NO178789B - Fremgangsmåte for fremstilling av gamma-interferonpolypeptid med forbedret stabilitet, ekspresjonsvektor samt DNA-sekvens kodende for polypeptidene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av gamma-interferon-polypeptid med forbedret stabilitet, ekspresjonvektor samt DNA-sekvens kodende for polypeptidene.

Publiksjonene og annet materiale sin er benyttet heri for å belyse oppfinnelsens bakgrunn og i spesielle tilfeller for tilveiebringelse av ytterligere detaljer i denne forbindelse, er for hensiktsmessighetens skyld referert til ved bruk av henvisningstall i den følgende tekst og gruppert tilsvarende i den medfølgende bibliografi.

Humane interferoner kan klassifiseres i tre grupper på grunnlag av forskjellig antigenisitet og biologiske og biokjemiske egenskaper. Den først gruppen omfatter en familie av leukocytt-interferoner som normalt produseres hovedsakelig av celler som befinner seg i humant blod ved viral induksjon. Disse har blitt fremstilt mikrobielt og funnet å være biologisk aktive (1,2,3). Deres biologiske egenskaper har tilskyndet deres bruk klinisk som terapeutiske midler for behandling av virale infeksjoner og ondartede tilstander (4).

I den andre gruppen er humant fibroblast-interferon, som normalt produseres av fibroblaster ved viral induksjon, som likeledes har blitt fremstilt mikrobielt og funnet å utvise et bredt område av biologiske aktiviteter (5). Kliniske forsøk indikerer også dets potensielle terapeutiske verdi. Leukocytt- og fibroblast-interferonene viser klart likheter i deres biologiske egenskaper til tross for det faktum at graden av homologi ved amino-syrenivået er relativt lavt. Begge grupper av interferoner inneholder fra ca 165 til ca 166 aminosyrer og er syrestabile proteiner.

Humant gamma-interferon (også i varierende grad referert til som immun-interferon, y-interferon, IIF eller IFN-y) viser de antivirale og anti-proliferative egenskapene som er karakteristiske for interferoner, men, i motsetning til leukocytt- og fibroblast-interferoner, er pH 2 labilt. Forut for fremstillingen av gamma-interferoner via rekombinant DNA-teknologi, har det blitt fremstilt hovedsakelig ved mitogen induksjon av lymfo-cytter. Humant gamma-interferon er klart antigenisk forskjellig fra leukocytt- og fibroblast-interferonene. Gray, Goeddel og medarbeidere var de første til å rapportere ekspresjon av et rekombinant gamma-interferon (6), som har vist seg å ha de karakteristiske egenskapene til humant gamma-interferon, dvs anti-viral og anti-proliferativ aktivitet koplet med pH 2 labilitet. Det rekombinante gamma-interferon til Gray og Goeddel, som fremstilt i E.coli, besto av 146 aminosyrer, idet molekylets N-terminaldel begynner med sekvensen CYS-TYR-CYS-. Derynck og andre rapporterte senere (7) et ytterligere rekombinant gamma-interferon med den samme N-terminus og en enkel aminosyre-substitusjon, idet polypeptidet muligens utgjør en allelisk variant av den som tidligere er rapportert i referanse (6). Andre forskere har rapportert fremstillingen av ytterligere rekombinante gamma-interferoner hvori en eller flere av aminosyrene som er tilstede i originalpublikasjonen (6) til Goeddel og Gray, angivelig har blitt substituert.

Alton et al (17) rapporterer om en serie IFN-gamma-materialer hvori en enkel aminosyre-substitusjon ved stilling 81 i Gray et al (6) gamma-interferonet, resulterte f.eks i et IFN-gamm som bibeholdt kun 70 % av aktiviteten (på en relativ basis) og hvori en ytterligere utelatelse av cys-tyr-cys ved stillingene 1, 2, 3 i dette IFN-gamma ytterligere reduserte den relative aktivitet og resulterte i et IFN-gamma med kun 49 % av gamma-interferonet til Gray et al (6).

I foreliggende sammenheng har rekombinante gamma-interferoner hvis N-terminale aminosyresekvens omfatter cysteinrester vist seg å være problematisk ut fra oligomeri-seringsstandpunktet som kan innebære deltakelse av sulfhydrylgrupper i en eller flere av cysteinrestene i disulfid-bindingsdannelse. Den kjensgjerning at man ikke er i stand til fullstendig å redusere disse antatte disulfidbindingene typer på at problemet kan være mer komplekst, og muligens også innebærer reaksjon gjennom hydroksylfunksjonen til den cysteinbundede tyrosinrest. Disse rekombinante interferoner har vist seg å være noe ustabile og har, selv om det resulterer fra en slik ustabilitet eller andre faktorer, vist å ha mindre enn optimal nyttevirkning.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant gamma-interferonpolypeptid som forøket stabilitet og aktivitet og som har den N-terminale aminosyresekvensen:

hvor X er en metioningruppe eller hydrogen og Y er en glutarningruppe, eller når X er hydrogen så er Y enten en glutamin- eller en pyroglutamatgruppe, og Z består av n aminosyrer fra sekvensen:

begynnende med GLY 127, hvorved n er 0 eller et helt tall 1- 17 når X er en metioningruppe, og n er 0 eller et helt tall 1-16 når X er hydrogen, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved dyrking av en bakterie slik som E. coli eller en pattedyrcellelinje slik som COS-7, som er transformert med en replikerbar ekspressjonsvektor som har evne til å uttrykke nevnte polypeptid.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en replikerbar ekspresjonsvektor, som er kjennetegnet ved at den i en transformert bakterie, slik som E. coli eller en pattedyrcellelinje slik som cellelinjen COS-7, har evne til å uttrykke et polypeptid med den ovenfor definerte N-terminale aminosyresekvensen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere en dobbeltkjedet DNA bestående av en kodende kjede og en komplementærkjede, kjennetegnet ved at den kodende kjeden koder et polypeptid med den ovenfor definerte N-terminale aminosyresekvensen.

De foretrukne fremstilte rekombinante gamma-interferonene (sammenlignet med de som tidligere er karakterisert i litteraturen) synes å komme nær opptil den virkelige aminosyresekvensen til nativt gamma-interferon, idet nevnte sekvens nå har blitt renset fra native kilder og fullstendig karakterisert. Foretrukne utførelser har som vist i det nedenstående sterkt forbedret stabilitet og aktivitet i forhold til de som tidligere er beskrevet i litteraturen.

Den måte på hvilken disse og andre formål ved oppfinnelsen er oppnådd vil fremgå fra følgende detaljerte beskrivelse og fra de medfølgende tegninger hvor: Fig 1. illustrerer aminosyrer 1 til 143 i et rekombinant gamma-interferon ifølge oppfinnelsen og DNA-sekvens som koder aminosyresekvensen som forutgås av en signalsekvens, hvilken DNA-sekvens flankeres av områder 5'- og 3'-utransla-terte DNA'er. Fig 2. illustrerer skjematisk et plasmid som koder for direkte syntese av et rekom binant gamma-interferon ifølge oppfinnelsen i E.coli og dets fremstilling. Fig 3. angir data som demonstrerer den forøkede stabiliteten til gamma-interferon

fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Man har lært at nativt humant-interferon (dvs det som skriver seg fra mitogen induksjon av humane, perifere blodlymfocytter og etterfølgende rensing) er et polypeptid som mangler CYS-TYR-CYS- N-terminusen assignert av Gray et al til det rekombinante gamma-interferon hvis sekvens er avbildet i (6). Tryptiske spaltningsmaterialer av sterkt renset nativt gamma-interferon som man har hatt til rådighet inkluderte sekvenser hvis aminosyresammensetning generelt tilsvarende den i til N-terminaldelen i det rekombinante gamma-interferom i (6) til Gray et al minus CYS-TYR-CYS.

Aminosyresekvensanalyse fra N-terminusen i nativt gamma-interferon viste seg å være resultatløs idet den ga opphav til den slutning at alfa-aminosyren ved molekylets N-terminus var beskyttet. Siden den første aminosyren utenfor den andre cysteingruppen i Gray et al (6) for hvilken cDNA kodet var GLN (glutamin), antok man at ringslutning av GLN-resten istedenfor hadde etterlagg pyroglutamat slik at N-terminusen var blokkert. Fjerning av pyroglutamat slik at N-terminusen var blokkert. Fjerning av pyroglutamat med pyroglutamat-aminopeptidase etterlot en fri alfa-amino-gruppe forbundet med ASP, den neste innkodede aminosyre, en sekvensanalyse kunne fortsette og tillot den første rapporterte karakterisering av nativt humant gamma-interferon.

Hensiktsmessig forandring av cDNA for CYS-TYR-CYS-holdig rekombinant human

gamma-interferon tillot direkte ekspresjon i E.coli av nytt rekombinant gamma-interferon fra et cDNA som innkoder proteinet hvis fulle sekvens er angitt ovenfor, idet X er MET og Y er GLN. N-terminal-metionet er et artifakt innkodet av mRNA-translasjons " start "-signalet AUG som, i det spesielle tilfellet for den eksemplifiserte E.coli ekspresjon, ikke behandles bort av vertssystemer. I andre mikrobielle systemer, f.eks pseudomonas, kan

metionin fjernes; i alle tilfeller synes det ikke å være nødvendig for aktivitet. Når metionin fjernes og avhengig av det benyttede system, kan GLN-resten ringslutte til pyrogluta-matformen, igjen uten noen antatt svekkelse av aktiviteten.

Det av Gray og medarbeidere tidligere rapporterte CYS-TYR-CYS-holdige rekombinante gamma-interferon som man har hatt til rådighet har trukket fordel av formulering med humant serumalbumin for stabiliseringsformål. Tilstedeværelsen av serumalbumin i det sluttelige lyofiliserte produkt krever imidlertid at visse kvalitetskontrolltrinn må foretas forut for lyofilisering istedenfor på det ferdige produkt. I tilfellet for foreliggende nye, rekombinante gamma-interferon har materialet i lyofilisert form på den annen side vist seg å være tilstrekkelig stabilt uten inklusjon av serumalbumin. Om ønsket kan imidlertid foreliggende gamma-interferoner formuleres med farmasøytisk akseptable nivåer av humant serumalbumin.

Utover det foregående synes de CYS-TYR-CYS-manglende rekombinante, humane gamma-ineterfoner fremstilt ifølge oppfinnelsen hva angår testing for inhibering av cytopatisk effekt å være betydelig mer aktive som antivirale midler enn deres CYS-TYR-CYS-holdige analoger. Aktiviteten analyseres konvensjonelt i mikrotiterplater ved inhibering av den cytopatiske effekt (CPE) til encefalomyokarditis-virus på humane lunge-karsinomaceller A549, se (12).

De fremstilte rekombinante gama-interferonene innbefatter alle de som omfatter aminosyrer 1 til 126 i den ovenfor gitte fulle sekvens. Gamma-interferoner som i variert grad er avskåret ved karboksy-terminaldelen i forhold til den fulle sekvens fortsetter å vise de karakteristiske egenskapene til humant gamma-interferon, skjønt ved minskede nivåer i noen tilfeller så lenge som aminosyrer 1 til 126 er tilstede. Forsøk med den CYS-TYR-CYS-holdige analogen rapportert i (7) viste virkelig et fremmede sekvenser kunne inn-settes istedenfor aminosyresekvensen etter aminosyre 132 (ved foreliggende nummerer-ingssystem) uten tap av aktivitet. Se f.eks (8). Preliminært bevis som er til rådighet understøtter denne hypotesen at mens aminosyrer 1 til 126 (THR) er relativt fast bundet i en tredimensjonal konfigurasjon som man forbinder med aktivitet, er gjenværende aminosyrer i den fulle sekvens ved sammenligning mindre begrenset og relativt føl-somme overfor proteolyse. Trypsinspaltning under begrensede betingelser fjerner forskjellige deler av sekvensen nedstrøms fra aminosyre 126, men ikke oppstrøms derfra. Native gamma-interferongrupper som man har til rådighet innbefatter molekyler som i variert grad forløper gjennom aminosyrer 127, 128, 129, 130, 132 og 134. Man har sett helt aktivt rekombinant gamma-interferon hvis aminosyresekvens etter metionin besto avvekslende av aminosyrer (utenfor MET) 1 til 139 og 1 til 131, idet den sistnevnte var oppnådd ved begrenset spalting av rekombinant gamma-interferon med trypsin fulgt av sekvenskonfirmasjon. Lignende trypsinspaltede fragmenter som avvekslende avsluttet ved omkring aminosyrer (utenfor MET) 128 og 129 bibeholdt aktivitet skjønt vesentlig minsket. På den annen side viste materialet med 125 aminosyrer (i tillegg til N-terminal-metionin), idet treoninet ved stilling 126 og etterfølgende aminosyrer er avspaltet, mindre enn 1 % av aktiviteten til ikke-spaltet materiale i CPE-inhiber-ingsanalyse.

Rekombinantavledet gamma-interferon synes, i tillegg til at det har et innledende metionin når det er fremstilt i verter hvor metionin ikke er spaltet intracellulært, å utvise en hovedtype som har 139 aminosyrer (basert på nummereringssystemet i fig 1) og en mindre betydelig type som har 143 aminosyrer. Sammensetningen av de to typene inneholder mer enn ca 95 %, mer foretrukket over ca 97 % av de typer som har 139 aminosyrer. Trypsinspalting under begrensede betingelser fjerner likeledes forskjellige deler av sekvensen nedstrøms fra omkring aminosyre 126. Rekombinant gamma-interferon som man har til rådhet etter en slik begrensende trypsinspaltning innbefatter typer som avvekslende strekker seg gjennom aminosyrer 125 (126 med en innledende metionin), 129, 131 og 134. Disse typer har bibeholdt aktivitet, skjønt vesentlig minsket, i den sone som rager fra aminosyre 125 til 129. Typer som har minst 129 aminosyrer og spesielt minst ca 131 aminosyrer, dvs typer som har fra 129 til 143 aminosyrer, er vesentlig funksjonelt fullstendig aktive.

Det er ifølge foreliggende oppfinnelse foretrukket at Z omfatter sekvensen:

eller at Z omfatter sekvensen: eller at Z omfatter sekvensen:

Med den er benyttede betegnelse "rekombinant gamma-interferon" menes et polypeptid (enten glykoslyert av cellen hvori det er produsert, eller ikke) uttrykt i en transformant

celle fra en replikerbar ekspresjonsvektor oppnådd fra rekombinant DNA-teknologi, idet polypeptidet viser større eller mindre grad av den antivirale og antiproliferative aktivitet i mennesker og pH 2 labile egenskaper som er karakteristiske for nativt, humant gamma-interferon.

De her beskrevne rekombinante gamma-interferoner antas å danne "dimerer", definert for foreliggende formål som en kombinasjon av to slike polypeptider som hver har minst fra 1 til 126 aminosyrer (hvilke polypeptider kan ha de samme eller forskjellige antall aminosyrer). Typen av den kjemiske kombinasjonsmekanisme er ikke fullt ut forstått, men antas å være forskjellig fra kovalent binding. Denne kombinasjon til dimerer synes å oppstå spontant og antas å være uunngåelig i de her beskrevne systemer. Således, når foreliggende rekombinante gamma-interferoner aministreres, vil de vanligvis være i den dimeriserte form.

Videre skal det forstås at, i likhet med det som beskrives i litteraturen vedrørende forskjellig karakteriserte rekombinante gamma-interferoner (8,9), aminosyresubstitusjoner eller -addisjoner, spesielt enkelt-aminosyre-substitusjoner og addisjon og substitusjon av grupper av aminosyrer oppstrøms eller nedstrøms fra ca aminosyre 126 eller C-terminusen, i de he beskrevne rekombinante gamma-interferoner, her er mulig uten å øde-legge interferonaktiviteten som de er i besittelse av. Det antas at det ville være åpenbart for en fagmann å foreta slike substitusjoner eller addisjoner uten å gå utenfor foreliggende oppfinnelses ramme. Igjen innbefatter foreliggende rekombinante gamma-interferoner typer som har modifikasjoner og alleliske variasjoner av den fulle sekvensen (se fig 1) som viser biologisk aktivitet ekvivalent med eller større enn den til den fulle sekvens.

Rensede rekombinante gamma-interferoner vil karakteristisk være vesentlig frie for andre proteiner av human opprinnelse, og skal derved skjeldnes fra de native, humane gamma-interferonsammensetninger som hittil har vært tilgjengelige.

Oppfinnelsen innbefatter som nevnt fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante gamma-interferonsammensetninger som (forut for formulering) er mer enn ca 95 % rene, fortrinnsvis mer enn ca 98 % rene, hvilke sammensetninger av denne grunn likeledes er forskjellige fra hittil tilgjengelige native gamma-interferoner.

Utførelser av oppfinnelsen hvori N-terminal aminosyreresten er metionyl er likeledes forskjellig fra gamma-interferoner fremstilt i det menneskelige legemet, og synes også av den grunn å være forskjellig, utover deres sløyfing av CYS-TYR-CYS- fra de hvis sekvens er rapportert av Gray et al (6).

De replikerbare ekspresjonsvektorer som det her vises til er dobbeltkjedede DNA grupper, fortrinnsvis plasmider, omfattende en kilde for replikasjon, en promotor eller promotor-operator, en sekvens som innkoder et ribosom-bindingssete, en kodon for et translasjonsstartsignal, og i riktig lesefase dermed et gen som innkoder det rekombinante gamma-interferon som er av interesse fulgt av kodon(er) for en translasjonsstopp. Ved foreliggende trinn er de generelle teknikker og leksikografi for rekombinant DNA-teknologi godt forstått av fagmannen, som i alle tilfeller henvises til (11) for bakgrunns-informasjon som er relevant for utførelse av foreliggende oppfinnelse, mutatis mutandis, i alle dens utførelser og alle legalt erkjenbare ekvivalenter.

EKSEMPEL

A. Kloning

Rekombinante DNA-kloner inneholdende gamma-interferon cDNA-sekvenser ble fremstilt som beskrevet i (6) og i US søknad Serial nr 312.489 med mRNA fra induserte, humane perifere blodlymfocytter. DNA-sekvensen for klon p67 er vist på fig 1. Et 5'-utranslatert område følges av 69 nukleotider som innkoder et forløper- eller signalpeptid av 23 aminosyrer, 429 nukleotider som koder for et ferdig interferon-polypeptid med 143 aminosyrer, og 587 nukleotider med 3'-utranslatert sekvens.

B. Ekspresjon

1. E.coli-eksempel

For å uttrykke høye nivåer av rekombinant IFN-y i E.coli, må initieringen av protein-syntese foregå ved et ATG-kodon umiddelbart forut for glutaminkodonet (aminosyre 1) i det ferdig utviklede polypeptid istedenfor enn ved ATG i signalpeptidet (aiminosyre Sl)

(fig 1). Fremgangsmåten som følges for å uttrykke cDNA-innskudd i p67 direkte i E.coli er skissert på fig 2. Metoden var lik den som anvendes for E.coli og uttrykke DNA-innskuddet i Gray et al (6).

Et Avall-restriksjonssete beliggende ved kodon 2 i den antatte ferdig utviklede kodings-sekvens ble benyttet for å fjerne det signalpeptid-kodende området. Det ble tilveiebragt to syntetiske deoksyoligonukleotider som gjenoppretter kodonene for aminosyrer 1 og 2, inkorporerer et initierende ATG-translasjonskodon, og danner en XBal kohesiv terminus. Disse to oligomerer ble ligert til resten av cDNA-innskuddet for å konstruere syntetisk, naturlig hybridgen av 1063 basepar som koder for et polypeptid med 144 aminosyrer og bundet ved XBal- og Pstl-seter. Dette gen ble innført i plasmide pLelF A25 (10) mellom XBal- og Pstl-seter for oppnåelse av ekspresjonsplasmidet py-CYC5. E.coli-stammen W3110 (F-, y-, protrofisk) (ATCC nr 27325) ble transformert med dette plasmid for oppnåelse av vert-vektorkombinasjonen E.coli W{ pl 10/py-CYC5.

2. Cellekultureksempel

Ekspresjon av et gen som innkoder både signalpeptidet og gamma-interferonet, som vist på fig 1, ble foretatt i COS-7-celler (16) i nærvær av radioaktivt merket cystein og metionin, hvilket bekrefter fremstillingen fra genet av fullt utviklet gamma-interferon hvis N-terminale aminosyrer er som indikert på fig 1 (til forskjell fra det tilfellet som innebærer E.coli ekspresjon, ekspresjonsproduktet til pattedyr-cellesystemer lik det som her er eksemplifisert mangler N-terminal metionin).

Sammenløpende monolag av COS-7-celler i 60 mm petriskåler ble transfektert i duplikat med DNA under anvendelse av den modifiserte DEAE-dekstranmetoden. Tre dager etter DNA-tilsetning ble mediene fjernet. Hvert sett av plater mottok 2 ml DMEM supplert med enten 100 fiCi S^metionin eller S^<5->cystein. Etter 16 timers inkubering i nærvær av den radiomerkede aminosyren, ble mediene fjernet og 500 ( x\ immunoutfelt under anvendelse av et anti-gamma-interferon-monoklonalt antistoff eller et anti-HBsAg-monoklonalt antistoff som det første antistoffet og et kanin-anti-mus IgG-antistoff

(Cappell Inc.) som det andre antistoffet. Reaksjon med antistoffet og den etterfølgende binding til Staphylococcus A-celler (Calbiochem) er beskrevet av Berman, P. et al (18). Prøvene ble resuspendert i SDS-merkaptoetanol og utsatt for elektroforese på 10A SDSPAGE geler. Gelen ble fiksert i 7A eddiksyre i etanol, bløtlagt i Enhance (New England Nuclear)-fluoroppløsning, tørket og eksponert i to uker under anvendelse av "Kodak AR5"-film og en forsterkningsskjerm (Dupont).

Plasmider benyttet i dette studium var pSVgamma69 (11); pDL RI (19), en hepatitt B virus-overflateantigen-ekspresjonsvektor på hvilken pSVgamma69 var basert; og pDL RIgamma Sau, et polycistronisk plasmid inneholdende 830 bp SAU3a-fragmentet til pSVgamma69 (11) som spenner over alle de gamma-interferonkodende sekvenser som er innført i EcoRI-setet i pDL RI. Det sistnevnte plasmid produserer et transkript inneholdende både gamma-interferon- og BHsAg-kodingsområdene.

Sammenligning av S^^-cystein- og S^^-metionin-merkde proteiner som reagerer med enten anti-gamma-interferon (A) eller anti-HBsAg (B)-antistoffer viste at ingen materiell migrering ved enten den glykosyleite (29.000 MW) eller monoglykosylerte stilling (18.000 MW) ble spesifikt immunoutfelt fra S<35->Cys-merket pDL RI -gamma Sau-transfekterte celler under anvendelse av anti-gamma-interferon-antistoff, i motsetning til de s<35->met-merkede cellene som vist immunoutfelling av interferon-gamma.

C. Fermenteringsproduksjon

Fremstilling av rekombinant humant interferon-gamma (rIFN-y) under anvendelse av E.coli W3110/py-CYC5 utføres i satser varierende i volum fra 10 til 1000 liter. Etter fermentering blir de interferonholdige E.coli-cellene utvunnet fra buljongen for isolering og rensing av rIFN-y. Det følgende er en beskrivelse av fermenterings- og celleutvin-ningsprosessene.

1. Fremstiling og opprettholdelse av forrådskulturer

en forrådskultur fremstilles i sterile, omrørte kulturkolber inneholdende 150-500 ml av et sterilt medium med følgende sammensetning:

Mediet inokuleres deretter med en primær kultur av E.coli W311/py-CYC5.

Den inokulerte kolben inkuberes deretter på en rysteinnretning ved 25-37 °C inntil absorbansen ved 550 nm når omtrent 1,0. Omtrent 50 % v/v av 30 % v/v dimetylsulfoksyd tilsettes til buljongen. 1 ml aliquoter fordeles umiddelbart i sterile ampuller og forsegles. Ampullene lagres ved -60°C eller under dette. Hver fermentering startes ved bruk av en replikat-forrådskultur for inokulum.

2. Inokulumfremstilling

Inokulumet fremstilles i det tidligere beskrevne medium (L.B. Brotn) i enten rystekolber eller små fermentere. Etter inkubering ved ca 37°C i omkring 8 timer overføres inokolumet til en fermenter. Inokulumets volum er melom 2 og 10 volum-% av fermenteringen.

3. Fermentering

Rekombinant interferon-gamma-produksjon utføres i fermentere med arbeidsvolum på ca 10-1000 liter. Fermenteringsmediet er sammensatt av:

<*> En del av glukosen og tryptofanen tilsettes til fermenteren til å begynne med og resten tilføres gjennom fermenteringsprosessen.

Bestanddeler i mediet steriliseres ved varmebehandling eller filtrering før bruk i fermenteringen.

Fermenteringen utføres ved 25-40°C. Andre operasjonsbetingesler er som følger:

4. Rensing

a. Eks tr aksjon av rekombinant gamma-interferon

E.coli-celler suspenderes i et medium som inneholder salter og en hensiktsmessig buffer i pH-området 6-9, fortrinnsvis ca 9. Rekombinant gamma-interferon ekstraheres ved homogenisering av cellesuspensjonen i en liøytrykkskolloidmølle slik som en Gaulin-mølle. Tilstrekkelig polyetylenimin tilsettes til oppløsningen til å gi en 0,1 % vekt/vol-oppløsning. Supernatanten inneholder gamma-interferon.

b. Delvis rensing av rekombinant gamma-interferon på et silisiumdioksydbasert absorbsjonsmiddel.

Supernatanten fra del (a) adsorberes på et silisiumdioksydbasert adsorbsjonsmiddel som vaskes for å fjerne urenheter med hensiktsmessige saltoppløsninger i pH-området 6-9. Rekombinant gamma-interferon elueres ved bruk av en oppløsning som inneholder 0,5-1,0 M tetrametylammoniumklorid. Alle operasjoner i dette trinnet foretas i pH-området 7-9.

c. Delvis rensing av rekombinant gamma-interferon ved anioneutvekslings-kromatografi

Elueringsmidlet fra del (b) dialyseres og adsorberes til et

anionutvekslingskromatografimedium som deretter vaskes for å fjerne urenheter. Rekombinant gamma-interferon elueres med en gradient av økende salt. Typiske anionutvekslingsharpikser som kan anvendes i dette trinnet innbefatter karboksymetylcellulose og sulfoetylcellulose. Alle operasjoner foretas i pH området mellom 7 og 9.

d. Delvis rensing av rekombinant gamma-interferon ved kromatografi på

kaliumfosfatgel

Elueringsmidlet fra del (c) adsorberes til et medium av kalsiumfosfat som deretter vaskes for å fjerne urenheter. Det rekombinante gamma-interferon elueres ved å øke saltkonsentrasjonen i en gradient med økende fosfatkonsentrasjon. Alle opersjoner i dette trinnet foretas i pH-området mellom 7 og 9.

e. Delvis rensing av rekombinant gamma-interferon ved anionutvekslings-kromatografi

Elueringsmidlet fra (d) dialyseres og adsorberes til et anionutvekslingskromatografimedium som deretter vaskes for å fjerne urenheter. Det rekombinante gamma-interferon elueres fra anionutvekslingsmediet med en gradient med økende saltkonsentrasjon. Typiske amonutvekslmgslaomatografimedier er karboksylmetylcellulose og sulfoetylcelluose og sulfoetylcellulose. Alle operasjoner i dette trinnet foretas i pH-området mellom 7 og 9.

f. Delvis rensing av rekombinant gamma-interferon ved geipermeasjons-kromatografi

Elueringsmidlet fra del (e) påføres på et gelpermeasjonsmedium og kolonnen utvikles med et saltholdig medium. De hensiktsmessige fraksjoner inneholdende rekombinant gamma-interferon oppsamles for tilveiebringelse av massen av legemiddelstoff. Alle operasjoner i dette trinnet foretas i pH-området mellom 7 og 9.

g. C-terminal-aminosyresekvens

For å bestemme C-terminal-sekvensen ble prøver dialysert i 70 % maursyre, spaltet med caynogenbromid og de resulterende peptider separert på en "Altec Ultrasphere C8" og del (c)-kolonne med reversert fase. Topper ble oppsamlet og analysert ved aminosyre- og sekvensanalyse. Et C-terminal-peptid ble funnet: -leu-phe-art-gly-arg

(rester 135-139, fig 1). I noen tilfeller ble et annet ytterligere peptid påvist: -leu-phe-arg-tly-arg-arg-ala-ser-gln (rester 135-143, fig 1). For å bestemme forholdet for disse to peptidene, ble kjente mengder (ved aminosyreanalyse) anbragt på HPLC-kolonnen med reversert fase og de respektive topphøydene bestemt. Hver av de tre produk-sjonsmengdene inneholdt mindre enn ca 2 % av det lange peptidet (135-143, fig 1), idet resten var 5-mer. Disse data er i overensstemmelse med E.coli produksjon av en balnding av 139 aminosyreholdige og 143 aminosyreholdige gamma-interferoner (unntatt N-terminal-metionin, som også er tilstede i hvert tilfelle) i de respektive relative mengdeforhold på ca 98,2 %.

5. Formulering

Rekombinant gamma-interferon fremstilt iføgle det ovenstående, formuleres fortrinnsvis for parenteral administrasjon ifølge nedenstående tabell.

Interferonene ifølge oppfinelsen kan benyttes i medisinsk passende doseringsområder, f.eks 1,0 mg/m<2> av legemsoverflateareal.

D. Bestemmelse av aktiviteten til forskjellige gamma-interferoner etter trypsinspalting

For å fastslå aktiviteten til forskjellige gamma-interferoner som adskiller seg med hensyn til deres karboksy-terminuser, ble gamma-interferon fremstilt som beskrevet i E.coli-eksemplet ovenfor, spaltet med trypsin i forskjellige grader og testet ved CPE-analyse med A549-celler som beskrevet.

En prøve av rekombinant gamma-interferon (r-HuIFN-gamma) (6,5 mg), fremstilt som beskrevet heri, ble avsaltet over en liten "Sephadex G-25"-molekylarsiktkolonne ("PD-10", Pharmacia) i 0,10 M ammoniumbikarbonatbuffer, pH 8,5 til en sluttelig proteinkonsentrasjon på 2,1 mg/ml. En fortynnet trypsinoppløsning ("Worthington TPCK"-trypsin, 10 /xg/ml i 0,001 M HC1, 16 /xl) ble tilsatt til 1,9 ml (4,0 mg) av r-HuIFN-gamma-oppløsningen, blandet og inkubert ved romtemperatur (trypsin:protein: 1:25.000). Prøver ble fjernet fra inkubasjonsblandingen ved 1 time, 3,5 timer, 5,75 timer, 8 timer og 10,25 timer. Ved 8 timer ble ytterligere 15 /il (150 ng) fortynnet trypsinoppløsning tilsatt for å akselerere reaksjonen for den siste tidspunktprøven ved 10,25 timer.

Fraksjonering av hver tidspunktprøve til dens respektive komponenter ble foretatt på et antall "Waters"-HPLC-system under anvendelse av en "BioRad Biogel"-HPHT-kolonne. Tidspunket aliquoten i bikarbonatbuffer ble anbragt direkte (ved manuell injeksjon) på kolonnen ved tidspunktet for prøvetakning. Kolonnen ble likevektsinnstilt i 0,01 M natriumfosfat, pH 8,0, 30 /xM kalsiumklorid og protein ble eluert fra kolonnen under anvendelse av en lineær gradient av den likevektsinnstilte buffer og 0,5 M natriumfosfat-buffer pH 8,0, 0,6 fiM kalsiumklorid.

Proteintopper som bestemt ved absorbans ved 214 nm og 280 nm ble preparativt oppsamlet og lagret tildekket ved 4°C inntil analyse. Typiske analyser for valgte topper innbefatter:

1. Antiviral aktivitet i det humane lungekarsinoma A549/EMC-virusanalysesystem (13). 2. SDS/PAGE-fraksjonering ved standardteknikker under anvendelse av Laemmli-gelsystemet (14). 3. Cyanogenbromid-proteinspalting og etterfølgende HPLC-analyse for peptididenti-fikasjon (15).

Prøver av protein dialyseres (12.000-14.000 MW avkutting) natten over mot 70 % maursyre, bringes til tørrhet ved rotasjonsfordampning og resuspenderes i 500 ^1 70 % maursyre. Fast cyanobromid tilsettes til hver prøve i et 12 x 75 mm glassrør, forsegling, blanding inntil oppløsning, tildekking med aluminiumfolie og inkubering natten over ved romtemperatur i et godt ventilert rom.

Etter spalting bringes prøvene til tørrhet ved rotasjonsfordampning, resuspensjon i 0,5 ml vann og tørking på nytt. Før fraksjonering ved HPLC, ble prøvene gjenoppløst i 50 % maur sy re til en proteinkonsentrasjon på omkring 1 mg/ml.

Peptider ble fraksjoner ved bruk av et Waters-HPLC-system under anvendelse av en Altex Ultrasphere Octyl-kolonne og en trifluoreddiksyre/vann - trifluoreddiksyre/aceto-nitril lineær elueringsgradient. Der det var mulig, ble peptider identifisert ved aminosyreanalyse. Tabell 1 angir sammenligningsdata for forkortede former av r-HuIFN-y:

A = alanin

F = fenylalanin

G = glycin

K = lysin

L = leucin

R = arginin

T = treonin

Det vil forstås at gamma-interferoner med en hvilken som helst lengde i området 126aa-143aa (unntatt N-terminal-metionin) vil bli uttrykt fra hensiktsmessig skreddersydde gener. Således inneholder f.eks genet illustrert på fig 1 et Fnu4H-restriksjonssete ved

Etter restriksjon med Fnu4H kan syntetiske oligonukleotider som koder en hvilken som helst ønsket sekvens fulgt av et " stopp "-kodon og et bindingselement som er forenelig med et tilgjengelig restrksjonssete i ekspresjonsplasmidet, ligeres til den fremre delen av gamma-interferongenet. For eksempel sekvensen hvor X koder en eller flere aminosyrer, kan ligeres i E.coli-ekspresjonsbæreren som eksemplifisert ovenfor etter spalting av plasmidet med Fnu4H og Bglll, et stoppkodon som resulterer fra ligering på følgende måte:

E. Analyse: inhibering av cytopatisk effekt (CPE)

1. Testmetode

Til hver brønn tilsett 100 fil av en suspensjon av humane lungekarsinoma (A549)-celler (ATCC nr CCL 185) som har blitt justert til å inneholde 4 x IO<5 >celler/ml Eagles MEM.

Inkuber plater ved 37°C i omkring 18 timer.

Etter 18-24 timers inkubering tilsett til hver brønn i den første kolonnen, 80 ^1 ytterligere medium.

Tilsett til en brønn i den første kolonnen 20 fil av en prøve som skal analyseres med henblikk på interferonaktivitet.

Overfør 100 fil av innholdet i hver brønn i den første kolonnen horisontalt til hver brønn i den andre kolonnen.

Fortsett å overføre 100 fil av innholdet i en brønn fra kolonne til etterfølgende kolonne inntil et totale på 10 overføringer har blitt foretatt med avslutning i kolonne 11.

Etter 24 timers inkubasjon, behandle alle brønner, unntatt cellekontroller, med 50 fil encefalomyokarditisvirus ved en infeksjonsmultiplisitet som resulterer i 100 % cytopatisk effekt i løpet av 24 timer etter infeksjon.

Tildekk skåler med lokk og inkuber ved 37°C i 24 timer.

Hell av væske fra alle brønner og foreta farging i 5-15 minutter med 0,5 % krystallfiolett.

Levedyktighet for celler bestemmes ved observasjon av fargede celler.

Titer av en prøve er det resiproke for fortynningen hvor 50 % levedyktige celler er tilbake.

2. Beregning

Aktiviteten for alle prøver normaliseres ved hjelp av referanseenheter-omdannelsesfaktoren som beregnet fra:

Aktuell titer for standard interferon _ . , ,

= Referanseenheter omdannelsesfaktor = RUCF

Observert titer

3 Spesifikk aktivitet

Ved anvendelse av A549/EMCV-bioanalysesystemer standardisert med IFN-gamma-referansemateriale tilveiebragt av NIH, er den spesifikke antivirale aktivitet for rekombinant human IFN-gamma (y-IFN, 139aa) omtrent tre ganger høyere enn aktiviteten for det modifiserte rIFN-gamma-molekyl med tre ytterligere aminosyrer (cys-tyr-cys) ved N-terminusen.

4. Stabilitet

Basert igjen på det ovenfor nevnte mål for bioaktivitet (A549/EMCV), fortsetter formulerg og ampulleanbragt rIFN-gamma å være stabilt (intet tap av biologisk aktivitet) tre måneder etter produksjon (lagret ved 4°C).

Antiproliferativ aktivitet for rIFN-gamma sammenlignet med de andre typene av humant interferon

1. Materialer og metoder

rIFN-gamma: Des Cys-Tyr-Cys rekombinant interferon-gamma i form av en oppløsning (20 mM natriumsuccinat, 0,15 M NaCl, pH6). Materialet ble fremstilt ifølge E.colieksemplet ovenfor. Den spesifikke aktiviteten var 2,7 x 10? IU/mg protein.

CTC-rlFN-gamma: Rekombinant interferon-gamma med "Cys-Tyr-Cys "-struktur ved molekylets N-terminus i form av en oppløsning (20 mM natriumsuccinat, 0,15 M NaCl, pH 6). Den spesifikke aktivitet var 1,3 x IO<7> IU/mg protein.

HuIFN-beta: Lyofilisert humant fibroblast-interferon fremstilt

i humant diplioid forhud-fibroblast med en spesifikk aktivitet på over 1 x IO<7> IU/mg protein fremstilt av Toray Ind. Inc. En ampulle inneholder 3 x IO<6> IU HuIFN-beta og 3 mg humant

serumalbumin

HuIFN/alfa: Humant naturlig leukocytt-interferon med spesifikk aktivitet på 4 x 10^ IU/mg protein levert i form av en oppløsning av dr K. Cantell, Central

Public Health Laboratory, Helsinki, Finland Kontroll: Placebo inneholdende 3 mg humant serumalbumin

Kulturmedium: Eagle's minimum vesentlig medium supplert med 10 % varme-inaktiver prekolostrumserium fra

nyfødt kalv ("PNCS") og 2 mM L-glutamin ble benyttet med Hela, KB, HMV-1, FL, og J-lll-celler. Dulbecco's minimum vesentlig medium inneholdende 10 % varme-inaktivert PNCS, 100 /ig/ml kanamycin og 2 mM L-glutamin ble benyttet ved A549-celler. RPMI 1640-medium supplert med varme-inaktivert PNCS og 100 fig/ mi kanamycin ble benyttet med de gjenværende humanceller angitt i tabell 2.

2. Evaluering av antiproliferativ aktivitet

Testcellene suspendert i kulturmediet ble anbragt som kimer i vevskulturplater av plast ved en konsentrasjon på 5 x 10^ celler/0,5 ml/brønn. Forskjellige mengder interferon oppløst i det tilsvarende kulturmedium (0,5 ml) ble deretter tilsatt (dag 0). Dyrking ble utført ved 37 °C i en fuktig atmosfære av 5 % CO2 og 95 % luft. På dag 6 ble kulturmediene fjernet og cellene i suspensjonskultur direkte suspendert i Isoton II (Coulter Electronics Inc.) for celletelling i en Coulter-teller. Cellene som dannet en plate i plastbeholderene ble forbehandlet med 0,05 % trypsin-0,02 % EDTA til preparert enkeltcellesuspensjon i Isoton II (Coulter Electronics Inc.). Anproliferativ aktivitet for interferon ble uttrykt som de antivirale enhetene som skulle til for å frembringe 50 % reduksjon av celle-tallet (IC50, IU/ml) sammenlignet med kontrollkulturen (uten interferon).

Som vist i tabellen varierte antiproliferasjonsaktiviteten til rIFN-gamma betydelig avhengig av de humane celletypene. I dette tilfellet var KATO-III, singlettringcellekarsinoma fra magen, meget sensitivt, idet cellelinjen viste IC50 på 1,2 IU/ml, mens Daudi-celler, Burkitts lymfoma, som er meget sensitivt overfor type II interferon (HuIFN-alfa, UnIFN-beta), var insensitivt overfor type II interferon inkludert rIFN-gamma. Lunge-adenokarsinoma (PC-8, PC-12) var insensitivt overfor alle testede interferontyper. Det anticellulære spektrum mellom rIFN-gamma og CTC-rlFN-gamma var nesten det samme og det var generelt tydelig at den antiproliferative effektivitet til rIFN-gamma var over-legen i forhold til den for CTC-rlFN-gamma. I dette sammenligningstilfellet mellom fire interferoner ble den høyeste effektiviteten oppnådd fra rIFN-gamma med unntakelse for Daudi-celler.

G. Sammenligning av stabilitet mellom r IFN-gamma og CTC-r IFN-gamma i

forskjellige væsker in vitro

1 x 10<6> IU/ampulle av lyofilisert rIFN-gamma fremstilt ifølge E.coli-eksemplet ovenfor og 1 x 10<6> IU/ampulle av lyofilisert rIFN-gamma med en "Cys-Tyr-Cys"-struktur ved N-terminusen, med 10 mg humanserumalbumin, fosfatbuffer og en isotonisk mengde NaCl for hvert interferon, ble rekonsituert med destillert vann og konsentrasjonen ble justert il 4 x 10<4> IU/ml.

In vitro-stabilitet for interferoner ble evaluert ved bestemmelse av den resterende antivirale aktivitet i forskjellige væsker. Inkubasjoner ble initiert ved tilsetning av de ovenfor nevnte interferonoppløsninger i 9 volumer kaninserum, humanserum eller Eagle's MEM som var preinkubert 10 minutter i en vannbadinkubator ved 37°C eller 4°C. Ved 0, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 24, 72 og 144 timer ble en aliquot høstet og blandet med 9 volum-deler i Eagle's MEM. Prøvene ble holdt frosset ved -80°C i en dypfryser inntil analyse av interferontiteren. Interferontiteren ble analysert ved CPE50-reduksjonsmetoden under anvendelse av humane amniotinceller (FL-cellene) angrepet av Sindbis-virus. Resultatene er angitt på fig 3 som prosentmengder av resterende titer mot den ytterligere titer.

De rekombinante gamma-interferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan også produseres i andre systemer slik som andre bakteriestammer, gjær og vevkultursystemer, kfr ref. (6).

Bibliografi

1. Goeddel, D. et al., Nature 287, 411 (1980)

2. Goeddel, D. et al., Nature 290, 20 (1981)

3. Yelverton, E. et al., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981)

4. Gutterman et al., Annals of Int.Med. 93, 399 (1980)

5. Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)

6. Gray, P. et al., Nature 295, 503-508 (1982)

7. Derynck, R. et al., Nucleic Acids Research 10, 3605 (1982) 8. Derynck, R. et al., Interferon Scientific Memoranda,

August 1982, Memo-I-All93/2

9. Derynck, R. et al., "Expression of Human Interferon Gamma in Heterologous Systems" i Experimental Manipulation of

Gene Expression, Academic Press, Inc. (1983) ved 247

10. Goeddel, D. et al., Nature 287, 411-416 (1980)

11. European Patent Application of Goeddel, D. et al., EPO publication No. 0 077 670. 12. W.E. Stewart II in "The Interferon System" Springer Verlag (New York) s. 13-26 (1979). 13. Stewart, "Interferon Systems" 'Ed.; Stewart, s. 13

Springer-Verlag, New York (1979)

14. Laemmli, Nature 227, 680 (1970)

15. Gross, et al., Methods in Enzymology, XI, 238

16. Gluzman, Cell 23, 175 (1981)

17. Alton et al., "Production, Characterization and Biological Effects of Recombinant DNA Derived Human IFN-alpha and IFN-gamma. Analogs", The Biology of the Interferon System, DeMaeyer and Schellekens, Eds., Elselvier Science Publ.

(1983 ) .

18. Berman et al., Science 222, 524 (1983)

19. Simonsen et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2250 (1983)

Claims (17)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant gamma- interferonpolypeptid som har den N-terminale aminosyresekvensen: hvor X er en metioningruppe eller hydrogen og Y er en glutamingruppe, eller når X er hydrogen så er Y enten en glutamin- eller en pyroglutamatgruppe, og Z består av n aminosyrer fra sekvensen: begynnende med GLY 127, hvorved n er 0 eller et helt tall 1-17 når X er en metioningruppe, og n er 0 eller et helt tall 1-16 når X er hydrogen, karakterise r t ved dyrking av en bakterie slik som E. coli eller en pattedyrcellelinje slik som COS-7, som er transformert med en replikerbar ekspressjonsvektor som har evne til å uttrykke nevnte polypeptid.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at X er metionin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

6. Replikerbar ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den i en transformert bakterie, slik som E. coli eller en pattedyrcellelinje slik som cellelinjen COS-7, har evne til å uttrykke et polypeptid som har den N-terminale aminosyresekvensen: hvor X er en metioningruppe eller hydrogen og Y er en glutamingruppe, eller når X er hydrogen så er Y enten en glutamin- eller en pyroglutamatgruppe, og Z består av n aminosyrer fra sekvensen: begynnende med GLY 127, hvorved n er 0 eller et helt tall 1- 17 når X er en metioningruppe, og n er 0 eller et helt tall 1-16 når X er hydrogen.

7. Ekspresjonsvektor ifølge krav 6, karakterisert ved at X er metionin.

8. Ekspresjonsvektor ifølge krav 6, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

9. Ekspresjonsvektor ifølge krav 6, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

10. Ekspresjonsvektor ifølge krav 6, karakterisert ved atZ omfatter sekvensen:

11. Ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 6-10,karakterisert v ed at det kodede polypeptid uttrykkes i en mikroorganisme.

12. Ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 6-10,karakterisert v ed at det kodede polypeptid uttrykkes i en bakterie eller gjær.

13. Ekspresjonsvektor ifølge hvilket som helst av kravene 6-10,karakterisert v ed at ekspresjonen av nevnte polypeptid er uledsaget av dannelsen av evenetuelt tilknyttet signalpeptid.

14. Dobbeltkjedet DNA bestående av en kodende kjede og en komplementær kjede, k a rakterisert ved at den kodende kjeden koder et polypeptid med den N-terminale aminosyresekvensen: hvor X er en metioningruppe eller hydrogen og Y er en glutamingruppe, eller når X er hydrogen så er Y enten en glutamin- eller en pyroglutamatgruppe, og Z består av n aminosyrer fra sekvensen: begynnende med GLY 127, hvorved n er 0 eller et helt tall 1- 17 når X er en metioningruppe, og n er 0 eller et helt tall 1-16 når X er hydrogen.

15. DNA ifølge krav 14, karakterisert ved at Z omfatter og koder for aminosyresekvensen:

16. DNA ifølge krav 14, karakterisert ved atZ omfatter og koder forr aminosyresekvensen:

17. DNA ifølge krav 14, karakterisert ved atZ omfatter og koder for aminosyresekvensen: