JPS615096A - 新規ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬品などとして有用な新規ポリペプチドお
よびその製造法に関するものである。

従来の技術 γ型インターフェロン（以下工ＦＮ−γト略称すること
がある）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起る
ような状況化で、免疫担当細胞から産生されるため、免
疫インターフェロンとも呼ばれている。ＩＦＮ−γは１
ＦＮ−αやＩＦＮ−βと比較しで、抗細胞増殖活性や抗
腫瘍活性が高いといわれており、臨床応用面からよシ期
待されている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球が必
要であることなどの制約があるため、これまで効率のよ
い産生糸は確立されていなかった。、しかし最近、遺伝
子組み換え技術が広く利用されるにいたっで、工ＦＮ−
γの相補Ｄ　ＨＡ（ｃＤＮＡ）がクローン化され、その
ヌクレオチド配列やその配列から予測されるアミノ酸配
列が明らかにされるとともに、ｃＤＮＡや化学合成した
遺伝子を各種の宿主を用いて発現させることが可能とな
ってきた〔グレイ、ｐ、ｗ、ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ　）。

２９５．５０８（１９８２）、デポヌ、Ｒら、ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
、Ｒｅｓ、）、１０　、２４８７（１９８２）、タナ力
、Ｓら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　）、　１１　、１７
０７（１９８８）など〕。

さらにモノクローナμ抗体を用いる精製法によシ、遺伝
子組み換え技術で得られる工ＦＮ−γ（以下ｒ工ＦＮ−
γと略記することがある）の大量生産も可能になりＣＩ
ＰＣ公開第公開第０１０８サ９８ 発明が解決しようとする問題点 しかし、ここで得られるｒ工ＦＮ−γは、二量体や多量
体を形成しやすく不安定なため、精製や製剤化が困難で
、その精製や製剤化のために高度な技術が必須となって
いる。

本発明者らは、公知ｒ工ＦＮ−γの上記欠点はそのＮ末
端部に存在する２個のＣｙｓに基づくものであると考え
、ｒ工ＦＮ−γと同等もしくはそれ以上の生物活性を有
し、二量化や多量化を起しに。

くい新規ポリペプチドの製造に成功し、本発明を完成し
た： 本発明は、式 ％式％ 〔式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を、ＹはＣ７Ｅｌ−Ｇ
ｌｎ　、　Ｇｌｎ　、　＜　Ｇｌｎまたは結合手を示し
、Ｚは（Ｎ）Ｌｙｓ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　（Ｃ）　　で示
されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜１
６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残基
を示す〕で表わされるポリペプチド、それの工業的に有
利な製造法ならびにその製造に用いることが出来る形質
転換体を提供するものである。

ポリペ１チド（Ｉ）に関し、又は結合手であることが好
ましい。ＹはＣｙｓ−Ｇｌｎ　、　Ｇｌｎまたは＜Ｇｌ
ｎであることが好ましく、と）わけ＜　Ｇｌｎであるこ
とが好ましい。ＺはＬｙｓまたはＬｙｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　（　ＩＩ　）またはＬｙｓ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅ　ｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ　　（１Ｍ）であることが好ま
しい。

とりわけポリペプチド（Ｉ）としで、Ｘが結合手でＹが
Ｃｙｓ−Ｇｌｎまたは＜Ｇｌｎで、２がＬ７Ｅ！または
ペプチド（■）であることが好ましい。

なおポリペプチドＣＩ）においてＹが＜Ｇｌｎのときは
、Ｘは結合手である。

ポリペプチド（Ｉ）は、たとえば５′末端にＡＴＧを有
しその下流に、式 ％式％ 〔式中、７はＣｙｓ−Ｇｌｎ，Ｇｌｎまたは結合手を示
し、Ｚは（Ｎ）Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ、　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｎ　ＭｅｔＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｆｌ（Ｃ）で
示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜
１６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残
基を示す〕で表わされるポリペプチドをコードする領域
、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによシ有利に製造することができ
る。

上記したＤＮＡに関し、ポリペプチド（工′）をコード
する領域は、上記ポリペプチド（Ｉ′）をコードする塩
基配列を有するものであればいかなるものでもよく、例
えば式 ％式％ 〔式中、ＹｌはＴＧＣＣＡＧまたはＣＡＧまたは結合手
を示し、ｚｌは（５’）　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　Ａ
ＧＧ　ＡＧＴＣＡＧ　　ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴ　
　ＣＧＡ　　ＧＧＴ　　ＣＧＡ　　ＡＧＡ　　ＧＣＡＴ
ＣＣＣＡＧ　（８’）で示される塩基配列においてその
５′末端から数えて１〜１６個のコドンからなる塩基配
列を示す〕で表わされるＤＮＡが挙けられ、とりわけｆ
として’ＩＧＣＣＡＧまたはＣＡＧが、ＺｌとしてＡＡ
Ｇ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ
　ＣＴＧＴＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　Ｇ
ＣＡ　ＴＣＣＣＡＧ　（Ｖ）で示される塩基配列を有す
るものが好ましい。翻訳終止コドンとしては’ＦＡＡ　
、　ＴＧＡまたはＴＡＧが挙げられ、とシわけＴＡＡが
好ましい。

上記ＤＮＡは、５′末端のＡ’［’Ｇとポリペプチド（
工′）をコードするＤＮＡの間にシグナルペプチドＬｙ
ｓ　−Ｔｙｒ−’ｆｉｈｒ＝Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−工１ｅ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
工１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ
１７をコードする］）ＮＡ、例えはＡＡＡ　ＴＡＴ　Ａ
ＣＡＡＧＴ　ＴＡＴ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　
ＣＡＧ　ＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　
ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣを有していてもよい。

上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモーターを有してい
るのが好ましく、該プロモーターは、形質転換体の製造
に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればい
かなるものでもよい。

たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
Ｈ例、２９４、Ｗ８１１０．ＤＨｌなど）ではｔｒｐプ
ロモーター、　ｌａｃプロモーター、　ｒｅｃ　Ａプロ
モーター、λＰＬプロモーター、１ｐｐプロモーターな
ど、枯草菌（Ｂａｃｉ１１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉａ　＋
例、Ｍ１１１４など）では５ｐｏｉプロモーター、５Ｐ
Ｏ２プロモーター、　ｐｅｎＰプロモーターなど、酵母
（８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｈ例、ＡＨ２２など）でｒｉＰＨＯ５プＩｊ−ｅ−ｐ　
−、ｐＧＫプａモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＥ
Ｉプロモーターなど、動物細胞°（例、サル細胞Ｃ０８
−７、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）では５
ｖ４０由来のプロモーターなどが挙げられ、とシわけ大
腸菌を宿主としで、ｔｒｐプロモーターを使用するのが
好ましい。

５′末端にＡ’ｌ”Ｇを有しその下流にポリペプチド（
工′）をコードする領域、ついで翻訳終止コドンを有す
るｎ１Ａ（プラスミド）は、化学合成であるいは遺伝子
工学的に製造された公知の工ＦＮ−γのｃＤＮＡもしく
は染色体由来の工ＦＮ−γＤＮＡを加工することによシ
製造することができる。

上記製造法をより具体的に説明するため、公知の工ＦＮ
−γの遺伝子（ｃＤＮＡ）含有ブラヌミドｐＨ工Ｔｔｒ
ｐＨ０１（ＥＰＣ公開第０１０８８９８号公報参考例２
（ｉｉｉ）参照〕を原料にポリペプチド（ｒ；但し２は
ペプチド（■））をコードする領域を有するＤＮＡ含有
プラスミドの製造法を以下に例示する。

プラスミドｐＨＩＴｔｒｐ　１１０１を制限酵素、たと
えばＡｖａＩ［、ＰｓｔＩによる同時消化することによ
ってＩＦＮ−ｙのＮ末端からＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｎを欠いたＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを得るこ
とができる。次にたとえばＡＴＧ　（スタートコドン）
を含みＣｙｓ−Ｇｌｎ　　をコードする合成アダプター
、スタートコドンを含みＧｌｍをコードする合成アダプ
ター、わるいはスタートコドンを含む合成アダプターを
それぞれトリエステρ法〔フレア、Ｒら、プロシージン
グ・オブ・ナショナｙ・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、８ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ）−Ｌｌ、　５７
６５（１９７８）〕によって合成し、これらをそれぞれ
Ｃ’ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎを欠いたＩＦＮ−１
をコードするＤＮＡに連結する。次に得られたＤＮＡを
適当なプロモーターの下流につないで適当な宿主に導入
することができるが、必要によシＳＤ（シャイン　アン
ド　ダｙｖｔｔ−））配列をプロモーターの下流に挿入
してもよい。

本発明の形質転換体は、上記のようにして得られる発現
用プラスミドを自体公知の方法〔コーエン８．　Ｎ、　
ラ、プロシージング・オプ・ナショナμ・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　〕、６９．２１１０（１９
７２））で宿主を形質転換することによシ製造すること
ができる。

ポリペプチド（Ｉ）は、上記形質転換体を培養し、培養
物中にポリペプチド（■）を生成、蓄積せしめ、これを
採取することによシ製造することができる。

培地としては、例えばグルコース、カサミノ酸を含むＭ
９培地〔ミラー、Ｊ、、エクスベリメンツ・イン・モレ
キュラー・ジエネテイクヌ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　。

４８１−４８Ｆ３　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｏｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
　１９７２　）：）が挙げられる。

ここに、必要によジブロモ−ターを効率よく働かせるた
めに、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬
剤を加えることができる。

培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要によ
り、通気や攪拌を加えることもできる。

λＣ工七８リプレッサーと、ＰＬ７”ロモーターヲ含有
する発現ベクターとを有する組み換え体を使用する場合
には、培養は約ａθ℃〜３６℃の低温で行い、　λＣ工
七〇リプレッサーの不活化は約８７℃〜４２℃で行うの
が好ましい。またｒｅｃＡグロモーターをよシ効率よく
働かせるため、すなわちｒｅｃＡ遺伝子発現抑制機能を
低下せしめるため、必要によシマイトマイシンＣ，ナル
ジキシン酸すどのような薬剤を添加したり、紫外線を照
射したシすることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、たとえば緩衝液にけ
ん濁したのち、たとえば、蛋白変性剤処理、超音波処理
やリゾチームなどの酵素処理を行って菌体を破砕し、遠
心分離など公知の方法によって上清を得る。

なお、２が１５以下のアミノ酸を有するポリペプチドも
しくはアミノ酸残基であるポリペ１チド（■）は、当該
Ｚよりも多くのアミノ酸を有する（例えば、Ｚが前記１
６個すべてのアミノ酸を有するペプチド）ポリペプチド
（■′）をコードする領域を有するＤｌｉＡを含有する
形質転換体を培養し、形質転換体中のプロテアーゼの作
用をうけやすい条件下に精製することによっても製造す
ることができる。

上記によシ得られる上清からポリペプチド（Ｉ）を単離
するには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。とシわけ工ＦＮ−γまたはポリペプチド（Ｉ）に結
合能を有する抗体、とシわけその抗体カラムを用いて有
利に精製することができ、たとえばＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨで示されるペプチドに対するモノク
ローナル抗体の抗体カラム［ＥＰＣ公開第０１０８８９
８号公報の実施例１２（γ２−１１．１モノクロ一ナμ
抗体カラム）、実施例１８（γａ−１１．１ミー１１．
１モノクローナ上記同様作成される抗体カラム〕や＜　
Ｇｌｎ　Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−’Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　　
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈで示されるペプチドに対するモノクローナル抗体の抗
体カラム〔特願昭５８−２１５１６８号（昭和５８年１
１月１５日出願）明細書実施例１１　（ＷＮγ２−７６
．５３モノクロ一ナμ抗体の抗体カラム）〕などが例示
される。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばポ
リペプチド（１）含有物を中性附近の緩衝液、たとえば
リン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラ
ムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したの
ち、ポリペプチド（ＩＪを溶出する。溶出液としては、
弱酸性溶液たとえは酢酸溶液、ポリエチレングリコール
を含む溶液。

ポリペプチド（Ｉ’）にくらべ抗体により結合し易いペ
プチドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらの組
み合せた溶液などが用いられ、ポリペプチド（Ｉ）の分
解をあまり促進しないものが好ましい。

カラム溶出液は、常法によシ緩衝液で中和する。

必要によシ再度上記の抗体カラムによる精製操作を行う
ことができる。

ポリペプチド（１）においで、ＹがＣｙｓ−Ｇｌｎ。

Ｇｌｎまたは結合手のときは、それぞれＸが結合手であ
るポリペプチドとＸがＮｅｔであるそれとの混合物とし
て得てもよい。

・　また、ポリペプチド（１）においてＲ末端アミノ酸
がＧｌｎのときは、それが＜Ｇｌｎであるポリペプチド
（Ｉ）との混合物として得られることもある。該混合物
はそのままでも以下に記載の目的に使用できるが、必要
によシ、例えば上記精製操作の後、加熱または弱酸（例
、希酢酸）処理を行うことによりｍ末端アミノ酸が＜　
Ｇｌｎであるポリペプチド（Ｉ）に導くことができる。

ここで得られるポリペプチド（Ｉ）溶液は透析に付し、
必要によシこれを凍結乾燥によシ粉末とすることができ
る。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニド−μ
、デキヌトローヌ、マｐドース、グリセロールなどの安
定剤を加えることができる。

かくして得られるポリペプチドＣＩ）は、Ｃｙｓを１個
のみまたは全く有さないため、従来のｒ工］ｉ’ＢＴ−
ｒに比し二量化や多量化を起しにくく安定な単量体とし
て得られ、例えば濃縮操作において沈殿が生じにくく、
またその生物活性の経時的な低下が極めて少ないため有
利に医薬品等として使用しうるものである。

本発明のポリペプチド（Ｉ）は、ヒト羊膜由来Ｗ工ＳＨ
細胞に対する水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の細胞変
性効果阻止試験によるウィルス活性測定において１０　
Ｕ／ＭｆＩ以上の比活性を有するポリペプチドに精製す
ることができ、公知のｒ工ＦＮ−γ〔グレイ、　ｐ、　
ｗ、ら、前出〕や天然由来の工ＦＮ−１（＝ｔｙｐｅ　
２工ＦＮ）（すμビンら、ジャーナμ・オプ・ナショナ
ル・キャンｔ−・イン７ｆｆニー　）　（Ｊ、　Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、５５
，１２３８（１９７５））と同様の目的に同様の用法に
ょシ使用できる。

本発明のポリペプチド（１）は、抗ウイルス。

抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を示す。

本発明のポリペプチド（１）は滅菌水、ヒト血清アルブ
ミン（Ｈ８Ａ）、生理食塩水その他公知の生理学的に許
容さ□る担体と混合することができ、非経口的に又は局
所に投与することができる。たとえば、成人１日当９１
０万〜１億ユニット、好ましくは４００万〜４０００万
ユニツトを静注又は筋注などにより投与することができ
る。

本発明のポリペプチド（Ｉ）を含有する製剤は、塩、希
釈剤、アジュバント、他の担体、バッファー、結合剤、
界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他の活
性成分も含有していてもよい。

非経口的投与用製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容
される溶媒との懸濁液アンプルＳｔたは生理学的に許容
される希釈液で用事希釈して使用しうる滅菌粉末（通常
ポリペプチド（１）溶液を凍結乾燥して得られる）アン
プルとして提供される。

さらに本発明のポリペプチド（Ｉ）を含有する製剤は、
工ＦＮ−α、工ＦＮ−βまたは工ＦＮ−γまたはインタ
ーロイキン２などのりンホカインのような活性成分を本
発明のポリペプチド（１）に対し１〜９９％含有してい
てもよい。

本明細書２図面および請求の範囲においで、アミノ酸、
ペプチド、保護基、活性基、その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−工Ｕ　Ｂ　（Ｃｏｍｍ１
ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＮｏｍｅｎｃ
ｌａｔｕｒｅ　）による略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであシ、その例を第１表に挙げる
。また、アミノ酸などに関し光学異性体があシうる場合
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

第１表 ＤＮＡ　　：　　デオキシリポ核酸 Ａ　　：　アデニン Ｔ　　：　チミン Ｇ　　：　グアニン Ｃ：　シトシン ＲＮＡ　　：　　リポ核酸 ｄＡＴＰ　：　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ
：　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　：　　デオキ
シグアノシン玉リン酸ｄＣＴＰ　：　　デオキシシチジ
ン三リン酸ＡＴＰ　　：　　アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ　：　　エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　：
　　ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ　　：　　グリシン Ａｌａ　　：　　アラニン Ｍａｌ　　：　　バリン Ｌｅｕ　　：　　ロイシン エ１ｅ　：　イソロイシン Ｓｅｒ　　：　　セリン Ｔｈｒ　　：　　ヌレオニン ０１日　＝　・システィン Ｍｅｔ　　：　　メチオニン Ｇｌｕ　　　：　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　：　　アスパラギン酸 Ｌｙ８　　：　　リジン Ａｒｇ　　：　　アルギニン Ｈｉｓ　　：　　ヒヌチジン Ｐｈｅ　　：　　フェニールアラニン Ｔｙｒ　　：　　チロシン Ｔｒｐ　　：　　）リプトファン Ｐｒｏ　　：　　プロリン Ａｓｎ　　：　　アスパラギン Ｇｌｎ　　：　　グルタミン ＜Ｇｌｎ：　　ピログルタミン 本明細書においで、ポリペプチドの抗ウィルス活性（Ｉ
ＦＮ−γ活性）としてのＵ　／　ｍｌ　（ユニット／ｗ
ｌ）の出し方は以下の様に行った。ユニットの確定した
国際標準１ＦＮ−αと白血球出来の粗工ＦＮ−γをヒト
羊膜出来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変性効果阻止
試験を用いて測定し、その力価の比較から白血球由来粗
工ＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標準品とした。

目的とする資料中のポリペプチドの力価算定のためには
、常にこの標準工Ｆ、Ｎ−γを並べて前述のＷ工５Ｈ−
ＶＳＶＯ系でアッセイを行い、その比率から力価を算出
した。

なお下記実施例に開示している形質転換体エシェリヒア
　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）２９４
　／ｐＨＩＴｔｒｐ　１１０１−ｄ２は、財団法人発酵
研究所（工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ、０ｓａｋａ　）に寄託番号工ＦＯ−１４８
５０として寄託され、また昭和５９年６月６日から通商
産業省工業技術院微生物工業研究所（ＦＢＩ’）に受託
番号ＦＥＲＭＰ−７６５８として寄託され、該寄、托が
ブタベスト条約に基づく寄託に切換えられで、受託番号
ＦＥＲＭ　　ｎｐ−７０８として同研究所に保管されて
いる。

また形質転換体エシェリヒア　コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）２９４　／　
ｐＨ工Ｔ　ｔｒｐ１２０１−ｄ４は財団法人発酵研究所
に寄託番号工ＦＯ−１４３６５として寄託され、また昭
和５９年９月４日から通商産業省工業技術院微生物工業
研究所に受託番号ＦＥＲＭ　　Ｐ−７８２８としてそれ
ぞれ寄託され、該寄託がブタベスト条約に基づく寄託に
切換えられで、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７８として同
研究所に保管されている。

以下実施例によシ本発明をさらに具体的に説明するが、
本発明はこれらに制限されるものでない。

実施例１　形質転換体の製造 （ｉ）　ＸＦＮ−１発現プラヌミドｐＨ工’ｌ”　ｔｒ
ｐ１ｉ０１１’：ＥＰＣ公開第０１０８８９８号公報参
考例２　（ｉｉｉ）＃照〕を制限酵素ＡｖａＩｒ、Ｐｓ
ｔ工で消化し、工ＦＮ−γ遺伝子部分を含むＡｖａＩＩ
−Ｐ日ｔｌｋｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を分取した。このＤＮ
Ａ断片に、前述したトリエステル法によって化学合成し
た蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレオチドアダプ
ター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧ ’Ｉ’ＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＣＣＴＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＡｖａｌＩののシしろ部
分に結合させた。

プラスミドｐｔｒｐ７７１ｃ上記公開公報参考例２（ｉ
ｉ）参照〕を制限酵素Ｃ１ａ工、Ｐｓｔ工で切断して得
たＤＮＡ断片のｔｒｐプロモーターの下流に上記アダプ
ターを結合させた工ＦＮ−７遺伝子を挿入しで、ＤＮＡ
（ＩＶｉ但しｙｌはＴＧＣＣＡＧ、Ｚｌは塩基配列（■
）〕を有し、ポリペプチド〔工′；但しＹ′はＣｙｓ−
Ｇｌｎ、　Ｚはペプチド（■）〕をコードする発現プラ
ノミドｐＨ工ＴｔｒｐＨ０ｌ−ｄ２を構築した（第１図
）。

このプラスミドｐＨ工ＴｔｒｐＨ０ｌ−ｄ２を用いてコ
ーエンらの方法（前出）に従って大腸菌２９４を形質転
換し、このプラスミドを含む形質転換体エシェリヒア　
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　＝　Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　’）　２９４　／　ｐＨ工ＴｔｒｐＨ０ｌ−ｄ
２を得た。

（ｉｉ）　　実施例１（ｉ）と同様に工ＦＮ−γ発現プ
ラスミドｐＥ工Ｔｔｒｐ　１１０１を制限酵素Ａｖａ１
１、Ｐｓｔ工で消化し、１ＦＮ−γ遺伝子部分を含むＡ
ｖａＩＩ−Ｐｓｔ　　１ｋｂＤＮＡ断片を分取する。こ
のＤＮＡ断片に前述したトリエステル法によって合成し
た蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレオチドアダプ
ター ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧ ＧＴＡＣＧＴＣＣＴＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＡｖａＩＩののシしろ部
分に結合させる。

別に発現用ベクターｐｔｒｐ７０１（上記公開公報参考
例２（ｉ）参照〕を制限酵素ＥｃｏＲ工で消化後Ｃ１ａ
工で部分分解し、生じたのシしろ部分をＤＮＡポリメラ
ーゼエラージフラグメントで修復したこのＤＮＡをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて環状とし、ＥｃｏＲ工認識部位
に近い方のＣｌａ丁認識部位がこわれ、異種遺伝子の挿
入部位がＥｃｏＲＩ部位となった発現用ベクターｐｔｒ
ｐ　７８１を構築した。

上記アダプターを結合させた工ＦＮ−γ遺伝子を、ｐｔ
ｒｐ　７８１を制限酵素ＥｃｏＲ工とＰｓｔ工で切断し
たＤｌｉＡ断片のトリプトファンプロモーターの下流に
挿入してＴ４ＤＭＡ９ガーゼを用いて結合させることに
よシ、ＤＮＡ〔Ｉ％Ｊ但しＹｌはＣＡＧ、Ｚｌは塩基配
列（■）〕を有し、ポリペプチド〔工′；但しＹ′はＧ
ｌｎ、　Ｚはペプチド（■）〕をコードする発現プラス
ミドｐＨ工’Ｉ”ｔｒｐ１２０１−ｄａを構築できる（
第２図）。

このプラスミドｐＨＩＴｔｒｐ　１２０１　　ａ　ａを
用いてコーエンらの方法（前出）に従って大腸菌２９４
を形質転換させ、このプラスミドを含む菌株Ｅ。

ｃｏｌｉ　２９４　／　ｐＨ工Ｔｔｒｐ１２０１−ａａ
が得られる。

（ｉｉｉ）実施例１（ｉ）と同様に工ＦＮ−γ発現プラ
ヌミドｐＨ１Ｔｔｒｐ　１１　Ｑ　１を制限酵素Ａｖａ
ＩＩ。

Ｐ８を工で消化し、１ＦＩＴ−γ遺伝子部分を含むＡｖ
ａＩ［−Ｐｓｔ工　１ｋｂＤＮＡ断片を分取する。この
ＤＭＡ断片の制限酵素ＡｖａＩ［の消化により生じたの
シしろ部分をＤＮＡポリメラーゼエラージフラグメント
を用いてうめたのち、ここにトリエステル法によって化
学合成した蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレオチ
ドリンカー ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ を’Ｉ”４ＤＮＡ！Ｊガーゼで結合させる。

このリンカ−を結合させたＩＦＮ−γ遺伝子を制限酵素
ＥｃｏＲ工で消化し、制限酵素ＥｃｏＲ王とＰｓｔ工で
切断したｐｔｒｐ　７８１のトリプトファンプロモータ
ーの下流に挿入することによ、Ｑ　、ＤＮＡ〔■１但し
Ｙｌは結合手、Ｚｌは塩基配列（■）〕を有し、ポリペ
プチド〔工′漬但しＹ′は結合手、Ｚはペプチド（■）
〕をコードする発現プラノミドｐＨ工Ｔｔｒｐ１２０１
−ｄ４’を構築できる（第３図）。

このプラスミドｐＨＩＴｔｒｐ　１２０１−　ｄ　４’
を用いで、コーエンらの方法（前出）に従って大腸菌２
９４を形質転換させ、このプラスミドを含む菌株Ｅ、　
ｃｏｌｉ　２９４　／　ｐＨ工Ｔｔｒｐｌ　２０１−ｄ
４’が得られる。

（ｉｖ）Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ遺伝子を含むプラスミドｐＪ（
ＩＴ３７０９（ＥＰＣ公開第０１０３８９８号公報参考
例１　（ｖＬｉ）参照）の挿入部を制限酵素ＢｓｔＮＩ
で部分分解してＢｓｔＮＩ−Ｐｓｔエフラグメントを得
た。

この１ｓｔＮ工切断部位に、化学合成した蛋白合成開始
コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオチドアダプター ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＣＧＴＡＣＡＣＡ
ＡＴＡＡＣＡＧＴ をＴ４ＤＮＡ！Ｉガーゼを用いて結合させた。

一方、ＥｃｏＲ工、Ｐｅｔ工で処理したプラスミドｐｔ
ｒｐ　７８１に、上述のアダプターを結合させた。

工ＦＮ−７遺伝子をＴ４ＤＮＡ！Ｉガーゼを用いて結合
させ、ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐ１２０
１を構築した（第４図）。

ｐ）ｉ工Ｔｔｒｐ１２０１を制限酵素ＡｖａｌＩ、Ｐｓ
ｔ工で消化し、工ＦＮ−γ遺伝子を含むＡｖａＩＩ−Ｐ
ｅｔ工１ｋｂＤＮＡ断片を分取した。

このＤＮＡのＡｖａＩ［切断部分をＤＮＡポリメラーゼ
エラージフラグメントで修復したのチ、トリエステｙ法
で合成した蛋白質合成開始コドンを含むオリゴヌクレオ
チドアダプター（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）をＴ４ＤＮＡ！ｌ
ガーゼを用いて修復部に結合させた。このようにして得
た工ＦＮ−γ遺伝子を、実施例１（ｉ）で得たＣ１ａ工
、Ｐｅｔ工で切断したｐｔｒｐ７７１１７１ｔｒｐプロ
モーターの下流に挿入しで、ポリペプチドＣＩ’暮但し
７は結合手、２はペプチド（■）〕をコードする発現プ
ラスミドｐＨ工Ｔｔｒｐ１２０１−ｄ４を構築した（第
５図）。

このプラスミドｐＨＩＴｔｒｐ　１２０１−ｄ　４を用
いてコーエンらの方法（前出）に従って大腸菌２９４を
形質転換させ、このプラスミドを含む菌株Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　２９４　／　ｐＨＩＴｔｒｐ　１２０１−　ｄ４を
得た。

実施例２　形質転換体の培養 （１）　　実施例１（ｉ）で構築したプラスミドを含む
菌株１ｉ！、　ｃｏｌｉ　２９４　／　ｐＨ工Ｔｔｒｐ
Ｈ０ｌ−ｄ２を８μＶ／ｒｔｔｌのテトラサイクリン、
０．４％カザミノ酸、１％グルコースを含むＭ９培地を
用いて３７°Ｃで培養し、生育がＫＵ２２０に達した時
に３βインドリルアクリル酸（工ＡＡ）を２５μＶゴに
なるように加えて更に４時間培養した。培養後、遠心分
離して菌体を集め、これを１／１０量の１０％蔗糖を含
む０．０５　Ｍ　Ｔｒｉ８−ＨＣＩ　ｐＨ７，６に懸濁
した。この懸濁液にフエ二μメチルヌμフオニμフμオ
ライド、ＮａＣ１，エチレンジアミンテトラァセテー）
　（ＥＤＴＡ）、スペルミジン、リゾチームをそれぞれ
１　ｍＭ　、　０．２　Ｍ　、　１０　ｍＭ、４０ｍＭ
および２００μ（１／ｄ、となるように加えで、０℃で
１時間放置したのち、３７℃で３分処理して溶菌液を得
た。

との溶菌液を４℃、　２０００　Ｏｒｐｍ　（サーバ〜
遠心機　８８−ａ４０−ターで３０分間遠心分離しで、
ポリペプチド（Ｉｉ但し、Ｘは結合手または（および）
Ｍｅｔ、ＹはＣｙｓ−Ｇｌｎ、　Ｚはペプチド（■）〕
を含む上溝を得た。この上清の抗ウィルス活性を測定す
ると２．８７ｘｌｏ８　Ｕ／ｌ培養液であった。

（ｉｉ）実施例１　（ｉｉ）で得られる形質転換体Ｅ、
ｃｏｌｉ２９４／ｐＨ工Ｔｔｒｐ　１２０１−　ｄ、ａ
を実施例２（１）と同様に培養、抽出し、ポリペプチド
〔工；但し又は結合手または（および）　Ｍｅｔ、　Ｙ
はＧｌｎまたは（および）＜Ｇｌｎ、Ｚはペプチド（■
）〕含有上清を得る。

この上清の抗ウィルス活性を測定し、実施例２（ｉ）と
同等の値を得る。

（ｉｉｉ　）実施例１（出）で得られる形質転換体Ｅ、
　ｃｏｌｉ２９４／　ｐＨＩＴｔｒｐ　１２０１−　ｄ
４’を実施例２（ｉ）と同様に培養、抽出し、ポリペプ
チド〔工；但しＸは結合手または（および）Ｍｅｔ、Ｙ
は結合手。

２はペプチド（■）〕含有上溝を得る。

この上清の抗ウィルス活性を測定し、実施例２（ｉ）と
同等の値を得る。

（ｉｌｖ）　　実施例１（ｉｖ）で得られた形質転換体
Ｅ、　ｃｏｌｉ２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ１２０１−ｄ４
を実施例２（１）と同様に培養、抽出し、ポリペプチド
〔１士但しＸは結合手またはくおよび）Ｍｅｔ、　Ｙは
結合手。

２はペプチド（■）〕含有上清を得た。この上清の抗ウ
ィルス活性を測定すると、２．５Ｘ１０５Ｕ／ｌ培養液
であった。

実施例３　塩酸グアニジン抽出によ゛り得られるポリペ
プチドの精製 （ｉ）　　実施例２（ｉ）と同様の方法で得た凍結菌体
５．９ｆを７Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメ
チルヌｐホニルフ！レオライドヲ含む０．１Ｍ）リヌ塩
酸緩衝液（’ｐＨ７，０）１８ｗ１ｔに懸濁し、４℃で
１時間攪拌したのち１０，０００Ｘｇでａｏ分間遠心分
離にかけて上清２０ｍを得た。この上清に１ａ７ｍＭｍ
化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭ　
リン酸二ナトリウムおよび１．５ｍＭリン酸−カリウム
から成る緩衝液（ｐＨ７，４）（以下ＰＢＳと略す）２
６０ｍを加えて希釈し、抗体力ツム（Ｍｅｔ２−１１．
１．カラム容量１２ｇ／ｌに流速１Ｍ７７分でかけた。

そののち、０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　６　（Ｉｇ／テ力
５Ａを洗浄し、ツいテ、２Ｍ塩酸グアニジンを含む２０
ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０＞　３６ｍ
Ｍで溶出し、抗ウィルス活性を有する両分２０ｍ１を得
た。

この両分２０ｘｌをあらかじめ１ｍＭ　エチレンジアミ
ン四酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭシヌテ
インおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ＃酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化シたセファクリ
Ａ／Ｓ−２００（ファルマシア社製）のカラム（２，６
Ｘ９４ｃＩＲ，カラム容量５００ｍ１　）にかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウィルス活性を有する画分３７ゴを
得た。

ここで得られたポリペプチド〔工、但しＸは結合手また
は（および）Ｍｅｔ、　ＹはＣｙｓ−Ｇｌｎ、　Ｚはペ
プチド（■）〕は５．９岬であシ比活性は（１，０ＸＩ
ＯＵ／Ｗ）であった。この標品をレムリの方法〔ネイチ
ャ（Ｎａｔｕｒｅ〕、　２２７　、６８０−６８５　。

（１９７０）］に準じてドデシμ硫酸ナトリウムポリア
クリルアミトゲμ電気泳動によって分析したところ、成
熟型ｒ１ＦＮ−γ〔米国特許第４．４７６，０４９号〕
とほぼ同じ移動度（分子量約１８．０００）を示す位置
に蛋白のバンドが検出された。なお、非還元条件下の電
気泳動では二量体の分子量に相当する位置にわずかに蛋
白のバンドが観察された。すなわち、従来のｒ工ＦＮ−
γにくらベニ量体の形成がはるかに少なくなった。

（ｉｉ）実施例２（ｈ）および（ｚ）の方法で得られる
凍結菌体をそれぞれ、７Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭ
　フェニルメチルスルホニμフルオライトヲ含む０．１
Ｍ）リヌ塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）３倍量に懸濁し、４
℃で１時間攪拌したのち１０，０００×２で８０分間遠
心分離Ｋかけて澄明な上清を得る。この上清をＰＢＳで
１４倍に希釈して抗体カラム（Ｍｅｔ２−１１．１）に
かける。そののち、０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０
　ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）でカラ
ムを洗浄し、ついで、２Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍ
Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，，０）で溶出し
、抗ウィルス活性を有する両分を得る。この画分をあら
かじめ１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、　１０　ｍＭシヌテインおよび２Ｍ塩酸グ
アニジンを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，（ｌで平衡化したセファクリルＳ−２００（ファル
マシア社製）のカラムにかけ同一緩衝液で溶出して抗ウ
ィルス活性を有する両分を得る。ここでそれぞれ得られ
るポリペプチド〔■；但しＸは結合手または（および）
Ｍｅｔ、ＹはＧｌｎまたは（および）＜Ｇｌｎ、Ｚはペ
プチド（■）〕およびポリペプチド〔工；但しＸは結合
手またはくおよび）Ｍｅｔ、Ｙは結合手、Ｚはペプチド
（■）〕の比活性は、実施例３（ｉ）で得たポリペプチ
ド（Ｉ）と同等もしくはそれ以上でおる。

実施例４　超音波抽出によシ得られるポリペプチドの精
製 実施例２　（ｉ３　、　（ｊｉ）および（止）の方法で
得られる凍結菌体２１Ｍずつをそれぞれ０．１５Ｍホウ
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）　１．５倍量に懸濁
し４℃で１時間攪拌したのち、３０秒間ずつ５回超音波
にかけて抽出しａｏ、ｏｏｏｘｙで１時間遠心分離して
上清を得る。この上清をあらかじめＰＢＳで洗浄したシ
リカゲ／Ｌ／２５．ｇｔと混合して４℃で１時間ゆるや
かに攪拌する。そののち、このシリカゲルをカラムに充
填してカラム容量の２Ｏ−３０倍量のＩ　Ｍ　！ＪａＣ
１で洗浄し、ついでｏ、５ｍｓ化テトラメチルアンモニ
ウムを含む０．０１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐｎｓ
、ｏ）で溶出して抗ウィルス活性を示す画分約２００１
を得る。これをさらに４つの画分にわけ、それぞれをＰ
Ｈ８で平衡化したモノクローナル抗体（Ｍｏγ２−１１
．１）アフイニテイ力ラムにかけてＰＨ８１０倍量で洗
浄したのち、５０％エチレングリコールおよび１Ｍ塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，（１）で溶出する。抗ウィルス活性は最初の約２
０ｙｘｌで溶出される。このようにしてそれぞれ得られ
るポリペプチド（Ｉ）含有液を５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけると、それぞれの試料につき分
子量約１５，０００（１５ｋｄ）および約１７，０００
（１７ｋｄ３のバンドが認められ、いずれの場合にも前
者が主バンドである。

上記１５ｋｄに相当するものは、それぞれポリペプチド
〔Ｉ；但しＸは結合手または（および）Ｍｅｔ、ＹはＣ
ｙｓ−Ｇｌｎ、　ＺはＬｙ８〕、ポリペプチド〔■量但
しＸは結合手または（および）Ｍｅｔ、ＹはＧｌｎまた
は（および）＜Ｇｌｎ、ＺはＬｙｓ　）およびポリペプ
チド（ＩＩ但しＸは結合手または（および）ｎｅｔ、Ｙ
は結合手、２はＬｙｓ　）であシ、１７ｋｄに相当する
ものは、それぞれポリペプチド〔ニー但し又は結合手ま
たはくおよび）Ｍｅｔ、　ＹはＣｙｓ−Ｇｌｎ、Ｚはペ
プチド（Ｉ［）１）、ポリペプチド〔工１但しＸは結合
手または（および）Ｍｅｔ、ｙはＧｌｎまたは（および
）　＜　Ｇｌｎ、Ｚはペプチド（■）〕およびポリペプ
チド〔１１但しＸは結合手または（および）Ｍｅｔ、Ｙ
は結合手、２はペプチド（■）〕である。

実施例５　ポリペプチド〔工電但しＸは結合手または（
および）ｎｅｔ、Ｙは結合手、２はペプチド（■）〕の
産生 （ｉ）実施例１　（ｉｖ）で構築した発現プラスミドｐ
Ｈ工Ｔｔｒｐ１２０１−ｄａを用いてニーエンらの方法
（前出）に従って大腸菌Ｃ６００を形質転換し、このプ
ラスミドを含む形質転換体エシェリヒア　　コ　リ　（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ＝　Ｅ、ｃｏｌｉ
）Ｃ６００／ｐＨＩＴｔｒｐ１２０１−ｄａを得た。

（ｉｉ）　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００／　ｐＨ工Ｔｔ
ｒｐ１２０１−ｄａを、５００ｇｊのＬｕｒｉａ培地（
バンド　トロ１１フ１０．０ ｆ，蒸留水１１１）の入った２１容エーレンマイヤーフ
フヌコに接種し、３７±１℃で１２時間種増養を行った
。

上記培養物を、９．５βのＴｒｐ−８Ｍｏｄａ培地（滅
菌した（　ＮＨ，　）、ＨＰＯ４５．　０　９　／　Ｉ
Ｉ　、　Ｋ２ＨＰＯ４６、０　９／Ｉ！　、　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４４．Ｏ　ｆｉｌ　、　ＮａＨ２ＰＯ４’Ｈ３０　　
８．Ｏ　ｆ／ＩＩ　、　（ＮＨ４）２Ｓｏ４２．Ｏ　ｆ
ｉｌシよび消泡剤（　Ｌ　Ｂ　６　２　５　）０．７ｇ
／に，別途そレ−すれ滅菌したグルコーヌ　ａ　Ｏ　’
Ｉ／Ｉｔ　、　Ｍｇ８０４・７　ｎ２ｏ　　Ｏ．５　ｆ
ｉｌ，チアミン塩酸　６４１／／ｌ。

クエン酸ナトリウム　０．１　ｆｉｌ　、　Ｉ−リフブ
トファン　５０ｔｌＬ９／ｌ，テトラサイクリン　５η
／Ｉｌを加えたもの）の入ったチマペック１４Ｊ容ガラ
７製培養槽に移し、８７℃で、ＰＨを２　９　％　Ｌｕ
２Ｏ３（を加えることによシロ、６〜７．０として培養
した。

゛１３時間後に工ＡＡを加えた。

菌の増殖および抗ウィルス活性を測定するために経時的
にサンプリングを行った。前者は吸光度の測定により、
後者は遠心分離してその上清につき前記した測定法を行
った。

培養開始後１４時間で菌の増殖は最大となり、その時の
抗ウィルス活性は５Ｘ１０６Ｕ／／であった。

発明の効果 本発明のポリペプチド（Ｉ）は抗ワイルヌ２．抗腫瘍お
よび免疫増強作用等を有し、安定であるので医薬品等と
して有利に使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図，第２図，第ａ図，第４図および第５図は、実施
例１　（ｉ）、　（ｉｉ）　、（ｉｉｉ）および（ｉｖ
）に示したそれぞれプラスミドｐＨ１ＴｔｒｐＨ０ｌ−
ｄ２。

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【アミノ酸配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を、ＹはＣｙｓ−Ｇｌ
   ｎ、Ｇｌｎ、＜Ｇｌｎまたは結合手を示し、Ｚは（Ｎ）
   Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍ
   ｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒ
   ｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ（Ｃ）で示されるペプチド
   鎖においてそのＮ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸
   を有するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す。］で表
   わされるポリペプチド。
2. （２）ＸがＭｅｔである特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。
3. （３）Ｘが結合手である特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。
4. （４）ＹがＣｙｓ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。
5. （５）ＹがＧｌｎである特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。
6. （６）Ｙが＜Ｇｌｎである特許請求の範囲第１項記載の
   ポリペプチド。
7. （７）Ｙが結合手である特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。
8. （８）ＺがＬｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ
   ｌｙ−ＡｒｇまたはＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ
   ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎである
   特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
9. （９）ＺがＬｙｓである特許請求の範囲第８項記載のポ
   リペプチド。
10. （１０）ＺがＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
    −Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−
    Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎである特許請
    求の範囲第８項記載のポリペプチド。
11. （１１）Ｘが結合手で、ＹがＣｙｓ−Ｇｌｎで、ＺがＬ
    ｙｓである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
12. （１２）Ｘが結合手で、ＹがＣｙｓ−Ｇｌｎで、ＺがＬ
    ｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
    ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
    −Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第１項
    記載のポリペプチド。
13. （１３）Ｘが結合手で、Ｙが＜Ｇｌｎで、ＺがＬｙｓで
    ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
14. （１４）Ｘが結合手で、Ｙが＜Ｇｌｎで、ＺがＬｙｓ−
    Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌ
    ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌ
    ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第１項記載の
    ポリペプチド。
15. （１５）ＸがＭｅｔで、ＹがＧｌｎで、ＺがＬｙｓであ
    る特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
16. （１６）ＸがＭｅｔで、ＹがＧｌｎで、ＺがＬｙｓ−Ａ
    ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅ
    ｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ
    −Ｓｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第１項記載のポ
    リペプチド。
17. （１７）ＸがＭｅｔもしくは結合手で、Ｙが結合手で、
    ＺがＬｙｓである特許請求の範囲第１項記載のポリペプ
    チド。
18. （１８）ＸがＭｅｔもしくは結合手で、Ｙが結合手で、
    ＺがＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
    −Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
    Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲
    第１項記載のポリペプチド。
19. （１９）５′末端にＡＴＧを有しその下流に、式【アミ
    ノ酸配列があります】 ［式中、Ｙ′はＣｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎまたは結合手を
    示し、Ｚは（Ｎ）Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓ
    ｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌ
    ｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ（Ｃ）で
    示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜
    １６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残
    基を示す。］で表わされるポリペプチドをコードする領
    域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡを含有する形
    質転換体を培養し、培養物中に式【アミノ酸配列があり
    ます】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を、ＹはＣｙｓ−Ｇｌ
    ｎ、Ｇｌｎ、＜Ｇｌｎまたは結合手を示し、Ｚは前記と
    同意義を示す］で表わされるポリペプチドを生成、蓄積
    せしめ、これを採取することを特徴とするポリペプチド
    （ I ）の製造法。
20. （２０）５′末端にＡＴＧを有しその下流に、式【アミ
    ノ酸配列があります】 ［式中、Ｙ′はＣｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎまたは結合手を
    示し、Ｚは（Ｎ）Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓ
    ｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌ
    ｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ（Ｃ）で
    示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜
    １６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残
    基を示す。］で表わされるポリペプチドをコードする領
    域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡを含有する形
    質転換体。
21. （２１）Ｙ′がＣｙｓ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第
    ２０項記載の形質転換体。
22. （２２）Ｙ′がＧｌｎである特許請求の範囲第２０項記
    載の形質転換体。
23. （２３）Ｙ′が結合手である特許請求の範囲第２０項記
    載の形質転換体。
24. （２４）ＺがＬｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
    −Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
    Ｇｌｙ−ＡｒｇまたはＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
    −Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
    Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎであ
    る特許請求の範囲第２０項記載の形質転換体。
25. （２５）Ｙ′がＣｙｓ−Ｇｌｎで、ＺがＬｙｓ−Ａｒｇ
    −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
    Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓ
    ｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第２０項記載の形質
    転換体。
26. （２６）Ｙ′がＧｌｎで、ＺがＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
    −Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
    Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
    ｌｎである特許請求の範囲第２０項記載の形質転換体。
27. （２７）Ｙ′が結合手で、ＺがＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
    −Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
    Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
    ｌｎである特許請求の範囲第２０項記載の形質転換体。
28. （２８）ポリペプチドをコードする領域が式【塩基配列
    があります】 ［式中、Ｙ＾１はＴＧＣ　ＣＡＧまたはＣＡＧまたは結
    合手を示し、Ｚ＾１は（５′）ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＡＡ
    　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　
    ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣ　Ｃ
    ＡＧ（３′）で示される塩基配列においてその５′末端
    から数えて１〜１６個のコドンからなる塩基配列を示す
    ］で表わされるＤＮＡである特許請求の範囲第２０項記
    載の形質転換体。
29. （２９）エシエリヒア　コリである特許請求の範囲第２
    ０項記載の形質転換体。
30. （３０）エシエリヒア　コリ２９４である特許請求の範
    囲第２０項記載の形質転換体。
31. （３１）エシエリヒア　コリ　２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ
    １１０１−ｄ２である特許請求の範囲第２０項記載の形
    質転換体。
32. （３２）エシエリヒア　コリ２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ１
    ２０１−ｄ３である特許請求の範囲第２０項記載の形質
    転換体。
33. （３３）エシエリヒア　コリ２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ１
    ２０１−ｄ４′である特許請求の範囲第２０項記載の形
    質転換体。
34. （３４）エシエリヒア　コリ２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ１
    ２０１−ｄ４である特許請求の範囲第２０項記載の形質
    転換体。