KR950008091B1 - 하이브리드 인터페론 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Description

하이브리드 인터페론 및 그의 제조방법

제1도는 parpATER33에 대한 구성 개요도.

제2도는 pRHW14에 대한 구성 개요도.

제3도는 맥기셀(maxicell ; 이. 콜라이(E. coli) CSR603)로부터 얻은³⁵S 표지된 단백질의 오토래디오그래프에 관한 도.

제4도는 pRH72에 대한 구성 개요도.

제5도는 pRH78r 및 pRH78f에 대한 구성 개요도.

제6도는 IFN-오메가 1/α2(BalⅡ)의 MONO-S 크로마토그래프에 관한 도(AUFS=흡수 유니트 총규모).

제7도는 IFN-오메가 1/α2(BalⅡ)의 겔 침투 HPLC에 관한 도.

제8도는 IFN-오메가 1의 MONO-S 크로마토그래프에 관한 도.

제9도는 IFN-오메가 1의 역상 HPLC에 관한 도.

문헌[Mucleic Acids Res. 13, 4739-4749(1985)(또한 EP-A-0.170,204 참조)]에는 오메가- 인터페론 omega-interferon)에 해당하는 새로운 부류의 타입 1인더페론, 이를 암호화하는 DNA서열, 이들 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 새로운 인터페론을 생산하는 유기체에 대해 기술되어 있다.

그러나 상기 언급한 문헌에 기술된 발현 플라스미드, 예를들면 이. 콜라이(E.Coli) HB101 내의 형질전환된 pRHW11 또는 pRHW12를 사용하여 새로운 오메가-인터페론의 상당히 많은 시험량을 생산할 경우에는 새로운 오메가-인터페론의 발현을 증대시키고 동시에 새로 발현된 인터페론에서 요구되는 후속 정제단계를 개선시키는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다.

놀랍게도, 본 발명에 따라 이들 단점들은 α-인터페론 일부와 오메가-인터페론 일부로 이루어진 신규한 하이브리드 인터페론으로 해결될 수 있으며, 신규한 플라스미드를 구성하여 이를 사용함으로써 오메가 -인터페론의 발현을 증진시킬수 있음이 밝혀졌다.

신규한 하이브리드 인터페론, 그의 N-말단 Met 또는 N-포르밀-Met 유도체 및 하이브리드 인터페론의 펩타이드 서열이 글라이코실화 부위를 함유할 경우 그의 n-글라이코실화된 유도체는 다소 우수한 약물학적 특성을 가지며, 특히 α- 및 오메가-인터페론의 정제에 적합한 신규의 모노클로날 항체를 제조하는 데 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)의 신규한 BalⅡ-하이브리드 인터페론, 그의 N-말단 Met 또는 N-포르밀- Met 유도체 및 하이브리드 인터페론의 펩타이드 서열이 글라이코실화 부위를 함유하는 경우 그의 N-글라이코실화된 유도체, 그의 약제학적 조성물 및 실험 동물을 면역화 시키기 위한 중간 생산물로서의 용도, 이들 하이브리드 인터페론을 암호화하는 DNA서열, 및 그들의 제조방법 ; 신규한 모노클로날 항체 및 α- 및 오메가-인터페론 정제를 위한 그의 용도, 그들을 분비하는 하이브리드 세포주 및 그들의 제조방법 ; 상술한 신규의 모노클로날 항체를 함유하는 신규한 항체 친화성 컬럼을 사용하여 α 및 오메가-인터페론을 정제하는 신규의 방법 및 그들의 제조방법 ; 오메가-인터페론의 발현을 증진시키기 위한 신규한 플라스미드 및 신규한 폴리스미드 제조용 신규한 폴리 스미드 및 그들의 제조방법에 관한 것이다.

상기 식에서, BalⅡ는 α1-, α2- 및 오메가-인터페론의 공통적인 BalⅡ제한 부위를 나타내고, R₁이 BalⅡ절단 부위 앞에 위치하는, α1- 또는 α2-인터페론의 DNA서열에 의해 암호화된 펩타이드 서열이며, R₂는 BalⅡ절단 부위 다음에 위치하는, 오메가 인터페론의 DNA서열에 의해 암호화된 펩타이드 서열이거나, 또는 R₁이 BalⅡ절단 부위 앞에 위치하는 오메가 인터페론의 DNA서열에 의해 암호화된 펩타이드서열이고, R₂는 BalⅡ절단 부위 다음에 위치하는 α1- 또는 α2-인터페론의 DNA 서열에 의해 암호화된 펩타이드 서열이다.

본 발명에 따라 하기 방법을 사용하여 상기 명시한 목적물을 제조한다 :

이 발명의 첫 번째 목적은, 특히 상응하는 안티-오메가-인터페론-항체-친화성 컬럼을 공지의 방법으로 제조하는데 아직 아무도 성공하지 못한 오메가-인터페론을 정제를 개선시키는 점이다.

이런 상태를 해결하는 방법중 하나는 α-인터페론, 바람직하게는 α1 또는 α2-인터페론, 예를들면 IFN-α2(Arg)(EP-A-0,095,702참조)의 일부와 오메가 인터페론, 바람직하게는 오메가 1(Gly) 인터페론(EP-A-0,170,204참조)의 일부로 구성된 본 발명에 따른 신규한 하이브리드 인터페론에 의해 제공된다. IFN-α2-(Arg) 및 IFN-오메가 1의 경우에, 상응하는 부분을 암호화하는 DNA서열은, 예를들어 두 유전자내 위치 191 내지 196에 있는 Bg1Ⅱ절단부위를 통해 연결시킬수 있다. 두 유전자의 서열을 서로 비교할 수 있도록 α-인터페론의 아미노산 1 내지 66의 펩타이드에는 특정 갭(gap)이 존재해야 하며(예 : IFN-α2(Arg)내의 아미노산 45번에 대한 갭), 이는 다음 도표로 명백해진다(세균의 단백질 합성 이후에 다시 통상적으로 분해 제거되는 N-말단 MET 그룹포함) :

상기 도표에서 각각의 2열중 제1열은 IFN-α2(Arg)의 상응하는 서열을 나타내고 제2열은 오메가 1-인터페론의 서열을 나타내며 ; 두 유전자의 공통적인 Bg1Ⅱ절단 부위는 뉴클레오타이드 위치 191 내지 196내에 위치하고 ; IFN -α2(Arg)유전자는 뉴클레오타이드 위치 451 내지 456에 제2BalⅡ절단부위를 갖는다.

또한, 일정한 비율로 만들어지지 않은 다음 각각의 대표적 플라스미드는 필수 서열과 제한 효소 인식 부위만을 함유한다. 하기의 약자가 사용된다 :

제한 효소 인식 서열 :

B : BamH I, Bg : BalⅡ, Bal : IFN-α2(Arg) 유전자내의 제1BalⅡ부위, Bg2 : IFN-α2(Arg) 유전자내의 제2BalⅡ부위, E : EcoR I, H : HindⅢ, N : Nco I, P : Pst I, S : Sph I

p/o ; 다음에 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence ; 라이보솜 결합 부위)를 갖는 트립토판 프로모터/오퍼레이터(세라티아 마르세슨스 : Serratia marces scens)

par : 플라스미드 pPM31로부터의 분할(partition) 유전자좌

ori : 복제 기점

Ap^r: 암피실린 내성 유전자

Tc^r: 테트라사이클린 내성 유전자

Tc^s: 테트라사이클린 감수성 유전자

kb : 1000염기쌍

본 출원은 또한 하기 도면을 포함한다 :

제1도 : parpATER33에 대한 구성 개요

제2도 : pRHW14에 대한 구성 개요

제3도 : 멕시셀(이.콜라이 CSR 603)로부터 얻은³⁵S표지된 단백질의 오토래디오그래프

제4도 : pRH72에 대한 구성 개요

제5도 : pRH78R 및 pRH78F에 대한 구성 개요

제6도 : IFN-오메가 1/α2(BalⅡ)의 MONO-S 크로마토그래프

(AUFS=흡수 유니트 총규모).

제7도 : IFN-오메가 1/α2(BalⅡ)의 겔 침투 HPLC

제8도 : IFN-오메가 1의 MONO-S 크로마토그래프.

제9도 : IFN-오메가 1의 역상 HPLC

따라서, 신규한 BalⅡ하이브리드 인터페론 및 그의 N-글라이코실화된 유도체는 α1 또는 α2 인터페론의 아미노산 1 내지 66, 바람직하게는 IFN-α2(Arg)의 아미노산 1내지 65 및 오메가 1 인터페턴의 아미노산 67 내지 173으로 이루어지거나, 또는 오메가 1 인터페론의 아미노산 1 내지 66 및 α1 또는 α2-인터페론의 아미노산 67 내지 167, 바람직하게는 IFN-α2(Arg)의 아미노산 66 내지 166으로 이루어지며, 여기에서 N-말단 Met 그룹은 통상 세균 단백질 합성후 다시 분해 제거된다.

놀랍게도, 신규한 하이브리도 인터페론은 안티-IFN-α-항체에 의해 인식된다. 따라서 문헌(예를들면 EP-A-0,119,476참조)에 공지된 안티-IFN-α-항체를 사용하여 신규한 하이브리드 인터페론을 정제할수 있다. 본 발명에 따라 수득된 순수한 신규의 하이브리드 인터페론을 사용하여 BALB/c 마우스와 같은 시험 동물을 면역화시킴으로써 상응하는 항체의 형성을 유도할 수 있다. 이들 신규한 항체는 신규한 하이브리드 인터페는 뿐만 아니라 놀랍게도 하이브리드 인터페론의 각기 성분, 예를들면 오메가-인터페론도 인식한다.

따라서 상응하는 하이브리드 인터페론 플라스미드를 구성하는 출발 기본은 α1-, α2- 및 오메가 1-인터페론 유전자의 위치 191 내지 196에 공통적인 BalⅡ 제한 부위인데, 전술한 바와같이 IFN-α2(Arg) 유전자에 코돈번호 45의 갭이 있고, 필요한 상응하는 유전자의 단리를 위한 기본은 α1 또는 α2-인터페론 또는 오메가 1 인터페론농를 암호화하는 플라스미드로 이루어진다.

이 목적을 위해서는, 본 발명에 따라 우선 오메가 1 인터페론의 발현을 증진시키는 신규의 플라스미드가 생성된다. 사용한 출발플라스미드는 문헌에 공지된 시판용 플라스미드 pAT153[Amersham에 의해 제조, 또한 문헌 ˝A.J. Twing 등, Nature 283, 216-218(1980)˝], 예를들면 IFN-α2(Arg)를 암호화하는 플라스미드 parpER33 (EP-A-0,115,613 참조) 및 하기 아미노산 서열의 오메가 1-인터페론을 암호화하는 플라스미드 pRHWⅡ 또는 12(EP-A-0,170,224 참조)와 같은 플라스미드이다.

상기 서열에서, 위치 111의 X는 Glu 또는 Gly을 나타낸다.

하기 서열의 par-유전자좌를 함유하는 플라스미드 parpER33 및 발현애 필요한 플라스미드 pER103의 리플리콘(replicon) 및 조절 서열(특허청구의 범위 제17항 참조)은 BamH I 및 pst I으로 절단한다.

상기 서열에서, Z는 뉴클리오타이드 G 또는 C를 나타내고, W는 뉴클리오타이드 G를 나타내거나 뉴클리오타이드가 없음을 나타낸다. 형성된 두 단편은 예를들면 1% 아가로스 겔을 사용하는 겔 전기 영동으로 분리하고, IFN-α2(Arg) 유전자를 함유하는 작은 단편을 전기 용출에 의해 단리한다. 계속해서, 생성된 DNA는 에탄올을 가하여 침전시키고, 원심분리하여 분리하며, TE 완충액과 같은 적합한 완충액, 예를들면 10밀리몰의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스, pH=0.8) 및 1밀리몰의 에틸렌디니트릴로테트리아세트산 이나트륨염(EDTA)중에 용해시킨다.

플라스미드 pAT153도 또한 BamH I 및 Pat I으로 절단한다. 생성된 두단편은 예를들면 1% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기 영동으로 분리하고, 복제 기점을 함유하는 큰 단편을 단리한다. 그후, 이렇게 해서 수득한 큰 단편은 리가아제, 예를들면, T₄DNA 리가아제의 존재하에서 플라스미드 parpER33로부터 수득한 작은 단편과 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 복제하기 위해, 세균, 바람직하게는 HB101균주의 이. 콜라이[유전형 F^-, hsdS20(r^-,m^-), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44, 람다^-]를 CaCl₂용액으로 세척하고, 생성된 수용능의 (competent)이. 콜라이 HB101을 리가아제 반응 혼합물과 혼합하며, 0℃에서 배양한 후, 42℃에서 2분에서 열 충격을 가하여 세균에 플라스미드 DNA를 도입시킨다. 계속해서, 형질 전환된 세균을 암피실린을 함유하는 LB 한천(LB배지+15g/한천

)상에 도말한다. 재조합형 벡터 분자를 취한 이. 콜라이 HB101 세균만이 이 한천상에서 생육할 수 있다.

상기 방법을 사용하여 37℃에서 배양한 후, 생성된 콜로니 12개를 선택하고, 문헌[Birnboim 등, Nucl.Acids Res. 7, 1573(1979)]의 방법을 사용하여 이들로부터 플라스미드를 단리한다. 선택한 플라스미드를 Pat I-BamH I, Pat I-PvuⅡ 또는 EcoR I-BamHI 제한효소를 이중 분해하고, 계속해서 생성된 단편을 겔 전기 영동하여, 이들 플라스미드가 정확히 구성되는지를 확인한다. 이렇게 수득한 플라스미드를 선별하여 parpATER33으로 명명한다(구성 개요는 제1도 참조). 이 플라스미드는 이. 콜라이 HB101에 형질 전환되었을 때 표현형 Ap^r(암피실린 내성), Tc^r(테트라 사이클린 내성)을 나타낸다.

이렇게 해서 수득한 하기 제한 지도의 플라스미드 parpATER33은 오메가 1-인터페론의 발현을 증진시키는 플라스미트를 제조하기 위해(구성 방법은 제2도 참조) HindⅡ 및 BamH I으로 절단한다.

이렇게 해서 생성된 3개의 단편은 예를들면 1% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분리한 후, 약 3750염기쌍(bp) 길이이며 트립토판 프로모터/오퍼레이터(세라티아 마르세슨스), 복제 기점 및 Apr 유전자를 가지고 있는 최대 단편(단편 a)을 단리하고 오메가 1-인터페론을 암호화하는 DNA와 연결시킨다. 이 DNA는 오메가 1-인터페론을 암호화하는 플라스미드, 바람직하게는 플라스미드 pRHW11 또는 pRWH12를 BamH I 및 HindⅢ로 절단하고, 계속해서 이렇게 해서 수득된 두 단편을 겔 전기 영동으로 분리하여 수득하는데 목적 유전자는 약 800bp 길이의 작은 단편에 함유되어 있다. 생성된 플라스미드를 복제하기 위해, 세균, 바람직하게는 이. 콜라이 HB101을 CaCl₂용액으로 세척하고, 이렇게 해서 수득된 수용능의 이. 콜라이 HB101을 리가아제 반응 혼합물과 혼합하며, 0℃에서 배양한 후 42℃에서 2분동안 열 충격을 가하여 세균에 플라스미드 DNA를 도입시킨다. 그후, 형질전환된 세균을 암피실린을 함유하는 LB 한전상에 도말한다. 재조합형 벡터 분자를 흡수한 이. 콜라이 HB101 세균만이 이 한천상에서 생육할 수 있다. 이 방법을 사용하여 37℃에서 배양한 후, 생성된 콜로니 6개를 선택하고, 문헌[Birnboim 등, Nucl. Acids Res.7, 1513(1979)]의 방법을 사용하여 이들로부터 플라스미드를 단리한다. 선택한 플라스미드를 EcoR I, HindⅢ, Nco I 및 Pst I 제한효소로 분해하고 계속해서 겔 전기영동시킨 후, 이들 플라스미드가 정확히 구성되었는지를 확인한다. 이렇게 해서 수득한 하기 제한 지도의 플라스미드를 선별하여, 사용한 출발 플라스미드가 오메가 1(Gly)인터페론을 암호화하는 플라스미드 pRHW12인 경우에는 pRHW 14(제2도참조)로 명명한다. 이. 콜라이 HB101에 형질전환되었을 때 이 플라스미드는 표현형 Ap^r및 Tc^s를 나타낸다.

상기 제한 지도에서 IFNω1은 IFN-오메가 1(Gly) 또는 IFN-오메가 1(Glu) 을 암호화하는 DNA서열을 나타낸다.

pRHW11을 출발 플라스미드로 사용할 경우에는, 오메가 1(Glu)-인터페론을 암호화하는 플라스미드 pRHW13이 유사하게 수득된다.

이렇게 해서 수득한 플라스미드 pRHW14는 맥시셀 시스템[J.Bacteriol.137, 692-693(1979) 참조]에서 입증될 수 있는 바와 같이, 지금까지 알려진 플라스미드 pRHW12(EP-A-0,170,204 참조)보다 오메가 1(GlY)-인터페론에 대한 발현율이 2배 정도 크다. 이를 위해 UV 유도된 손상에 대한 회복 시스템이 결여된 이. 콜라이 CSR 603(유전형 F^-, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recA1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galK2, xy1-5, mtl-1, gyrA98(nalA98), rpsL31, tsx-33, 다-, supE44)을 플라스미드 pRHW12 및 pHW14로 형질전환 시킨다. 방사선 투사량을 세균의 염색체는 종종 손상되나 플라스미드는 거의 손상되지 않을 정도로 선택하면, 플라스미드-암호화된 유전자만이 주로 전사되고 따라서 해독되게 된다. 배지에³⁵S-메티오닌을 함유시키면, 주로 플라스미드 유전자 생성물이 표지되어 아크릴아미드겔상에 분리후 증감 필름을 사용한 X-선 필름으로 직접 기록할 수 있다(제3도 참조). 암피실린 내성 유전자 생성물(β-락타마아제, bla)은 두 경우에서 동일한 강도로 표지된다. 그러나 pRHW 14의 경우에서, 오메가 1(Gly)-인터페론이 pRHW12이 경우보다 2배 더 강하게 표지된다.

일반식(Ⅰ)의 하이브리드 인터페론을 암호화하고, 공통적 BalⅡ절단 부위 앞에 α1- 또는 α2-인터페론을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 제조하기 위해서는(구성 방법은 제4도 참조), 플라스미드 parpATER33과 예를들면 플라스미드 pRHW14와 같이 오메가 1-인터페론을 암호화하는 플라스미드를 각각 BalⅡ 및 Sph I으로 절단한다. 이렇게 해서 생성된 단편을, 예를 들면 1% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분리하고, 용출시키며 에탄올 침전으로 정제한다. parpATER33과 pRHW14로 출발하여, 이렇게 수득된 단편을 적합한 완충액, 예를 들면 TE 완충액중에 용해시킨 후, 플라스미드 parpATER33으로부터 수득한 큰 단편을 리가아제, 예를들면 T₄DNA-리가아제의 존재하에서 플라스미드 pRHW14로부터 수득한 작은 단편과 연결시킨다. 수득한 플라스미드를 복제하기 위해, 세균, 바람직하게는 HB101 균주의 이. 콜라이[유전형 F^-, hsdS20(r^-,m^-), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm^r), xyl-5 mtl-1, supE44, 람다^-]를 CaCl₂용액으로 세척하고 이렇게 해서 수득된 수용능의 이. 콜라이 HB101을 리가아제 반응 혼합물과 혼합하며,0℃에서 배양한 후 42℃에 2분동안 열 충격을 가하여 세균에 플라스미드 DNA를 도입시킨다. 계속해서, 형질전환된 세균을 암피실린을 함유하는 LB한천(LB 베지+15g/한천

)상에 도말한다. 재조합형 벡터 분자를 취한 이. 콜라이 HB101 세균만이 이 한천상에서 생육할 수 있다.

37℃에서 배양한 후, 형성된 콜로니 몇개를 선별하고, 문헌[Birnboim 등, Nucl. Acids Res. 7, 1513(1979)]의 방법을 사용하여 이들로부터 플라스미드를 단리한다. 선별된 플라스미드를 Bg1Ⅱ 및 Sph I 제한효소로 이중 분해하고 계속해서 수득 단편을 겔 전기영동시켜, 이들 플라스미드가 정혹히 구성되었는지 확인한다. 이렇게 해서 수득한 플라스미드를 선별하여 pRH72로 명명한다. 하기의 제한 지도를 갖는 이 플라스미드는 이. 콜라이 HB101에 형질전환되었을 때 표현형 Ap^r및 TC⁵를 나타낸다.

이 플라스미드는 또한 하기 아미노산 서열의 IFN-α2/오메가 1(Gly)-(BalⅡ), 그의 Met 및 N-포르밀-Met 유도체 및 그의 N-글라이코실화된 유도체를 암호화한다.

이 플라스미드는 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 하기 유전자 서열을 함유한다.

pRH72DML IFN-α2/오메가 1(Gly) 암호화 서열은 그의 변이체로 치환될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

일반식(Ⅰ)의 하이브리드 인터페론을 암호화하고, 공통적 Bg1Ⅱ 절단 부위앞에 오메가 1-인터페론을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 제조하기 위해서는 (구성 방법은 제5도 참조), IFN-α2(Arg)의 DNA서열에서와 같이 α-인터페론의 DNA서열에 두 개에 Bg1Ⅱ 절단 부위가 있는 경우 2단계 과정이 후속되어야 한다.

제1단계에서는 플라스미드 pRHW14를 Bg1Ⅱ 및 Sph 으로 절단하여 수득한 큰 단편을 리가아제, 예를들면, T₄DNA 리가아제의 존재하에서 플라스미드 parpATER33을 Bg1Ⅱ 및 Sph I으로 분해하여 수득한 것으로 IFN-α2(Arg)의 C말단을 암호화하는 단편과 열결시킨다. 형성된 플라스미드를 복제하기 위해, 세균, 바람직하게는 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 배양한다. 선별된 플라스미드의 구조를 플라스미드 pRH72의 제조방법에 관해 상술한 바와같이 점검한다.

이렇게 해서 수득한 플라스미드는 선별하여 pRH77로 명명하며, 이는 하기의 제한 지도를 갖는다 :

제2단계에서는 하이브리드 인터페론, 예를들면 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)의 유전자를 완성하기 위해서는, parpATER33의 절단시에 분리된 위치 192 내지 455를 함유하는 단편을 플라스미드 pRH77 내로 재삽입시켜야 한다. 이렇게 하기 위해서 플라스미드 pRH77을 Bg1Ⅱ로 절단하고 5'-말단 인산염을 송아지의 장내 포스파타아제(CIP)를 사용하여 제거한다. 이렇게 해서 수득한 플라스미드 pRHW77의 선형화된 형태를 예를들면 1% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분리하고, 단리하며, 에탄올 침전으로 정제한다. 이렇게 해서 수득한 선형화된 단편을 적합한 완충액, 예를들면 TE 완충액에 용해시키고, 이 단편을 T₄DNA-리가아제와 같은 리가아제의 존재하에서 parpATER33를 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 최초 분해하는 중에 수득한 263bp 단편과 연결시킨다. 수득한 플라시미드를 복제하기 위해, 세균, 바람직하게는 이. 콜라이 HB101을 플라스미드 pRH72의 제조방법에 관해 상술한 바와같이 형질전환시키고 배양한다. 선별된 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 Alu I 또는 HaeⅢ로 절단함으로써 구조의 정확성을 절감한다. 말단이 동일하므로, 263bp 단편은 두 방법으로 삽입할 수 있다.

263bp Bg1Ⅱ 단편이 발현을 위한 정위치에 삽입된 플라스미드는 pRH78r로 명명하고, 반면에 발현하는데 잘못된 배향을 갖는 플라스미드는 pRH78f라 명명한다.

이. 콜라이 HB101에 형질전환되었을 경우, 두 플라스미드는 표현형 Ap^r과 Tc^r을 나타낸다. 플라스미드 pRH78_r은 하기의 제한 지도를 가지며 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)에 대한 하기 폴리펩타이드 서열을 암호화하고, 이 폴리펩타이드를 암호화하는 하기 뉴클리오타이드서열을 함유한다.

플라스미드 pRH78f는 하기의 제한 지도를 가지며, 하기의 폴리펩타이드 서열을 함호화하고 이 폴리펩타이드를 암호화하는 하기 뉴클레오타이드 서열을 함유한다 :

복제 또는 발현을 목적으로, 본 발명에 따란 신규의 플라스미드를 세균 숙주내로 도입시킬 수 있다. 이. 콜라이 K12, 균주 294(ATCC No. 31. 446), 이. 콜라이 X 1776 (ATCC No. 31.537), 이. 콜라이 W3110(F^-, 람다^-, 원영양균주, ATCC No. 31.325), 이. 콜라이 HB101 [F^-, hsdS20(r^-,m^-), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Smr), xy1-5, mtl-l supE44, 람다^-] , 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 및 살모넬라 타이퍼머리엄(Salmonella typhimurium)또는 세라티아 마르세슨스(Serratia marcens) 및 여러가지 슈도모나스(Pseudomonads)와 같은 장내세균과 등의 원핵성물이 적합한 것으로 입증 되었다.

신규한 하이브리드 인터페론을 발현시키기 위해, 예를들면 플라스미드 pRH72, pRH78f 및 pRH78r을 이. 콜라이에 형질전환시키고 배양한다. 세포벽을 파괴하고 원심분리에 의해 세균 부스러기를 제거한 후 CPE환원(reduction) 시험을 사용해 세포 잔류물에서 발현된 폴리펩타이드의 항바이러스 활성을 측정한다. pRH72로 형질전환된 이. 콜라이와 pRH78f로 형질전환된 이. 콜라이로부터 수득한 세포 잔류물은 항바이러스 특성을 전혀 나타내지 않는것으로 밝혀졌다. 그러나 놀랍게도, IF오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)를 함유하는 플라스미드 pRH78r로부터 수득한 세포 잔류물은 A549 세포에 대해 INF-α2(Atg)의 활성보다 약 4배나 큰 특이적 항바이러스 활성을 가진다.

신규한 하이브리드 인터페론을 암호화하는 본 발명에 따라 제조된 신규한 폴라스미드의 DNA서열은 또한 적절한 변형후 다른 유기체내로 도입시킬 수 있다.

이런 종류의 서열의 발현 및 해독은 비형질전환된 형태에서 해당 유기체와 ˝상동적˝인 것으로 간주되는 다른 조절 시스템의 제어하에 수행할 수도 있다. 따라서 예를들면 락토스-의존성 이. 콜라로부터 얻은 염색체 DNA는 효소 β-갈락토시디아제의 발현을 조정하여 락토스를 분해시킬 수 있는 락토스 또는 lac-오페론을 함유한다.

lac 제어 요소는 이. 콜라이에 감염성인 박테리오파아지 람다-plac5로부터 수득할 수 있다. 이 파이지의 lac-오페론은 형질도입에 의해 동일한 세균종으로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 조절 시스템은 또한 그 유기체 고유의 플라스미드 DNA로부터 유래할 수도 있다. lac-프로모터/오퍼레이터 시스템은 IPTG(이소프로필티오갈락토사이드)에 의해 유도할 수 있다.

다른 프로모터/오퍼레이터 시스템 또는 그의 일부, 예를들면 아라비노스 프로모터/오퍼레이터, 콜리신 E₁프로모터/오퍼레이터, 갈락토스 프로모터/ 오퍼레이터, 알칼리성 포스파타아제 프로모터/오퍼레이터, trp 프로모터/오퍼레이터, 크실로스-A 프로모터/오퍼레이터, tac 프로모터 등을 비슷한 성공율로 사용할 수 있다.

원핵생물외에 효모와 같은 진핵생물을 사용할 수도 있다. 많은 다른 종들도 일반적으로 이용가능하지만 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 통상적으로 사용되는 진핵 미생물이다. 사카로마이세세에서의 발현을 위해서는, 예를 들면 플라스미드 YRp7[Stinchcomb 등, nature 282, 39(1979) ; Kingsman 등, Gene 7, 141(1979) ; Tschumper등, Gene 10, 157(1980) 참조] 및 플라스미드 YEp13[Bwach 등, Gene 8, 121-133(1979) 참조] 를 보통사용한다. 플라스미드 YRp7(예를들면 ATCC No. 44076)은 트립토판-부재 배지에서 성장할 수 없는 효모 변이주에 대한 선별 마커(marker)를 제공하는 TRP1유전자를 함유한다.

효모 숙주 게놈의 특성으로서 TRP1변이의 존재는 형질전환을 확인하는 효과적 도구를 의미하며, 배양은 트립토판 없이 수행한다.

이런 상태는 효모 유전자 LEU2를 함유하는 플라스미드 YEp13에서도 동일하며, 이 플라스미드를 사용하여LEU-2 마이너스 변이주를 보충할 수 있다. 효모 벡터에 적합한 프로모터 서열은 ADH I[Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201(1983) 참조], 3- 포스포글리세레이트-키나아제[Hitzeman등, J. Biol. Chem. 255, 2073(1980)참조]또는 에놀라이제, 글리세르알데히드-3-포스페이트-다하이드로게나아제, 헥소키나이제, 피루베이트 디카복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트이소머라아제, 포스로글루코스 이소머라아제 및 글루코키나아제와 같은 그밖의 해당 효소[Kawaski and Fraenkel. BBRC 108, 1107-1112(1982)참조] 유전자의 5′-플랭킹(flanking) 영역을 함유한다. 적합한 발현 플라스미드의 구성시, 이들 유전자와 결합된 말단 서열을 발현 벡터내에 발현시킬 서열의 3′말단에 삽입시켜 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공할 수도 있다.

생육 조건에 의해 제어되는 전사의 장점을 또한, 갖는 그밖의 프로모터에는 알코올 디하이드로게나이제-2, 이소사이토크롬 C, 산포스파타아제, 질소 대시와 관련된 분해 효소, 상술한 글리세르알데히드-3- 포스페이트 디하이드로게나아제 및 말토스와 갈락토스의 공정에 관련된 효소에 대한 유전자의 프로모터 영역이 포함된다. 효모의 교배형 유전자좌에 의해 조절되는 프로모터, 예를들면 유전자 BAR1, MFα1, STE2 STE3 및 STE5의 프로모터는 온도-의존성 sir변이를 사용하여 온도-조절된 시스템내에 삽입할 수 있다. [Rhine PH. D. in Thesis, Universiry of Oregon, Eugene, Oregon(1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Part I, 181-209(1981), Cold Spring Harbor Laboratory 참조]. 이들 변이는 효모의 휴면 교배형 카세트(cassettes)의 발현에, 따라서 간접적으로 교배형-의존성 프로모터의 발현에 영향을 준다. 그러나 일반적으로 효모-적합성 프로모터 및 효모-특이성 복제와 종결서열을 함유하는 벡터가 적합하다.

미생물외에 다세포 유기체의 배양물이 또한 적합한 숙주 유기체이다. 이론적으로는 척추동물 또는 무척추동물 세포 배양물중의 하나로부터 얻은 특정 배양물을 사용할 수 있다. 그러나 최대의 관심은 척추동물 세포에 집중되었으며, 그 결과 배양물중에서 척추동물 세포를 증식(조직 배양)하는 것이 최근에는 일상적인 과정이 되었다[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors(1973) 참조]. 이런 종류의 유용한 숙주 세포중의 예로는 베로(VERO) 및 헬라세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 및 W138, BJL. COS-7 및 MDCK 세포수가 포함된다. 이들 세포용 발현 벡터는 일반적으로 복제 기점, 발현될 유전자 앞에 위치한 프로모터, 필수적 RN 스플라이싱(splicing) 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전자 종결 서열을 함유한다.

포유류 세포에 사용할 경우 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 물질로부터 취한다. 예를들면 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 아데노바이러스 2, 특히 종종 시미안 바이러스 40(SV 40)으로부터 수득한다. SV 40의 초기 및 말기 유전자의 프로모터는 SV 40의 바이러스 복제 기점을 여전히 함유하는 단편으로서 둘다 바이러스로부터 용이하게 수득할 수 있기 때문에 특히 유용하다[Fiers 등, Nature 273, 113(1978)참조]. SV 40의 작은 또는 큰 단편이 바이러스 복제 부위내에 HindⅢ 절단 부위로부터 Bgl1 절단 부위까지 연장되는 약 250bp 길이의 서열을 함유한다면 이 단편들을 사용할 수도 있다. 또한, 목적 유전 서열과 정상적으로 연결된 프로모터 또는 제어 서열을 사용하는 것도 또한 가능하고 종종 바람직한데, 단 이들 제어 서열은 숙주 세포 시스템에 적합해야한다.

복제 부위는 예를들면 SV40 또는 기타 바이러스 공급원(예를들면 플리오마,아데노, VSV,PBV 등)으로 부터의 외인성 부위를 도입시키기 위하여 적합한 벡터 구성에 의해 제공되거나, 또는 숙주 세포의 염색체 복제 기작에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체내로 통합될 경우에는 후자의 방법이 일반적으로 만족스럽다.

그들은 생물학적 활성 범위를 근거로, 본 발명에 따른 신규한 하이브리드, 특히 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 인터페론은 공지된 인터페론이 사용되는 어느 형태의 치료에도 사용할 수 있다. 예를들면 이들은 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 리노바이러스(Rhinovirus), AIDS 및 다른 바이러스 질환에서의 바이러스 감염, 여러가지 형태의 암등이다. 신규한 인터페론은 그 자체로서 또는 공지된 기타 인터페론 또는 생물학적으로 활성인 생성물, 예를들면 IFN-γ, IL-2, 기타 면역 조정인자 등과 함께 사용할 수 있다.

IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)와 같은 IFN-오메가/α 하이브리드는 항종양 또는 항바이러스 치료가 필요한 경우 및 면역-억재된 환자에게 있어서 항바이러스 예방을 위해 비경구적 경로로 투여할 수 있다. 투여량 및 투여율은 IFN-α물질에 대해 임상적 시도시 현재 사용하는 것과 비슷한데, 예를들면 1일 약 (1-10×10⁶단위이고, 1% 순도 이상인 제제에서는 매일 약 5×10⁷단위이하이다.

예를들면 상당히 균질하게 세균적으로 생산된 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 에 대한 비경구적 용도의 용이한 투여 형태를 제조하기 위해서는, IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 3㎎을 5% 사람 혈청 알부민 25ml에 용해시킬 수 있다. 그후, 이 용액을 세균학적 필터를 통해 여과시키고, 여과된 용액을 무균 조건하에서100개의 바이알에 분배하는데, 각 바이알은 비경구적 투여에 적합한 순수한 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 6×10⁶단위를 함유한다. 유리 바이알은 사용전에 냉도 조건(-20℃)하에 보관하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 물질은 공지의 방법으로 제형화하여 약제학적으로 사용할 수 있는 조성물을 수득할 수 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체 물질과 혼합한다. 통상적인 담체 및 그들의 체형은 문헌[E. W. Martin in Remington′s Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있으며 본원에서 참조하였다. IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)는 적절한 양의 담체와 혼합하여 환자에게 효과적으로 투여할 수 있는 적합한 약제학적 제제를 제조한다. 비경구 투여가 바람직하다.

또한, 신규의 하이브리드 인터론은 이들 인터페론, 특히 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)에 대한 항체, 또는 동시에 모 인터페론은 IFN-α2 및 IFN-오메가 1을 인식하는 항체를 제조하는데 적합하다. 그러므로, 이렇게 해서 수득한 항체는 오메가가-인터페론의 면역 친화성 크로마토 그래피에 적합하다.

따라서, 이 출원은 또한, 신규한 모노클로날 항체-생성 하이브리드 세포주, 이들의 제조 방법 및 마우스로부터 IFN-α와 오메가 인터페론, 특히 오메가 1인터 페론에 특이적인 모노클로날 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

그러므로 신규한 모노클로날 항체는 오메가 1(Glu) 또는 오메가 1(Gly) 인터페론의 고도의 정제 및 검출에 특히 적합하다.

여기에 필요한 항체-생성 히이브리드 세포주는 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)와 같은 하이브리드 인터페론으로 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포, 예를들면 골수종 세포주 P3-X-63Ag8-653[Nature 266, 550-552(1977)참조]과 세포융합시켜 수득한다. 이렇게 해서 수득한 세포주는 면역화에 사용한 하이브리드 인터페론 및 두개의 모 인터페론의 항바이러스 활성 모두, 예를들면 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)경의 경우, 오메가 1인터페론 및 IFN-α2(Arg)의 항바이러스 활성을 중성화시킬수 있으며 오메가 1인터페론의 친화성 크로마토그래피에 적합한 다량의 항체를 분비한다.

생물학적으로 불활성인 담체에 공유 결합한 후, 이렇게 해서 수득한 항체는 오메가 1인터페론 또는 IFN-α2의 한외-정제(ultra-purification)에 사용할 수 있다.

항체는 상응하여 활성화된 담체, 바람직하게는 덱스트란 기본의, 예를들면 Pharmacia Uppsala사 제품인 CNBr-활성화된 세파로스 또는 CH-활성화된 세파로스에 공유 결합시킨다. 한외-정제시, EP-A-0,170,204에 기술된 방법 또는 상술한 신규의 플라스미드를 사용하는 본 발명에 따라 적절히 수득한 정제해야 할 오메가 1인터페론의 용액을, 약염기성 pH, 예를들면 pH 7 내지 8, 바람직하게는 pH 7.5에서 제조한 항체 친화성 담체를 통해 펌프질하고, pH 7.5에서 용출물에 단백질이 없어질때까지 세척하며, 계속해서 결합된 인터페론을 산성 범위에서 예를 들면 25% 에틸렌 글리콜중의 0.1M 시트르산을 사용하여 용출시킨다. 그후, 이렇게 해서 수득한 단백질- 함유 분획을 강한 산성 양이온 교환기, 예를들면 파마시아사가 제조한 양이온 교환기 Mono-S를 통해 크로마토그래피한다. 상기 용출몰중 사람 인터페론은 양이온 교환기 컬럼에 즉시 흡착되고, 계속해서 NaCl 구배사용에 따라 용출된다.

본 출원과 관련하여 필요한 기본 플라스미드는 각각 EP-A-0,115,613 및 EP-A-0,170,204와 연루되어 독일 미생물 보관소(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen)에 기탁하고 있으며, 예를들면 pER103은 DMS No.2773으로 1983년 12월 20일에 기탁되었고, E76E9는 DMS No. 3003으로 P9A2는 DMS No. 3004로 1984년 7월 4일에 기탁 되었으며, 분양에 필요한 발표가 이미 이들 클론에 대해 이루어졌다. 이들 플라스미드를 사용하여, 당분야 전문가들이 EP-A-0,115,613 및 EP-A-0,170,204[ 또한 Nucleic Acids Res. 13, 4739-4749(1985)참조]를 참조하여 본 발명을 용이하게 재현할 수 있다.

하기의 실시예는 제한함없이 본 발명을 설명하기 위한 것이다:

[서문]

모는 효소반응은 제조회사가 지시한 조건하에서 수행한다.

[실시예 1]

parpATER33의 제조

parpER33 10㎍을 반응 용액 200μl중에서 BamH I 및 Pat I 각각 20유니트로 사용하여 절단한다. 그후, 형성된 두 단편을 1% 아가로스겔에서 분리한다[1×TBE 완충액중 1% 아가로스 : 10.8g/l의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 5.5g/1의 붕산, 0.93g/1의 에틸렌디니트릴로테트라아세트산 이나트륨염(EDTA) 및 0.5㎎/1의 에티듐 브로마이드(EtBr), 영출 완충액은 1×TBE ; 5V/㎝에서 전기영동 ; DNA단편은 UV광(254㎚)을 아가로스겔에 투사하여 가시화 함]. 인터페론 α2-Arg(IFN-α2(Arg)를 하유하는 작은 단편는 단리하고[DE-81 페이퍼(Whatman)상에 DNA밴드를 전기영동하고 페리퍼를 200mM NaCl, 2.5mM 트리스 pH=7.5, 1mM EDTA로 세척하며, DNA를 1M NaCl, 25mM 트리스 (pH=7.5), 1mM EDTA로 용출시킴]. 에탄올 2.5용적을 가하여 DNA를 침전시킨다. 원심분리한 후, DNA를 건조시키고 적당한 용적의 TE 완충액(10mM 트리스(pH=8.0), 1mM EDTA)에 취한다.

pAT153 10㎍을 또한 반응 용액 200μl중에서 BamH I 및 Pat I 20유니트로 절단하고 수득한 단편을 분리한다. 복제 기점을 함유하는 큰 단편을 pAT153으로부터 단리한다.

정제된 DNA단편 0.5㎍을 반응 용액[66mM 트리스(pH=7.5). 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM EDTA, 1mM 아데노신 트리포스페이트(ATP)]20μl 중에서 T₄DNA리가아제 5유니트로 연결시킨다. 그후, 수용능이 이. 콜라이 HB101 세균[F^-,hadS20(r^-,m^-), recA13, ara-4, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Smr), xyl-5, mtl-1, supE44, 람다^-]150μl를 리가아제 반응 혼합물1μl와 혼합하고, 0℃에서 30분동안 배양하며, 42℃에서 2분동안 배양하여 DNA로 형질전환시킨다.[수용능의 이. 콜라이 세균 : 이. 콜라이를 LB 배지(10g/1의 트립토판, 5g/1의 효모추출물, 5g/1의 NaCl, (pH=7.5)에서 OD600㎚=0.3까지 생육하도록 하고 원심분리한다. 세균을 50mM CaCl₂빙냉 용액 0.5용적에 재현탁하여 30분동안 배양한다. 다시 원심분리한 후, 세균을 초기 용적의 1/15용적의 50mM CaCl₂재현탁한다]. 세균 현탁액을 50㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 한펀(LB 배지에 15g/l의 한천을 가함)상에 도말한다. 37℃에서 16시간 배양한 후, 이렇게 해서 형성된 콜로니 12개를 선별하고, 이들로부터 플라스미드를 미시적 규모로 단리한다[Birnboin, H.C. 및 Doly, J., Nucl. Acids Res, 7. 1513(1979)참조]. Pst I-BamH I, Pst I-PvnⅡ 및 EcoRI-BamHI제한 효소로 이중 분해하고 계속해서 겔 전기영동한 후, 예상 단편이 출현하는지 여부로 구성의 정확도를 확인한다. 하나의 플라스미드를 선택하여 parpATER33으로 명명한다. parpATER33으로 형질전환된 이. 콜라이는 표현형 Ap^r(암피실린 내성) 및 Tc^r(테트라사이클린 내성)을 나타낸다.

[실시예 2]

pRHW14의 제조

parpATER33 10㎍을 반응 용액 150μl 중에서 HindⅢ 및 BamH I으로 이중 분해한다. 생성된 3개의 DNA 단편을 1% 아가로스 겔상에서 분리하고, 약 3750 염기쌍(bp) 길이의 최대 단편을 단리한다(단편 a). 이 단편은 트립토판 프로모터/오퍼레이터(세라티아 마르세슨스), 복제기점 및 Ap^r유전자를 가지고 있다. pRHW12 10㎍도 또한 반응 용액 150μl 중에서 BamH I 및 HindⅢ 로 이중 분해한다. 생성된 두 단편을 겔 전기영동으로 분리하고 IFN-오메가 1(Gly) 유전자를 함유하는 약 800bp 길이의 작은 단편을 단리한다(단편 b). 단편(a) 40ng을 T₄DNA 리가아제 5유니트를 함유하는 반응 용액 10μl 중에서 단편(b) 약50ng과 연결시킨다. 수용능의 이. 콜라이 HB101 현탁액 200μl를 리가아제 반응 용액과 혼합하고, 세균을 42℃에서 열충격을 가해 형질 전환시켜, 50㎍/ml의 암피실린이 함유된 한천상에 도말한다. 37℃에서 16시간 배양한 후, 이렇게 해서 수득된 콜로니 6개를 선별하여 세균으로부터 미시적 규모로 플라스미드 DNA를 단리한다. DNA를 제한 엔도뉴클레아제 EcoR I, HindⅢ, Nco I 및 Pst I으로 분해하고 계속해서 단편들을 겔 전기영동으로 분석한 후, 플라스미드중 목적구조를 갖는 하나를 확인한다. 이 플라스미드를 pRHW14라 명명한다. pRHW14로 형질 전환된 이. 콜라이는 표현 Ap^r과 Tc^s를 나타낸다.

[실시예 3]

플라스미드-암호화된 단백질의 검출

플라스미드-암호화된 단백질은 맥시셀 시스템[Sancar. A., Hack, A.M. 및 Rupp. W.D., J. Bacteriol. 137, 692-693(1979)참조]을 사용하여 검출할 수 있다. 이 목적을 위해, 플라스미드 pRHW12 및 pRHW14로 형질전환된 이.콜라이 CSR603[F^-, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recA1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98(nalA98), rpsL31, tsx-33, 람다^-, supE44]을 발현 배지[10g/

의 (NH₄)₂PO₄, 3.5g/

의 KH₂PO₄,(pH=7.3), 0.5g/

의 NaCl 21g/

의 카제인 가수분해물(산-가수분해된, 비타민 부재의), 11g/

의 글루코스, 1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 1㎎/

의 염산 티아민, 20㎎/

의 L-시스테인, 100㎎/

의 암피실린]에서 37℃로 OD600㎚=0.6의 밀도까지 생육시킨다. 배양물 100ml를 개방 페트리 접시에서 UV 살균램프(15W)로 50㎝의 거리에서 5초동안 투사하고 1시간 더 배양한다. D-사이클로세린 10㎍을 배양물에 가하여 계속 증식할 수 있는 세균을 살균시킨다. 37℃에서 16시간 배양한 후, 세균을 원심분리하고, 허쉬(Hershey) 염 용액[5.4g/

의 NaCl, 3.0g/

의 KCl, 1.1g/

의 NH₄Cl, 15㎎/

의 CaCl₂×2H₂O, 0.2g/

의 MgCl₂×6H₂O, 0.2㎎/

의 FeCl₃×6H₂O, 87㎎/

의 KH₂PO₄, 12.1g/

의 트리스(pH=7.4)] 5ml로 2회 세척하며, 허쉬 배지(허쉬염 100ml당 다음 성분 함유 : 20% 글루코스 2.0ml, 2% 트레오닌 0.5ml, 1% 로이신 1.0ml, 2% 프롤린 1.0ml, 2% 아르기닌, 0.1% 염산 티아민 0.1ml)5ml 중에서 20㎍/ml의 인돌아크릴산(IAA)과 함께 배양한다.³⁵S-메티오닌 5μCi/ml를 가하고 37℃에서 1시간 더 배양하여 새로 합성된 단백질을 방사능으로 표지한다. 세균을 원심분리하고 Na-도데실설페이트(SDS) 샘플 완충액(6.6mM Na 포스메이트(pH=6.8), 2mM EDTA, 2% SDS, 3% 글리세롤, 0.02% 브로모 페놀 블루 및 0.66% 2-메갑토에탄올) 200㎍ 중에서 100℃로 5분동안 용균시킨다. 그후, 샘플을 15% 폴리아크릴아미드 결에서 분리한다. (분리용 겔 : 15% 아크릴아미드, 0.4% 비스아크릴아미드, 375mM 트리스(pH=8.8), 2mM EDTA, 0.1% SDS ; 수거용 겔 : 6% 아크릴아미드, 0.16% 비스아크릴아미드, 375㎜ 트리스(pH=6.8), 2mM EDTA, 0.1% SDS; 전극 완충액 : 3.0g/

의 트리스, 14.2g/

글리신, 0.335g/

의 EDTA, 0.5g/

의 SDS ; 전기영동기간 : 일정 20㎃에서 16시간). 겔을 20% 메탄올 및 7.5% 아세트산에서 1시간동안 고정시키고, 5% 메탄올 및 1% 글리세롤에서 30분동안 항온처리하며, 겔 건조기에서 건조시킨다. 겔을 -80℃에서 증감도장(intensifitrfield)을 사용한 코닥(Kodak) X Omat S X-선 필름상에 노출시킨다. 암피실린-내성 유전자 생성물(β-락타마아제)은 두 경우에 있어 동일한 강도로 표시된다. 그러나, pRHW14를 사용할 경우, IFN-오메가1이 g/ℓ12를 사용한 경우보다 2배나 더 강하게 표지된다(제3도 참조)

[실시예 4]

세균으로부터의 IFN-오메가 1(Gly)의 추출

g/

12 또는 g/

14로 형질전환시킨 이. 콜라이 HB101을 20㎍/ml의 IAA가 함유된 발현 배지에서 OD600㎚=20까지 생육한다. pH 2가 될 때까지 H₂SO₄를 가하여 세균을 살균시키고 20℃에서 60분동안 배양한다. 세균을 원심분리하여 분리하고 이 세균 집단을 후처리를 위한 준비때까지 -20℃에서 냉동시킨다. 세균을 1% 아세트산 10용적에 재현탁시킨다. 2N NaOH를 가하여 용액의 pH를 10으로 조정하고 현탁액을 0℃에서 2시간동안 교반한다. 그후, 2N HCl를 사용하여 pH를 7.5로 재조정하고 원심분리[J2-21 원심분리기(beckman), JA10로터(rotor), 4℃, 10,000rpm, 30분]하여 세포 부스러기를 제거한다. 표준품으로서 IFN-α2(Arg)를 사용하여 뇌심근염(EMC) 바이러스에 감염된 사람 A549세포(사람 페암 세포주)에 대한 세포변성 효과(CPE) 환원 시험에 의해 상층액(조추출물)의 인터페론 활성을 측정한다. g/

12로 형질전환시킨 이. 콜라이의 세균집단은 100,000유니트/그램(독립적인 3개의 배양물의 평균)을 산출하고, 반면에 클론 pRHW14는 200,000유니트/세균집단 그램(15배양물)을 산출한다.

[실시예 5]

하이브리드 인터페론 발현 클론 pRH72의 구성

parpATER33 및 pRHW14 10㎍을 Bg1Ⅱ 및 Sph I이 함유된 100μl의 용액에서 각각 이중 분해한다. 수득한 단편을 0.8% 아가로스 겔상에서 분리하고, DNA를 용출시키며, 침전에 의해 정제한다. 단편을 TE 20㎍에 용해시킨다. parpATER33의 큰 단편 1μl와 pRHW의 작은 단편 5μl을 T₄DNA 리가아제 5유니트를 사용하여 총 20㎍ 중에서 연결 반응시켜 IFN-α2/오메가 1(Bg1Ⅱ)의 발현 플라스미드를 제조한다. 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨 후, 생성된 암피실린 내성 클론 일부의 플라스미드를 미시적 규모로 단리하고, Bg1Ⅱ/Sph I을 사용한 이중제한 효소 분해로 구성의 정확도를 점검한다. 이렇게 해서 선택한 플라스미드중 하나를 pRH72로 명명한다. 이 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이는 표현형 Ap^r및 Tc^s를 갖는다.

[실시예 6]

플라스미드 pRH78r 및 pRH78f의 구성

g/

14의 큰단편 1μl를 T₄DNA, 라가아제 5유니트를 사용하여 반응 용액 20㎍ 중에서 IFN-Q2(Arg)의 C-말단을 암호화하는, parpATER33으로 부터의 Bg1Ⅱ(2)-Sph I 단편 5μl와 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101을 생성된 플라스미드로 형질전환시키고, 실시예 5에 기술한 바와같이 목적하는 구성의 플라스미드를 선별한다. 이 중간 플라스미드는 pRH77로 명명한다. 하이브리드 인터페론 오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)에 대한 유전자를 완성하기 위해서는, parpATER33을 Bg1Ⅱ로 절단하였을 때 분리된 단편을 pRH77내로 도입하여야 한다. 이렇게 하기 위해, 용액 50μl 중의 pRH77 10㎍을 Bg1Ⅱ로 절단하여 분리한 단편을 pRH77내로 도입하여야 한다. 이렇게 하기 위해, 용액 50μl 중의 pRH77 10㎍을 Bg1Ⅱ로 절단하고, 용액의 용적을 2×CIP 완충액 : 100mM트리스(pH=9.0), 2mM MgCl₂, 0.2mM ZnCl₂)을 사용해 2배로 하며, CIP(Boehringer Mannheim) 1유니트를 가하여 (37℃에서 60분)5′-말단 포스페이트를 제거한다. pRH77의 선형화된 형태를 아가로스 겔 전기영동하고 DNA를 용출시키며 계속해서 침전시켜 정제한다. DNA를 TE완충액 20μl에 취하고 그중 1μl를 T₄DNA 리가아제 5유니트를 사용하여 반응 용액 총 10μl 중에서 parpATER33을 Bg1Ⅱ/SphI으로 분해하여 수득한 263bp 단편(Bg1Ⅱ(1)-Bg1Ⅱ(2) 단편)5μl와 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101을 형질전환 시킨다. 이렇게 해서 형성된 6개의 콜로니로부터의 DNA를 분석한다. 263bp 단편의 삽입은 동일한 말단으로 인해 두 방향으로 일어날 수 있기 때문에, 제한 엔도뉴클레아제 Alu I 및 HaeⅢ를 사용하여 정확한 구조에 대해 플라스미드들을 점검한다. Bg1Ⅱ 단편이 발현을 위한 정위치에 삽입된 플라스미드를 pRHW78r로 명명하며, 반면에 발현을 위해 잘못된 배향의 것을 pRH78f라 명명한다. pRH78r 또는 pRH78f로 형질 전환된 이. 콜라이는 표현형 Ap^r및 Tc^s을 나타낸다.

[실시예 7]

인터페론(항바이러스) 활성 측정을 위한 용해질 시험

여러 가지 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이를 20㎍/ml의 IAA와 함께 발현 배지 35ml에서 37℃로 OD600㎚까지 생육한다. 센균을 원심분리한다. 세균 펠릿을 50mM 트리스(pH=7.6)/30mM MgCl₂용액 3.5ml에 취하고, 얼음으로 냉각시키면서 초음파 분쇄기(MSE, Soniprep 150)를 이용해 최대 동력으로 파쇄한다. 현탁액을 10분동안 원심분리하고(J2-21 원심분리기, 10,000rpm, 4℃, JA20로터) 상층액을 멸균 조건하에서 여과한다. 용액의 항바이러스 활성을 CPE환원 시험(A549 세포, EMC 바이러스)에 의해 측정한다. pRH72(IFN-α2 오메가(Bg1Ⅱ))로 형질전환시킨 이.콜라이나 완성된 IFN-오메가 1의 처음 64 아미노산에 이어 세린을 함호화하는 pRH78f로 형질전환시킨 이. 콜라이는 어떠한 항바이러스 활성도 나타내지 않는다. 이와는 대조적으로 클론 pRH78r 내의 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)암호화 서열은 배양물 리터당 및 OD600㎚ 세균 밀도당 인터페론 약 30×10⁶유니트를 산출하며(표준품으로서 IFN-α2(Arg)와 비교), 이는 A549 세포상에서 IFN-α2(Arg)의 것보다 거의 4배나 큰 특이적 항바이러스 활성이다.

하기 도표는 IFN-α2(Arg)와 비교한 하이브리드 인터페론 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)의 아미노산에 있어서의 변화를 수록한 것이다 :

[표 1]

범례 : a : 산성, ar : 방향족, b : 염기성, 1 : 비극성, p : 극성, 0 : 이 위에는 아미노산이 없음.

전하(위치)에서의 차이점:

1) 양성 전하 1개 상실 : 14

2) 양성 전하 4개 수득 : 20,38,45,53

3) 음성 전하 2개 상실 : 43,53

하이브리드는 IFN-α2(Arg)보다 양성 전하를 5개 더 함유함.

[실시예 8]

IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)의 정제

℃에서 냉동하였던 산-처리한 클론 HB101/pRH78r의 이. 콜라이 145g을 1% 아세트산 1450ml 중에서, 얼음으로 냉각하면서 물질이 균일하게 분배될 때까지(약 30분) 교반한 후, 울트라-투락스 T 45/6(ultra-Turrax T 45/6 ; Janke and Kunkel)를 사용하여 10,000rpm에서 2×1분동안 균질환시킨다. 그후, 폴리민 P(Polymin P : Serva, 카탈로그 번호 33141)를 0.25% 농도까지 가하고 5N NaOH를 이용해서 pH를 10.0으로 조정한다. 얼음으로 냉각하면서 2시간 교반한 후, 5N HCl을 이용해 pH를 7.5로 조정하고, 조추출물을 원심분리(Christ Cryofuge 6-6 S, 3000rpm, 1 시간, 약 4℃)하여 청정하게 한다.

인터페론을 침전시키기 위해 조추출물을 430g/

의 황산 암모늄과 혼합하고, 침전이 완료될 때까지 4 내지 8℃에서 16시간동안 방치한다. 그후, 침전물을 원심분리(베크만 원심분리기 J2-21, 로터 JA10, 10,000rpm, 60분, 4 내지 8℃)하여 회수한다. 황산 암모늄 펠릿을 0.01M NaCl 145ml에 취하고 5N NaOH를 사용하여 현탁액을 pH 7.5로 조정한다. 3시간 교반한 후(얼음으로 냉각하면서) 용액이 맑아질 때까지 원심분리(베크만 J2-21, 로터 JA10, 10,000rpm, 4℃, 60분)하고, 네프로스-알레그로 투석 카트리지(Nephross-Allegro Dialysis Cartridge ; Messrs, Organon)를 사용하여 인터페론 용액이 370mOsmol/

의 삼투몰 농도를 가질 때까지 0.01M NaCl에 대해 투석한다.

직렬식 크로마토그래피 : 크로마토그래피 정제를 위하여 DE-52 셀룰로오스 75g의 컬럼(Whatman)을 0.025M트리스/HCl+0.2M NaCl(pH 7.5)로 평형화하고, 세파로스 4B와 결합된 모노클로날 항체 EBI-1(EP-A-0,119,476 참조)을 함유하는 친화성 컬럼(60ml)[BrCN-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia)를 사용하여 제조]의 앞에 삽입한다. 친화성 컬럼은 모노클로날 항체 EBI-1을 480㎎ 함유하고, 또한 상술한 바와같이 트리스/HCl+NaCl(pH 7.5)로 평형화되어 있다. 인터페론 용액을 두 컬럼을 통해 펌프질하고, 0.1미만의 OD280㎚ 흡광도만이 용출액에서 측정될 때까지 0.025M 트리스/HCl+0.2M NaCl로 세척한다. 그후, 예비 컬럼(DE-52 셀룰로오스)을 분리하고 EBI-1 컬럼을 용출액에 단백질이 없어질 때까지(용출액의 OD280㎚이 0.01 미만) 세척한다. 그후, 흡착된 인터페론을 25% 에틸렌 글리콜중 0.1M 시트르산을 사용하여 용출시킨다. 단백질 피크를 수거한다. 항체 컬럼으로부터의 산 용출액을 2N 암모니아를 이용해 pH 4.5로 조정하고 형성된 침전물을 원심분리하여 분리한다.

최종 정제단계는 담체 MONO-S(파마시아)상의 이온 교환 크로마토그래피이다. 베드 용적이 1ml인 컬럼(HR 5/5)을 FPLC장치(파마시아)와 연결하고 0.1M Na-시트레이트(pH 4.2)로 평형화한다. IFN 용액을 적용시키고 흡착된 인터페론을 pH 구배[완충액 A : 0.1M Na 시트레이트(pH 4.2) 및 완충액 B : 0.1M Na-포스페이트(pH 8.0)]를 이용해서 용출시킨다. 인터페론-오메가 1을 pH 7.0에서 용출시키고, IFN 피크를 수거한다(제6도 참조).

IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)의 정제도 측정

출발물질 : 이. 콜라이 HB101/pRH78r 145g

[표 2]

X) 인터페론 함량은 A549 세포 및 뇌심근염 바이러스(ENC 바이러스)를 사용하여 항바이러스 활성을 측정(CPE 환원 시험)함으로써 결정함. IFN-α2(Arg)를 표준품으로 사용함.

XX)단백질은 Bio-Rad 단백질 측정법을 사용하여 측정함. 사용한 표준품은 혈청 알부민임.

[실시예 9]

정제도의 평가

정제된 하이브리드 인터페론-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)는 균질하다(참조 : 제7도-겔 침투 HPLC). 수득한 약 800×10⁶유니트/단백질㎎의 특이적 활성은 IFN-α2(Arg)의 경우(약 300×10⁶유니트/단백질㎎) 보다 높다.

[실시예 10]

HuIFN-오메가 1에 대한 모노클로날 항체의 제조

a)면역화

약 8주된 Balb/c 마우스 암컷 두마리를 고도로 정제된 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)(순도＞95%, 0.1M 인산나트륨/나트륨 시트레이트(pH 7)중에 용해)로 다음과 같이 면역화시킨다.

1차 면역화 : 완전 프로인트 보조액(Freumd's adjuvant)를 함유하는 유탁액중 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 복강내 주사.

2차 면역화 : 불완전 프로인트 보조액을 함유하는 유탁액중 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 1차 면역화 한달후에 복강내 주사.

2차 면역화 10일후 혈액 샘플을 취한다. HuIFN-오메가 1, HuIFN-α2(Arg) 및 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)의 항바이러스 활성을 중성화시키는 혈청의 능력을 하기와 같이 시험한다 : 세포 배양 배지중 혈청 샘플의 희석액 100μl를 세포 배양 배지중 IFN용액(100항 바이러스 유니트/ml)100와 혼합하고 37℃에서 90분동안 배양한다. 그후, 샘플의 항바이러스 활성을 생물학적 시험으로 측정한다(A549 페암세포, 뇌심근염 바이러스).

[표 3]

부호 : + 완전 중성화, +/- 부분 중성화, -중성화 활성 없음.

2차 면역화 4주후, 마우스 1에게 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 추가로 정맥내 주사한다. 3일후 비장을 절제하여 하이브리도마를 제조하는데 사용한다. 2차 면역화 3주후 마우스 2를 다시 면역화한다 ; IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 복강내 투여하고 오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 피하 투여한다. 2주후 다른 혈정 샘플을 취하는데 이는 상술한 시험에서 1 : 100의 희석도로 HuIFN-오메가 1에 대해 부분적 중성화 효과를 나타낸다. 3차 면역화 4주후 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ) 100㎍을 정맥내 주사로 투여하고, 4일후 비장을 절제하여 하이브리도마를 제조하는데 사용된다.

b)하이브리도마의 제조 및 선별

쾰러 및 밀스타인이 최초로 개발한 방법[Kohler 및 Milstein, Nature 256. 495(1975) 참조]으로 비-분비 세포주 P3X63Ag8.653[Kearney 등, J. Immunol. 123, 1548(1979) 참조]을 사용하여 하이브리도마를 제조한다. 융합시 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 5% 디메틸설폭사이드와 함께 사용한다. HAT 배지중 하이브리드 세포의 선별을 또한 공지의 방법으로 수용한다[Monoclonal Antibodies : Production 및 Maintenance, Lovborg, U., William Heinemann Medical Books, London 1982; Monoclonal Antibodies, Hybidomas : A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennet, R.H., McKearn, T.J., 및 Bechtol, K.B., published by ; Plenum Press, New Youk 및 London(1980) 참조]. 이렇게 해서 두 개의 융합으로부터 총 730 하이브리도마 배양물을 수득한다. 신별을 하기와 같이 수행한다: 적어도 10 내지 20% 합류한 하이브리도마 배양물의 배양상층액을 HuIFN-오메가 1 용액(20항바이러스 유니트/ml) 등용적과 혼합하고, 37℃에서 90분동안 배양한 후, 그들의 항바이러스 활성에 대해 시험한다. 모든 배양물을 1주 간격으로 적어도 2회 시험한다. 730 하이브리도마 배양물중 하나만이 모든 시험에서 항바이러스활성의 감소를 일관되게 나타냈다. 이후 OMG-2에 해당하는 이 배양물을 한계 희석에 의해 아클론화시키고, 기술한 방법을 사용하여 아클론을 활성에 대해 다시 시험한다. 수개의 양성 아클론을 프리스탄(Pristane)으로 전처리한 마우스에게 접종한다. 아클론중 하나가 모든 마우스에서 항체-함유 복수의 형성을 초래한다. 수득한 항체를 50% 포화된 황산 암모늄 용액으로 침전시켜 부분적으로 정제한다. 생성된 제제는 약 75%의 순도로 항체를 함유한다(겔 침투 고압 액체 크로마토그래피로 측정). 약 10㎎의 항체를 복수액 1ml로부터 수득할 수 있다. 95% 이상 순도까지의 추가의 정제는 음이온 교환 크로마토 그래피에 의해 달성한다.

C) 항체 OMG-2의 특성 분석

비-환원 조건하에 나트륨 도데시설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 항체 ONG-2는 분자량이 약 150,000이다. 겔 침투 고압 액체 크로마토그래피에서 항체는 IgG 마커 단백질과 동일한 잔류 능력을 갖는다. 따라서 항체는 IgG 타입으로 보인다.

중성화 시험(실시예 10b 참조)에서는, 황산 암모늄 침전(실시예 10b 참조)에 의해 부분적으로 정제한 항체에 대해 하기 결과가 수득되었다:

[표 4]

따라서 항체는 마우스를 면역화하는데 사용한 하이브리드 IFN-오메가 1/α2(Bg1Ⅱ)에 대해 강력한 중성화 효능을 갖고 있으나, HuIFN-α2(Arg) 및 HuIFN-오메가 1에 대한 효능은 거의 500배나 미약하다. HuIFN-오메가 1에 대한 친화성이 명백히 비교적 미약함에도 불구하고, 항체 OMG-2는 이 인터페론의 면역 친화성 크로마토그래피에 성공적으로 사용할 수 있다(실시예 11 참조).

[실시예 11]

IFN-오메가 1의 정체

a)추출 및 CPG 크로마토 그래피 :

-20℃로 냉동시킨 클론 pRHW14의 산-침전된 이. 콜라이 794g을 얼음으로 냉각하면서 1% 아세트산 7700ml에 물질이 완전히 분배될 때까지(약 30분)교반하고, 2N NaOH를 사용하여 pH 10으로 조정한다. 얼음으로 냉각하면서 2시간동안 교반한 후, 현탁액을 pH 7.5로 조정하고(2N HCl) 청정해질 때까지 원심 분리한다(10,000rpm에서 1시간, 4℃, 베크만 원심분리기 J2-21 내의 JA10-로터). 청정 상층액을 CPG(조절된 천공 유리, CPG 10-350, 120-200메쉬, Electro-Nucleonics Inc., USA)의 500ml 컬럼을 통해 시간당 50ml의 속도로 펌프질한 후, 컬럼을 0.025M 트리스 /HCl+1M KSCN(pH 7.5)로 철저히 세척한다. 그후 컬럼상에 흡착된 인터페론을 0.025M 트리스/HCl+50% 에틸렌글리콜중 1M NaCl(pH 7.5)으로 용출시킨다(시간당 50ml). 그후, IFN 푸울을 0.025M 트리스/HCl+0.1M NaCl에 대해 투석하면서, 동시에 10% 플리에틸렌 글리콜 40,000을 외부 용액에 가하여 IFN 푸울을 농축시킨다. 투석된 농축물을 원심분리(1시간, 4℃, 15,000rpm, 베크만 원심분리기 J2-20 내의 JA-20 로터)하여 청정하게 한다.

b)OMG-2-세파로스상의 친화성 크로마토그래피

정제된 모노클로날 항체 OMG-2를 BrCN-활성화된 세파로스 4b를 이용하여 제조회사의 설명서(파마시아)에 따라 담체 세파로스 4B에 결합시킨다. 모노클로날 항체 16㎎을 활성화된 세파로스 4B의 매 그램에 대해 사용한다. 용적 8ml의 친화성 컬럼을 기술한 분리시에 사용한다.

실시예 11a에 따른 CPG 컬럼으로부터의 농축물을 친화성 컬럼을 통해 분당 4ml의 속도로 펌프질한 후, 용출액에 단백질이 없어질 때까지(용출액의 OD28㎚ 값이 세척 완충액과 동일) 컬럼을 0.025M 트리스/HCl+0.1M NaCl(pH 7.5)로 세척한다. 결합된 인터페론을 25% 에틸렌 글리콜중 0.1M 시트르산을 사용하여 2ml/분의 속도로 용출시킨후, 단백질 피크(OD280㎚)

c) 담체 MONO-S 상의 이온 교환 크로마토그래피

FPLC 장치(파마시아)에 결합된 담체 물질 MONO-S의 1ml 컬럼(HR 5/5)을 사용한다(둘다 파마시아사 제품). 이온 교환 컬럼을 25% 프로필렌 글리콜중 0.1M K-포스페이트(pH 6.0)로 평형화하고, 실시예 11b에 따라 수득한 친화성 컬럼으로부터의 용출물을 0.5ml/분의 속도로 펌프질한다. 그후, 흡착된 인터페론을 NaCl 구배[완충액 B : 25% 프로필렌 글리콜중 0.1M K-포스페이트+1M NaCl(pH 6.0)]를 사용하여 용출시킨다. 분획(각각 1ml)을 인터페론 활성에 대해 시험한다. 46%의 완충액 B에서의 첫번째 피크(OD280㎚)는 인터페론-오메가를 함유한다(제8도 참조).

d) 역상 HPLC

입자 직경이고 5 마이크론이고 구경 직경이 300Å인 베이커 본드(Bakerbond) WP-RP 18컬럼, 4×250㎚를 정지상으로 사용한다. 이동상은 0.1% 트리플루오로아세트산중 아세토니트릴의 구배이다 :

완충액 A : 물중 0.1% 트리플루오로아세트산

완충액 B : 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산

28분에 20 내지 68% B의 구배

유속 : 1ml/분

검출 : OD214㎚

실시예 11c에 따라 수득한 단백질(MONO-S에 따른 IFN 푸울) 630㎍을 적용한다. 용출물을 48 내지 65% B의 범위에서 시험한다. 인터페론 오메가 1을 24.5분의 잔류시간과 63%의 완충액 B로 용출시킨다(제 9도 참조). 수득량은 5 내지 10㎍이고 특이한 활성도는 ＞10⁸유니트/단백질㎎이다.

e) N-말단 아미노산 서열의 결정

실시예 11d에 따라 수득한 IFN-오메가 1피크(RP-HPLC)를 스피트백(Speedvac)원심분리기에서 건조시키고 타입 470A 서열결정기(Applied Biosystems)에서 분석한다. 하기 아미노산 서열이 수득된다.

이 서열은 cDNA로부터 유도된 아미노산의 순서를 나타낸다(제1위치의 시스테인은 단백질의 환원 및 알칼화없이는 검출할 수 없고 제7위치의 히스티딘은 명확히 검출할 수 없다).

IFN-오메가 1정제의 요약 :

1. 추출 및 CPG 크로마토그래피

[표 5]

2. OMG 2-세파로스상의 친화성 크로마토그래피

[표 6]

3. MONO-S상의 이온 교환 크로마토그래피

[표 7]

X)인터페론 함량은 A549 세포 및 뇌심근염 바이러스(EMC 바이러스)를 사용해서 항바이러스 활성을 측정(CPE 환원 시험)함으로써 결정한다. 표준품 : γIFN-α2(Arg). 이 값은 3개의 독립적인 시험의 평균치이다.

XX) 단백질은 Bio-Rad 단백질 측정법에 의해 측정한다. 표준품은 혈청 알부민이다.

Claims (11)

1. 플라스미드 parpER33을 BamH I 및 Pst I로 분해하여 수득한 작은 단편을, 플라스미드 pAT153을 BamH I 및 Pat I로 분해하여 수득한 큰 단편에 연결시켜 수득함을 특징으로 하여 하기 제한 지도의 플라스미드 parpATER33을 제조하는 방법.

   
2. 제1항에 따라 제조한 플라스미드 parpATER3의 약 3750bp 길이의 HindⅢ-BamH I단편을, 오메가 1 인터페론을 암호화하는 폴리스미드를 HindⅢ 및 BamH I로 분해하여 수득한 약 800bp 길이의 단편에 연결시켜 수행함을 특징으로 하여 하기 제한 지도의 발현 플라스미드를 제조하는 방법.

   

   상기 식에서, IFNω1은 IFN-오메가 1(Gly) 또는 IFN-오메가 1-Glu)을 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
3. 제2항에 있어서, 수득된 발현 플라스미드가 IFNω1이 IFN-오메가 1(Gly)을 암호화하는 DNA 서열을 나타내는 플라스미드 pRHW14인 방법.
4. 제1항에 따라 제조한 플라스미드 parpATER33을 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 분해하여 수득한 큰 단편을, 제3항에 따라 제조한 플라스미드 pRHW14를 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 분해 하여 수득한 작은 단편에 연결시켜 수득함을 특징으로 하여 하기제한 지도의 발현 플라스미드 pRH72를 제조하는 방법.

   
5. 제3항에 따라 제조한 플라스미드 pRHW14를 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 분해하여 수득한 큰 단편을, 제1항에 따라 제조한 플라스미드 parpATER33을 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 분해하여 수득한 작은 단편에 연결시켜 수득함을 특징으로 하여 하기 제한 지도의 발현 플라스미드 pRH77를 제조하는 방법.

   
6. 제5항에 따라 제조한 플라스미드 pRH77을 Bg1Ⅱ로 절단하고 계속해서 제1항에 따라 제조한 플라스미드 parpATER33을 Bg1Ⅱ 및 Sph I로 분해하여 수득한 263bp 길이의 단편에 연결시켜 수득함을 특징으로 하여 하기 제한 지도의 발현 플라스미드 pRH78r을 제조하는 방법.

   
7. 세균 숙주를 제4 또는 6항에 따라 제조한 발현 플라스미드로 형질전환시킴을 특징으로 하여 형질전환된 숙주 유기체를 제조하는 방법.
8. 적합한 세균 숙주 유기체를 제4 또는 6항에 따라 제조한 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 이를 발현시킨 후, 생성된 하이브리드 인터페론을 숙주 유기체로부터 단리시킴을 특징으로 하여, α-인터페론 일부 및 오메가-인터페론 일부로 이루어진 하이브리드 인터페론, 그의 N-말단 Met 또는 N-포르밀-Met 유도체, 및 하이브리드 인터페론의 펩타이드 서열이 글라이코실화 부위를 함유할 경우에는 그의 N-글라이코실화된 유도체를 제조하는 방법.
9. 제7항에 따라 제조한 숙주 유기체를 후처리하여 수득함을 특징으로 하여, α-인터페론 일부 및 오메가-인터페론 일부로 이루어진 하이브리드 인터페론, 그의 N-말단 Met 또는 N-포르밀-Met 유도체, 및 하이브리드 인터페론의 펩타이드 서열이 글라이코실화 부위를 함유할 경우에는 그의 N-글라이코실화된 유도체를 암호화하는 DNA서열을 제조하는 방법.
10. IgG-항체 생성 하이브리드 세포주를 세포 융합에 의해 제조하고, 아클론화시키며, 세포 성장후 안티-인터페론 특이성이 있는 IgG 항체를 단리시킴을 특징으로 하여, 안티-사람 인터페론-α2, -오메가 1 및 안티-하이브리드 인터페론 특이성이 있는 마우스로부터 IgG-항체를 제조하는 방법.
11. 제8항에 따라 제조한 하이브리드 인터페론에 대한 모노클로날 항체를 함유하는 항체 친화성 컬럼을 사용하여, 재조합 방법으로 오메가-인터페론을 정제함을 특징으로 하여 하기 서열의 순수한 오메가 1 인터페론을 제조하는 방법.

    

    상기 서열에서, 위치 111의 X는 Glu 또는 Gly을 나타낸다.

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