrid sejtvonalak előállítására, azzal jellemezve, hogy BALB/c egerekből származó lépsejteket fuzionálunk a P3-X63Aq8-653 sejtvonalból származó mieloma sejtekkel.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti eljárás OMG-2 hibrid sejtvonal előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti eljárással előállított hibrid interferonnal immunizálunk.
  31. 31. Eljárás monoklonális antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy a 28-30. igénypontok bármelyike szerint előállított hibrid sejtvonalat tenyésztjük, és a keletkezett antitesteket izoláljuk.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás anti-humána2-, anti-ωΐ- és anti-hibrid-interferon specifitású egér IgGantitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2830. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított hibrid sejtvonalat szubklónozunk, majd a sejtek tenyésztése után az anti-interferon specifitású IgG-antitesteket izoláljuk.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az OMG-2 hibrid sejtvonalat tenyésztjük.
  34. 34. Eljárás a
    Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly 20 Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Lys Asp Arg Arg 35 Asp Phe Arg Phe Ser Gin Leu Gin 50 Lys Alá His Val Leu Gin Gin Ile 65 Phe Ser Leu Phe Alá Trp Asn Met 80 Thr Leu Leu Asp Gin Gin Leu Gin 95 His Leu Glu Thr
    Leu 10 Leu Ser Arg Asn Thr 15 Leu Ile 25 Ser Pro Phe Leu Cys 30 Leu Pro 40 Gin Glu Met Val Lys 45 Gly Met 55 Ser Val Leu His Glu 60 Met His 70 Thr Glu Arg Ser Ser 75 Alá Gin 85 Leu His Thr Gly Leu 90 His Cys 100 Leu Leu Gin Val Val 105 Gly
    110 115 120
    Glu Gly Glu Ser Alá -X- Alá He Ser Ser Pro Alá Leu Thr Leu
    HU 206 896 B
    Arg Arg Tyr Phe 125 Gin Gly Ile Tyr Ser Asp Cys 14 0 Alá Trp Glu Ser Leu Phe Leu 155 Ser Thr Asn Asp Arg Asp Leu 170 Gly Ser Ser
    Arg Val 13 0 Tyr Leu Lys Glu. Lys 135 Lys Val Val 14 5 Arg Met Glu 11Θ Met 150 Lys Met Gin 160 Glu Arg Leu Arg Ser 165 Lys
    általános képletű a képletben X jelentése a 111. helyzetben Glu vagy Gly - ωΐ-interferonok tisztítására, azzal, jellemezve, hogy a rekombináns úton előállított ωΐ-interferont az 1-4. igénypontok valamelyike szerinti eljárással előállított hibrid interferon elleni monoklonális antitestet tartalmazó antitest-affinitás-oszlopra kötjük, majd eluáljuk.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás rekombináns ωΐ-interferonok tisztítására, azzal jellemezve, hogy a rekombináns ωΐ-interferont a 26-27. igénypontok valamelyike szerint előállított transzformált bakteriális gazdasejtek egyike segítségével előállított rekombináns interferon elleni monoklonális antitestet tartalmazó antitest-affinitás-oszlopra kötjük, majd eluáljuk.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóhoz kovalensen kötött antitestként a humán a2-interferon, ωΐ-interferon és a 4. igénypont szerinti eljárással előállított hibrid-interferon hatását teljesen vagy részben semlegesítő monoklonális antitestet használunk.
  37. 37. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóként aktivált Sepharose-t használunk.
  38. 38. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztításhoz Mono-S kromatográfiás oszlopot használunk.
  39. 39. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként a 31-33. igénypontok bármelyike szerint előállított monoklonális antitestet használjuk.
HU87995A 1986-03-10 1987-03-09 Process for producing hibride interferons, their intermediates, pharmaceutical compositions containing them, monoclonal antibodies against them and purifying them HU206896B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863607835 DE3607835A1 (de) 1986-03-10 1986-03-10 Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44074A HUT44074A (en) 1988-01-28
HU206896B true HU206896B (en) 1993-01-28

Family

ID=6295926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU87995A HU206896B (en) 1986-03-10 1987-03-09 Process for producing hibride interferons, their intermediates, pharmaceutical compositions containing them, monoclonal antibodies against them and purifying them

Country Status (21)

Country Link
US (1) US4917887A (hu)
EP (1) EP0236920B1 (hu)
JP (1) JPS62282595A (hu)
KR (1) KR950008191B1 (hu)
AT (1) ATE81671T1 (hu)
AU (1) AU600702B2 (hu)
DD (2) DD266118A5 (hu)
DE (2) DE3607835A1 (hu)
DK (1) DK120387A (hu)
ES (1) ES2052502T3 (hu)
FI (2) FI871012A (hu)
GR (1) GR3006844T3 (hu)
HU (1) HU206896B (hu)
IE (2) IE60573B1 (hu)
IL (1) IL81832A0 (hu)
NO (1) NO870967L (hu)
NZ (1) NZ219549A (hu)
PH (1) PH27060A (hu)
PT (1) PT84427B (hu)
SU (1) SU1604164A3 (hu)
ZA (1) ZA871679B (hu)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3633323A1 (de) * 1986-10-01 1988-04-07 Boehringer Ingelheim Int Neue monoklonale antikoerper gegen ifn-omega, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung zur reinigung sowie zum nachweis von ifn-omega
DE3642096A1 (de) * 1986-12-10 1988-06-16 Boehringer Ingelheim Int Pferde-(gamma)-interferon
AT389318B (de) * 1987-10-22 1989-11-27 Boehringer Ingelheim Int Neue hybridomzellinien, welche neue monoklonale antikoerper gegen ifn-omega produzieren, verfahren zu ihrer herstellung und die verwendung der neuen monoklonalen antikoerper zur reinigung sowie zum nachweis von ifn-omega
US5000943A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Canine biscuits containing an inorganic pyrophosphate
US5047231A (en) * 1989-05-30 1991-09-10 Nabisco Brands, Inc. Raw hide containing an inorganic pyrophosphate
US5000940A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Devices, compositions and the like having or containing an inorganic pyrophosphate
US5000973A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Nutritionally-balanced canine biscuits containing an inorganic pyrophosphate
US5015485A (en) * 1989-05-30 1991-05-14 Nabisco Brands, Inc. Dog biscuits having a coating containing an inorganic pyrophosphate
EP0626448A3 (de) * 1993-05-26 1998-01-14 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon
US5939286A (en) * 1995-05-10 1999-08-17 University Of Florida Hybrid interferon tau/alpha polypeptides, their recombinant production, and methods using them
US6204022B1 (en) 1996-04-12 2001-03-20 Pepgen Corporation And University Of Florida Low-toxicity human interferon-alpha analogs
EP1987845B1 (en) 1997-11-20 2012-03-21 Vical Incorporated Treatment of cancer using cytokine-expressing polynucleotides and compositions therefor.
ES2378977T3 (es) * 1998-03-13 2012-04-19 Brown University Research Foundation Isoforma del canal de calcio del tipo N humano y usos de la misma
US6685933B1 (en) 1998-07-28 2004-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Interferon α hybrids
AU2587002A (en) * 2000-11-03 2002-05-15 Biomedicines Inc Method for short-term and long-term drug dosimetry
FR2821625B1 (fr) * 2001-03-01 2003-05-16 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
CA2454860A1 (en) * 2001-08-12 2003-02-27 Pepgen Corporation Hybrid interferon/interferon tau proteins, compositions and methods of use
ATE481135T1 (de) * 2001-11-09 2010-10-15 Intarcia Therapeutics Inc Kombinationstherapie mit omega-interferon zur behandlung von hepatitis c virus oder gelbfieber virus infektionen
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
DK2020990T3 (da) 2006-05-30 2010-12-13 Intarcia Therapeutics Inc Strømningsmodulator med en indre kanal til et todelt osmotisk fremføringssystem
EP2049081B1 (en) 2006-08-09 2012-11-14 Intarcia Therapeutics, Inc. Osmotic delivery systems and piston assemblies
CN101715340A (zh) 2007-04-23 2010-05-26 精达制药公司 促胰岛素释放肽的混悬制剂及其应用
WO2009102467A2 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
JP5718925B2 (ja) 2009-09-28 2015-05-13 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド 実質的な定常状態薬物送達の迅速な確立及び／又は停止
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
CN105358575B (zh) * 2013-03-15 2020-09-22 詹森生物科技公司 干扰素α和ω抗体拮抗剂
TWI713453B (zh) * 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
WO2016196851A2 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
WO2017200943A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
KR20190104039A (ko) 2017-01-03 2019-09-05 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI77877C (fi) * 1979-04-20 1989-05-10 Technobiotic Ltd Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein.
US4414150A (en) * 1980-11-10 1983-11-08 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
ES506955A0 (es) * 1980-11-10 1983-02-01 Genentech Inc Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.
JPH064673B2 (ja) * 1980-11-10 1994-01-19 ゲネンテツク・インコ−ポレ−テツド ハイブリド型ヒト白血球インタフエロン
US4456748A (en) * 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
IT1167610B (it) * 1982-01-19 1987-05-13 Cetus Corp Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione
AU1155083A (en) * 1982-01-19 1983-07-28 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
DE3247922A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten
DE3409966A1 (de) * 1984-03-19 1985-09-26 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-gammainterferon und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3428370A1 (de) * 1984-08-01 1986-02-13 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Interferon, genetische sequenzen, die hierfuer codieren, und diese produzierende organismen
EP0170204B1 (de) * 1984-08-01 1991-09-25 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Neue genetische Sequenzen, die durch sie codierten Interferon-Peptide vom Typ I und diese sie produzierende Organismen
DE3574145D1 (en) * 1984-08-27 1989-12-14 Genentech Inc Novel, distinct family of human leukocyte interferons, compositions containing them, methods for their production, and dna and transfected hosts therefor
EP0173935A1 (en) * 1984-08-31 1986-03-12 University Patents, Inc. Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons
DE3685996T2 (de) * 1985-06-11 1993-01-14 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators

Also Published As

Publication number Publication date
FI871012A0 (fi) 1987-03-09
IE60573B1 (en) 1994-07-27
PT84427B (pt) 1989-10-04
PT84427A (de) 1987-04-01
IE940131L (en) 1987-09-10
DK120387D0 (da) 1987-03-09
NZ219549A (en) 1990-07-26
EP0236920A3 (en) 1988-03-02
JPS62282595A (ja) 1987-12-08
DE3782259D1 (de) 1992-11-26
FI871012A (fi) 1987-09-11
HUT44074A (en) 1988-01-28
KR950008191B1 (ko) 1995-07-26
FI925631A0 (fi) 1992-12-11
ZA871679B (en) 1988-11-30
DD276493A5 (de) 1990-02-28
ES2052502T3 (es) 1994-07-16
PH27060A (en) 1993-02-01
DK120387A (da) 1987-09-11
ATE81671T1 (de) 1992-11-15
KR870009020A (ko) 1987-10-22
IL81832A0 (en) 1987-10-20
SU1604164A3 (ru) 1990-10-30
EP0236920A2 (de) 1987-09-16
US4917887A (en) 1990-04-17
IE870591L (en) 1987-09-10
FI925631A (fi) 1992-12-11
DD266118A5 (de) 1989-03-22
AU6978687A (en) 1987-09-17
DE3607835A1 (de) 1987-09-24
NO870967D0 (no) 1987-03-09
EP0236920B1 (de) 1992-10-21
NO870967L (no) 1987-09-11
GR3006844T3 (hu) 1993-06-30
AU600702B2 (en) 1990-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU206896B (en) Process for producing hibride interferons, their intermediates, pharmaceutical compositions containing them, monoclonal antibodies against them and purifying them
JP3507507B2 (ja) 非免疫原性ペプチドを介して結合されたインターフェロン―αと免疫グロブリンとのハイブリッド
US6027720A (en) G-CSF conjugate
JP2708099B2 (ja) エリスロポエチン類縁体
AU625214B2 (en) Vascular anticoagulant proteins
FI99116C (fi) Menetelmä valmistaa hevosen -interferonia
HU212836B (en) Method for producing canine and equine interferons
US5681720A (en) DNA encoding human granulocyte colony stimulating factor plasmids and host cells comprising same, and methods of expressing the encoded polypeptide
PL149079B1 (en) Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type
CA2084514A1 (en) O-glycosylated ifn-alpha
WO1987002060A1 (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells
CA1340184C (en) Cloning and characterizing omega-interferon and related genes
NZ223696A (en) Platelet factor 4-related peptide expression cassette, its use and compositions containing the peptide produced using this cassette
Gomes et al. Expression of recombinant human mutant granulocyte colony stimulating factor (Nartograstim) in Escherichia coli
US5714140A (en) Method for inhibiting the production of bioactive IL-1 by administering M-CSF
EP0328061A2 (en) Human colony-stimulating factors
US4855409A (en) Novel polypeptides and method of producing same
US5650297A (en) DNA encoding human colony-stimulating factors
KR950008091B1 (ko) 하이브리드 인터페론 및 그의 제조방법
US5696250A (en) DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs
EP0456842B1 (en) Medicinal application of m-csf
PT85560B (pt) Processo para o isolamento, para a preparacao por tecnicas recombinantes e para a purificacao, de um receptor fce-humano de baixa afinidade
EP0490233A1 (de) Monoclonale Antikörper gegen BgIII-Hybridinterferone, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0452505A1 (en) M-csf derivative, expression vector of said derivative, product of transformation by said vector, and production of them
HU204889B (en) Process for producing erythropoietin