DE60129432T2 - Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Herstellung von Proteinen und insbesondere von rekombinanten Proteinen, welche mindestens einen "freien" Cysteinrest, d. h. einen Cysteinrest, welcher nicht an einer Disulfidbindung beteiligt ist, enthält.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Protein-Therapeutika müssen an Patienten im Allgemeinen durch Injektion verabreicht werden. Die meisten Protein-Therapeutika werden rasch aus dem Körper entfernt, was häufige, oft tägliche Injektionen erfordert. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung von Verfahren zur Verlängerung der Kreislaufhalbwertzeiten von Protein-Therapeutika im Körper, sodass die Proteine nicht häufig injiziert werden müssen. Die kovalente Modifikation von Proteinen mit Polyethylenglykol (PEG) erwies sich als ein nützliches Verfahren zur Verlängerung der Kreislaufhalbwertzeiten von Proteinen im Körper (Abuchowski et al., 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al., 1991). Die kovalente Bindung von PEG an ein Protein erhöht die tatsächliche Größes des Proteins und verringert die Geschwindigkeit von dessen Entfernung aus dem Körper. PEGs sind kommerziell in mehreren Größen verfügbar, was die spezifische Anpassung der Kreislaufhalbwertszeiten von PEG-modifizierten Proteinen für einzelne Indikationen durch die Verwendung von PEGs unterschiedlicher Größe gestattet. Andere dokumentierte in-vivo-Vorteile der PEG-Modifikation sind eine Erhöhung der Proteinlöslichkeit und -stabilität und eine Abnahme der Protein-Immunogenizität (Katre et al., 1987; Katre, 1990).
  • Ein bekanntes Verfahren zur PEGylierung von Proteinen lagert PEG kovalent an Cysteinreste unter Verwendung von Cystein-reaktiven PEGs an. Eine Reihe von hochspezifischen Cystein-reaktiven PEGs mit verschiedenen reaktiven Gruppen (z. B. Maleimid, Vinylsulfon) und PEGs unterschiedlicher Größe (2-40 kDa, einzel- oder verzweigtkettig) sind kommerziell verfügbar. Bei einem neutralen pH-Wert lagern sich diese PEG-Reagenzien selektiv an "freie" Cysteinreste an, d. h. an Cysteinreste, die nicht an Disulfidbindungen beteiligt sind. Cysteinreste in den meisten Proteinen sind an Disulfidbindungen beteiligt und stehen nicht für die PEGylierung unter Verwendung von mit Cystein reagierenden PEGs zur Verfügung. Durch in-vitro-Mutagenese unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken können zusätzliche Cysteinreste an beliebiger Stelle in das Protein eingebaut werden. Die neu hinzugefügten "freien" oder "nicht-natürlichen" Cystein können als Stellen für die spezifische Anheftung eines PEG-Moleküls unter Verwen dung von Cystein-reaktiven PEGs dienen. Der hinzugefügte "freie" oder "nicht-natürliche" Cysteinrest kann eine Substitution für eine existierende Aminosäure in einem Protein sein, vor dem Amino-Terminus des reifen Proteins oder nach dem Carboxy-Terminus des reifen Proteins hinzugefügt werden oder zwischen zwei normalerweise benachbarten Aminosäuren in dem Protein eingefügt werden. Alternativ kann eines von zwei an einer nativen Disulfidbindung beteiligten Cysteinen deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert werden, wobei ein natives Cystein (der Cysteinrest in dem Protein, das normalerweise eine Disulfidbindung mit dem deletierten oder substituierten Cysteinrest bilden würde) frei bleibt und für die chemische Modifikation zur Verfügung steht. Vorzugsweise wäre die für das Cystein substituierte Aminosäure eine neutrale Aminosäure, wie Serin oder Alanin. Zum Beispiel besitzt humanes Wachstumshormon (hGH) zwei Disulfidbindungen, die reduziert und mit Iodacetamid alkyliert werden können, ohne die biologische Aktivität zu beeinträchtigen (Bewley et al., (1969)). Jedes der vier Cysteine wäre ein sinnvolles Ziel für eine Deletion oder Substitution durch eine andere Aminosäure.
  • Mehrere natürlich vorkommende Proteine sind dafür bekannt, dass sie einen oder mehrere "freie" Cysteinreste enthalten. Beispiele für solche natürlich vorkommenden Proteine schließen humanes Interleukin(IL)-2 (Wang et al., 1984), beta-Interferon (Mark et al., 1984; 1985), G-CSF (Lu et al., 1989) und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, Thompson, 1992) ein. IL-2, Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF) und beta-Interferon (IFN-☐) enthalten eine ungerade Zahl an Cysteinresten, wohingegen basischer Fibroblast-Wachstumsfaktor eine gerade Zahl an Cysteinresten enthält.
  • Die Expression von rekombinanten Proteinen, die freie Cysteinreste enthalten, war problematisch aufgrund der Reaktivität des freien Sulfhydryls bei physiologischen Bedingungen. Mehrere rekombinante Proteine, die freie Cysteine enthalten, sind cytoplasmisch, d. h. als intrazelluläre Proteine, in Bakterien, wie E. coli, exprimiert worden. Beispiele schließen natürliche Proteine, wie IL-2, beta-Interferon, G-CSF und gentechnisch hergestellte Cysteinmuteine von IL-2 (Goodson und Katre, 1990), IL-3 (Shaw et al., 1992), Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein (Tuma et al., 1995), Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I, Cox und McDermott, 1994), Insulinartigen Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-1 (IGFBP-1, Van Den Berg et al., 1997) und Protease-Nexin und verwandte Proteine (Braxton, 1998) ein. Alle von diesen Proteinen waren vorwiegend unlöslich, als sie intrazellulär in E. coli exprimiert wurden. Die unlöslichen Proteine waren größtenteils inaktiv und mussten rückgefaltet werden, um eine signifikante biologische Aktivität wiederzuerlangen. In einigen Fällen wurde das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) zur Unterstützung der Solubilisierung und/oder Rückfaltung der unlöslichen Proteine verwendet. Gereinigtes, rückgefaltetes IL-2, G-CSF und beta-Interferon-Proteine sind instabil und verlieren an Aktivität bei einem physiologischen pH, offenbar infolge der Disulfid-Umgruppierungen, an denen der freie Cysteinrest beteiligt ist (Wang et al., 1984; Mark et al., 1984; 1985; Oh-eda et al., 1990; Arakawa et al., 1992). Der Austausch des freien Cysteinrests in diesen Proteinen durch Serin führte zu einem Protein, das bei einem physiologischen pH-Wert stabiler war (Wang et al., 1984; Mark et al., 1984; 1985; Arakawa et al., 1993).
  • Ein zweites bekanntes Verfahren zum Exprimieren rekombinanter Proteine in Bakterien ist deren Sezernierung in den periplasmatischen Raum oder in das Medium. Es ist bekannt, dass bestimmte rekombinante Proteine, wie GH, in einer löslichen aktiven Form exprimiert werden, wenn sie in das E. coli-Periplasma sezerniert werden, wohingegen sie unlöslich sind, wenn sie intrazellulär in E. coli exprimiert werden. Die Sezernierung wird durch Fusionieren von GH oder andere Proteine von Interesse codierenden DNA-Sequenzen mit DNA-Sequenzen erreicht, welche bakterielle Signalsequenzen codieren, wie diejenigen, die von den stII-(Fujimoto et al., 1988) und ompA-Proteinen (Ghrayeb et al., 1984) abgeleitet sind. Die Sezernierung von rekombinanten Proteinen in Bakterien ist erwünscht, weil der natürliche N-Terminus des rekombinanten Proteins beibehalten werden kann. Die intrazelluläre Expression von rekombinanten Proteinen erfordert, dass ein N-terminales Methionin am Amino-Terminus des rekombinanten Proteins vorhanden ist. Methionin ist normalerweise am Amino-Terminus der reifen Formen zahlreicher humaner Proteine nicht vorhanden. Zum Beispiel ist die Amino-terminale Aminosäure der reifen Form von humanem GH Phenylalanin. Ein Amino-terminales Methionin muss an den Amino-Terminus eines rekombinanten Proteins hinzugefügt werden, wenn ein Methionin an dieser Position nicht vorhanden ist, damit das Protein wirksam in Bakterien exprimiert wird. Typischerweise wird die Hinzufügung des Amino-terminalen Methionins durch Hinzufügen eines ATG-Methionin-Codons, welches der das rekombinante Protein codierenden DNA-Sequenz vorausgeht, bewerkstelligt. Das hinzugefügte N-terminale Methionin wird häufig nicht aus dem rekombinanten Protein entfernt, insbesondere wenn das rekombinante Protein unlöslich ist. Dies ist bei hGH der Fall, wo das N-terminale Methionin nicht entfernt wird, wenn das Protein intrazellulär in E. coli exprimiert wird. Das hinzugefügte N-terminale Methionin erzeugt ein "nicht-natürliches" Protein, das möglicherweise eine Immunantwort bei einem Menschen stimulieren kann. Demgegenüber befindet sich kein hinzugefügtes Methionin auf hGH, das unter Verwendung von Signalsequenzen von stII (Chang et al., 1987) oder ompA (Cheah et al, 1994) in den periplasmatischen Raum sezerniert wird; das rekombinante Protein beginnt mit der nativen Amino-terminalen Aminosäure Phenylalanin. Die native hGH-Proteinsequenz wird beibehalten, weil bakterielle Enzyme das stII-hGH-Protein (oder ompA-hGH-Protein) zwischen der Signalsequenz von stII (oder ompA) und dem Anfang des reifen hGH-Proteins spalten.
  • hGH weist vier Cysteine auf, welche zwei Disulfide bilden. hGH kann in das E. coli-Peniplasma mit Hilfe von stII- oder ompA-Signalsequenzen sezerniert werden. Das sezernierte Protein ist löslich und biologisch aktiv (Hsiung et al., 1986). Die vorherrschende sezerniere Form von hGH ist ein Monomer mit einem apparenten Molekulargewicht bei Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) von 22 kDa. Rekombinantes hGH kann aus dem periplasmatischen Raum mit Hilfe einer osmotischen Schockprozedur isoliert werden (Koshland und Rotstein, 1980), welche vorzugsweise periplasmatische, aber nicht intrazelluläre, Proteine in den osmotischen Schockpuffer freisetzt. Das freigesetzte hGH-Protein wird dann durch Säulenchromatographie gereinigt (Hsiung et al., 1986). Eine große Zahl von GH-Mutanten ist in das E. coli-Periplasma sezerniert worden. Die sezernierten mutierten Proteine waren löslich und konnten mit Hilfe von ähnlichen Prozeduren, wie sie zur Reinigung von Wildtyp-GH angewandt werden (Cunningham und Wells, 1989; Fuh et al., 1992), gereinigt werden. Unerwartet stellte man bei der Anwendung ähnlicher Prozeduren zur Sezernierung von GH-Varianten, die einen freien Cysteinrest enthalten (fünf Cysteine; 2N+1), fest, dass bestimmte rekombinante GH-Varianten unlöslich waren oder Multimere oder Aggregate bildeten, wenn sie mit Hilfe von standardmäßigen osmotischen Schock- und Reinigungsprozeduren, die für GH entwickelt wurden, isoliert wurden. Es konnte sehr wenig von den monomeren GH-Varianten-Proteinen durch nicht-reduzierte SDS-PAGE in den Osmotischen-Schock-Lysaten detektiert werden. Unlösliche oder aggregierte GH-Varianten hatten verringerte biologische Aktivitäten im Vergleich mit löslichem, richtig gefaltetem hGH. Verfahren zum Rückfalten von unlöslichen sezernierten Wachstumshormon-Varianten, welche einen freien Cysteinrest enthalten, in eine biologisch aktive Form sind nicht beschrieben worden.
  • Alpha-Interferon (IFN-α2) enthält auch vier Cysteinreste, welche zwei Disulfidbindungen bilden. IFN-α2 kann in das E. coli-Periplasma mit Hilfe der stII-Signalsequenz sezerniert werden (Voss et al., 1994). Ein Teil des sezernierten Proteins ist löslich und biologisch aktiv (Voss et al., 1994). Sezerniertes, lösliches rekombinantes IFN-α2 kann durch Säulenchromatographie gereinigt werden (Voss et al., 1994). Wenn ähnliche Prozeduren zum Sezernieren von IFN-α2-Varianten, die einen freien Cyteinrest enthalten (fünf Cysteine; 2N+1), versucht wurden, wurde festgestellt, dass bestimmte der rekombinanten IFN-α2-Varianten vorwiegend unlöslich waren oder Multimere oder Aggregate bildeten, wenn sie mit Hilfe von Standard-Reinigungsprozeduren, die für IFN-α2 entwickelt wurden, isoliert wurden. Unlösliche oder aggregierte IFN-α2-Varianten wiesen verringerte biologischen Aktivitäten im Vergleich mit löslichem, richtig gefaltetem IFN-α2 auf. Verfahren zum Rückfalten unlöslicher, sezernierter IFN-α2-Varianten, die einen freien Cysteinrest enthalten, in eine biologisch aktive Form sind nicht beschrieben worden.
  • Humaner Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF) enthält fünf Cysteinreste, welche zwei Disulfidbindungen bilden. Der Cysteinrest an der Position 17 in der reifen Proteinsequenz ist frei. Perez-Perez et al. (1995) berichteten, dass G-CSF in das E.coli-Periplasma unter Verwendung einer Variantenform der ompA-Signalsequenz sezerniert werden konnte. Allerdings wurde sehr wenig von dem ompA-G-CSF-Fusionsprotein korrekt prozessiert für den Erhalt von reifem G-CSF. Der Prozentanteil an korrekt prozessiertem G-CSF konnte durch Coexpression der E.coli-dnaK- und dnaJ-Proteine in den Wirtszellen, die das ompA-G-CSF-Fusionsprotein exprimierten, verbessert werden (Perez-Perez et al., 1995). Korrekt prozessiertes, sezerniertes G- CSF war in allen untersuchten E.coli-Stämmen größtenteils unlöslich (Perez-Perez et al., 1995). Unlösliches G-CSF besitzt eine verringerte biologische Aktivität im Vergleich mit löslichem, richtig gefaltetem G-CSF. Wenn ähnliche Prozeduren zum Sezernieren von Wildtyp-G-CSF, G CSF-Varianten, in welchen der freie Cysteinrest durch Serin ersetzt war [G-CSF (C17S)], und G-CSF(C17S)-Varianten, die einen freien Cysteinrest (fünf Cysteine; 2N+1) enthielten, mit Hilfe der stII-Signalsequenz versucht wurden, stellte man fest, dass die rekombinanten G-CSF-Proteine ebenfalls vorwiegend unlöslich waren. Verfahren zum Rückfalten von unlöslichen, sezernierten G-CSF-Proteinen in eine biologisch aktive Form sind nicht beschrieben worden.
  • Humaner Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) enthält vier Cysteinreste, welche zwei Disulfidbindungen bilden. Libbey et al. (1987) und Greenberg et al. (1988) berichteten, dass GM-CSF mit Hilfe der ompA-Signalsequenz in das E.coli-Periplasma sezerniert werden konnte. Korrekt prozessierter sezernierter GM-CSF war unlöslich (Libbey et al., 1987; Greenberg et al., 1988). Unlöslicher GM-CSF besitzt eine verringerte biologische Aktivität im Vergleich mit löslichem, richtig gefalteten GM-CSF. Wenn ähnliche Prozeduren zum Sezernieren von GM-CSF-Varianten, die einen freien Cyteinrest enthalten (fünf Cysteine; 2N+1), mit Hilfe der stII-Signalsequenz versucht wurden, wurde festgestellt, dass die rekombinanten GM-CSF-Proteine ebenfalls vorwiegend unlöslich waren. Verfahren zum Rückfalten unlöslicher, sezernierter GM-CSF-Proteine in eine biologisch aktive Form sind nicht beschrieben worden.
  • Das US-Patent Nr. 5 206 344 und Goodson und Katre (1990) beschreiben die Expression und Reinigung eines Cystein-Substitutionsmuteins von IL-2. Das IL-2-Cysteinmutein war unlöslich, wenn es intrazellulär in E.coli exprimiert wurde. Das Protein wurde durch Behandlung mit einem Denaturierungsmittel [entweder 10 %igem Natriumdodecylsulfat (SDS) oder 8M Harnstoff] und einem Reduktionsmittel [100 mM Dithiothreitol (DTT)] solubilisiert, rückgefaltet und durch Größenausschlusschromatographie und Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Expression und Reinigung von Cysteinmuteinen von IL-3 sind in dem US-Patent Nr. 5 166 322 beschrieben. Die IL-3-Cysteinmuteine waren ebenfalls unlöslich, als sie intrazellulär in E. coli exprimiert wurden. Die Proteine wurden mit einem Denaturierungsmittel (Guanidin) und einem Reduktionsmittel (DTT) solubilisiert, rückgefaltet und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die gereinigten IL 3-Cysteinmuteine wurden durch Einschluss von DTT in den Aufbewahrungspuffern in einem teilweise reduzierten Zustand gehalten. Als die Erfinder nur ein Denaturierungsmittel und ein Reduktionsmittel (DTT) zum Denaturieren und Rückfalten unlöslicher Cysteinmuteine von GH und G-CSF verwendeten, stellte man fest, dass die rückgefalteten Proteine heterogen waren und Spezies mit mehreren Molekulargewichten umfassten. Ebenso wurden, als die Erfinder unlösliche, sezernierte IFN-α2-Cysteinmuteine mit nur einem Denaturierungsmittel und einem Reduktionsmittel (DTT) denaturierten und rückfalteten, nicht nachweisbare Spiegel von richtig gefalteten IFN-α2-Cysteinmuteinen erhalten.
  • Malik et al. (1992) und Knusli et al. (1992) beschrieben die Konjugation von Wildtyp-GM-CSF mit Amin-reaktiven PEG-Reagenzien. Der Amin-PEGylierte GM-CSF umfasste eine heterogene Mischung von PEG-GM-CSF-Spezies mit unterschiedlichem Molekulargewicht, modifiziert an mehreren Aminosäureresten (Malik et al. 1992; Knusli et al., 1992). Die verschiedenen Amin-PEGylierten GM-CSF-Spezies konnten nicht voneinander oder von Nicht-PEGyliertem GM-CSF durch herkömmliche Chromatographieverfahren gereinigt werden, was spezifische Aktivitätsmessungen der verschiedenen Isoformen verhinderte. Clark et al. (1996) beschrieben die Konjugation von GH mit Amin-reaktiven PEGs. Amin-PEGylierter GH war ebenfalls heterogen und umfasste eine Mischung von Spezies mit mehreren Molekulargewichten, modifiziert an mehreren Aminosäureresten. Die Amin-PEGylierten GH-Proteine zeigten eine wesentlich verringerte biologische Aktivität (Clark et al., 1996). Monkarsh et al. (1997) beschrieben Amin-PEGyliertes alpha-Interferon, welches ebenfalls Spezies mit mehreren Molekulargewichten, modifiziert an verschiedenen Aminosäureresten, umfasste. Amin-PEGyliertes alpha-Interferon zeigte ebenfalls eine verringerte biologische Aktivität. Tanaka et al. (1991) beschrieben Amin-PEGylierten G-CSF, der ebenfalls eine heterogene Mischung von Spezies mit unterschiedlichen Molekulargewichten, modifiziert an verschiedenen Aminosäureresten, umfasste. Amin-PEGylierter G-CSF zeigte eine verringerte biologische Aktivität (Tanaka et al., 1991). Kinstler et al. (1996) beschrieben ein Amin-PEGyliertes G-CSF-Protein, das vorzugsweise an dem nicht-natürlichen N-terminalen Methioninrest modifiziert ist. Dieses Protein zeigte ebenfalls eine verringerte biologische Aktivität (Kinstler et al., 1996).
  • WO 94/12219 A und WO 95/32003A beschreiben beide das Rückfalten von IGF-I-Cysteinmuteinen mit Hilfe eines im Wesentlichen wie folgt lautenden Verfahrens. Zuerst wird das unlösliche IGF-I-Protein mit einem Denaturierungsmittel (Guanidin) und einem Reduktionsmittel (DTT) solubilisiert. Dieses denaturiert und reduziert das Protein, blockiert aber nicht die Cysteinreste. Nach dem Solubilisierungsschritt wird die Lösung zentrifugiert zur Entfernung von unlöslichen Proteinen. Das Protein wird mit Hilfe eines mehrstufigen Verfahrens rückgefaltet. Zuerst wird ein molarer Überschuss von oxidiertem Glutathionin (im Verhältnis zu dem Reduktionsmittel) der Mischung zugegeben. Das überschüssige oxidierte Glutathionin erzeugt eine oxidierende Umgebung und reagiert mit allen Cysteinen in dem Protein unter Bildung gemischter Disulfide und blockiert diese. Das denaturierte Protein wird vollständig oxidiert. Die Lösung wird dann verdünnt und ein molarer Überschuss (im Verhältnis zu Glutathionin) eines zweiten Reduktionsmittels, das ebenfalls ein Cystein blockierendes Mittel ist (Cystein), wird zugegeben. Nach der Verdünnung beginnt sich das Protein rückzufalten. Das zweite Reduktionsmittel/Cystein-blockierende Mittel (Cystein) beschleunigt die Disulfid-Umbildung. Die nativen Cystein bilden sich schließlich neu, weil sie stabiler sind als die gemischten Disulfide. Das rückgefaltete Protein enthält die nativen Disulfide und den freien Cysteinrest, welcher in der Form eines gemischten Disulfids vorliegt.
  • Die EP 0 355 460 A lehrt die irreversible Modifikation von Wildtyp-Wachstumshormon (auch als Somatotropin bekannt) mit Iodacetamid. Mutanten von Wachstumshormon, das durch die Ersetzung von Cysteinresten in dem Protein durch Nicht-Cystein-Reste gebildet wird, sind ebenfalls beschrieben worden.
  • Die EP 0 312 358 A und WO 94/01453 betreffen beide die Herstellung von rekombinanten Wildtyp-Proteinen durch Solubilisieren der Proteine mit einem Denaturierungsmittel und einem Oxidationsmittel. Das bevorzugte Denaturierungsmittel ist Natriumdodecylsulfat (SDS) und das bevorzugte Oxidationsmittel ist Cystin.
  • Daher besteht trotz beträchtlicher Anstrengungen immer noch ein Bedarf an Verfahren, welche das Rückfalten eines unlöslichen oder aggregierten Proteins, das einen oder mehrere freie Cysteinreste enthält, in eine lösliche, biologisch aktive Form bei hoher Ausbeute gestatten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderung und liefert ebenso damit verbundene Vorteile. Desgleichen besteht auch ein Bedarf nach Verfahren zur Erzeugung homogener Präparate von lange wirkenden rekombinanten Proteinen durch eine Erhöhung des Protein-Molekulargewichts, wie durch PEGylierung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren für den Erhalt rückgefalteter, löslicher Formen von Proteinen, die einen oder mehrere freie Cysteinreste aufweisen und die durch eine Wirtszelle in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert werden. In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, löslichen Form eines unlöslichen oder aggregierten Proteins bereitgestellt, welches ein Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie ist und welches einen oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste enthält, umfassend die Schritte: (a) Bewirken, dass eine Wirtszelle ein Protein, das einen oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste enthält und ein Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie ist, in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert; (b) Lysieren der Zellen durch chemische, enzymatische oder physikalische Mittel; (c) Solubilisieren und Reduzieren des unlöslichen oder aggregierten Proteins, indem das unlösliche oder aggregierte Protein einem Denaturierungsmittel, einem Reduktionsmittel und einem Cystein blockierenden Mittel ausgesetzt wird; und (d) Rückfalten des Proteins durch Verringern der Konzentrationen an dem Denaturierungsmittel und den Reduktionsmitteln auf Spiegel, die ausreichen, um die Renaturierung des Proteins in eine lösliche, biologisch aktive Form zu gestatten, wobei das Cystein blockierende Mittel ein reversibles gemischtes Disulfid mit mindestens einem freien Cysteinrest in dem Protein bildet. Gegebenenfalls wird das lösliche rückgefaltete Protein von anderen Proteinen in dem Rückfaltungsgemisch isoliert.
  • Geeignete Wirtszellen schließen Bakterien, Hefe, Insekten- oder Säugerzellen ein. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine bakterielle Zelle, insbesondere E. coli.
  • Vorzugsweise sind die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten löslichen, rückgefalteten Proteine rekombinante Proteine, insbesondere Cystein-Varianten oder Cysteinmuteine eines Proteins. Wie hierin verwendet, sollen die Ausdrücke "Cystein-Variante" und "Cysteinmutein" eine der folgenden Veränderungen in der Aminosäuresequenz eines Proteins umfassen: Hinzufügung eines nicht-natürlichen Cysteinrests, welcher dem Amino-Terminus des reifen Proteins vorausgeht oder auf den Carboxy-Terminus des reifen Proteins folgt; Substitution eines eines nicht-natürlichen Cysteinrests für eine vorhandene Aminosäure in dem Protein; Einbau eines nicht-natürlichen Cysteinrests zwischen zwei normalerweise benachbarten Aminosäuren in dem Protein; oder Substitution einer anderen Aminosäure für einen natürlich vorkommenden Cysteinrest, der normalerweise eine Disulfidbindung in dem Protein bildet. Die Verfahren werden für die Herstellung von Proteinen angewandt, darin eingeschlossen, ohne Einschränkung, GH, G-CSF, GM-CSF und Interferon, insbesondere alpha-Interferon, Cystein-Varianten dieser Proteine, deren Derivate oder Antagonisten. Andere Proteine, für welche die Verfahren von Nutzen sind, schließen andere Mitglieder der GH-Supergen-Familie ein.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Cystein blockierendes Mittel" jedwedes Reagens oder Kombination von Reagenzien, die zur Bildung eines reversibel blockierten freien Cysteinrests in einem Protein führt. Beispiele für nützliche Cystein blockierende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Dithiole, wie Cystin, Cystamin, oxidiertes Glutathion, Dithioglykolsäure und dergleichen, oder Thiole, wie Cystein, Cysteamin, Thioglykolsäure und reduziertes Glutathion. Vorzugsweise sollten Thiole in Gegenwart eines Oxidationsmittels verwendet werden. Nützliche Oxidationsmittel schließen Sauerstoff, Iod, Ferricyanid, Wasserstoffperoxid, Dihydroascorbinsäure, Tetrathionat und O-Iodbenzoat ein. Wahlweise kann ein Metallion, wie Kupfer (Cn++) oder Kobalt (Co++), hinzugefügt werden, um die Oxidationsreaktion zu katalysieren. Ohne an eine spezielle Theorie gebunden sein zu wollen, postulieren die Erfinder, dass das Cystein blockierende Mittel ein gemischtes Disulfid mit dem freien Cysteinrest in dem Protein bildet, wodurch mögliche Disulfid-Umgruppierungen eingeschränkt werden, welche unter Beteiligung des freien Cysteinrests auftreten könnten. Das gemischte Disulfid stabilisiert den freien Cysteinrest und erhöht in signifikanter Weise die Ausbeute von richtig gefaltetem, biologisch aktivem löslichen Protein. Wie hierin verwendet, gelten Reduktionsmittel, wie DTT und 2-Mercaptoethanol, nicht als Cystein blockierende Mittel, weil sie nicht zur Bildung eines reversibel blockierten gemischten Disulfids mit dem freien Cysteinrest in dem Protein führen. DTT bildet typischerweise keine gemischten Disulfide mit Cysteinresten in Proteinen aufgrund einer thermodynamisch bevorzugten intramolekularen Bindung, die sich bei Oxidation bildet.
  • Dimere und multimere Proteine höherer Ordnung, die durch die kovalente Assoziation von zwei oder mehreren der rückgefalteten Proteine mittels ihrer freien Cysteinreste gebildet werden, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegenden Verfahren schließen ferner verschiedene Verfahren zur Bindung einer Cystein-reaktiven Einheit an das rückgefaltete Protein zur Bildung von modifiziertem Protein ein, in welchem die Cystein-reaktive Einheit an das rückgefaltete Protein durch den/die freien Cysteinrest(e) gebunden wird. Ein Beispiel für eine nützliche, mit Cystein reagierende bzw. Cystein-reaktive Einheit, die an das rückgefaltete Protein gebunden werden kann, ist ein mit Cystein reagierendes PEG, welches zur Bildung von PEGyliertem Protein verwendet werden kann. Solche Verfahren schließen Folgendes ein: (a) Isolieren des rückgefalteten Proteins mit einem freien Cysteinrest von anderen Proteinen in dem Rückfaltungsgemisch; (b) Reduzieren, zumindest teilweise, des isolierten rückgefalteten Proteins mit einem Disulfid reduzierenden Mittel und (c) Aussetzen des Proteins einer mit Cystein reagierenden Einheit, wie einem mit Cystein reagierenden PEG. Wahlweise kann das modifizierte Protein von unmodifiziertem Protein isoliert werden. Beispiele für andere nützliche, mit Cystein reagierende Einheiten sind mit Cystein reagierende Dextrane, mit Cystein reagierende Kohlehydrate, mit Cystein reagierende Poly(N-vinylpyrrolidone), mit Cystein reagierende Peptide, mit Cystein reagierende Lipide und mit Cystein reagierende Polysaccharide.
  • Die vorliegende Erfindung schließt zudem die löslichen, rückgefalteten Proteine und deren Derivate ein, darin eingeschlossen PEGylierte Proteine, die durch hierin offenbarte Verfahren hergestellt werden. Solche PEGylierten Proteine schließen monopegylierte Cystein-Varianten von GH, G-CSF, GM-CSF und alpha-Interferon-Proteinen ein. Solche PEGylierten Proteine schließen auch Cystein-Varianten von GH, G-CSF, GM-CSF und alpha-Interferon-Proteinen, die mit zwei oder mehreren PEG-Molekülen modifiziert sind, ein, wobei mindestens eines der PEG-Moleküle an das Protein durch einen freien Cysteinrest gebunden ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zur Herstellung von rückgefalteten, löslichen Formen von GH-, IFN-α2-, G-CSF- und GM-CSF-Proteinen zur Verfügung, die mindestens einen hinzugefügten freien Cysteinrest aufweisen und die durch eine Wirtszelle in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert werden. Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, rückgefaltete, lösliche Formen von anderen Mitgliedern der GH-Supergen-Familie herzustellen, die mindestens einen freien Cysteinrest aufweisen und die durch eine Wirtszelle in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert werden. Die Erfindung stellt ferner neue Proteine, insbesondere rekombinante Proteine, welche durch diese neuen Verfahren hergestellt wurden, sowie Derivate solcher rekombinanten Proteine zur Verfügung. Die neuen Verfahren zur Herstellung solcher Proteine werden im Allgemeinen bewerkstelligt durch:
    • (a) das Bewirken, dass eine Wirtszelle ein Protein, das einen oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste aufweist und ein Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie ist, in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert;
    • (b) das Lysieren der Wirtszelle durch chemische, enzymatische oder physikalische Mittel;
    • (c) das Solubilisieren des unlöslichen oder aggregierten Proteins, indem das Protein einem Denaturierungsmittel, einem Reduktionsmittel und einem Cystein blockierenden Mittel ausgesetzt wird; und
    • (d) das Rückfalten des Proteins durch Verringern der Konzentrationen an dem Denaturierungsmittel und dem Reduktionsmittel im Solubilisierungsgemisch auf Spiegel, die ausreichen, um die Renaturierung des Proteins in eine lösliche, biologisch aktive Form zu gestatten, wobei das Cystein blockierende Mittel ein reversibles gemischtes Disulfid mit mindestens einem freien Cysteinrest in dem Protein bildet.
  • Wahlweise kann das rückgefaltete lösliche Protein von anderen Proteinen in dem Rückfaltungsgemisch isoliert werden. Die Verfahren und anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden in der vorläufigen US-Anmeldung der Serien-Nr. 60/204 617, eingereicht am 16. Mai, 2000, ausführlich beschrieben.
  • Wie oben aufgezeigt, ist es der erste Schritt bei diesen Verfahren zu bewirken, dass eine Wirtszelle ein Protein, das einen freien Cysteinrest aufweist, in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert. Geeignete Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Beispiele von geeigneten Wirtszellen, die verwendet werden können, um rekombinante Proteine zu exprimieren, schließen Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säuger-Zellen ein. Bakterienzellen sind besonders nützlich, insbesondere E. coli. Verfahren, um zu bewirken, dass eine Wirtszelle ein Protein exprimiert, sind im Fachbereich gut bekannt und Beispiele werden hierin zur Verfügung gestellt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Protein, das einen freien Cysteinrest aufweist" ein beliebiges natürliches oder rekombinantes Protein oder Peptid, das 2N+1 Cysteinreste enthält, wobei N 0 oder eine beliebige ganze Zahl sein kann, und ein beliebiges natürliches oder rekombinantes Protein oder Peptid, das 2N Cystein enthält, wobei zwei oder mehr der Cysteine in der Regel nicht an einer Disulfidbindung beteiligt sind. Somit sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich für die Verbesserung der Expression, Gewinnung und Reinigung von einem beliebigen Protein oder Peptid mit einem freien Cystein, insbesondere von durch hinzugefügtes Cystein abweichenden rekombinanten Proteinen (hierin als „Cysteinmuteine" oder „Cystein-Varianten" bezeichnet), die ein oder mehrere freie(s) Cystein(e) aufweisen. Obwohl die Expression, Gewinnung und Hufreinigung eines natürlichen Proteins mit einem freien Cystein, welches durch seine natürliche Wirtszelle exprimiert wird, durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung verbessert werden kann, bezieht sich die Beschreibung hierin in erster Linie nur für veranschaulichende Zwecke auf rekombinante Proteine. Darüber hinaus können die Proteine von einer beliebigen Tierart stammen, einschließlich Mensch, Haustiere und Nutztiere. Die Proteine können auch von Pflanzenarten oder Mikroben stammen.
  • Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung eine große Vielfalt an rekombinanten Proteinen und an Cystein-Varianten dieser Proteine. Diese Proteine schließen die Mitglieder der GH-Supergen-Familie und Cystein-Varianten dieser Proteine ein. Die folgenden Proteine („zusammengefasst als die GH-Supergen-Familie bezeichnet") werden durch Gene der GH-Supergen-Familie codiert (Bazan (1990; 1991; 1992); Mott und Campbell (1995); Silvennoinen und Ihle (1996); Martin et al. (1990); Hannum et al. (1994); Slumberg et al., 2001): GH, Prolactin, Placenta-Lactogen, Erythropoetin (EPO), Thrombopoetin (TPO), Interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35-Untereinheit), IL-13, IL-15, IL-19, IL-20, IL-TIF, MDA-7, AK-155, Oncostatin M, ciliärer neurotropher Faktor, Leukämieinhibierender Faktor, alpha-Interferon, beta-Interferon, gamma-Interferon, Omega-Interferon, tau-Interferon, Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Cardiotrophin-1 (CT-1), Stammzellfaktor und der flt3/flk2-Ligand. Es wird damit gerechnet, dass zusätzliche Mitglieder der GH-Supergen-Familie in der Zukunft durch Gen-Klonierung und -Sequenzierung identifiziert werden. Die Mitglieder der GH-Supergen-Familie weisen ähnliche Sekundär- und Tertiärstrukturen auf, trotz der Tatsache, dass sie im Allgemeinen eine begrenzte Identität der Aminosäure- oder DNA-Sequenz aufweisen. Die gemeinsamen strukturellen Merkmale der Mitglieder der GH-Supergen-Familie, welche bei Bazan (1990; 1991; 1992), Mott und Campbell (1995) und Silvennoinen und Ihle (1996) beschrieben sind, erlauben es, dass neue Mitglieder der Genfamilie leicht identifiziert werden. Varianten dieser Proteine, wie der selektive IL-2-Antagonist, der von Shanafelt et al. (2000) beschrieben wurde, werden von dieser Erfindung ebenfalls umfasst.
  • Andere Protein-Varianten, die von einer PEGylierung einen Nutzen ziehen würden und daher sinnvolle Kandidaten für Modifikationen durch hinzugefügtes Cystein wären, schließen Proteine oder Peptide mit einer schlechten Löslichkeit oder einer Neigung zu aggregieren, Proteine oder Peptide, die für eine Proteolyse anfällig sind, Proteine oder Peptide, die eine verbesserte mechanische Stabilität benötigen, Proteine oder Peptide, die aus dem Körper schnell entfernt werden, oder Proteine oder Peptide mit unerwünschten immunogenen oder antigenen Eigenschaften ein.
  • Wenn es gewünscht ist, können Cystein- und andere Aminosäure-Muteine dieser Proteine allgemein unter Verwendung einer ortsgerichteten PCR-basierten Mutagenese konstruiert werden, wie es in den Beispielen unten und in der PCT/US98/14497 ( WO-A-99/03887 ) und der PCT/US00/00931 ( WO-A-00/42175 ), von denen jede in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme mit einbezogen ist, beschrieben ist. Verfahren für die Konstruktion von Muteinen unter Verwendung von PCR-basierten PCR-Verfahren sind im Allgemeinen auch in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, herausgegeben von White, B. A. (1993) Humana Press, Inc., Totowa, NJ, und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, herausgegeben von Innis, M. A. et al. (1990) Academic Press, Inc. San Diego, CA, beschrieben.
  • Verfahren, die im Fachbereich bekannt sind, können dazu angewendet werden, eine Expression eines Proteins im Zytoplasma zu induzieren oder eine Sekretion des Proteins zu steuern, in Abhängigkeit von der Herkunft der Zelle, was zum Beispiel die Verfahren einschließt, die in den Beispielen unten beschrieben sind. Eine große Vielfalt von Signal-Peptiden wurde erfolgreich dazu verwendet, um Proteine zum periplasmatischen Raum von E. coli zu transportieren. Beispiele von diesen schließen prokaryotische Signalsequenzen wie ompA, stII, PhoA-Signal (Denefle et al. 1989), OmpT (Johnson et al. 1996), LamB und OmpF (Hoffman und Wright, 1985), beta-Lactamase (Kadonaga et al., 1984), die Enterotoxine LT-A, LT-B (Morioka-Fujimoto et al., 1991) und Protein A aus S. aureus (Abrahmsen et al., 1986) ein. Eine Anzahl von nicht-natürlichen, synthetischen Signal-Sequenzen, welche die Sekretion von bestimmten Proteinen erleichtern, sind dem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls bekannt Als nächstes wird die Wirtszelle lysiert. Die Zell-Lyse kann vor oder gleichzeitig mit den unten beschriebenen Prozeduren der Solubilisierung stattfinden. Die Zell-Lyse kann zum Beispiel durch eine mechanische Scherung, wie mit einer French-Press-Zelle, durch einen enzymatischen Verdau, eine Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, durch Vortexen mit Glaskügelchen, eine Detergenz-Behandlung, organische Lösungsmittel, durch Gefrieren-Auftauen, Zermahlen mit Aluminiumoxid oder Sand, durch Behandlung mit einem Denaturierungsmittel, wie unten definiert, und dergleichen bewerkstelligt werden (Bollag et al., 1996). Wahlweise können die Zellen in Gegenwart eines Denaturierungsmittels, eines Disulfid reduzierenden Mittels oder eines Cystein blockierenden Mittels lysiert werden. Wahlweise kann unlösliches oder aggregiertes Material von den löslichen Proteinen durch verschiedene Methoden wie Zentrifugation, Filtration (einschließlich Ultrafiltration), Fällung, Flockung oder Absetzen abgetrennt werden.
  • Als nächstes wird das unlösliche oder aggregierte Material (oder ganze Zellen ohne vorherige Lyse) löslich oder monomer gemacht, indem das unlösliche oder aggregierte Material (oder ganze Zellen ohne vorherige Lyse) einem Denaturierungsmittel und einem Disulfid reduzierenden Mittel, das auch ein Cystein blockierendes Mittel ist, ausgesetzt wird. Nützliche Denaturierungsmittel schließen Harnstoff, Guanidin, Arginin, Natriumthiocyanat, Extreme beim pH-Wert (verdünnte Säuren oder Basen), Detergenzien (SDS, Sarkosyl☐), Salze (Chloride, Nitrate, Thiocyanate, Cetylmethylammonium-Salze, Trichloracetate), eine chemische Derivatisierung (Sulfitolyse, Reaktion mit Citraconsäureanhydrid), Lösungsmittel (2-Amino-2-methyl-1-propanol oder andere Alkohole, DMSO, DMF) oder starke Anionenaustauschharze wie Q-Sepharose ein. Nützliche Konzentrationen von Harnstoff sind 1-8 M, wobei 5-8 M bevorzugte Konzentrationen sind. Nützliche Konzentrationen von Guanidin sind 1-8 M, wobei 4-8 M bevorzugte Konzentrationen sind. Nützliche Disulfid reduzierende Mittel, die auch Cystein blockierende Mittel sind, schließen Thiole wie Cystein, Thioglykolsäure, reduziertes Glutathion und Cysteamin ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese Verbindungen können im Bereich von 0,5 bis 200 mM eingesetzt werden, wobei 1-50 mM bevorzugte Konzentrationen sind. Cystein, reduziertes Glutathionin, Thioglykolsäure und Cysteamin sind bevorzugte Reduktionsmittel, da sie auch Cystein blockierende Mittel sind, d. h. sie Wechselwirken mit dem freien Cysteinrest im Protein, um einen reversibel blockierten freien Cysteinrest zu bilden. Die Verwendung eines Disulfid reduzierenden Mittels, das auch ein Cystein blockierendes Mittel ist, während des Solubilisierungsschritts reduziert die Zahl der Verbindungen und Schritte, die im gesamten Verfahren zur Rückfaltung des unlöslichen oder aggregierten Proteins in eine lösliche, aktive Form notwendig sind. Darüber hinaus hat die Verwendung eines Cystein blockierenden Mittels eine Form des rückgefalteten Proteins zur Folge, die für eine Derivatisierung am freien Cysteinrest unter Verwendung von verschiedenen mit Cystein reagierenden Einheiten und von unten beschriebenen Vorgehensweisen geeignet ist. Vorzugsweise liegt der pH-Wert des Denaturierungs-/Reduktionsgemisches zwischen pH 6 und pH 10.
  • Der nächste Schritt in der Vorgehensweise ist die Rückfaltung des Proteins, um die native Konformation und die nativen Disulfidbindungen des Proteins zu erhalten. Die Rückfaltung wird dadurch erreicht, dass die Konzentrationen des Denaturierungsmittels und des Reduktionsmittels auf Spiegel verringert werden, die ausreichen, um die Renaturierung des Proteins in eine lösliche, biologisch aktive Form zu gestatten. Dies kann durch Dialyse, Verdünnung, Gelfiltration, Fällung des Proteins, oder durch eine Immobilisierung auf einem Harz, gefolgt von Waschen mit Puffer erreicht werden. Die Bedingungen für diesen Schritt werden so gewählt, dass sie die Regeneration der nativen Disulfidbindung(en) des Proteins gestatten. Dies kann durch Zugabe eines Oxidationsmittels oder einer Redox-Mischung aus einem Oxidationsmittel und einem Reduktionsmittel erreicht werden, um eine Disulfidaustausch-Reaktion zu katalysieren. Vorzugsweise wird ein Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien gewählt, die zur Bildung einer nativen Disulfidbindung und zu einem reversibel blockierten Cysteinrest führen, d. h. das Reagenz oder die Kombination von Reagenzien wirkt als Cystein blockierende Mittel. Beispiele für nützliche Oxidationsmittel schließen Sauerstoff oxidiertes Glutathion, Cystamin und Dithioglykolsäure mit ein. Beispiele für nützliche Redox-Mischungen schließen Cystein/Sauerstoff, Cystein/Cystin, Cystein/Cystamin, Cysteamin/Cystamin, reduziertes Glutathion/oxidiertes Glutathion und dergleichen ein. Wahlweise kann ein Reduktionsmittel wie DTT oder 2-Mercaptoethanol zu dem Rückfaltungsgemisch zugesetzt werden, um den Disulfidaustausch zu begünstigen. Wahlweise kann ein Metallion wie Kupfer (Cu++) oder Kobalt (Co++) zu dem Rückfaltungsgemisch zugesetzt werden, um die Proteinoxidation voranzutreiben. Nützliche Konzentrationen der Metallionen in dem Rückfaltungsgemisch sind 1 μM bis 1 mM, wobei 40 μM eine bevorzugte Konzentration darstellt. Vorzugsweise liegt der pH-Wert der Rückfaltungs-Mischung zwischen pH 6 und pH 10.
  • Alternativ wird das unlösliche oder aggregierte Material (oder ganze Zellen ohne vorherige Zell-Lyse) durch die Verwendung eines Denaturierungsmittels und eines Disulfid reduzierenden Mittels, das ein Cystein blockierendes Mittel sein kann oder auch nicht, löslich oder monomer gemacht. Nützliche Denaturierungsmittel schließen jene ein, die oben beschrieben sind, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für nützliche Disulfid reduzierende Mittel schließen DTT, 2-Mercaptoethanol, Natriumborhydrid, tertiäre Phosphine und Thiole wie Cystein, reduziertes Glutathionin, Thioglykolsäure und Cysteamin ein, ohne darauf beschränkt zu sein. DTT und 2-Mercaptoethanol können im Bereich von 0,5-200 mM eingesetzt werden, wobei 1-50 mM bevorzugte Konzentrationen darstellen. Das denaturierte und reduzierte Protein wird dann mit einem molaren Überschuss (bezogen auf die Konzentration des Reduktionsmittels) eines Dithiol-Reagenzes gemischt, welches, wenn es reduziert wird, als ein Cystein blockierendes Mittel wirken kann. Beispiele für nützliche Dithiol-Reagenzien, die, wenn sie reduziert werden, als Cystein blockierende Mittel wirken können, schließen Verbindungen ein, die Disulfidbindungen enthalten, wie Cystin, Cystamin, oxidiertes Glutathion, Dithioglykolsäure, 5,5'-Dithiobis(2-nitro-benzoesäure (Ellman's Reagenz), Pyridin-Disulfide, Verbindungen des Typs R-S-S-CO-OCH3, wobei R eine organische Verbindung ist, andere Derivate von Cystin wie Diformylcystin, Diacetylcystin, Diglycylcystin, Dialanylcystin, Diglutaminylcystin, Cystinyldiglycin, Cystinyldiglutamin, Dialanylcystin-Dianhydrid, Cystin-Phenylhydantoin, Homocystin, Dithiodipropionsäure, Dimethylcystin oder ein beliebiges Dithiol oder eine Chemikalie, das/die in der Lage ist, eine Disulfidaustauschreaktion einzugehen. Das Rückfalten des Proteins wird ausgelöst, indem die Konzentration des Denaturierungsmittels (unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden) verringert wird und indem der Disulfidaustausch durch die Zugabe eines Reduktionsmittels wie Cystein, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, reduziertem Glutathion, Thioglykolsäure oder einem anderen Thiol begünstigt wird. Vorzugsweise werden ein Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien gewählt, die die Bildung einer nativen Disulfidbindung und einen reversibel blockierten freien Cysteinrest zur Folge haben. Wahlweise kann ein Metallion wie Kupfer (Cu++) oder Kobalt (Co++) zu dem Rückfaltungsgemisch zugesetzt werden, um die Proteinoxidation zu begünstigen. Wahlweise kann Glycerin zu dem Rückfaltungsgemisch zugesetzt werden, um die Ausbeute an rückgefaltetem Protein zu erhöhen. Nützliche Konzentrationen von Glycerin im Rückfaltungsgemisch sind 1-50 % (Volumen/Volumen), wobei 10-20 % einen bevorzugten Bereich darstellt. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert des Rückfaltungsgemischs 6-10.
  • Obwohl es nicht gewünscht ist, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, dass die Cystein blockierenden Mittel, die in den vorliegenden Verfahren zum Einsatz kommen, kovalent an den „freien" Cysteinrest unter Bildung eines gemischten Disulfids binden, wodurch sie den freien Cysteinrest stabilisieren und eine Multimerisation und Aggregation des Proteins verhindern. Eine Anzahl von mit Thiol reagierenden Verbindungen können als Cystein blockierende Mittel verwendet werden, um Proteine, die freie Cysteine enthalten, zu stabilisieren. Zusätzlich zu Cystein, Cysteamin, Thioglykolsäure und reduziertem Glutathionin können Cystein blockierende Mittel auch Reagenzien einschließen, die Disulfidbindungen enthalten, wie Cystin, Cystamin, Dithioglykolsäure, oxidiertes Glutathion, 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (Ellman's Reagenz), Pyridin-Disulfide, Verbindungen des Typs R-S-S-CO-OCH3, andere Derivate von Cystin wie Diformylcystin, Diacetylcystin, Diglycylcystin, Dialanylcystin, Diglutaminylcystin, Cystinyldiglycin, Cystinyldiglutamin, Dialanylcystin-Dianhydride, Cystin-Phenylhydantoin, Homocystin, Dithiodipropionsäure, Dimethylcystin oder ein beliebiges Dithiol oder eine Chemikalie, das/die in der Lage ist, eine Disulfidaustauschreaktion einzugehen. Sulfenylhalogenide können ebenfalls dazu verwendet werden, gemischte Disulfide herzustellen. Andere Thiol blockierende Mittel, die bei der Stabilisierung von Proteinen, die freie Cysteinreste enthalten, Anwendung finden können, schließen Verbindungen ein, die in der Lage sind, mit freien Thiolen reversibel zu reagieren. Diese Mittel schließen bestimmte Schwermetallsalze oder organische Derivate von Zink, Quecksilber und Silber mit ein. Andere Mercaptid bildende Mittel oder mit Thiol reversibel reagierende Verbindungen werden von Cecil und McPhee (1959) und Torchinskii (1971) beschrieben.
  • Wahlweise wird das rückgefaltete lösliche Protein, das einen freien Cysteinrest enthält, zurückgewonnen und von anderen Proteinen in der löslichen Fraktion des Rückfaltungsgemischs isoliert. Solche Verfahren der Rückgewinnung und Reinigung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder werden leicht ermittelt, was zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Dialyse, Chromatographie, einschließlich Größenausschluss-, Innenaustausch-, hydrophobe Wechselwirkungs- und Affinitäts-Chromatographie-Verfahren und dergleichen einschließt. Ein geeignetes Verfahren für die Rückgewinnung und Hufreinigung eines gewünschten Proteins wird zum Teil von den Eigenschaften des Proteins und der beabsichtigten Anwendung abhangen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch neue Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven G-CSF-Proteinen, insbesondere Wildtyp-G-CSF, G-CSF(C17S), und G-CSF- und G-CSF(C17S)-Varianten, einschließlich Cystein-Varianten (zusammengefasst als „G-CSF-Proteine" bezeichnet) zur Verfügung, die zu einer signifikanten Zunahme im Prozentsatz der rückgewonnenen G-CSF-Proteine führen, welcher ordnungsgemäß prozessiert wurde und biologisch aktiv ist. Diese neuen Verfahren schließen das Sezernieren der G-CSF-Proteine in das Periplasma von E. coli unter Verwendung der stII-Signalsequenz, das Denaturieren und Rückfalten der unlöslichen oder aggregierten G-CSF-Proteine und das Reinigen der löslichen rückgefalteten G-CSF-Proteine von anderen Proteinen in der löslichen Fraktion des Renaturierungs/Rückfaltungsgemischs ein. Den zurückgewonnenen G-CSF-Proteinen fehlt der nicht natürliche N-terminale Methioninrest, der vorhanden ist, wenn G-CSF-Proteine intrazellulär in E. coli exprimiert werden. Veröffentlichte Berichte (Perez-Perez et al., 1995) beschreiben die Sekretion von G-CSF in das Periplasma von E. coli hinein unter Verwendung einer modifizierten ompA-Leader-Sequenz. Jedoch wurde nur sehr wenig des exprimierten ompA-G-CSF-Fusionsproteins ordnungsgemäß prozessiert, um reifes G-CSF zu liefern. Der Prozentsatz an ordnungsgemäß prozessierten G-CSF-Proteinen konnte auf 10-30 % der insgesamt exprimierten G-CSF-Proteine durch eine Co-Expression der dnaJ- und dnaK-Proteine von E. coli gesteigert werden. In allen Fällen waren die sezernierten G-CSF-Proteine in hohem Maße unlöslich und biologisch inaktiv. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ergeben mindestens 80-100 % an richtig prozessierten G-CSF-Proteinen und benötigen keine Co-Expression der dnaK- und dnaJ-Proteine. Die vorliegende Erfindung stellt auch, zum ersten Mal, Verfahren für die Denaturierung und Rückfaltung der unlöslichen, sezernierten G-CSF-Proteine in eine biologisch aktive Form zur Verfügung.
  • Die gereinigten Proteine, die gemäß dieser Verfahren erhalten werden, können, wenn gewünscht, weiter prozessiert werden. Zum Beispiel können die isolierten Proteine am freien Cysteinrest mit verschiedenen mit Cystein reagierenden Einheiten modifiziert werden. Zum Beispiel können die Proteine am freien Cysteinrest mit verschiedenen mit Cystein reagierenden PEG-Reagenzien PEGyliert werden und anschließend als monoPEGylierte Proteine gereinigt werden. Der Begriff „monoPEGyliert" ist so definiert, dass er ein Protein bedeutet, das durch eine kovalente Anheftung eines einzelnen PEG-Moleküls an das Protein modifiziert ist. Ein beliebiges Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, kann dazu verwendet werden, das PEGylierte Protein von unmodifiziertem Protein und nicht reagierten PEG-Reagenzien zu reinigen, was zum Beispiel die Verfahren einschließt, die in den Beispielen unten, und in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben sind. Beispiele für andere nützliche mit Cystein reagierende Einheiten sind mit Cystein reagierende Dextrane, mit Cystein reagierende Kohlenhydrate und mit Cystein reagierende Poly(N-vinylpyrrolidon)e.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit für die PEGylierung von Cysteinmuteinen von GH, G-CSF, GM-CSF, alpha-Interferon und anderen Proteinen, die 2N + 1 Cysteinreste enthalten, und von anderen Proteinen, die 2N Cysteinreste enthalten, wobei zwei oder mehr der Cysteinreste frei sind, insbesondere jene Muteine und Proteine, bei denen der freie Cysteinrest durch ein gemischtes Disulfid blockiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gereinigte, monoPEGylierte Proteinvarianten, die durch die hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden, welche nicht nur biologisch aktiv sind, sondern auch eine hohe spezifische Aktivität in proteinabhängigen Proliferationsassays von Sängerzellen beibehalten. Solche Proteinvarianten schließen zum Beispiel gereinigte, monoPEGylierte Cysteinmuteine von G-CSF, GH, GM-CSF und IFN-α2 ein. Zum Beispiel sind die biologischen Aktivitäten in vitro von bestimmten der hierin beschriebenen monoPEGylierten G-CSF-Varianten 3- bis 50-fach größer als die biologische Tätigkeit von G-CSF, das unter Verwendung von mit Amin reagierenden NHS-PEG-Reagenzien PEGyliert wurde.
  • Es gibt über 25 verschiedene IFN-α-Gene (Pestka et al., 1987). Die Mitglieder der IFN-α-Familie haben variierende Grade an Aminosäurehomologie gemein und weisen überlappende Sätze von biologischen Aktivitäten auf. Nicht-natürliche rekombinante IFN-αs, die dadurch erzeugt wurden, dass Regionen von verschiedenen IFN-α-Proteinen verbunden wurden, befinden sich in verschiedenen Stadien der klinischen Entwicklung (Horisberger und DiMarco, 1995). Ein nicht-natürliches "Consensus"-Interferon (Blatt et al., 1996), das die häufigste Aminosäure an jeder Position von IFN-α enthält, wurde ebenfalls beschrieben. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind auch für das Rückfalten anderer alpha-Interferon-Arten und nicht-natürlicher alpha-Interferon-Proteine, die einen freien Cysteinrest enthalten, nützlich. Nützliche Stellen und Regionen für die PEGylierung von Cysteinmuteinen von IFN-α2 sind direkt auf andere Mitglieder der IFN-α-Genfamilie und auf nicht-natürliche IFN-αs anwendbar. Kinstler et al. (1996) beschrieben ein monoPEGyliertes Consensus-Interferon, bei dem das Protein vorzugsweise am N-terminalen, nicht-natürlichen Methioninrest durch Amin- oder Amidbindungen monoPEGyliert ist. Die Bioaktivität des PEGylierten Proteins war bezogen auf das nicht modifizierte Consensus-Interferon etwa 5-fach verringert (Kinstler et al., 1996).
  • In einer Ausführungsform des monoPEGylierten G-CSF ist das Polyethylenglykol an die Region proximal zur Helix A von G-CSF gebunden, und das resultierende monoPEGylierte G-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 1000 pg/ml (etwa 50 pM), vorzugsweise weniger als etwa 100 pg/ml (etwa 5 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 20 pg/ml (etwa 1 pM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 15 pg/ml (etwa 0,7 pM) auf. Alternativ kann die Polyethylenglykoleinheit an den C-D-Loop bzw. die C-D-Schleife von G-CSF gebunden werden, und das resultierende monoPEGylierte G-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 1000 pg/ml (etwa 50 pM), vorzugsweise weniger als etwa 100 pg/ml (etwa 5 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 20 pg/ml (etwa 1 pM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 15 pg/ml (etwa 0,7 pM) auf. Alternativ kann die Polyethylenglykoleinheit an die Region, die distal von der Helix D von G-CSF liegt, gebunden werden, und das resultierende monoPEGylierte G-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 1000 pg/ml (etwa 50 pM), vorzugsweise weniger als etwa 100 pg/ml (etwa 5 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 20 pg/ml (etwa 1 pM) und am stärksten bevorzugt etwa 15 pg/ml (etwa 0,7 pM) auf. Kinstler et al., (1996) beschrieben ein monoPEGyliertes Wild typ-G-CSF, bei dem das Protein vorzugsweise am N-terminalen, nicht-natürlichen Methioninrest durch Amin- oder Amidbindungen monoPEGyliert ist. Es wurde berichtet, dass die Bioaktivität des monoPEGylierten G-CSF-Proteins um etwa 30% verringert war, bezogen auf das nicht modifizierte G-CSF, obwohl die EC50s nicht bereit gestellt wurden (Kinstler et al., 1996). Kinstler et al. (1996) bestimmten nicht, ob ein Modifizieren von anderen Aminosäuren in der Region proximal zur Helix A bei G-CSF mit PEG zu biologisch aktiven G-CSF-Proteinen führt. Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, andere Aminosäurepositionen in der Region proximal zur Helix A und in anderen Regionen in G-CSF zu offenbaren, wo PEG angeheftet werden kann, was zu biologisch aktiven monoPEGylierten G-CSF-Proteinen führt.
  • In einer Ausführungsform des monoPEGylierten GM-CSF wird das Polyethylenglykol an die Region proximal zur Helix A von GM-CSF gebunden, und das resultierende monoPEGylierte GM-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 14000 pg/ml (etwa 1000 pM), vorzugsweise weniger als etwa 1400 pg/ml (etwa 100 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 280 pg/ml (etwa 20 pM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 140 pg/ml (etwa 10 pM) auf. Alternativ kann die Polyethylenglykoleinheit an den B-C-Loop von GM-CSF gebunden werden, und das resultierende monoPEGylierte GM-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 14000 pg/ml (etwa 1000 pM), vorzugsweise weniger als etwa 1400 pg/ml (etwa 100 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 280 pg/ml (etwa 20 pM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 140 pg/ml (etwa 10 pM) auf. Alternativ kann die Polyethylenglykoleinheit an den C-D-Loop von GM-CSF gebunden werden, und das resultierende monoPEGylierte GM-CSF weist einen EC50 von weniger als etwa 14000 pg/ml (etwa 1000 pM), vorzugsweise weniger als etwa 1400 pg/ml (etwa 100 pM), stärker bevorzugt weniger als etwa 280 pg/ml (etwa 20 pM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 140 pg/ml (etwa 10 pM) auf.
  • In einer Ausführungsform des monoPEGylierten GH ist das Polyethylenglykol an die Region proximal zur Helix A von GH gebunden, und das resultierende monoPEGylierte GH weist einen EC50 von weniger als etwa 2000 ng/ml (etwa 100 nM), vorzugsweise weniger als etwa 200 ng/ml (etwa 10 nM), stärker bevorzugt weniger als etwa 20 ng/ml (etwa 1 nM) und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 2 ng/ml (etwa 0,1 nM) auf.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Proteinvarianten bereit, die an einander oder an eine chemische Gruppe kovalent gebunden oder konjugiert sein können, so dass sie Multimere höherer Ordnung wie Dimere, Trimere und Tetramere erzeugen. Solche Multimere höherer Ordnung können gemäß der Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, oder wie es in den Beispielen 2 und 20 beschrieben ist. Zum Beispiel kann eine solche Konjugation ein GH-, G-CSF-, GM-CSF- oder alpha-IFN-Addukt erzeugen, das ein größeres Molekulargewicht als das entsprechende native Protein aufweist. Chemische Gruppen, die für eine Kopplung geeignet sind, sind vorzugsweise nicht toxisch und nicht immunogen. Diese chemischen Gruppen würden Kohlenwasserstoffe oder Polymere wie Polyole einschließen.
  • Die "PEG-Einheit", die für eine Anheftung an die Cysteinvarianten der vorliegenden Erfindung zur Bildung von "PEGylierten" Proteinen nützlich ist, schließt ein beliebiges geeignetes Polymer, zum Beispiel ein linear- oder verzweigtkettiges Polyol ein. Ein bevorzugtes Polyol ist Polyethylenglykol, das ein synthetisches Polymer ist, das sich aus Ethylenoxid-Einheiten zusammensetzt. Die Ethylenoxid-Einheiten können so variieren, dass PEGylierte Proteinvarianten mit apparenten bzw. scheinbaren Molekulargewichten durch Größenausschluss-Chromatographie erhalten werden können, die im Bereich von etwa 10 000 bis größer als 500 000 kDa liegen. Die Größe der PEG-Einheit hat einen direkten Einfluss auf seine Halbwertszeit im Kreislauf (Yamaoka et al., 1994). Dementsprechend könnte man Proteinvarianten mit unterschiedlichen Kreislauf-Halbwertszeiten für bestimmte therapeutische Anwendungen oder bevorzugte Dosierungsregime durch das Variieren der Größe oder der Struktur der PEG-Einheit konstruieren. Somit umfasst die vorliegende Erfindung Proteinvarianten von GH, die ein apparentes Molekulargewicht von mehr als etwa 30 kDa und stärker bevorzugt mehr als etwa 70 kDa, wie es durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt wurde, aufweisen, mit einem EC50 von weniger als etwa 400 ng/ml (18 nM), vorzugsweise weniger als 100 ng/ml (5 nM), stärker bevorzugt weniger als etwa 10 ng/ml (0,5 nM) und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 2,2 ng/ml (0,1 nM). Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Proteinvarianten von G-CSF, die ein apparentes Molekulargewicht von mehr als etwa 30 kDa und stärker bevorzugt mehr als etwa 70 kDa, wie es durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt wurde, aufweisen, mit einem EC50 von weniger als etwa 100 ng/ml (5 nM), vorzugsweise weniger als 1000 pg/ml (50 pM), stärker bevorzugt weniger als 100 pg/ml (6 pM) und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 15 pg/ml (0,7 pM). Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Proteinvarianten von alpha-IFN (IFN-α), die ein apparentes Molekulargewicht von mehr als etwa 30 kDa und stärker bevorzugt von mehr als etwa 70 kDa, wie es durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt wurde, aufweisen, mit einem IC50 von weniger als etwa 1900 pg/ml (100 pM), vorzugsweise weniger als 400 pg/ml (21 pM), stärker bevorzugt weniger als 100 pg/ml (5 pM) und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 38 pg/ml (2 pM). Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Proteinvarianten von GM-CSF, die ein apparentes Molekulargewicht von mehr als etwa 30 kDa und stärker bevorzugt von mehr als etwa 70 kDa, wie es durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt wurde, aufweisen, mit einem EC50 von weniger als etwa 14 000 pg/ml (~1000 pM), vorzugsweise weniger als 1400 pg/ml (~100 pM), stärker bevorzugt weniger als 280 pg/ml (20 pM) und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 140 pg/ml (~1 pM).
  • Die reaktive PEG-Endgruppe für eine Cystein-Modifizierung schließt Vinylsulfon-, Maleimid- und Iodoacetyl-Einheiten ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die PEG-Endgruppe sollte für Thiole spezifisch sein, wobei die Reaktion unter Bedingungen stattfindet, die für das Protein nicht schädlich sind.
  • hGH-Antagonisten-Varianten können ebenfalls unter Verwendung eines durch ein hinzugefügtes Cystein variantes GH, wie in der PCT/US98/14497 und der PCT/US/00/00931 beschrieben, hergestellt werden. Leiden, die von der Verabreichung eines GH-Antagonisten profitieren würden, schließen Akromegalie, Augengefäßerkrankungen, diabetisches Nierenleiden, Restenose nach einer Angioplastie und auf Wachstumshormon ansprechende Malignitäten ein.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Derivat" auf eine beliebige Variante eines Proteins, das durch die vorliegenden Verfahren exprimiert und zurückgewonnen wird. Solche Varianten schließen PEGylierte Varianten, Dimere und andere Varianten höherer Ordnung, Aminosäuren-Varianten, trunkierte Varianten, Fusionsproteine, Änderungen bei Kohlenhydrat, Phophorylierung oder anderen gebundenen Gruppen, die man an natürlichen Proteinen findet, und beliebige andere Varianten, die hierin offenbart sind, ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • Die Verbindungen, die durch die vorliegenden Verfahren hergestellt werden, können für eine Vielzahl von in vitro- und in vivo-Anwendungen eingesetzt werden. Die Proteine und ihre Derivate der vorliegenden Erfindung können für Forschungs-, diagnostische oder therapeutische Zwecke angewendet werden, die für ihre Wildtyp-, natürlichen oder zuvor bekannten modifizierten Gegenstücke bekannt sind. In vitro-Anwendungen schließen zum Beispiel die Verwendung des Proteins zum Screenen, Detektieren und/oder Reinigen anderer Proteine ein.
  • Für therapeutische Anwendungen kann ein Fachmann auf dem Gebiet leicht die geeignete Dosis, die Häufigkeit der Dosierung und den Weg der Verabreichung bestimmen. Faktoren bei der Durchführung solcher Bestimmungen schließen, ohne Einschränkung, die Natur des zu verabreichenden Proteins, den zu behandelnden Zustand, die mögliche Patienten-Compliance, das Alter und Gewicht des Patienten und dergleichen ein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch als Zuführungsvehikel für eine Erhöhung der Kreislauf-Halbwertszeit der Therapeutika, die angeheftet sind, zum Einsatz kommen, oder um die Zuführung zu einem bestimmten Ziel innerhalb des Körpers zu lenken.
  • Die folgenden Beispiele sollen nicht einschränkend, sondern nur beispielhaft für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung sein.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Rückfaltung des Wachstumshormon-Muteins T3C
  • Verfahren zum Exprimieren, Reinigen und Bestimmen der biologischen in vitro- und in vivo-Aktivität des rekombinanten menschlichen Wachstumshormons (hGH) und hGH-Cysteinmuteinen sind in der PCT/US98/14497 und der PCT/US/00/00931 beschrieben. Verfahren zur Konstruktion von Cysteinmuteinen von hGH sind ebenfalls in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren zum Exprimieren von hGH in E. coli besteht darin, das Protein in das Periplasma unter Verwendung der STII-Leadersequenz zu sezernieren. Sezerniertes hGH ist löslich und kann mittels Säulenchromatographie gereinigt werden, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Bestimmte Cysteinmuteine vom hGH bleiben unlöslich, wenn sie in das Periplasma von E. coli unter Verwendung der STII-Leadersequenz sezerniert werden. Prozeduren zur Rückfaltung von unlöslichen, sezernierten hGH-Proteinen sind bisher nicht beschrieben worden. Die folgenden Protokolle wurden entwickelt, um unlösliche hGH-Cysteinmuteine zu einer biologisch aktiven Form rückzufalten.
  • Das unlösliche GH-T3C-Mutein (Threonin an der Position 3 ausgetauscht zu Cystein; beschrieben in PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 ) wurde in E. coli als ein Protein exprimiert, welches in den periplasmatischen Raum unter Verwendung der stII-Leadersequenz sezerniert wird, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Das T3C-Protein wurde solubilisiert und unter Anwendung der folgenden zwei Prozeduren rückgefaltet, wobei beide davon Cystein als ein Reduktionsmittel und als ein Cystein blockierendes Mittel verwenden, um den freien Cysteinrest zu stabilisieren. Kulturen (200 ml) eines E. coli-Stammes, welcher das T3C-Mutein exprimiert, wurden wachsen gelassen, und eine Expression von T3C wurde induziert, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Die Zellen wurden lysiert, und der unlösliche Teil wurde durch Zentrifugation isoliert, wie es im Beispiel 14 beschrieben ist. Das unlösliche Material, welches T3C enthielt, wurde in 20 ml 8 M Harnstoff, 20 mM Cystein, 20 mM Tris, pH 9, gelöst und durch Schütteln während einer Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Die Solubilisierungsmischung wurde als nächstes in zwei Teile aufgeteilt, wobei die Hälfte in 50 ml 10% Glyzerol, 20 mM Tris, pH 8, verdünnt wurde, und die andere Hälfte in 50 ml 0,5% TWEEN 20, 20 mM Tris, pH 8, verdünnt wurde. Die Rückfaltungen wurden bei 4°C 24 Stunden lang gehalten, bevor sie durch Zentrifugation geklärt wurden und auf eine 5 ml Q-Sepharose Hi Trap-Säule, welche im Voraus in 20 mM Tris, 0,5% Tween 20, pH 7,6, äquilibriert wurde, geladen wurden. Rückgefaltetes, lösliches T3C wurde von der Säule während eines 20-Säulenvolumen-Gradienten von 0-300 mM NaCl in 0,5% Tween 20, 20 mM Tris, pH 7,6, eluiert. Rückgewonnene Säulenfraktionen wurden durch nicht reduzierende SDS-PAGE analysiert. Monomeres T3C eluierte bei etwa 160 mM NaCl. Etwa 790 μg monomeres T3C wurde aus der Rückfaltung, die Glyzerol in dem Renaturierungspuffer enthielt, gewonnen. Etwa 284 μg monomeres T3C wurde aus der Rückfal tung gewonnen, wenn Tween 20 in dem Renaturierungspuffer vorlag. Die Ergebnisse geben an, dass lösliches, monomeres T3C-Protein unter Verwendung entweder der Rückfaltungs-/Renaturierungs-Prozedur erhalten werden kann. Basierend auf den größeren Rückgewinnungsausbeuten von monomerem T3C-Protein wurde Glyzerol als ein Stabilisierungsmittel in anschließenden Rückfaltungsexperimenten verwendet.
  • Beispiel 2
  • Vergleich von Reduktionsmitteln, die verwendet wurden, um das Wachstumshormons-Mutein T3C rückzufalten
  • Kulturen (200 ml) eines E. coli-Stammes, der T3C-Mutein exprimiert, wurden wachsen gelassen, und T3C wurde exprimiert, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Unlösliches T3C wurde isoliert, indem die Zellen mittels einer Detergens/Lysozym-Behandlung der Zellen lysiert wurden, wie es in den Beispielen 5 und 14 beschrieben ist. Dieses Material wurde in 20 ml 8 M Harnstoff, 20 mM Tris pH 9 suspendiert und in 3 Röhrchen aliquotiert. Dem ersten Röhrchen wurde kein Reduktionsmittel hinzugesetzt ("Rückfaltung A"), dem zweiten Röhrchen wurden 5 mM DTT hinzugesetzt ("Rückfaltung B"), und dem dritten Röhrchen wurden 20 mM Cystein hinzugesetzt ("Rückfaltung C"). Nach einer Stunde des Mischen bei Raumtemperatur wurden die Solubilisierungen in 30 ml 10% Glyzerol, 20 mM Tris, pH 8, verdünnt. Die Rückfaltungen wurden bei 4°C über Nacht gehalten. Am nächsten Tag wurden die Rückfaltungen mittels Zentrifugation geklärt und auf 5 ml Q-Sepharose Hi Trap-Säulen geladen, wie in der PCT/US/00/00931 beschrieben. Rückgewonnene Fraktionen wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert. Es wurde das T3C-Protein von der "Rückfaltung A" (kein Reduktionsmittel) gewonnen, welches als mehrere breite Peaks aus der Q-Sepharose-Säule eluiert wurde. Bei der SDS-PAGE lag bei dem rückgewonnenen Proteinprodukt etwas monomeres T3C-Protein vor, jedoch bestand es hauptsächlich aus aggregierten T3C-Dimeren (die bei 210 mM NaCl eluierten) und T3C-Multimeren (die zwischen 300 mM bis 1 000 mM NaCl) eluierten. Die endgültigen Rückgewinnungen von monomeren und dimeren T3C-Proteinen sind in der Tabelle 1 gezeigt. Das aus der "Rückfaltung B" (mit 5 mM DTT) rückgewonnene T3C-Protein eluierte als ein einzelner breiter Peak aus der Q-Sepharose-Säule, war jedoch heterogen bei nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse. Die monomere T3C-Bande war viel breiter als die Hypophysen-hGH-Bande und umfasste eine Vielzahl von im Molekulargewicht unterschiedlichen monomeren Spezies, welche wahrscheinlich unterschiedliche Disulfid-Isoformen vom T3C darstellten. Eine kleine Menge an dimerem T3C-Protein wurde ebenfalls in mehreren der Fraktionen nachgewiesen. Die "Rückfaltung C" (mit Cystein als Reduktionsmittel) ergab hauptsächlich monomeres T3C-Protein, welches anscheinend eine einzelne homogene Spezies war, wie es durch die Scharfe des Peaks, der von der Q-Sepharose-Säule bei 160 mM NaCl eluierte, und durch die Schärfe der Proteinbande bei dem korrekten Molekulargewicht (im Vergleich zum standardmäßigen Hypophysen-hGH), wenn mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert wurde, den Anschein hatte. Endgültige Rückgewinnungen von monomeren und dimeren Formen von T3C aus jeder der Rückfaltungen sind in der Tabelle 1 angegeben. Die Daten geben an, dass das T3C-Protein in Gegenwart von Cystein zu größeren Ausbeuten an löslichem monomerem T3C-Protein führte, als es die Solubilisierung/Rückfaltung des Proteins in Abwesenheit eines Reduktionsmittels oder in Gegenwart von DTT hervorrief. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls an, dass die Solubilisierung/Rückfaltung des T3C-Proteins in Gegenwart von Cystein eine stabilere, homogene Präparation von löslichem, monomerem T3C-Protein ergibt als die Solubilisierung/-Rückfaltung des Proteins in Abwesenheit eines Reduktionsmittels oder in Gegenwart von DTT. Tabelle 1 Ausbeuten an T3C-Proteinen, die unter Verwendung von verschiedenen Rückfaltungsprozeduren hergestellt wurden
    Rückfaltung Reduktionsmittel Monomeres T3C-Protein Ausbeute (μg)a Dimeres T3C-Protein Ausbeute (μg)a
    A keines 30 120
    B 5 mM DTT 370 25
    C 20 mM Cystein 534 225
    • a pro 66 ml E. coli-Kultur gewonnenes Protein
  • Das monomere T3C-Protein, welches aus der Rückfaltung B, welche DTT in der Solubilisierungsmischung enthielt, gewonnen wurde, kann zu stabilem, Disulfid-verknüpften homodimeren T3C-Protein umgewandelt werden, indem das Protein unter Bedingungen gestellt wird, welche die Disulfidbindungsbildung ermöglichen. Diese schließen Bedingungen ein, bei denen ein Oxidationsmittel dem Protein hinzugesetzt wird, oder durch die Zugabe eines zweiten Disulfidverknüpften Reagenz, welches in der Lage ist, eine Disulfidumordnung zu erfahren, wenn der pH-Wert fast neutral oder alkalisch ist. Beispiele für Oxidationsmittel, welche verwendet werden könnten, schließen Natriumtetrathionat oder Sauerstoff ein. Gegebenenfalls können Spurenmengen von zweiwertigen Metallionen, wie Kupfer oder Cobalt, hinzugesetzt werden, um die Reaktion zu katalysieren. Brauchbare Disulfid-verknüpfte Reagenzien schließen Cystin, Cystamin, oxidiertes Glutathion, Dithioglycolat oder andere niedermolekulargewichtige Dithiole ein. Alternativ kann monomeres T3C-Protein bei einem sauren pH-Wert gehalten werden, um eine Aggregation und unerwünschte Disulfidumordnungen zu verhindern.
  • Die gelösten, rückgefalteten GH-Cysteinmuteine, die gemäß den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Prozeduren hergestellt wurden, können mittels verschiedener chromatographischer Prozeduren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt werden. Diese chromatographischen Prozeduren schließen Innenaustausch-, Größenausschluss-, Hydrophobe-Wechselwirkungs(HIC)-, Metallchelatierungs-Affinitäts-Chromatographien (IMAC), Größenausschlusschromatographie (SEC), Umkehrphasenchromatographie oder eine Kombination von diesen Techniken ein. Als ein Beispiel können die GH-Muteine aus der löslichen Fraktion der rückgefalteten Mischung unter Verwendung eines Q-Sepharose-Fast-Flow-Harzes (Pharmacia), das in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, äquilibriert worden war, eingefangen werden. Die Säule kann mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen werden, und gebundene Proteine können mit 10-20 Volumina m linear ansteigendem Salzgradienten von 0 bis 250 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, eluiert werden. Gegebenenfalls kann Glyzerol (10% Endkonzentration) den Säulenpuffern hinzugesetzt werden. Fraktionen, welche die hGH-Muteine enthalten, können durch SDS-PAGE und Western-Blotting identifiziert werden. Alternative Harze, welche verwendet werden können, um hGH-Muteine aus der löslichen Fraktion des Rückfaltungs/Renaturierungs-Gemischs einzufangen, schließen HIC, andere Ionenaustauschharze oder Affinitätsharze ein.
  • Die Cysteinmuteine können ferner durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie gereinigt werden. Q-Sepharose-Säulenfraktionen, welche die GH-Muteine enthalten, können gepoolt bzw. vereinigt werden, und NaCl kann zu einer Endkonzentration von 2 M hinzugesetzt werden. Der vereinigte Ansatz kann auf ein Butyl-Sepharose-"Fast Flow"-Harz gegeben werden, das im Voraus in 2 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, äquilibriert wurde. GH-Muteine können aus dem Harz unter Verwendung eines umgekehrten Salzgradienten von 2 M bis 0 M NaCl in 20 mM Phosphat, pH 7,5, eluiert werden. Fraktionen, welche die GH-Muteine enthalten, können mittels SDS-PAGE und Western-Blotting identifiziert werden und vereinigt werden. Alternativ können die Q-Sepharosefraktionen, welche die GH-Muteine enthalten, vereinigt werden, und Ammoniumsulfat kann zu einer Endkonzentration von 2 M hinzugegeben werden, bevor sie auf eine Phenyl-Sepharose-Säule gegeben werden. Die GH-Muteine können von dem Harz unter Verwendung eines reversen Salzgradienten von 2 M bis 0 M Ammoniumsulfat in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, eluiert werden. Fraktionen, welche die GH-Muteine enthalten, können mittels SDS-PAGE und Western-Blotting identifiziert werden und vereinigt werden.
  • Wenn eine weitere Reinigung erwünscht ist, kann der HIC-Pool, welcher die GH-Muteine enthält, direkt auf ein Nickel-Chelatisierungsharz (Qiagen), das in 10 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,5, äquilibriert worden war, gegeben werden. Nach einem Waschschritt können die GH-Muteine unter Verwendung eines 0-30 mM Imidazolgradienten in 10 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,5, rückgewonnen werden. GH besitzt eine hohe Affinität für Nickel, angenommenermaßen durch die zweiwertige Metallbindungsstelle, die durch H18, H21 und E174 gebildet wird. Als ein Ergebnis kann GH in einer hochreinen Form unter Verwendung einer Metallchelatisierungssäule (Maisano et al., 1989) erhalten werden. Die GH-Muteine binden fest an die Nickelsäule und eluieren bei ähnlichen Imidazolkonzentrationen (etwa 15 mM) wie Wildtyp-GH. Alternativ kann eine Kupferchelatisierungssäule anstelle einer Nickel-Chelatisierungssäule verwendet werden.
  • Biologische Aktivitäten der gereinigten GH-Cysteinmuteine können unter Verwendung des Zellproliferations-Assays, welcher in der PCT/US00/00931 beschrieben wird, gemessen werden.
  • Proteinkonzentrationen können unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays (Bio-Rad Laborstories) bestimmt werden.
  • Das T3C-Mutein wurde wie folgt gereinigt. Eine 600 ml große Kultur von E. coli wurde wachsen gelassen, und die T3C-Protein-Expression wurde wie oben beschrieben induziert. Unlösliches T3C wurde isoliert, indem die Zellen mit einer Detergens/Lysozym-Mischung (B-PerTM, Pierce) behandelt wurden, wie es in den Beispielen 5 und 14 beschrieben ist. Das unlösliche Material wurde in 40 ml 8 M Harnstoff, 20 mM Tris, 20 mM Cystein, pH 9, suspendiert. Nach einer Stunde des Mischens bei Raumtemperatur wurde die Solubilisierungsmischung in 200 ml 15% Glyzerol, 20 mM Tris, pH 8, 40 μM Kupfersulfat verdünnt. Der Rückfaltungsansatz wurde bei 4°C über Nacht gehalten. Am nächsten Tag wurde der Rückfaltungsansatz durch Zentrifugation geklärt und auf eine 5 ml große Q-Sepharose Hi Trap-Säule, die in 10% Glyzerol, 20 mM Tris, pH 8, äquilibriert worden war, gegeben. T3C wurde durch Flution mit 20 Säulenvolumina eines Gradienten von 0-250 mM NaCl in 20 mM Tris, pH 8, 10% Glyzerol, rückgewonnen. Rückgewonnene Fraktionen wurden durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, welche vornehmlich T3C-Protein des korrekten apparenten Molekulargewichtes enthielten, wurden vereinigt. Vereinigte Fraktionen ergaben 4,6 mg an reinem T3C-Protein. Dieses Material wurde für die in Beispiel 3 beschriebenen PEGylierungs-Untersuchungen verwendet. Die biologische Aktivität des gereinigten T3C-Proteins wurde in dem in den Beispielen 1 und 2 und der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschriebenen GH-R4-Zellproliferations-Assay gemessen. Das T3C-Protein stimulierte die Proliferation der GH-R4-Zellen mit einer EC50 von 1,35 ng/ml.
  • Andere Cysteinmuteine vom GH, welche durch diese Prozedur hergestellt wurden, schließen *-1C, P2C, P5C, K38C, Q40C, K41C, S55C, S57C, T60C, Q69C, N72C, N99C, L101C, V102C, Y103C, D130C, S132C, P133C, R134C, T135C, Q137C, K140C, Q141C, T142C, Y143C, K145C, D147C, N149C, S150C, H151C, N152C, D153C, E186C und G187C ein. Die biologischen Aktivitäten von bestimmten der gereinigten GH-Cysteinmuteine wurden in dem in der PCT/US00/00931 beschriebenen GH-R4-Zellproliferations-Assay gemessen. Die beobachteten EC50-Werte für die Muteine *-1C, P2C, P5C, K38C, Q40C, S55C, N99C, L101C, V102C, Y103C, P133C, Q137C, K140C, Y143C, D147C, N149C, E186C und G187C lagen im Bereich von 0,7 ng/ml bis 2,2 ng/ml. Diese Werte sind fast alle nahezu äquivalent zu den beobachteten EC50-Werten für Wildtyp-GH-Kontrollen in diesen Assays, welche im Bereich von 0,3 ng/ml bis 1,5 ng/ml lagen.
  • Beispiel 3
  • Allgemeine Verfahren zur PEGylierung und Reinigung von PEGylierten Formen von Proteinen, die freie Cysteinreste enthalten
  • Proteine, welche freie Cysteinreste enthalten, können unter Verwendung einer Vielzahl von Cystein-reaktiven PEG-Maleimid(oder PEG-Vinylsulfonyl)-Reagenzien, welche im Handel ver fügbar sind, PEGyliert werden. Die rekombinanten Proteine werden im allgemeinen teilweise mit Dithiothreitol (DTT), Tris-(2-carboxyethyl)phosphin-HCl (TCEP) oder einem anderen Reduktionsmittel reduziert, um eine optimale PEGylierung des freien Cysteins zu erreichen. Das freie Cystein ist gegenüber Cystein-reaktiven PEGs relativ wenig reaktiv, wenn nicht dieser partielle Reduktionsschritt durchgeführt wird. Die Menge an Reduktionsmittel, die erforderlich ist, um jedes Mutein partiell zu reduzieren, kann empirisch unter Verwendung eines Bereiches von Reduktionsmittelkonzentrationen bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen bestimmt werden. Reduktionsmittelkonzentrationen variieren typischerweise von 0,5 äquimolar bis zu einem 10-fachem molarem Überschuss. Bevorzugte Temperaturen liegen bei 4°C bis 37°C. Der pH-Wert kann von 6,5 bis 9,0 reichen, liegt jedoch vorzugsweise bei 7,5 bis 8,5. Die optimalen Bedingungen variieren ebenfalls in Abhängigkeit von dem Reduktionsmittel und der Zeit der Aussetztung. Unter den angemessenen Bedingungen werden die am wenigsten stabilen Disulfide (üblicherweise intermolekulare Disulfide und gemischte Disulfide) eher als die thermodynamisch stabileren nativen Disulfide aufgebrochen. Typischerweise ist ein 5- bis 10-facher molarer Überschuss von DTT während 30 Minuten bei Raumtemperatur effektiv. Eine partielle Reduktion kann durch eine leichte Veränderung im Elutionsprofil des Proteins aus einer Umkehrphasensäule nachgewiesen werden. Eine partielle Reduktion kann durch eine leichte Veränderung im apparenten Molekulargewicht bei nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse der Proteinprobe nachgewiesen werden. Man muss darauf achten, das Protein nicht "überzureduzieren" und zusätzliche Cysteinreste zu exponieren. Eine Überreduktion kann durch Umkehrphasen-HPLC (das überreduzierte Protein wird eine Retentionszeit ähnlich den vollständig reduzierten und denaturierten Protein aufweisen) und durch das Auftreten von Proteinmolekülen, welche zwei PEGs nach der PEGylierungsreaktion enthalten (nachweisbar durch eine Änderung im apparenten Molekulargewicht mittels SDS-PAGE), nachgewiesen werden. Im Fall von Cysteinmuteinen kann das entsprechende Wildtypprotein als eine Kontrolle dienen, da es unter Bedingungen, welche die nativen intramolekularen Disulfide nicht reduzieren, nicht PEGyliert werden sollte. Überschüssiges Reduktionsmittel kann vor der PEGylierung durch Größenausschlusschromatographie oder durch Dialyse entfernt werden. TCEP muss nicht vor Zugabe des PEGylierungs-Reagenz entfernt werden, da es keine freie Thiolgruppe enthält. Das partiell reduzierte Protein kann mit verschiedenen Konzentrationen an PEG-Maleimimid oder PEG-Vinylsulfon (typischer PEG: Protein-Molverhältnisse von 1:1, 5:1, 10:1 und 50:1) umgesetzt werden, um das optimale Verhältnis der zwei Reagenzien zu bestimmen. Die PEGylierung des Proteins kann durch eine Veränderung im Molekulargewicht, zum Beispiel unter Verwendung von SDS-PAGE, überwacht werden. Die geringste Menge an PEG, welche signifikante Mengen an mono-pegyliertem Produkt erzeugt, ohne das di-pegylierte Produkt zu erhalten, wird typischerweise als wünschenswert angesehen. In einigen Fällen können bestimmte Additive die PEGylierungsausbeute erhöhen. Diese Additive schließen EDTA, Borat, Chaotrope (Harnstoff, Guanidin, organische Lösungsmittel), Detergenzien, osmolytische Stabilisatoren (Polyole, Zucker, Polymere, Aminosäuren und Derivate davon) und andere ionische Verbindungen (Citrat, Sulfate, Phosphate, quaternäre Amine, Chloride, Nitrate, Thiocyanate etc.) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Brauchbare Konzentrationen von EDTA sind 0,01-10 mM, wobei 0,5-1 mM bevorzugte Konzentrationen sind. Im allgemeinen kann mono-PEGyliertes Protein von nicht-PEGyliertem Protein und nicht reagiertem PEG mittels Größenausschluss-, Innenaustausch-, Affinitäts-, Umkehrphasen- oder hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie gereinigt werden. Fraktionen, die bezüglich des mono-PEGylierten Proteins (bei dem ein einzelnes PEG-Molekül an das Cysteinmutein gebunden ist) angereichert sind, können durch SDS-PAGE und/oder Western-Blotting identifiziert werden. Diese Fraktionen können vereinigt und gefroren gelagert werden. Die Anwesenheit des PEG-Restes ändert im allgemeinen die Affinität des Proteins bezüglich des Harzes, wodurch es dem PEGylierten Protein ermöglicht wird, von dem nicht-PEGylierten Protein getrennt zu werden. Andere Reinigungsprotokolle, wie die 2-phasige organische Extraktion oder die Salzpräzipitation, können auch zur Anwendung kommen. Das gereinigte PEGylierte Protein kann in den Zellproliferations/Inhibitions-Assays, die in den verschiedenen hierin beschriebenen Beispielen und in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben sind, getestet werden, um seine spezifische Aktivität zu bestimmen. Die in vivo-Effektivität der PEGylierten Proteine kann so bestimmt werden, wie es in den hierin vorgelegten Beispielen und in der PCT/US98/14497 und in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Experimente können durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass das PEG-Molekül an das Protein an der richtigen Stelle gebunden ist. Dies kann durch chemischen oder proteolytischen Verdau des Proteins, Reinigung des PEGylierten Peptids (welches ein hohes Molekulargewicht aufweisen wird) durch Größenausschluss-, Innenaustausch- oder Umkehrphasenchromatographie, gefolgt von einer Aminosäuresequenzierung bewerkstelligt werden. Die PEG-gekoppelte Aminosäure wird als eine Leerstelle in dem Aminosäure-Sequenzierlauf erscheinen.
  • Die folgenden Konditionen wurden verwendet, um das GH-Mutein-T3C zu PEGylieren und das PEGylierte T3C-Protein zu reinigen. Anfängliche PEGylierungs-Reaktionsbedingungen wurden unter Anwendung von Aliquots des rückgefalteten T3C-Proteins, das wie in Beispiel 2 beschrieben (unter Verwendung von Cystein als Reduktionsmittel und als Cystein-Blockierungsmittel, um das Protein zu solubilisieren und rückzufalten) hergestellt worden war, TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphin]-HCl als Reduktionsmittel und 5 kDa großen Cystein-reaktiven PEGs von Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama) bestimmt. Zwei μg große Aliquots von gereinigtem T3C wurden mit zunehmenden Konzentrationen an TCEP bei Raumtemperatur in 100 mM Tris, pH 8,5, in Gegenwart von verschiedenen Mengen an überschüssigem 5-kDa-Maleimid-PEG oder 5-kDa-Vinylsulfon-PEG inkubiert. Nach 120 Minuten wurden die Aliquots der Reaktionen sofort mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert. Bei einem pH-Wert von 8,5 ergab ein 5-facher molarer Überschuss an TCEP und ein 15-facher molarer Überschuss entweder an 5-kDa-Maleimid- oder 5-kDa-Vinylsulfon-PEG signifikante Mengen an mono-PEGyliertem T3C-Protein nach zwei Stunden ohne nachweisbares Di- oder Tri-PEGyliertes Protein. Das T3C-Mutein musste partiell durch die Behandlung mit einem Reduktionsmittel wie TCEP reduziert werden, um es zu PEGylieren. Wildtyp-GH PEGylierte unter identischen partiellen Reduktionsbedingungen nicht, was anzeigte, dass der PEG-Rest an den in das Mutein einge führten Cysteinrest gebunden war. Diese Bedingungen wurden verwendet, um die PEGylierungsreaktion zur Reinigung und Evaluierung der biologischen Aktivität einer Maßstabsvergrößerung zu unterziehen. Es wurde eine größere PEGylierungsreaktion (300 μg) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt, und zwar unter Anwendung eines 5-fachen Überschusses an TCEP und eines 15-fachen Überschusses an 10 kDa großem Maleimid-PEG. Am Ende der Reaktionszeit wurde die PEGylierungsmischung mit eiskaltem 20 mM Tris, 15% Glyzerol, pH 8,0, 2 X verdünnt und sofort auf eine Q-Sepharose-Säule (1 ml, HiTrap) geladen. PEGyliertes T3C wurde von der Säule eluiert, indem ein 20 ml großer Gradient von 0-0,2 M NaCl in 20 mM Tris, 15% Glyzerol, pH 8, laufen gelassen wurden. Die Anwesenheit des PEG-Restes senkte die Affinität des Proteins für das Harz, wodurch es ermöglicht wurde, dass das PEGylierte Protein von dem nicht-PEGylierten Protein getrennt wurde. Fraktionen, die mit mono-PEGyliertem T3C (ein einzelnes PEG-Molekül, angeheftet an dem T3C-Monomer) angereichert war, wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, vereinigt und eingefroren. Das mono-PEGylierte T3C-Protein eluierte bei etwa 80 mM NaCl, und sein apparentes Molekulargewicht gemäß SDS-PAGE betrug etwa 30 kDa.
  • 10K-PEG-T3C, 20K-PEG-T3C und 40K-PEG-T3C wurden ebenfalls durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt. Die Bioaktivität der gereinigten PEG-T3C-Proteine wurde in dem Zellproliferations-Assay, das in den Beispielen 1 und 2 und der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben ist, gemessen, um deren spezifische Aktivität zu bestimmen. Die PEG-T3C-Proteine stimulierten die Proliferation von GH-R4-Zellen ähnlich zu Wildtyp-GH und nicht-PEGyliertem T3C-Protein. Der EC50-Wert für das 5K-PEG-T3C-Protein betrug 1,2 ng/ml, der EC50-Wert für das 10K-PEG-T3C betrug 1,2 ng/ml, und der EC50-Wert für das 20K-PEG-T3C betrug 3-4 ng/ml. Der EC50-Wert für das 40K-PEG-T3C kann unter Verwendung des Zellproliferations-Assays, das in den Beispielen 1 und 2 und der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben ist, bestimmt werden. Die in vivo-Effektivität von PEG-T3C und anderen PEGyliertem GH-Cysteinmuteinen kann so bestimmt werden, wie es in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 und dem Beispiel 4 beschrieben wird.
  • Andere Cystein-Mutanten von GH, welche gemäß den oben skizzierten Prozeduren PEGyliert und gereinigt wurden, schließen P2C, P5C, S132C, P133C und R134C ein. Die biologischen Aktivitäten dieser Muteine, welche mit 20-kDa-PEG-Resten modifiziert wurden, wurden unter Anwendung des Zellproliferations-Assays, das in den Beispielen 1 und 2 und der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben ist, gemessen. Die festgestellten EC50-Werte für diese PEGylierten Muteine lagen im Bereich von 1,7 ng/ml bis 6,0 ng/ml. Diese Werte sind ähnlich zu, jedoch etwas höher als die festgestellten EC50-Werte für Kontrollassays mit Wildtyp-GH, welche parallel durchgeführt wurden. Die EC50-Werte für diese Kontrollen mit Wildtyp-GH lagen im Bereich von 0,6 ng/ml bis 1,2 ng/ml.
  • Beispiel 4
  • Das PEGT3C-Wachstumshormon stimuliert das somatische Wachstum in Ratten mit Wachstumshormonmangel
    • A. Die Fähigkeit von PEG-T3C, das somatische Wachstum zu stimulieren, wurde in hypophysektomierten (HYPOX) Ratten bestimmt, welche aufgrund der Entfernung ihrer Hypophysen nicht in der Lage sind, das Wachstumshormon zu synthetisieren. Männliche HYPDX-Sprague-Dawley-Ratten wurden von einem kommerziellen Hersteller gekauft, und sie wogen etwa 90 g. Die Ratten wurden 13 Tage lang akklimatisiert. Tiere, welche mehr als 4 g während der Akklimatisierung zunahmen, wurden aus der Studie ausgeschlossen. Körpergewichtsmessungen wurden zur selben Zeit an jedem Tag vorgenommen (9:30 am Vormittag). Ratten wurden bezüglich des Gewichtes auf die verschiedenen Testgruppen randomisiert. Es gab 5 Ratten pro Gruppe, außer für die Gruppe, welche jeden Tag Dosen von 20kDa-PEG-T3C erhielten, in welcher sich nur vier Ratten befanden. Die Ratten wurden täglich gewogen, und es wurden ihnen täglich oder jeden zweiten Tag subkutane Injektionen an Placebo (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), welche 200 μg/ml Rattenserumalbumin (Sigma Chemical Company) enthielt), einem kommerziellen rekombinanten humanen Wachstumshormon, Nutropin®, oder verschiedene Dosen an 20kDa-PEG-T3C, das wie im Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden war, gegeben. Alle Proteinlösungen wurden in PBS, das 200 μg/ml Rattenserumalbumin enthielt, hergestellt. Die Tiere wurden während 9 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt. Am Tag 10 wurden die Tiere getötet, und ihre Tibien wurden geerntet. Die Tibien wurden in 10%igem neutral gepufferten Formalin fixiert. Die fixierten Tibien wurden in 5% Ameisensäure decalcifiziert und am proximalen Ende in der Frontalebene gespalten. Die Tibien wurden für eine Paraffin-Einbettung prozessiert und zu 8 Mikrometer in Schnitte aufgeteilt und mit Toluidinblau angefärbt. Die Breite der tibialen Physe wurde an der linken Tibia (5 Messungen pro Tibia) gemessen. Die kumulative Körpergewichtszunahme und die tibialen Epiphysenmessungen für die unterschiedlichen Testgruppen sind in der Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass 20-kDa-PEG-T3C die Körpergewichtszunahme und das Knochenwachstum in Ratten mit Wachstumshormonmangel stimuliert.
  • Tabelle 2 Wirkungen der täglichen oder jeden zweiten Tag vorgenommenen Verabreichung von Placebo, Nutropin oder 20-kDa-PEG-T3C auf die Körpergewichtszunahme und die tibiale Epiphysenbreite in hypophysektomierten Ratten
    Verbindung Dosis Injektionshäufigkeit Kumulative Körpergewichtszunahme (Gramm) Tibiale Epiphysenbreite (Durchschnitt +/- Standardabweichung (um)
    Placebo - Jeden Tag -1,0 +/- 0,707 206,8 +/- 9,2
    Nutropin 10 μg/Injektion Jeden Tag 11,2 +/- 0,97a 348,8 +/- 8,6a
    20-kDa-PEG-T3C 10 μg/Injektion Jeden Tag 14,3 +/- 0,75a 333,0 +/- 9,8a
    Placebo - Jeden zweiten Tag 0,6 +/- 1,03 204,4 +/- 8,6
    Nutropin 10 μg/Injektion Jeden zweiten Tag 8,6 +/- 1,12b 298,8 +/- 10,1b
    20-kDa-PEG-T3C 10 μg/Injektion Jeden zweiten Tag 15,4 +/- 0,68 ba,c 357,2 +/- 7,7b
    20-kDa-PEG-T3C 2 μg/Injektion Jeden zweiten Tag 5,6 +/- 0,51b 274,8 +/- 9,0b
    20-kDa-PEG-T3C 0,4 μg/Injektion Jeden zweiten Tag -0,2 +/- 0,66 225,2 +/- 10,0b
    • a p < 0,05 gegenüber der täglichen Verabreichung von Placebo unter Anwendung eines zweischwänzigen T-Tests
    • b p < 0,05 gegenüber der jeden zweiten Tag vorgenommenen Placeboverabreichung unter Anwendung eines zweischwänzigen T-Tests
    • c p < 0,05 gegenüber einer jeden zweiten Tag vorgenommenen Nutropinverabreichung unter Verwendung eines zweischwänzigen T-Tests
    • B. Ein zweites Experiment wurde so durchgeführt, wie es für das Beispiel 4.A. beschrieben wurde, außer dass die Testverbindungen durch täglich vorgenommene oder jeden dritten Tag vorgenommene subkutane Injektion verabreicht wurden. Darüber hinaus wurde eine Dosis an mit einem 40-kDa-PEG modifizierten T3C getestet. Männliche HYPDX-Sprague-Dawley-Ratten wurden von einem kommerziellen Vertreiber gekauft, und sie wogen etwa 100 g. Die Körpergewichtsmessungen wurden zum gleichen Zeitpunkt jeden Tag durchgeführt. Ratten wurden bezüglich des Gewichtes auf verschiedene Testgruppen randomisiert. Es gab 5 Ratten pro Gruppe, außer für die Testgruppe, welche 40-kDa-PEG-T3C erhielt. Ratten wurden täglich gewogen, und es wurden ihnen täglich oder jeden dritten Tag subkutane Injektionen an Placebo (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 200 μg/ml Rattenserumalbumin (Sigma Chemical Company) enthielt), an einem kommerziellen rekombinanten humanen Wachstumshormon, Nutropin®, und an verschiedenen Dosen von 20-kDa-PEG-T3C oder 40-kDa-PEG-T3C verabreicht. Die PEG-T3C-Proteine wurden so hergestellt, wie es im Beispiel 3 beschrieben wurde. Alle Proteinlösungen wurden in PBS hergestellt, welches 200 μg/ml Rattenserumalbumin enthielt. Tiere wurden 9 aufeinanderfolgende Tage lang behandelt. Am zehnten Tag wurden die Tiere geopfert, und ihre Tibien wurden geerntet und für eine Herstellung von Schnitten so präpariert, wie es im Beispiel 4.A. beschrieben ist. Die kumulative Körpergewichtszunahme und die Tibia-Epiphyse breiten für die unterschiedlichen Testgruppen sind in der Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass 20-kDa-PEG-T3C und 40-kDa-PEG-T3C die Körpergewichtszunahme und das Knochenwachstum in Ratten mit Mangel an Wachstumshormon stimulieren.
  • Tabelle 3 Wirkung der täglichen oder jeden dritten Tag gegebenen Verabreichung von Placebo, Nutropin, 20kDa-PEGT3C oder 40kDa-PEGT3C auf die Körpergewichtszunahme und die tibialen Epiphysenbreiten in hypophysektomierten Ratten
    Verbindung Dosis Injektionshäufigkeit Kumulative Körpergewichtszunehme (Gramm) Tibiale Epiphysenbreite (Durchschnitt +/- Standardabweichung (μm)
    Placebo - Jeden Tag 0,8 +/- 0,685 223 +/- 15,1
    Nutropin 30 μg/Injektion Jeden Tag 21,3 +/- 1,432 408,4 +/- 14,2
    Nutropin 10 μg/Injektion Jeden Tag 16,2 +/- 1,232 399,6 +/- 15,6
    20-kDa-PEG-T3C 10 μg/Injektion Jeden Tag 18,6 +/- 2,215 384,4 +/- 13,0
    Placebo - Jeden dritten Tag 1,5 +/- 1,370 231,6 +/- 17,4
    Nutropin 30 μg/Injektion Jeden dritten Tag 6,8 +/- 1,385 315,2 +/- 15,6
    Nutropin 10 μg/Injektion Jeden dritten Tag 8,0 +/- 1,614 284,0 +/- 6,9
    20-kDa-PEG-T3C 30 μg/Injektion Jeden dritten Tag 17,5 +/- 1,162 428,4 +/- 18,3
    20-kDa-PEG-T3C 10 μg/Injektion Jeden dritten Tag 12,3 +/- 0,792 329,2 +/- 15,6
    20-kDa-PEG-T3C 2 μg/Injektion Jeden dritten Tag 8,0 +/- 1,379 263,2 +/- 7,1
    40-kDa-PEG-T3D 10 μg/Injektion Jeden dritten Tag 17,2 +/- 0,868 360,5 +/- 21,9
  • Beispiel 5
  • Rückfaltung und Reinigung von IFN-α2-Cysteinmuteinen
  • Verfahren zum Exprimieren, Reinigen und Bestimmen der biologischen in vitro- und in vivo-Aktivität von rekombinantem humanem Alpha-Interferon 2 (IFN-α2) und IFN-α2-Cysteinmuteinen sind in der PCT/US00/00931 beschrieben. Verfahren zum Konstruieren von Cysteinmuteinen von IFN-α2 und bevorzugte Stellen innerhalb des IFN-α2-Proteins für die Orte von hinzugefügten Cysteinresten sind ebenfalls in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben. Die folgenden Muteine wurden in E. coli unter Anwendung dieser Verfahren konstruiert: C1S, Q5C, 43C44, N45C, Q46C, F47C, Q48C, A50C, D77C, C98S, Q101C, T106C, E107C, T108C, S163C, E165C, *166C, D2C, L3C, T6C, S8C, T52C, G102C, V103C, G104C, V105C, P109C, L110C, M111C, S160C, L161C, R162C und K164C. Ein bevorzugtes Verfahren zum Exprimieren von IFN-α2 in E. coli ist es, das Protein in das Periplasma unter Verwendung der STII-Leader-Sequenz zu sezernieren. Eine Fraktion des sezernierten IFN-α2 ist löslich und kann mittels Säulenchromatographie gereinigt werden, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Bestimmte Cysteinmuteine von IFN-α2 bleiben unlöslich, wenn sie in das E. coli- Periplasma unter Verwendung der STII-Leader-Sequenz sezerniert werden. Die SDS-PAGE-Analyse der osmotischen Schocküberstände der Muteine zeigten meistens, dass sie verringerte (im Vergleich zum Wildtyp) Spiegel der 19 kDa rIFN-α2-Bande aufweisen. Die SDS-PAGE-Analysen von Ganz-Zelllysaten und des unlöslichen Materials von den osmotischen Schocks enthüllten, dass diese Muteine in relativ hohen Spiegeln exprimiert wurden, sich jedoch hauptsächlich in einer unlöslichen Form angenommenermaßen im Periplasma akkumulierten. Diese Proteine wanderten zusammen mit Wildtyp-rIFN-α2-Standards unter reduzierenden Bedingungen, was anzeigte, dass der STII-Leader entfernt worden war. Qualitative Bestimmungen von relativen Expressionsspiegeln der Muteine sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Prozeduren zur Rückfaltung von unlöslichen, sezernierten IFN-α2-Proteinen sind bisher nicht beschrieben worden. Das folgende Protokoll (hierin als "Protokoll P" bezeichnet) wurde entwickelt, um IFN-α2-Cysteinmuteine in einer biologisch aktiven Form zu exprimieren und rückzufalten.
  • Zur Expression von IFN-α2-Cysteinmuteinen und IFN-α2 wurden üblicherweise eine 325 ml große Kultur in einem 2 Liter großen Schüttelkolben oder eine 500 ml große Kultur in einem 2 Liter großen Schüttelkolben mit Prallwänden bei 37°C in einem gyrotorischen Schüttelwasserbad bei ~170-220 U/min wachsen gelassen. Kulturen wurden wachsen gelassen, induziert, geerntet und einem osmotischen Schock unterzogen, wie es in der PCT/US00/00931 beschrieben ist. Resultierende Überstände und Pellets wurden sofort verarbeitet oder bei -80°C gelagert.
  • IFN-α2 Cysteinmuteine, welche als unlösliche Proteine in den osmotischen Schockpellets gewonnen worden waren, wurden denaturiert, reduziert und zu ihren korrekten Konformationen unter Anwendung der folgenden Rückfaltungsprozedur rückgefaltet. Das Pellet aus dem osmotischen Schocklysat wurde zuerst mit B-PERTM-Bakterienprotein-Extraktionsreagens behandelt, wie es von dem Hersteller (Pierce) beschrieben worden ist. B-PER ist eine milde Detergensmischung, welche die E. coli-Membranen aufbricht und den cytoplasmatischen Inhalt der Zellen freisetzt. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser resuspendiert und rezentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 5 ml 6 M Guanidin, 50 mM Cystein in 20 mM Tris-Base solubilisiert. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, bevor sie über Nacht bei 4°C gegen 400 ml 40 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 8,0, dialysiert wurde. Am nächsten Tag wurde der pH-Wert des Rückfaltungsgemischs auf 3,0 eingestellt, und die Mischung wurde zentrifugiert, bevor sie auf eine S-Sepharose-Säule geladen wurde, gefolgt von einer Cu++-IMAC-Säule, wie für die Reinigung von rIFN-α2 aus dem osmotischen Schockliberstand in der PCT/US00/00931 beschrieben. Sechs IFN-α2-Cysteinmuteine: Q5C, C98S, Q101C, T106C, E107C und *166C sind unter Anwendung dieser Prozeduren rückgefaltet und gereinigt worden. Ähnliche Prozeduren können angewandt werden, um unlösliches Wildtyp-IFN-α2 rückzufalten und zu reinigen.
  • Die nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analyse von gereinigten Q5C-, C98S-, Q101C-, T106C-, E107C- und *166C-Cysteinmuteinen zeigte, dass die Muteine vornehmlich als Monomere ge wohnen wurden, welche bei dem erwarteten Molekulargewicht von ~19 kDa wanderten. C98S wanderte mit einem etwas höheren Molekulargewicht als die anderen rINF-α2-Muteine aufgrund der Abwesenheit der nativen Cysl-Cys-98-Disulfidbindung. Einige der gereinigten Muteine enthielten kleine Mengen an Disulfid-verknüpften rIFN-α2-Dimeren. Die Molekulargewichte der Dimerspezies betrug etwa 37-38 kDa.
  • Wenn eine Vielzahl von Cysteinmuteinen von IFN-α2 verarbeitet wurde, wurde festgestellt, dass bestimmte Cysteinmuteine anscheinend sowohl in den löslichen als auch unlöslichen Fraktionen nach der Zelllyse vorlagen. Die Verhältnisse von löslichem zu unlöslichem IFN-α2-Protein variierte von Mutante zu Mutante. Deshalb wurde eine alternative Solubilisierung/Rückfaltungs-Prozedur (hierin als "Protokoll II" bezeichnet), welche einen Ganzzell-Solubilisierungsschritt beteiligte, entwickelt, um die Rückgewinnung der IFN-α2-Cysteinmuteine zu erhöhen. Es wurde eine Modifizierung der Kulturverfahren gefunden, um die Effizienz der Prozessierung der STII-Leadersequenz zu verbessern, und sie wurde angewandt, um IFN-α2-Cysteinmuteine für die Rückfaltung und Reinigung zu exprimieren, wie unten ausführlich aufgeführt. Bei dem modifizierten Verfahren wurden 325-400 ml große Kulturen in LB-Medium, das 100 mM MES, pH 5,0, und 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C enthielt, unter kräftigem Schütteln, z. B. 220-250 U/min in einem New Brunswick C25KC-Umgebungsschüttler auf eine Zelldichte von 0,5-0,7 OD bei 600 nm wachsen gelassen. Kulturen wurden dann induziert durch Zugabe von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) auf eine Endkonzentration von 0,5 mM, und nach der Induktion wurde die Temperatur auf 28°C gesenkt, und die Schüttlergeschwindigkeit wurde auf 140 U/min verringert. Induzierte Kulturen wurden über Nacht (14-18 Stunden) inkubiert und durch Zentrifugation geerntet. Zellpellets wurden sofort verarbeitet oder bei -20°C oder -80°C bis zur Verarbeitung gelagert. Die Zellpellets, welche von einer 325-400 ml großen induzierten Kultur herrührten, wurden zuerst in 10 ml 8 M Guanidin, 20 mM Cystein, 20 mM Mes, 2% Tween 20, pH 3, suspendiert und so lange gemischt, bis eine homogene Suspension vorlag. Der pH-Wert wurde dann auf einen pH-Wert von 8-9 erhöht, und die Solubilisierungsmischung wurde 3 Stunden lang gerührt. Das Zelllysat wurde als nächstes auf 1:20 mit eiskaltem Renaturierungspuffer (20 mM Tris, pH, 0,3 M Guanidin, 1 M Harnstoff, 40 μm Kupfersulfat, pH 8) verdünnt. Die trübe Suspension ließ man dann 1-2 Tage lang bei 4°C zum Absetzen stehen. Der Rückfaltungsansatz wurde durch Zentrifugation geklärt, gefolgt von einer pH-Einstellung auf 3 und einer zweiten Runde der Zentrifugation. Der Überstand wurde auf 1:4 mit kaltem Wasser verdünnt und auf eine 5 ml große S-Seph Hi Trap geladen. Die Ionenaustauschsäule wurde mit einem 100 ml-Gradienten von 0-70% Puffer B, wobei Puffer A 20 mM Mes, pH 5, war, und Puffer B 10% Ethylenglykol, 500 mM NaCl, 20 mM Mes pH 5, war, eluiert. Alternativ können rückgefaltete IFN-α-Cysteinmuteine aus dem Rückfaltungsgemisch unter Verwendung einer HIC-Säule, wie einer Phenyl-Sepharose-Säule, eingefangen werden. Das Rückfaltungsgemisch wird zuerst zentrifugiert, Ammoniumsulfat wird dem Überstand auf eine Endkonzentration von 10% hinzugesetzt, die Mischung wird erneut zentrifugiert, und der Überstand wird auf eine 10 ml-Phenyl-Sepharose-Säule, die in 10% Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 8, äquilibriert wurde, geladen.
  • IFN-α-Cysteinmuteine werden aus der Säule unter Verwendung eines 100 ml großen linearen Gradienten aus 10% Ammoniumsulfat, 20 mM Tris pH 8 zu 30% Ethylenglykol, 20 mM Tris, pH 8, eluiert. Der Interferon-Pool aus einer Phenyl-Sepharose-Säule kann weiter unter Verwendung einer Kupfer-Chelatisierungs-Säule, S-Sepharose-Säule oder beidem gereinigt werden.
  • Interferon-Cysteinmuteine können ebenfalls unter Verwendung von anderen Reduktionsmitteln solubilisiert und rückgefaltet werden, welche auch als Cystein-Blockiermittel wirken. Die Substitution von reduziertem Glutathion, Thioglykolsäure oder Cysteamin für Cystein in den Solubilisierungs-/Rückfaltungs-Gemischen ergab rückgefaltete lösliche IFN-Cysteinvarianten, welche nach den in Beispiel 7 beschriebenen Prozeduren gereinigt und PEGyliert werden konnten. Wenn kein Reduktionsmittel oder 20 mM DTT für Cystein in den Solubilisierungs-/Rückfaltungs-Gemischen substituiert wurde, waren die Ausbeuten an rückgefalteten, löslichen IFN-Cysteinmuteinen auf nicht nachweisbare Spiegel gesenkt, als das Rückfaltungsgemisch mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert wurde. Darüber hinaus wurde kein rückgefaltetes, lösliches IFN-Cysteinmutein nach der S-Sepharose-Chromatographie des Rückfaltungsgemischs gewonnen, wenn kein Reduktionsmittel oder 20 mM DTT für Cystein in den Solubilisierungs-/Rückfaltungs-Gemischen substituiert wurden.
  • Die folgenden Muteine wurden in E. coli exprimiert, rückgefaltet und unter Verwendung vom Protokoll II gereinigt: C1S, Q5C, 43C44, N45C, F47C, Q48C, A50C, C98S, Q101C, T106C, E107C, S163C, E165C, *166C, D2C, L3C, T6C, S8C, T52C, G102C, V103C, G104C, V105C, P109C, L110C, M111C, S160C, L161C, R162C und K164C. Diese Rückfaltungsansätze wurden bei einem pH-Wert von 8 oder in einigen Fällen von 7,5 durchgeführt.
  • Beispiel 6
  • Bioaktivitäten von IFN-α2-Cysteinmuteinen
  • Biologische Aktivitäten der gereinigten Q5C-, C98S-, Q101C-, T106C-, E107C- und *166C-IFN-α2-Cysteinmuteine, welche unter Anwendung von Protokoll I vom Beispiel 5 gereinigt wurden, wurden im Daudi-Wachstums-Inhibitionsassay, das in der PCT/US00/00931 beschrieben ist, gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung von Bradford-, oder BCA-Proteinassay-Kits (Bio-Rad Laborstories und Pierce) bestimmt. Kommerzielles Wildtyp-rIFN-α2 und rIFN-α2, hergestellt wie in der PCT/US00/00931 beschrieben, wurden parallel an den gleichen Tagen analysiert, um die zwischen unterschiedlichen Tagen vorliegende Variabilität in den Assays zu kontrollieren. Die Muteine inhibierten die Proliferation von Daudi-Zellen im gleichen Ausmaß wie Wildtyp-rIFN-α2-Kontrollproteine, mit dem gleichen Fehler des Assays. Durchschnittliche IC50-Werte für fünf der Muteine (Q5C, Q101C, T106C, E107C und *166C) waren ähnlich zu den durchschnittlichen IC50-Werten der Wildtyp-rIFN-α-Proteine, die im Bereich von 15-18 pg/ml lagen. Der durchschnittliche IC50-Wert für das C98S-Protein belief sich auf 28 pg/ml. Diese Daten sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4 Expression und in vitro-Bioaktivitäten von IFN-α2-Cysteinmuteinen
    IFN-α2-Protein Mutation-Lage Relative Expression Untersuchte Form Durchschnittlicher IC50 (pg/ml) IC50-Bereich3 (pg/ml)
    Gesamt Zellulär1 Prozent Löslich2
    rIFN-α24 - 16 +/- 7 8-29 (n = 10)
    rIFN-α25 ++++ ~33 Löslich 13 +/- 4 7-19 (n = 10)
    CIS N-terminale Region +/- 0
    Q5C N-terminale Region ++++ ~20 Rückgefaltet 17 15, 17, 20
    43C44 A-B-Loop ++ 0
    N45C A-B-Loop ++ 0
    Q46C A-B-Loop +/- 0
    F47C A-B-Loop ++++ ~5
    Q48C A-B-Loop +/- 0
    A50C A-B-Loop +/- 0
    D77C B-C-Loop +/- 0
    C98S C-Helix7 +++++ ~5-10 Rückgefaltet 28 22, 30, 32
    Q101C C-D-Loop +++++ ~5-10 Rückgefaltet 18 10, 22, 23
    T106C C-D-Loop +++++ ~5-10 Rückgefaltet 18 18, 18
    E107C C-D-Loop +++++ ~5-10 Rückgefaltet 18 8, 22, 24
    T108C C-D-Loop +/- 0
    S163C C-terminaler Bereich ++++ ~33
    E165C C-terminaler Bereich +++ ~20
    *166C C-Terminus +++ ~20 Rückgefaltet 15 8, 16, 20
    • 1 Relative Akkumulation des IFN-α2-Proteins in Ganzzellextrakten
    • 2 Anteil des IFN-α2-Proteins im osmotischen Schocküberstand, bestimmt durch SDS-PAGE- Gele
    • 3 IC50-Werte von einzelnen Experimenten. Ein Bereich ist gezeigt, wenn N > 5 ist.
    • 4 Kommerzielles Wildtyp-rIFN-α2 (Endogen, Inc.)
    • 5 Wildtyp-rIFN-α2, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
    • 6 Mutation erzeugt ein freies Cystein (C98) in der C-Helix
    • 7 Mutation erzeugt ein freies Cystein (C1) in der N-terminalen Region
  • Die biologischen Aktivitäten der folgenden Muteine, gereinigt unter Anwendung von Protokoll II vom Beispiel 5, wurden in dem Daudi-Wachstumsinhibitionsassay gemessen, welches in der PCT/US00/00931 beschrieben ist: C1S, D2C, L3C, S8C, N45C, F47C, C98S, V103C, V105C, E107C, M111C, R162C, S163C, K164C, E165C und *166C. Die beobachteten IC50-Werte sind in der Tabelle 5 zusammen mit den IC50-Werten für in den gleichen Experimenten verwendete Wildtyp-rIFN-α-Protein-Kontrollen aufgelistet. Tabelle 5 In vitro-Bioaktivitäten von durch das Protokoll II gereinigten IFN-α2-Cysteinmuteinen, mit und ohne PEGylierung
    IFN-α2-Mutante Lage der Mutation IC50' (pg/ml) IC50 (pg/ml), 20K-PEG-Proteins1
    rIFN-α22 - 15 bis 55
    rIFN-α23 - 16 bis 109 -
    CIS4 N-terminale Region 120, 130 100, 160
    D2C N-terminale Region 39 300
    L3C N-terminale Region 24, 75 105, 270
    S8C N-terminale Region 37 220
    N45C A-B-Loop 52 104
    F47C A-B-Loop 66, 56, 58 120, 72, 240
    C98S5 C-Helix 105, 110, 100 500, 720, 900
    G104C C-D-Loop 110 600
    V105C C-D-Loop 38 33
    E107C C-D-Loop 90, 98, 110 160, 220, 180
    M111C C-D-Loop 40 190
    R162C C-terminale Region 600 4000
    S163C C-terminale Region 70, 50, 88 310, 125, 360
    K164C C-ter 100 600
    E165C C-ter 43, 60, 51 160, 220, 300
    *166C C-Terminus 48, 78, 96 120, 300
    • 1 IC50-Werte von einzelnen Experimenten. Ein Bereich ist gezeigt, wenn N > 5 ist.
    • 2 Kommerzielles rIFN-α2 vom Wildtyp
    • 3 rIFN-α2 vom Wildtyp, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
    • 4 Mutation erzeugt ein freies Cystein (C98) in der C-Helix
    • 5 Mutation erzeugt ein freies Cystein (CI) in der N-terminalen Region
  • Beispiel 7
  • PEGylierung von IFN-α2-Cysteinmuteinen
  • Die gereinigten IFN-α2-Cysteinmuteine können unter Verwendung der Prozeduren, die im Beispiel 3 und der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben sind, PEGyliert werden. Ein PEGylierungsexperiment im kleinen Maßstab wurde mit zwei der gereinigten rIFN-α2-Cysteinmuteine durchgeführt, um Bedingungen zu identifizieren, welchen es den Proteinen erlauben, an dem freien Cysteinrest monoPEGyliert zu werden. Eine Überreduktion der Proteine wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE überwacht, wobei man auf eine Verschiebung zu einem höheren als dem erwarteten apparenten Molekulargewicht als Ergebnis der Proteinentfaltung achtete, oder auf das Auftreten von multiplen PEGylierten Spezien, die als Ergebnis der Reduktion von nativen Disulfiden erzeugt wurden. Ein-μg-Aliquots von gereinigtem Wildtyp und rIFN-α2-Muteinen T106C und E107C wurden 1 Stunde lang mit einem 10-fach molaren Überschuss an TCEP und einem 20-fachen molaren Überschuss an 5-kDA-Maleimid-PEG bei einem pH-Wert von 8,5 bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 60 Minuten wurden die Reaktionen angehalten und sofort mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert. Beide Muteine ergaben unter diesen Bedingungen monoPEGyliertes Protein, basierend auf der SDS-PAGE-Analyse der Reaktionsmischungen. Die apparenten Molekulargewichte der monoPEGylierten Proteine betrugen etwa 28 kDa mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE. Wildtyp-rIFN-α2 zeigte keine nachweisbare PEGylierung unter diesen Bedingungen. Kontrollexperimente zeigten an, dass die T106C- und E107C-Cysteinmuteine partiell mit einem Reduktionsmittel wie TCEP reduziert werden mussten, um PEGyliert zu werden. Diese Daten zeigen an, dass das PEG-Molekül an den Cysteinrest gebunden ist, der in das T106C- und E107C-Protein eingeführt wurde.
  • Größere Mengen der IFN-α2-Cysteinmuteine können mit Cystein-reaktiven PEGs von verschiedenen Größen modifiziert und gereinigt werden, um ausreichend Material für Bioaktivitätsmessungen zu erhalten. Zur Reinigung der PEGylierten Proteine sollten die größeren PEGylierungsreaktionen wie oben beschrieben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt werden, 10 × mit 20 mM MES, pH 5,0, verdünnt werden, auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt werden und dann schnell auf eine S-Sepharose-Säule unter Bedingungen aufgebracht werden, die jenen ähnlich sind, die für die anfängliche Reinigung der rIFN-α2-Muteine beschrieben wurden. Die Anwesenheit des PEG-Restes vermindert die Affinität des Proteins für das Harz, wodurch es dem PEGylierten Protein ermöglicht wird, von dem nicht-PEGylierten Protein abgetrennt zu werden. Das Chromatogramm von der S-Sepharose-Säule sollte zwei Hauptproteinpeaks zeigen. Der früh eluierende Hauptpeak (Flution bei einer NaCl-Konzentration von weniger als 230 mM) sollte das mono-PEGylierte IFN-α-Protein sein, was durch nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analyse bestätigt werden kann. Das apparente Molekulargewicht von monoPEGyliertem IFN-α2, welches mit einem 5 kDa großen Cystein-reaktiven PEG modifiziert worden ist, ist gemäß SDS-PAGE etwa 28 kDa. Der später eluierende Hauptpeak (Flution bei etwa 230 mM NaCl) sollte das nicht umgesetzte IFN-α2-Protein sein. Fraktionen von den früh eluierenden Peaks, die vornehmlich PEG-IFN-α2 enthielten, können gepoolt und für Bioaktivitätsmessungen verwendet werden. Die biologische Aktivität der gereinigten PEG-IFN-α2-Proteine kann in dem Daudi-Zell-Assay, das in der PCT/US00/00931 beschrieben ist, gemessen werden. Die Konzentrationen der Proteine können unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt werden. Die biologischen in vivo-Aktivitäten der PEGylierten IFN-α2-Cysteinmuteine können so bestimmt werden, wie es in der PCT/US98/14497 und der PCT/US00/00931 beschrieben ist.
  • Zur PEGylierung des Q5C-Muteins wurde das gereinigte Protein auf 100 μg/ml Protein mit 100 mM Tris, pH 8, verdünnt. Ein 15-facher Überschuss an 5-kDa-Maleimid-PEG wird hinzugesetzt, gefolgt von einem 10-15-fachen molaren Überschuss an TCEP. EDTA wurde ebenfalls hinzugesetzt (0,5 mM Endkonzentration), um die Disulfidbildung zu inhibieren, sobald das Protein teilweise reduziert wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gehalten. Ein alternatives Verfahren, welches ebenfalls eine gute PEGylierungseffizienz ergab, involvierte die wiederholte Zugabe der PEG- und TCEP-Reagenzien. Wir haben herausgefunden, dass 3 Runden der Zugabe von 10 × molarem Überschuss an PEG-Reagenz und 10 × molarem Überschuss an TCEP über einen Zeitraum von 2 Stunden zu mehr als 80%iger PEGylierungseffizienz führte.
  • Diese letztere Prozedur der wiederholten Zugaben der PEG- und TCEP-Reagenzien war erfolgreich, um Q5C herzustellen, das mit 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEGs modifziert war. Die PEGylierten Proteine wurden von nicht ungesetztem Q5C-Ausgangsmaterial und PEGylierungsreagenzien durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen S-Sepharose-Protokolls getrennt. Alternative Verfahren, wie andere Ionenaustauscher (Q, DEAE, CM), HIC-Harze (Phenyl, Butyl), Affinitätssäulen, Größenausschlusssäulen oder Chelatisierungsharze, können zur Anwendung kommen, um das PEGylierte Protein zu reinigen.
  • Die biologische Aktivität der gereinigten 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEG-Q5C-Proteine wurden im Daudi-Zell-Assay, das in der PCT/US00/00931 beschrieben wurde, gemessen. Die Konzentrationen der Proteine wurden unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt. Durchschnittliche IC50-Werte für die 10-kDa-PEG-Q5C, 20-kDa-PEG-Q5C und 40-kDa-PEG-Q5C-Proteine wurden als 70 pg/ml (N = 2 Assays), 100 pg/ml (N = 8 Assays) bzw. 108 pg/ml (N = 8 Assays) bestimmt.
  • Beispiel 8
  • Klonierung, Expression und Reinigung von Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S)
  • A. Klonierung von G-CSF codierenden DNA-Sequenzen.
  • Eine G-CSF-codierende cDNA wurde durch PCR aus Gesamt-RNA amplifiziert, welche aus der humanen Blasenkarzinom-Zelllinie 5637 (American Type Culture Collection) isoliert worden war. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium wachsen gelassen, welches mit 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt worden war. RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung eines RNeasy-Mini-RNA-Isolierungs-Kits, welches von Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) erworben wurde, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers isoliert. Erststrang-Synthese von einzelsträngiger cDNA wurde durchgeführt unter Verwendung eines "1st Strand cDNA Synthesis"-Kits für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim Corp., und statistische Hexamere wurden als der Primer verwendet. Anschließende PCR-Reaktionen unter Verwendung der Produkte der Erststrang-Synthese als Matrize wurden mit Vorwärts-Primer BB91 (5> CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACC TGCCACCCAG >3; SEQ ID Nr. 1) und Rückwärts-Primer BB92 (5> CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGT GGCGTAG >3; SEQ ID Nr. 2) durchgeführt. Der Primer BB91 annealt an das 5'-Ende der codierenden Sequenz für das G-CSF-Sekretionssignal, und der Rückwärts-Primer BB92 annealt an das 3'-Ende der G-CSF codierenden Sequenz. Das resultierende ~640 bp große PCR-Produkt wurde mit Hind III und Bam HI verdaut, über ein Gel gereinigt und in den Vektor pCDNA3.1(+) kloniert, welcher mit Hind III und Bam HI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Ein Klon mit der korrekten DNA-Sequenz (Souza et al., 1986; Nagata et al., 1986a,b) wurde als pCDNA3.1(+)::G-CSFfus oder pBBT165 bezeichnet.
  • PCR wurde angewandt, um diesen G-CSF-Klon für periplasmatische und cytoplasmatische Expression von Wildtyp-G-CSF (Wildtyp) und einer Variante, in der das natürlich vorkommende freie Cystein an Position 17 durch Serin ersetzt war (C175), in E. coli zu modifizieren. Das Wildtyp-G-CSF-Protein enthält 5 Cysteine, von denen zwei an kritischen Disulfidbindungen teilnehmen, und ein freies Cystein (C17), welches teilweise verborgen bzw. versenkt ist und nicht für die Aktivität benötigt wird (Ishikawa et al., 1992, Kuga et al., 1989, Lu et al., 1992, Wingfield et al., 1988). Um mögliche Schwierigkeiten, verursacht von dem ungepaarten Cystein, zu vermeiden, konstruierten wir eine Variante, welche die Cys-nach-Ser-Substitution an Position 17 enthält (C17S), als unser Plattform-Molekül. Alle nachfolgenden Cysteinmuteine wurden mit Vorhandensein der C175-Substitution hergestellt. G-CSF(C17S) besitzt berichteterweise eine identische biologische Aktivität zu Wildtyp-G-CSF (Ishikawa et al., 1992, Lu et al., 1992).
  • Sezerniertes G-CSF enthält kein hinzugefügtes N-terminales Methionin und besitzt eine identische Aminosäuresequenz zu natürlich vorkommendem G-CSF (Souza et al., 1986). Um eine sezernierte Form von G-CSF zu exprimieren, wurde PCR eingesetzt, um die Leadersequenz des hitzestabilen Enterotoxin (STII)-Gens von E. coli (Picken et al., 1983) an die codierende Sequenz für reifes G-CSF zu fusionieren, und ein TAA-Stopcodon wurde nachfolgend an den carboxyterminalen Rest P174 angefügt. Zur gleichen Zeit wurde auch der aminoterminale Bereich der G-CSF codierenden Sequenz modifiziert. Codons für Proline an den Positionen 2, 5 und 10 wurden alle zu CCG geändert, und eine Xho I-Restriktionsstelle wurde eingeführt durch Ändern des L18-Codons von TTA zu CTC, um anschließende Mutageneseverfahrensweisen zu erleichtern.
  • Diese Konstruktionen wurden parallel für die Wildtyp- und C17S-Gene durchgeführt und setzten drei aufeinander folgende PCR-Reaktionen ein. Für das C17S-Konstrukt verwendete die erste Reaktion den Vorwärts-Primer BB116
    (5> GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTGAAGAGCCTCGAG CAAGTGCGTAAGATCCAG >3; SEQ ID Nr. 3) und den Rückwärts-Primer BB114 (5> CGCGAATTCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG >3; SEQ ID Nr. 4) und die klonierte G-CSF-cDNA als Matrize. BB116 lagert sich an das 5'-Ende der codierenden Sequenz von reifem G-CSF an und führt die oben erwähnten Codon-Änderungen bei P2, P5, P10 und L18 ein, welche die codierten Aminosäuren nicht ändern. Er führt des Weiteren die C17S-Mutation (TGC =>AGC) ein und ändert das Leucin-Codon an Position 15 zum bevorzugten CTG-Triplet. BB114 annealt an das 3'-Ende (18 bp) der G-CSF-codierenden Sequenz und führt ein TAA-Translations-Stopcodon unmittelbar anschließend an den carboxyterminalen Rest P174 ein. BB114 enthält auch eine Eco RI-Stelle zu Klonierungszwecken. Für das Wildtyp-Konstrukt verwendete die erste Reaktion den Vorwärts-Primer BB117 (5> GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGC TTCCTGCTTAAGTGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG >3; SEQ ID Nr. 5) und den Rückwärts-Primer BB114 (obige Sequenz) mit der klonierten G-CSF-cDNA als Matrize. BB117 ist identisch zu BB116 mit zwei Ausnahmen; das natürlich vorkommende C17-Codon, TGC, ist vorhanden, und das verwendete L15-Codon ist CTT. Dieses CTT erzeugt eine Afl II-Restriktionsstelle, um ein rasches und zweckmäßiges Verfahren zum Unterscheiden von Wildtyp-C17-Klonen von der C17S-Variante bereitzustellen. Die C17S-Klone tragen das CTG-Codon an der Position 15, und ihnen fehlt daher die Afl II-Restriktionsstelle. Das ~530 bp große PCR-Produkt aus jeder dieser Reaktionen wurde über ein Gel gereinigt und als Matrize für die zweite PCR-Reaktion verwendet.
  • Für die zweite Reaktion wurde jedes der ~530 bp großen, gel-gereinigten Produkte mit dem Vorwärts-Primer BB115 (5> ATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCGTACGC AACCCCGCTGGGCCCGGCCAGCTCCCTG >3; SEQ ID Nr. 6) und den Rückwärts-Primer BB114 (oben beschrieben) amplifiziert. Der 3'-Bereich (27 Nukleotide) von BB115 annealt an das 5'-Ende der modifizierten codierenden Sequenz von reifem G-CSF, welches sowohl in den Wildtyp- als auch C17S-PCR-Produkten identisch ist. Das 5'-Segment (36 Nukleotide) von BB115 codiert einen Abschnitt des STII-Leader-Peptids. Die ~550 bp großen PCR-Produkte aus jeder dieser sekundären Reaktionen wurden über ein Gel gereinigt und als Matrize für die dritte und letzte Runde PCR verwendet.
  • In der dritten Reaktion wurde jedes der ~550 bp großen gel-gereinigten Produkte mit Vorwärts-Primer BB11 (5> CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTG CTGGCATCTATGTTCGT TTTCTCTATCG >3; SEQ ID Nr. 7) und Rückwärts-Primer BB114 (oben beschrieben) amplifiziert. BB11 fügt den Rest des STII-Leader-Peptids an und enthält eine Nde I-Stelle, welche mit dem Initiator-ATG des STII-Leaders überlappt, sowie eine Xba I-Stelle zu Klonierungszwecken. Die ~620 bp großen Produkte dieser Reaktionen wurden mit Eco RI und Xba I verdaut und in ähnlich verdauten Plasmid-Vektor pBC-SK(+) (Stratagene) zur Sequenzierung kloniert.
  • Für das Wildtypkonstrukt wurde von einem Klon, bezeichnet als pBBT187, festgestellt, die korrekte Sequenz für das 620 bp große Nde I-Eco RI-Segment, enthaltend die STII-G-CSF codierende Sequenz, zu enthalten. Dieses Fragment wurde dann in (Nde I + Eco RI)-geschnittenen Expressionsvektor pCYB1 (New England BioLabs) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pBBT188 bezeichnet. Hinsichtlich des C17S-Konstrukts wurde von keinem der drei sequenzierten Klone festgestellt, die korrekte Sequenz zu enthalten; alle wiesen einen oder mehrere Fehler auf. Ein Klon enthielt eine einzelne Fehlsinn-Mutation an der A10-Position des STII-Leaders; der Rest der Sequenz des 620 bp großen Nde I-Eco RI-Segments war korrekt. Eine In-vitro-Rekombination zwischen diesem Klon und Plasmid pBBT188 wurde angewandt, um ein STII-G-CSF(C17S)-Konstrukt der korrekten Sequenz in pCYB1 zu erzeugen. pBBT188 und der C17S-Klon, enthaltend die einzelne Fehlsinn-Mutation an der A10-Position des STII-Leaders, wurden beide mit Bsi WI und Eco RI verdaut. Die einzige, in jedem Plasmid vorhandene, Eco RI-Stelle ist diejenige, welche auf das Translations-Stopcodon von G-CSF folgt. Bsi WI schneidet auch nur einmal an einer Stelle innerhalb der codierenden Sequenz des STII-Leader-Peptids, 7 bp vom Beginn der reifen G-CSF codierenden Sequenz entfernt. Deshalb erzeugten wir, durch Ersetzen des ~535 bp großen Bsi WI-Eco RI-Fragments von pBBT188 mit dem ~535 bp großen Bsi WI-Eco RI-Fragment mit der korrekten C17S-Konstrukt-Sequenz, ein pCYB1-Derivat, welches die STII-G-CSF(C17S) codierende Sequenz exprimierte. Dieses Plasmid wurde als pBBT223 bezeichnet.
  • Für die cytoplasmatische Expression in E. coli wurden die klonierten STII-G-CSF-Wildtyp- und STII-G-CSF(C17S)-Gene durch PCR modifiziert, um die STII-Leadersequenzen zu eliminieren und ein Initiator-Methionin-Codon (ATG) unmittelbar vorausgehend zum Codon der aminoterminalen Aminosäure (T1) von reifem G-CSF hinzuzufügen. Die hinsichtlich der Sequenz bestätigten STII-G-CSF-Wildtyp- und STII-G-CSF(C17S)-Klone wurden mit den Primern BB166 (5> CGCCATATGACCCCGCTGGGCCCGGCCAG >3; SEQ ID Nr. 8) und BB114 (oben beschrieben) amplifiziert. BB166 annealt an das 5'-Ende der codierenden Sequenz von reifem G-CSF und codiert ein Initiator-Methionin, welches der ersten Aminosäure von reifem G-CSF vorangeht. Eine Nde I-Stelle, welche mit dem ATG überlappt, wurde für Klonierungszwecke eingeschlossen. Die ~540 bp großen Produkte dieser PCR-Reaktionen wurden mit Nde I plus Aat II, welches ~400 bp stromabwärts der Nde I-Stelle schneidet, verdaut. Diese ~400 bp großen Fragmente wurden über ein Gel gereinigt und in pBBT187, das oben beschriebene pBC-SK(+)::STII-G-CSF-Konstrukt, welches mit Nde I plus Aat II geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war, kloniert. Ein Met-G-CSF-Wildtyp- und ein Met-G-CSF(C17S)-Klon wurden sequenziert, und von beiden wurde festgestellt, die korrekten Sequenzen zu enthalten. Diese Met-G-CSF-Wildtyp- und Met-G-CSF(C17S)-Gene wurden als Nde I-Eco RI-Fragmente in Nde I-Eco RI-geschnittenen Expressionsvektor pCYB1, welcher oben beschrieben ist, subkloniert. Die resultierenden Plasmide wurden wie folgend bezeichnet: pBBT225 = pCYB1::Met-G-CSF und pBBT226 = pCYB1::Met-G-CSF(C17S).
  • B. Expression von Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) in E. coli.
  • pBBT225, welches Met-G-CSF-Wildtyp codiert, pBBT226, welches Met-G-CSF(C17S) codiert, und der pCYB1-Stammform-Vektor wurden in E. coli JM109 transformiert. Experimente mit diesen Stämmen führten zur Expression der G-CSF-Proteine. Sezernierte G-CSF-, und zwar sowohl Wildtyp- als auch C17S-Formen, werden bevorzugt, weil ihnen der nicht-natürliche Methionin-Rest am N-Terminus von cytoplasmatischen exprimierten Met-G-CSF-Proteinen fehlt.
  • Für die Expression von sezerniertem G-CSF wurden pBBT188 [pCYB1::STII-G-CSF], pBBT223 [pCYB1::STII-G-CSF(C17S)] und der Stammform-Vektor pCYB1 in E. coli W3110 transformiert. Die resultierenden Stämme wurden bezeichnet als BOB130: W3110(pCYB1), BOB213: W3110(pBBTI88) und BOB268: W3110(pBBP223). In vorbereitenden Screening-Experimenten wurden die Stämme über Nacht in Luria-Nährmedium (LB-Medium), welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C in Rollröhrchen wachsen gelassen. Gesättigte Übernachtkul turen wurden auf ~0,025 O.D. bei A600 in LB, welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, verdünnt und bei 28, 37 oder 42°C in Schüttelkolben inkubiert. Typischerweise wurde eine 25 ml große Kultur in einem 250 ml großen Schüttelkolben gezüchtet. Als die Kultur-O.D.'s ~0,3-0,5 erreichten, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt, um die Expression von G-CSF zu induzieren. Für anfängliche Experimente wurden den Kulturen bei 0, 1, 3, 5 und ~16 Stunden nach der Induktion Proben entnommen. Proben von induzierten und nicht-induzierten Kulturen wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf im Voraus gegossenen 14%igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Induzierte Kulturen sowohl von. BOB213 (Wildtyp) als auch BOB268 (C17S) zeigten eine Bande bei ungefähr 19 kDa, welche konsistent mit dem Molekulargewicht von reifem G-CSF ist. Diese Bande wurde nicht in nicht-induzierten Kulturen von BOB213 und BOB268 oder in induzierten oder nicht-induzierten Kulturen von BOB130, der Nur-Vektor-Kontrolle, nachgewiesen. Western-Blot-Analysen zeigten, dass diese ~19 kDa große Bande in BOB213- und BOB268-Lysaten stark mit einem Anti-Mensch-G-CSF-Antiserum (R&D Systems) reagierte. Dieser Antikörper erkannte nicht Proteine in nicht-induzierten Kulturen von BOB213 und BOB268 oder in induzierten oder nicht-induzierten Kulturen von BOB130, der Nur-Vektor-Kontrolle. Diese Western-Blots zeigten auch, dass diese ~19 kDa große Bande mit einem kommerziellen humanen G-CSF-Standard comigrierte, welcher von R & D Systems erworben worden war. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das STII-Leader-Peptid entfernt worden ist, was konsistent damit ist, dass das Protein in das Periplasma sezerniert worden ist. N-terminale Sequenzierungsuntersuchungen, welche im Beispiel 10 dargestellt sind, weisen darauf hin, dass die STII-Signalsequenz richtig prozessiert worden war.
  • Die Proben bei 16 Stunden nach der Induktion aus 28°C- und 37°C-Kulturen wurden ebenfalls einem osmotischen Schock unterworfen, basierend auf dem Vorgehen von Koshland und Rotstein (1980). Dieses Vorgehen zerbricht die Außenmembran von E. coli und setzt den Inhalt des Periplasmas in das umgebende Medium frei. Anschließende Zentrifugation trennt die löslichen periplasmatischen Komponenten (zurückgewonnen im Überstand) von cytoplasmatischen, unlöslichen periplasmatischen und zell-assoziierten Komponenten (zurückgewonnen im Pellet). Bei beiden Temperaturen wurde ein gewisser Teil des synthetisierten G-CSF-Proteins, sowohl für Wildtyp, bei BOB213, als auch C17S, bei BOB268, im Überstand zurückgewonnen, aber die Hauptmasse des G-CSF-Proteins blieb mit dem Pellet assoziiert. Dies weist darauf hin, dass das Protein, obgleich es prozessiert und in das Periplasma sezerniert worden zu sein scheint, dort hauptsächlich in einer unlöslichen Form angesammelt wird.
  • Das vorbereitende Screening von Expressionsbedingungen für G-CSF-Wildtyp und die C17S-Variante zeigte, dass beide Proteine unter einer Vielzahl von Bedingungen relativ gut exprimiert werden. Für eine Expression und Reinigung im großen Maßstab wurden Kulturen bei 28°C wachsen gelassen und während ~16 Stunden induziert.
  • C. Reinigung von Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S).
  • Wildtyp und G-CSF(C17S) wurden in einem größeren Maßstab exprimiert und gereinigt, unter Verwendung identischer Protokolle. Frische gesättigte Übernachtkulturen von BOB213 (Wildtyp) und BOB268 (C17S) wurden bei ~0,05 OD @ A600 in LB, welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Typischerweise wurden 400 ml große Kulturen in einem 2 Liter großen Schüttelkolben mit Prallwänden bei 28°C in einem gyrotorischen Schüttelwasserbad bei 250 U/min wachsen gelassen. Als die Kulturen eine Dichte von ~0,5-0,7 OD erreichten, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Die induzierten Kulturen wurden dann über Nacht während ~16 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und bei -80°C eingefroren. Zellpellets wurden aufgetaut und mit 5 ml B-PERTM Bakterienprotein-Extraktionsreagenz gemäß den Protokollen des Herstellers (Pierce) behandelt. Das unlösliche Material, welches die Hauptmasse des G-CSF-Proteins enthielt, wurde durch Zentrifugation rückgewonnen und in B-PER resuspendiert. Diese Mischung wurde mit Lysozym (200 μg/ml) 10 Minuten lang behandelt, um die Zellwände weiter aufzubrechen, und MgCl2 (Endkonzentration 10 mM) und proteasefreie DNAse (2 μg/ml) wurden zugesetzt. Unlöslicher G-CSF wurde durch Zentrifugation abgesammelt und mittels Resuspension in Wasser und erneuter Zentrifugation gewaschen, um den Großteil der solubilisierten Zelltrümmer zu entfernen. Das resultierende Pellet, enthaltend unlöslichen G-CSF, wurde in 20 ml 8 M Harnstoff, 25 mM Cystein in 20 mM Tris-Base gelöst. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und danach in 100 ml 40 mM Natriumphosphat, 40 μM Kupfersulfat, 15% Glyzerol, pH 8,0, verdünnt. Dieses Rückfaltungsgemisch wurde 2 Tage lang bei 4°C gehalten. Der pH-Wert des Rückfaltungsgemischs wurde dann mit verdünnter HCl auf 4,0 eingestellt, und die Mischung wurde zentrifugiert, vor dem Auftragen auf eine 5 ml große S-Sepharose-Säule (Pharmacia HiTrap), die in 40 mM Natriumphosphat pH 4,0 (Puffer A) äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Salzgradienten von 0-100% Puffer B (500 mM NaCl, 40 mM Natriumphosphat, pH 4,0) eluiert. Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) eluierten aus der S-Sepharose-Säule als einzelne Hauptpeaks bei einer Salzkonzentration von ungefähr 300-325 mM NaCl. Die Säulenfraktionen wurden durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, welche G-CSF und keine sichtbaren Verunreinigungen enthielten, wurden vereinigt. Die Endausbeuten an G-CSF-Wildtyp und G-CSF(C17S), wie durch Bradford-Analyse ermittelt, beliefen sich auf etwa 1,1 mg bzw. 3,3 mg aus 400 ml Kultur. Gereinigter Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) comigrierten unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen der SDS-PAGE. Die apparenten Molekulargewichte von reduziertem und nicht-reduziertem G-CSF und G-CSF(C17S) betrugen ungefähr 19 bzw. 17 kDa.
  • D. In-vitro-Bioaktivitäten von Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S).
  • Ein Zell-Proliferations-Assay unter Verwendung der NFS60-Mauszelllinie wurde entwickelt, um die Bioaktivitäten von Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) zu messen. Die NFS60-Zelllinie wurde von Dr. J. Ihle bei der University of Tennessee Medical School, Memphis Tennessee, erhalten. Diese Zelllinie proliferiert in Antwort auf humanen oder Maus-G-CSF oder IL-3 (Weinstein et al., 1986). Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium gehalten, welches mit 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 17-170 Units/ml Maus-IL-3 (R&D Systems) ergänzt worden war. Bio-Assays wurden in Zellhaltungsmedium ohne IL-3 ausgeführt. Im Allgemeinen wurden die Bio-Assays angesetzt durch Waschen der NFS60-Zellen dreimal mit RPMI-Medium (keine Zusatzstoffe) und Resuspendieren der Zellen bei einer Konzentration von 0,5-1 × 105/ml in Zellhaltungsmedium ohne IL-3. 50 μl (2,5-5 × 103 Zellen) der Zellsuspension wurden pro Testvertiefung einer 96-Vertiefungs-Gewebekulturplatte mit flachem Boden aliquotiert. Serielle Verdünnungen der Proteinproben, welche zu testen waren, wurden in Haltungsmedium ohne IL-3 hergestellt. Serielle Verdünnungen von rekombinantem humanem G-CSF (exprimiert in E. coli; R&D Systems) wurden parallel analysiert. Fünfzig μl der verdünnten Proteinproben wurden zu den Testvertiefungen zugesetzt, und die Platten wurden bei 37°C in einem Gewebekulturinkubator mit angefeuchtetem 5% CO2 inkubiert. Die Proteinproben wurden in Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung geassayt. Nach ungefähr 48-72 Stunden wurden 20 μl "CellTiter 96 AQueous One"-Lösung (Promega Corporation) in jede Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden bei 37°C in dem Gewebekulturinkubator während 1-4 Stunden inkubiert. Die Absorption bzw. Extinktion der Vertiefungen wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts abgelesen. Kontrollvertiefungen enthielten Medien, aber keine Zellen. Die mittleren Absorptionswerte für die Kontrollvertiefungen in dreifacher Ausfertigung wurden von Mittelwerten subtrahiert, welche für die Testvertiefungen erhalten worden waren. EC50-Werte, die Konzentration bei halbmaximaler Stimulation, wurden für jede Probe berechnet.
  • Die NFS60-Zeltlinie zeigt eine starke proliferative Antwort auf G-CSF, wie verdeutlicht durch einen dosisabhängigen Anstieg der Zellzahl und Absorptionswerte. Kommerzieller G-CSF und von uns hergestellter G-CSF besaßen mittlere EC50's von 19 bzw. 10 pg/ml im Bio-Assay (Tabelle 6). Unerwarteterweise besaß G-CSF(C17S) einen mittleren EC50 von 7 pg/ml und war reproduzierbar 1,5- bis 2-fach wirksamer als unser Wildtyp-G-CSF-Standard und ~3-fach wirksamer als der kommerzielle Wildtyp-G-CSF-Standard im Bio-Assay (Tabelle 3). Die überlegene Aktivität von G-CSF(C17S) war überraschend, weil von anderer Seite berichtet wurde, dass Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) identische Aktivitäten aufweisen (Lu et al., 1992).
  • Beispiel 9
  • Konstruktion, Expression, Reinigung und Bioaktivität von G-CSF(C17S)-Cysteinmuteinen
  • A. Konstruktion von G-CSF-Cysteinmuteinen.
  • Fünfzehn Mutanten-G-CSF-Gene wurden unter Verwendung von ortsgerichteten PCR-basierenden Mutageneseverfahren konstruiert, welche ähnlich zu denjenigen waren, die in PCT/US00/00931 und Innis et al. (1990) und White (1993) beschrieben wurden. Wir konstruierten fünf Muteine in der aminoterminalen Region, proximal zur Helix A [*-1C (die Addition eines Cysteinrests auf den natürlichen Aminoterminus), T1C, L3C, A6C und S7C]; zwei Muteine im B-C-Loop [E93C und S96C]; sechs Muteine im C-D-Loop [A129C, T133C, A136, A139C, A141C und S142C]; und zwei Muteine in der carboxy-terminalen Region, distal zur Helix D [Q173C und *175C (die Addition eines Cysteinrests an den natürlichen Carboxyterminus)]. Die G-CSF-Cysteinmuteine wurden alle im C17S-Hintergrund konstruiert, um potenzielle Schwierigkeiten und/oder Unklarheiten zu vermeiden, welche von dem ungepaarten Cystein verursacht werden könnten, das normalerweise an Position 17 in Wildtyp-G-CSF vorhanden ist. G-CSF(C17S) besitzt nach früheren Berichten die volle biologische Aktivität (Ishikawa et al., 1992; Lu et al., 1992), und in unserem E. coli-Sekretions-System stellen wir fest, dass die Ausbeuten an gereinigtem C17S höher sind als jene von gereinigtem Wildtyp-G-CSF. Darüber hinaus ist, im In-vitro-Assay, unser rekombinantes C17S aktiver als Wildtyp-G-CSF, welches durch uns hergestellt wurde, und ein zweites, in E. coli produziertes, rekombinantes Wildtyp-G-CSF, welches von einem kommerziellen Verkäufer (R&D Systems, Inc.) erhalten wurde.
  • Das für die mutagenen PCR-Reaktionen verwendete Template war das Plasmid pBBT227, in welchem das STII-G-CSF(C17S)-Gen aus pBBT223 (beschreiben im Beispiel 8) als ein Nde I-Eco RI-Fragment in Nde I-Eco RI-geschnittenen pUC18 kloniert wurde. PCR-Produkte wurden mit passenden Restriktionsendonukleasen verdaut, über ein Gel gereinigt und mit pBBT227-Vektor-DNA ligiert, welche mit diesen selbigen Restriktionsenzymen geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Transformanten aus diesen Ligationen wurden herangezüchtet, und Plasmid-DNAs wurden isoliert und sequenziert. Die Sequenz des gesamten klonierten mutagenisierten PCR-Fragments wurde bestimmt, um die Gegenwart der Mutation von Interesse sowie die Abwesenheit jedweder weiterer Mutationen zu bestätigen, welche potenziell von der PCR-Reaktion oder von den synthetischen Oligonukleotid-Primern eingeführt worden sein könnten.
  • Die Cystein-Substitutionsmutation L3C wurde wie folgend konstruiert. Das mutagene Vorwärts-Oligonukleotid BB172 (5> ACCAACGCGTACGCAACCCCGTGTGGCCCGGCCAGC >3; SEQ ID Nr. 9) war entworfen, um das Codon CTG für Leucin an der Position 3 von reifem G-CSF in ein TGT, welches Cystein codiert, zu ändern und die in der Nähe liegende Mlu I-Stelle zu überspannen. Dieses Oligo wurde in PCR mit dem nicht-mutagenen Rückwärts-Primer BB188 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID Nr. 10) verwendet, welcher an DNA-Sequenzen anlagert, die für die Aminosäurereste 21-27 von reifem G-CSF in pBBT227 codieren. Eine 100-μl-PCR-Reaktion wurde im 1X Promega-PCR-Puffer durchgeführt, welcher 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,4 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 3 ng Matrizen-Plasmid pBBT227 (oben beschrieben), 2,5 Units Taq-Polymerase (Promega) und 0,5 Units Pfu-Polymerase (Stratagene) enthielt. Die Reaktion wurde in einem GeneAmp®-PCR-System 2400-Thermocycler von Perkin-Elmer durchgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 96°C während 3 Minuten, 25 Zyklen von [95°C während 60 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] und einen Halt bei 4°C. Ein 10 μl großes Aliquot der PCR-Reaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und produziert festgestelltermaßen ein Einzelfragment der erwarteten Größe ~100 bp. Der Rest der Reaktion wurde unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers "gesäubert" und mit Mlu I und Xho I (New England BioLabs) gemäß den Protokollen der Hersteller verdaut. Im Anschluss an einen weiteren Säuberungsschritt unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT227 ligiert, welcher mit Mlu I und Xho I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus den resultierenden Transformanten wurden sequenziert. Ein Klon, der die L3C-Mutation und die korrekte Sequenz über das gesamte ~70 bp große Mlu I-Xho I-Segment aufwies, wurde identifiziert.
  • Die Substitutionsmutation T1C wurde konstruiert und die Sequenz wurde unter Verwendung der oben für L3C aufgeführten Protokolle mit dem nachfolgenden Unterschied bestätigt. Das mutagene Oligonukleotid BB171 (5> ACCAACGCG TACGCATGCCCG CTGGGCCCGGCCAGC >3; SEQ ID Nr. 11), welches das ACC-Codon für T1 zu einem TGC-Codon für Cystein ändert und die naheliegende Mlu I-Stelle überspannt, wurde in der PCR-Reaktion anstatt von BB172 verwendet.
  • Die Substitutionsmutation Q173C wurde konstruiert, und die Sequenz wurde unter Verwendung der oben für L3C aufgeführten Protokolle mit den folgenden Unterschieden bestätigt. Das mutagene Rückwärts-Oligonukleotid BB185 (5> CGCGA ATTC TTAGGGACAGGCAAGGTGGCG >3; SEQ ID Nr. 12), welches das CAG-Codon für Q173 zu einem TGT-Codon für Cystein ändert und die naheliegende Eco RI-Stelle überspannt, wurde in der PCR-Reaktion anstatt von BB172 verwendet. Der nicht-mutagene Vorwärts-Primer BB187 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID Nr. 13), welcher an die DNA-Sequenz annealt, welche für die Aminosäurereste 78-84 von reifem G-CSF codiert, in pBBT227 annealt, wurde anstelle von BB188 verwendet. Ein 10 μl großes Aliquot der PCR-Reaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und produziert festgestelltermaßen ein Einzelfragment der erwarteten Größe ~300 bp. Der Rest der Reaktion wurde unter Verwendung der QIAquick-PCR-Reinigung (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers "aufgereinigt" und mit Sty I und Eco RI (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Herstellers verdaut. Im Anschluss an einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte auf einem 1,5%igen Agarosegel laufen gelassen, und das ~220 bp große Sty I-Eco RI-Fragment von Interesse wurde unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers über ein Gel gereinigt. Das gelgereinigte Fragment wurde mit pBBT227 ligiert, welcher mit Sty I und Eco RI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert. Ein Klon, aufweisend die Q173C-Mutation und die korrekte Sequenz überall im ~220 bp großen Sty I-Eco RI-Segment, wurde identifiziert.
  • Es wurde auch eine Mutation konstruiert, welche ein Cystein im Anschluss an die carboxyterminale Aminosäure der G-CSF-codierenden Sequenz hinzufügte. Diese Mutante, welche als *175C bezeichnet wird, wurde unter Anwendung der oben für die Konstruktion der Q173C-Mutante beschriebenen Protokolle mit den folgenden Unterschieden konstruiert. Das mutagene Oligonukleotid BB186 (5> CGCGAATTCTTAACA GGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG >3; SEQ ID Nr. 14), welches ein TGT-Codon für Cystein zwischen dem CCC-Codon für P174 und einem TAA-Stopcodon inseriert und die naheliegende Eco RI-Stelle überspannt, wurde anstatt von BB185 in der PCR-Reaktion verwendet.
  • Die Substitutionsmutation A6C wurde unter Anwendung der Technik von "Mutagenese durch Überlapp-Verlängerung" konstruiert, wie beschrieben in Horton et al. (1993) und PCT/US00/00931 . Die anfänglichen oder "primären" PCR-Reaktionen für die A6C-Konstruktion wurden in einem 50-μl-Reaktionsvolumen in 1X Promega-PCR-Puffer durchgeführt, welcher 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,4 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 1 ng Matrizen-Plasmid pBBT227, 1,5 Units Taq-Polymerase (Promega) und 0,25 Units Pfu-Polymerase (Stratagene) enthielt. Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer-GeneAmp®-PCR-System 2400-Thermocycler durchgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 96°C während 3 Minuten, 25 Zyklen von [95°C während 60 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] und einen Halt bei 4°C. Die verwendeten Primerpaare waren [BB173 × BB188] und [BB174 × BB125]. BB188 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID Nr. 10) annealt an DNA-Sequenzen, codierend die Aminosäurereste 21-27 von reifem G-CSF, in pBBT227. BB125 (5> CTATGCGGCATCAGAGCAGATA >3; SEQ ID Nr. 17) annealt an die pUC18-Vektorsequenz 20 bp stromaufwärts der klonierten G-CSF-Sequenz. BB173 und BB174 sind komplementäre mutagene Oligonukleotide, welche das GCC-Codon für A6 in ein TGC-Codon für Cystein ändern. Die Sequenz von BB173 ist (5> CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG >3; SEQ ID Nr. 15) und die Sequenz von BB174 ist (5> CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG >3; SEQ ID Nr. 16). Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel laufen gelassen, welches zeigte, dass die [BB173 × BB188]- und [BB174 × BB125]-PCR-Reaktionen Produkte der erwarteten Größen ergaben: ~80 bp für [BB173 × BB188] und ~140 bp für [BB174 × BB125]. Diese Fragmente wurden aus dem Gel herausgeschnitten, vereinigt und gemeinsam aus den Agarosegelscheibchen unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers eluiert und in 30 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) zurückgewonnen. Diese zwei mutagenisierten Fragmente wurden dann in der nachfolgenden oder "sekundären" PCR-Reaktion zusammen "gespleisst". In dieser Reaktion wurden 3 μl der gel-gereinigten PCR-Produkte der primären Reaktionen als Matrize verwendet, und BB125 und BB188 wurden als Primer verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 100 μl, und 2,5 Units Taq-Polymerase und 0,5 Units Pfu-Polymerase wurden verwendet. Ansonsten waren die Reaktionsbedingungen identisch zu denjenigen, welche in den primären Reaktionen angewandt wurden. Ein Aliquot der sekundären PCR wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und die erwartete Bande von ~190 bp wurde beobachtet. Die Hauptmasse der sekundären PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der QIAquick-PCR-Reinigung (Qiagen) "aufgereinigt" und mit Nde I und Xho I (New England BioLabs) gemäß den Protokollen der Hersteller verdaut. Im Anschluss an eine zusätzliche Hufreinigung unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT227 ligiert, welcher mit Nde I und Xho I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert, um einen Klon zu identifizieren, welcher die A6C-Mutation enthielt und im gesamten ~130 bp großen Nde I Xho I-Segment die korrekte Sequenz aufwies.
  • Die Substitutionsmutation S7C wurde konstruiert, und die Sequenz wurde unter Anwendung der oben für A6C aufgeführten Protokolle mit den nachfolgenden Unterschieden bestätigt. Komplementäre mutagene Primer BB175 (5> CTGGGCCCGGCCTGCTCCCTGCCGCAG >3; SEQ ID Nr. 18) und BB176 (5> CTGCGGCAGGGAGCAGGCCGGGCCCAG >3; SEQ ID NR. 19), welche das AGC-Codon für S7 in ein TGC-Codon für Cystein verändern, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen.
  • Eine Mutation, welche ein Cystein-Codon vor dem Codon für den aminoterminalen Rest, T1, von reifem G-CSF hinzufügte, wurde konstruiert, und hinsichtlich der Sequenz bestätigt. Diese Mutation, welche als *-1C bezeichnet wird, wurde unter Verwendung des oben für die Konstruktion von A6C beschriebenen Protokolls mit den folgenden Unterschieden konstruiert. Komplementäre mutagene Primer BB206 (5> AACCCGTACGCATGTACCCCGCTGGGC >3; SEQ ID NR. 20) und BB207 (5> GCC CAGCGGGGTACATGCGTACGCGTT >3; SEQ ID NR. 21), welche ein TGC-Codon für Cystein zwischen dem GCA-Codon für den carboxyterminalen Rest der STII-Leadersequenz und dem ACC-Codon für den aminoterminalen Rest von reifem G-CSF in pBBT227 inserieren, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen. Die primären PCR-Reaktionen wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt. Jeder Primer war bei 0,5 μM vorhanden. Die Reaktion schloss 0,5 ng Matrizenplasmid pBBT227, 2 Units Taq-Polymerase und 0,25 Units Pfu-Polymerase ein. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 3 Minuten, 25 Zyklen von [94°C während 60 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] und einen Halt bei 4°C. Die Produkte der primären Reaktionen wurden direkt auf ein präparatives 2%iges Agarosegel aufgetragen. Die primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~100 bp für [BB206 × BB188] und ~125 bp für [BB207 × BB125]. In der sekundären PCR belief sich das Reaktionsvolumen auf 100 μl. 5 μl der gel-gereinigten PCR-Produkte der primären Reaktionen, die als Matrize verwendet wurden, BB187 und BB126 wurden als Primer verwendet, und 4 Units Taq-Polymerase und 0,25 Units Pfu-Polymerase wurden verwendet. Ansonsten waren die Reaktionsbedingungen identisch zu denjenigen, welche in den primären Reaktionen verwendet wurden.
  • Die Substitutionsmutation A129C wurde konstruiert, und hinsichtlich Sequenz unter Verwendung der oben für A6C aufgeführten Protokolle mit den folgenden Unterschieden bestätigt. Die primären PCR-Reaktionen verwendeten Primerpaare [BB177 × BB126] und [BB178 × BB187]. Der nicht-mutagene Rückwärts-Primer BB126 (5> TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC >3; SEQ ID NR. 22) annealt an die pUC18-Vektorsequenz ~40 bp stromabwärts der klonierten G-CSF-Sequenz. Der nicht-mutagene Vorwärts-Primer BB187 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID Nr. 13) annealt an die DNA-Sequenz, codierend für die Aminosäurereste 78-84 von reifem G-CSF, im pBBT227. BB177 und BB178 sind komplementäre mutagene Oligonukleotide, welche das GCC-Codon für A129C in ein TGC-Codon für Cystein ändern. Die Sequenz von BB177 ist (5> GGAATGGCCCCTTGCCTGCAGCCCACC >3); SEQ ID Nr. 23) und die Sequenz von BB178 ist (5> GGTGGGCTGCAGGCAAGGGGCCATTCC >3; SEQ ID Nr. 24). Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~220 bp für [BB177 × BB126] und ~170 bp für [BB178 × BB187]. Die sekundäre PCR verwendete BB187 und BB126 als Primer und erzeugte ein Produkt der erwarteten Größe: ~360 bp. Dieses Produkt wurde mit Sty I und Eco RI (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Verstellers verdaut. Im Anschluss an eine zusätzliche Aufreinigung unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT227 ligiert, welcher mit Sty I und Eco RI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert, um einen Klon zu identifizieren, welcher die A129C-Mutation enthielt und die korrekte Sequenz im gesamten ~230 bp großen Sty I-Eco RI-Segment aufwies.
  • Die Substitutionsmutation T133C wurde konstruiert und hinsichtlich der Sequenz unter Anwendung der oben für A129C aufgeführten Protokolle mit den folgenden Unterschieden bestätigt. Komplementäre mutagene Primer BB179 (5> GCCCTGCAGCCCTGCCAGGGTGCCATG >3; SEQ ID Nr. 25) und BB180 (5> CATGGCACCCTGGCAGGGCTGCAGGGC >3; SEQ ID Nr. 26), welche das ACC-Codon für T133 in ein TGC-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen. Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~205 bp für [BB179 × BB126] und ~180 bp für [BB180 × BB187].
  • Die Substitutionsmutation A139C wurde konstruiert und hinsichtlich der Sequenz bestätigt, wobei die oben für A129C aufgeführten Protokolle mit den folgenden Unterschieden angewandt wurden. Komplementäre mutagene Primer BB181 (5> GGTGCCATGCCGTGCTTCGCCTCTGCT >3; SEQ ID Nr. 27) und BB182 (5> AGCAGAGGCGAAGCACGGCATGGCACC >3; SEQ ID Nr. 28), welche das GCC-Codon für A139 in ein TGC-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen. Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~185 bp für [BB181 × BB126] und ~200 bp für [BB182 × BB187].
  • Die Substitutionsmutation S142C wurde konstruiert und hinsichtlich der Sequenz bestätigt unter Verwendung der oben für A129C aufgeführten Protokolle mit den folgenden Unterschieden. Komplementäre mutagene Primer BB183 (5> CCGGCCTTCGCCTGTGCTTTCCAGCGC >3; SEQ ID Nr. 29) und BB184 (5> GCGCTGGAAAGCACAGGCGAAGGCCGG >3; SEQ ID Nr. 30), welche das TCT-Codon für S142 in ein TGT-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen. Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~180 bp für [BB183 × BB126] und ~210 bp für [BB184 × BB187].
  • Die Substitutionsmutation A136C wurde konstruiert, und die Sequenz wurde unter Anwendung der oben für A129C aufgeführten Protokolle bestätigt, mit den folgenden Unterschieden. Komplementäre mutagene Primer BB224 (5> CCCACCCAGGGTTGCATGCCGGCCTTC >3; SEQ ID Nr. 31) und BB225 (5> GAAGGCCGGCATGCAACCCTGGGTGGG >3; SEQ ID Nr. 32), welche das GCC-Codon für A136 in ein TGC-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB173 bzw. BB174 in den primären PCR-Reaktionen. Die primären PCR-Reaktionen wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt. Jeder Primer war bei 0,5 μM vorhanden. Die Reaktion beinhaltete 0,5 ng Matrizenplasmid pBBT227, 2 Units Taq-Polymerase und 0,25 Units Pfu-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem GeneAmp®-PCR-System 2400-Thermocycler von Perkin-Elmer ausgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 3 Minuten, 25 Zyklen [94°C während 60 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] und einen Halt bei 4°C. Die Produkte der primären Reaktionen wurden direkt auf ein präparatives 2%iges Agarosegel geladen. Die primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~195 bp für [BB224 × BB126] und ~190 bp für [BB225 × BB187]. In der sekundären PCR belief sich das Reaktionsvolumen auf 100 μl, 5 μl der gel-gereinigten PCR-Produkte der primären Reaktionen wurden als Matrize verwendet, BB187 und BB126 wurden als Primer verwendet, und 4 Units Taq-Polymerase und 0,25 Units Pfu-Polymerase wurden eingesetzt. Ansonsten waren die Reaktionsbedingungen identisch zu denjenigen, welche in den primären Reaktionen verwendet wurden.
  • Die Substitutionsmutation A141C wurde konstruiert und hinsichtlich der Sequenz unter Anwendung der oben für A136C aufgeführten Protokolle bestätigt, mit den folgenden Unterschieden. Komplementäre mutagene Primer BB226 (5> ATGCCGGCCTTCTGCTCTGCTTTCCAG >3; SEQ ID NR. 33) und BB227 (5> CTGGAAAGCAGAGCAGAAGGCCGGCAT >3; SEQ ID NR. 34), welche das GCC-Codon für A141 in ein TGC-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB224 bzw. BB225 in den primären PCR-Reaktionen. Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~180 bp für [BB226 × BB126] und ~205 bp für [BB227 × BB187].
  • Die Substitutionsmutation E93C wurde unter Anwendung der Technik der "Mutagenese durch Überlapp-Verlängerung" konstruiert. Die primären PCR-Reaktionen für die E93C-Konstruktion wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in 1 X Promega-PCR-Puffer durchgeführt, enthaltend 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,5 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 0,5 ng Matrizenplasmid pBBT227, 2 Units Taq-Polymerase (Promega) und 0,25 Units Pfu-Polymerase (Stratagene). Die Reaktionen wurden in einem GeneAmp®-PCR-System 2400-Thermocycler von Perkin-Elmer durchgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 3 Minuten, 25 Zyklen von [94°C während 60 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] und einen Halt bei 4°C. Die verwendeten Primerpaare waren [BB218 × BB211] und [BB219 × BB210]. Der nicht-mutagene Rückwärts-Primer BB211 (5> GGCCATTCCCAGTTCTTCCAT >3; SEQ ID Nr. 35) annealt an DNA-Sequenzen, welche die Aminosäurereste 121-127 von reifem G-CSF in pBBT227 codieren. Der nicht-mutagene Vorwärts-Primer BB210 (5> TTCGTTTTCTCTATCGCTACCAAC >3; SEQ ID Nr. 36) annealt an DNA-Sequenzen, codierend die Aminosäurereste 13-20 des STII-Leader-Peptids, in pBBT227. BB218 und BB219 sind komplementäre mutagene Oligonukleotide, welche das GAA-Codon für E93 in ein TGT-Codon für Cystein ändern. Die Sequenz von BB218 ist (5> CTGCAGGCCCTGTGTGGGATCTCCCCC >3; SEQ ID Nr. 37), und die Sequenz von BB219 ist (5> GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG >3; SEQ ID Nr. 38). Die Produkte der primären Reaktionen wurden direkt auf ein präparatives 2%iges Agarosegel geladen, welches zeigte, dass die PCR-Reaktionen Produkte der erwarteten Größen ergaben: ~115 bp für [BB218 × BB211] und ~325 bp für [BB219 × BB210]. Diese Fragmente wurden aus dem Gel herausgeschnitten, vereinigt und gemeinsam aus den Agarosegel-Scheibchen unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers eluiert und in 30 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) zurückgewonnen. In der sekundären PCR-Reaktion wurden 5 μl des Pools von gel-gereinigten PCR-Produkten der primären Reaktionen als Matrize verwendet, und BB211 und BB210 wurden als Primer verwendet. Das Reaktionsvolumen war 100 μl, und 4 Units Taq-Polymerase und 0,25 Units Pfu-Polymerase wurden verwendet. Ansonsten waren die Reaktionsbedingungen identisch zu denjenigen, welche in den primären Reaktionen verwendet wurden. Ein Aliquot der sekundären PCR wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und die erwartete Bande von ~415 bp wurde beobachtet. Die Hauptmasse der sekundären PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der QIAquick-PCR-Reinigung (Qiagen) "aufgereinigt" und mit Sty I und Xho I (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Herstellers verdaut. Im Anschluss an eine zusätzliche Aufreinigung unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT227 ligiert, welcher mit Sty I und Xho I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert, um einen Klon zu identifizieren, welcher die E93C-Mutation enthielt und die korrekte Sequenz im gesamten ~260 bp großen Sty I Xho I-Segment aufwies.
  • Die Substitutionsmutation S96C wurde konstruiert und hinsichtlich der Sequenz bestätigt unter Anwendung der oben für E93C ausführlich dargelegten Protokolle, mit den folgenden Unterschieden. Komplementäre mutagene Primer BB220 (5> CTG GAA GGG ATC TGC CCC GAG TTG GGT >3; SEQ ID Nr. 39) und BB221 (5> ACC CAA CTC GGG GCA GAT CCC TTC CAG >3; SEQ ID NR. 40), welche das TCC-Codon für 596 in ein TGC-Codon für Cystein ändern, ersetzten BB218 bzw. BB219 in den primären PCR-Reaktionen. Die Produkte der primären Reaktionen ergaben Produkte der erwarteten Größen: ~110 bp für [BB220 × BB221] und ~330 bp für [BB221 × BB210].
  • Für die Expression in E. coli als in den periplasmatischen Raum sezernierte Proteine wurden die STII-G-CSF(C17S)-Gene, welche die Muteine codieren, aus den pUC18-basierenden pBBT227-Derivaten als Nde I-Eco RI-Fragmente von ~600 bp herausgeschnitten, in den Expressionsvektor pCYB1 subkloniert und in E. coli W3110 transformiert.
  • Unter Anwendung von Vorgehensweisen, die ähnlich zu den hierin beschriebenen sind, kann man andere Cysteinmuteine von G-CSF und G-CSF(C175) konstruieren. Die Cysteinmuteine können Substitutionsmutationen, welche Cystein für einen natürlichen Aminosäurerest in der G-CSF codierenden Sequenz substituieren, Insertionsmutationen, welche einen Cysteinrest zwischen zwei natürlich vorkommenden Aminosäuren in der G-CSF codierenden Sequenz inserieren, oder Additionsmutationen sein, welche einen Cysteinrest vorausgehend zur ersten Aminosäure T1 der G-CSF codierenden Sequenz hinzufügen oder einen Cysteinrest anschließend an den terminalen Aminosäurerest P174 der G-CSF codierenden Sequenz hinzufügen. Die Cysteinreste können für jedwede Aminosäure substituiert oder zwischen jedweden zwei Aminosäuren inseriert werden, an beliebiger Stelle in der G-CSF codierenden Sequenz. Bevorzugte Stellen zum Substituieren oder Inserieren von Cysteinresten in G-CSF liegen in der Region, vorausgehend der Helix A, dem A-B-Loop, dem B-C-Loop, dem C-D-Loop und der Region distal zur Helix D. Andere bevorzugte Stellen sind die ersten oder letzten drei Aminosäuren der A-, B-, C- und D-Helizes. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Mutationen sind weitere bevorzugte Reste in diesen Regionen zur Erzeugung von Cysteinsubstitutionen P2, G4, P5, S8, L9, P10, Q11, S12, T38, K40, S53, G55, I56, W58, A59, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, Q70, A72, Q90, A91, L92, G94, I95, S96, E98, G100, G125, M126, A127, Q131, Q134, G135, S142, A143, Q145 und P174. Alle der in diesem Beispiel beschriebenen Varianten werden im Kontext der natürlichen Proteinsequenz oder eines Variantenproteins bereitgestellt, in welchem der natürlich vorkommende "freie" Cysteinrest (Cystein 17) zu einer anderen Aminosäure, bevorzugt Serin oder Alanin, geändert worden ist.
  • Man kann G-CSF- und G-CSF(C17S)-Muteine, die ein freies Cystein enthalten, auch durch Substituieren einer anderen Aminosäure für einen der natürlich vorkommenden Cysteinreste in G-CSF, welche normalerweise eine Disulfidbindung bilden, konstruieren. Der natürlich vorkommende Cysteinrest, der normalerweise eine Disulfidbindung mit dem substituierten Cysteinrest bildet, ist nun frei. Der Cysteinrest kann mit einer beliebigen der anderen 19 Aminosäuren, aber vorzugsweise mit einem Serin- oder Alaninrest, ersetzt werden. Diese Varianten werden im Kontext der natürlichen Proteinsequenz oder eines Variantenproteins bereitgestellt, in welchem der natürlich vorkommende "freie" Cysteinrest (Cystein-17) zu einer anderen Aminosäure, vorzugsweise Serin oder Alanin, geändert worden ist. Ein freier Cysteinrest kann in G-CSF auch durch chemische Modifikation einer natürlich vorkommenden Aminosäure unter Anwendung von Vorgehensweisen eingebracht werden, wie denjenigen, welche von Sytkowski et al. (1998) beschrieben wurden.
  • Unter Anwendung von Vorgehensweisen, ähnlich zu denjenigen, welche in den Beispielen 8, 9, 10, 11 und 13 beschrieben werden, kann man die Proteine in E. coli exprimieren, die Proteine reinigen, die Proteine PEGylieren und ihre Bioaktivitäten in In-vitro- und In-vivo-Bio-Assays messen. Die Proteine können cytoplasmatisch in E. coli oder als in den periplasmatischen Raum sezernierte Proteine exprimiert werden. Die Muteine können auch in eukaryotischen Zellen, wie Insekten- oder Säugerzellen, unter Anwendung von Vorgehensweisen, ähnlich zu denjenigen, beschrieben in PCT/US00/00931 , oder verwandten Vorgehensweisen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, exprimiert werden. Wenn eine Sekretion aus eukaryotischen Zellen gewünscht wird, kann die natürliche G-CSF-Signalsequenz oder eine andere Signalsequenz verwendet werden, um die Proteine aus eukaryotischen Zellen zu sezernieren.
  • B. Expression und Reinigung von G-CSF(C17S)-Cysteinmuteinen.
  • E. coli-Stämme, welche 13 G-CSF(C17S)-Muteine exprimieren (*-1C, T1C, L3C, A6C, S7C, E93C, A129C, T133C, A136C, A139C, A141C, Q173C und *175C), wurden herangezüchtet, induziert und geerntet unter Verwendung der Protokolle, welche im Beispiel 8 beschrieben werden, die für BOB213 (Wildtyp) und BOB268 (C17S) angewandt wurden. Alle der Muteine waren in großem Maße unlöslich. Die Muteine wurden unter Anwendung der Protokolle, welche im Beispiel 8 für G-CSF-Wildtyp und G-CSF(C17S) beschrieben sind, rückgefaltet und gereinigt. Eine Analyse mit nicht-reduzierender SDS-PAGE enthüllte, dass die 13 gereinigten Cysteinmuteine vorwiegend als Monomere zurückgewonnen wurden, welche bei ungefähr 17 kDa wandern. Die gereinigten Muteine comigrierten mit Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) mit Ausnahme des *-1C-Muteins, welches geringfügig langsamer als Wildtyp-G-CSF wanderte. Alle außer einem der Muteine eluierten aus der Ionenaustauschsäule bei einer ähnlichen Salzkonzentration wie Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S). Die eine Ausnahme, E93C, eluierte später während des Gradienten (NaCl-Konzentration von ungefähr 400 mM), möglicherweise wegen der Substitution von Cystein für die geladene Aminosäure Glutaminsäure.
  • C. Bioaktivitäten von G-CSF(C17S)-Cysteinmuteinen.
  • Die 13 gereinigten G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine wurden im NFS60-Zellproliferations-Assay, welcher im Beispiel 8 beschrieben wurde, geassayt. Proteinkonzentrationen wurden unter Anwendung eines Bradford-Protein-Assay-Kits (Bio-Rad Laboratories) bestimmt. Handelsüblicher Wildtyp-G-CSF und Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S), welche von uns hergestellt wurden, wurden parallel an den gleichen Tagen analy siert, um eine Kontrolle hinsichtlich einer Tages-Variabilität in den Assays vorzunehmen. Alle 13 Muteine stimulierten die Proliferation der NFS60-Zellen zum gleichen Ausmaß wie die Wildtyp-G-CSF-Kontrollproteine, innerhalb des Fehlers des Assays. Mittlere EC50-Werte für die 13 Muteine lagen im Bereich von 5-9 pg/ml. Mittlere EC50-Werte für die Cysteinmuteine waren ähnlich zu dem mittleren EC50 des G-CSF(C17S)-Kontrollproteins und 1,5 bis 2-fach niedrigerer, d.h. wirkungsvoller, als der mittlere EC50 für unser Wildtyp-G-CSF-Kontrollprotein und ~3-fach niedriger als der mittlere EC50 für das kommerzielle Wildtyp-G-CSF-Protein. Diese Daten sind in der Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6 Bioaktivitäten von Wildtyp-G-CSF, G-CSF(C17S) und G-CSF(C17S)-Cysteinmuteinen
    G-CSF-Protein Mutations-Lage Mittlerer EC50 (pg/ml) EC50-Bereich1 (pg/ml)
    R&D G-CSF2 - 18,6 +/- 6,6 12-35 (N = 12)
    BBT G-CSF3 - 10,2 +/- 1,6 8,5-13 (N = 8)
    G-CSF(C17S) - 7,2 +/- 2,0 5-12 (N = 18)
    *-1C/C17S N-Terminus 7,0 5,8, 6,0, 7,5, 8,5
    T1C/C17S N-Terminus 7,8 4,5, 5,0, 9,0, 10
    L3C/C17S Proximal zur A-Helix 8,0 4,5, 7,5 9,0, 9,0, 10
    A6C/C17S Proximal zur A-Helix 8,2 4,5, 9,0, 11
    S7C/C17S Proximal zur A-Helix 7,3 3,8, 8,0, 10
    E93C/C17S B-C-Loop 7,6 6,5, 7,5, 8,0, 8,5
    A129C/C17S C-D-Loop 6,0 6,0, 6,0, 6,0
    T133C/C17S C-D-Loop 6,6 5,0, 6,0, 6,5, 7,5, 8,0
    A136C/C17S C-D-Loop 8,3 7,0, 7,5, 8,5, 10
    A139C/C17S C-D-Loop 5,2 5,0, 5,0, 5,5
    A141C/C17S C-D-Loop 8,9 7,5, 8,5, 9,5, 10
    Q173C/C17S Distal zur D-Helix 6,2 +/- 1,3 5,2-9,0 (N = 7)
    *175C/C17S C-Terminus 5,6 5,0, 5,5, 5,5, 6,0, 6,0
    • 1 EC50-Werte aus individuellen Experimenten; ein Bereich wird gezeigt, wenn N > 5
    • 2 Kommerzieller Wildtyp-G-CSF (R&D Systems)
    • 3 Wildtyp-G-CSF, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
  • D. Konstruktion von G-CSF-Doppel-Cystein-Mutanten
  • Mehrfachmutanten, die zwei oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste enthalten, können entweder durch aufeinander folgende Runden der Mutagenese unter Anwendung der in den Beispielen 9, 14 und 15 beschriebenen Vorgehensweisen konstruiert werden oder alternativ dazu durch In-vitro-Rekombination von einzelnen Mutanten zum Konstruieren rekombinanter Expressionsplasmide, welche Muteine mit zwei oder mehr freien Cysteinresten codieren. Die bevorzugten Mehrfachmutanten werden diejenigen sein, welche zwei oder mehr Cysteinmuteine kombinierten und die jeweils eine hohe Aktivität bei PEGylierung beibehalten. Beispiele wären L3C plus T133C, L3C plus *175C und T133C und *175C. Andere bevorzugte Mehrfachmutanten können abgeleitet werden ausgehend von den Daten aus Tabelle 3 und Tabelle 4, und werden Kombinationen einschließen, enthaltend zwei oder mehr Mutationen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus L3C, T133C, A141C und *175C besteht.
  • Wir konstruierten die folgenden G-CSF-Doppel-Cystein-Mutanten: L3C/T133C, L3C/*175C und T133C/*175C. Um L3C/T133C herzustellen, wurde das L3C-Derivat von pBBT227 (G-CSF C17S in pUC18) mit Xho I und Eco RI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Die DNA wurde unter Verwendung des Qiagen-PCR-Reinigungs-Kits extrahiert, und wird als G-CSF L3C X-R1-Cip-Vektor bezeichnet. Als Nächstes wurde das T133C-Derivat von pBBT227 mit Xho I und Eco RI verdaut, und das ~480 bp große Fragment wurde über ein Gel gereinigt und mit dem Vektor G-CSF L3C X-R1-Cip ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Ligationsreaktion transformiert, und Klone mit der korrekten Sequenz wurden identifiziert.
  • Um L3C/*175C herzustellen, wurde das *175C-Derivat von pBBT227 mit Xho I und Eco RI verdaut, und das ~480 bp große Fragment wurde über ein Gel gereinigt und mit dem Vektor G-CSF L3C X-R1-Cip (siehe oben) ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Ligationsreaktion transformiert, und Klone mit der korrekten Sequenz wurden identifiziert.
  • Um T133C/*175C herzustellen, diente das T133C-Derivat von pBBT227 als Matrize in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des mutagenen Rückwärts-Oligonukleotid-Primers BB186 (5> CGC GAA TTC TTA ACA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG > 3; SEQ ID Nr. 14) und des nichtmutagenen Vorwärts-Oligonukleotides BB125, welches an pUC18-Vektorsequenzen stromaufwärts des G-CSF-Inserts annealt. Die PCR war eine 50 μl große Reaktion, durchgeführt in 1X Promega-PCR-Puffer, enthaltend 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,4 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 0,5 ng Matrizen-Fragment, 1 Unit Taq-Polymerase (Promega) und 0,1 Unit Pfu-Polymerase (Stratagene). Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 5 Minuten, 22 Zyklen von [94°C während 30 Sekunden, 55°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden], einen 7 Minuten langen Halt bei 72°C und einen Halt bei 4°C. Zwanzig μl der PCR wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und das ~630 bp große Fragment wurde aus dem Gel isoliert. Dieses Fragment wurde mit Xho I und Eco RI verdaut und unter Verwendung des Qiagen-PCR-Aufreinigungs-Kits extrahiert. Diese DNA wurde an einen Vektor ligiert, der hergestellt worden war durch Verdauen des T133C-Derivats von pBBT227 mit Xho I und Eco RI, Behandeln mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm und Extrahieren unter Verwendung des Qia gen-PCR-Aufreinigungs-Kits. E. coli JM109 wurde mit der Ligationsreaktion transformiert, und Klone mit der korrekten Sequenz wurden identifiziert.
  • Beispiel 10
  • PEGylierung, Reinigung und Bioaktivität von G-CSF-Cysteinmuteinen
  • A. Vorbereitende PEGylierungs-Untersuchungen.
  • Anfängliche PEGylierungs-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung von T1C als dem Testprotein, TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphin]-HCl als dem Reduktionsmittel und von 5kDa großen Cystein-reaktiven PEGs von Shearwater Polymers, Inc., bestimmt. Eine Über-Reduktion des Proteins wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE verfolgt, wobei man nach einer Verschiebung zu einem höheren apparenten Molekulargewicht als erwartet, als Ergebnis der Protein-Entfaltung, oder nach dem Auftreten von mehreren PEGylierten Spezies, erzeugt als das Ergebnis der Reduktion nativer Disulfide, suchte. Ein μg-Aliquots von gereinigtem T1C wurden mit steigenden Konzentrationen an TCEP bei Raumtemperatur in 100 mM Tris, pH 8,5, in Gegenwart von variierenden Mengen an überschüssigem 5-kDa-Maleimid-PEG oder 5-kDa-Vinylsulfon-PEG inkubiert. Nach 60 Minuten wurden die Reaktionen unmittelbar durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert. Die Mengen an TCEP und jeweiligem PEG-Reagenz, welche signifikante Mengen an monoPEGyliertem T1C-Protein ergaben, ohne Wildtyp-G-CSF zu modifizieren, wurden für weitere Experimente verwendet. Die Titrations-Experimente zeigten an, dass bei pH 8,5 ein 10-facher molarer Überschuss an TCEP und ein 20-facher Überschuss an 5-kDa-Maleimid-PEG signifikante Mengen an monoPEGyliertem T1C-Protein (apparentes Molekulargewicht von 28 kDa bei SDS-PAGE) ohne nachweisbares di- oder tri-PEGyliertes Protein ergab. Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) wurden unter identischen PEGy-lierungs-Bedingungen nicht modifiziert. Diese Reaktionsbedingungen wurden verwendet, um die PEGylierung der anderen G-CSF-Muteine hinsichtlich des Maßstabs zu vergrößern. Kontrollexperimente wiesen darauf hin, dass das T1C-Protein partiell durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie TCEP, reduziert werden muss, um PEGyliert zu werden.
  • B. Herstellung und Reinigung von PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen:
  • Aliquots von 200 bis 300 μg der 13 gereinigten G-CSF-Cysteinmuteine wurden mit 5-kDa-Maleimid-PEG PEGyliert, um ausreichend Material für die Reinigung und Charakterisierung bereitzustellen. Die größeren PEGylierungs-Reaktionen wurden ebenfalls 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei die oben beschriebenen Bedingungen verwendet wurden. Diese Reaktionsbedingungen ergaben monoPEGyliertes Protein für alle der Muteine. Elf der monoPEGylierten Muteine sind unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Vorgehens gereinigt worden. Am Ende der Reaktionszeit wurde die PEGylierungs-Mischung 10X mit 40 mM Natriumphosphat (einwertig) verdünnt, und der pH-Wert wurde auf 4,0 eingestellt, vor raschem Auftragen auf eine S-Sepharose-Säule (1 ml, HiTrap) unter Anwendung von ähnlichen Bedingungen zu denjenigen, welche für die anfängliche Reinigung der G-CSF-Muteine beschrieben wurden (20 ml Gradient, 0-0,5 M NaCl in 40 mM Natriumphosphat, pH 4). Die Gegenwart der PEG-Einheit verringerte die Affinität des Proteins für das Harz, was gestattet, dass das PEGylierte Protein vom nicht-PEGylierten Protein getrennt werden kann. Die Chromatogramme aus den S-Sepharose-Säulen zeigten zwei hauptsächliche Protein-Peaks, welche bei ungefähr 275 mM NaCl und 300-325 mM NaCl für die meisten Muteine eluierten. Der früh eluierende Haupt-Peak wurde mittels SDS-PAGE als das monoPEGylierte G-CSF(C17S) bestimmt. Der später eluierende Haupt-Peak wurde als das nicht-umgesetzte G-CSF(C17S)-Mutein bestimmt. Das PEG-E93C-Mutein eluierte bei etwa 325 mM NaCl gegenüber etwa 400 mM NaCl für nicht-umgesetztes E93C-Protein. Fraktionen aus dem früh eluierenden Peak, enthaltend hauptsächlich das monoPEGylierte G-CSF(C17S)-Mutein, wurden vereinigt und für Bioaktivitäts-Messungen verwendet. Fünf Cysteinmuteine (L3C, T133C, A141C, Q173C und *175C) wurden ebenfalls unter Verwendung eines 20-kDa-PEG-Maleimids und den oben beschriebenen PEGylierungs- und Reinigungs-Vorgehensweisen PEGyliert. Die 20-kDa-PEGylierten Proteine eluierten aus der S-Sepharose-Säule bei ungefähr 250 mM NaCl. SDS-PAGE-Analysen zeigten, dass die gereinigten PEGylierten Proteine weniger als 10% und wahrscheinlich weniger als 5% nicht-PEGyliertes Protein enthielten. Die Cysteinmuteine mussten durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie TCEP, partiell reduziert werden, damit sie PEGyliert werden konnten. Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S) zeigten unter identischen partiellen reduzierenden Bedingungen keine PEGylierung, was darauf hinweist, dass der PEG-Rest an den in die Muteine eingeführten Cysteinrest angeheftet wird.
  • C. Reinigung und PEGylierung des L3C-G-CSF-Cysteinmuteins:
  • Zeitverläufe der Rückfaltungs- und der PEGylierungs-Reaktionen für L3C wurden ausgeführt. Die Rückfaltung für dieses besondere Mutein war festgestelltermaßen nach 4 Stunden vollständig. Der Fortschritt der Rückfaltungs-Reaktion wurde durch Umkehrphasen-HPLC (C4-Säule) überwacht. Die Ausbeuten beliefen sich auf ~10 mg/400 ml Kultur, die wie im Beispiel 8 beschrieben wachsen gelassen worden war. Die Zeitabläufe wurden für die PEGylierung des L3C-Muteins mit 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEGs vollführt. PEGylierungs-Reaktionsbedingungen waren wie obenstehend im Beispiel 10 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 0,5 mM EDTA in den PEGylierungs-Puffern eingeschlossen wurde. Für Reaktionen von 0,5-1 mg ergaben längere Reaktionszeiten von 2-4 Stunden bei Raumtemperatur größere Mengen an PEGyliertem Produkt. Die Effizienzen der PEGylierung beliefen sich auf ~80% bei der verlängerten Zeitdauer. Größere (bis zu 5 mg) PEGylierungs-Reaktionen wurden mit gleicher Effizienz durchgeführt. PEGyliertes Protein wurde von nicht-PEGyliertem Protein auf einer 5 ml großen S-Sepharose-Säule unter Anwendung der zuvor im Beispiel 10 beschriebenen Aufreinigungsmethodik gereinigt. Das 20-kDa-PEGylierte Protein eluierte bei ~200 mM NaCl, wohingegen das 40-kDa-PEG-Protein und das 10-kDa-PEG-Protein bei ~150 mM bzw. ~220 mM eluierten. Das nicht-PEGlyierte G-CSF-L3C-Mutein eluierte bei ~260 mM. Die Gegenwart von EDTA verringerte signifikant die Bildung von Proteindimeren in der PEGylierungs-Reaktion.
  • D. N-terminale Sequenzierung von 20-kDa-PEG-L3C.
  • Die N-terminale Aminosäure von natürlichem G-CSF ist Threonin (Souza et al., 1986). Eine N-terminale Sequenzierung des gereinigten 20-kDa-PEG-L3C-Proteins unter Anwendung der automatisierten Edman-Abbau-Chemie ergab die Sequenz TPXGPAS, was darauf hinweist, dass der N-Terminus korrekt prozessiert ist und damit in Übereinstimmung steht, dass der dritte Rest PEGyliert ist; PEGylierte Aminosäuren zeigen sich als Leerstellen in Sequenzierungsläufen, wie es durch das X angegeben wird.
  • E. Strukturbestimmung von PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen durch Zirkulardichroismus(CD)-Analyse:
  • CD-Analyse wurde auf einem Jasco 720 CD-Spektropolarimeter in einer 300-μl-Zelle mit einer Weglänge von 1 cm bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Daten wurden aus 260 nm-200 nm bei einer Empfindlichkeit von 50m° und 32 Akkumulierungen erfasst. Die anfünglichen Experimente wurden ausgeführt mit dem L3C-Mutein und 10K-PEG-L3C-Protein. Beide hatten CD-Spektren, sehr ähnlich zu denjenigen, welche in der Literatur für Wildtyp-G-CSF gefunden werden. Ähnliche Analysen können an anderen G-CSF-Cysteinmuteinen und ihren PEGylierten Derivaten durchgeführt werden.
  • F. Bioaktivitäten von PEGylierten G-CSF(C17S)-Cysteinmuteinen:
  • Biologische Aktivitäten der 11 gereinigten 5-kDa-PEG-G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine und 5 gereinigten 20-kDa-PEG-G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine wurden im NFS60-Zellproliferations-Assay, der im Beispiel 8 beschrieben ist, gemessen. Konzentrationen der Proteine wurden unter Anwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt. Alle der PEGylierten G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine zeigten ähnliche Dosis-Antwort-Kurven und erreichten denselben Grad an maximaler Wachstumsstimulierung wie G-CSF(C17S) innerhalb des Fehlers des Assays. Mittlere EC50-Werte für die 5-kDa-PEG-modifizierten Cysteinmuteine lagen im Bereich von 2-11 pg/ml. Diese PEGylierten Muteine waren 1,5- bis 2-fach wirksamer als unser Wildtyp-G-CSF und ~3-fach wirksamer als der kommerzielle Wildtyp-G-CSF im Bio-Assay. Mittlere EC50-Werte für die 20-kDa-modifizierten Cysteinmuteine lagen im Bereich von 9 bis 14 pg/ml. Biologische Aktivitäten der PEGylierten G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine waren gleich zu oder höherwertiger als jene von Wildtyp-G-CSF. Sämtliche NFS60-Zellen-stimulatorische Aktivität von 5-kDa-PEG-L3C konnte beseitigt werden durch einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen G-CSF (R&D Systems, Inc.), was darauf hinweist, dass die wachstumsfördernde Aktivität auf das PEG-L3C-G-CSF-Protein und nicht auf eine Kontaminante in der Proteinpräparation zurückzuführen war. Die Bioaktivitäts-Daten sind in der Tabelle 7 zusammengefasst. Der EC50 von L3C, welches mit einem 40-kDa-PEG modifiziert ist, wurde unter Verwendung des NFS60-Zellproliferations-Assays als 30-50 pg/ml bestimmt.
  • Biologische Aktivitäten der hier beschriebenen PEGylierten G-CSF(C17S)-Cysteinmuteine sind den Aktivitäten von früher beschriebenen PEGylierten G-CSF-Proteinen überlegen, von denen alle biologische Aktivitäten aufweisen, welche relativ zu Wildtyp-G-CSF reduziert sind (Tanaka et al., 1991; Kinstler et al., 1996a; Bowen, et al., 1999). Tanaka et al. (1991) berichteten, dass G-CSF, modifiziert mit einem aminreaktiven 10-kDa-NHS-PEG, aus mehreren Molekulargewichts-Spezies und mehreren Isoformen bestand, die an unterschiedlichen Lysingruppen oder der N-terminalen Aminosäure modifiziert waren. Die biologische Aktivität dieser NHS-PEG-Mischung wurde als ungefähr 3-fach im Verhältnis zu ummodifizierten G-CSF verringert bestimmt (Tanaka et al., 1991; Satake-Ishikawa et al., 1992). Bowen et al. (1999) berichteten, dass bei G-CSF-Variante, modifiziert mit amin-reaktiven 5-kDa-, 10-kDa- und 20-kDa-PEGs, ungefähr 6-fache, 10-fache und 20-fache Verringerungen im Verhältnis zu unmodifizierten G-CSF vorlagen. Bowen et al. (1999) reinigten eine einzelne Molekulargewichts-Spezies der PEGylierten G-CSF-Variante, welche mit einem mit Amin reagierenden 20-kDa-PEG modifiziert war, und stellten fest, dass ihre biologische Aktivität ungefähr 4-fach im Verhältnis zu unmodifizierten G-CSF verringert war. Obwohl die von Bowen et al. (1999) isolierte einzelne Molekulargewichts-Spezies der G-CSF-Variante entsprach, welche mit einem einzelnen PEG-Molekül modifiziert war, war die PEG-Protein-Präparation heterogen, weil das PEG-Molekül an das Protein an mehreren Stellen angeheftet war. Kinstler et al. (1996) reinigten eine PEGylierte Met-G-CSF-Spezies, welche präferenziell an dem nicht-natürlichen amino-terminalen Methionin-Rest von E. coli-exprimiertem Met-G-CSF (cytoplasmatisch exprimiert) mittels Amin- oder Amidbindungen modifiziert ist. Dieses PEGylierte Met-G-CSF-Protein besaß lediglich 68% der In-vitro-Bioaktivität von Wildtyp-Met-G-CSF (Kinstler et al., 1996). Tabelle 7 Bioaktivitäten von PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen
    G-CSF-Protein EC50's (pg/ml)
    5 kDa PEG 20 kD a PEG
    Mittelwert Bereich1 Mittelwert Bereicha
    *-1C/ C17S 5,6 5,5, 5,5, 5,5, 6,0
    T1C/C17S 7,0 6,0, 7,0, 8,0
    L3C/C17S 5,5 5,0, 5,3, 6,2 8,8 8,0, 8,0, 9,0 10
    A6C/C17S 6,9 6,0, 6,0, 7,5, 8,0
    S7C/C17S 2,4 1,7, 3,0
    E93C/C17S 1,9 1,6, 2,0, 2,0, 2,0
    A129C/C17S 7,1 5,0, 5,2, 11
    T133C/C17S 7,4 5,2, 6,0, 11 9,0 6,0, 7,0, 11, 12
    A136C/C17S 6,9 6,0, 6,5, 6,5, 8,5
    A139C/C17S 6,8 5,0, 5,5, 10
    A141C/C17S 7,1 6,5, 7,0, 7,0, 8,0 9,3 6,0, 6,0, 12, 13
    Q173C/C17S 7,0 5,5, 5,5, 10 11 9,0, 10, 12, 13
    *175C/C17S 11 10,11,12 14 12, 12,16,16
    • a EC50-Werte aus einzelnen Experimenten
  • Beispiel 11
  • Verwendung eines Cystein-Blockierungsmittels verbessert Rückgewinnung von richtig gefalteten G-CSF-Cysteinmuteinen
  • Unlösliches, in E. coli-exprimiertes Wildtyp-G-CSF und G-CSF(C17S/Q173C) wurden durch Verfahrensweisen rückgefaltet, welche die Menge und den Typ an Reduktionsmittel und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von katalytischen Mengen von Kupfersulfat variierten. 5 mM Dithiothreitol (DTT) wurden als das Standard-Reduktionsmittel gewählt, basierend auf einer Literaturbezugsstelle, welche seine Verwendung in einem optimierten Rückfaltungs-Protokoll für G-CSF beschreibt (Kuga et al., 1989). Lu et al. (1992) beschreibt ein Protokoll zum Rückfalten/Renaturieren von unlöslichem G-CSF, bei welchem kein Reduktionsmittel während des Solubilisierungsschritts vorhanden ist, aber welches 40 μM Kupfersulfat in den Renaturierungspuffern enthält.
  • E. coli-Kulturen (400 ml) wurden herangezüchtet, und die Expression jedes G-CSF-Proteins wurde induziert, wie beschrieben im Beispiel 8. Die Zellen wurden lysiert, und der unlösliche Anteil wurde durch Zentrifugation isoliert, wie beschrieben im Beispiel 8. Das unlösliche Material, welches einen Großteil der unlöslichen G-CSF-Proteine enthielt, wurde in 20 ml von 8 M Harnstoff, 20 mM Tris, pH 8, suspendiert und gerührt, bis es homogen war. Die Mischung wurde in 6 Röhrchen aliquotiert. 5 mM DTT oder 25 mM Cystein wurden in manche der Röhrchen zugesetzt, wie beschrieben in der Tabelle 6. Nach einer Stunde wurden die Solubilisierungsmischungen in 25 ml 40 mM Natriumphosphat, 15% Glyzerol, pH 8, mit und ohne 40 μM Kupfersulfat verdünnt. Die Rückfaltungen wurden zwei Tage lang bei 4°C stehen gelassen. Zu dieser Zeit wurde der pH-Wert jeweils auf 4 eingestellt. Die Rückfaltungen wurden zentrifugiert, die Überstände wurden auf eine S-Sepharose-Säule aufgetragen, und die G-CSF-Wildtyp- und Q173C-Proteine wurden gereinigt, wie beschrieben im Beispiel B. Säulenfraktionen wurden vereinigt, basierend auf Analyse mit nicht-reduzierender SDS-PAGE, wie beschrieben im Beispiel B. Die Menge jedes Proteins, welche nach der Chromatografie zurückgewonnen wurde, ist in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 8 Rückgewinnungen von G-CSF-Proteinen, rückgefaltet/renaturiert in Gegenwart und Abwesenheit von verschiedenen Reduktionsmitteln
    Rückfaltungs-Protokoll Reduktionsmittel Kupfersulfat G-CSF (WT) Ausbeute (μg)a G-CSF(C17S/Q173C) Ausbeute (μg)a
    A Keines Keines 49 161
    B Keines 40 μM 24 73
    C 5 mM DTT Keines 17 23
    D 5 mM DTT 40 μM 47 53
    E 25 mM Cystein Keines 60 243
    F 25 mM Cystein 40 μM 80 275
    • a Protein, zurückgewonnen aus 67 ml E. coli-Kultur
  • Wie in der Tabelle 8 gezeigt, wurden die größten Ausbeuten von G-CSF-Wildtyp und des G-CSF-Cysteinmuteins erzielt, als Cystein als das Reduktionsmittel während des Solubilisierungsschritts verwendet wurde. Die Gegenwart von Kupfersulfat (40 μM) schien die Ausbeuten geringfügig zu erhöhen, wenn es in Verbindung mit einem Reduktionsmittel verwendet wurde. Eine nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analyse von Wildtyp-G-CSF-Proteinen, welche unter Verwendung der Rückfaltungs-Protokolle A-F zurückgewonnen wurden, zeigte, dass jedes hauptsächlich eine einzelne Molekulargewichts-Spezies der Größe enthielt, welche für monomeres G-CSF erwartet wurde (ungefähr 17 kDa unter nicht-reduzierenden Bedingungen). Wenn im Gegensatz dazu die S-Sepharose-Säule-Pools aus den G-CSF(C17S/Q173C)-Rückfaltungen A-D durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert wurden, war die Endproduktbande breit und enthielt eine Anzahl von Spezies von unterschiedlichem apparenten Molekulargewicht im monomeren Bereich. Das unterschiedliche Molekulargewicht kommt vermutlich daher zustande, dass die monomeren Spezies unterschiedliche Disulfid-Isoformen des G-CSF(C17S/Q173C)-Proteins repräsentieren. Das aus den Rückfaltungen E und F zurückgewonnene G-CSF(C17S/Q173C)-Protein lief als eine einzelne scharfe Bande, welche mit Wildtyp-G-CSF comigrierte, was anzeigt, dass eine einzelne, hauptsächliche gefaltete Spezies zurückgewonnen worden war. Die Daten zeigen, dass die Zugabe von Cystein während der Solubilisierungs- und Rückfaltungsschritte die Ausbeute an richtig gefaltetem G-CSF(C17S/Q173C)-Protein signifikant verstärkt. Obwohl man nicht wünscht, durch irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein, postulieren wir, dass das zugesetzte Cystein ein gemischtes Disulfid mit dem freien Cysteinrest im Mutein bildet. Das gemischte Disulfid limitiert mögliche Disulfid-Rearrangements, welche unter Beteiligung des freien Cysteinrests stattfinden könnten. Cystein kann effektiver als DTT sein, weil DTT typischerweise keine gemischten Disulfide bildet, wegen einer thermodynamisch bevorzugten intramolekularen Bindung, welche sich bei Oxidation bildet.
  • Beispiel 12
  • Vergleich von G-CSF-Proteinstabilitäten bei Herstellung in Gegenwart und Abwesenheit von Cystein
  • Wie in Beispiel 11 beschrieben unter Anwendung des Rückfaltungsverfahrens A (kein Reduktionsmittel, kein Kupfersulfat) und Rückfaltungsverfahrens F (25 mM Cystein, 40 μM Kupfersulfat) hergestellte Wildtyp-G-CSF- und G-CSF(C17S/Q173C)-Proteine wurden bei 50°C bei pH 4 und pH 8 stehen gelassen. An den Zeitpunkten 0, 5 Minuten, 30 Minuten, 1, 2, 3, 4, 5 und 20 Stunden wurden die Proteinproben zentrifugiert, um jedwede denaturierten Proteinausfällungen zu entfernen. Aliquots wurden von den Überständen entnommen und eingefroren. Am Ende des Experiments wurden alle Aliquots durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert, um zu bestimmen, welcher Abschnitt der ursprünglichen G-CSF-Protein-Probe in Lösung blieb und monomer war. Jede Prote-in-Halbwertszeit in Lösung wurde basierend auf relativen Bandenintensitäten, wie sie auf dem Gel sichtbar waren, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Stabilitäten von G-CSF-Proteinen, hergestellt unter Anwendung unterschiedlicher Rückfaltungs/Renaturierungs-Verfahren
    Proteinprobe pH Geschätzte Halbwertszeit
    G-CSF WT Rückfaltung A 4 3-4 Stunden
    G-CSF WT Rückfaltung F 4 3-4 Stunden
    G-CSF WT Rückfaltung A 8 ~1 Stunde
    G-CSF WT Rückfaltung F 8 ~1 Stunde
    G-CSF(C17S/Q173C) Rückfaltung A 4 ~30 Minuten
    G-CSF(C17S/Q173C) Rückfaltung F 4 > 20 Stunden
    G-CSF(C17S/Q173C) Rückfaltung A 8 < 15 Minuten
    G-CSF(C17S/Q173C) Rückfaltung F 8 > 20 Stunden
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Wildtyp-G-CSF eine längere Halbwertsdauer in Lösung bei pH 4 als bei pH 8 aufweist, was übereinstimmend mit den Ergebnissen ist, welche früher von Arakawa et al.
  • (1993) berichtet wurden. Die Halbwertszeit in Lösung von Wildtyp-G-CSF war nicht wesentlich unterschiedlich, ungeachtet dessen, ob das Protein unter Verwendung von Rückfaltungsverfahren A oder F rückgefaltet wurde. Im Gegensatz dazu wies G-CSF(C17S/Q173C) eine viel längere Halbwertsdauer in Lösung auf, wenn das Protein unter Anwendung von Verfahren F rückgefaltet wurde (> 20 Stunden), als bei Verfahren A (< 30 Minuten). Zusätzlich zur Erhöhung der Rückgewinnung von richtig gefalteten G-CSF-Cysteinmuteinen, erhöht die Verwendung von Cystein im Solubilisierungs/Rückfaltungs-Verfahren somit die thermische Stabilität des Endprodukts.
  • Weitere Untersuchungen können durchgeführt werden, um die Stabilitäten von G-CSF-Cysteinmuteinen mit Wildtyp-G-CSF zu vergleichen. Zum Beispiel kann eine Matrix von Experimenten durchgeführt werden durch Exponieren der Proteine an verschiedene pHs, Temperaturen und Serumkonzentrationen. An verschiedenen Zeitpunkten kann die Integrität der Proteine überwacht werden durch Assays, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den im Beispiel 8 beschriebenen NFS60-In-vitro-Zellproliferations-Bioaktivitäts-Assay, Größenausschlusschromatografie, Zirkulardichroismus, ELISA-Assays und Western-Blot-Analyse.
  • Beispiel 13
  • In-vivo-Wirksamkeit von PEG-G-CSF-Cysteinmuteinen
  • Gruppen von drei männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von jeweils ~320g erhielten eine einzelne intravenöse Injektion (laterale Schwanzvene) von rekombinantem Wildtyp-G-CSF (hergestellt von Bolder BioTechnology), Neupogen® (ein rekombinantes G-CSF, verkauft von Amgen, Inc.) oder PEG-L3C bei einer Dosis von 100 μg/kg. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt. An ausgewählten Zeitpunkten wurden Blutproben (0,3 bis 0,4 ml) von den Ratten in EDTA-Antigerinnungsröhrchen abgenommen. Aliquots der Blutproben wurden für eine Komplett-Blutzellen(CBC)-Zählung zu einer marktüblichen Firma übersandt. Der Rest der Blutprobe wurde zentrifugiert, und das Plasma wurde bei -80°C eingefroren. Blutproben wurden 0,25, 1,5, 4, 8, 12, 16, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 Stunden nach der Injektion entnommen. Eine 0-Stunden-Grundlinienprobe wurde ~24 h vor der Injektion der Testverbindungen erhalten. Die Tabellen 10 und 11 zeigen die durchschnittlichen Zählungen von Blutneutrophilen und gesamten weißen Blutkörpchen für die verschiedenen Testgruppen über die Zeit. Alle drei Testverbindungen stimulierten eine Zunahme in peripheren weißen Blutzellen und Neutrophilen über Grundlinienwerte hinaus. Die Zählungen für weiße Blutkörperchen und Neutrophile für die Testgruppen, welche rekombinantes Wildtyp-G-CSF und Neupogen® erhielten, erreichten einen Gipfel ~24 Stunden nach der Injektion und kehrten bei ~48 Stunden auf die Grundlinienwerte zurück. Im Gegensatz dazu erreichten die Zählungen für weiße Blutkörperchen und Neutrophile für die Ratten, welche PEG-L3C erhielten, einen Gipfel ~48-72 Stunden nach der Injektion und kehrten bis ~120 Stunden nach der Injektion nicht auf die Grundlinienwerte zurück. Die in Ratten, welche PEG-L3C erhielten, beobachteten Spitzenspiegel der weißen Blutkörperchen und Neutrophilen waren signifikant höher als für die Gruppen, welche rekombinantes Wildtyp-G-CSF oder Neupogen® erhielten (p < 0,05). Die Daten zeigen, dass PEG-L3C in der Lage ist, eine Erhöhung bei zirkulierenden Neutrophilen und weißen Blutkörperchen zu stimulieren, und dass die absolute Erhöhung bei Zählungen der peripheren weißen Blutkörperchen und bei Neutrophilen größer und lang anhaltender ist als jene, welche mit Wildtyp-G-CSF oder Neupogen® beobachtet wird.
  • Ähnliche Experimente können durchgeführt werden, um die Wirksamkeit von anderen PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen (C17- oder C17S-Versionen) aufzuzeigen. Ähnliche Untersuchungen können ebenfalls unter Anwendung des subkutanen Wegs für die Verabreichung der Proteine durchgeführt werden. Tabelle 10 Effekte von G-CSF, Neupogen® und PEG-L3C auf die Zählungen von neutrophilen Blutzellen im Anschluss an eine einzelne intravenöse Verabreichung der Proteine (100 μg/kg)
    Zeit (Stunden) Neutrophile Mittelwert +/- Standardabweichung (Zellen/μl Blut)
    G-CSFa Neupogen PEG-L3C
    0 1147 +/- 167 1906 +/- 564 1596 +/- 462
    4 6752 +/- 923 4504 +/- 549 b4237 +/- 624
    8 8437 +/- 546 5525 +/- 894 b5939 +/- 664
    12 10744 +/- 549 11891 +/- 1545 b8470 +/- 833
    24 11035 +/- 788 11148 +/- 977 b14849 +/- 1398
    48 2355+/- 218 2610 +/- 245 b,c18488 +/- 2954
    72 2113 +/- 438 3077 +/-590 b,c17353 +/- 2515
    96 2086+/- 496 2675 +/- 673 b,c5467 +/- 914
    120 2179+/- 373 2063 +/- 469 2390 +/- 238
    • a Wildtyp-G-CSF, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
    • b p<0,05 gegenüber 0-Stunden-Neutrophilenspiegeln
    • c p<0,05 gegenüber G-CSF und Neupogen beim gleichen Zeitpunkt
    Tabelle 11 Effekte von G-CSF, Neupogen® und PEG-L3C auf die Zählungen weißer Blutkörperchen im Anschluss an eine einzelne intravenöse Verabreichung der Proteine (100 μg/kg)
    Zeit (Stunden) Weiße Blutkörperchen Mittelwert +/- Standardabweichung (Zellen/μl Blut)
    G-CSFa Neupogen PEG-L3C
    0 11100 +/- 252 11100 +/- 829 12900 +/- 1320
    4 16000 +/- 1059 13600 +/- 570 13700 +/- 1923
    8 15200 +/- 371 14900 +/- 260 13800 +/- 1044
    12 18400 +/- 240 20100 +/- 674 b16700 +/- 586
    24 23900 +/- 1110 25500 +/- 1734 b29200 +/- 2321
    48 14700 +/- 426 15300 +/- 1715 b,c37400 +/- 4971
    72 15300 +/- 426 14800 +/- 764 b,c37800 +/- 4715
    96 14200 +/- 1000 14700 +/- 689 b18100 +/- 2550
    120 11000 +/- 2651 11300 +/- 1477 13800 +/- 1189
    • a Wildtyp-G-CSF, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
    • b p<0,05 gegenüber 0-Stunden-Spiegeln der weißen Blutkörperchen
    • c p<0,05 gegenüber G-CSF und Neupogen beim gleichen Zeitpunkt
  • Die Plasma-Proteinspiegel von G-CSF und PEGyliertem G-CSF-Cysteinmutein können quantifiziert werden unter Verwendung der im Handel erhältlichen G-CSF-ELISA-Kits (R&D Systems, Inc.). Titrationsexperimente können durchgeführt werden, um die relative Empfindlichkeit des ELISAs zum Nachweisen von Wildtyp-G-CSF, unmodifizierten G-CSF-Cysteinmuteinen und PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen zu bestimmen. Ähnliche Untersuchungen können unter Anwendung der subkutanen Route zur Verabreichung der Proteine durchgeführt werden.
  • Plasmakonzentrationen der Proteine aus dem oben in Beispiel 13 dargestellten Wirksamkeitsexperiment wurden unter Anwendung von Human-G-CSF-ELISA-Kits gemessen, welche von R&D Systems, Inc., erworben wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass 20-kDa-PEG-L3C eine signifikant längere Kreislauf-Halbwertsdauer aufweist als Wildtyp-G-CSF oder Neupogen® im Anschluss an eine intravenöse Verabreichung der Proteine an Ratten. Tabelle 12 Plasmakonzentrationen von G-CSF, Neupogen® und 20-kDa-PEG-L3C im Anschluss an eine einzelne intravenöse Verabreichung der Proteine (Dosis von 100 μg/kg)
    Zeit nach der Injektion (Stunden) G-CSFa (ng/ml) Neupogen (ng/ml) 20-kDa-PEGL3C (ng/ml)
    Mittelwert +/- Standardabweichung Mittelwert +/- Std.abw. Mittelwert +/- Std.abw.
    0 0 +/- 0 0 +/- 0 0 +/- 0
    0,25 6974 +/- 1809 7546 +/- 486 9667 +/- 1382
    1,5 1866 +/- 292 2083 +/- 461 8368 +/- 1215
    4 399 +/- 73 534 +/- 131 7150 +/- 892
    8 101 +/- 21 167 +/- 26 5692 +/- 1094
    12 14 +/- 5 26 +/- 1,1 4165 +/- 783
    16 2 +/- 3 2,9 +/- 0,5 3669 +/- 513
    24 0,9 +/- 0,3 0,08 +/- 0,03 2416 +/- 462
    48 0,16 +/- 0,01 0 +/- 0 773 +/- 137
    72 0,08 +/- 0,02 0 +/- 0 36 +/- 36
    Zeit nach der Injektion (Stunden) G-CSFa (ng/ml) Neupogen (ng/ml) 20-kDa-PEGL3C (ng/ml)
    Mittelwert +/- Std.abw. Mittelwert +/- Std.abw. Mittelwert +/- Std.abw.
    96 0,11 +/- 0,02 0 +/- 0 0,62 +/- 0,13
    120 0,05 +/- 0,02 0 +/- 0 0,15 +/- 0,02
    144 0,03 +/- 0,02 0 +/- 0 0,03 +/- 0,01
    • a Wildtyp-G-CSF, hergestellt von Bolder BioTechnology, Inc.
  • Die In-vivo-Wirksamkeit der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine (C17- oder C17S-Versionen) kann in normalen oder neutropenischen Nagetieren, wie Mäusen oder Ratten, gemessen werden, indem gezeigt wird, dass die Proteine Erhöhungen hinsichtlich Kreislauf-Neutrophilenspiegeln und Granulopoiese im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Tieren stimulieren. G-CSF stimuliert die Spiegel der Neutrophilen in normalen und neutropenischen Nagetieren bei einer Dosis von 100 μg/kg (Kubota et al., 1990; Kang et al., 1995). Zum Aufzeigen von Effektivität in normalen Mäusen können Gruppen von 5 Mäusen (jeweils mit einem Gewicht von 20 g) subkutane Injektionen von G-CSF, PEG-G-CSF-Cysteinmuteinen oder Placebo (Vehikellösung) bei spezifischen Intervallen während bis zu fünf Tagen erhalten. Normale Mäuse, wie ICR-Mäuse, können von einem kommerziellen Verkäufer erworben werden. Am Tag 6 können die Tiere getötet werden, und Blutproben für die Analyse durch Gesamt-Blutkörperchen-Zählung (CBC) abgenommen werden. Hämatopoietische Gewebe (Leber und Milz) können abgesammelt, gewogen und in Formalin für histopathologische Analysen fixiert werden, um nach Beweisen einer erhöhten Granulopoiese zu suchen. Knochenmark kann aus verschiedenen langen Knochen und dem Sternum für Einheits-Partikel-Präparationen und histopathologische Analyse entnommen werden, um nach Anzeichen einer erhöhten Granulopoiese zu suchen. Vergleiche zwischen Gruppen sollten unter Verwendung eines T-Tests nach Student für Einzelvergleiche und einer Ein-Weg-Analyse der Varianz für Mehrfachvergleiche vorgenommen werden. P<0,05 sollte als signifikant angesehen werden. Die PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine sollten größere Erhöhungen in den Kreislauf-Neutrophilen-Spiegeln und in der Granulopoiese in den Mäusen stimulieren, verglichen mit den Mäusen, welche mit Vehikel behandelt wurden. Die Effektivität der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine, die mit 5-kDa-, 10-kDa-, 20-kDa- oder 40-kDa-PEGs modifiziert wurden, kann getestet werden, wenn sie einmal, einmal am Tag, jeden zweiten Tag oder jeden dritten Tag verabreicht werden. In anfänglichen Experimenten können unterschiedliche Gruppen von Mäusen subkutane Injektionen von 0,0032, 0,016, 0,08, 0,4 und 2 μg der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine pro Injektion erhalten. Kontrollmäuse können nur Vehikellösung erhalten. Zusätzliche Kontrollgruppen können Wildtyp-G-CSF (2 μg/jeden Tag (ED) während 5 Tagen) und 2 μg Wildtyp-G-CSF unter Anwendung desselben Dosierungsplans wie bei den PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen erhalten.
  • Die Effektivität der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine kann auch in neutropenischen Mäusen demonstriert werden. Neutropenie kann durch Behandlung mit Cyclophosphamid (CPA; 100 mg/kg) herbeigeführt werden, welches ein allgemein verwendetes myelosuppressives chemotherapeutisches Mittel ist und für die humanklinischen Gegebenheiten relevant ist. G-CSF beschleunigt die Wiederherstellung von normalen Neutrophilenspiegeln in Cyclophosphamidbehandelten Tieren (Kubota et al., 1990; Kang et al., 1995; Matsuzaki et al., 1996). Mäuse (~20g) können eine intraperitoneale Injektion von Cyclophosphamid am Tag 0 erhalten, um Neutropenie herbeizuführen. Die Tiere sollten in verschiedene Gruppen eingeteilt werden, welche subkutane Injektionen von G-CSF, PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen oder Placebo bei spezifischen Intervallen während bis zu fünf Tagen erhalten sollten. Eine Kontrollgruppe sollte kein Cyclophosphamid erhalten, sondern sollte Placebo-Injektionen erhalten. Die Effektivität der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine, die modifiziert wurden mit 5-kDa-, 10-kDa 20-kDa- oder 40-kDa-PEGs, kann getestet werden, wenn sie einmal, jeden zweiten Tag oder jeden dritten Tag verabreicht werden. In Anfangsexperimenten können verschiedene Gruppen von Mäusen subkutane Injektionen von 0,0032, 0,016, 0,08, 0,4 und 2 μg pro Injektion an PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen erhalten. Kontrollmäuse können lediglich Vehikellösung erhalten. Zusätzliche Kontrollgruppen können Wildtyp-G-CSF (2 μg/jeden Tag (ED) während 5 Tagen) und 2 μg/Injektion Wildtyp-G-CSF unter Anwendung des gleichen Dosierungsschemas wie für die PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine erhalten. An den Tagen 0-10 können fünf Mäuse pro Gruppe getötet werden, und Blut- und Gewebeproben analysiert werden, wie beschrieben für die oben genannten normalen Mausexperimente. Die PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine sollten eine beschleunigte Erhöhung der Kreislauf-Neutrophilenspiegel und der Granulopoiese in den Mäusen stimulieren, verglichen mit der Kontrollgruppe, welche eine Vehikel-Injektion und CPA-Injektion erhielt.
  • Alternativ dazu kann die Effektivität von PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen in Neutropenie-Studien unter Verwendung eines Rattenmodells aufgezeigt werden. G-CSF beschleunigt die Wiederherstellung von normalen Neutrophilenspiegeln in Ratten, welche mit myelosuppressiven chemotherapeutischen Mitteln behandelt wurden. In diesem Fall können Gruppen von Spague-Dawley-Ratten (Gewicht je ~300g) eine intraperitoneale Dosis von CPA (100 mg/kg) am Tag 0 erhalten, um Neutropenie herbeizuführen. Die Tiere können dann in drei Gruppen eingeteilt werden, und zwar diejenigen, welche subkutane Injektionen von G-CSF, PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen oder Placebo bei spezifizierten Intervallen während bis zu 10 Tagen erhalten. Eine Kontrollgruppe kann Placebo-Injektionen anstatt Cyclophosphamid erhalten. In Anfangsexperimenten kann die Wirksamkeit der PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteine, welche mit 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEGs modifiziert wurden, gemessen werden durch Ausführen von subkutanen Dosierungen von ~0,1 μg-500 μg/kg (wobei der bevorzugte Bereich sich auf 1-100 μg/kg beläuft), wenn die Dosierungen einmal, jeden Tag, alle zwei Tage oder alle drei Tage verabreicht werden. Eine zusätzliche Kontrollgruppe kann kommerziell verfügbaren Wildtyp-G-CSF (100 μg/kg) jeden Tag während 5 Tagen erhalten, und eine weitere Kontrollgruppe kann Wildtyp-G-CSF bei der gleichen Dosis und mit dem gleichen Dosierungsschema wie bei den PEGylierten G-CSF-Cysteinmutanten erhalten. Kontrollratten können nur die Vehikellösung erhalten. An den Tagen 0-6, 8, 10, 12 und 14 können Blutproben für die CBC-Analyse abgenommen werden. Beim Abschluss des Zeitverlaufs können die Ratten zur Absammlung der hämatopoietischen Gewebe und von Knochenmark getötet werden, um nach Beweisen einer erhöhten Granulopoiese zu untersuchen. Die PEGylierten G-CSF-Cysteinmutanten sollten eine beschleunigte Erhöhung der Kreislauf-Neutrophilenspiegel und der Granulopoiese in den Ratten stimulieren, verglichen mit der Vehikel-injizierten, CPA-injizierten Kontrollgruppe.
  • Beispiel 14
  • Klonierung, Expression, Reinigung und Bioaktivität von Wildtyp-GM-CSF
  • A. Klonierung von DNA-Sequenzen, welche GM-CSF codieren.
  • Wir klonierten und sequenzierten eine cDNA, die humanen GM-CSF codiert, mittels RT-PCR von Gesamt-RNA, welche aus der humanen Blasenkarzinom-Zelllinie 5637 (erhalten von der American Type Culture Collection) isoliert wurde. Eine G-CSF codierende cDNA wurde durch PCR aus Gesamt-RNA amplifiziert, welche aus der humanen Blasenkarzinom-Zelllinie 5637 (American Type Culture Collection) isoliert worden war. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, welches mit 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt war, wachsen gelassen. RNA wurde aus den Zellen unter Anwendung eines RNeasy-Mini-RNA-Isolations-Kits, welches von Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) erworben worden war, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers isoliert. Erststrang-Synthese von einzelsträngiger cDNA wurde unter Verwendung eines "1st Strand"-cDNA-Synthese-Kits für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim Corp. bewerkstelligt, und statistische Hexamere wurden als der Primer verwendet. Anschließende PCR-Reaktionen unter Verwendung der Produkte der Erststrang-Synthese als Matrize wurden mit Vorwärts-Primer BB267 (5> GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT G >3; SEQ ID Nr. 75) und Rückwärts-Primer BB268 (5> CTT GTA GTG GCT GGC CAT CAT G >3; SEQ ID Nr. 76) durchgeführt. Der Primer BB268 annealt an das 5'-Ende der codierenden Sequenz für das GM-CSF-Sekretionssignal, und der Rückwärts-Primer BB268 annealt an das 3'-Ende der GM-CSF-codierenden Sequenz. Das resultierende ~450 bp große PCR-Produkt wurde mit Hind III und Bam HI verdaut, über ein Gel gereinigt und in den Vektor pCDNA3.1(+) kloniert, welcher mit Hind III und Bam HI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Ein Klon mit der korrekten DNA-Sequenz wurde als pCDNA3.1(+)::GM-CSFfus oder pBBT267 bezeichnet. Wir verwendeten PCR, um diesen GM-CSF-Klon für periplasmatische Expression in E. coli zu modifizieren. Bei Expression in E. coli über Sekretion in das Periplasma enthält GM-CSF kein angefügtes N-terminales Methionin und besitzt eine identische Aminosäuresequenz zu natürlich vorkommendem GM-CSF (Lee et al., 1985). Um eine sezernierte Form von GM-CSF zu exprimieren, wurde PCR angewandt, um die Leadersequenz des Gens für hitzestabiles Enterotoxin (STII) von E. coli (Picken et al., 1983), welchem eine Nde I-Restriktionsstelle vorangeht, an die aminoterminale codierende Sequenz von reifem GM-CSF zu fusionieren. Darüber hinaus wurde ein TAA-Stopcodon, welchem unmittelbar eine Eco RI-Restriktionsstelle folgte, anschließend an den carboxyterminalen Rest E127 hinzugefügt. Zur gleichen Zeit wurden Codons für Proline an den Positionen 2, 6, 8, 12, 117 und 124 sämtlich zu CCG verändert, und das Codon für Leucin an Position 114 wurde zu CTG geändert. Die PCR-Reaktion verwendete den Vorwärts-Primer BB300 (5> CGC AAC GCG TAC GCA GCA CCG GCC CGC TCG CCG AGC CCG AGC ACG CAG CCG TGG GAG >3; SEQ ID Nr. 77) und den Rückwärts-Primer BB301 (5> CGC GAA TTC PTA CTC CTG GAC CGG CTC CCA GCA GTC AAA CGG GAT GAC CAG CAG AAA >3; SEQ ID Nr. 78) mit pBBT267 als Matrize. Das resultierende ~400 bp große PCR-Produkt wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut, über ein Gel gereinigt und in pBBT227 kloniert, welcher oben in Beispiel 9 beschrieben ist. pBBT227-DNA wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen. Das ~2,4 kb große Vektorfragment wurde gereinigt und in der Ligation verwendet. Die resultierenden Rekombinanten tragen einen vollständigen stII-Leader, fusioniert an GM-CSF, und dieses "stII-GM-CSF"-Konstrukt kann als ein Nde I-Eco RI-Fragment von ~450 bp herausgeschnitten werden. Ein Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pUC18::stII-GM-CSF bezeichnet. Für Expressionsuntersuchungen wurde das Nde I-Eco RI-Fragment dieses Plasmids in den Expressionsvektor pBBP257 subkloniert, welcher nachstehend beschrieben ist. Das resultierende Plasmid, pBBT257; stII-muGM-CSF oder pBBT271 wurde zur Expression in E. coli W3110 eingebracht.
  • Das Plasmid pBBT257 wurde aus dem Expressionsvektor pCYB1 (New England BioLabs) durch Deletieren des Ampicillinresistenz-Gens von pCYB1 und Ersetzen desselbigen mit dem aus dem klassischen Klonierungsvektor pBR322 (Bolivar et al., 1977), abgeleiteten Gen für Tetracyclinresistenz abgeleitet. Sowohl in pBBT257 als auch pCYB1 steht die Expression des klonierten Gens unter der Steuerung des tac-Promotors, welcher von dem Produkt des Plasmidgetragenen lacIq-Gens reguliert wird. Diese Vektoren gestatten, dass Gene als unfusionierte Proteine oder als Fusionen an eine Chitin-Bindungs-Domäne exprimiert werden; unsere Konstrukte wurden so erzeugt, dass die Proteine als unfusionierte Proteine exprimiert werden. Das Plasmid pBBT257 wurde wie folgend konstruiert. Das Tetracyclinresistenz-Gen (TcR-Gen) von Plasmid pBR322 (erworben von New England BioLabs) wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer BB228 (5> CGC GCT GCA GTT CTC ATG TTT GAC AGC TTA TCA TC >3; SEQ ID Nr. 41) und BB229 (5> CGC GCT GCA G AT TTA AAT TAG CGA GGT GCC GCC GGC TTC CAT >3; SEQ ID Nr. 42) amplifiziert. Der Vorwärts-Primer BB228 annealt an die Nukleotide 1 bis 25 der pBR322-Sequenz (GenBank-Zugangsnummer J01749), welche stromaufwärts des TcR-Gens lokalisiert sind und die "-35"-Region des TcR-Gen-Promotors einschließen. Das Oligo BB228 enthält eine hinzugefügte Pst I-Stelle für Klonierungszwecke. Der Rückwärts-Primer BB229 annealt an die Nukleotide 1277 bis 1300, welche unmittelbar stromabwärts des Translations-Stopcodons lokalisiert sind, welches der codierenden Sequenz des TcR-Gens folgt. BB229 enthält eine hinzugefügte Dra I-Stelle für Klonierungszwecke. Die 40-μl-PCR-Reaktion wurde in 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 (25°C), 0,1% Triton® X-100, 1,5 mM MgCl2 durchgeführt, und schloss dNTPs bei jeweils 200 μM, 20 pmol jedes Primers, 0,5 ng pBR322-DNA, 2,5 Units Taq-Polymerase (Promega) und 0,5 Units pfu-Polymerase (Stratagene) ein. Die PCR-Reaktion bestand aus: 95°C während 3 Minuten, 25 Zyklen von [94°C während 30 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden, 72°C während 90 Sekunden], gefolgt von einem Halt bei 4°C. Das resultierende 4300 bp große Produkt wurde über ein Gel gereinigt, mit Pst I und Dra I verdaut und in einer Ligationsreaktion, wie nachstehend beschrieben, verwendet. Gereinigte pCYB1-DNA wurde mit Pst I und Swa I verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm gemäß den Protokollen des Herstellers (New England BioLabs) verdaut. Pst I und Swa I schneiden den Vektor jeweils einmal und flankieren das Ampicillinresistenz(ApR)-Gen. Die Verdauungsprodukte wurden unter Verwendung eines QIAquick-PCR-Aufreinigungs-Kits (Qiagen) gemäß dem Herstellerprotokoll aufgereinigt und anschließend auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen. Das ~5,3 kb große Vektorfragment, bei welchem das ApR-Gen deletiert war, wurde über ein Gel gereinigt und mit dem Pst I-Dra I-geschnittenen PCR-Produkt, welches das TcR-Gen enthielt, ligiert. Sowohl Dra I als auch Swa I erzeugen glattendig gemachte Verdauprodukte, welche zusammenligiert werden können. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren, und Tetracyclin-resistente Transformanten wurden selektiert. Drei Isolate wurden anschließend analysiert, und von allen wurde gefunden, empfindlich gegenüber Ampicillin zu sein. Von diesen Isolaten erhaltene Restriktionsendonuklease-Verdauprodukte waren auch konsistent mit der Deletion des 1500 bp großen Pst I- und Swa I-Fragments, welches das ApR-Gen enthält, und dessen Ersetzung durch das 1300 bp große Pst I-Dra I-Fragment, welches das TcR-Gen trägt. Ein als pBBT257 bezeichnetes Isolat wurde zur Verwendung in der Expression von rekombinanten Proteinen ausgewählt.
  • B. Expression von Wildtyp-GM-CSF in E. coli.
  • Für die Expression von sezerniertem GM-CSF wurden pBBT271 [pBBT257::STII-GM-CSF] und der pBBT257-Stammform-Vektor in E. coli W3110 transformiert. Die resultierenden Stämme wurden als BOB340: W3110(pBBT257) und BOB350: W3110(pBBT271) bezeichnet. Frische gesättigte Übernachtkulturen wurden bei ~0,05 OD @ A600 in LB, welches 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, inokuliert. Diese 100-ml-Kulturen wurden in einem 500 ml großen Schüttelkolben mit Prallwänden bei 28°C in einem gyrotorischen Schüttelwasserbad bei ~250 U/min wachsen gelassen. Als die Kultur eine Dichte von ~0,6 OD erreichte, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, und die induzierte Kultur wurde dann über Nacht während ~16 h inkubiert. Proben von induzierten und nicht-induzierten Kulturen wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf im Voraus gegossenen 16%igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Die induzierte Kultur von BOB350 (GM-CSF) ergab eine Bande bei ungefähr 14 kDa, was konsistent mit dem Molekulargewicht von reifem GM-CSF ist. Diese Bande wurde nicht in einer uninduzierten Kultur von BOB350 oder in induzierten oder nicht-induzierten Kulturen von BOB340, der Nur-Vektor-Kontrolle, detektiert. Western-Blot-Analysen zeigten, dass diese ~14 kDa große Bande stark mit einem Anti-Human-GM-CSF-Antiserum (R&D Systems) reagierte. Dieses Antiserum erkannte keine Proteine in nicht-induzierten Kulturen von BOB340 und BOB350 oder in der induzierten Kultur BOB340, der Nur-Vektor-Kontrolle. Diese Western-Blots zeigten ebenfalls, dass diese ~14 kDa große Bande mit einem kommerziellen, aus E. coli abgeleiteten humanen GM-CSF-Standard, welcher von R&D Systems erworben wurde, comigrierte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das STII-Leader-Peptid entfernt worden ist, was konsistent damit ist, dass das Protein in das Periplasma sezerniert worden ist. Nachstehend dargestellte N-terminale Sequenzierungsuntersuchungen zeigen, dass die STII-Signalsequenz korrekt prozessiert worden war.
  • Die 16 Stunden Nach-Induktions-Proben aus diesen Kulturen wurden ebenfalls einem osmotischen Schock unterzogen, basierend auf der Vorgehensweise von Koshland und Botstein (1980). Dieses Vorgehen zerstört die E. coli-Außenmembran und setzt den Inhalt des Periplasmas in das umgebende Medium frei. Eine anschließende Zentrifugation trennt die löslichen periplasmatischen Komponenten (zurückgewonnen im Überstand) von cytoplasmatischen, unlöslichen periplasmatischen und zell-assoziierten Komponenten (zurückgewonnen im Pellet). Wenig des synthetisierten GM-CSF-Proteins wurde im Überstand rückgewonnen. Die Hauptmasse des GM-CSF blieb mit dem Pellet assoziiert. Dies zeigt an, dass, obgleich das Protein prozessiert und in das Periplasma sezerniert worden zu sein scheint, es sich dort hauptsächlich in einer unlöslichen Form akkumuliert. Ähnliche Ergebnisse sind von anderer Seite für GM-CSF, welches in das E. coli-Periplasma sezerniert worden ist, berichtet worden (Libby et al., 1987; Greenberg et al., 1988).
  • C. Reinigung von Wildtyp-GM-CSF.
  • Wildtyp-GM-CSF wurde bei einem größeren Maßstab unter Anwendung der nachstehenden Protokolle exprimiert und gereinigt. Eine frische gesättigte Übernachtkultur von BOB350 (Wildtyp) wurde bei ~0,05 OD @ A600 in LB, welches 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, inokuliert. Die 400-ml-Kultur wurde in einem 2 Liter großen Schüttelkolben mit Prallwänden bei 28°C in einem gyrotorischen Schüttelwasserbad bei ~250 U/min wachsen gelassen. Als die Kultur eine Dichte von ~0,6 OD erreichte, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Die induzierte Kultur wurde dann über Nacht während ~16 h inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und bei -80°C eingefroren. Das Zellpellet wurde aufgetaut und mit 5 ml B-PERTM Bakterienprotein-Extraktionsreagenz gemäß den Protokollen des Herstellers (Pierce) behandelt. Der unlösliche Anteil und die Hauptmasse des GM-CSF-Proteins wurden durch Zentrifugation zurückgewonnen und in B-PER resuspendiert. Diese Mischung wurde mit Lysozym (200 μg/ml) während 10 Minuten behandelt, um die Zellwände weiter zu zerstören, und MgCl2 (letztendlich 10 mM) und proteasefreie DNAse (2 μg/ml) wurden zugegeben. Unlösliches GM-CSF wurde durch Zentrifugation abgesammelt und gewaschen durch Resuspendieren in Wasser und erneutes Zentrifugieren, um den Großteil der solubilisierten Zelltrümmer zu entfernen. Für die Rückfaltung wurde das resultierende Pellet, enthaltend unlösliches GM-CSF, in 10 ml 8 M Harnstoff, 25 mM Cystein in 20 mM Tris-Base gelöst. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, und dann in 100 ml 20 mM Tris, 40 μM Kupfersulfat, 15% Glyzerol, pH 8,0, verdünnt. Dieses Rückfaltungsgemisch wurde 2 Tage lang bei 4°C gehalten und dann zentrifugiert und auf eine 5 ml große Q-Sepharose-Säule (Pharmacia HiTrap) aufgetragen, welche in 20 mM Tris, pH 8,0 (Puffer A) äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Salzgradienten von 0-35% Puffer B (1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 8) eluiert. Säulenfraktionen wurden durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert. GM-CSF eluierte bei ungefähr 230 mM NaCl. Fraktionen, welche hauptsächlich GM-CSF enthielten, wurden vereinigt.
  • Der Q-Sepharose-Pool wurde mit einem gleichen Volumen von 30% Ammoniumsulfat verdünnt und auf Raumtemperatur erwärmt, vor Auftragen auf eine 1 ml große Phenyl-HP-Säule (Pharmacia HiTrap), welche zuvor mit 15% Ammoniumsulfat in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, äquilibriert worden war. Gereinigter GM-CSF wurde aus der Säule durch Flution mit einem reversen Salzgradienten (15% Ammoniumsulfat bis 0% Ammoniumsulfat in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5) zurückgewonnen. Das Phenyl-HP-Säulen-Elutionsprofil für GM-CSF zeigte einen einzelnen Haupt-Peak, welcher bei ungefähr 6,5% Ammoniumsulfat eluierte. Säulenfraktionen über den Peak hinweg wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, welche GM-CSF und keine sichtbaren Kontaminanten enthielten, wurden vereinigt. Die Endausbeute an Wildtyp-GM-CSF, wie durch Bradford-Analyse bestimmt, belief sich auf etwa 2,6 mg aus 400 ml Kultur. Eine N-terminale Sequenzierung von Wildtyp-GM-CSF unter Verwendung von automatisierter Edman-Abbau-Chemie ergab die Sequenz APARSPS, welche in identischer Weise den ersten sieben Aminosäuren von reifem humanem GM-CSF entspricht, und zeigt an, dass der N-Terminus korrekt prozessiert wird (Lee et al., 1985). Gereinigter Wildtyp-GM-CSF und kommerziell erhältlicher GM-CSF (E. coli-exprimiert; R&D Systems) comigrierten unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen, wie durch Western-Blot-Analyse gezeigt. Beide Proteine zeigten die erwartete Mobilitätsverschiebung zu einem höheren apparenten Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen auf Grund der Disruption der intramolekularen Disulfidbindungen.
  • D. In-vitro-Bioaktivitäten von Wildtyp-GM-CSF.
  • Ein Zellproliferations-Assay unter Verwendung der humanen erythroleukämischen Zelllinie TF-1 (Kitamura et al., 1989) wurde entwickelt, um die Bioaktivität von Wildtyp-GM-CSF zu messen. Die humane TF-1-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium gehalten, welches mit 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 2 ng/ml rekombinantem humanen GM-CSF (E. coli-abgeleitet; R&D Systems) supplementiert worden war. Im Allgemeinen wurden die Bio-Assays durch dreimaliges Waschen der TF-1-Zellen mit RPMI-1640-Medium (keine Zusatzstoffe) und Resuspendieren der Zellen bei einer Konzentration von 1 × 105/ml in RPMI-1640-Medium, welches 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin enthielt (Assay-Medium), angesetzt. Fünfzig μl (5 × 103-Zellen) der Zellsuspension wurde pro Testvertiefung einer Flachboden-96-Vertiefungs-Gewebekulturplatte aliquotiert. Serielle Verdünnungen der zu testenden Proteinproben wurden in Assay-Medium hergestellt. Serielle Verdünnungen von kommerziellem rekombinanten humanen GM-CSF (E. coli-exprimiert; R&D Systems) wurden parallel dazu analysiert. 50 μl der verdünnten Proteinproben wurden in die Testvertiefungen zugesetzt, und die Platten wurden bei 37°C in einem Gewebekultur-Inkubator mit angefeuchtetem 5% CO2 inkubiert. Proteinproben wurden in Vertiefungen bei dreifacher Ausfertigung geassayt. Nach ~3 Tagen wurden 20 μl einer MTS/PMS-Mischung (CellTiter 96 AQueous One Solution, Promega) zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 1-4 Stunden lang bei 37°C im Gewebekultur-Inkubator inkubiert. Die Absorption der Vertiefungen wurde bei 490 nm unter Anwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts abgelesen. Kontrollvertiefungen enthielten Medium, aber keine Zellen. Durchschnittliche Absorptionswerte für die Kontrollvertiefungen in dreifacher Ausfertigung wurden von Mittelwerten, die für die Testvertiefungen erhalten worden waren, subtrahiert. EC50s, die Konzentration bei halbmaximaler Stimulation, wurden für jede Probe berechnet, um die Bioaktivitäten der Proteine zu vergleichen.
  • Die TF-1-Zelllinie zeigt eine starke proliferative Antwort auf GM-CSF, wie verdeutlicht durch eine dosisabhängige Erhöhung in der Zellzahl und den Absorptionswerten. Kommerzielles GM-CSF und von uns hergestelltes GM-CSF wiesen mittlere EC50-Werte von 97 bzw. 105 pg/ml im Bio-Assay auf (Tabelle 13).
  • Beispiel 15
  • Konstruktion, Expression, Reinigung und Bioaktivität von GM-CSF-Cysteinmuteinen
  • A. Konstruktion von GM-CSF-Cysteinmuteinen.
  • Dreizehn Mutanten-GM-CSF-Gene wurden unter Anwendung von ortsgerichteter, PCR-basierender Mutagenese konstruiert, wie es im Allgemeinen von Innis et al. (1990) und Horton et al. (1993) und im Beispiel 9 beschrieben wird. Wir konstruierten fünf Muteine in der aminoterminalen Region proximal zur Helix A [*-1C (Addition eines Cysteinrests auf den natürlichen Amino-Terminus), A1C, A3C, S5C und S7C]; ein Mutein im B-C-Loop [S69C]; drei Muteine im C-D-Loop [E93C, T94C und T102C]; und drei Muteine in der carboxyterminalen Region distal zur Helix D [V125C, Q126C und *128C (Addition eines Cysteinrests an den natürlichen Carboxy-Terminus)]. Wir konstruierten auch ein Mutein an einer vermeintlichen N-verknüpften Glykosylierungsstelle [N27C], welche am distalen Ende von Helix A lokalisiert ist. Die für die mutagenen PCR-Reaktionen verwendete Matrize war das Plasmid pBBT268, in welchem das STII-GM-CSF-Gen als ein Nde I-Eco RI-Fragment in pUC18 kloniert ist. PCR-Produkte wurden mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut, über ein Gel gereinigt und mit pBBT268-Vektor-DNA ligiert, welche mit diesen selben Restriktionsenzymen geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Transformanten aus diesen Ligationen wurden wachsen gelassen und Plasmid-DNAs wurden isoliert und sequenziert. Die Sequenz des gesamten klonierten mutagenisierten PCR-Fragments wurde bestimmt, um das Vorhandensein der Mutation von Interesse und die Abwesenheit von jedweden zusätzlichen Mutationen, welche potenziell durch die PCR-Reaktion oder durch die synthetischen Oligonukleotid-Primer eingeführt worden sein könnten, zu bestätigen.
  • Für die Expression in E. coli als in den periplasmatischen Raum sezernierte Proteine wurden die STII-GM-CSF-Gene, welche die 13 Muteine codieren, aus den pUC18-basierenden pBBT268-Derivaten als Nde I-Eco RI-Fragmente von ~450 bp herausgeschnitten, in den Expressionsvektor pBBT257 subkloniert und in E. coli W3110 transformiert.
  • Unter Verwendung von Vorgehensweisen, welche ähnlich zu den hierin beschriebenen sind, kann man andere Cysteinmuteine von GM-CSF konstruieren. Die Cysteinmuteine können Substitutionsmutationen, welche Cystein für einen natürlichen Amino[säure]rest in der GM-CSF codierenden Sequenz substituieren, Insertionsmutationen, welche einen Cysteinrest zwischen zwei natürlich vorkommenden Aminosäuren in der GM-CSF codierenden Sequenz inserieren, oder Additionsmutationen sein, welche einen Cysteinrest vorausgehend der ersten Aminosäure A1 der GM-CSF codierenden Sequenz addieren oder einen Cysteinrest nachfolgend zum terminalen Aminosäuerest E127 der GM-CSF codierenden Sequenz addieren, sein. Die Cysteinreste können für jedwede Aminosäure substituiert werden, oder zwischen jedweden zwei Aminosäuren inseriert werden, an beliebiger Stelle in der GM-CSF codierenden Sequenz. Bevorzugte Stel len zum Substituieren oder Inserieren von Cysteinresten in GM-CSF liegen in der der Helix A vorangehenden Region, dem A-B-Loop, dem B-C-Loop, dem C-D-Loop und der Region distal zur Helix D. Andere bevorzugte Stellen sind die ersten oder letzten drei Aminosäuren der A-, B-, C- und D-Helizes. Einige bevorzugte Positionen für Cysteinmutationen sind in der Tabelle 13 beschrieben. Andere bevorzugte Positionen schließen R67C, G68C, L70C, R30C, T32C, A33C, E35C, N37C, T39C, E45C, D48C, Q50C, E51C, Q99C, T98C, E113C und E127C ein. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Mutationen werden andere bevorzugte Reste in diesen Regionen zur Erzeugung von Cysteinsubstitutionen in der PCT/US98/14497 beschrieben.
  • Man kann ebenfalls GM-CSF-Muteine, welche ein freies Cystein enthalten, konstruieren durch Substituieren einer sonstigen Aminosäure für einen der natürlich vorkommenden Cysteinreste in GM-CSF, welcher normalerweise eine Disulfidbindung ausbildet. Der natürlich vorkommende Cysteinrest, der normalerweise eine Disulfidbindung mit dem substituierten Cysteinrest ausbildet, ist nun frei. Der Cysteinrest kann mit jedweder der anderen 19 Aminosäuren ersetzt werden, jedoch vorzugsweise mit einem Serin- oder Alaninrest. Ein freier Cysteinrest kann auch durch chemische Modifikation einer natürlich vorkommenden Aminosäure unter Anwendung von Vorgehensweisen, wie denjenigen, welche von Sytkowski et al. (1998) beschrieben wurden, in GM-CSF eingeführt werden.
  • Mehrfachmutanten, welche zwei oder mehr hinzugefügte freie Cysteinreste enthalten, können ebenfalls konstruiert werden, entweder durch aufeinander folgende Mutageneserunden unter Anwendung der in den Beispielen 8, 9, 14 und 15 beschriebenen Vorgehensweisen, oder alternativ dazu durch In-vitro-Rekombination von individuellen Mutanten zum Konstruieren rekombinanter Expressionsplasmide, codierend Muteine mit zwei oder mehr freien Cysteinen. Die bevorzugten Mehrfachmutanten werden diejenigen sein, welche zwei oder mehr Cysteinmuteine kombinierten, die jeweils hohe Aktivität bei PEGylierung beibehalten, zum Beispiel A3C plus S69C, S69C plus E93C und A3C plus E93C. Andere bevorzugte Mehrfachmutanten können basierend auf den Daten aus der Tabelle 9 und Tabelle 10 abgeleitet werden und werden Kombinationen einschließen, welche zwei oder mehr Mutationen aus der Gruppe enthalten, welche *-1C, A1C, A3C, S5C, S7C, S69C und E93C einschließt.
  • Unter Anwendung von Vorgehensweisen, welche denjenigen, die in den Beispielen 14-16 beschrieben werden, ähnlich sind, kann man die Proteine in E. coli exprimieren, die Proteine reinigen, die Proteine PEGylieren und ihre Bioaktivitäten in einem In-vitro-Bio-Assay messen. Die Proteine können cytoplasmatisch in E. coli oder als in den periplasmatischen Raum sezernierte Proteine exprimiert werden. Die Muteine können auch in eukaryotischen Zellen, wie Insekten- oder Säugerzellen, exprimiert werden, unter Anwendung von Vorgehensweisen, welche ähnlich zu denjenigen sind, die in PCT/US00/00931 beschrieben werden, oder verwandten Vorgehensweisen, die dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Wenn eine Sekretion aus eukaryotischen Zellen gewünscht wird, kann die natürliche GM-CSF-Signalsequenz oder eine andere Signalsequenz verwendet werden, um die Proteine aus eukaryotischen Zellen zu sezernieren.
  • B. Expression und Reinigung von GM-CSF-Cysteinmuteinen.
  • E. coli-Stämme, welche die 13 GM-CSF-Cysteinmuteine exprimieren, wurden herangezüchtet, induziert und abgeerntet unter Verwendung der Protokolle, welche im Beispiel 14 für Wildtyp-GM-CSF beschrieben wurden. Die Muteine wurden rückgefaltet und gereinigt, wobei die Protokolle verwendet wurden, welche für Wildtyp-GM-CSF im Beispiel 14 beschrieben wurden. Die Muteine eluierten aus der Q-Sepharose-Säule bei ungefähr 200-230 mM NaCl, und aus der Phenyl-HP-Säule bei ungefähr 6-8% Ammoniumsulfat. Die Muteine wurden hauptsächlich als Monomere zurückgewonnen, mit apparenten Molekulargewichten von ~14 kDa bei nicht-reduzierender SDS-PAGE.
  • C. Bioaktivitäten von GM-CSF-Cysteinmuteinen.
  • Die 13 gereinigten GM-CSF-Muteine wurden im TF-1-Zellproliferations-Assay getestet. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bradford-Protein-Assay-Kits (Bio-Rad-Laborstories) bestimmt. Handelsüblicher Wildtyp-GM-CSF und Wildtyp-GM-CSF, der von uns. hergestellt wurde, wurden parallel an den gleichen Tagen analysiert, um hinsichtlich Tagesvariabilität in den Assays zu überprüfen. Alle 13 Muteine stimulierten die Proliferation der TF-1-Zellen zum gleichen Ausmaß wie die Wildtyp-GM-CSF-Kontrollproteine. Mittlere EC50-Werte für die 13 Muteine lagen im Bereich von 80 bis 134 pg/ml (Tabelle 13). Tabelle 13 Eigenschaften von GM-CSF-Cysteinmuteinen
    G-CSF-Protein Mutations-Lage Mittlerer EC50 ± Std.Abw. (pg/ml) EC50-Bereicha (pg/ml)
    R&D wtb - 97 ± 5 90-100 (6)
    BBT wtc - 105 ± 8 90-115 (14)
    *-1C N-Terminus 111 ± 5 105-115 (14)
    A1C N-Terminus 80 ± 0 80-80 (4)
    A3C Proximal zur A-Helix 108 ± 3 105-110 (4)
    S5C Proximal zur A-Helix 125 ± 6 120-130 (4)
    S7C Proximal zur A-Helix 106 ± 6 100-110 (4)
    N27C A-Helix 134 ± 30 105-160 (4)
    S69C B-C-Loop 103 ± 10 90-110 (4)
    E93C C-D-Loop 103 ± 14 90-115 (4)
    T94C C-D-Loop 120 ± 4 115-125 (4)
    T102C C-D-Loop 114 ± 3 110-115 (4)
    V125C Distal zur D-Helix 110 ± 0 110-110 (4)
    Q126C Distal zur D-Helix 126 ± 9 120-140 (4)
    *128C C-Terminus 124 ± 3 120-125 (4)
    • a Beobachteter Bereich von EC50-Werten; Zahl von Assays in Klammern
    • b Handelsüblicher Wildtyp-GM-CSF (R&D Systems)
    • c Wildtyp-GM-CSF, der von Bolder BioTechnology hergestellt wurde
  • Beispiel 16
  • PEGylierung, Reinigung und Bioaktivität von GM-CSF-Cysteinmuteinen
  • A. Vorbereitende PEGylierungs-Untersuchungen.
  • Anfängliche PEGylierungs-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung von A1C, S7C und S69C als den Testproteinen, TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphin]-HCl als dem Reduktionsmittel und mit Cystein reagierenden 5-kDa-PEGs von Shearwater Polymers bestimmt. Drei-μg-Aliquots der gereinigten Cysteinmuteine oder von Wildtyp-GM-CSF wurden mit steigenden Konzentrationen an TCEP bei Raumtemperatur in 100 mM Tris, pH 8,5, in Gegenwart von 5-kDa-Maleimid-PEG oder 5-kDa-Vinylsulfon-PEG (lineare Formen eines Polyethylenglycol-Polymers, zusammengesetzt aus einem Molekulargewichts-Durchschnitt von 5 kDa, mit einer reaktiven Maleimid- oder Vinylsulfongruppe an einem der Polymerenden) im Überschuss inkubiert. Die Maleimid- und Vinylsulfongruppen reagieren mit Michael-Nukleophilen, bei einer hohen Selektivität für Mercaptangruppen, wie denjenigen, welche auf Cystein-Seitenketten enthalten sind. Nach 90 Minuten wurden die Reaktionen unverzüglich durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert. Die Mengen von TCEP und jeweiligem PEG-Reagenz, welche signifikante Mengen an monoPEGyliertem Cysteinprotein, ohne Modifizieren von Wildtyp-GM-CSF ergaben, wurden zur Verwendung in den nachfolgenden Experimenten ausgewählt. Die Titrationsexperimente zeigten, dass bei pH 8,5 ein 15-facher molarer Überschuss von TCEP und ein 20-facher Überschuss von 5-kDa-Maleimid-PEG signifikante Mengen an monoPEGyliertem A1C-Protein und monoPEGyliertem S7C-Protein ohne nachweisbares di- oder tri-PEGyliertes Protein ergaben. Im Falle von GM-CSF-S69C war 5-kDa-Vinylsulfon-PEG gegenüber 5-kDa-Maleimid-PEG bevorzugt und ergab signifikante Mengen an monoPEGyliertem S69C-Protein. Rekombinantes Wildtyp-GM-CSF war gegenüber den PEGs unreaktiv, selbst in Gegenwart eines 50-fachen Überschusses an TCEP. Kontrollexperimente zeigten, dass die Muteine partiell reduziert sein mussten, um PEGyliert zu werden.
  • B. Herstellung und Reinigung von PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen:
  • Aliquots von 200 bis 300 μg von 10 gereinigten GM-CSF-Cysteinmuteinen wurden PEGyliert, um ausreichend Material für Reinigung und Charakterisierung zur Verfügung zu stellen. Die größeren PEGylierungs-Reaktionen wurden ebenfalls 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Für jede der Mutanten wurde ein 15-facher Überschuss von TCEP und ein 20-facher Überschuss von 5-kDa-Maleimid-PEG verwendet. Die einzige Ausnahme war S69C, für welches 5-kDa-Vinylsulfon-PEG verwendet wurde. Diese Reaktionsbedingungen ergaben monoPEGyliertes Protein für alle zehn Muteine. Am Ende der Reaktionszeit wurde die PEGylierungs-Mischung 20X mit eiskaltem 20 mM Tris, pH 8,0, verdünnt, bevor sie rasch auf eine Q-Sepharose-Säule (1 ml, HiTrap) aufgetragen wurde unter Verwendung ähnlicher Bedingungen zu denjenigen, welche für die anfäng liche Reinigung der GM-CSF-Muteine beschrieben wurden (25 ml Gradient, 0-0,35 M NaCl in 20 mM Tris, pH 8). Das Vorhandensein des PEG-Rests verringert die Affinität des Proteins für das Harz, was gestattet, dass das PEGylierte Protein von dem nicht-PEGylierten Protein getrennt werden kann. Nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analysen der PEGylierungs-Reaktionen zeigten, dass die einzige detektierbare PEGylierte Spezies das PEG-GM-CSF-Cysteinmutein-Monomer war, welches mit einem apparenten Molekulargewicht von ~26 kDa wandert. Das Chromatogramm aus der Q-Sepharose-Säule zeigte zwei hauptsächliche Protein-Peaks. Der früh eluierende Haupt-Peak (160-200 mM NaCl) wurde mittels SDS-PAGE als monoPEGyliertes GM-CSF bestimmt. Der zweite Haupt-Peak (200-230 mM NaCl) wurde als nicht-umgesetztes GM-CSF-Protein bestimmt. Fraktionen aus dem früh eluierenden Peak, enthaltend vorwiegend monoPEGyliertes GM-CSF-Cysteinmutein, wurden vereinigt und für Bioaktivitäts-Messungen verwendet. Alle GM-CSF-Muteine wurden PEGyliert und durch das identische Protokoll gereinigt. Die PEGylierten Proteine zeigten ähnliche apparente Molekulargewichte bei SDS-PAGE, außer für die Muteine PEG-E93C und PEG-T94C, welche geringfügig kleinere apparente Molekulargewichte aufzeigten. Vier der Cysteinmuteine in der N-terminalen Region (*-1C, A1C, A3C und S7C) sind ebenfalls in einem kleinen Maßstab unter Verwendung von 10- und 20-kDa-Maleimid-PEGs PEGyliert worden. Diese Reaktionen wurden mit 3 μg jedes Muteins durchgeführt, unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen, und durch SDS-PAGE analysiert. Jedes dieser Proteine reagierte ohne Weiteres mit den 10-kDa- und 20-kDa-PEG-Reagenzien, wobei monoPEGyliertes Protein erhalten wurde. 40-kDa-PEG-A3C wurde ebenfalls unter Befolgung des oben beschriebenen Protokolls hergestellt. Dieses Protokoll wurde hinsichtlich des Maßstabs vergrößert, um größere Mengen des 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEG-A3C-Proteins vorzusehen.
  • C. Bioaktivitäten von PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen:
  • Wir reinigten ausreichende Mengen von 7 Muteinen (*-1C, A1C, A3C, S5C, S7C, S69C und E93C), welche mit einem 5-kDa-PEG modifiziert waren, für exakte Proteinkonzentration- und spezifische Bioaktivitäts-Messungen. Die biologischen Aktivitäten der 7 gereinigten 5-kDa-PEG-GM-CSF-Cysteinmuteine wurden im TF-1-Zellproliferations-Assay gemessen. Konzentrationen der Proteine wurden unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt. Alle PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteine zeigten ähnliche Dosis-Antwort-Kurven und erreichten denselben Spiegel an maximaler Wachstumsstimulation wie Wildtyp-GM-CSF. Die mittleren EC50-Werte für die PEG-GM-CSF-Cysteinmuteine lagen im Bereich von 80-123 pg/ml (Tabelle 14). Tabelle 14 Bioaktivitäten von PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen
    GM-CSF-Protein 5-kDa-PEG-Protein Mittlerer EC50 ± STD. ABW. (pg/ml) 5-kDa-PEG-Protein EC50-Bereicha (pg/ml)
    *-1C 96 ± 5 90-100(4)
    A1C 115 ± 4 110-120(4)
    A3C 106 ± 3 105-110(4)
    S5C 80 ± 11 70-100(6)
    S7C 123 ± 15 110-140(4)
    S69C 88 ± 6 80-95 (4)
    E93C 86 ± 5 80-90 (4)
    • a Beobachteter Bereich von EC50-Werten, Anzahl der Assays in Klammern
  • Die biologischen Aktivitäten des A3C-Muteins, welches mit 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEG-Molekülen modifiziert worden war, wurden im TF-1-Zellproliferations-Assay gemessen. Konzentrationen der Proteine wurden unter Verwendung eines Bradford-Farbstoffbindungs-Assays bestimmt. Jedes der PEG-A3C-Proteine stimulierte die Proliferation von TF-1-Zellen. Mittlere EC50s für die 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEG-A3C-Cysteinmuteine betrugen 78 +/- 3 pg/ml, 113 +/- 5 pg/ml bzw. 300 +/- 50 pg/ml (N = 4 Assays für jedes Protein).
  • D. Apparente Molekulargewichte von A3C, modifiziert mit 5-kDa-, 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-K-PEGs:
  • Die apparenten Molekulargewichte der PEGylierten GM-CSF-A3C-Proteine wurden durch Größenausschluss-HPLC (SEC) unter Verwendung einer Biorad Bio-Sil SEC-400-5-Säule auf einer Beckman System Gold HPLC bestimmt. Ein isokratischer Gradient, der aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bestand, wurde als das Elutionsmittel verwendet. Retentionszeiten für jedes Protein wurden verwendet, um Molekulargewichte basierend auf einer Eichkurve zu berechnen, welche mit Gelfiltrations-Proteinstandards (BioRad Laborstories, Richmond, CA) aufgestellt wurde. Die PEGylierten Proteine zeigten ein drastisch erhöhtes apparentes Molekulargewicht im Verhältnis zum nicht-PEGylierten GM-CSF (Tabelle 15). Größere PEGs erhöhten das apparente Molekulargewicht des Proteins mehr als kleinere PEGs. Ähnliche Daten wurden für PEGylierte Cysteinmuteine von GH, IFN-α2 und G-CSF aufgezeichnet. Tabelle 15 Apparente Molekulargewichte von PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen mittels Größenausschlusschromatografie
    Protein Apparentes SEC-Molekulargewicht (Dalton)
    GM-CSF 20000
    5kDa-PEG A3C 80000
    10kDa-PEG A3C 200000
    20kDa-PEG A3C 470000
    40kDa-PEG A3C 680000
  • Beispiel 17
  • Klonierung, Expression, Reinigung und Bioaktivität von murinem Wildtyp-GM-CSF und Cysteinmuteinen von murinem GM-CSF
  • Wir klonierten und sequenzierten eine cDNA, welche das reife Maus-GM-CSF codiert, mittels RT-PCR von Gesamt-RNA, die isoliert worden war aus der Maus-Zelllinie EL4.IL-2 (Katalog-Nr. TIB-181), die von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten wurde. Die Zellen wurden in DMEM-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt worden war. Die Zellen wurden 6 oder 24 Stunden lang mit 1 μg/ml PHA-L (Sigma-Aldrich Chemical Company, Katalog-Nr. L-4144) und 10 ng/ml PMA (Sigma-Aldrich Chemical Company, Katalog-Nr. P-1585) in DMEM-Medium, 10% FBS, 50 Units/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin bei 37°C vor der RNA-Isolierung induziert. RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung eines RNeasy "Mini-RNA"-Isolierungs-Kits, das von Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) erworben worden war, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers isoliert. Eine Erststrang-Synthese von einzelsträngiger cDNA wurde unter Verwendung eines "1st Strand"-cDNA-Synthese-Kits für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim Corp. bewerkstelligt, und statistische Hexamere wurden als der Primer verwendet. Eine anschließende PCR-Reaktion unter Verwendung der Produkte der Erststrang-Synthese als Matrize wurde mit dem Vorwärts-Primer BB481 [5> GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC ACC CGC TCA CCC ATC ACT >3; SEQ ID Nr. 43] und dem Rückwärts-Primer BB482 durchgeführt. BB481 annealt an die 24 Nukleotide, welche die ersten acht Aminosäuren von reifem Maus-GM-CSF codieren. BB481 fügt des Weiteren, unmittelbar 5' zu dieser Sequenz, Nukleotide an, welche mit den Sequenzen überlappen, codierend die carboxyterminalen vier Aminosäuren der E. coli-stII-Signalsequenz, welche oben im Beispiel 7 und von Picken et al. (1983) beschrieben wurde. Diese 11 Nukleotide schließen eine Mlu I-Restriktionsstelle ein. BB482 [5> GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG >3; SEQ ID Nr. 44] annealt an die Nukleotide, welche die carboxyterminalen zehn Aminosäuren von Maus-GM-CSF codieren, und fügt ein TAA-Translation-Stopcodon und eine Eco RI-Restriktionsstelle unmittelbar anschließend an die codierende Sequenz an. Sowohl die 6h- als auch 24h-RNA-Proben ergaben ein GM-CSF-RT-PCR-Produkt. Das resultierende ~400 bp große PCR-Produkt aus der 6h-RNA-Probe wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut, über ein Gel gereinigt und in pBBT227 [pUC18::stII-G-CSF(C17S)], welcher oben im Beispiel 8 beschrieben ist, kloniert. pBBT227-DNA wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und auf einem 1 %igen Agarosegel laufen gelassen. Das ~2,4 kb große Vektorfragment wurde gereinigt und in der Ligation verwendet. Die resultierenden Rekombinanten tragen einen vollständigen stII-Leader, fusioniert an murinen GM-CSF, und dieses "stII-muGM-CSF"-Konstrukt kann als ein Nde I-Eco RI-Fragment von ~450 bp herausgeschnitten werden. Ein Klon mit der korrekten Sequenz (Gough et al., 1984) wurde als pUC18::stII-muGM-CSF oder pBBT435 bezeichnet. Für Expressionsuntersuchungen wurde das Nde I-Eco RI-Fragment von pBBT435 in den Expressionsvektor pBBT257, der oben in Beispiel 14 beschrieben ist, subkloniert. Das resultierende Plasmid, pBBT257::stII-muGM-CSF, oder pBBT456, wurde zur Expression in E. coli W3110 eingebracht. Wildtyp-Maus-GM-CSF wurde unter Anwendung der Protokolle zur Expression und Reinigung von humanem GM-CSF, welche im Beispiel 14 oben beschrieben sind, exprimiert und gereinigt.
  • Mutante Maus-GM-CSF-Gene können unter Anwendung von ortsgerichteter, PCR-basierender Mutagenese konstruiert werden, wie im Allgemeinen beschrieben von Innis et al. (1990) und Horton et al. (1993) und in den anderen oben aufgeführten Beispielen. Ein Mutein, T3C, wurde in der aminoterminalen Region proximal zur Helix A konstruiert. Die mutagene PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von Plasmid pBBT435 (beschrieben im Beispiel 17) als Matrize, und des Vorwärts-Primers BB504 [5> GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC TGC CGC TCA CCC ATC ACT >3; SEQ ID Nr. 45] und des Rückwärts-Primers BB482 [5> GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG >3; SEQ ID Nr. 46] durchgeführt. BB504 ändert das ACC-Codon für Threonin an der Position 3 von reifem Maus-GM-CSF in ein TGC-Codon für Cystein. Das resultierende ~400 bp große PCR-Produkt wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut, über ein Gel gereinigt und in pBBT435 kloniert, welcher mit Mlu I und Eco RI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Ein Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pUC18::stII-muGM-CSF(T3C) bezeichnet. Für Expressionsuntersuchungen wurde das Nde I-Eco RI-Fragment von diesem Plasmid in den Expressionsvektor pBBT257, der oben stehend im Beispiel 14 beschrieben ist, subkloniert. Das resultierende Plasmid pBBT257::stII-muGM-CSF(T3C), oder pBBT469, wurde zur Expression in E. coli JM109 eingebracht. Das T3C-Mutein von Maus-GM-CSF wurde unter Verwendung der Protokolle für Expression und Reinigung von humanem GM-CSF, welche oben in Beispiel 14 beschrieben sind, exprimiert und gereinigt.
  • Unter Anwendung von Vorgehensweisen, die ähnlich zu denjenigen sind, welche hier und oben in den Beispielen 9 und 15 beschrieben sind, kann man andere Cysteinmuteine von Maus-GM-CSF konstruieren. Die Cysteinmuteine können Substitutionsmutationen, welche Cystein für einen natürlichen Amino[säure]rest in der GM-CSF codierenden Sequenz substituieren, Insertionsmutationen, welche einen Cysteinrest zwischen zwei natürlich vorkommenden Aminosäuren in der Maus-GM-CSF codierenden Sequenz inserieren, oder Additionsmutationen sein, welche einen Cysteinrest vorangehend zur ersten Aminosäure der Maus-GM-CSF codierenden Sequenz addieren oder einen Cysteinrest nachfolgend zum terminalen Aminosäurerest der Maus-GM-CSF codierenden Sequenz addieren. Die Cysteinreste können für jedwede Aminosäure substituiert oder zwischen jedweden zwei Aminosäuren inseriert werden, an beliebiger Stelle in der Maus-GM-CSF-codierenden Sequenz. Bevorzugte Stellen zum Substituieren oder Inserieren von Cysteinresten liegen in der Region, welche der Helix A vorangeht, dem A-B-Loop, dem B-C-Loop, dem C-D-Loop und der Region distal zur Helix D. Andere bevorzugte Stellen sind die ersten oder letzten drei Aminosäuren der A-, B-, C- und D-Helizes. Man kann ebenfalls Muteine, welche ein freies Cystein enthalten, durch Substituieren einer sonstigen Aminosäure für einen der natürlich vorkommenden Cysteinreste im GM-CSF, welcher normalerweise eine Disulfidbindung bildet, konstruieren. Der natürlich vorkommende Cysteinrest, der normalerweise eine Disulfidbindung mit dem substituierten Cysteinrest bildet, ist nun frei. Der Cysteinrest kann mit irgendeiner der anderen 19 Aminosäuren, aber vorzugsweise mit einem Serin- oder Alaninrest ersetzt werden. Ein freier Cysteinrest kann in GM-CSF auch durch chemische Modifikation einer natürlich vorkommenden Aminosäure eingeführt werden, und zwar unter Anwendung von Vorgehensweisen, wie denjenigen, welche von Sytkowski et al. (1998) beschrieben wurden.
  • Mehrfach-Mutanten, welche zwei oder mehr hinzugefügte freie Cysteinreste enthalten, können ebenfalls konstruiert werden, entweder durch aufeinander folgende Runden der Mutagenese unter Anwendung der in den Beispielen 9 und 15 oben stehend beschriebenen Vorgehensweisen, oder alternativ dazu durch In-vitro-Rekombination von einzelnen Mutanten, um rekombinante Expressionsplasmide zu konstruieren, welche Muteine mit zwei oder mehr freien Cysteinen codieren. Die bevorzugten Mehrfach-Mutanten werden diejenigen sein, welche zwei oder mehr Cysteinmuteine kombinierten, die jeweils hohe oder vollständige spezifische Aktivität bei PEGylierung beibehalten.
  • Unter Anwendung von zu denjenigen, die in den Beispielen 12-14, 15 und 16 beschrieben wurden, ähnlichen Vorgehensweisen kann man Maus-GM-CSF-Muteine exprimieren, reinigen und PEGylieren und die biologischen Aktivitäten dieser Proteine in einem In-vitro-Bio-Assay und Modellen für die Wirksamkeit in vivo messen. Die Proteine können cytoplasmatisch im E. coli oder als in den periplasmatischen Raum sezernierte Proteine exprimiert werden. Die Muteine können auch in eukaryotischen Zellen, wie Insekten- oder Säugerzellen exprimiert werden, unter Anwendung von Vorgehensweisen, ähnlich zu denjenigen, welche in PCT/US00/00931 beschrieben werden, oder verwandten Vorgehensweisen, die dem Fachmann auf dem Gebiet all gemein bekannt sind. Wenn eine Sekretion aus eukaryotischen Zellen gewünscht wird, kann die natürliche GM-CSF-Signalsequenz oder eine andere Signalsequenz verwendet werden, um die Proteine aus eukaryotischen Zellen zu sezernieren.
  • Das gereinigte GM-CSF-Wildtyp-Protein, Cysteinmuteine und PEGylierte Formen der Cysteinmuteine können hinsichtlich biologischer Aktivität mit einem Zellproliferations-Assay unter Verwendung der NFS60-Zelllinie, wie beschrieben in den oben stehenden Beispielen 8 und 9, geassayt werden.
  • Muriner Wildtyp-GM-CSF und das murine GM-CSF-Cysteinmutein T3C wurden aus E. coli unter Befolgung des Vorgehens isoliert, welches für humanes WT-GM-CSF beschrieben wurde (Beispiele 14-16), mit der Ausnahme, dass 30% Ammoniumsulfat verwendet wurden, um die Maus-Proteine an eine Phenyl-Sepharose-Säule zu binden, anstatt von 15%, wie es für humanes GM-CSF beschrieben wurde. Die murine T3C-Cysteinmutante PEGylierte ohne Weiteres mit 10-kDa-, 20-kDa- und 40-kDa-PEG-Maleimid-Reagenzien unter Anwendung der oben für humanes GM-CSF-Cysteinmutein A3C beschriebenen Protokolle. Die Bioaktivitäten dieser PEGylierten Proteine können im NFS60-Zellproliferations-Assay gemessen werden, wie es in den Beispielen 8 und 9 beschrieben ist.
  • Beispiel 18
  • E. coli-Expression und Reinigung von humanem Wildtyp-Erythropoietin
  • A. Expression von Erythropoietin durch Sekretion in E. coli.
  • Die humanes Wildtyp-Erythropoietin (Epo) codierende DNA wurde mittels PCR aus dem Plasmid pBBT358 (siehe nachstehend) amplifiziert, weiches ein Gen für Epo im Vektor pBlueBac 4.5 (Invitrogen) enthält, welcher für die Expression von Epo in Insektenzellen verwendet worden ist. Das Gen für Epo in pBBT358 ist ähnlich zur natürlichen cDNA mit Ausnahme von drei stillen Mutationen an Codons für die Aminosäuren 84 und 85 (von reifem Epo), welche eine Xho I-Restriktionsstelle zur Erleichterung des Mutageneseverfahrens erzeugen.
  • Die drei Mutationen, welche die Xho I-Stelle erzeugten, wurden unter Anwendung der Technik der "Mutagenese durch Überlapp-Verlängerung", wie beschrieben in Horton et al. (1993) und PCT/US00/00931 , eingebaut. Die anfänglichen oder "primären" PCR-Reaktionen für die Xho I-Konstruktion wurden in einem 50-μl-Reaktionsvolumen in 1X Promega-PCR-Puffer durchgeführt, enthaltend 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,4 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 1 ng Matrizen-Plasmid pBBT132 (das Wildtyp-Epo-Flag-Gen, welches als ein BamH I-Eco RI-Fragment in pUC19 kloniert wurde (beschrieben in PCT/US00/00931 ), 2 Units Taq Platinum (BRL) und 0,25 Units Pfu-Polymerase (Stratagene). Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer GeneAmp®-PCR-System-2400-Thermocycler durchgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 5 Minuten, 25 Zyklen von [94°C während 30 Sekun den, 56°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden] einen 7 Minuten langen Halt bei 72°C und einen Halt bei 4°C. Die verwendeten Primerpaare waren [BB361 × BB125] und [BB362 × BB126]. BB361 (5> GTTGGTCAAC TCGAGCCAGC CGTGGGAG >3; SEQ ID Nr. 79) annealt an DNA-Sequenzen, welche die Aminosäurereste 81-89 von reifem Epo codieren. BB125 (5> CTATGC GGCATCAGAGCAGATA >3; SEQ ID Nr. 17) annealt an die pUC19-Vektorsequenz ~20 bp stromabwärts der klonierten Epo-Sequenz. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel laufen gelassen, aus dem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Diese zwei mutagenisierten Fragmente wurden dann in der nachfolgenden oder "sekundären" PCR-Reaktion zusammen-"gespleisst". In dieser Reaktion wurden 0,3 μl von jedem der gelgereinigten PCR-Produkte der primären Reaktionen als Matrize verwendet, und BB125 und BB126 wurden als Primer verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 50 μl, und 2,5 Units Taq-Polymerase und 0,5 Units Pfu-Polymerase wurden verwendet. Ansonsten waren die Reaktionsbedingungen identisch zu denjenigen, welche in den primären Reaktionen eingesetzt wurden. Ein Aliquot der sekundären PCR wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und die erwartete Bande von ~190 bp wurde beobachtet. Die Hauptmasse der sekundären PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs[kits] (Qiagen) "aufgereinigt" und mit Kpn I und Stu I (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Herstellers) verdaut. Im Anschluss an eine zusätzliche Aufreinigung unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits, wurden die Verdauungsprodukte mit pBBT138 (dem Wildtyp-Epo-Flag-Gen, kloniert als ein BamH I-Eco RI-Fragment in pBlueBac 4.5 ( PCT/US00/00931 )) ligiert, welcher mit Kpn I und Stu I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und über ein Gel gereinigt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert, um einen Klon zu identifizieren, welcher die Xho I-Stelle enthielt und im gesamten 433 bp großen Kpn I-Stu I-Segment die korrekte Sequenz aufwies. Dieser Klon wird als pBBT358 bezeichnet.
  • Für die Expression von an das STII-Signalpeptid fusioniertem Epo (eine Peptid-Sequenz, welche die Sekretion des reifen Proteins in das E. coli-Periplasma lenkt) waren die in der PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide BB583 (5> CCAACGCGTA CGCAGCCCCA CCACGCCTCATC 3>; SEQ ID Nr. 46), welches an die N-terminale codierende Region des Gens annealt, und entweder BB585 (5> CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCA GGC >3; SEQ ID Nr. 47) oder BB586 (5> CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC >3; SEQ ID Nr. 48), welche an die C-terminale codierende Region des Gens annealen. BB585 schließt das Codon für Arg166, die von der cDNA-Sequenz vorhergesagte C-terminale Aminosäure, ein, wohingegen BB586 das Arg166-Codon deletiert und für Asp165 als der C-terminalen Aminosäure codiert. Die resultierenden ~600 bp großen PCR-Produkte wurden mit Mlu I und Eco RI verdaut und in einen ähnlich verdauten pBBT227-Vektor (Beispiel 9) kloniert, um Fusionen zwischen der STII-Leadersequenz und der aminoterminalen codierenden Sequenz von Wildtyp-Epo zu erzeugen. Das durch PCR unter Verwendung von BB583 und BB585 gebildete Gen wird bezeichnet als STII-Epo-Volllänge (STII-Epo-FL), und das durch PCR unter Verwendung von BB583 und BB586 gebildete Gen wird als STII-Epo-des Arg (STII-Epo-dR) bezeichnet. Die Klone STII-Epo-FL und STII-Epo-dR mit der korrekten Sequenz wurden dann als Nde I-Eco RI-Fragmente in pBBT257 (beschrieben im Beispiel 14) subkloniert, um pBBT477 bzw. pBBT478 zu erzeugen.
  • pBBT477 und pBBT478 wurden in JM109 transformiert, um die Stämme BOB578 und BOB579 zu erzeugen. Diese Stämme, zusammen mit B0B490 (pBBT257/JM109), wurden über Nacht in Luria-Nährbrühe (LB-Medium), welche 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, bei 37°C in Rollröhrchen wachsen gelassen. Gesättigte Übernachtkulturen wurden auf 0,025 O.D. bei A600 in LB-Medium, enthaltend 10 μg/ml Tetracyclin, verdünnt und bei 37°C in Schüttelkolben inkubiert. Typischerweise wurde eine 25 ml große Kultur in einem 250 ml großen Schüttelkolben wachsen gelassen. Als die Kultur-O.D.-Werte ~0,3-0,5 erreichten, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, um eine Expression von entweder Epo-Wildtyp oder Epo-des Arg166 zu induzieren. Für anfängliche Experimente wurden den Kulturen bei 4 und ~19 Stunden nach der Induktion Proben entnommen. Die Proben wurden analysiert durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf im Voraus gegossenen 14%igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen, und mit Coomassie-Blau gefärbt. Induzierte Kulturen von sowohl BOB578 als auch BOB579 zeigten eine Bande bei ungefähr 20 kDa, was konsistent mit dem Molekulargewicht von Wildtyp-Epo ist. Diese Bande wurde in der induzierten Kultur von BOB490, der Nur-Vektor-Kontrolle, nicht detektiert.
  • B. Expression von Met-Erythropoietin im Cytoplasma von E. coli.
  • Wie beschrieben im Beispiel 18 A., wurde die für humanes Wildtyp-Erythropoietin (Epo) codierende DNA durch PCR aus dem Plasmid pBBT358, welches ein Gen für Wildtyp-Epo enthält, amplifiziert. Für die Expression von Met-Epo im Cytoplasma von E. coli, waren die in der PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide BB584 (5> TTC OCT AGC ATG CAT GAC CTG CAG GAG GAA ATT TAA ATG GCC CCA CCA CGC CTC ATC 3>; SEQ ID Nr. 49), welches an die N-terminale codierende Region des Gens annealt, und entweder BB585 (5> CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCA GGC >3; SEQ ID Nr. 47) oder BB586 (5> CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC >3; SEQ ID Nr. 48), welche oben beschrieben sind. Die resultierenden ~600 bp großen PCR-Produkte wurden mit Mlu I und Eco RI verdaut und in ähnlich verdauten pBBT227-Vektor (Beispiel 9) kloniert, um Gene zu erzeugen, welche Methionyl-Epo codieren. Das durch PCR unter Verwendung von BB583 und BB585 gebildete Gen wird als Met-Epo-Volllänge (Met-Epo-FL) bezeichnet, und das durch PCR unter Verwendung von BB583 und BB586 gebildete Gen wird als Met-Epo-desArg (Met-Epo-dR) bezeichnet. Met-Epo-FL- und Met-Epo-dR-Klone mit der korrekten Sequenz wurden dann als Nde I-Eco RI-Fragmente in pBBT257 (beschrieben im Beispiel 14) subkloniert, um pBBT479 bzw. pBBT480 zu erzeugen. pBBT479 und pBBT480 wurden in JM109 transformiert, um die Stämme BOB580 und BOB581 zu erzeugen. Expressionsexperimente mit diesen Stämmen, neben BOB490 (pBBT257/JM109), waren die gleichen, wie diejenigen, welche oben stehend für die STII-Epo-Konstrukte beschrieben sind. Induzierte Kulturen sowohl von BOB580 als auch BOB581 zeigten eine Bande bei ungefähr 20 kDa, was konsistent mit dem Molekulargewicht von Wildtyp-Epo ist. Diese Bande wurde in der induzierten Kultur von BOB490, der Nur-Vektor-Kontrolle, nicht nachgewiesen.
  • Beispiel 19
  • Konstruktion, E. coli-Expression, Reinigung und Bioaktivität von Erythropoietin-Cysteinmuteinen
  • A. Konstruktion von Epo-Cysteinmuteinen.
  • Verfahren zum Konstruieren von Epo-Cysteinmuteinen unter Anwendung von ortsgerichteten, PCR-basierenden Mutagenese-Vorgehensweisen, und bevorzugte Stellen für Lokalisierungen von Cysteinmuteinen in EPO werden beschrieben in PCT/US00/00931 , PCT/US98/14497 und Innis et al. (1990) und White (1993) und den verschiedenen, hierin angegebenen Beispielen. Darüber hinaus ist L80 eine andere bevorzugte Stelle für ein Cystein-Substitutionsmutein.
  • Rekombinantes Erythropoietin und Cysteinmuteine von Erythropoietin können in E. coli unter Anwendung der Vorgehensweisen exprimiert werden, welche im Beispiel 18 für Wildtyp-EPO beschrieben wurden. Die Zellen werden unter Verwendung von B-per (Pierce) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers lysiert, und der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugation isoliert. Das Pellet wird unter Verwendung von 20 mM Cystein, 6 M Guanidin, 20 mM Tris solubilisiert. Die Mischung wird 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie 1:20 (v/v) mit 20 mM Tris, pH 8, 40 μM Kupfersulfat, 2% Lauroylsarcosin verdünnt wird. Die Renaturierung wird 24-48 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Das rückgefaltete EPO und EPO-Cysteinmuteine werden unter Verwendung einer S-Sepharose-Säule gereinigt, welche äquilibriert worden war in 20 mM Mes, pH 5, 0,01% Tween und 20% Glyzerol (Puffer A). EPO kann aus der S-Sepharose-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-1 M NaCl in Puffer A eluiert werden. Sekundäre Säulen für weitere Reinigung des rekombinanten EPO, falls notwendig, schließen SEC, Blue-Sepharose-, Hydroxyapatit- oder HIC-Harze (Phenyl, Butyl) ein.
  • Beispiel 20
  • Konstruktion von Disulfid-verknüpften Trimeren und Disulfid-verknüpften Multimeren höherer Ordnung von Cysteinmuteinen
  • GH-Varianten mit mehr als einem "freien" Cystein konnten bzw. könnten konstruiert und verwendet werden, um Disulfid-verknüpfte Multimere von hGH zu erzeugen, wie beschrieben in PCT/US00/00931 . Eine solche Variante könnte in E. coli exprimiert, rückgefaltet und gereinigt werden, wie offenbart in den Beispielen 1 und 2 und der PCT/US00/00931 . Anschließende Aufarbeitungsschritte konnten dann eingesetzt werden, um Disulfidbrücken-Bildung zu induzieren, wie beschrieben in Beispiel 2 und der PCT/US00/00931 . Unter solchen Bedingungen werden manche hGH-Varianten mit einem freies Cystein, wie T3C, praktisch quantitativ zu Disulfid-verknüpften Dimeren umgewandelt. Unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen wird die intermolekulare Disulfid-Bildung durch eine hGH-Variante mit zwei freien Cysteinen, z. B. einer Doppel-Mutante, welche T3C und ein anderes Cysteinmutein kombiniert, zu einer Polymerisation von hGH-Molekülen führen, und die Kettenlänge solcher Polymere wird im Prinzip unbegrenzt sein. Die Kettenlänge könnte eingegrenzt und zu einem gewissen Ausmaß gesteuert werden durch Zugabe von hGH-Molekülen mit nur einem freien Cystein zu der Polymerisationsreaktion, wie der T3C-Variante und/oder anderen Cysteinmuteinen. Disulfidbrücken-Bildung zwischen dem wachsenden Polymer und einem Molekül mit nur einem freien Cystein wird eine der zwei Polymerisationsstellen in dem wachsenden Polymer "mit einer Kappe versehen" oder eine weitere Verlängerung davon verhindern. Eine anschließende Reaktion eines zweiten hGH-Moleküls, welches nur ein freies Cystein aufweist, mit der anderen Polymerisationsstelle dieses wachsenden Polymers terminiert die Polymerisierung und fixiert die Länge dieses polymeren Moleküls. Die durchschnittliche Polymerlänge konnte durch die Stöchiometrie der Recktanten gesteuert werden, d.h. dem Verhältnis von hGH-Molekülen mit zwei freien Cysteinen zu hGH-Molekülen mit einem freien Cystein. Im Durchschnitt kürzere Polymere würden von niedrigeren Verhältnissen begünstigt werden, und im Durchschnitt längere Polymere würden von höheren Verhältnissen begünstigt werden. Komplexere "verzweigte" Polymere könnten aus Reaktionen konstruiert werden, welche hGH-Varianten mit 3 oder mehr freien Cysteinen mit hGH-Varianten mit nur einem freien Cystein beinhalten.
  • Diskrete Größenklassen von bestimmten Polymeren könnten anschließend durch chromatografische Verfahren, wie Größenausschlusschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, Chromatografie mit hydrophoben Wechselwirkungen und dergleichen, gereinigt werden. Ähnliche Vorgehensweisen zu denjenigen, welche für GH beschrieben wurden, könnten angewandt werden, um Disulfid-verknüpfte Dimere und Multimere höherer Ordnung von G-CSF, Alpha-Interferon, GM-CSF und anderen Proteinen zu erzeugen.
  • Beispiel 21
  • Klonierung, Expression und Reinigung von humanem Wildtyp-Endostatin
  • A. Klonierung von Endostatin codierenden DNA-Sequenzen.
  • Eine Endostatin codierende cDNA wurde durch PCR aus einer humanen fötalen Leber-cDNA-Bibliothek (Clontech) amplifiziert. PCR-Reaktionen wurden mit Vorwärts-Primer BB383 (5> GCTAACGCGTACGCACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG >3; SEQ ID Nr. 50) und Rückwärts-Primer BB384 (5> CGGAATTCCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT >3; SEQ ID Nr. 51) durchgeführt. Der Primer BB383 annealt an das 5'-Ende der codierenden Sequenz von humanem En dostatin, und der Rückwärts-Primer BB92 annealt an das 3'-Ende der Endostatin codierenden Sequenz. Das resultierende ~600 bp große PCR-Produkt wurde mit Mlu I und Eco RI verdaut und in einen ähnlich verdauten pBBT227-Vektor (Beispiel 9) kloniert, um eine Fusion zwischen der STII-Leadersequenz und der amino-terminalen codierenden Sequenz von humanem Endostatin zu erzeugen. Nach Bestätigung seiner Sequenz wurde das Gen für eine intrazelluläre Expression durch PCR-Amplifikationen mit Vorwärts-Primer BB434 (5'> GTGCACCATA TGAAGAAGAA CATCGCATTC CTGCTGGCTA GCATGCATGA CCTGCAGGAG GAAATTTAAA TGCACAGCCA CCGCGACTTC>3'; SEQ ID Nr. 52) und BB384 (SEQ ID Nr. 51) modifiziert. BB434 fusioniert ein Methionin(Met)-Codon an den Amino-Terminus von Endostatin. Das resultierende 630 bp große Fragment wurde mit Nde I und Sac II verdaut und in ein ähnlich verdautes, oben beschriebenes, STII-Endostatin-pUC18-Plasmid kloniert. Ein Met-Endostatin-Klon mit der korrekten Sequenz (pBBT370) wurde dann als ein Nde I-Eco RI-Fragment in pBBT257 (beschrieben im Beispiel 14) subkloniert, um pBBT371 zu erzeugen.
  • B. Expression von Wildtyp-met-Endostatin in E. coli.
  • pBBT371, welcher Met-Endostatin-Wildtyp codiert, und pBBT257, der Stammform-Vektor, wurden in E. coli-JM109 transformiert, um die Stämme BOB460 und BOB490 zu erzeugen, und in W3110 transformiert, um die Stämme BOB461 und BOB340 zu erzeugen. Diese Stämme wurden über Nacht in Luria-Nährbrühe (LB-Medium), welches 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, bei 37°C in Rollröhrchen wachsen gelassen. Gesättigte Übernachtkulturen wurden zu ~0,025 O.D. bei A600 in LB, 10 μg/ml Tetracyclin, verdünnt und bei 37°C in Schüttelkolben inkubiert. Typischerweise wurde eine 25-ml-Kultur in einem 250 ml großen Schüttelkolben wachsen gelassen. Als die Kultur-O.D.-Werte ~0,3-0,5 erreichten, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, um die Expression von humanem met-Endostatin zu induzieren. Für Anfangsexperimente wurden den Kulturen bei 0,4 und ~19 h nach der Induktion Proben entnommen. Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf im Voraus gegossenen 14%igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Induzierte Kulturen von sowohl BOB460 als auch BOB461 zeigten eine Bande bei ungefähr 20 kDa, was konsistent mit dem reifen humanen Endostatin ist. Diese Bande wurde nicht in den nicht-induzierten Kulturen von BOB460 und BOB461 oder in induzierten oder nicht-induzierten Kulturen von BOB490 und BOB340, den Nur-Vektor-Kontrollen, nachgewiesen. Die ~20 kDa große Bande comigrierte mit kommerziell hergestelltem humanem Endostatin, das von Calbiochem erworben worden war.
  • Beispiel 22
  • Konstruktion, Expression, Reinigung und Bioaktivität von humanen Endostatin-Cysteinmuteinen
  • A. Konstruktion von Endostatin-Cysteinmuteinen.
  • Elf mutante humane Endostatingene wurden unter Anwendung von ortsgerichteten, PCR-basierenden Mutageneseverfahren konstruiert, welche ähnlich zu denjenigen waren, die in PCT/US00/00931 und Innis et al. (1990) und White (1993) beschrieben wurden. Vier Muteine [*-1C, H2C, R5C und F7C], wurden in der aminoterminalen Region konstruiert (die Aminosäurereste sind nummeriert durch Subtrahieren von 130 von den nummerierten Resten in Hohenester et al. (1998)); drei Muteine waren an Resten, codiert von Sequenzen in der Nähe der Mitte des Gens [G90C, G98C und H112C]; und drei Muteine lagen in der carboxy-terminalen Region [L154C, R157C und S162C]. Ein zusätzliches Mutein [R28C] wurde an einem Rest innerhalb der aktiven Stelle von Endostatin konstruiert. Dieses konnte als ein Kontrollprotein im Bio-Assay dienen.
  • Die Quelle von für die mutagenen PCR-Reaktionen verwendeten Matrizenfragmenten war das Plasmid pBBT370. PCR-Produkte wurden mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut, unter Verwendung des Qiagen-PCR-Aufreinigungs-Kits extrahiert und mit pBBT370-Vektor-DNA ligiert, welche mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und unter Anwendung des Qiagen-PCR-Aufreinigungs-Kits extrahiert worden war. Transformanten aus diesen Ligationen wurden herangezüchtet, und Plasmid-DNAs wurden isoliert und sequenziert. Die Sequenz des gesamten klonierten mutagenisierten PCR-Fragments wurde ermittelt, um sowohl die Gegenwart der Mutation von Interesse als auch die Abwesenheit von jedweden zusätzlichen Mutationen zu bestätigen, welche potenziell durch die PCR-Reaktion oder durch die synthetischen Oligonukleotid-Primer eingebracht werden könnten.
  • Die Cystein-Substitution-Mutation *-1C wurde unter Verwendung von drei PCR-Amplifikationen wie folgend konstruiert. Das mutagene Vorwärts-Oligonukleotid BB531 (5> GAGGAAATTT AAATGTGCCA CAGCCATCGC GACTTCC >3; SEQ ID Nr. 53) war entworfen, um ein TGC-Cystein-Codon zwischen dem N-terminalen ATG-Methionin-Codon und dem ersten CAC-Histidin-Codon zu inserieren. Dieses Oligo wurde in PCR #1 mit dem nicht-mutagenen Rückwärts-Primer BB126 (5> TGTGGAATTG TGAGCGGATA AC >3; SEQ ID Nr. 54) verwendet, welcher an pUC18-Vektorsequenzen innerhalb von 60 bp stromabwärts der Endostatin codierenden Sequenz annealt. Die Matrize für diese PCR war ein gereinigtes 1264 bp großes Nhe I-ApaL I-Fragment, welches aus pBBT370 abgeleitet worden war. Dieses Fragment enthält die gesamte Endostatin codierende Sequenz und 670 bp pUC18-Sequenz stromabwärts des Endostatin-Gens, einschließlich der Sequenz, an welche BB126 annealt. Die PCR #1 war eine 25 μl große Reaktion, durchgeführt in 1X Promega-PCR-Puffer, welcher 1,5 mM MgCl2, jeden Primer bei 0,4 μM, jedes von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bei 200 μM, 0,5 ng Matrizen-Fragment, 1 Unit Taq-Polymerase (Promega) und 0,1 Unit Pfu-Polymerase (Stratagene) enthielt: Die Reaktion wurde in einem GeneAmp®-PCR-System 2400-Thermocycler von Perkin-Elmer durchgeführt. Das Reaktionsprogramm beinhaltete 95°C während 5 Minuten, 22 Zyklen von [94°C während 30 Sekunden, 55°C während 30 Sekunden, 72°C während 45 Sekunden], einen 7 Minuten langen Halt bei 72°C und einen Halt bei 4°C.
  • Die PCR #2 wurde ausgeführt unter Verwendung des mutagenen Rückwärts-Oligonukleotids BB532 (5> GGAAGTCGCG ATGGCTGTGG CACATTTAAA TTTCCTC >3; SEQ ID Nr. 55), welches das inverse Komplement von BB531 ist, und des nicht-mutagenen Primers BB125 (5> CTATGCGGCA TCAGAGCAGAT >3; SEQ ID Nr. 17), welcher an pUC18-Sequenzen 40 bp stromaufwärts der Nde I-Stelle annealt. Die Matrize für die PCR #2 war ein gereinigtes 990 bp großes Ssp I-Eco RI-Fragment aus pBBT370, das die gesamte Endostatin codierende Sequenz und 367 bp pUC18-Sequenz stromaufwärts der Nde I-Stelle am 5'-Ende des Endostatin-Genfragments, einschließlich der Sequenz, an welche BB125 annealt, enthält. Die Komponenten und das Programm für die PCR #2 sind die gleichen wie bei PCR #1. Zehn-μl-Aliquots von PCR #1 und #2 wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und von jeder wurde festgestellt, ein einzelnes Fragment der erwarteten Größe hergestellt zu haben.
  • Die PCR #3 war eine 50-μl-Reaktion, welche unter Verwendung von nicht-mutagenen Primern BB125 und BB126 ausgeführt wurde. Die Matrize für diese PCR war 1 μl PCR #1 und 0,3 μl PCR #2. Die Komponenten von PCR #3 waren die gleichen wie bei den Reaktionen 1 und 2. Das Reaktionsprogramm beinhaltete: 95°C während 5 Minuten, 23 Zyklen [94°C während 30 Sekunden, 56°C während 30 Sekunden, 72°C während 1 Minute], einen 7 Minuten langen Halt bei 72°C und einen Halt bei 4°C. Ein 10-μl-Aliquot von PCR #3 wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und es wurde festgestellt, dass ein 740-bp-Fragment erzeugt wurde, wie erwartet. Der Rest der Reaktion wurde unter Anwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits (Qiagen) gemäß des Protokolls des Herstellers "gesäubert" und mit Nhe I und BsrG I (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Herstellers verdaut. Im Anschluss an einen zusätzlichen Aufreinigungs-Schritt unter Anwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT370 ligiert, welcher mit Nhe I und BsrG I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits "aufgereinigt" worden war. Die Ligationsreaktion wurde zum Transformieren von E. coli JM109 verwendet, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert. Ein Klon, welcher die *-1C-Mutation und die korrekte Sequenz überall im 205 bp großen Nhe I-BsrG I-Segment aufwies, wurde identifiziert.
  • Die Substitution-Mutationen H2C, R5C, F7C und R28C (d.h. unter Änderung von Histidin an der Position 2 zu Cystein, etc.) wurden konstruiert, und hinsichtlich der Sequenz unter Anwendung der oben für *-1C ausführlich beschriebenen Protokolle bestätigt, mit der Ausnahme, dass andere mutagene Oligonukleotide verwendet wurden (Tabelle 16). Die mutagenen Vorwärts-Oligonukleotide wurden immer zusammen mit dem nicht-mutagenen Rückwärts-Primer BE 126 und dem gereinigten 1264 bp großen Nhe I ApaL I-Fragment als Matrize verwendet, und die mutagenen Rückwärts-Oligonukleotide wurden stets zusammen mit dem nicht-mutagenen Vorwärts-Primer BB125 und dem gereinigten 990 bp großen Ssp I-Eco RI-Fragment als Matrize verwendet. Tabelle 16 Zur Konstruktion von Endostatin-Cysteinmuteinen verwendete Oligonukleotide
    Mutation Oligonukleotid Richtung Sequenz (5' > 3'); Cys-Codon wird fettgedruckt gezeigt
    H2C 1313533 vorwärts GAGGAAATTTAAATTGCAGCCATCGCGACTTCCAG SEQ ID Nr. 56
    H2C 1313534 rückwärts CTGGAAGTCGCGATGGCTGCACATTTAAATTTCCTC SEQ ID Nr. 57
    R5C 1313535 vorwärts ATGCACAGCCACTGCGACTTCCAGCCG SEQ ID Nr. 58
    R5C 1313536 rückwärts CGGCTGGAAGTCGCAGTGGCTGTGCAT SEQ ID Nr. 59
    F7C 1313537 vorwärts GCCACCGCGACTGTCAACCGGTGCTCCAC SEQ ID Nr. 60
    F7C 1313538 rückwärts GTGGAGCACCGGTTGACAGTCGCGGTGGC SEQ ID Nr. 61
    R28C 1313539 vorwärts CATGCGGGGCATCTGCGGCGCCGACTTCCAG SEQ ID Nr. 62
    R28C 1313540 rückwärts CTGGAAGTCGGCGCCGCAGATGCCCCGCATG SEQ ID Nr. 63
    G90C 1313543 vorwärts GGCTCTGTTCTCGTGCTCTGAGGGTCC SEQ ID Nr. 64
    G90C 1313544 rückwärts GGAGCGTCAGAGCACGAGAACAGAGCC SEQ ID Nr. 65
    G98C 1313545 vorwärts CCGCTGAAGCCCTGCGCACGCATCTTC SEQ ID Nr. 66
    G98C 1313546 rückwärts GAAGATGCGTGCGCAGGGCTTCAGCGG SEQ ID Nr. 67
    H112C 1313547 vorwärts GACGTCCTGAGGTGCCCGACCTGGCCCCAG SEQ ID Nr. 68
    L154C BB548 vorwärts GGCCAGGCCTCCAGCCTCTGCGGGGGCAGGCTC SEQ ID Nr. 69
    L154C BB549 rückwärts GAGCCTGCCCCCGCAGAGGCTGGAGGCCTGGCC SEQ ID Nr. 70
    R157C BB550 vorwärts CTGCTGGGGCTGCCTCCTGGGCCAGAGTGCCGCG SEQ ID Nr. 71
    R157C BB551 rückwärts CGCGGCACTCTGGCCCAGGAGGCAGCCCCCCAGCAG SEQ ID Nr. 72
    S162C BB552 vorwärts CTCCTGGGGCAGTGCGCAGCGAGCTGCCATC SEQ ID Nr. 73
    S162C BB553 rückwärts GATGGCAGCTCGCTGCGCACTGCCCCAGGAG SEQ ID Nr. 74
  • Die Muteine G90C und G98C wurden durch ähnliche Verfahren zu denjenigen, welche für *-1C beschrieben wurden, konstruiert, mit der Ausnahme, dass die mutagenen Oligonukleotide anders waren (Tabelle 16), und dass die Matrize für PCR #3 0,5 μl PCR #1 und 0,5 μl PCR #2 war. Darüber hinaus wurde nach der "Hufreinigung" die PCR #3 mit BsrG I und Bsu36 I (New England BioLabs) verdaut, und im Anschluss an einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt wurden die Verdauprodukte mit pBBT370 ligiert, welcher mit BsrG I und Bsu36 I geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits "aufgereinigt" worden war.
  • Die Muteine L154C, R157C und S162C wurden durch ähnliche Verfahren zu denjenigen, die für *-1C beschrieben wurden, konstruiert, mit der Ausnahme, dass die mutagenen Oligonukleotide unterschiedlich waren (Tabelle 16) und die Matrize für PCR #3 0,3 μl PCR #1 und 1 μl PCR #2 war.
  • Darüber hinaus wurde nach dem "Aufreinigen" die PCR #3 mit Bsu36 I und Eco RI verdaut, und im Anschluss an einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt wurden die Verdauungsprodukte mit pBBT370 ligiert, welches mit Bsu36 I und Eco RI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England BioLabs) behandelt und unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits "aufgereinigt" worden war.
  • Das Mutein H112C wurde durch Verfahren konstruiert, welche in mehreren Hinsichten von denjenigen, die für *-1C beschrieben wurden, verschieden sind. Zuerst war die Sequenz des mutagenen Vorwärts-Oligonukleotids, verwendet in PCR #1, verschieden (Tabelle 16), und das Volumen der Reaktion belief sich auf 50 μl anstatt von 25 μl. PCR #2 und PCR #3 wurden nicht durchgeführt, weil sie nicht notwendig waren. Anstatt dessen wurde, nachdem ein 10-μl-Aliquot durch Gelelektrophorese analysiert worden war, diese Reaktion genauso behandelt, wie normalerweise PCR #3 behandelt wird. D.h. der Rest der Reaktion wurde unter Anwendung der QIAquick-PCR-Reinigung "gesäubert" und mit Bsu36 I und Eco RI (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Herstellers verdaut. Im Anschluss an einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits wurden die Verdauprodukte mit pBBT370 ligiert, welcher mit Bsu36 I und Eco RI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England Bio-Labs) behandelt und unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kits "aufgereinigt" worden war. Die Ligationsreaktion wurde zum Transformieren von E. coli JM109 verwendet, und Plasmide aus resultierenden Transformanten wurden sequenziert.
  • B. Expression von Cysteinmuteinen von met-Endostatin in E. coli:
  • Jeder met-Endostatin-Cysteinmutein-Klon mit der korrekten Sequenz wurde als ein Nde I-Eco RI-Fragment in pBBT257 (beschrieben im Beispiel 14) subkloniert, um einen Satz von Expressionsplasmiden zu erzeugen, welche in JM109 transformiert wurden, um die Stämme zu erzeugen, die in den Expressionsuntersuchungen verwendet wurden.
  • Diese Stämme wurden über Nacht in Luria-Nährbrühe (LB-Medium), welche 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, bei 37°C in Rollröhrchen wachsen gelassen. Gesättigte Übernachtkulturen wurden auf 0,025 O.D. bei A600 in LB, 10 μg/ml Tetracyclin, verdünnt und bei 37°C in Schüttelkolben inkubiert. Typischerweise wurde eine 25-ml-Kultur in einem 250 ml großen Schüttelkolben wachsen gelassen. Wenn ein Kultur-O.D. ~0,3-0,5 erreichte, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, um die Expression des für diesen Stamm spezifischen Endostatin-Cysteinmuteins zu induzieren. Vor-Induktions-, 4-Stunden-nach-Induktions- und 16-Stundennach-Induktions-Proben wurden abgenommen. Die Proben wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf im Voraus gegossenen 14%igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Induzierte Kulturen von jedem der Endostatin-Cysteinmutein-Stämme zeigten eine Bande bei ungefähr 20 kDa, welche konsistent mit reifem humanem Endostatin ist. Diese Bande wurde nicht in den nicht-induzierten Kulturen oder in induzierten oder nicht-induzierten Kulturen von BOB490, der Nur-Vektor-Kontrolle, detektiert. Die ~20 kDa große Bande comigrierte mit kommerziell hergestelltem humanem Endostatin, welches von Calbiochem erworben wurde.
  • C. Expression und Reinigung von Endostatin und Endostatin-Cysteinmuteinen:
  • E. coli, enthaltend exprimiertes Wildtyp-Endostatin oder Endostatin-Cysteinmutein R5C, wurden durch Zentrifugation pelletiert und bei -80°C eingefroren. Zellpellets wurden aufgetaut und mit 5 ml B-PER-Bakterienprotein-Extraktionsreagenz gemäß den Protokollen des Herstellers (Pierce) behandelt. Das unlösliche Material, welches die Hauptmasse des Endostatinproteins enthielt, wurde durch Zentrifugation zurückgewonnen und in B-PER resuspendiert. Diese Mischung wurde mit Lysozym (200 μg/ml) 10 Minuten lang behandelt, um die Zellwände weiter zu zerstören, und MgCl2 (Endkonzentration 10 mM) und proteasefreie DNAse (2 μg/ml) wurden zugegeben. Unlösliches Endostatin wurde durch Zentrifugation abgesammelt und durch Resuspension in Wasser und erneute Zentrifugation gewaschen, um den Großteil der solubilisierten Zelltrümmer zu entfernen. Für die Rückfaltung wurde das resultierende Pellet, welches unlösliches Endostatin enthielt, in 20 ml von 8 M Harnstoff, 10 mM Cystein in 20 mM Tris-Base gelöst. Diese Mischung wurde 120 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Cystein wurde zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, bevor die Solubilisierung in 200 ml eiskaltem 3 M Harnstoff, 40 μM Kupfersulfat, 20 mM Tris, pH 7,5, verdünnt wurde. Dieses Rückfaltungsgemisch wurde 3 Tage lang bei 4°C langsam gerührt. Der pH-Wert des Rückfaltungsgemischs wurde dann mit verdünnter HCl auf 5,0 eingestellt, und die Mischung wurde zentrifugiert, bevor sie auf eine 5 ml große S-Sepharose-Säule (Pharmacia HiTrap) geladen wurde, welche in 40 mM Natriumphosphat pH 5,0 (Puffer A) äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Salzgradienten von 0-100% Puffer B (500 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 5,0) eluiert. Die S-Sepharose-Fraktionen, welche vorwiegend Endostatin enthielten, wurden vereinigt, wobei ihr pH-Wert auf 7,4 eingestellt wurde, bevor sie aufgetragen wurden auf [eine] Heparin-Sepharose (HiTrap)-Säule, die zuvor in 20 mM Tris, pH 7,4, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem 0-1 M NaCl-Salzgradienten eluiert. Heparin-Säulen-Fraktionen mit reinem Endostatin wurden vereinigt und eingefroren. Die Endostatin-Cystein-Mutanten G90C, G98C, H112C und R157C sind ebenfalls unter Anwendung des oben stehenden Protokolls partiell gereinigt worden, wobei der Heparinsäulen-Schritt weggelassen wurde.
  • R5C-Endostatin-Cysteinmutein wurde unter Verwendung eines 15X Überschusses an 5-kDa-PEG-Maleimid und eines 10-15-fachen Überschusses an TCEP PEGyliert. Die Reaktion ergab monoPEGyliertes R5C-Protein
  • D. Endostatin-Bio-Assay:
  • Rückgefaltetes rekombinantes Wildtyp-Endostatin und das rückgefaltete Endostatin-Cysteinmutein R5C waren biologisch aktiv, wie es unter Verwendung des MMP-2-Inhibitions-Assays gezeigt wurde, der von Kim et al. (2000) beschrieben wurde.
  • Die Bioaktivität der Proteine kann auch in einem Endothelzellproliferations-Inhibitions-Assay gemessen werden. Die In-vitro-Inhibition der Endothelzellproliferation kann wie folgend durchgeführt werden. Fünftausend HMVEC-L-Zellen (Clonetics) können auf gelatinisierten 96-Vertiefungs-Kulturplatten ausplattiert und während 24 Stunden in 100 μl HMVEC-L-Medium mit bFGF inkubiert werden (37°C, 5% CO2). Das Medium wird dann mit 20 μl Medium ersetzt, welches serielle Verdünnungen von Endostatin, Endostatin-Cysteinmuteinen oder PEGylierten Endostatin-Cysteinmuteinen enthält, und 20 Minuten lang inkubiert. 80 μl frisches HMVEC-L-Medium, welches bFGF enthält, wird dann zu der Vertiefung zugesetzt. Nach 72 Stunden können die Zellzahlen bestimmt werden. Die verschiedenen Endostatin-Proteine werden die Proliferation der Endothelzel len inhibieren, wie es durch dosisabhängige Verringerungen der Endothelzell-Anzahlen am Ende des Assays verdeutlicht wird.
  • Beispiel 23
  • Rückfaltung von rekombinanten Angiostatin-Cysteinmuteinen
  • Angiostatin ist vollständig aktiv, wenn es nicht-glycosiliert ist, und erfordert daher kein eukaryotisches Expressionssystem zur Produktion. Die codierende Sequenz für humanes Angiostatin, bestehend aus den ersten vier "Kringle"-Untereinheiten von humanem Plasminogen, kann mittels PCR aus einer humanen Plasminogen-cDNA-Matrize (verfügbar von der American Type Culture Collection, Rockville, MD) amplifiziert werden. Wildtyp-Angiostatin und Angiostatin-Cysteinmuteine können aus E. coli sezerniert werden, indem man bakterielle Signalsequenzen, wie diejenigen aus den STII- oder ompA-Proteinen, auf den N-Terminus von reifem Angiostatin, zum Zwecke des Transportierens des Proteins in den periplasmatischen Raum, fusioniert. Dieses Verfahren ist ebenfalls erfolgreich für Fragmente von Angiostatin angewandt worden (Kringle(K)1, K2, K3 und K2-3 (Cao et al., (1996)). Alternativ dazu können Angiostatin und Angiostatin-Cysteinmuteine cytoplasmatisch in E. coli oder einer anderen Wirtszelle exprimiert werden. Angiostatin besitzt 26 Cysteine, welche 13 Disulfide ausbilden. Deshalb werden herkömmliche Rückfaltungsprotokolle, ohne eine zugesetzte Cysteinblockierung, bei einem Cystein-reichen Protein wie Angiostatin wahrscheinlich erfolglos sein. Bevorzugte Stellen zur Einbringung von Cysteinresten in Angiostatin schließen K97C (ein auf den N-Terminus von reifem Angiostatin zugefügter Cysteinrest), T365C, 371C, S460C, A463C und *466C (ein auf den C-Terminus des reifen Angiostatinproteins hinzugefügter Cysteinrest) ein.
  • Bakterienzellen, welche rekombinantes Angiostatin oder die Angiostatin-Cysteinmuteine exprimieren, können unter Verwendung von B-per, wie beschrieben vom Protokoll des Herstellers (Pierce), lysiert werden. Der unlösliche Anteil kann durch Zentrifugation isoliert werden. Das Pellet kann unter Verwendung einer Mischung von 20 mM Cystein, 6 M Guanidin, 20 mM Tris-Base solubilisiert werden. Die Mischung kann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt werden, bevor sie 10-fach in 20 mM Tris verdünnt wird. Die Rückfaltung kann 1-2 Tage lang bei 4°C gehalten werden. Am Ende dieser Zeit kann die Rückfaltung zentrifugiert werden, und das Angiostatin-Protein (oder Cysteinmuteine) können unter Verwendung einer Lysin-Sepharose-Säule gereinigt werden. Das Rückfaltungsgemisch kann direkt auf die Säule aufgetragen werden, welche zuvor in 20 mM Hepes, 0,15 M NaCl, pH 7,4, äquilibriert wird. Angiostatin (oder ein Angiostatin-Cysteinmutein) kann aus der Säule unter Verwendung eines Gradienten von 0-12 mM E-Aminocapronsäure freigesetzt werden. Eine weitere Reinigung kann, falls notwendig, unter Anwendung verschiedener Ionenaustauscher- oder HIC-Harze durchgeführt werden.
  • Beispiel 24
  • Peptidkartierung von PEGylierten Proteinen
  • In vielen Fällen können Peptidkarten verwendet werden, um den Ort der PEGylierung zu bestätigen. Typischerweise wird das PEGylierte Protein spezifisch verdaut, sodass das Cysteinmutein in einem Peptid ohne andere Cysteinreste vorhanden ist. Das Vorhandensein eines kovalent an das Peptid angehefteten PEG wird die Retentionszeit drastisch verändern, wenn die Verdauungsmischung durch Umkehrphasen-HPLC geassayt wird. Wenn GH mit Trypsin unter Anwendung von Bedingungen aus der Literatur (Clark et al., 1996) verdaut wird, können 21 mögliche tryptische Peptide (aufeinander folgend nummeriert als T1-T21) isoliert werden. Bei T1, das die Reste 1-8 repräsentiert und das die Mutation T3C einschließt, liegt eine Verschiebung zu einer geringfügig früheren Retentionszeit für die Cystein-Mutante (61 Minuten) im Vergleich zum Wildtyp (64 Minuten) oder Hypophysen-Wachstumshormon vor. Wenn es mit einem 5K-PEG PEGyliert ist, bewegt sich das T1-Peptid zum Ende des Chromatogramms mit einer Retentionszeit von mehr als 100 Minuten. Wenn GH mit der Endoprotease Lys-C verdaut wird, [entstehen] 10 Peptide (aufeinanderfolgend nummeriert L1-10). L1, welches die Reste 1-38 repräsentiert, eluiert bei ungeführ 59 Minuten für Wildtyp-GH und bei etwa 61 Minuten für das Mutein T3C. Wenn es mit einem 20K-PEG PE-Gyliert ist, fehlt L1 bei dem Chromatogramm. Diese Daten bestätigen, dass die PEG-Einheit tatsächlich an den Cysteinrest an der Position 3, wie vorhergesagt, anstatt an einem nativen Cystein angeheftet ist. Enzymatischer Verdau und RP-HPLC-Analyse von Cysteinmuteinen von IFN (Trypsin und Endoprotease Glu-C), GM-CSF (Endoprotease Glu-C) und G-CSF (Endoprotease Lys-C) vor und nach PEGylierung zeigten ebenfalls Daten, welche konsistent mit einer einzigen Stelle der PEGylierung an dem neu eingeführten Cysteinrest waren.
  • Beispiel 25
  • Mobilisierung von Vorläuferzellen des peripheren Bluts, herbeigeführt durch PEG-G-CSF- und PEG-GM-CSF-Cysteinmuteine
  • Von der Behandlung mit rekombinantem G-CSF und rekombinantem GM-CSF wurde gezeigt, Vorläuferzellen des peripheren Bluts (PBPC, Peripheral Blood Progenitor Cells) zu mobilisieren, welche zu einer rascheren Produktion und Einpflanzung von Neutrophilen und Blutplättchen im Anschluss an eine Chemotherapie führen. Die Steigerung der PBPC-Mobilisierung (und potenziell der Einpflanzungs-Raten) kann in Gegenwart der PEGylierten G-CSF- und PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteine ausgewertet werden. Splenektomierte Mausstämme, welche bekannterweise gut definierte Knochenmarkzellprofile und -wachstumskinetiken aufweisen, können eine einzelne oder tägliche (bis zu 7 Tagen) intravenöse oder subkutane Dosierung(en) von G-CSF (Wildtyp oder Neupogen®) oder PEGylierten G-CSF-Cysteinmuteinen erhalten. Jedes Experiment kann auch eine Gruppe von Mäusen enthalten, die nur mit einem Träger behandelt wurden, bestehend aus Mausserumalbumin, das in isotonischer Kochsalzlösung suspendiert ist. Im Anschluss an die Behandlung kann das periphere Blut durch Herzpunktur abgeerntet und in EDTA-enthaltenden Röhrchen aufge sammelt werden. Eine CBC-Analyse kann durchgeführt werden. Knochenmarkszellen können durch Ausspülen des Inhalts des Femurs und des Marks geerntet werden. Die Zählungsanzahlen von weißen Blutkörperchen bzw. weißen Zellen können durch Färben mit Kristallviolett und Hämacytometer-Zählung ermittelt werden. Niedrigdichte Zellen können unter Anwendung von Blut-Dichtegradienten-Fraktionierung isoliert und in Vorläuferzellen-Assays verwendet werden. Das Protokoll für die Vorläuferzell-Assays ist in Briddell et al. (1993) umrissen. Grundsätzlich kann ein auf Doppelschicht-Agar-basierendes System (Bradley et al., 1978) angewandt werden, um sowohl primitive (hochproliferative, potenzielle Kolonie-bildende Zellen) als auch reife (Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-bildende Zellen) Vorläuferzellen auszuwerten. Ein auf Methylzellulose basierendes Assay-System, welches von Iscove et al. (1974) entwickelt worden war, kann angewandt werden, um eine Erythroid-Koloniebildung auszuwerten. PEGylierte G-CSF-Cysteinmuteine werden die Mobilisierung von Vorläufer- und Stammzellen erhöhen. Ähnliche Untersuchungen können mit PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen und Wildtyp-GM-CSF durchgeführt werden. Letztendlich kann die Effizienz einer Transplantation in lethal bestrahlten Mäusen und das Vermögen, den Einpflanzungsvorgang in Gegenwart von PEGylierten G-CSF- und PEGylierten GM-CSF-Cysteinmuteinen zu fördern, untersucht werden.
  • Referenzen
    • Abrahmsen, L., Moks, T., Nilsson, B. and Uhlen, M. (1986) Nucleic Acids Res.14:7487-7500.
    • Abuchowski, A., Kazo, G.M., Verhoest, C.R., van Es, T., Kafkewitz, D., Nucci, M.L., Viau, A.T. and Davis, F.F. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7: 175-186.
    • Alt, F.W., Kellems, R.E., Bertino, J.R., and Schimke, R.T. (1978) J. Biol. Chem. 253:1357-1370. Arakawa, T., Prestrelski, S.J., Narhi, L.O., boone, T.C. and Kenney, W.C. (1993) J. Protein Chem. 12: 525-531.
    • Balkwill, F.R, Goldstein, L. and Stebbing, N. (1985) Int. J. Cancer 35: 613-617.
    • Balkwill, F.R. (1986) Methods Enzymology 119: 649-657.
    • Barik, S. (1993) in "Methods in Molecular Biology", White, B.A., ed. (Humana Press, Totawa, NJ), 15: 277-286.
    • Bazan, F. (1990) Immunology Today 11: 350-354.
    • Bazan, J.F. (1991) Cell 65: 9-10.
    • Bazan, J.F. (1992) Science 257: 410-411.
    • Becker, G.W. and Hsiung, H.M. (1986) FEBS Lett. 204: 145-150.
    • Bewley et al., (1969) Biochem. 8: 4701-4708.
    • Blatt, L.M., Davis, J.M., Klein, S.B. and Taylor, M.W. (1996) J. Interferon and Cytokine Research 16: 489-499.
    • Blezinger, P., Wang, J., Gondo, M., Quezada, A., Mehrens, D., French, M., Singhal, A., Sullivan, S., Rolland, A., Ralston, R., and Min, W. (1999) Nature Biotechnology 17: 343.
    • Blumberg, H., Conklin, D., xu, W., Grossman, A., Brender, T., Carollo, S., Eagen, M., foster, D., Haldeman, B.A., Hammond, A., Haugen, H., Jelinek, L., Kelley, J.d., madden, K., Maurer, M.F., Panish-novak, j., Prunkard, D., sexson, S., Sprecher, C., Waggie, K., west, J., Whitmore, T.E., Yao, L., Kuechle, M.k., Dale, B. and chandrasekher, Y.A. (2001) Cell 104: 9-19.
    • Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. and Falkow, S. (1977) Gene 2:95-113.
    • Bollag, D.M., Rozycki, M.D. and Edelstein, S.J. (1996) Protein Methods, 415 pages, Wiley-Liss, NY, NY.
    • Bowen, S., Tare, N., Inoue, T., Yamasaki, M., Okabe, M., Horii, I. And Eliason, J. (1999) Exp. Hematol. 27, 425-432.
    • Bradley, T., Hodgson, G. and Rosendaal, M. (1978) J. Cell Physiol. 94: 517 Braxton, S.M. (1998) U.S. Patent 5,766,897 .
    • Briddell, R.A., Hartley, C.A., Smith, K.A. and McNiece, I.K. (1993) Blood 82 (6), 1720-1723.
    • Cantrell, M.A., Anderson, D. and Cerretti, D.P (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6250-6254.
    • Cao Y., Ji R.W., Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCance SG., O'Reilly MS., Llinas M. and Folkman J. (1996) 271:29461-29467.
    • Cecil, R. and McPhee, J.R. (1959). Advances in Protein Chemistry 14, 255-389.
    • Chamow & Ashkenazi (1996), Trends in Biotech 14:52-60.
    • Chang, C.N., Rey, B., Bochner, B., Heyneker, H. and Gray, G. (1987) Gene: 189-196.
    • Cheah, K-C., Harrison, S., King, R., Crocker, L., Wells, J.R.E. and Robins, A. (1994) Gene, 138: 9-15.
    • Clark, R., Olson, K., Fuh, G., Marian, M., Mortensen, D., Teshima, G., Chang, S., Chu, H., Mukku, V., Canova-Davis, E., Somers, T., Cronin, M., Winkler, M. and Wells, J. A. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21969-21977.
    • Cox, G.N. and McDermott, M.J. (1994) WO 9412219 .
    • Cox, G.N., McDermott, M.J., Merkel, E., Stroh, C.A., Ko, S.C., Squires, C.H., Gleason, T.M. and Russell, D. (1994) Endocrinology 135: 1913-1920.
    • Crouse, G.F., McEwan, R.N., and Pearson, M.L. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257-266.
    • Cunningham, B.C. and Wells, J.A. (1989) Science 244: 1081-1085.
    • Daopin, S., Piez, K.A., Ogawa, Y., and Davies, D.R. (1992) Science 257: 369-373.
    • Denefle, P., Kovarik, S., Ciora, T. Gosselet, M., Benichou, J.-C., Latta, M. Guinet, F., Ryter, A. and Mayaux, J.-F. (1989) Gene 85, 499-510.
    • Donahue, R.E., Wang E.A., Stone, D.K., Kamen, R., Wong, G.G., Sehgal, P.K., Nathan, D.G. and Clark, S.C. (1986a) Nature 321:872-5.
    • Donahue, R.E., Wang, E.A., Kaufaman, R.J., Foutch, L., Leary, A.C. and Witek-Giannetti, J.S. (1986b) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 685-692.
    • Evinger, M. and Pestka, S. (1981) Methods Enzymol. 79:362-368.
    • Fuh, G., Cunnungham, B.C., Fukanaga, R., Nagata, S., Goeddel, D.V. and Wells, J.A. (1992) Science 256: 1677-1680.
    • Fujimoto, K., Fukuda., T., and Marumoto., R. (1988) J. Biotechnol. 8:77-86.
    • Gamba-Vitalo, C., DiGiovanna, M.P., and Sartorelli, A.C. (1991) Blood Cells 17:193-205.
    • Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B. and Kocher, H.P. (1996) Prot. Express. Purif: 8:271-282.
    • Goffin, V., Bernichtein, S., Carriere, O., Bennett, W.F., Kopchick, J.J. and Kelley, P.A. (1999) Endocrinology 140: 3853-3856.
    • Goodson, R.J. and Katre, N.V. (1990) Biotechnology 8: 343-346.
    • Gough, N.M., Metcalf, D., Gough, J., Grail, D. and Dunn, A.R. (1985) EMBO J. 4:645-53.
    • Gough, N.M., Gough, J., Metcalf, D., Kelso, A., Grail, D., Nicola, N.A., Burgess, A.W. and Dunn, AR (1984) Nature 309:763-7.
    • Greenberg, R, Lundell, D., Alroy, Y. and Bonitz, S. (1988) Curr. Microbiol. 17:321-332.
    • Greenspan, F.S., Li., C.H., Simpson, M.E. and Evans, H.M. (1949) Endocrinology 45:455-463.
    • Ghrayeb, J., Kimura, H., Takahara, M., Hsiung, H., Masui, Y. and Inouye, M. (1984) EMBO J. 3:2437-2442.
    • Hannum, C., Culpepper, J., Campbell, D., McClanahan, T., Zurawski, S. et al. (1994) Nature 368: 643-648.
    • Henco, K., Brosius, J., et al., (1985) J. Mol. Biol. 185: 227-260.
    • Hershfield, M.S., Buckley, R.H., Greenberg, M.L. et al., (1987) N. Engl. J. Medicine 316: 589-596.
    • Hoffman, C.S. and Wright, A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5107-5111.
    • Hohenester, E., Sasaki, T., Olsen, B.R. and Timpl, R. (1998) EMBO J. 17:1656-1664.
    • Horisberger, M.A. and Di Marco, S. (1995) Pharmac. Ther. 66: 507-534.
    • Horoszewicz, J.S., Leong, S.S. and Carter, W.A. (1979) Science 206:1091-1093.
    • Horton, R.M. (1993) in "Methods in Molecular Biology", White, B.A., ed. (Humana Press, Totawa, NJ), v.15, 214- 250.
    • Hsiung, H.M., Mayne, N.G. and Becker, G.W. (1986) Biotechnology 4: 991-995.
    • Innis, M.A., Gelfand, D.H, Sninsky, J.J. and White, T.J. eds. (1998) "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" (Academic Press, San Diego, CA).
    • Iscove, N. N., Sieber, F. and Winterhalter, K.H. (1974) J. Cell Physiol. 83: 309
    • Ishikawa, M., Iijima, H., Satake-Ishikawa, R, Tsumura, H., et al., (1992) Cell Struct. Function 17, 61-65.
    • Johns, T.G., Mackay, I.R., Callister, K.A., Hertzog, P.J., Devenish, R.J. and Linnane, A.W. (1992) J. Natl. Cancer Institute 84: 1185-1190.
    • Johnson, D.L., Middleton, S.A., McMahon, F. Barbone, F.P., Kroon, D., Tsao, E., Lee, W.H., Mulcahy, L.S. and Jolliffe, L.K. (1996) Protein Expression Purif. 7:104-113.
    • Kadonaga, J., Gautier, A. Straus, D.R, Charles, A.D., Edge, M.D. and Knowles, J.R. (1984) J. Biol. Chem. 259: 2149-2154.
    • Kajigaya, S., Suda, T., Suda, J., Saito, M., Miura, Y., Iizuka, M., Kobayashi, S., Minato, N. and Sudo, T. (1986) J Exp Med 164:1102-13
    • Kang, S.-H., Na, K.-H., Park, J.-H. Park C-I, Lee, S.-Y. and Lee, Y-I. (1995) Biotech. Lett. 17, 687-692.
    • Katre, N.V. (1990) J. Immunology 144: 209-213.
    • Katre, N.V., Knauf, M.J. and Laird, W.J. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1487-1491.
    • Kaufman, R.J. (1990) Meth. Enzymol. 185:537-566.
    • Khan, F.R. and Rai, V.R. (1990) Bioprocess Technology 7:161-169.
    • Kim, Y.M., Jang, J., Lee, O., Yeon, J., Choi, E., Kim, K., Lee, S. and Kwon, Y. (2000) Cancer Research 60, 5410-5413.
    • Kingsley, D.M. (1994) Genes Dev. 8: 133-146.
    • Kinstler, O.B., Gabriel, N.E., Farrar, C.E. and DePrince, R.B. (1996) International Patent Application Number WO 96/11953 .
    • Kitamura, T., Tange, T., Terasawa, T., Chiba, S., Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y.F., Miyazono, K., Urabe, A. and Takaku, F. (1989) J. Cell. Physiol. 140:323-334.
    • Knusli, C., Delgado, C., Malik, F., Domine, M., Tejedor, M.C., Irvine, A.E., Fisher, D. and Francis, G.E. (1992) Brit. J Haematol. (1992) 82:654-663.
    • Koshland, D. and Botstein, D. (1980) Cell 20: 749-760.
    • Kubota, N., Orita, T., Hattori, K., Oh-eda, M., Ochi, N. and Yamazaki, T. (1990) J. Biochem. 107: 486-492.
    • Kuga, T., Komatsu, Y., Yamasaki, M., De4kine, S., Miyaji, H., Nishi, T., Sato, M., Yokoo, Y., Asano, M., Okabe, M., Morimoto, M. and Itoh, S. (1989) Bioch.. Biophys. Res. Comm. 159: 103-111.
    • Kutty G., Kutty, R.K., Samuel, W., Duncan, T., Jaworski, C., and Wiggert, B. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246:644-649.
    • Lawton, L.N., Bonaldo, M.F., Jelenc, P.C., Qiu, L., Baumes, S.A., Marcelino, R.A., de Jesus, G.M., Wellington, S., Knowles, J.A., Warburton, D., Brown, S., and Soares, M.B. (1997) Gene 203: 17-26.
    • Lee, F., Yokota, T., Otsuka, T., Giemmell, L., Larson, N., Luh, J., Arai, K.-I. And Rennick, D. (985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-64.
    • Libby, R.T., Braedt, G., Kronheim, S.R., March, C.J., Urdal, D.L., Chiaverotti, T.A., Tushinski, R.J., Mochizuki, D.Y., Hopp, T.P., and Cosman, D. (1987) DNA 6:221-229.
    • Lindner, D.J. and Borden, E.C. (1997) J. Interferon and Cytokine Research 17:681-693.
    • Lu, H.S., Boone, T.C., Souza, L.M., and Lai, P.H. (1989) Arch. Biochem.Biophys. 268: 81-92.
    • Lu, H.S., Clogston, C.L., Narhi, L.O., Merewether, L.A., Pearl, W.R. and Boone, T.C. (1992) J. Biol. Chem. 267: 8770-8777.
    • Lucas, B.K., Giere, L.M., DeMarco, M.A., Shen, A., Chisolm, V., and Crowley, C.W. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1774-1779.
    • Lydon, N.B., Favre, C., Bove, S., Neyret, O., Benureau, S., Levine, A.M., Seelig, G.F., Nagabhushan, T. L. and Trotta, P.P. (1985) Biochemistry 24: 4131-4141.
    • Maisano, F., Testori, S.A., and Grandi, G. (1989) J. Chromatograph. 472: 422-427.
    • Malik, F., Delgado,C., Knusli, C., Fisher, D. and Francis, G.E.(1992) Exp. Hematol. 20: 1028-1035.
    • Mark, D.F., Lin, L.S. and Lu, S-D.Y. (1985) U.S. Patent 4,518,584 .
    • Mark, D.F., Lu, S.d., Creasey, A.a., Yamamoto, R. and Lin, L.S. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-5666.
    • Martin, F.H., Suggs, S.V., Langley, K.E., Lu, H.S., Ting, J., Okino, K.H., Morris, F.C., McNiece, I.K, Jacobsen, F.W., Mendiaz, E.A., Birkett, N.C. et al., (1990) Cell 63: 203-211.
    • Massague, J. (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597-641.
    • Matsuzaki, G., Li, X.-Y., Ohyama, Y. and Nomoto, K. (1996) Int. J. Immunopharmac. 18: 363-369.
    • Mayer, P., Lam, C., Obenaus, H., Liehl, E., and Besemer, J. (1987a) Mm N Y Acad Sci 511:17-29.
    • Mayer, P., Lam, C., Obenaus, H., Liehl, E., and Besemer, J. (1987b) Blood 70:206-13.
    • Mayer, P., Schutz, E., Lam,C., Kricek, F., and Liehl, E. (1991) J. infect. Dis.163:584-590.
    • Mayer, P., Werner, F., Lam, C., and Besemer, J. (1990) Exp. Hematol. 18:1026-1033, McDonald, N.Q. and Hendrickson, W.A. (1993) Cell 73: 421424.
    • McKay, D.B. (1992) Science 257: 412.
    • Meyers, F.J., Paradise, C., Scudder, S.A., Goodman, G. and Konrad, M. (1991) Clin.Pharmacol. Ther. 49:307-313.
    • Monkarsh, S.P., Ma, Y., Aglione, A., Bailon, P. et al. (1997) Anal. Biochem. 247: 434-440.
    • Morehead, H., Johnson, P.D. and Wetzel, R. (1984) Biochemistry 23: 2500-2507.
    • Morioka-Fujimoto, K., Marumoto, R. and Fukuda, T. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1728-1732.
    • Moschera, J.A., Woehle, D., Tsai, K.P., Chef, C.-H. and Tamowski, S.J. (1986) Methods in Enzymology 119: 177-183.
    • Mott, H.R. and Campbell, I.D. (1995) Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121.
    • Nagata, S., Tsuchiya, M., Asano, S., Kziro, Y., Yamazaki, T., Yamamoto, O., Hirata, Y., Kubota, N., Oh-eda, M., Nomura, H. and Ono, M. (1986a) Nature 319: 415-418.
    • Nagata, S., Tsuchiya, M., Asano, S., Yamamoto, O., Hirata, Y., Kubota, N., Oh-eda, M., Nomura, H. and Yamazaki, T. (1986b) EMBO J. 5: 575-581.
    • Oh-eda, M., Hasegawa, M., Hattori, K., Kuboniwa, H., Kojima, T., Orita, T., Tomonou, K., Yamazaki, T., and Ochi, N. (1990) J. Biol. Chem. 265: 575-11435.
    • Ostermeier, M., De Sutter., K., Georgiou, G. (1996) J. Biol. Chem. 271: 10616-10622.
    • Paul, W.E. ed. (1989) "Fundamental Immunology" (Raven Press, New York, NY).
    • Perez-Perez, J., Martinez-Caja, C., Barbero, J.L. and Gutierrez, J. (1995) Biochem. Biophys Res. Comm. 210: 524-529.
    • Pestka, S., Langer, J.A., Zoon, K.C. and Samuel, C.E. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 727-777.
    • Picken, R.N., Mazaitis, A.J., Maas, W.K., Rey, M. and Heyneker, H. (1983) Infect. and Immun. 42: 269-275.
    • Roitt, I.M., Brostoff, J., and Male, D.K. eds. (1989) "Immumology" (Gower Medical Publishers, New York, NY and London, UK)
    • Rowlinson, S.W. Barnard, R., Bastiras, S., Robins, A.J., Brinkworth, R. and Waters, M.J. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16833-16839.
    • Satake-Ishikawa, R., Ishikawa, W., Okada, Y., Kakitani, M., Kawagishi, M., Matsuki, S. and Asanao, K. (1992) Cell Structure and Function 17: 157-160.
    • Schuening, F.G., Storb, R., Goehle, S., Nash, R., Graham, T.C., Appelbaum, F.R., Hackman, R., Sandmaier, B.M., and Urdal, D.L. (1989) Exp. Hematol. 17:889-894.
    • Shanafelt, A.B., Lin, Y., Shanafelt, M.-C., Forte, C.P. et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1197-1202.
    • Shaw, G., Veldman., G. and Wooters, J.L. (1992) U.S. Patent 5,166,322 .
    • Silvennoinen, O. and Ihle, J.N. (1996) Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G. Landes, Company, Austin, TX.
    • Souza, L.M., Boone, T.C., Gabrilove, J., Lai, P.H., Zsebo, K.M., Murdock, D.C., Chazin, V.R., Bruszewski, J., Lu, H., Chef, K.K., Barendt, J., Platzer, E., Moore, M.A.S., Mertelsmann, R. and Welte, K. (1986) Science 232: 61-65.
    • Sytkowski, A.J., Lunn, E.D., Davis, K.L., Feldman, L. and Siekman, S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1184-1188.
    • Tanaka, H., Satake-Ishikawa, R., Ishikawa, M., Matsuki, S. and Asano, K. (1991) Cancer Research 51: 3710-3714.
    • Thompson, S.A. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2269-2273.
    • Torchinskii, Y.M. (1971) in "Sulfhydryl and Disulfide Groups of Proteins" in Studies of Soviet S cience (1971) Nauka Press, Moscow.
    • Trill, J.J., Shatzman, A.R., and Ganguly, S. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:553-560.
    • Trotts, P.B. (1986) Seminars in Oncology XIII Supplement 2: 3-12.
    • Tuma, R., Rosendahl, M. and Thomas, G. (1995) Biochem. 34: 15150-15156.
    • Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220.
    • Van Den Berg, C.L., Stroh, C., Hilsenbeck, S.G., Weng, C.-N., McDermott, M.J., Cox, G.N. and Yee, D. (1997) Eur. J. Cancer 33: 1108-1113.
    • Voss, T., Falkner, E., Ahorn, H. Krystek, E. Maurer-Fogy, I. Bodo, G., Hauptmann, R (1994) Biochem. J. 298, 719-725.
    • Wang, A., Lu, S.-d. and Mark, D.F. (1984) Science 224: 1431-1433.
    • Weinstein, Y., Ihle, J.N., Lavu, S. and Reddy, E.P. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5010-5014.
    • White, B. A. (1993) in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications edited by Humana Press, Inc., Totowa,NJ.
    • Wingfield, P., Benedict, R., Turcatti, G., Allet, B., Mermod, J.-J., DeLamarter, J., Simana, M. and Rose, K. (1988) Biochem. J. 256, 213-218.
    • Yamaoka, T., Tabata, Y. and Ikada, Y. (1994) J. Pharm. Sci. 83: 601-606.
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Claims (41)

  1. Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, löslichen Form eines unlöslichen oder aggregierten Proteins, das ein Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie ist und einen oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste enthält, umfassend die Schritte: a) Bewirken, dass eine Wirtszelle ein Protein, das einen oder mehrere hinzugefügte freie Cysteinreste enthält und ein Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie ist, in einer unlöslichen oder aggregierten Form exprimiert; b) Lysieren der Zellen durch chemische, enzymatische oder physikalische Mittel; c) Solubilisieren und Reduzieren des unlöslichen oder aggregierten Proteins, indem das unlösliche oder aggregierte Protein einem Denaturierungs-mittel, einem Reduktionsmittel und einem Cystein blockierenden Mittel ausgesetzt wird; und d) Rückfalten des Proteins durch Verringern der Konzentrationen an dem Denaturierungsmittel und den Reduktionsmitteln auf Spiegel, die ausreichen, um die Renaturierung des Proteins in eine lösliche, biologisch aktive Form zu gestatten, wobei das Cystein blockierende Mittel ein reversibles gemischtes Disulfid mit mindestens einem freien Cysteinrest in dem Protein bildet.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie von der Wirtszelle sezerniert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie von der Wirtszelle als intrazelluläres Protein exprimiert wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Lysierschritt (b) das Lysieren der Wirtszelle in Gegenwart des im Schritt (c) verwendeten Cystein blockierenden Mittels umfasst.
  5. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis 3, wobei der Lysierschritt (b) das Lysieren der Wirtszelle in Gegenwart eines Denaturierungsmittels umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis 3, wobei der Lysierschritt (b) das Lysieren der Wirtszelle in Gegenwart eines Denaturierungsmittels und des im Schritt (c) verwendeten Reduktionsmittels umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Lysierschritt (b) Folgendes umfasst: 1) Lysieren der Wirtszelle und 2) Abtrennen löslicher Proteine von unlöslichen oder aggregierten Proteinen.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Reduktionsmittel und das Cystein blockierende Mittel des Schrittes (c) die gleiche Verbindung sind.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Cystein blockierende Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cystein, Cysteamin, reduziertem Glutathion oder Thioglykolsäure besteht.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Cystein blockierende Mittel des Schrittes (c) ein Dithiol ist, das, wenn es reduziert ist, als Cystein blockierendes Mittel wirkt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Dithiol aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cystin, Cystamin, oxidiertem Glutathion oder Dithioglykolsäure besteht.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart von Glycerin umfasst.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart eines Oxidationsmittels umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sauerstoff, einem Dithiol, Iod, Wasserstoff-Peroxid, Dihydroascorbinsäure, Tetrathionat oder O-Iodbenzoat besteht.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart eines Metallions umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Metallion Cu++ oder Co ist.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart des im Schritt (c) verwendeten Cystein blockierenden Mittels umfasst.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart eines Denaturierungsmittels umfasst.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) das Rückfalten des Proteins in Gegenwart eines Dithiols umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Dithiol aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cystin, Cystamin, Dithioglykolsäure oder oxidiertem Glutathion besteht.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rückfaltungsschritt (d) in Gegenwart eines Reduktionsmittels erfolgt.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cystein, DTT, 2-Mercaptoethanol, reduziertem Glutathion, Cysteamin, Thioglykolsäure oder einem anderen Thiol besteht.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das unlösliche oder aggregierte Protein ein rekombinantes Protein ist.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das unlösliche oder aggregierte Protein eine Cystein-Variante eines Mitglieds der Wachstumshormon-Supergen-Familie oder ein Derivat oder Antagonist davon ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wachs-tumshormon, Prolactin, Placenta-Lactogen, Erythro-poetin, Thrombopoetin, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12 (p35-Untereinheit), Interleukin-13, Interleukin-15, IL-19, IL-20, Oncostatin M, ciliärem neurotrophem Faktor, Leukämieinhibierendem Faktor, alpha-Interferon, beta-Interferon, gamma-Interferon, Omega-Interferon, tau-Interferon, Granulozytenkoloniestimulierendem Faktor, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor, Cardiotropin-1, Makrophagenkoloniestimulierendem Faktor, Stammzellfaktor und flt-3-Ligand besteht, wobei das Mitglied ein oder mehrere hinzugefügte freie Cysteine enthält.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie Wachstumshormon ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie alpha-Interferon ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie α-Interferon α2 ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendes Hormon (GM-CSF) ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie Granulozyten-koloniestimulierendes Hormon (G-CSF) ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das G-CSF-Protein eine Nicht-Cystein-Aminosäure als Substitution für Cystein 17 enthält.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Nicht-Cystein-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Serin und Alanin besteht.
  33. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie Interleukin-11 (IL-11) ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie beta-Interferon ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Mitglied der Wachstumshormon-Supergen-Familie gamma-Interferon ist.
  36. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, das zudem die Schritte umfasst: (e) Isolieren des rückgefalteten löslichen Proteins von anderen Proteinen in dem Rückfaltungsgemisch des Schrittes (d).
  37. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Denaturierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Harnstoff, Guanidin und SARKOSYLTM besteht.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, das zudem die Schritte umfasst: (e) Binden einer mit Cystein reagierenden Einheit an das isolierte Protein des Schrittes (e), so dass ein Cystein-modifiziertes Protein erhalten wird.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, das die Schritte umfasst: Reduzieren des isolierten, rückgefalteten löslichen Proteins mit einem Disulfid-Reduktionsmittel und Aussetzen des Proteins einer mit Cystein reagierenden Einheit, so dass ein Cystein-modifiziertes Protein erhalten wird, wobei die mit Cystein reagierende Einheit an mindestens ein hinzugefügtes freies Cystein in dem isolierten rückgefalteten Protein gebunden wird.
  40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die mit Cystein reagierende Einheit ein mit Cystein reagierendes Polyethylenglykol, Dextran, Kohlenhydrat-Poly(N-vinylpyrrolidon), Peptid, Lipid oder Polysaccharid ist.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 40, wobei die mit Cystein reagierende Einheit ein Polyethylenglykol ist.
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Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1012184B1 (de) 1997-07-14 2007-10-10 Bolder Biotechnology, Inc. Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US7153943B2 (en) 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US7495087B2 (en) 1997-07-14 2009-02-24 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11
US7270809B2 (en) * 1997-07-14 2007-09-18 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine variants of alpha interferon-2
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6677433B2 (en) * 1999-01-27 2004-01-13 The Regents Of The University Of California Stabilization of hypoallergenic, hyperdigestible previously reduced proteins
KR100356140B1 (ko) * 1999-07-08 2002-10-19 한미약품공업 주식회사 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
IL152804A0 (en) * 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP1314739A1 (de) * 2001-11-22 2003-05-28 Bayer Ag Verfahren zur Renaturierung rekombinanter, Disulfid-enthaltender Proteine bei hohen Proteinkonzentrationen in Gegenwart von Aminen
CA2476589C (en) 2002-02-27 2014-02-25 Pharmain, Ltd. Compositions for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same
US7635463B2 (en) 2002-02-27 2009-12-22 Pharmain Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials
WO2003078461A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biopolymed Inc. Preparation of g-csf stoichiometrically conjugated with biocompatible polymers at cystein residue
DE60332358D1 (de) * 2002-09-09 2010-06-10 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
RS20050502A (en) 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency
KR101031206B1 (ko) † 2002-12-31 2011-04-27 넥타르 테라퓨틱스 말레암산 중합체 유도체 및 이의 바이오컨쥬게이트
EP1596887B1 (de) 2003-02-26 2022-03-23 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii-konjugate
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP1610825A2 (de) 2003-03-31 2006-01-04 Xencor, Inc. Verfahren zur rationellen pegylierung von proteinen
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
DE602004025799D1 (de) 2003-04-15 2010-04-15 Glaxosmithkline Llc Humane il-18 substitutionsmutanten und deren konjugate
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
AU2004279895A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc Protein based TNF-alpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP1694274B1 (de) * 2003-12-03 2013-04-24 BioGeneriX AG Glykopegylierter Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor
US20050170457A1 (en) * 2003-12-31 2005-08-04 Chadler Pool Novel recombinant proteins with N-terminal free thiol
EP1586334A1 (de) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF Konjugate mit PEG
MXPA06013412A (es) 2004-05-19 2007-01-23 Maxygen Inc Polipeptidos de interferon-alfa y conjugados.
EA010374B1 (ru) * 2004-07-16 2008-08-29 Микромет Аг Полипептиды с повышенной экспрессией
EP1768700B1 (de) * 2004-07-16 2010-12-15 Nektar Therapeutics Konjugate enthaltend gm-csf und ein polymer
AU2005277227B2 (en) 2004-08-19 2011-10-06 Biogen Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
DE102004041639A1 (de) 2004-08-27 2006-03-02 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktivem humanen G-CSF aus Inclusion Bodies
EP1814573B1 (de) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodellierung und glykopegylierung von fibroblasten-wachstumsfaktor (fgf)
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
US7678578B2 (en) * 2005-02-07 2010-03-16 Beckman Coulter, Inc. Cell permeabilization and stabilization reagent and method of use
EP1871795A4 (de) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glycosylierungsmutanten eines proteaseresistenten menschlichen wachstumshormons
CA2607651A1 (en) 2005-05-18 2007-04-19 Maxygen, Inc. Evolved interferon-alpha polypeptides
KR100694994B1 (ko) * 2005-06-13 2007-03-14 씨제이 주식회사 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
DE102005033250A1 (de) 2005-07-15 2007-01-18 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von G-CSF
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US20080032343A1 (en) 2005-12-22 2008-02-07 Genentech, Inc. Recombinant Production of Heparin Binding Proteins
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
DE202006020194U1 (de) 2006-03-01 2007-12-06 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
GB0605684D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Sicor Biotech Uab Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor
CN101045742B (zh) * 2006-03-27 2011-12-21 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 重组人粒细胞集落刺激因子的复性纯化工艺
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2029738A2 (de) * 2006-05-24 2009-03-04 Novo Nordisk Health Care AG Faktor-ix-analoge mit verlängerter in-vivo-halbwertszeit
RU2439076C2 (ru) 2006-07-14 2012-01-10 Дженентек, Инк. Способ выделения повторно свернутого рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток (варианты)
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008015239A2 (en) * 2006-08-01 2008-02-07 Pieris Ag Muteins of tear lipocalin and methods for obtaining the same
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
US8617531B2 (en) 2006-12-14 2013-12-31 Bolder Biotechnology, Inc. Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine
CN101219219B (zh) * 2007-01-10 2013-02-13 北京普罗吉生物科技发展有限公司 包含血管抑素或其片段的复合物、其制备方法及应用
AU2012203658B2 (en) * 2007-01-10 2014-05-08 Protgen Ltd. Complexes comprising angiostatin and its fragments, preparation preparing methods and uses thereof
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
CA2685686A1 (en) 2007-05-01 2008-11-13 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin polypeptides for use increasing vascularization in a tissue
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
PT2197919E (pt) 2007-08-27 2014-07-17 Ratiopharm Gmbh Formulação líquida de conjugado de g-csf
CA2702618A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Pain Therapeutics, Inc. Radiolabeled monoclonal antibodies, methods of preparation using tcep, and uses thereof
JP2011507913A (ja) * 2007-12-29 2011-03-10 バイオスティード ジーン エクスプレッション テック． カンパニー リミテッド Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用
EP3103880A1 (de) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modifizierte leptinpolypeptide und deren verwendungen
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
MX2010010021A (es) * 2008-03-12 2011-02-15 Imclone Llc Anticuepos anti-tyrp1.
EP2285402A2 (de) 2008-04-14 2011-02-23 Halozyme, Inc. Modifizierte hyaluronidasen und ihre verwendungen bei der behandlung von erkrankungen und zuständen im zusammenhang mit hyaluronan
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
DK3037529T3 (da) 2008-12-09 2019-05-20 Halozyme Inc Udvidede opløselige ph20-polypeptider og anvendelse deraf
SG176963A1 (en) 2009-06-22 2012-02-28 Amgen Inc Refolding proteins using a chemically controlled redox state
MX2011013417A (es) 2009-06-25 2012-03-29 Amgen Inc Procesos de purificacion por captura para proteinas expresadas en un sistema no mamifero.
JP5734985B2 (ja) 2009-09-17 2015-06-17 バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニムＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＡ ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤およびそれらの使用方法
CN103002918B (zh) 2010-01-22 2016-05-04 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 体内功效延长的生长激素
RU2012134974A (ru) * 2010-01-22 2014-02-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Стабилизированное соединение гормона роста
CN102892780B (zh) 2010-03-17 2015-07-29 通益制药有限公司 获得生物活性的重组人g-csf的方法
US9878046B2 (en) 2010-07-20 2018-01-30 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
WO2012064867A1 (en) * 2010-11-09 2012-05-18 Nektar Therapeutics Pharmacologically active polymer-g-csf conjugates
WO2012106463A2 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 Fate Therapeutics, Inc. Cardiotrophin related molecules for enhanced therapeutics
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
BR112013028271B1 (pt) 2011-05-05 2020-11-24 Wellstat Immuno Therapeutics, Llc Polipeptideo, acido nucleico, vetor viral, preparação farmaceutica, bem como uso dos mesmos no tratamento de doenqa mediada por complemento
US9320777B2 (en) 2011-05-13 2016-04-26 Bolder Biotechnology, Inc. Methods and use of growth hormone supergene family protein analogs for treatment of radiation exposure
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CN103889443A (zh) 2011-06-17 2014-06-25 哈洛齐梅公司 使用透明质酸降解酶的持续皮下胰岛素输注法
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
AU2012328880B2 (en) 2011-10-24 2017-02-23 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
IL298330A (en) 2011-12-30 2023-01-01 Halozyme Inc Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
HUP1200171A1 (hu) 2012-03-19 2013-09-30 Richter Gedeon Nyrt Módszerek polipeptidek elõállítására
HUP1200172A2 (en) * 2012-03-19 2013-10-28 Richter Gedeon Nyrt Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
EA031986B1 (ru) 2012-04-04 2019-03-29 Галозим, Инк. Способ и комбинация для лечения солидной раковой опухоли и набор, содержащий комбинацию
US9926344B2 (en) * 2012-08-31 2018-03-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Stabilised proteins for immunising against Staphylococcus aureus
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
JP6475630B2 (ja) * 2012-11-16 2019-02-27 イーベーアー ゲーエムベーハー ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法
EP2981282B1 (de) 2013-04-05 2020-11-04 Novo Nordisk Health Care AG Wachstumshormonverbindungsformulierung
US20160068583A1 (en) * 2013-04-24 2016-03-10 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-10 Compositions and Uses Thereof
WO2015000585A1 (en) 2013-07-02 2015-01-08 Walter Sebald Muteins of cytokines of the gamma-chain receptor family conjugated to a non-protein group
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
CN106068127B (zh) * 2013-12-13 2020-06-19 诺和诺德保健股份有限公司 蛋白质的硫醚缀合方法
CN103992400B (zh) * 2014-05-29 2017-01-04 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂 重组人血管内皮抑素的复性液及其制备、使用方法
US10457716B2 (en) 2014-08-06 2019-10-29 University Of Notre Dame Du Lac Protein folding and methods of using same
HUE043847T2 (hu) 2014-08-28 2019-09-30 Halozyme Inc Hialuronán-lebontó enzimmel és egy immun checkpoint inhibitorral végzett kombinációs terápia
EA201700181A1 (ru) 2014-10-14 2017-09-29 Галозим, Инк. Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования
US11229683B2 (en) 2015-09-18 2022-01-25 Bolder Biotechnology, Inc. Hematopoietic growth factor proteins and analogs thereof and angiotensin converting enzyme inhibitors for treatment of radiation exposure
US10781435B2 (en) 2017-06-22 2020-09-22 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (MTSP-1) polypeptides and methods of use
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
EP3902913A1 (de) 2018-12-28 2021-11-03 Catalyst Biosciences, Inc. Modifizierte urokinaseartige plasminogenaktivatorpolypeptide und verfahren zur verwendung
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
WO2021034727A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Applied Molecular Transport Inc. Compositions, formulations, and interleukin production and purification
US20230131808A1 (en) * 2020-04-22 2023-04-27 Southlake Pharmaceuticals, Inc. Pegylated interferon tau and compositions and methods thereof

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5582824A (en) 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US5096705A (en) 1981-10-19 1992-03-17 Genentech, Inc. Human immune interferon
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
MX9203641A (es) 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4677196A (en) 1985-09-06 1987-06-30 International Minerals & Chemical Corp. Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies
DE3537708A1 (de) 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
AU609824B2 (en) * 1987-06-15 1991-05-09 Southern Cross Biotech Pty Ltd. Production of proteins in active forms
JPH01132598A (ja) 1987-10-14 1989-05-25 Pitman Moore Inc 変性剤溶液中に含まれる組換え蛋白質における分子内ジスルフィド結合の生成を促進する方法
ATE198353T1 (de) * 1988-08-24 2001-01-15 American Cyanamid Co Stabilisierung von somatotropinen durch modifikation von cystein-resten durch orts- spezifische mutagenese oder chemische derivatisierung
US5223407A (en) 1988-08-31 1993-06-29 Allelix Inc. Excretion of heterologous proteins from e. coli
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DK0458064T3 (da) 1990-05-04 1998-04-27 American Cyanamid Co Stabilisering af somatotropiner ved modificering af cysteinrester
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
AU4665193A (en) * 1992-07-02 1994-01-31 Pitman-Moore, Inc. A process for recovering a recombinant protein, in biologically active form, from a solution containing inactive protein
EP0679095A1 (de) * 1992-11-25 1995-11-02 Amgen Boulder Inc. Modifizierte insulinartigen wachtstumfaktor
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
EP0756494A1 (de) * 1994-05-24 1997-02-05 Amgen Boulder Inc. Modifizierte insulinähnliche-wachstumsfaktore
DE19535853C2 (de) 1995-09-18 1999-04-01 Fraunhofer Ges Forschung Varianten des rekombinanten humanen Interferon-gamma, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DK1568772T3 (da) 1995-09-21 2010-10-18 Genentech Inc Varianter af humant væksthormon
JPH10234386A (ja) * 1996-12-26 1998-09-08 Takeda Chem Ind Ltd 成長ホルモン類の製造方法
EP1012184B1 (de) * 1997-07-14 2007-10-10 Bolder Biotechnology, Inc. Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
DE69907139T2 (de) 1998-01-12 2004-01-29 Searle & Co Verfahren zur angiostatinrückfaltung
US6653098B1 (en) 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
JP2004507201A (ja) * 1998-09-16 2004-03-11 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
BR122013003013B8 (pt) 1999-01-14 2021-07-06 Bolder Biotechnology Inc proteína isolada monopeguilada do hormônio do crescimento e método para sua obtenção
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
US6584764B2 (en) 2000-01-12 2003-07-01 Allison Advanced Development Company Propulsion module
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US20030138403A1 (en) 2001-06-29 2003-07-24 Maxygen Aps Interferon formulations
US6692264B2 (en) 2001-11-13 2004-02-17 General Motors Corporation Elastomeric connector for fuel cell stack cell voltage monitor
US8617531B2 (en) 2006-12-14 2013-12-31 Bolder Biotechnology, Inc. Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine

Also Published As

Publication number Publication date
ES2290142T3 (es) 2008-02-16
JP2004508014A (ja) 2004-03-18
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IL152804A0 (en) 2003-06-24
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AU2001274853C1 (en) 2001-11-26
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US20040018586A1 (en) 2004-01-29
CA2408851A1 (en) 2001-11-22
CN1318443C (zh) 2007-05-30
WO2001087925A3 (en) 2002-08-01
US20110189124A1 (en) 2011-08-04
IL152804A (en) 2010-11-30
WO2001087925A2 (en) 2001-11-22
CA2408851C (en) 2011-07-12
ATE367398T1 (de) 2007-08-15
US7306931B2 (en) 2007-12-11
AU2001274853B2 (en) 2007-03-22
US8932828B2 (en) 2015-01-13
JP2011173911A (ja) 2011-09-08
US20090269804A1 (en) 2009-10-29
DE60129432D1 (de) 2007-08-30
JP5517991B2 (ja) 2014-06-11

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Class et al. Patent application title: METHODS FOR MAKING PROTEINS CONTAINING FREE CYSTEINE RESIDUES Inventors: George N. Cox (Louisville, CO, US) George N. Cox (Louisville, CO, US) Daniel H. Doherty (Boulder, CO, US) Daniel H. Doherty (Boulder, CO, US) Mary S. Rosendahl (Broomfield, CO, US) Mary S. Rosendahl (Broomfield, CO, US) Assignees: BOLDER BIOTECHNOLOGY, INC.

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