KR940008978B1

KR940008978B1 - 안정성이 증대된 재조합 감마 인터페론 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR940008978B1
Application number: KR1019840007908A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 그레이 패트릭; 하인리히 린더크네흐트 에른스트
Original assignee: 제넨테크 인코포레이티드; 월터 에이취, 드레거
Priority date: 1983-12-16
Filing date: 1984-12-13
Publication date: 1994-09-28
Also published as: FI844934A0; JP2580491B2; JPH0789935B2; FI91884C; HUT36187A; JP2719128B2; KR850004273A; CY1945A; JPH10210985A; ATE135405T1; JP2886145B2; MY102899A; JPH0794477B2; JPH0919295A; OA07902A; DE3486424T2; CA1341573C; JPH07173196A; LV11633B; AU597872B2

Abstract

내용 없음.

Description

안정성이 증대된 재조합 감마 인터페론 및 그의 제조 방법

제1도는 본 발명의 재조합 감마 인터페론의 아미노산 1-143 및 5′- 및 3′-비번역 DNA부위가 측면 말단을 이루고 신호 서열이 상류에 위치한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA서열임.

제2도는 대장균에서 본 발명의 재조합 감마 인터페론의 직접합성을 코딩하는 플라스미드 및 그의 제조 방법을 도시한 것임.

제3도는 본 발명에 따라서 제조된 감마 인터페론의 증대된 안정성을 보여주는 데이타 기록임.

본 발명은 재조합 DNA기법, 본 기법을 안정성이 증대된 재조합 감마 인터페론 제조에 사용하는 방법 및 수단, 그의 제조 방법 및 여러가지 제조 생성물과 그 용도에 관한 것이다.

본 발명은 1983년 12월 16일자 미합중국 특허출원 06/562,009의 부분계속 출원(CIP)이다. 본 출원은 고에델과 그레이의 1981년 10월 19일자 “인간 면역 인터페론”이란 미합중국 특허출원 제312,489호에 관련된 것으로서, 이 출원은 본원에서 참고로 기재하였다.

본 발명의 배경을 설명하고, 특히 그 실시에 관한 상세한 점을 제공하기 위해 본 명세서에 이용된 출판물 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 기재하였고, 각각 사전식으로 집합시켜 놓았다.

인체 인터페론은 상이한 항원성 및 생물학적 그리고 생화학적 특성에 의거하여서 세개의 군으로 분류될 수 있다. 첫째 그룹은 비루스 유도 작용에 의하여 인체 혈액의 구성 세포에 의하여 주로 정상적으로 생성되는 백혈구 인터페론 쪽으로 되어 있다. 이것은 미생물학적으로 생성되며 생물학적인 활성이 있음이 발견되었다(1, 2, 3). 이들의 생물학적 특성은 임상에서 비루스 감염 치료 및 악성 질환 치료제로서 그 사용을 촉진 시키고 있다(4).

두번째 그룹은 비루스 감염시 섬유아세포에 의하여 정상적으로 생성된 인체 섬유아세포 인터페론으로서, 이것은 미생물학적으로 생성되며, 광범위한 생물활성을 보여주는 것이 발견되었다(5). 임상 시험은 잠재적인 치료 가치가 있음을 보여주고 있다. 백혈구 및 섬유아세포 인터페론은 아미노산 수준에 있어서는 상대적으로 유사성이 낮음에도 불구하고 생물학적 활성에 있어서는 유사함을 보여주고 있다. 두 그룹의 인터페론은 아미노산이 약 165-166이고, 산에 안정한 단백질이다.

인체 감마 인터페론(또한 면역 인터페론, γ-인터페론, IIF 또는 IFN-γ로도 분류됨)은 인터페론류의 특성인 항비루스 및 항증식성을 나타내지만, 백혈구 및 섬유아세포 인터페론과는 달리 pH2에서 불안정하다. 재조합 DNA 기법으로 감마 인터페론을 생산하기 전에는, 이것은 주로 임파구의 미토겐 유도로 생산되었다. 인체 감마 인터페론은 백혈구와 섬유아세포 인터페론과는 항원적인 면에서 완전히 다르다. 그레이, 고에델과 그의 공동 연구자들은 최초로 재조합 감마 인터페론의 발현을 보고하였는데(6), 이것은 pH2에서 불안정성이 있는 항비루스 및 항증식성과 같은 인체 감마 인터페론의 특징적인 특성을 나타내는 것으로 입증되었다. 대장균에서 생성된 그레이와 고에델의 재조합 감마 인터페론은 분자의 -N 말단이 CYS-TYR-CYS 서열로 시작하는 146개 아미노산으로 이루어져 있다. 이어서, 데린크(Derynck)등은 계속해서 동일한 N- 말단부와 단일 아미노산 치환을 가지는 재조합 감마 인터페론, 즉 초기에 보고된 것의 대립(allelic) 변이체로 된 폴리펩티드를 발표하였다(6). 다른 연구자들은 고에델과 그레이의 출판물(6)에 기재되어 있는 다수의 아미노산이 치환된 재조합 감마 인터페론의 생산을 추가로 발표하였다.

예를 들면, 알톤 등 (17)은 그레이 등(6)의 감마 인터페론의 81번 아미노산이 단일 치환되면 활성이 단지 70%만을 유지하는 (상대적 기준) IFN-감마가 생성되며, 이 IFN-감마의 1, 2, 3위치의 CYS-TYR-CYS의 부가적인 결실로 그레이 등(6)의 감마 인터페론의 49% 활성만 지닌 IFN-감마로 되는 일련의 IFN-감마류를 발표하였다.

본 발명자의 견해로는, N-말단 아미노산 서열이 시스테인잔기인 재조합 감마 인터페론은 디술피드 결합 형성시에 다수의 시스테인잔기의 술프히드릴기가 관련될 수 있는 중합화의 관점에서 문제를 안고 있었다. 추정되는 디술피드 결합을 완전히 감소시킬 수 없었던 본 발명자들은 시스테인-결합 티로신잔기의 히드록실기를 통한 반응이 관련될 가능성으로 인하여 문제가 더욱 복잡해질수 있다는 것을 제안하였다. 이들 재조합 인터페론은 다소 불안정한 것으로 나타났으며, 이러한 불안정성 또는 다른 것에 기인한 것인지 모르지만 최정 유용도가 낮은 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명은 안정성과 홀성이 증대된 재조합 감마 인터페론에 관한 것이다. 가장 바람직한 실시태양으로, N-말단에서 신장하는 하기의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 감마 인터페론(이후 “완전 서열”로 명명함) 또는 이 서열의 카르복실 말단의 특정 부위가 결실된 유도체가 제공된다.

(상기 식에서, X는 메티오닌잔기 또는 수소이고, Y는 글루타민잔기이고, X가 수소인 경우, 글루타민 또는 피로글루타메이트잔기임). 본 발명은 또한 대응하는 클론된 유전자, 이것으로 된 발현 벡터 및 재조합 DNA기법을 통해 본 발명의 인터페론 생산에 유용한 형질변이체를 제공한다. 본 발명의 더욱 바람직한 재조합 감마 인터페론(종전의 문헌에 특성화된 것과 비교한 것)은 본 발명자가 천연물에서 정체하여 완전 규명한 천연의 감마 인터페론의 고유 아미노산 서열과 거의 일치하는 것으로 나타나고 있다. 바람직한 예는 본 발명의 제품은 종래의 문헌상 나타난 것과 비교하여서 안정성과 활성이 크게 증대되었음을 보여주고 있다.

본 발명자는 천연의 인체 감마 인터페론(인체 말초 혈액 림프구의 미토겐 유도와 연속 정제로 생성되는 것)이 그레이 등에 의하여 문헌(6)에 기술된 서열의 재조합 감마 인터페론에서 CYS-TYR-CYS-N 말단이 결핍된 폴리펩티드라는 것을 발견하였다. 고순도 천연 감마 인터페론의 트립신 분해물은 그레이 등의 재조합 감마 인터페론(6)의 N-말단부와 일치하나 CYS-TYR-CYS가 적은 아미노산 조성을 갖는 서열을 포함한다. 천연의 감마 인터페론의 N-말단으로 부터 아미노산 서열을 분석하면 분자의 N-말단에서 알파 아미노산이 보호되었다는 추측을 일으키면서 실제로 수득할 수 없는 것으로 입증되었다. cDNA가 코딩된 그레이 등(6)의 두번째 시스테인 다음의 첫번째 아미노산이 GLN(글루타민)이기 때문에, GLN잔기의 고리화는 대신에 N-말단이 보호된 피로글루타메이트를 남기는 것으로 추측된다. 피로글루타메이트 아미노펩티다제로 피로글루타메이트를 제거하면 ASP, 즉 그 다음에 코딩된 아미노산과 결합된 유리 알파 아미노기가 생성되며, 서열 분석을 계속 진행하면 천연 인체 감마 인터페론의 초기에 보고된 특성들을 갖는다.

CYS-TYR-CYS- 함유 재조합 인체 감마 인터페론을 코딩하는 cDNA를 적당히 변경함으로써 X가 MET이고, Y가 GLN인 상기의 완전 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA로 부터 새로운 재조합 감마 인터페론을 대장균에서 직접 발현하게 되었다. N-말단 메티오닌은 예로서 대장균 발현의 경우에 숙주 시스템에 의하여 프로세스 되지 않는 mRNA 번역“개시”신호 AUG에 의하여 코딩된 인공의 잔기이다. 다른 미생물 시스템, 예를 들면, 슈도모나스 등의 경우에 메티오닌은 제거되어질 수 있다. 이 메티오닌은 어느 경우에도 활성에 필요한 것으로 나타나지 않고 있다. 메티오닌이 제거되면 사용된 시스템에 따라, GLN잔기를 활성의 감소 없이 피로글루타메이트 형으로 고리화할 수 있다.

본 발명에서, 안정화를 위해 인체 혈청 알부민 제제를 사용하는 CYS-TYR-CYS- 함유 재조합 감마 인터페론이 그레이와 공동 연구자에 의하여 훨씬 먼저 보고 되었다. 그러나, 최종의 동결 건조 제품 내의 혈청 알부민의 존재는 최종 제품에서보다는 동결 건조 공정 전에 몇가지 품질 관리를 요구한다. 한편, 새로운 본 발명의 재조합 감마 인터페론의 경우에, 동결 건조된 형의 제품은 혈청 알부민 첨가가 없이 충분히 안정한 것이 입증되었다. 그러나, 필요시에 본 발명의 감마 인터페론은 약리 허용 가능량의 인체 혈청 알부민과 함께 제제될 수 있다.

상기한 것과 달리, 본 발명의 CYS-TYR-CYS 결핍 재조합 인체 감마 인터페론은 세포 병리 효과 저해 실험에서 CYS-TYR-CYS 함유 유사체 보다 항비루스제로서 활성이 훨씬 높은 것으로 나타났다. 호라성은 마이크로타이터 판에서 인간의 폐암 세포 A549에 대한 뇌심근염 비루스의 세포 병리 효과(CPE) 저해에 의하여 일반적으로 분석된다(12참조).

본 발명의 재조합 감마 인터페론은 상기한 완전 서열중 아미노산 1 내지 약126을 포함하는 것이다. 완전서열과 관련된 카르복시 말단부에서 다양하게 단부 절개된 감마 인터페론은 몇몇의 경우에 수준이 감소될지라도, 아미노산 1내지 126이 존재하는 한 인체 감마 인터페론의 특징적인 특성을 계속 나타냈다. 실제로, 문헌(7)에 밝힌 CYS-TYR-CYS- 함유 유사체를 사용한 실험에서 활성의 손실없이 아미노산 132(현재의 번호 시스템으로)에 뒤이은 아미노산 서열이 부가 서열로 치환될 수 있다는 것을 보여주고 있다(8 참조). 본 발명자에 의해서 예비적인 증거로 아미노산 1 내지 126(THR)은 본 발명자가 활성과 관련되었다고 보는 삼차원 구조로 비교적 강하게 결합되어 있지만 완전 서열의 잔존 아미노산은 비교적 덜 구속되어 있어서 단백질 가수분해에 상대적으로 민감하다는 가설을 제안한다. 제한적 조건하에서 트립신 분해로 서열의 상류 방향이 아닌 아미노산 126의 하류 방향 서열의 여러 부분이 제거된다. 본 발명의 천연 감마 인터페론 성분은 아미노산 127, 128, 129, 130, 132 및 134를 통하여 다양하게 신장하는 분자를 포함한다. 본 발명자들은 메티오닌 다음의 아미노산 서열이 아미노산 1(MET의 다음) 내지 약 139와 1 내지 약 131로 다양하게 구성된 완전 활성 재조합 감마 인터페론을 발견하였는데, 후자의 것은 트립신으로 재조합 감마 인터페론의 제한 분해후 서열 확인으로 얻었다. 대략 아미노산 128(MET 뒤의)과 129에서 다양하게 종지된 유사한 트립신 분해 처리된 단편은 실제적으로 감소되었지만 활성은 유지되고 있었다. 한편 125개 아미노산(N-말단 메티오닌과 함께), 및 126 위치의 트레오닌을 포함하며, 그 이후이 아미노산은 분해제거된 물질은 CPE 저해 분석에서 분해안 된 것의 활성의 1% 이하를 보여주었다.

숙주에서 생성될 때 메티오닌이 세포 내 절개가 되지 아니한 메티오닌 개시체를 포괄하는 재조합 유도 감마 인터페론은 139개 아미노산을 지닌 주성분(제1도의 번호 붙이기에 근거함)과 143의 아미노산을 지닌 소량의 성분을 보여주는 것으로 나타나고 있다. 두 성분의 조성은 139개의 아미노산 함유 성분을 약 95% 이상을, 가장 적당하게는 약 97% 이상을 함유한다. 제한 조건하에서 트립신 분해로 대략 아미노산 126으로 부터 하류 서열의 여러 부분이 제거된다. 이같은 제한 트립신 분해가 된 본 발명의 재조합 감마 인터페론은 아미노산 125(개시 메티오닌을 지닌 126), 129, 131 및 134를 통하여 다양하게 신장되는 성분을 포함하고 있다. 이상의 종류는 실제로는 감소되었지만 아미노산 약 125-약 129로 신장된 지역에서 활성을 유지하고 있었다. 약 129개 이상의 아미노산, 특히 약 131개 아미노산, 즉 약 129-143개 아미노산을 지닌 종류는 본질적 기능면에서 완전한 활성이 있다.

상기의 관점에서, 본 발명은 상기한 완전 서열을 나타내는 재조합 감마 인터페론 뿐만아니라 아미노산 143이 결핍되거나, 아미노산 서열 Z(Z는 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142임) 내지 아미노산 143이 결핍된 여러가지 혼합물로 되었음이 명백하다. 본 발명에 따른 재조합 감마 인터페론을 코딩하는 이중 사슬 DNA서열은 상기한 완전 서열을 코딩하는 것 뿐만 아니라, 다양한 카르복시말단부가 절단된 유사체를 코딩하는 것으로 이루어진다. 각기 서로 다른 단부 절단의 경우에 후속 코돈은 번역 중지 신호를 코딩하는 코돈이다.

본 발명에서 “재조합 감마 인터페론”은 재조합 DNA기법으로 얻은 복제성 발현 매개체로부터 형질 전환세포에 발현된 폴리펩티드(이를 생성한 세포에 의하여 글리코실화 되거나 되지 않은 것은 관계없음)로서, 이 폴리펩티드는 인체에서 항비루스 및 항증식 활성을 어느 정도 보여주며, 천연 인체 감마 인터페론의 특징적 특성인 pH2에서 불안정한 면을 보여준다.

상기한 재조합 감마 인터페론은 최소한 1 내지 약 126개 아미노산을 각각 지닌 두개의 이같은 폴리펩티드의 결합으로서 정의된 “다이머(dimer)”를 형성하는 것으로 짐작된다(상기에서 폴리펩티드는 동일하거나 서로 다른 수의 아미노산을 가질 수 있음). 화학적 결합 매카니즘의 특성은 완전히 이해될 수 없지만 공유 결합 이외의 것으로 생각된다. 다이머로의 결합은 자발적으로 발생되지만, 상기의 시스템에서는 불가피한 것으로 생각된다. 즉, 본 발명의 재조합 감마 인터페론이 투여될 때, 이것은 통상 다이머화된 형이 될 것이다.

더 나아가서, 다르게 특성화된 재조합 감마 인터페론에 관련된 문헌(8, 9)에 발표된 것과 마찬가지로 아미노산 치환 또는 첨가, 특히 상기한 재조합 감마 인터페론에서 C-말단 또는 아미노산 126 근처로부터 상 또는 하류 아미노산의 단일 아미노산 치환 및 군의 치환 또는 첨가가 고유의 인터페론 활성의 파괴 없이 가능하다. 당업자들이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 이같은 치환 또는 첨가를 할 수 있음은 명백하다. 본 발명의 재조합 감마 인터페론은 완전 서열 보다 크거나 동일한 생물학적 활성을 나타내는 완전 서열(제1도 참조)의 변형 및 대립 변이체를 지닌 종류도 포함한다.

특징적으로, 정제된 재조합 감마 인터페론은 인체 유래의 다른 단백질을 포함하지 않아야 하며, 이제까지 존재하는 천연 인체 감마 인터페론 조성물과는 구분되는 것이다.

본 발명은 순도 95%이상, 특히 98% 이상이며, 그 이유로는 현재까지 존재하는 천연 감마 인터페론과는 다른 재조합 감마 인터페론 조성체를 포함한다.

N-말단 아미노산 잔기가 메티오닐인 본 발명의 실제품은 인체에서 생성된 감마 인터페론과는 다르며, 이 관계로 인하여 그레이 등(6)에 의하여 발표된 서열과 CYS-TYR-CYS-의 결실 이상의 차이를 보이고 있다.

본 발명의 복제성 발현 매개체는 이중 사술 DNA성분, 특히 복제시발제, 프로모터 또는 프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 번역 개시 신호용 코돈 및 적정한 번역 구조에 목적으로 하는 재조합 감마 인터페론을 코딩하는 유전자, 그리고 번역 종지용 코돈이 이어진 플라스미드이다. 현재 재조합 DNA기법의 일반기법과 문헌은 본 발명의 실시에 적절한 배경 정보인 문헌(11)에 인용되는 바와 같이, 모든 실제예 및 법적으로 인식될 수 있는 균등체에 근거한 통상의 기술자에게 잘 인식되어 있는 것이다.

[실시예]

A. 클로닝

감마 인터페론 cDNA서열 함유 재조합 DNA클로운은 문헌 (6)과 상기의 관련 미합중국 출원 제312,489호(대응하는 한국 특허 출원이 1984년 6월 7일자로 특허 출원 공개 제84-1837호로 공개되어 있음)에 기술된 바와 같이 유도된 인체 말초 혈액 림프구로부터의 메신저 RNA를 사용하여 제조된다. 클로운 p67의 DNA서열은 제1도에 나타나 있다. 5′비번역 부위는 전구체 또는 23아미노산의 신호 펩티드를 코딩하는 69개의 뉴클레오티드, 143아미노산의 성숙 인터페론 폴리펩티드를 코딩하는 429뉴클레오티드 및 3′비번역 서열의 587뉴클레오티드로 이어진다.

B. 발현

1. 대장균

대장균에서 재조합 IFN-γ를 고슈율로 발현시키기 위하여 단백질 합성 개시는 신호 펩티드의 ATG(아미노산 S1)에서 보다는 성숙 폴리펩티드의 글루타민 코돈(1 아미노산)바로 앞의 ATG코돈에서 일어나야 한다(제1도). 대장균에서 직접 p67의 cDNA 삽입체 발현이 이어지는 공정은 제2도에 나타나 있다. 방법은 대장균에서 그레이 등(6)의 cDNA 삽입체 발현에 사용된 것과 유사하다.

예상된 성숙 코딩 서열`의 코돈 2에 위치한 AvaⅡ제한 부위는 신호 펩티드 코딩부위를 제거하는 데 사용하였다. 아미노산 1과 2용 코돈을 회복하고, ATG번역 개시 코돈을 삽입하고, XBaⅠ점착 말단을 형성하는 두 개의 합성 데옥시뉴클레오티드를 제조하였다. 이 두개의 올리고머를 cDNA 삽입체의 잔존부에 결합시켜 144개 아미노산의 폴리펩티드를 코딩하며 XBa Ⅰ과 Pst Ⅰ부위에 결합된 1063염기쌍 합성-천연 하이브리드 유전자를 작제하였다. 이 유전자를 플라스미드 pleIF A25(10)의 XBa Ⅰ과 Pst Ⅰ부위 사이에 삽입시켜 발현 플라스미드 pγ-CYC5를 얻었다. 대장균 W3110 균주(F-, λ-, 프로트로픽)(ATCC 27325호)를 상기 플라스미드로 형질전환시켜 숙주-벡터 결합체 대장균 W3110/pγ-CYC5를 얻었다.

2. 세포 배양

제1도에 나타난 신호 펩티드와 감마 인터페론 모두를 코딩하는 유전자의 발현은 N-말단 아미노산이 제1도에 나타난 바와 같은 성숙 감마 인터페론 유전자로부터의 생성을 확인하면서 방사능 표차된 시스테인과 메티오닌의 존재하에 COS-7 세포(16)에서 수행하였다.(대장균 발현에 관계된 경우와 달리, 여기에 예시한 포유동물 세포계의 발현물은 N-말단 메티오닌이 없음).

60㎜ 페트리 디쉬에서 COS-7 세포의 융합 단층을 개질된 DEAE-덱스트란 공정을 사용하여 DNA로 중복 형질 감염시켰다. DNA첨가 3일후, 배지를 제거시켰다. 각 세트판에 100μCi S³⁵-메티오닌 또는 S³⁵-시스테인이 보충된 2㎖ DMEM를 보층하였다. 방사능 표지된 아미노산의 존재하에 16시간 배양후, 배지를 제거하고 제1항체로서 안티-감마-인터페론 모노클로날 항체 또는 안티-HBsAg 모노클로날 항체, 그리고 제2항체로서 토끼 안티-마우스 IgG 항체(Cappell Inc.)를 사용하여 500㎕면역 침전시켰다. 항체와의 반응과 스타필로코커스 A세포(Calbiochem)에 대한 연속 결합은 버만(Bermann, P)등(18)에 의하여 기술된 바와 같이 행하였다. 시료를 SDS-머캡토에탄올에 재현탁시키고, 10ΔSDS-PAGE겔에서 전기 영동시켰다. 겔을 7Δ초산 에탄올 용액에서 고정시키고, Enhance(New England Nuclear) 형광액에 침지, 건조시키고, Kodak AR5필름과 강화스크린(듀퐁)을 사용하여 2주간 노출 시켰다.

여기에 사용된 플라스미드는 pSVgamma69(11) ; pDl RI(19), pSVgamma69가 기본이 된 B형 간염 비루스 표면 항원 발현 벡터 및 pDl RIgamma Sau, pDl RI의 EcoRI부위에 삽입된 전체 감마-인터페론 코딩 서열을 포함하는 pSVgamma69(11)의 830염기쌍 SAU3a 단편을 지닌 폴리시스트론 플라스미드였다. 후자의 플라스미드는 감마-인터페론과 HBsAg 코딩 부위 모두를 함유한 전사체를 생성하였다.

안티-감마-인터페론(A) 또는 안티-HBsAg(B) 항체와 반응하는 S³⁵-시스테인 및 S³⁵-메티오닌 표지된 단백질을 비교하면 글리코실화(분자량 29,000) 또는 모노글리코실화(분자량 18,000) 위치에서 이동하는 어떠한 물질도 인터페론-감마의 면역 침전을 나타낸 S³⁵-met 표지된 세포와 달리 안티-감마-인터페론 항체를 사용하는 S³⁵-Cys 표지된 pDl RI-gamma Sau 감염 세포로 부터 특이적으로 면역 침전되지 않은 것을 보여주고 있다.

C. 발효 생산

대장균 W3110/pγ-CYC5를 사용하는 재조합 인체 인터페론-감마(rIFN-γ)의 생산은 부피 1-100리터인 배치에서 행하였다. 발효 시킨후, 인터페론 함유 대장균 세포 발효액으로 부터 회수하여 IFN-γ를 단리 및 정제하였다. 다음은 발효와 세포 회수 공정에 대한 설명이다.

1. 원료 배양액의 제조 및 유지

원료 배양체는 다음 조성을 갖는 멸균 배지 150 내지 500㎖ 함유 멸균 배플 배양 플라스크에서 생성시켰다.

박토트립톤 10g/ℓ

효모추출물 5g/ℓ

염화나트륨 5 내지 10㎎/ℓ

배지를 대장균 W3110/pγ-CYC5의 일차 배양체로 접종시켰다. 접종된 플라스크는 550nm에서 흡수가 약 1.00이 될 때까지 진탕기에서 25 내지 37℃로 배양시켰다. 30%v/v 디메틸술폭시드중 약 50%v/v를 배양액에 첨가하였다. 일(1)㎖ 분취액을 즉시 멸균바이알에 넣고 밀봉시켰다. 바이알을 -60℃이하에서 보관시켰다. 각 발효는 접종용 복제 원료 배양체를 사용하여서 시작하였다.

2. 접종체 생산

접종체는 진탕 플라스크 또는 소형 발효기에서 상기 배지(L.B.Broth)에서 생성시켰다. 약 37℃에서 약 8시간 동안 배양시킨 후, 접종체를 발효기에 옮겼다. 접종체의 부피는 발효액 부피 2-10%사이였다.

3. 발효

재조합 인터페론-감마 생산은 약 10내지 1000리터의 작업부피를 지닌 발효기에서 행하였다. 발효 배지의 조성은 다음과 같다 :

리터당

* 글루코스 50-100g

황산암모늄 4.0-8.0g

인산칼륨, 일염기성 3.0-5.0g

인산칼륨, 아염기성 5.0-8.0g

황산마그네슘, 6수화물 0.5-5.1g

구연산나트륨, 이수화물 0.5-2.0g

UCON LB-625 0.5-2.0㎖

염화제2철, 6수화물 0.005-0.15g

황산아연, 나트륨, 이수화물 0.001-0.005g

황산제2구리, 5수화물 0.001-0.005g

붕 산 0.001-0.005g

황산 망간, 1수화물 0.001-0.005g

염 산 0.0-1.0㎖

티아민-염산 0.0-0.1g

테트라사이클린·HC1 0.001-0.01g

* L-트립토판 0.1-0.5g

효모 추출물 2.0-8.0g

3-β-인돌아크릴산 0.02-0.10g

* 글루코스와 트립토판의 일부는 초기에 발효기에 첨가하고, 나머지는 발효 공정을 통하여 공급하였다. 배지내 성분은 발효에 사용되기 전에 열처리 또는 여과 처리로 멸균시켰다.

발효는 25-40℃에서 행하였다. 다른 조작 조건은 다음과 같다 :

교반(rpm) : 100-1000

통기(vvm) : 0.5-1.5(필요시 산소로 보충시킴)

pH : 6.5-7.5(수산화암모늄을 첨가하여 조절시킴)

4. 정제

a. 재조합 감마 인터페론의 추출

대장균 세포를 pH6-9, 특히 약 9의 적당한 완충액 및 염을 함유한 배지에 현탁시켰다. 재조합 감마 인터페론을 Gaulin mill과 같은 고압 콜로이드 밀에서 세포 현탁액의 균질화에 의해 추출시켰다. 충분한 폴리에틸렌이민을 용액에 첨가하여 0.1-1%w/v 용액을 얻었다. 상징액은 감마 인터페론을 포함하고 있다.

b. 실리카 기재 흡착제 상에서의 재조합 감마 인터페론의 부분정제 상기(a)에서의 상징액을 pH 6 내지 9범위내의 적당한 염용액으로 불순물을 세척한 실리카 기재 흡착제로 흡착시켰다. 재조합 감마 인터페론은 0.5-1.0M 테트라메틸 염화암모늄을 함유한 용액을 사용하여서 용출시켰다. 이 단계에서 모든 조작은 pH7 내지 9에서 수행하였다.

c. 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 재조합 감마 인터페론의 부분 정제

상기(b)에서의 용출물을 음이온 교환 크로마토그라피 매질에 투석 및 흡착시키고, 이어서 세척하여 불순물을 제거하였다. 재조합 감마 인터페론을 증가하는 염의 농도 구배로 용출시켰다. 이 단계에 적용될 수 있는 대표적인 음이온 교환 수지는 카르복시메틸셀룰로스 및 술포에틸셀룰로스이다. 모든 조작은 pH7 내지 9 사이에서 수행하였다.

d. 인산칼슘겔에서의 크로마토그라피에 의해 재조합 감마 인터페론의 부분정제

상기(c)에서의 용출물을 인산칼슘 매질에 흡착시키고, 이어서 세척하여 불순물을 제거하였다. 재조합 감마 인터페론을 증가하는 인산염 농도의 농도구배 용출시켰다. 이 단계에서 모든 조작은 pH7 내지 9 사이에서 수행하였다.

e. 음이온 교환 크로마토그라피에 의한 재조합 감마 인터페론의 부분 정제

상기(d)에서의 용출물을 음이온 교환 크로마토그라피 매질에 투석 및 흡착시키고, 이어서 세척하여 불순물을 제거하였다. 재조합 감마 인터페론을 증가하는 염 농도의 농도 구배로 음이온 교환 매질로부터 용출시켰다. 전형적인 음이온 크로마토그라피 매질을 카르복시메틸 셀룰로스와 술포에틸 셀룰로스이였다. 이 단계에서 모든 조작은 pH7 내지 9 사이에서 수행하였다.

f. 겔 투과 크로마토그라피에 의한 재조합 감마 인터페론의 부분정제

상기(e)에서의 용출물을 겔 투과 매질에 가하고, 칼럼은 염 함유매질로 전개시켰다. 적당한 재조합 감마 인터페론 함유 분획을 합하여 벌크 약제를 생성시켰다. 이 단계에서 모든 조작은 pH7 내지 9 사이에서 수행하였다.

g : C-말단 아미노산 서열

C-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해서 시료를 70% 포름산에서 투석시키고, 브롬화시아노겐으로 절단시키고, 생성되는 펩티드를 Altex Ultrasphere C8 역상 HPlC 칼럼상에서 분리시켰다. 피크를 수집하고, 아미노산 서열 분석에 의해 분석하였다. 하나의 C-말단 펩티드가 발견되었다 : -leu-phe-arg-gly-arg(잔기 135-139, 제1도). 몇몇의 경우에 다른 부가 펩티드가 검출되었다 : -leu-phe-arg-gly-arg-arg-ala-ser-gln(잔기 135-143, 제1도). 이들 두 펩티드의 비율을 결정하기 위하여, 가지의 양(아미노산 분석에 의하여)을 역상 HPlC 칼럼에 부하시키고, 각각의 피크 높이를 결정하였다. 세개의 생산 로트(lot)의 각각은 약 2% 미만의 긴 펩티드(135-143, 제1도)를 포함하고, 나머지는 5-mer를 포함하고 있었다. 이 데이타는 상대 비율에 있어서 각각 약 98.2%의 139 아미노산 함유 및 143 아미노산 함유 감마 인터페론 혼합물(각각의 경우에 존재하는 N-말단 메티오닌을 제외함)의 대장균 생산물과 일치한다.

5. 조제

상기한 바와 같이 생성된 재조합 감마 인터페론을 하기 표에 의거하여 비경구 투여용으로 적당하게 조재하였다.

(1) 바이알은 주사용 멸균수 2.5㎖로 용해시킴.

(2) 바이알은 주사용 멸균수 2.0㎖로 용해시킴.

본 발명의 인터페론은 의학적으로 적당한 투여량, 즉 신체 표면적의 1.0㎎/㎡의 양으로 사용될 수 있다.

D. 여러가지 감마 인터페론의 활성 결정 및 트립신 분해

상기 대장균(supra) 발현 예에서 기재된 바와 같이 제조된 카르복시-말단 감마 인터페론과 상이한 여러가지 감마 인터페론의 활성을 얻기 위해서 다양한 수준으로 트립신 분해시키고, 기술된 범위내에서 A549세포를 CPE 분석에 의하여 시험하였다.

상기와 같이 제조된 재조합 감마 인터페론(r-HuIFN-감마) 시료(6.5㎎)을 소형 Sephadex G-25 분자체 칼럼(PD-10, pharmacia) 상에서 pH 8.5, 0.10 M 중탄산암모늄 완충액에 탈염화 처리시켜 최종 단백질 농도를 2.1㎎/㎖가 되도록 하였다. 묽은 트립신 용액(Worthington TPCK 트립신, 0.001 M 염산중에서 10ug/㎖, 16uℓ)을 1.9㎖(4.0㎎)의 r-HuIFN-감마용액에 첨가, 혼합시키고, 실온에서 배양시켰다(트립신 : 단백질=1 : 25,000). 시료를 배양 혼합물에서 1시간, 3.5시간, 5.75시간, 8시간 및 10.25시간에 제거하였다. 8시간째에 묽은 트립신 용액 15uℓ(150ng)을 첨가하여 10.25시간에서 최종 시간대 치료의 반응을 촉진시켰다.

각 시간대에 각각의 성분을 함유하는 시료 분획하는 BioRad Biogel HPHT 칼럼을 사용하는 Waters HPlC 시스템에서 수행하였다. 중탄산염 완충액 중의 시간대 분취물은 시료 채취 시간에 칼럼에 직접 부하시켰다(수동 주입). 칼럼을 0.01 M 인산나트륨 pH 8.0, 30μM 염화칼슘으로 평형화시켰고, 단백질을 평형 완충액 및 0.5 M 인산나트륨 완충액 pH 8.0, 0.6μM 염화칼슘의 선형 농도 구배를 사용한 칼럼에서 용출시켰다.

214㎚과 280㎚에서 흡수로 결정된 단백질 피크를 예비 수집하고, 분석 때까지 4℃에서 포장 보관하였다. 선택된 피크의 일반 분석은 다음과 같다 :

1. 인체 폐 암종 A549/EMC 비루스 분석 시스템에서의 항 비루스 활성(13).

2. Laemmli 겔 시스템을 사용한 표준기법에 의한 SDS/PAGE 분획화(14).

3. 시판(Pierce Chemical CoM Rockford, IL.) 염료 결합법에 의한 단백질 농도 결정.

4. 펩티드 규명용 브롬화 시아노겐 단백질 절단 및 연속 HPLC 분석(15).

단백질 시료는 70% 포름산으로 철야 투석시키고(12,000-14,000 분자량으로 절단됨), 교반 증류로 전조시키고, 500㎕의 70% 포름산에 재현탁시켰다. 고체 브롬화 시아노겐을 12×75㎜ 유리 시험관내 각 샘플에 첨가시키고, 밀봉시키고, 용해될 때까지 혼합시키고, 알루미늄 포일로 덮고, 통기가 잘 되는 곳에서 실온으로 철야 배양시켰다.

절단시킨 후, 시료를 교반 증류기로 건조시키고, 0.5㎖ 물에 재현탁시키고, HPLC로 분획화시키기 전에, 시료를 50% 포름산에 약 1㎎/㎖의 단백질 농도로 재용해시켰다.

펩티드를 Altex Ultrasphere Octyl 칼럼과 트리플루오로 초산/물-트리플루오로초산/아세토니트릴 선형용출 농도 구배를 사용하여 Waters HPlC 시스템에서 분획화시켰다. 가능하면, 펩티드는 아미노산 분석으로 동정하였다. 표 1은 r-HuIFN-γ의 단축형용 비교 데이타이다.

[표 1]

* 제1도의 번호 시스템에 기준하였지만 N-말단 메티오닌이 각 경우에 존재하는 것은 예외됨.

* * 아미노산 잔기를 위한 통상적인 단일 문자 약자는 다음과 같다.

A : 알라닌 F : 페닐알라닌 G : 글리신

K : 리닌 L : 로이신 R : 아르기닌

T : 트레오닌

범위 126aa-143aa(N-말단 메티오닌 제외)내 일정 길이의 감마 인터페론은 적절한 꼬리가 있는 유전자로부터 발현될 것이다. 즉, 예를들면, 제1도에 나타난 유전자는 다음 위치에 Fnu4H 제한 부위를 함유하고 있다.

Fnu4H로 제한 절단시킨 후, 발현 플라스미드에서 존재하고 있는 제한 부위와 상용성인 링커 및 “종지”코돈이 이어진 목적 서열을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를 감마 인터페론 유전자의 전반부에 결합시킬 수 있다. 예를 들면, X가 하나 이상의 아미노산을 코딩하는 다음의 서열

를 상기한 대장균 발현 매개체에 결합시킨 후 Fnu4H와 BglII로 플라스미드를 분해시키면 다음 종지 코돈이 결합에 의해 생성되었다.

B g 1 I I

E. 분석 : 세포병리 효과의 저해(CPE)

1. 시험과정

각각의 웰에 Eagles MEM중에 4×10⁵세포/㎖를 함유하도록 조절된 인체 폐암종(A549) 세포(ATCCCCl 185호)의 현탁액 100㎕를 첨가하였다.

플레이트를 37℃에서 약 18시간 동안 배양시켰다.

18 내지 24시간 동안 배양시킨 후, 첫째 칼럼 중의 각 웰에 80㎕ 배지를 더 첨가하였다.

인터페론 활성 분석을 위해 첫째 칼럼의 웰에 20㎕의 시료를 첨가하였다.

첫째 칼럼의 각 웰의 내용물 100㎕를 수평으로 둘째 칼럼의 각 웰에 옮겼다.

칼럼으로부터의 웰내 내용물 100㎕를 계속 10회 옮겨서 칼럼11까지 계속한다.

24시간 동안 배양시킨 후, 대조용 세포만 빼고 모든 웰을 배양 24시간 내 100% 세포 병리 효과를 일으키는 다중 감염에서 50㎕의 엔세팔로미오카르디티스(Encephalomyocarditis) 비루스로 감염시켰다.

트레이를 뚜껑으로 덮고, 37℃에서 24시간 배양한다.

모든 웰에서 액을 따라 내고, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 5 내지 15분 염색하였다.

세포 생존도는 염색된 세포를 관찰함으로써 결정하였다.

시료의 역가는 50% 생존 세포가 잔존하는 희석의 역수이다.

2. 계산

모든 시료의 활성은 다음으로 계산되는 Reference Unit Conversion Factor로 노르말화시킨다.

3. 비활성

NIH에 의하여 제공된 IFN-감마 대조 물질로 표준화된 A549/EMCV 생분석 시스템을 사용하여 분석한 결과, 재조합 인체 IFN-감마의 항비루스 비활성은 N-말단에 세개의 부가 아미노산(CYS-TYR-CYS)이 있는 변형된 r-IFN-감마 분자의 활성보다 약 3배로 높게 나타났다.

4. 안정성

상기의 생활성 측정(A549/EMCV)에 다시 기준하여서 조제되어 바이알에 넣어진 rIFN-감마는 생산 3개월후(4℃ 보관)에도 계속 안정하였다(생물학적 활성 손실이 없음).

F. 다른 유형의 인체 인터페론과 비교한 rIFN-감마의 항증식 활성

1. 재료 및 방법

rIFN-감마 : 용액 형태의 Des Cys-Tyr-Cys 인터페론 감마(20mM 숙신산나트륨, 0.15M NaCl, pH6). 재료는 상기의 대장균 발효예에 의거하여 제조되었다. 비활성은 2.7×10⁷IU/㎎ 단백질이다.

CTC-rIFN-감마 : 용액 형태의 분자의 N-말단에 “Cys-Tyr-Cys구조”를 지닌 재조합 인터페론 감마(20mM 숙신산나트륨, 0.15M NaCl, pH6). 비활성은 1.3×10⁷IU/㎎ 단백질이다.

HuIFN-베타 : Toray Ind., Inc. 사에 의하여 제조된 1×10⁷IU/mg 단백질 이상의 비활성을 지닌 인체 디플로이드 포어스킨 (foreskin) 섬유 아세포에서 생성된 동결 건조 인체 섬유 아세포 인터페론. 하나의 바이알을 3×10⁶IU/HuIFN-베타와 3mg 인체 혈청 알부민을 함유한다.

HuIFN-알파 : 중앙 보건연구소(핀란드 헬싱키 소재)의 칸델(Dr. K. Cantell)에 의하여 용액 형태로 공급된 4×10⁶IU/㎎ 단백질의 비활성을 갖는 인체 천연 백혈구 인터페론.

대조용 : 3㎎ 인체 혈청 알부민을 함유한 플라시보(Placebo).

배양배지 : 10% 열 비활성화된 프레콜로스트룸 신생 소혈청(“PNCS”)와 2mM L-글루타민이 보충된 Eagle's 최소 필수 영양 배지가 Hela, KB, HMV-1, FL, 및 J-Ⅱ 세포에 대해 사용되었다. 10% 열 비활성화된 PNCS, 100ug/㎖ 카나마이신 및 2mM L-글루타민을 함유한 Dulbecco의 최소 필수 영양 배지가 A549 세포에 대해 사용되었다. 열 비활성화된 PNCS와 100ug/㎖ 카나마이신이 보충된 RPMI 1640 배지가 표 2에 나타난 나머지 인체 세포에 대해 사용되었다.

2. 항증식 활성의 평가

배양 배지에 현탁된 시험 세포를 5×10³세포/0.5㎖/웰의 농도로 플라스틱 조직 배양판에 접종시켰다. 대응하는 배양 배지(0.5㎖)에 용해된 다양한 양의 인터페론을 계속 첨가하였다(0일째). 5% CO₂와 95% 공기의 습한 분위기에서 37℃로 배양시켰다. 6일째에 배양 배지를 제거하고, 현탁 배양액 중의 세포를 Coulter 계수기에서 세포를 계수하기 위해 Isoton Ⅱ(Coulter 전자 주식회사 제품)에 직접 현탁시켰다. 플라스틱 용기에서 막을 형성하는 세포를 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 전처리하고 Isoton (Coulter 전자 주식회사 제품)에서 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 인터페론의 항증식 활성은 대조 배양체(인터페론이 없는 것)와 비교하여 세포수를 50% 감소시키는데 필요한 항비루스 단위(IC₅₀, IU/㎖)로 표시하였다.

표에 나타나듯이, rIFN-감마의 항증식 활성은 인체 세포 종에 따라서 크게 변하였다. 이 경우에 KATO-Ⅱ, 위의 단일 고리 세포 암종은 매우 민감하게 반응하여서 IC₅₀1.2 IU/㎖가 나타났지만, Ⅱ형 인터페론(HuIFN-α, HuIFN-β)에 매우 민감한 Daudi 세포인 Burkitt의 림포마는 rIFN-감마를 포함한 Ⅱ형 인터페론에 민감하지 않았다. 폐아데노 암종(PC-8, PC-12)은 시험된 모든 인터페론 종에 민감하지 않았다. rIFN-감마와 CTC-rIFN-감마 사이의 항세포 스펙트럼은 거의 동일하며, rIFN-감마의 항증식 효율은 CTC-rIFN-감마보다 우수하였다. 4가지 인터페론을 비교한 경우에, Daudi 세포의 경우만 제외하고 가장 높은 효력이 rIFN-감마에서 얻어졌다.

[표 2]

G. 시험관 내에서 여러가지 체액중의 rIFN-감마와 CTC-rIFN-감마 사이의 안정성 비교

10㎎ 인체 혈청 알부민, 인산염 완충액 및 등장양의 NaCl을 함유한 대장균 발효예에 따라서 생성된 동결건조 rIFN-감마 1×10⁶IU 바이알과 N-말단에 “Cys-Tyr-Cys”를 지닌 동결 건조 rIFN-감마 1×10⁶IU/ 바이알을 증류수로 용해시켜 농도를 4×10⁴IU/㎖로 조정하였다.

인터페론의 시험관 내 안정성은 여러가지 체액에서 잔류 항비루스 활성의 결정으로 평가하였다. 수조 배양기에서 37℃ 또는 4℃로 10분간 예비 배양시킨 토끼 혈청, 인체 혈청 또는 Eagle's MEM 9부피에 상기 인터페론 용액을 첨가하므로서 배양을 시작하였다. 0, 0.25, 0.5, 1, 4, 8, 24, 72, 및 144시간에서, 시료를 분취하고, 9부피의 Eagle's MEM과 혼합하였다. 시료를 인터페론 역가 분석때까지 -80℃에서 계속 동결시켰다. 인터페론 역가는 Sindbis 비루스로 감염시킨 인체 양막 세포(FL세포)를 사용하는 CPE50 감소법에 의하여 분석하였다. 결과는 제3도에 부가 역가에 대한 잔류 역가의 백분율로 나타냈다.

본 발명은 발현을 대장균과 COS-7 세포에서 수행하는 바람직한 실시태양에 의해 참고로 예시되었지만, 본 발명의 재조합 감마 인터페론은 관련 미합중국 출원 제312,489호와 문헌(6)에 나타낸 바에 따라 다른 박테리아 균주, 효모 및 조직 배양계와 같은 것 뿐만 아니라 다른 계에서 생성될 수 있음은 자명하다. 즉, 본 발명은 가장 양호한 예에 한정되지 않고, 다음의 청구 범위에 합법적으로 인식되는 균등물까지 확장된다.

[참고 문헌]

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19. Simonsen et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2250 (1983)

Claims

N-말단에서 신장하는 하기의 아미노산 서열로 되는 재조합 감마 인터페론 폴리펩티드

상기 식에서, X는 메티오닌 잔기 또는 수소이고, Y는 글루타민 잔기이거나, 또는 X가 수소인 경우에, Y는 글루타민 또는 피로글루타메이트 잔기임.
제1항에 있어서, X가 메티오닌인 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 X에서 부터 신장되는 126+n 아미노산으로 되고, 여기서 n이 0또는 1-17의 정수인 폴리펩티드.
제3항에 있어서, n 아미노산이

인 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 폴리펩티드가 아미노산 143이 없거나 또는 아미노산 서열 z 내지 아미노산 143이 없는 폴리펩티드의 유사체로 된 군 중에서 선택되며, 여기서 z는 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 또는 142인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 127인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 128인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 129인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 130인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 131인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 132인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 133인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 134인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 135인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 136인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 137인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 138인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 139인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 140인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 141인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, Z가 아미노산 142인 폴리펩티드.
제5항에 있어서, 아미노산 143만이 없는 폴리펩티드.
제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드가 세포 병리 억제 마이크로타이터 분석에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 재조합 감마 인터페론의 활성과 거의 동일하거나 그 이상인 활성을 나타내는 것인 폴리펩티드.

상기 식에서, X는 수소이고, A는 CYS-TYR-CYS임.
제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 병리 억제 마이크로타이터 분석에 있어서, 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 재조합 감마 인터페론의 활성에 거의 2배 이상의 활성을 나타내는 것인 폴리펩티드.

상기 식에서, X는 수소이고, A는 CYS-TYR-CYS임.
천연 인체 감마 인터페론의 특징적 특성을 나타내고, 적어도 제1항에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나서 다음과 같은 아미노산 서열

까지 신장되는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나고 다음과 같은 아미노산 서열

까지 신장되는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나서 다음과 같은 아미노산 서열

까지 신장되는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나서 다음과 같은 아미노산 서열

까지 신장되는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나서 다음과 같은 아미노산 서열

까지 신장되는 폴리펩티드.

상기 식에서, Z는
제25항에 있어서, 아미노산 서열이 126 위치를 지나서 다음과 같은 아미노산 서열.

GLY-LYS-ARG-LYS-ATG-Z까지 신장되는 폴리펩티드.

127 128 129 130 131

상기 식에서, Z는
제26항의 폴리펩티드와 제27항의 폴리펩티드의 혼합물로 되는 조성물.
제32항에 있어서, 폴리펩티드의 약95 이상이 제26항의 폴리펩티드로 되는 조성물.
제32항에 있어서, 폴리펩티드의 약 97 이상이 제26항의 폴리펩티드로 되는 조성물.