FI91884B - Menetelmä yhdistelmägammainterferonin valmistamiseksi, jolla on parannettu stabiilisuus, ja menetelmässä käytetty vektori ja DNA - Google Patents

Description

91884

Menetelmä yhdistelmägammainterferonin valmistamiseksi, jolla on parannettu stabiilisuus, ja menetelmässä käytetty vektori ja DNA.

5 Tämä keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikan alaan ja koskee menetelmää, jossa käytetään hyväksi tällaista tekniikkaa valmistettaessa yhdistelmägammainterfe-roneja, joilla on parannettu stabiilisuus. Keksintö koskee 10 edelleen polypeptidejä koodaavaa DNA:ta ja niitä ilmentävää vektoria.

Julkaisut ja muu materiaali, joita tässä yhteydessä on käytetty valaisemaan keksinnön taustaa ja tietyissä tapauksissa sen käytännön toteutusta koskevien lisäyksityis-15 kohtien antamiseen, on annettu tässä viitteenä ja mukavuuden vuoksi numeroituina seuraavassa tekstissä ja koottuina liitteenä olevaan kirjallisuusluetteloon.

Ihmisen interferonit voidaan luokitella kolmeen ryhmään erilaisen antigeenisyyden ja erilaisten biologis-20 ten ja biokemiallisten ominaisuuksien perusteella. Ensimmäinen ryhmä koostuu leukosyytti-interferoneista, joita normaalisti tuottavat ihmisen veren rakennesolut virusten indusoimina. Näitä interferoneja on tuotettu mikrobien avulla ja niiden on havaittu olevan biologisesti aktiivi-25 siä (1, 2, 3). Niiden biologiset ominaisuudet ovat antaneet virikkeen niiden kliiniselle käytölle virusinfektioiden ja pahanlaatuisten tilojen hoitamiseksi (4).

Toisessa ryhmässä on ihmisen sidekudosinterferoni, jota normaalisti tuottavat fibroblastit virusten indusoi-30 minä, jota on samoin tuotettu mikrobien avulla ja jolla on havaittu olevan monenlaisia biologisia toimintoja (5). Kliiniset kokeet viittaavat myös sen mahdolliseen terapeuttiseen arvoon. Leukosyytti- ja sidekudosinterferoneil-la on hyvin selviä yhtäläisyyksiä biologisissa ominaisuuk-35 sissaan huolimatta siitä tosiasiasta, että homologisuusas- 2 91884 te aminohappotasolla on suhteellisen alhainen. Molemmat interferoniryhmät sisältävät noin 165-166 aminohappoa ja ovat happostabiileja proteiineja.

Ihmisen gammainterferonilla (josta käytetään myös 5 nimityksiä immuuni-interferoni, γ-interferoni, IIF ja IFN-γ) on interferoneille luonteenomaiset virusten vastaiset ja antiproliferatiiviset ominaisuudet, mutta se on, päinvastoin kuin leukosyytti- ja sidekudosinterferonit, labiili pH-arvossa 2. Ennen tuottamista yhdistelmä-DNA-10 tekniikalla gammainterferonia on tuotettu pääasiallisesti imusolujen mitogeenisen induktion tuloksena. Ihmisen gam-mainterferoni on antigeenisesti selvästi erilainen kuin leukosyytti- ja sidekudosinterferonit. Gray, Goeddel ja heidän työtoverinsa raportoivat ensimmäisinä yhdistelmä-15 gammainterferonin ilmentämisestä (6) , jolla interferonilla on osoitettu olevan ihmisen gammainterferonille luonteenomaiset ominaisuudet, so. virusten vastainen ja anti-proliferatiivinen aktiivisuus yhdistyneenä labiilisuuteen pH 2:ssa. Grayn ja Goeddelin E. colissa tuotettu yhdistel-20 mägammainterferoni koostui 146 aminohaposta ja molekyylin N-terminaalinen osa alkoi jaksolla CYS-TYR-CYS-. Derynck et ai. ilmoittivat myöhemmin (7) toisesta gammainterfe-ronista, jolla on sama N-pää ja yksi erilainen aminohappo ja joka polypeptidi ehkä muodostaa alleellisen muunnoksen 25 viitteessä (6) aiemmin kuvatusta. Muut tutkijat ovat kuvanneet vielä muiden yhdistelmägammainterferonien tuotantoa, joissa Goeddelin ja Grayn alkuperäisen julkaisun (6) mukaisista aminohapoista väitetään yhden tai useamman korvautuneen.

30 Alton et ai. (17) kuvaavat esimerkiksi sarjaa IFN- gammoja, joissa yhden aminohapon korvautuminen toisella Grayn et ai. (6) gammainterferonin asemassa 81 johti IFN-gammaan, jossa oli (suhteellisesti laskettuna) jäljellä vain 70 % aktiivisuudesta ja jossa lisäksi tapahtuva tämän 35 IFN-gamman asemissa 1, 2 ja 3 olevan cys-tyr-cys-jakson 3 91884 poistuminen alensi suhteellista aktiivisuutta edelleen, jolloin tuloksena oli IFN-gamma, jonka aktiivisuus oli vain 49 % Grayn et ai. (6) gammainterferonin aktiivisuudesta .

5 On havaittu ongelmallisiksi sellaiset yhdistelmä- gammainterferonit, joiden N-terminaalisessa aminohappojaksossa on kysteiiniryhmiä, siinä mielessä, että niissä esiintyy oligomeroitumista, johon saattaa liittyä yhden tai useamman kysteiiniryhmän sulfhydryyliryhmien osallis-10 tuminen disulfidisiltojen muodostukseen. Se, että ei ole täysin kyetty poistamaan näitä oletettuja disulfidisilto-ja, viittaa siihen, että ongelma saattaa olla monimutkaisempi ja siihen saattaa liittyä myös reaktio kysteiinin sitoutuneen tyrosiiniryhmän funktionaalisen hydroksyyli-15 ryhmän kautta. Nämä yhdistelmäinterferonit ovat osoittautuneet jossain määrin epästabiileiksi eikä niiden käyttökelpoisuus ole, joko tämän epästabiilisuuden tai muun syyn takia, osoittautunut parhaaksi mahdolliseksi.

Tämä keksintö koskee menetelmää yhdistelmägammain-20 terferonien valmistamiseksi, joilla on parannettu stabiilisuus ja aktiivisuus. Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä yhdistelmägammainterferonipolypeptidin valmistamiseksi, jolla on N-päästä lähtien aminohapposekvenssi X-Y-ASP-FRO-TXR-VMr-IXS-GIU-MA-Gm-ASi-IfU-IXS-LYS-TiR-PHE-25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 ASN-ALA-GLY-KIS-SER-ASP-VM^ALA-ASP-ASN-GLY-THR-Lej-mE-LHJ-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 GLY- II£-ra>LYS-ASN-TKP-I^-ai>-GIIf-SER-ASP-AK>LYS-II£-i«T-31 32 33 34 35 36 37 38 2 40 41 42 43 44 45

CiN-SER-GLN-XLB-VAL-SER-HiE-TYR-mE-LYS-LEli-HIE-IYS-ASN-PHE-46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 30 LYS-ASI^ASP-<2if-SER-II£-GIN-IXS-SSl-VAL-<aX»-TOR-ILE-LYS-GUJ-61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 ASP-+ET-ASN-VAL-LYS-IHE-PHE-ASN-SER-ASN-LYS-XÄS-iaS-ARG^ASP-76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ASP-PHE-GULf-LYS-LBU-lHR-ASi-TXR-SBR-VAL-TOR-ASP-LBU-ASN-VAli-91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 3 5 GlN-AHG-LYS-AlA-ILE-HIS-GIIi-LEU-Iir-GtN-VXlr-MEr-AtA-GtiJ-IS.*- 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 SER-fTO-AIA-AIA-LYS-THR-Z 121 122 123 124 125 126 4 91S84 jossa X on metioniiniryhmä tai vety ja Y on glutamiiniryh-mä, tai kun X on vety, Y on joko glutamiini- tai pyroglu-tamaattiryhmä, ja Z koostuu n aminohaposta GLY 127:stä alkavasta sekvenssistä, 5 gly-lys-arg-lys-arg-ser-gln-met-leu- 127 128 129 130 131 132 133 134 135 PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-A1A-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 jolloin n on nolla tai kokonaisluku 1-17, kun X on melo tioniiniryhmä, ja n on nolla tai kokonaisluku 1-16, kun X on vety.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Keksintö koskee myös vastaavia kloonattuja geenejä 15 ja niitä sisältäviä ilmentämisvektoreita. Keksinnön mukaiset edulliset yhdistelmäinterferonit näyttävät (verrattuina kirjallisuudessa aiemmin esitettyihin) tarkemmin jäljittelevän luontaisen gammainterfeonin todellista aminohappo jaksoa, joka on nyt puhdistettu ja karakterisoitu 20 täydellisesti. Tämän keksinnön edullisilla suoritusmuodoilla on paljon parempi stabiilisuus ja aktiivisuus kuin kirjallisuudessa aiemmin esitetyillä yhdistelmägammainter-feroneilla.

Tapa, jolla tämä ja muut keksinnön päämäärät saavu-25 tetaan, käy ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta sekä liitteenä olevista piirroksista, joissa:

Kuvio 1 valaisee tämän keksinnön mukaisen yhdistel-mägammainterferonin aminohappoja 1-143 ja tätä aminohappo-jaksoa edeltävää signaalijaksoa koodaavaa DNA-jaksoa, jota 30 reunustavat 5'- ja 3'-DNA-jaksot, joita ei lueta.

Kuvio 2 on kaaviokuva plasmidista, joka koodaa tämän keksinnön mukaisesti valmistetun yhdistelmägammainter-feronin suoraa synteesiä E. colissa sekä tämän plasmidin valmistuksesta.

Il 5 91884

Kuviossa 3 esitetään tulokset, jotka osoittavat tämän keksinnön mukaisesti valmistetun gammainterferonin parannetun stabiilisuuden.

On saatu selville, että luontainen ihmisen gammain-5 terferoni (so. sellainen, joka syntyy indusoitaessa mito-geenisesti ihmisen perifeeriset veren lymfosyytit ja puhdistettaessa sitten tuote) on polypeptidi, josta puuttuu CYS-TYR-CYS- N-pää, joka Grayn et ai. mukaan on yhdistel-mägammainterferonilla, jonka jakso esitetään (6):ssa. Saa-10 dut hyvin puhtaan luontaisen interferonin trypsiinipilkko-mistuotteet sisälsivät jaksoja, joiden aminohappokoostumus yleisesti vastasi Grayn et ai. yhdistelmägammainterferonin (6) N-terminaalista osaa jaksoa CYS-TYR-CYS lukuun ottamatta. Aminohapposekventointi luontaisen gammainterferonin 15 N-päästä alkaen osoittautui tuloksettomaksi, mikä antaa aiheen päätellä, että molekyylin N-päässä oleva alfa-aminohappo oli suojattu. Koska cDNA:n koodaama ensimmäinen aminohappo Grayn et ai. (6) interferonin toisen kysteiinin jälkeen oli GLN (glutamiini), otaksuttiin, että GLN-ryhmän 20 syklisoitumisessa oli muodostunut pyroglutamaattiryhmä, niin että N-pää oli suojattuna. Poistettaessa pyrogluta-maatti pyroglutamaattiaminopeptidaasilla jäi jäljelle vapaa alfa-aminoryhmä liittyneenä ASP:hen, seuraavaksi koodattuun aminohappoon ja sekventointi pääsi jatkumaan, mikä 25 teki mahdolliseksi ensimmäisen raportoidun ihmisen luontaisen gammainterferonin karakterisoinnin.

CYS-TYR-CYS-jakson sisältävää ihmisen yhdistelmägammainterf eronia koodaavan cDNA:n asianmukainen muuntaminen teki mahdolliseksi ilmentää suoraan E. colissa uutta 30 yhdistelmägammainterferonia, jota vastasi cDNA, joka koo- daa proteiinia, jonka täysi jakso on annettu edellä (X on MET ja Y on GLN). N-terminaalinen metioniini on tuote, jota koodaa mRNA:n luennan aloitussignaali AUG ja jota esimerkkinä esitetyn E. coli -ilmentämisen ollessa kysees-35 sä isäntäorganismi ei poista. Muissa mikrobisysteemeissä, • · 6 91884 esimerkiksi Pseudomonas-lajeissa, saattaa metioniini poistua; se ei missään tapauksessa näytä tarpeelliselta aktiivisuuden kannalta. Metioniinin puuttuessa ja käytettävästä organismista riippuen voi GLN-ryhmä syklisoitua pyroglyta-5 maattimuotoon aktiivisuuden tästäkään uskoaksemme heikentymättä .

On havaittu, että Grayn et ai. aiemmin kuvaamien CYS-TYR-CYS-jakson sisältävien yhdistelmägammainterfero-nien stabiilisuutta paransi formulointi ihmisen seerumial-10 bumiinin kanssa. Seerumialbumiinin läsnäolo lopullisessa kylmäkuivatussa tuotteessa vaatii kuitenkin sen, että tehdään tiettyjä laaduntarkkailutoimenpiteitä kylmäkuivauksen aikana eikä vasta lopputuotteelle. Keksinnön mukaisesti valmistetun uuden yhdistelmägammainterferonin ollessa ky-15 seessä on kylmäkuivatussa muodossa oleva materiaali sen sijaan osoittautunut riittävän stabiiliksi ilman seeru-mialbumiiniakin. Haluttaessa voidaan tässä kuvatut gam-mainterferonit kuitenkin formuloida farmaseuttisesti hyväksyttävien määrien kanssa ihmisen seerumialbumiinia.

20 Edellä esitetyn lisäksi osoittautuvat keksinnön mu kaisesti valmistetut ihmisen yhdistelmägammainterferonit sytopaattisen vaikutuksen estoa testattaessa merkittävästi aktiivisemmiksi virusten vastaisina aineina kuin niiden kanssa analogiset, CYS-TYR-CYS-jakson sisältävät prote-25 iinit. Aktiivisuus mitataan tavanomaisesti mikrotiitteri-levyillä tutkimalla, miten interferoni estää aivo-sydänli-hastulehduksen aiheuttavan viruksen sytopaattista vaikutusta (CPE) ihmisen keuhkosyöpäsoluihin A549. Katso (12).

Keksinnön mukaisesti valmisteltaviin yhdistelmägam-30 mainterferoneihin kuuluvat kaikki ne, jotka sisältävät edellä annetun täyden jakson aminohapot l - 126. Gammain-terferoneilla, joita typistetään vaihtelevasti karboksyy-lipäästä täyteen jaksoon nähden, on edelleen ihmisen gam-mainterferonille luonteenomaiset ominaisuudet, vaikkakin 35 aktiivisuus on alempi joissakin tapauksissa, kunhan amino- 11 7 91884 hapot 1 - 126 ovat läsnä. Itse asiassa kokeet, joita tehtiin analogisella, viitteessä (7) kuvatulla CYS-TYR-CYS-jakson sisältävällä interferonilla, osoittivat, että aminohapon 132 (tällä järjestelmällä numeroituna) jälkeinen 5 aminohappojakso voidaan korvata ulkopuolisilla jaksoilla aktiivisuutta menettämättä. Katso esimerkiksi (8). Saadut alustavat todisteet tukevat sitä hypoteesiä, että vaikka aminohapot 1 - 126 (THR) ovat suhteellisen tiukasti sitoutuneina kolmiulotteiseksi rakenteeksi, joka yhdistetään 10 aktiivisuuteen, ovat täyden jakson muut aminohapot sen sijaan löyhemmin sitoutuneita ja suhteellisen alttiita proteolyysille. Rajoittavissa olosuhteissa tehtävä tryp-siinipilkkominen poistaa erilaisia osia aminohapon 126 jälkeen olevasta jaksosta, muttei tämän aminohapon edeltä.

15 Saatuihin luontaisiin gammainterferonilajeihin kuuluu molekyylejä, jotka vaihtelevasti jatkuvat aminohappojen 127, 128, 129, 130, 132 ja 134 yli. On havaittu täysin aktiivisia yhdistelmägammainterferoneja, joiden metioniinia seuraava aminohappojakso koostui vaihtelevasti (MET:n jäl-20 keen) aminohapoista 1 - noin 139 ja 1 - noin 131, joista jälkimmäinen saadaan pilkkomalla rajoitetusti yhdistelmä-gammai interferonia trypsiinillä ja varmistamalla jakso sen jälkeen. Samanlaisissa trypsiinipilkkomisella saaduissa fragmenteissa, jotka päättyivät vaihtelevasti aminohap-25 poihin 128 ja 129 (MET:n jälkeen), säilyi aktiivisuus, vaikkakin merkittävästi alentuneena. Toisaalta materiaalin, jossa oli 125 aminohappoa (N-terminaalisen metionii-nin lisäksi) ja josta asemassa 126 oleva ja sitä seuraavat aminohapot oli poistettu, aktiivisuus oli alle 1 % pilkko-30 mattoman materiaalin aktiivisuudesta CPE:n estokokeessa.

Yhdistelmägammainterferoni näyttää sen lisäksi, että siinä on alkumetioniini kun sitä tuotetaan isännissä, joissa metioniini ei lohkea solun sisäisesti, koostuvan päälajista, jossa on 139 aminohappoa (kuvion 1 mukaisella 35 järjestelmällä numeroituna) ja sivulajista, jossa on 143 91884 δ aminohappoa. Näiden kahden lajin muodostama koostumus sisältää yli noin 95, edullisesti yli noin 97 % 139 aminohappoa sisältävää lajia. Rajoittavissa olosuhteissa tehtävä trypsiinipilkkominen poistaa tässäkin tapauksessa eri-5 laisia osia jaksosta, joka on aminohapon noin 126 jälkeen. Tällaisen trypsiinipilkkomisen jälkeen sisältävät saadut yhdistelmäinterferonit lajeja, jotka ulottuvat vaihtelevasti yli aminohappojen 125 (126 alkumetioniini mukaan luettuna), 129, 131 ja 134. Näissä lajeissa on aktiivisuus 10 säilynyt, vaikkakin oleellisesti alentuneena, pituuden ollessa noin 125 - noin 129 aminohappoa. Lajit, joissa on vähintään noin 129 aminohappoa, erityisesti vähintään noin 131 aminohappoa, so. lajit, joissa on noin 129-143 aminohappoa, ovat toiminnaltaan käytännöllisesti katsoen täysin 15 aktiivisia.

Edellä esitetyn valossa on ilmeistä, että keksintö ei sisällä vain edellä esitetyn täyden jakson sisältäviä yhdistelmägammainterferoneja, vaan myös sellaisia interferoneja tai erilaisten interferonien seoksia, joista puut-20 tuu aminohappo 143 tai aminohappo jakso Z->143, jolloin Z on aminohappo 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 tai 142. Samoin on selvää, etteivät tämän keksinnön mukaisesti valmistettaviin, yhdistelmägammainterferoneja koodaaviin kaksisäikeisiin DNA-25 jaksoihin sisälly vain edellä esitettyä täyttä jaksoa koo- daavat DNA-jaksot, vaan myös jaksot, jotka koodaavat juuri esitettyjä karboksyylipäästä typistettyjä jaksoja, jolloin kunkin erilaisen typisteen ollessa kyseessä seuraava(t) kodonit(t) koodaa(vat) luennan lopetussignaalia (-signaa-30 leja).

Ilmaisu "yhdistelmagammainterferoni" tarkoitetaan tässä polypeptidiä (joko glykosyloimattomana tai solun, jossa sitä tuotetaan, glykosyloimana), joka ilmentyy transformoidussa solussa yhdistelmä-DNA-tekniikalla val-35 mistetun replikoituvan ilmentämisvektorin vaikutuksesta ja • · 9 91884 jolla on pienempi tai suurempi ihmisen luontaiselle gam-mainterferonille luonteenomainen virusten vastainen ja antiproliferatiivinen vaikutus ihmisissä ja labiilisuus pH-arvossa 2.

5 Tässä kuvattujen yhdistelmägammainterferonien usko taan muodostavan "dimeerejä", joka määritellään tähän tarkoitukseen kahden tällaisen polypeptidin, joista kumpikin sisältää vähintään aminohapot 1 - 126 (polypeptidit voivat sisältää saman tai erilaisen määrän aminohappoja), yhdis-10 telmäksi. Tämän kemiallisen liittymismekanismin luonnetta ei täysin tunneta, mutta sen uskotaan olevan muu kuin ko-valenttinen sitoutuminen. Tämä liittyminen dimeereiksi näyttää tapahtuvan spontaanisti ja sen uskotaan olevan väistämätön tässä kuvatuissa järjestelmissä. Kun tämän 15 keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdistelmägammainterfe- roneja annetaan, ovat ne näin ollen tavallisesti dimeroi-tuneessa muodossa.

Lisäksi on selvää, että tässä samoin kuin kirjallisuudessa, joka koskee erilaisiksi karakterisoituja yhdis-20 telmägammainterferoneja (8, 9), kuvatuissa yhdistelmägam- mainterferoneissa ovat aminohappojen korvautumiset tai lisäykset, erityisesti yhden aminohapon korvautumiset ja aminohapporyhmien lisäykset tai korvautumiset aminohapon noin 126 edellä tai jäljessä tai C-päässä, mahdollisia 25 interferonin aktiivisuuden häviämättä. Uskotaan, että alan asiantuntijoille tällaisten korvausten ja lisäysten tekeminen on selvää.

Puhdistetuille yhdistelmägammainterferoneille on luonteenomaista se, että ne ovat suurin piirtein vapaita 30 muista ihmisestä peräisin olevista proteiineista ja ne tulee siten erottaa tähän asti saatavilla olleista luontaista ihmisen gammainterferonia sisältävistä koostumuksista.

Tässä kuvataan myös yhdistelmägammainterferonikoos-35 tumuksia, jotka (ennen formulointia) ovat yli noin • · 10 91884 95-%:isesti, edullisesti yli noin 98-%:isesti puhtaita, mistä syystä nämä koostumukset ovat samoin erilaisia kuin tähän asti saatavissa olleet luontaiset gammainterferonit.

Ne tämän keksinnön suoritusmuodot, joissa N-ter-5 minaalinen aminohapporyhmä on metionyyli, ovat samoin erilaisia kuin ihmiselimistössä tuotetut gammainterferonit ja samasta syystä, CYS-TYR-CYS-jakson puuttumisen lisäksi, ne eroavat myös interferoneista, joiden jaksoa ovat kuvanneet Gray et ai. (6).

10 Replikoituvat ilmentämisvektorit, joihin tässä vii tataan, ovat kaksisäikeisiä DNA-ketjuja, edullisesti plas-mideja, jotka sisältävät replikoitumisen aloituskohdan, promoottorin tai promoottorioperaattorin, ribosomin sitou-tumis kohtaa koodaavan jakson, kodonin luennan aloitussig-15 naalia varten ja sen kanssa oikeassa luentajaksossa mielenkiinnon kohteena olevaa yhdistelmägammainterferonia koodaavan geenin, jota seuraa yksi tai useampia kodoneja luennan lopetusta varten. Nykyisessä vaiheessa alan asiantuntijat hallitsevat yhdistelmä-DNA-tekniikan yleiset me-20 netelmät ja sanaston; joka tapauksessa viittaamme viitteeseen (11) taustatietojen saamiseksi tälle keksinnölle.

Esimerkki A. Kloonaus

Gammainterferoni-cDNA-jaksoja sisältävät yhdistel-25 mäDNA-kloonit valmistettiin viitteessä (6) kuvatulla tavalla ihmisen indusoiduista perifeerisistä veren lymfosyyteistä saadun lähetti-RNA:n avulla. Kloonin p67 DNA-jakso esitetään kuviossa 1. 5'-aluetta, jolle ei ole tehty luentaa, seuraa 69 nukleotidia, jotka koodaavat 23 aminohapon 30 esi- eli signaalijaksoa, 429 nukleotidia, jotka koodaavat valmista 143 aminohapon interferonipolypeptidiä sekä 587 nukleotidin pituinen 3'-jakso, jolle ei ole tehty luentaa.

♦ ·

II

11 91884 B. Ilmentäminen 1. E. coli -esimerkki

Suurten yhdistelmä-IFN-Ύ-määrien ilmentämiseksi E. colissa tulee proteiinisynteesin aloituksen tapahtua ATG-5 kodonista, joka on heti valmiin polypeptidin glutamiiniko-donin (aminohappo 1) edellä, mieluummin kuin signaalipep-tidin ATGrsta (aminohappo SI) (kuvio 1). Menettely, jolla p67:een sijoitettu cDNA ilmennetään suoraan E. colissa, esitetään kuviossa 2. Lähestymistapa oli samanlainen kuin 10 se, mitä käytettiin ilmennettäessä E. colissa Grayn et ai. plasmidiin sijoitettua cDNAtta (6).

Oletetun valmiin koodausjakson kodonissa 2 sijaitsevaa Avall-restriktiokohtaa käytettiin signaalipeptidiä koodaavan alueen poistamiseen. Suunniteltiin kaksi syn-15 teettistä deoksioligonukleotidia, jotka säilyttävät aminohappoja 1 ja 2 vastaavat kodonit, sisältävät luennan aloi-tuskodonin ATG ja muodostavat tarttuvan XBal-pään. Nämä kaksi oligomeeriä liitettiin loppuosaan sijoitettavasta cDNArsta, jolloin saatiin 1 063 emäsparin synteettisluon-20 nollinen hybridigeeni, joka koodaa 144 aminohapon polypep-tidiä ja jota rajoittavat XBal-kohta ja Pstl-kohta. Tämä geeni sijoitettiin plasmidiin pLelF A25 (10) XBal- ja

Pstl-kohtien väliin, jolloin saatiin ilmentämisplasmidi ΡΎ -CYV5. E. coli -kanta W3110 (F-, γ -, protrooppinen) 25 (ATCC nro 27325) transformoitiin tällä plasmidilla, jol loin saatiin isäntä-vektori-yhdistelmä E. coli W#10/py-CYC5.

2. Soluvilielmäesimerkki

Sekä signaalipeptidiä että gammainterferonia koo-30 daavan geenin (kuvio 1) ilmentäminen tehtiin COS-7-soluis-sa (16) radionuklidileimatun kysteiinin ja metioniinin läsnä ollessa, jolla tavalla varmistettiin se, että geenin vaikutuksesta syntyy valmista gammainterferonia, jonka N-terminaaliset aminohapot ovat kuviossa 1 esitetyt (toisin 35 kuin E. colissa tehtävän ilmentämisen ollessa kyseessä, 12 91 884 puuttuu tässä esitetyn kaltaisten nisäkässolujärjestelmien ilmentämistuotteesta N-terminaalinen metioniini).

60 non:n petrimaljoissa olevat COS-7-soluista koostuvat yhtenäiset yksisolukerrokset transfektoitiin (kaksi 5 rinnakkaismaljaa) DNA:11a käyttämällä muunnettua DEAE- dekstraani-menettelyä. Kolmen vuorokauden kuluttua DNA:n lisäämisestä alusta poistettiin. Kullekin maljasarjalle lisättiin 2 ml DMEM:ää, johon oli lisätty 100 uCi 35C-me-tioniinia tai 35S-kvsteiiniä. Kun oli inkuboitu 16 tuntia 10 radionuklidileimatun aminohapon läsnä ollessa, alusta poistettiin ja 500 μΐ immuunisaostettiin käyttämällä anti-gammainterferonimonoklonaalista vasta-ainetta tai anti-HBsAg-monoklonaalista vasta-ainetta ensimmäisenä vasta-aineena ja kaniinin anti(hiiren IgG)-vasta-ainetta (Cappel 15 Inc.) toisena vastaaineena. Reaktiota vasta-aineen kanssa ja sen jälkeen seuraavaa sitomista Staphylococcus A -soluihin (Calbiochem) kuvaavat Berman, P. et ai. (18). Näytteet suspendoitiin takaisin SDS-merkaptoetanoliin ja niille tehtiin elektroforeesi 10-%:isella SDS-PAGE-geelillä.

20 Geeli kiinnitettiin 7-%:isessa etikkahapon etanoliliuok-sessa, upotettiin fluoresoivaa ainetta sisältävään liuokseen (Enhance, New England Nuclear), kuivattiin ja säteilytettiin kaksi viikkoa käyttäen Kodak AR5 -filmiä ja ku-vanvahvistuslevyä (Dupont).

25 Tässä tutkimuksessa käytetyt plasmidit olivat pSVg- amma69 (11); pDL Rl (19), hepatiitti B -viruksen pintaan-tigeenin ilmentämisvektori, jolle pSVgamma69 perustui; ja pDL Rlgamma Sau, polysistroninen plasmidi, joka sisältää pSVgamma 69:n (11) 830 bp:n SAU3a-fragmentin, joka ulottuu 30 yli pDL Rl:n EcoRI-kohtaan sijoitetun koko gammainterfero-nia koodaavan jakson. Jälkimmäinen plasmidi tuottaa trans-kriptiotuotetta, joka sisältää sekä gammainterferonia että HBsAG:a koodaavat alueet.

Verrattaessa 35S-kysteiinillä ja 35S-metioniinilla 35 leimattuja proteiineja, jotka reagoivat joko antigammain- 13 91884 terferonin (A) tai anti-HBsAg:n (B) kanssa, havaittiin, että materiaali, joka liikkui joko glykosyloidulla (M = 29 000) tai monoglykosyloidulla (M = 18 000) alueella, ei immuunisaostunut spesifisesti 35S-Cys-leimatuista pDL RI- 5 gamma Sau:lla transfektoiduista soluista käytettäessä an- tigammainterferoni-vasta-ainetta, sitä vastoin 35S-Met-lei-matuilla soluilla esiintyi gammainterferonin immuunisaos-tumista.

C. Tuottaminen fermentoimalla 10 Ihmisen yhdistelmägammainterferonia (rIFN-γ) tuote taan E. coli W31l0/py-CYC5:a käyttäen 10-1 000 litran erissä. Fermentoinnin jälkeen interferonia sisältävät E. coli -solut otetaan talteen liemestä rIFN-Y:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Seuraavassa on kuvaus fermentointi-15 ja solujen talteenottomenetelmistä.

1. Kantavilielmien valmistus ia ylläpito Kantaviljelmä valmistetaan steriileissä, väliseinillä varustetuissa viljelypulloissa, jotka sisältävät 150500 ml steriiliä alustaa, jonka koostumus on seuraava.

20 Baktotryptonia 10 g/1

Hiivauutetta 5 g/1 Natriumkloridia 5-10 mg/1

Alusta siirrostetaan sitten E. coli W3110/py-CYC5-primaa-riviljelmällä. Inokuloitua pulloa inkuboidaan ravistimessa 25 25-37 °C:ssa, kunnes aallonpituudella 550 nm mitattu ab- sorbanssi on noin 1,0. Liemeen lisätään noin 50 tilavuus-% 30 tilavuus-%:ista dimetyylisulfoksidia. Yhden ml:n annokset siirretään välittömästi steriileihin pulloihin ja pul-lut suljetaan. Pulloja säilytetään -60 °C:ssa tai kylmem- 30 mässä. Kukin fermentointi aloitetaan käyttämällä siirroksena replikaattikantaviljelmää.

2. Siirroksen valmistus

Siirros valmistetaan edellä kuvatussa liemessä (L-B-liemi) joko ravistuspulloissa tai pienissä fermentoreis-35 sa. Kun on inkuboitu noin 37 °C:ssa noin kahdeksan tuntia, 14 91884 siirros siirretään fermentoriin. Siirroksen tilavuus on 2-10 % fermentointitilavuudesta.

3. Fermentointi

Yhdiste lmägamma inter f eronia tuotetaan fermentoreis-5 sa, joiden työskentelytilavuus on noin 10-1 000 1. Fer-mentointialustan koostumus on: litrassa ♦Glukoosia 50 - 100 g

Ammoniumsulfaattia 4,0 - 8,0 g 10 Kaliumfosfaattia, yksiemäksistä 3,0 - 5,0 g

Kaliumfosfaattia, kaksiemäksistä 5,0 - 8,0 g

Magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,5 - 5,1 g

Natriumsitraattidihydraattia 0,5 - 2,0 g UCON LB-625:a 0,5 - 2,0 ml 15 Rauta(III)kloridiheksahydraattia 0,005 - 0,15 g

Sinkkisulfaattiheptahydraattia 0,001 - 0,15 g

Kobolttikloridiheksahydraattia 0,001 - 0,005 g

Natriummolybdaattidihydraattia 0,001 - 0,005 g

Kupari(II)sulfaattipentahydraattia 0,001 - 0,005 g 20 Boorihappoa 0,001 - 0,005 g

Mangaanisulfaattimonohydraattia 0,001 - 0,005 g

Vetykloridihappoa 0,0 - 1,0 ml

Tiamiinihydrokloridia 0,0 - 0,1 g

Tetrasykliinihydrokloridia 0,001 - 0,01 g 25 *L-tryptofaania 0,1 - 0,5 g

Hiivauutetta 2,0 - 8,0 g 3-B-indoliakryylihappoa 0,02 - 0,10 g ♦Osa glukoosista ja tryptofaanista lisätään fermentoriin alussa ja loppuosa syötetään fermentoinnin aikana.

30 Alustassa olevat aineosat steriloidaan lämpökäsit telyllä tai suodattamalla ennen käyttöä fermentointiin. Fermentointi tehdään 25 - 40 °C:ssa. Muut toimintaolosuhteet ovat seuraavat:

II

«i 15 91 884

Sekoitus 100 - 1 000 rpm

Ilmastus 0,5 - 1,5 vvm (Täydennetään tarvittaessa hapella) pH 6,5-7,5 (Säädetään lisäämällä ammonium- 5 hydroksidia) 4. Puhdistus a. Yhdistelmäaammainterferonin uuttaminen E. coli -solut suspendoidaan alustaan, joka sisältää suoloja ja asianmukaista puskuria, jonka pH-alue on βίο 9, edullisesti noin 9. Yhdistelmägammainterferoni uutetaan homogenoimalla solususpensio suuripaineisessa kolloidimyl-lyssä, kuten Gaulin-myllyssä. Liuokseen lisätään sellainen määrä polyetyleeni-imiiniä, että saadaan 0,1 - 1 %:inen (paino/tilavuus) liuos. Supernatantti sisältää gammainter-15 feronin.

b. Yhdistelmäaammainterferonin osittainen puhdistus silikapohiaisella adsorbentilla

Kohdassa (a) saatu supernatantti adsorboidaan sili-kapohjäiseen adsorbenttiin, joka pestään asianmukaisilla 20 suolaliuoksilla, joiden pH on 6-9, epäpuhtauksien poista miseksi. Yhdistelmägammainterferoni eluoidaan käyttämällä liuosta, joka sisältää 0,5 - 1,0 mol/1 tetrametyyliam-moniumkloridia. Kaikki toimenpiteet tehdään tässä vaiheessa pH-alueella 7-9.

’ 25 c. Yhdistelmäaammainterferonin osittainen puhdistus anioninvaihtokromatoarafiän avulla

Kohdassa (b) saatu eluaatti dialysoidaan ja adsorboidaan anioninvaihtokromatograflamassaan, joka sitten pestään epäpuhtauksien poistamiseksi. Yhdistelmägammain-30 terferoni eluoidaan kasvavaa suolapitoisuutta käyttäen.

Tyypillisiin, tässä vaiheessa käyttökelpoisiin anionin- vaihtohartseihin kuuluvat karboksimetyyliselluloosa ja sulfoetyyliselluloosa. Kaikki toimenpiteet tehdään pH-alueella 7-9.

16 91884 d. Yhdistelmäqammainterferonin osittainen puhdistus kalsiumfosfaattiqeelikromatoqrafiän avulla

Kohdassa (c) saatu eluaatti adsorboidaan kalsium-fosfaattigeeliin, joka sitten pestään epäpuhtauksien pois-5 tautiseksi. Yhdistelmägammainterferoni eluoidaan lisäämällä suolapitoisuutta gradientissa, jossa fosfaattipitoisuus kasvaa. Kaikki toimenpiteet tehdään tässä vaiheessa pH-alueella 7-9.

e. Yhdistelmäqammainterferonin osittainen puhdistus 10 anioninvaihtokromatoqrafiän avulla

Vaiheessa (d) saatu eluaatti dialysoidaan ja adsorboidaan anioninvaihtokromatograflamassaan, joka pestään sitten epäpuhtauksien poistamiseksi. Yhdistelmägammainter-feroni eluoidaan anioninvaihtomassasta kasvavaa suolapi-15 toisuutta käyttäen. Tyypillisiä anioninvaihtomassoja ovat karboksimetyyliselluloosa ja sulfoetyyliselluloosa. Kaikki toimenpiteet tehdään tässä vaiheessa pH-alueella 7-9.

f. Yhdistelmäqammainterferonin osittainen puhdistus geelipermeaatiokromatoqrafiän avulla 20 Kohdassa (e) saatu eluaatti laitetaan geelille ja kolonni kehitetään suolapitoisella liuoksella. Asianmukaiset gammainterferonia sisältävät fraktiot yhdistetään, jolloin saadaan lääkeaine. Kaikki toimenpiteet tehdään tässä vaiheessa pH-alueella 7-9.

25 g. C-terminaalinen aminohappojakso C-terminaalisen jakson määrittämiseksi näytteet dialysoitiin 70-%:iseen muurahaishappoon, pilkottiin sy-anogeenibromidilla ja saadut peptidit erotettiin Altex Ultrasphere C8 -RP-HPLC-kolonnissa. Piikit kerättiin ja 30 analysoitiin tekemällä aminohappoanalyysi ja sekventointi. Löydettiin yksi C-terminaalinen peptidi: -leu-phe-arg-gly-arg (ryhmät 135-139, kuvio 1). Joissakin tapauksissa havaittiin lisäksi toinen peptidi: -leu-phe-arg-gly-arg-arg-ala-ser-gln (ryhmät 135-143, kuvio 1). Näiden kahden pep-35 tidin suhteen määrittämiseksi, tunnetut määrät (aminohap- • » 17 91884 poanalyysin perusteella) tuotteita laitettiin RP-HPLC-ko-lonniin ja mitattiin vastaavat piikin korkeudet. Kukin kolmesta valmistuserästä sisälsi alle noin 2 % pitkää peptidiä (135-143, kuvio 1), lopun ollessa pentameeriä. Tämä 5 tulos sopii yhteen sen kanssa, että E. coli -tuotannossa syntyy 139 aminohapporyhmää ja vastaavasti 143 aminohappo-ryhmää sisältäviä gammainterferoneita (N-terminaalinen metioniini, joka kussakin tapauksessa on myös läsnä, pois luettuna) suhteessa noin 98,2 %.

10 5. Formulointi

Edellä esitetyllä tavalla tuotettu yhdistelmägamma-interferoni formuloidaan edullisesti parenteraalisesti annettavaksi seuraavan taulukon mukaisesti: Määrä pulloa kohden 15 Aineosa 0,5 mg:n 2,0 itgrn pullo (1) pullo(2)

Ihmisen yhdistelmägammainterferoni 0,5 2,0

Mannitolia 100 80

Meripihkahappodinatriumheksahydraattia 12,4 9,9 20 Glysiiniä 5,6 4,5

Natriumkloridia 4,4 3,5

Polysorbate 20 0,8 0,6

Meripihkahappoa 0,5 0,4 (1) Pulloihin lisätään käyttöä varteh 2,5 ml steriiliä, : 25 ruiskeisiin tarkoitettua vettä.

(2) Pulloihin lisätään käyttöä varten 2,0 ml steriiliä, ruiskeisiin tarkoitettua vettä.

Keksinnön mukaisia interferoneita voidaan käyttää lääketieteellisesti asianmukaisina annostuksina, esimer-30 kiksi 1,0 mg/m2 ruumiin pinta-alaa.

D. Erilaisten aammainterferonien aktiivisuuden määritys trypsiinipilkkomisen jälkeen

Eri gammainterferonien, joiden karboksyylipäät eroavat toisistaan, aktiivisuuden määräämiseksi pilkottiin E.

35 coli -esimerkissä kuvatulla tavalla valmistettua gammain- 18 91884 terferonia trypsiinillä pilkkoutumisasteen vaihdellessa ja näytteet tutkittiin CPE-kokeella A549-soluja käyttäen tässä kuvatulla tavalla.

Yhdistelinägaimnainterferoninäytteestä (r-HuIFN-gam-5 ma) (6,5 mg), joka valmistettiin tässä kuvatulla tavalla, poistettiin suolat pienellä Sephadex G-25-molekyyliseula-kolonnilla (PD-10, Pharmacia); proteiini otettiin 0,10 M ammoniumbikarbonaattipuskuriin (pH 8,5) ja lopullinen proteiinipitoisuus oli 2,1 mg/ml. Laimeaa trypsiiniliuosta 10 (Worthington TPCK -trypsiini, 10 μg/ml 0,001 M Helissä, 16 μΐ) lisättiin 1,9 ml:aan (4,0 mg) r-HuIFN-gamma-liuos-ta, sekoitettiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa (trypsiini : proteiini 1:25 000). Inkubointiseoksesta otettiin näytteet 1, 3,5, 5,75, 8 ja 10,25 tunnin kuluttua. Kahdek-15 san tunnin kuluttua lisättiin vielä 15 μΐ (150 ng) laimeaa trypsiiniliuosta reaktion nopeuttamiseksi viimeiseen näytteeseen (10,25 h).

Kullakin ajankohdalla otettu näyte fraktioitiin komponenteikseen Waters HPLC-järjestelmällä käyttämällä 20 BioRad Biogel HPHT -kolonnia. Kullakin ajankohdalla otettu annos laitettiin bikarbonaattipuskuriin sekoitettuna suoraan (käsin ruiskuttamalla) kolonniin näytteenottohetkel-lä. Kolonni tasapainotettiin 0,01 M natriumfosfaattipusku-rilla, pH 8,0, joka sisälsi 30 μπιοΐ/ΐ kalsiumkloridia ja 25 proteiini eluoitiin kolonnista käyttämällä lineaarista gradienttia tasapainotuspuskuri -» 0,5 M natriumfosfaatti-puskuri, pH 8,0, joka sisältää 0,6 μιηοΐ/ΐ kalsiumkloridia.

Proteiinipiikit, jotka määritettiin absorbanssin (214 ja 280 nm) avulla, kerättiin preparatiivisesti ja 30 säilytettiin peitettyinä 4 °C:ssa analysointiin asti. Valituille piikeille tehdyt tyypilliset analyysit olivat: 1. Virusten vastainen aktiivisuus ihmisen keuhkosyöpä A549/EMC-viruskoejärjestelyssä (13).

2. SDS/PAGE-fraktiointi tavanomaisin menetelmin 35 Laemmlin geelijärjestelmää käyttäen (14).

Il 19 91 884 3. Proteiinipitoisuuden määrittäminen kaupallisella värinsitomismenettelyllä (Pierce Chemical Co., Rockford, IL.).

4. Proteiinin pilkkominen syanogeenibromidilla ja 5 sitä seuraavat HPLC-analyysi peptidien identifioimiseksi (15) .

Proteiininäytteitä (M = 12 000 - 14 000) dialysoi-daan yön yli 70-%:ista muurahaishappoa vastaan, haihdutetaan kuiviin pyöröhaihduttimella ja suspendoidaan takaisin 10 500 μl:aan 70-%:ista muurahaishappoa. Kuhunkin näyttee seen, joka on 12 x 75 mm:n lasiputkessa, lisätään kiinteää syanogeenibromidia, putki suljetaan, sekoitetaan kunnes tapahtuu liukeneminen, peitetään alumiinifoliolla ja inku-boidaan yön yli huoneen lämpötilassa hyvin tuuletetussa 15 paikassa.

Pilkkomisen jälkeen näytteet haihdutetaan kuiviin pyöröhaihduttimella, suspendoidaan takaisin 0,5 ml:aan vettä ja kuivataan uudelleen. Ennen HPLC-fraktiointia näytteet liuotettiin takaisin 50-%:iseen muurahaishappoon 20 proteiinipitoisuudeksi noin 1 mg/ml.

Peptidit fraktioitiin käyttämällä Waters HPLC-jär-jestelmää ja Altex Ultrasphere Octyl -kolonnia ja eluoi-malla lineaarisella gradientilla trifluorietikkahappo/vesi -* trifluorietikkahappo/asetonitriili. Milloin mahdollista ' 25 peptidit identifioitiin aminohappoanalyysin avulla. Taulu kossa 1 annetaan vertailutulokset r-HuIFN-Y:n lyhennetyille muodoille: » · 20 91884

Taulukko 1 r-HuIFN-γ-muoto* C-pää** Ominaisaktiivisuus (%) 139aa:143aa :98:2 (vert.) LFRGR 100 13 laa AAKTGKRKR 4 0-50 5 129aa AAKTGKR 6-9 125aa AAK noin 1 * Perustuu kuvion 1 mukaiseen numerointijärjestelmään, mutta kussakin tapauksessa myös läsnä oleva N-terminaa-linen metioniini jätetään pois.

10 **Tavanomaiset yksikirjainlyhenteet aminohapporyhmille: A = alaniini F = fenyylialaniini G = glysiini K = lysiini 15 L = leusiini R = arginiini T = treoniini

Huomataan, että gammainterferoneja, joiden pituus on mikä tahansa alueella 126aa-143aa (N-terminaalinen me-20 tioniini pois luettuna), ilmentyy asianmukaisesti käsitellyistä geeneistä. Niinpä esimerkiksi kuviossa 1 esitetty geeni sisältää Fnu4H-restriktiokohdan kohdalla 123 124 25 Ala Ala

GdA GCT

CGTl CGA

30 Fnu4H-pilkkomisen jälkeen synteettiset oligonukleotidit, jotka koodaavat mitä tahansa haluttua jaksoa ja joita seuraa "lopeutus"-kodoni ja liittämisosa, joka soveltuu yhteen ilmentämisplasmidissa käytettävissä olevan restrik-tiokohdan kanssa, voidaan liittää gammainterferonigeenin 35 etuosaan. Esimerkiksi jakso ti 21 91884

A GCT AAA ACA TA

-(X)-

CGA TTT TGT ATCTAG

5 jossa X koodaa yhtä tai useampaa aminohappoa, voidaan liittää edellä esitettyyn E. coli -ilmentämisplasmidiin, kun plasmidi on pilkottu Fnu4H:lla ja BglII:lla, jolloin lopetuskodoni, joka seuraa ligaatiosta, on siis 10 stop . .. (X)-TA|GATC. . .

atctagI

Bglll 15 E. Koe; Svtopaattisen vaikutuksen esto fCPEl 1. Koemenettelv

Kuhunkin syvennykseen lisätään 100 μΐ suspensiota, joka sisältää ihmisen keuhkosyöpäsoluja (A549) (ATCC nro CCL 185) Eagles MEM:ssä 4 x 105 solua/ml.

20 Inkuboidaan maljoja 37oC:ssa noin 18 tuntia.

Kun on inkuboitu 18-24 tuntia, kuhunkin ensimmäisen pystyrivin syvennykseen lisätään vielä 80 μΐ alustaa.

Lisätään ensimmäisen pystyrivin yhteen syvennykseen näyte, jonka interferoniaktiivisuus on määrä tutkia.

25 Siirretään 100 μΐ ensimmäisen pystyrivin kunkin sy vennyksen sisältöä vaakasuorasti toisen pystyrivin kuhunkin syvennykseen.

Siirretään edelleen 100 μΐ pystyrivin syvennyksestä seuraavan pystyrivin syvennykseen, kunnes on tehty kaik- 30 kiaan 10 siirtoa ja päästään pystyriviin 11.

Kun on inkuboitu 24 tuntia, tartutetaan kaikki syvennykset soluvertailusyvennyksiä lukuun ottamatta 50 μ1:1ΐΆ enkefalomyokardiittivirusta (aivo-sydänlihastuleh-duksen aiheuttava virus), jonka infektiokerroin on sellai- 35 nen, että tuloksena on 100-%:inen sytopaattinen vaikutus 24 tunnin kuluttua infektoinnista.

22 91884

Peitetään maljat kansilla ja inkuboidaan 37 °C:ssa 24 tuntia.

Kaadetaan neste pois kaikista syvennyksistä ja värjätään 5-15 minuuttia 0,5-%:isella kristallivioletilla.

5 Solujen elinkyky määritetään värjättyjä soluja tarkkailemalla.

Näytteelle annettava luku on käänteisluku laimennuksesta, jossa 50 % soluista on eläviä.

2. Laskeminen 10 Kaikkien näytteiden aktiivisuus normalisoidaan re- ferenssiyksikkömuuntokertoimella (Reference Units Conversion Factor), joka lasketaan kaavasta: standardi-interferonin Referenssl kslk_

15 todellinen luku_ = 1 = RUCF

I¥ ... , . kömuuntokerroin

Havaittu luku 3. Ominaisaktiivisuus Käytettäessä A549/EMCV-biologisia koejärjestelmiä, 20 jotka on standardoitu NIHrsta saadulla IFN-gammavertailu- aineella, on ihmisen yhdistelmä-IFN-gamman virusten vastainen ominaisaktiivisuus suunnilleen kolme kertaa suurempi kuin muunnetun rlFN-gammamolekyylin, jossa on kolme ylimääräistä aminohappoa (cys-tyr-cys) N-päässä, aktiivi-25 suus.

4. Stabiilisuus

Mittaamalla edellä mainittu biologinen aktiivisuus (A549/EMCV) havaitaan, että formuloitu ja pullotettu rlFN-gamma on edelleen stabiilia (ei biologisen aktiivisuuden 30 menetystä) kolmen kuukauden kuluttua tuottamisesta (varas toitu 4 °C:ssa).

F. rlFN-aamman antiproliferatiivinen aktiivisuus verrattuna muihin ihmisen interferonityyppeihin 1. Materiaalit ia menetelmät 35 rlFN-gamma: Yhdistelmägammainterferoni, josta puut tuu jakso Cys-Tyr-Cys, liuosmuodossa (20 mM natriumsuk- 23 91884 kinaatti, joka sisältää 0,15 mol/1 NaCl, pH 6). Materiaali valmistettiin edellä esitetyn E. coli -esimerkin mukaisesti. Ominaisaktiivisuus oli 2,7 x 107 ky/mg proteiinia.

CTC-rIFN-gamma: Yhdistelmägammainterferoni, jossa 5 on jakso "Cys-Tyr-Cys" molekyylin N-päässä, liuosmuodossa (20 mM natriumsukkinaatti, joka sisältää 0,15 mol/1 NaCl, pH 6). Ominaisaktiivisuus oli 1,3 x 107 ky/mg proteiinia.

HuIFN-beta: Ihmisen diploidisessa esinahan fibro-blastissa tuotettu, kylmäkuivattu ihmisen sidekudosinter-10 f eroni, jonka ominaisaktiivisuus on yli 1 x 107 ky/mg proteiinia, valmistaja Toray Ind., Inc. Pakkaus sisältää 3 x 106 ky HuIFN-betaa ja 3 mg ihmisen seerumialbumiinia.

HuIFN-alfa: Ihmisen luonnollinen leukosyytti-interferoni, jonka ominaisaktiivisuus on 4 x 106 ky/mg proteii-15 nia ja jonka toimitti liuosmuodossa Tri K. Cantell, Kan-santerveyslaboratorio, Helsinki, Suomi.

Vertailu: Plasebo, joka sisältää 3 mg ihmisen seerumialbumiinia .

Viljelyalusta: Eagle's Minimum Essential Medium 20 täydennettynä 10 %:lla lämmöllä inaktivoitua vastasyntyneen vasikan prekolostrumiseerumia ("PNCS") ja L-gluta-miinilla (2 mmol/1), käytettiin Hela-, KB-, HMV-1-, FL- ja J-lll-solujen yhteydessä. Dulbecco's Minimum Essential Medium, joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua PNCS, 100 25 ^g/ml kanamysiiniä ja 2mmol/l L-glutamiinia, käytettiin A549-solujen yhteydessä. RPMI 1640 -alusta, joka oli täydennetty lämmöllä inaktivoidulla PNCSrllä ja kanamysiinil-lä (100 Mg/ml), käytettiin muiden taulukossa 2 esitettyjen ihmissolujen yhteydessä.

30 2. Antiproliferatiivisen aktiivisuuden arviointi

Tutkittavat solut suspendoituina viljelyalustaan siirros-tettiin muovisiin soluviljelymaljoihin pitoisuudeksi 5 x 103 solua/0,5 ml/syvennys. Sen jälkeen lisättiin (päivänä 0) erilaisia määriä interferonia vastaavaan viljelyalus-35 taan liuotettuna (0,5 ml). Kasvatus tehtiin 37 °C:ssa kos- 24 9 1 8 8 4 tutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02 ja 95 % ilmaa. Päivänä 6 viljelyalusta poistettiin ja suspensiovil-jelmässä olevat solut suspendoitiin suoraan Isoton II:een (Coulter Electronics Inc.) Coulter-laskurilla tehtävää so-5 lulaskentaa varten. Solut, jotka muodostivat levyn muovi-astioissa, esikäsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 0,05 % trypsiiniä ja 0,02 % EDTA:a, jolloin saatiin yksisolusus-pensio Isoton II:ssa (Coulter Electronics Inc.). Interferonin antiproliferatiivinen aktiivisuus ilmaistiin yksik-10 köinä virusten vastaista ainetta, joka tarvittiin saamaan aikaan 50 %:n solulukumäärän aleneminen (ICS0, ky/ml) ver-tailuviljelmään (ei interferonia) nähden.

Kuten taulukosta ilmenee, rlFN-gamman antiprolife-ratiivinen aktiivisuus vaihteli merkittävästi ihmissolula-15 jista riippuen. Tässä tapauksessa KATO-III, vatsan yksit-täisrengassolusyöpä, oli hyvin herkkä; solulinjan IC50 oli 1,2 ky/ml, kun taas Daudi-solut, Burkittin imukudoskas-va-insolut, jotka olivat hyvin herkkiä tyypin II interferonille (HuIFN-alfa, HuIFN-beta), olivat epäherkkiä tyypin 20 II interferonille rlFN-gamma mukaan luettuna. Keuhkorau-hassyöpäsolut (PC-8, PC12) olivat epäherkkiä kaikille tutkituille interferonilajeille. rlFN-gamman ja CIC-rlFN-gam-man solujen vastainen spektri oli melkein samanlainen ja oli yleensä ottaen ilmeistä, että rlFN-gamman antiprolife-25 ratiivinen teho oli paljon parempi kuin CTC-rIFN-gamman. Verrattaessa neljää interferonia keskenään oli rlFN-gamma tehokkain kaikkien muiden paitsi Daudi-solujen suhteen.

25 9 1 8 8 4 ö

S TT TT

[t, o o o n o o

H I I I I I Η Η ΓΊ tO H H

3 CO X> K Λ Λ Λ Λ (0 ! - “ Τ\ El Ζ τΤ ro τί vsoor^oo JO !dm | I I I I «ϋ* γη n n h h

H H 3 ^ H H

P w *3 Λ Λ Λ Q) > s >r c u i.

•H h g rt -h h n /IV M ** ro ro ro rl t Hoooooooino ir> o

L? Cj nHHHnn^H "3· H

Jr ^ n iH n " tj Λ Λ Λ Λ Λ

G

ο ρ >~ ™ Q) I * m m m γ*ϊ

4_l g ΗΓ'ΟΟΟίΝ^'ΟΟίη COO

j_l a ΠιΗΗΗΓΜίηηΟ OrH

Q) Η Ή .μ p Λ Λ Λ Λ

C •H

I :rö pj ιο h :<o a N 3 <a a ~ =o n 3 :0 :f0 >i 9 10 G :(Ö >t :(Ö :f0 tn S -h o) a w a p tn ΐ > -r-ι :0 tn :0 Cl) (0 ^ ·η 3 >1 to >1 ax: ~ -h h tn x: tn 33 d -p o tn 3 tn to

LO :(Ö (0 (0 (0 HP

^ as a Λ Ρ Λ <0

• :0 3 3 -P

C >i :(0 (0 -P (0 (03 a> .p w a p 3 p -pc G 3 3 :0 C tn 3

•H .p H >i +J 3 -P -H 4J

> O tn 3 -P 3 (0 3 W

•h -h tn tn c tn c g -P -h •h (0 01(03 -h 3 O (0(0

-P +J (0 ,C -P (0 -Ρ O (OH

(0 tr> 3 tn h tn c rH-H

P -H G (0 *H ·Η ·Ρ (0 CP

0) a <DP(0P(C:(0 Ή 30) *p ap rHtDrna o» x:

•H >1 tn C -H -H :0 E 3 -H

H >1 -H Q) p -H P >1 :(0 a -P

0 .p :(octi)4J(Dtnac tn

P -p -H tn :0 QJ -HO

a C -P3C0CC>iC QJ Λί

•H QJ -H H -H X ·Η (0 tn -H '— *H

-p c mo>-H>H3P o) C -H ^|3>iQJ>i3rH+J(0 o x: »o tr >itnxix;x;(0Q)OE > O X -H O O H c

C r-i:<0CCCCCCCCO (OO

·· OP(0(0(0(0(03l(0C XX

+jQ)inintntntnT!:(0rH(0 -h ,c 1 ina-p-p-p-p-PxscaiM 013 a -h 3 (0(0(0(0(000) g oi cu ω s κ*>>>>>«ζ<2 > a

H

P

H

H

H 00 tf) 'S' a 1 h c\ tj· hi 3 o 1 1 1 I (0 1 H co h e-< z z z z h g a 1

O rt5Z««ZQ)CQSW XI O

co «SEEszatcco aa 26 91 884 'o r~ *o

Hill I H

Λ Λ "b ^

Hl I 1^10

fM

Λ ί-»-ϊ m

O O O

HI I | H H CO

Λ Λ Λ m r<i m m o in in in o o in

h in H H (M

Λ Λ Λ

:itJ

α :0 >1 ω ρ Η Ο ω •Η

C

α) •Η :ι0 a α :0 C :η3 >ι 0) £Χ :<C 10 C (0 (0 (0 :ο α ρ -η ε e ·η >, :0 H +J o o e ω >, ο to ο ο φ to m ω <0 u-i <w χ ns ιο ρ h g g 3 χ; η ε α >, >ι φ 3 3 Ο (0 Η Η Η to χ 3 e -η ^ χ <η ro c c -ρ ί0 *Η ·Η -Ρ Ρ C ^ C C Ρ 4-> >ι Ρ Ο Ο Ο Ο 4-> ·Ρ >ι ,* ,* χ ^ -η ·η m Ρ Λ Λ Λ Λ X X ο

(0 3 3 3 3 Ρ Ρ C

•η ΦΦΦΦ330

. « « « « OQ 0Q S

CM

O

X (¾ * 5

Ρ (N Ή ·Η H

ι-Ί ΗσιΙΟΟΌΦΗ Ρ ι "sr ιη σ> 3 S η <0 U m ο ο (0 Φ ι ρ λ < α α α s ^ 27 91884 G. rlFN-qamman ia CTC-rIFN-qamman stabiilisuuden vertailu erilaisissa nesteissä in vitro 1 x 106 ky/pullo kylmäkuivattua, edellä esitetyn E. coli -esimerkin mukaisesti valmistettua, rlFN-gammaa ja 1 x 106 ky/pullo kylmä-5 kuivattua rlFN-gammaa, jossa oli jakso "Cys-Tyr-Cys" N-päässä, 10 mg ihmisen seerumialbumiinia, fosfaattipuskuria ja isotoninen määrä NaCl kutakin interferonia varten sekoitettiin tislattuun veteen ja pitoisuus säädettiin 4 x 104 ky/ml:ksi.

10 Interferonien stabiilisuus in vitro arvioitiin mää rittämällä virusten vastainen jäännösaktiivisuus erilaisissa nesteissä. Inkuboinnit aloitettiin lisäämällä edellä mainittuja interferoniliuoksia yhdeksänkertaiseen tilavuuteen kaniinin seerumia, ihmisen seerumia tai Eagle's MEM, 15 joita esi-inkuboitiin 10 minuuttia vesihauteessa 37 °C:ssa tai 4 °C:ssa. Ajankohtina 0, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 24, 72 ja 144 tuntia otettiin näytteistä annos ja sekoitettiin se yhdeksänkertaiseen tilavuuteen Eagle's MEM. Näytteet pidettiin pakastettuina -80 °C:ssa interferonimäärän tutki-20 miseen asti. Interferonimäärä tutkittiin CPE50-alenemis-menetelmällä käyttäen ihmisen vesikalvosoluja (FL-solu), joihin oli tartutettu Sindbis-virus. Tulokset annetaan kuviossa 2 jäännösaktiivisuuden prosenttiosuutena lisätystä aktiivisuudesta.

25 Vaikka keksintöä on tässä kuvattu edullisten suori tusmuotojen avulla, joissa ilmentäminen tehdään E. coli ja COS-7-soluissa, on selvää, että keksinnön mukaisia yhdis-telmägammainterferoneja voidaan tuottaa muissa systeemeissä samoin kuin muissa bakteerikannoissa ja soluviljelmis-30 sä, joiden suhteen viittaamme aiheeseen liittyvään ja julkaisuun (6) .

28 91884

Kirjallisuus: 1. Goeddel, D. et al., Nature 287 (1980) 411 2. Goeddel, D. et al., Nature 290 (1981) 20 3. Yelverton, E. et al., Nucleic Acids Research 8 (1981) 5 731 4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93 (1980) 399 5. Goeddel, D. , et al., Nucleic Acids Research 8 (1980) 4057 6. Gray, P. et al., Nature 295 (1982) 503-508 10 7. Derynck, R. et al., Nucleic Acids Research 10 (1982) 3605 8. Derynck, R. et al., Interferon Scientific Memoranda, elokuu 1982, Memo-I-A1193/2.

9. Derynck, R. et al., "Expression of Human Interferon 15 Gamma in Heterologous Systems" teoksessa Experimental Ma nipulation of Gene Expression, Academic Press, Inc., 1983, s. 247 10. Goeddel, D. et al., Nature 287 (1980) 411-416 11. Goeddel, D. et al., EP-hakemusjulkaisu 0 077 670 20 12. Stewart, W.E., II teoksessa "The Interferon System",

Springer Verlag (New York), 1979, s. 13-26 13. Stewart, "Interferon Systems", toim. Stewart, Springer Verlag, New York, 1979, s. 13 14. Laemmli, Nature 227 (1970) 227 25 15. Gross, et al., Methods in Enzymology XI 238 16. Gluzman, Cell 23 (1981) 175 17. Alton et al., "Production, Characterization and Biological Effects of Recombinant DNA Derived Human IFN-alpha and IFN-gamma Analogs", The Biology of the Interferon Sys- 30 tern, toim. DeMaeyer ja Schellekens, Elsevier Science Pubi., 1983 18. Berman et al., Science 222 (1983) 524 19. Simonson et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 2250

Claims (13)

1. 91884
2. 1. Menetelmä yhdistelmägammainterferonipolypeptidin valmistamiseksi, jolla on N-päästä lähtien aminohapposek-5 venssi X-Y-ASP-PRO-TXR-VT^L-ISS-CaU-AIA-Ga^-ASN-LEU-iaS-LyS-TiR-PHE-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 A^AIA-CUf-HIS-SER-ASP-VAL-AIA-ASP-ASN-GLY-THR-LEU-PHE-IEU-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 GLY-IIE-I£lJ-LYS-ASH-lKP-iaS-<3iJ-GlU-SER-ASP-ARG-lSS-IIE-MET-31 32 33 34 35 36 37 38 3 40 41 42 43 44 45 10 GtM-SER-GUJ-IIE-Vilr-SER-PHE-TSiR-PHE-LYS-LBLf-FHE-IYS-ASN-EHE-46 47 48 49 50 51 52535455565758 59 60 LYS-*SP-ASP-GLN-SER-ILE-GLN-I.YS-SER-VAI/-GUJ-THR-II£-LYS-GUi-61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 ASP-MEr-ASN-VAL-LYS-PHE-raE-ASN-SER-ASf-LYS-LYS-IYS-ARG-ASP-76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
3. 15 ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER-ViiL-TOR-ASP-LEJ-ASN-VAL- 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 GLN-AR3-LYS-AIA-ILE-HIS-Gm-lfU-XLi:-GLN-VMr-fET-AtA-'3LU-I.Elc-106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 SER-fTO-ALA-AIA-LYS-THR-Z 121 122 123 124 125 126 20 jossa X on metioniiniryhmä tai vety ja Y on glutamiiniryh-mä, tai kun X on vety, Y on joko glutamiini- tai pyroglu-tamaattiryhmä, ja Z koostuu n aminohaposta GLY 127:stä alkavasta sekvenssistä
4. 2. GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU- 127 128 129 130 131 132 133 134 135 PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 * jolloin n on nolla tai kokonaisluku 1-17, kun X on me-30 tioniiniryhmä, ja n on nolla tai kokonaisluku 1-16, kun X on vety, tunnettu siitä, että viljellään bakteeria, kuten E. colia tai nisäkkään solulinjaa, kuten COS-7 -solulinjaa, joka on transformoitu replikoituvalla ilmentämisvektorilla, joka pystyy ilmentämään mainitun 35 polypeptidin. 91884
5. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on metioniini.
6. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Z sisältää sekvenssin
7. 5 GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137. 138 139
8. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Z sisältää sekvenssin GLY-LYS-ARG 127 128 129 10
9. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Z sisältää sekvenssin GLY-LYS-ARG-LYS-ARG 127 128 129 130 131
10. 6. Replikoituva ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että sillä on kyky transformoidussa bakteerissa, kuten E. colissa tai nisäkkään solulinjassa, kuten COS-7 -solulinjassa ilmentää polypeptidin, jolla on N-päästä luettuna aminohapposekvenssi 2 o X-Y-ASP-PFD-TYR-VAL-LYS-GLU-AtA-GLU-ASN-LEO-LYS-LYS-TYR-PHE-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 AS4-AIA-GLY -HLS-SER-ASP-VAIr-ALA-ASP-ASN-GLY-TBR-LSLKfHE-LEU-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 GLY-II£-LEIJ-LYS-ASN-TRP-IYS-GUM3Xf-SER-ASP“ARG-I2S-IIE-MCT-31 32 33 34 35 36 37 38 3 40 41 42 43 44 45 * 2 5 gln-ser-gln-he-val-ser-phe-tyr-phe-lys-lblj-phe-lxs-asn-phe- 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 LYS-ASP“ASP-GU4-SSS-HjE-GU4-LYS-SER-VAI/-GUD-THR-HE-LYS-GrU-61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 ASP-MEr-ASN-VAL-L,YS“FHE-FHE-ASN-S3R-ASN-LYS-I2S-I2S-ARG-ASP-76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ASP-PHE-GUJ-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER-V^L-TOR-ASP-LBO-ASN-VAL-.3 0 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 GLN-ARG-LYS-AIA-ILE-HIS-GUJ-LEO-ILr-Gl.N-YAIr-HET-ALA^GLG-IZl.'-106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 SER-HO-ALA-AIA-LYS-TOR-2 121 122 123 124 125 126 . · » « 31 91884 jossa X on met ioni iniryhmä tai vety ja Y on glutamiiniryh-mä, tai kun X on vety, Y on joko glutamiini- tai pyroglu-tamaattiryhmä, ja Z koostuu n aminohaposta GLY 127:stä alkavasta sekvenssistä
11. 5 GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU- 127 128 129 130 131 132 133 134 135 PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 ' jolloin n on nolla tai kokonaisluku 1-17, kun X on melo tioniiniryhmä, ja n on nolla tai kokonaisluku 1-16, kun X on vety.
12. 7. Koodaavasta säikeestä ja komplementaarisesta säikeestä koostuva kaksisäikeinen DNA, tunnettu siitä, että koodaava säie koodaa polypeptidiä, jolla on N-15 päästä luettuna aminohapposekvenssi X-Y-ASP-PRO-T^R-VAL-LYS-GLU-ALA-GLU-ASN-LBU-IYS-LyS-IYR-PHE-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 ASN-ALA-GUf -HXS-SER-ASP-VAL-ALA-ASP-ASN-GLY-THR-IHl-HiE-LHJ- 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
13. 9. GLY-ILE-LEU-LYS-ASN-lRP-IYS-GUJ-GrU-SER-ASP-AR3-ISS-IIJE-i«T- ZU 31 3233343536373834041424344 45 GtN-SHR-GIN-ILE-VAtr-SER-PHE-lYR-PHE-LYS-LEIJ-HE-ISS-ASii-PHE-46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 LYS—ASP-ASP-GLN-SER—XLE-GLN-LYS-SER-VAL-GLU-THR-ILE-LYS-GIJJ— 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 ASP-MEr-ASN-VAL-LY5-PHE-FHE-ASN-SER-ASN-LYS-ISS-IYS-ARG-ASP-2 5 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER-VAL-THR-ASP-LELI-ASN-VAL-91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 GLN-ARG-LYS-AIA-II£-HlS-<n2MS^Iir--GUi-W^ET-AIA-GtO-:S> 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 SER-FRO-AIA-AIA-LYS-TOR-Z 121 122 123 124 125 126 30 jossa X on metioniiniryhmä tai vety ja Y on glutamiiniryh-mä, tai kun X on vety, Y on joko glutamiini- tai pyroglu-tamaattiryhmä, ja Z koostuu n aminohaposta GLY 127:stä 35 alkavasta sekvenssistä 91884 GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-127 128 129 130 131 132 133 134 135 PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 J 5 jolloin n on nolla tai kokonaisluku 1-17, kun X on me-tioniiniryhmä, ja n on nolla tai kokonaisluku 1 - 16, kun X on vety. n 91884