JP2011173911A - 遊離システイン残基を含有するタンパク質をリフォールディングする方法 - Google Patents

遊離システイン残基を含有するタンパク質をリフォールディングする方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、遊離システインを有する不溶性または凝集性タンパク質を製造またはリフォールディングする新規な方法を提供する。
【解決手段】本発明は、遊離システインを有する不溶性または凝集性タンパク質を製造またはリフォールディングする方法は、タンパク質を発現する宿主細胞をシステイン・ブロッキング剤に暴露する方法に関する。そのような新規な方法により製造される可溶性でリフォールディングされたタンパク質は、修飾し、それらの有効性を高めることができる。そのような修飾には、ＰＥＧ部分を結合してＰＥＧ化タンパク質を作成することが含まれる。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的にはタンパク質を製造する方法、より具体的には少なくとも１個の「遊離」システイン残基、すなわちジスルフィド結合に関与していないシステイン残基を含有する組み換えタンパク質に関する。
（発明の背景）
タンパク質治療薬は、一般的に注射によって患者に投与しなければならない。大部分のタンパク質治療薬は身体から急速に消失するため、頻繁な注射、多くの場合毎日の注射を必要とする。タンパク質を頻繁に注射しなくてもよいように、体内におけるタンパク質治療薬の循環半減期を延長する方法の開発にはかなりの関心がある。ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）によるタンパク質の共有結合修飾は、体内におけるタンパク質治療薬の循環半減期を延長する有用な方法であることが分かっている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、１９８４；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、１９８７；Ｍｅｙｅｒｓ他、１９９１）。タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、タンパク質の有効サイズを増加させ、身体からのタンパク質のクリアランス速度を低下させる。ＰＥＧはいくつかのサイズのものが市販されており、異なるサイズのＰＥＧを用いることにより個々の適応症に応じてＰＥＧ修飾タンパク質の循環半減期を調整することができる。その他の立証されているＰＥＧ修飾のインビボにおける恩恵は、タンパク質の溶解性および安定性の増加、ならびにタンパク質の免疫原性の減少である（Ｋａｔｒｅ他、１９８７；Ｋａｔｒｅ、１９９０）。
タンパク質をＰＥＧ化する知られている方法の一つは、システイン反応性ＰＥＧを用いてシステイン残基にＰＥＧを共有結合させるものである。様々な反応性基（例えば、マレイミド、ビニルスルホン）および様々なサイズのＰＥＧ（２〜４０ｋＤａ、単鎖または分枝鎖）を有する多くの極めて特異的なシステイン反応性ＰＥＧが市販されている。中性ｐＨでは、これらのＰＥＧ試薬は、「遊離」システイン残基、すなわちジスルフィド結合に関与していないシステイン残基と選択的に結合する。大部分のタンパク質中のシステイン残基は、ジスルフィド結合に関与し、システイン反応性ＰＥＧを用いるＰＥＧ化には利用できない。組み換えＤＮＡ技術を用いたインビトロ変異誘発により、付加的システイン残基をタンパク質中のどこかに導入することができる。新たに付加された「遊離」すなわち「非天然」システインは、システイン反応性ＰＥＧを用いるＰＥＧ分子の特異的結合用の部位としての役割を果たす。付加された「遊離」すなわち「非天然」システイン残基を、タンパク質中の既存のアミノ酸と置換したり、成熟タンパク質のアミノ末端の前または成熟タンパク質のカルボキシ末端の後に付加したり、またはタンパク質中の２個の正常に隣接するアミノ酸の間に挿入したりすることができる。あるいは、天然のジスルフィド結合に関与する２個のシステインのうち１個を除去するか別のアミノ酸で置換し、天然のシステイン（タンパク質中の通常は除去または置換されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成すると考えられるシステイン残基）を遊離させるか化学修飾のために利用可能にしてもよい。システインと置換するアミノ酸は、セリンまたはアラニンなどの中性アミノ酸であることが好ましい。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、生理活性を損なうことなく還元およびヨードアセトアミドでアルキル化することができる２個のジスルフィド結合を有する（Ｂｅｗｌｅｙ他、１９６９）。４個の各システインは、除去または別のアミノ酸による置換にとって妥当な標的と思われる。
天然に存在するいくつかのタンパク質は、１個または複数の「遊離」システイン残基を含有することが知られている。天然に存在するこのようなタンパク質の例には、ヒト・イ
ンターロイキン（ＩＬ）−２（Ｗａｎｇ他、１９８４）、β−インターフェロン（Ｍａｒｋ他、１９８４；１９８５）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｌｕ他、１９８９）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９２）が含まれる。ＩＬ−２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびβ−インターフェロン（ＩＦＮ−β）は奇数個のシステイン残基を含有するが、塩基性線維芽細胞成長因子は偶数個のシステイン残基を含有する。
遊離システイン残基を含有する組み換えタンパク質の発現には、生理的条件下における遊離スルフヒドリルの反応性のために問題があった。遊離システインを含有するいくつかの組み換えタンパク質は、大腸菌などの細菌中、細胞質、すなわち細胞内タンパク質として発現されていた。その例には、ＩＬ−２、β−インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦなどの天然タンパク質、ならびにＩＬ−２（ＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ、１９９０）、ＩＬ−３（Ｓｈａｗ他、１９９２）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（Ｔｕｍａ他、１９９５）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ、ＣｏｘおよびＭｃＤｅｒｍｏｔｔ、１９９４）、インスリン様成長因子結合タンパク質−Ｉ（ＩＧＦＢＰ−Ｉ、Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇ他、１９９７）およびプロテアーゼ・ネキシンの改変システイン・ムテインならびに関連タンパク質（Ｂｒａｘｔｏｎ、１９９８）が含まれる。これらのタンパク質はすべて、大腸菌の細胞内で発現された場合には大部分が不溶性であった。不溶性タンパク質はおおむね不活性であり、有意な生物活性を取り戻すためにはリフォールディングされる必要があった。一部の例では、不溶性タンパク質の可溶化および／またはリフォールディングを助けるために還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が用いられた。精製され、リフォールディングされたＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびβ−インターフェロンタンパク質は、おそらく遊離システイン残基が関与するジスルフィド転位のために不安定であり、生理的ｐＨで活性を失う（Ｗａｎｇ他、１９８４；Ｍａｒｋ他、１９８４；１９８５；Ｏｈ−ｅｄａ他、１９９０；Ａｒａｋａｗａ他、１９９２）。これらのタンパク質中の遊離システイン残基をセリンで置換すると、生理的ｐＨでより安定なタンパク質が得られる（Ｗａｎｇ他、１９８４；Ｍａｒｋ他、１９８４；１９８５；Ａｒａｋａｗａ他、１９９３）。
細菌中で組み換えタンパク質を発現させるための知られている第二の方法は、周辺質空間または培地中にタンパク質を分泌させることである。ＧＨなどのある種の組み換えタンパク質は、大腸菌の周辺質中に分泌される場合には可溶性の活性な形で発現されるが、大腸菌の細胞内で発現される場合には不溶性であることが知られている。分泌は、ＧＨまたは他の問題のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ｓｔＩＩ（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ他、１９８８）およびｏｍｐＡタンパク質（Ｇｈｒａｙｅｂ他、１９８４）に由来する細菌のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列に融合することによって行われる。細菌中の組み換えタンパク質の分泌が望ましいのは、組み換えタンパク質の天然Ｎ末端が保持できるからである。組み換えタンパク質の細胞内発現には、Ｎ末端メチオニンが組み換えタンパク質のアミノ末端に存在することが必要である。メチオニンは通常、多くの成熟型ヒトタンパク質のアミノ末端には存在しない。例えば、成熟型のヒトＧＨのアミノ末端アミノ酸はフェニルアラニンである。メチオニンがこの位置に存在しない場合には、細菌中で効率良くタンパク質を発現させるために組み換えタンパク質のアミノ末端にアミノ末端メチオニンを付加しなければならない。通常、アミノ末端メチオニンの付加は、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列の前にＡＴＧというメチオニン・コドンを付加することによって行われる。付加されたＮ末端メチオニンは、組み換えタンパク質が不溶性の場合は特に、組み換えタンパク質から除去されないことが多い。ｈＧＨがこのような例であり、タンパク質が大腸菌の細胞内で発現された場合にＮ末端メチオニンは除去されない。付加されたＮ末端メチオニンは、ヒトにおいて免疫応答を強力に促進することができる「非天然」タンパク質を生み出す。対照的に、ｓｔＩＩ（Ｃｈａｎｇ他、１９８７）またはｏｍｐＡ（Ｃｈｅａｈ他、１９９４）シグナル配列を用いて周辺質空間中に分泌されるｈＧＨ上には付加されたメチオニンはなく、組み換えタンパク質は、天然のアミノ末端アミノ酸であるフ
ェニルアラニンで始まる。天然のｈＧＨタンパク質配列が維持されるのは、ｓｔＩＩ（またはｏｍｐＡ）シグナル配列と成熟ｈＧＨタンパク質の出発点との間で細菌の酵素がｓｔＩＩ−ｈＧＨタンパク質（またはｏｍｐＡ−ｈＧＨタンパク質）を切断するためである。
ｈＧＨは、２個のジスルフィドを形成する４個のシステインを有する。ｈＧＨは、ｓｔＩＩまたはｏｍｐＡシグナル配列を用いて大腸菌周辺質に分泌させることができる。分泌タンパク質は可溶性で生物学的に活性である（Ｈｓｉｕｎｇ他、１９８６）。過半の分泌型ｈＧＨは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による見かけの分子量が２２ｋＤａである単量体である。組み換えｈＧＨは、浸透圧衝撃手順を用いることにより周辺質空間から単離することができ（ＫｏｓｈｌａｎｄおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、１９８０）、この手順は細胞内ではなく周辺質タンパク質を浸透圧衝撃緩衝液中に優先的に放出する。次いで、放出されたｈＧＨタンパク質をカラム・クロマトグラフィにより精製する（Ｈｓｉｕｎｇ他、１９８６）。多数のＧＨ変異体が大腸菌周辺質中に分泌されている。分泌した変異体タンパク質は可溶性であり、野生型ＧＨを精製するのに用いられる手順と類似した手順を用いて精製することができると考えられる。（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、１９８９；Ｆｕｈ他、１９９２）。意外にも、同様の手順を用いて遊離システイン残基（５個のシステイン；２Ｎ＋１）を含有するＧＨ変異体を分泌させると、ＧＨ用に開発された標準的浸透圧衝撃および精製手順を用いて単離した場合には、ある種の組み換えＧＨ変異体は不溶性であるか多量体または凝集体を形成することが発見された。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、浸透圧衝撃溶解物中では単量体ＧＨ変異体タンパク質がほとんど検出されなかった。不溶性または凝集性ＧＨ変異体は、可溶性で適切に折り畳まれたｈＧＨに比べて生物活性が低下していた。遊離システイン残基を含有する不溶性の分泌成長ホルモン変異体を生物活性の形にリフォールディングする方法が記載されたことは未だない。
α−インターフェロン（ＩＦＮ−α２）もまた、２個のジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を含有する。ＩＦＮ−α２は、ｓｔＩＩシグナル配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌させることができる（Ｖｏｓｓ他、１９９４）。分泌タンパク質の一部は可溶性で生物学的に活性である（Ｖｏｓｓ他、１９９４）。分泌された可溶性の組み換えＩＦＮ−α２はカラム・クロマトグラフィによって精製できる（Ｖｏｓｓ他、１９９４）。同様の手順を試みて遊離システイン残基（５個のシステイン；２Ｎ＋１）を含有するＩＦＮ−α２変異体を分泌させると、ＩＦＮ−α２用に開発された標準的精製手順を用いて単離した場合には、ある種の組み換えＩＦＮ−α２変異体はその大部分が不溶性であるか多量体または凝集体を形成することが発見された。不溶性または凝集性ＩＦＮ−α２変異体は、可溶性で適切に折り畳まれたＩＦＮ−α２に比べて生物活性が低下していた。遊離システイン残基を含有する不溶性の分泌ＩＦＮ−α２変異体を生物活性の形にリフォールディングする方法が記載されたことは未だない。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、２個のジスルフィド結合を形成する５個のシステイン残基を含有する。成熟タンパク質配列中の１７位にあるシステイン残基は遊離している。Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ他（１９９５）は、異型のｏｍｐＡシグナル配列を用いて大腸菌周辺質中にＧ−ＣＳＦを分泌させることができると報告した。しかしながら、正確にプロセシングされて成熟Ｇ−ＣＳＦが得られるｏｍｐＡ−Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質は極めてわずかであった。正確にプロセシングされたＧ−ＣＳＦの割合は、ｏｍｐＡ−Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質を発現する宿主細胞中で大腸菌のｄｎａＫおよびｄｎａＪタンパク質を同時発現することにより改良されると考えられる（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ他、１９９５）。正確にプロセシングされた分泌Ｇ−ＣＳＦは、すべての被験大腸菌株で大部分が不溶性であった（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ他、１９９５）。不溶性Ｇ−ＣＳＦは、可溶性で適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦに比べて生物活性が低下していた。同様の手順を試みて野生型Ｇ−ＣＳＦ、遊離システイン残基がセリンで置換されたＧ−ＣＳＦ変異体
［Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）］、およびｓｔＩＩシグナル配列を用いた遊離システイン残基（５個のシステイン；２Ｎ＋１）を含有するＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を分泌させた場合には、組み換えＧ−ＣＳＦタンパク質もその大部分が不溶性であることが発見された。不溶性の分泌Ｇ−ＣＳＦタンパク質を生物活性の形にリフォールディングする方法が記載されたことは未だない。
ヒト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、２個のジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を含有する。Ｌｉｂｂｅｙ他（１９８７）およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ他（１９８８）は、ｏｍｐＡシグナル配列を用いて大腸菌周辺質中にＧＭ−ＣＳＦを分泌できることを報告した。正確にプロセシングされた分泌ＧＭ−ＣＳＦは不溶性であった（Ｌｉｂｂｅｙ他、１９８７；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他、１９８８）。不溶性ＧＭ−ＣＳＦは、可溶性で適切に折り畳まれたＧＭ−ＣＳＦに比べて生物活性が低下していた。同様の手順を試みて、ｓｔＩＩシグナル配列を用いる遊離システイン残基（５個のシステイン；２Ｎ＋１）を含有するＧＭ−ＣＳＦ変異体を分泌させた場合には、組み換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質もその大部分が不溶性であることが発見された。不溶性の分泌ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を生物活性の形にリフォールディングする方法が記載されたことは未だない。
米国特許第５，２０６，３４４号およびＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ（１９９０）は、ＩＬ−２のシステイン置換ムテインの発現および精製について記載している。ＩＬ−２システイン・ムテインは、大腸菌で細胞内に発現された場合には不溶性であった。このタンパク質は、変性剤［１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）あるいは８Ｍ尿素］および還元剤［１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）］で処理することにより可溶化され、リフォールディングされ、サイズ排除クロマトグラフィおよび逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＩＬ−３のシステイン・ムテインの発現および精製は、米国特許第５，１６６，３２２号に記載されている。ＩＬ−３システイン・ムテインも、大腸菌で細胞内に発現された場合には不溶性であった。このタンパク質は変性剤（グアニジン）および還元剤（ＤＴＴ）で可溶化され、リフォールディングされ、逆相ＨＰＬＣにより精製された。精製ＩＬ−３システイン・ムテインは、保存緩衝液中にＤＴＴを含めることにより部分的な還元状態に保たれた。発明者らが、ＧＨおよびＧ−ＣＳＦの不溶性システイン・ムテインを変性およびリフォールディングするために変性剤および還元剤（ＤＴＴ）のみを使用した場合には、リフォールディングされたタンパク質は不均一で、複数の分子量分子種を含むことが発見された。同様に、発明者らが変性剤および還元剤（ＤＴＴ）のみで不溶性の分泌ＩＦＮ−α２システイン・ムテインを変性およびリフォールディングした場合には、検出不可能なレベルの適切に折り畳まれたＩＦＮ−α２システイン・ムテインが得られた。
Ｍａｌｉｋ他（１９９２）およびＫｎｕｓｌｉ他（１９９２）は、アミン反応性ＰＥＧ試薬と野生型ＧＭ−ＣＳＦの抱合について記載した。アミンＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦは、複数のアミノ酸残基において修飾された様々な分子量のＰＥＧ−ＧＭ−ＣＳＦ分子種の不均一な混合物を含んでいた（Ｍａｌｉｋ他、１９９２；Ｋｎｕｓｌｉ他、１９９２）。様々なアミンＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦ分子種は、従来のクロマトグラフィ法によってお互いにまたは非ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦから精製できず、このことが様々なアイソフォームの特異的活性測定を行うことを妨げた。Ｃｌａｒｋ他（１９９６）は、ＧＨとアミン反応性ＰＥＧとの抱合について記載した。アミンＰＥＧ化ＧＨもまた不均一で、複数のアミノ酸残基において修飾された複数の分子量分子種の混合物を含んでいた。アミンＰＥＧ化ＧＨタンパク質は、著しく低下した生物活性を示した（Ｃｌａｒｋ他、１９９６）。Ｍｏｎｋａｒｓｈ他（１９９７）は、アミンＰＥＧ化α−インターフェロンについて記載したが、これもまた複数のアミノ酸残基において修飾された複数の分子量分子種を含んでいた。アミンＰＥＧ化α−インターフェロンもまた、低下した生物活性を示した。Ｔａｎａｋａ他（１９９１）は、アミンＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦについて記載したが、これもまた様々なアミノ酸残
基において修飾された様々な分子量分子種の不均一な混合物を含んでいた。アミンＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、低下した生物活性を示した（Ｔａｎａｋａ他、１９９１）。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（１９９６）は、非天然Ｎ末端メチオニン残基で優先的に修飾されたＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦタンパク質について記載した。このタンパク質もまた、低下した生物活性を示した（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他、１９９６）。
したがって、多大な努力にもかかわらず、１個または複数の遊離システイン残基を含有する不溶性または凝集性タンパク質を、高収率で可溶性の生物学的に活性な形にリフォールディングさせる方法に対する要求が依然として存在する。本発明はこの要求を満たし、さらに関連する利点を提供する。同様に、ＰＥＧ化によるなどのタンパク質分子量を増すことによる持続性組み換えタンパク質の均一調製物の製造方法に対する要求も存在する。
（発明の概要）
本発明は一般的に、１個または複数の遊離システイン残基を有し、不溶性または凝集性の形で宿主細胞により発現される、タンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を得るための方法に関する。このようなタンパク質には、ＧＨなどの成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、ＩＦＮ−α、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦタンパク質、ならびにエンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されるものではない。この方法は一般的に、（ａ）遊離システイン残基を含有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること；（ｂ）細胞を溶解すること；（ｃ）変性剤、還元剤およびシステイン・ブロッキング剤の存在下で不溶性または凝集性タンパク質を可溶化すること；および（ｄ）変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることによりタンパク質をリフォールディングすることによって行われる。場合によっては、可溶性のリフォールディングされたタンパク質は、リフォールディングされた混合物中の他のタンパク質から単離される。
適当な宿主細胞には、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞が含まれる。宿主細胞は、細菌細胞、特に大腸菌であることが好ましい。
本発明の方法によって製造された可溶性のリフォールディングされたタンパク質は、組み換えタンパク質、特にタンパク質のシステイン変異体またはシステイン・ムテインであることが好ましい。本明細書では、用語「システイン変異体」および「システイン・ムテイン」は、タンパク質のアミノ酸配列に以下の変化、成熟タンパク質のアミノ末端の前または成熟タンパク質のカルボキシ末端の後への非天然システイン残基の付加；タンパク質中の既存のアミノ酸の非天然システイン残基による置換；タンパク質中の２個の正常に隣接するアミノ酸間への非天然システイン残基の導入；またはタンパク質中で通常はジスルフィド結合を形成する天然に存在するシステイン残基の別のアミノ酸による置換のいずれかを含むことを意味する。この方法は、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロン、特にα−インターフェロン、これらのタンパク質のシステイン変異体、それらの誘導体または拮抗薬を含むがこれらに限定されないタンパク質を製造するのに有用である。この方法が有用である他のタンパク質には、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバー、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β−スーパーファミリー、血小板由来成長因子−Ａ、血小板由来成長因子−Ｂ、神経成長因子、脳由来の神経向性因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、血管内皮成長因子、ケモカイン、ホルモン、エンドスタチン、アンジオスタチン、これらのタンパク質のシステイン・ムテイン、またはその誘導体もしくはその拮抗薬が含まれる。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のシ
ステイン・ムテインまたはその誘導体も想定されている。
本明細書では、用語「システイン・ブロッキング剤」は、タンパク質中で可逆的にブロックされた遊離システイン残基の形成をもたらすすべての試薬または試薬の組合せを意味する。有用なシステイン・ブロッキング剤の例には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸などのジチオール、またはシステイン、システアミン、チオグリコール酸、および還元型グルタチオンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。チオールは、酸化剤の存在下に用いることが好ましい。有用な酸化剤には、酸素、ヨウ素、フェリシアン化物、過酸化水素、ジヒドロアスコルビン酸、テトラチオン酸塩（ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ）、およびＯ−ヨードソ安息香酸が含まれる。場合によっては、銅（Ｃｕ＋＋）またはコバルト（Ｃｏ＋＋）などの金属イオンを加えて酸化反応を触媒することができる。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、発明者らは、システイン・ブロッキング剤がタンパク質中の遊離システイン残基と混合ジスルフィドを形成し、それによって遊離システイン残基が関与して起こる可能性のあるジスルフィド転位を制限すると仮定している。混合ジスルフィドは遊離システイン残基を安定化し、適切に折り畳まれた生物学的に活性な可溶性タンパク質の収率を著しく向上させる。本明細書でＤＴＴおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤をシステイン・ブロッキング剤として見なさないのは、それらがタンパク質中の遊離システイン残基との可逆的にブロックされた混合ジスルフィドの形成をもたらさないからである。ＤＴＴは通常、酸化によって生成する熱力学的に好ましい分子内結合のために、タンパク質中のシステイン残基とは混合ジスルフィドを形成しない。
遊離システイン残基を介して２個以上のリフォールディングされたタンパク質の共有結合によって形成される高次の二量体および多量体タンパク質も本発明の範囲内にある。
本方法にはさらに、リフォールディングされたタンパク質にシステイン反応性部分を結合させ、遊離のシステイン残基を介してリフォールディングされたタンパク質にシステイン反応性部分が結合している修飾タンパク質を生成する様々な方法が含まれる。リフォールディングされたタンパク質と結合することができる有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性ＰＥＧであり、これを用いてＰＥＧ化タンパク質を生成することができる。このような方法には、（ａ）リフォールド混合物中の他のタンパク質から遊離システイン残基を有するリフォールディングされたタンパク質を単離すること、（ｂ）単離したリフォールディングされたタンパク質をジスルフィド還元剤で少なくとも部分的に還元すること、および（ｃ）そのタンパク質をシステイン反応性ＰＥＧなどのシステイン反応性部分に暴露することが含まれる。場合によっては、修飾タンパク質を非修飾タンパク質から単離することができる。他の有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性デキストラン、システイン反応性炭水化物、システイン反応性ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、システイン反応性ペプチド、システイン反応性脂質、およびシステイン反応性多糖類である。
本発明にはさらに、本明細書中に開示された方法により製造されるＰＥＧ化タンパク質を含む、可溶性のリフォールディングされたタンパク質およびそれらの誘導体が含まれる。このようなＰＥＧ化タンパク質には、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびα−インターフェロンタンパク質のモノＰＥＧ化、システイン変異体が含まれる。このようなＰＥＧ化タンパク質には、２個以上のＰＥＧ分子で修飾され、少なくとも１個のＰＥＧ分子が遊離システイン残基を介してタンパク質と結合しているＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびα−インターフェロンタンパク質のシステイン変異体も含まれる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも１個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるＧＨ、ＩＦＮ−α２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製する方法を提供する。本発明を用いて、少なくとも１個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるＧＨスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバーのリフォールディングされた可溶性の形を調製することができる。本発明を用いて、少なくとも１個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現される、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生タンパク質を含むがそれらに限定されない他のタイプのタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製することもできる。本発明はさらに、新規タンパク質、特にこれらの新規方法によって製造される組み換えタンパク質ならびにこのような組み換えタンパク質の誘導体を提供する。このようなタンパク質を調製するための新規な方法は一般的に、
（ａ）遊離システインを有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること；
（ｂ）化学的、酵素的または物理的手段により、宿主細胞を溶解すること；
（ｃ）変性剤、還元剤およびシステイン・ブロッキング剤に不溶性または凝集性タンパク質を暴露することによって、そのタンパク質を可溶化すること；および
（ｄ）可溶化混合物中の変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることにより、タンパク質をリフォールディングすることによって行われる。
任意選択で、リフォールディングされた可溶性のタンパク質は、リフォールド混合物中の他のタンパク質から単離することができる。本発明の方法および他の実施形態は、２０００年５月１６日出願の米国仮出願番号６０／２０４，６１７で詳細に記載されていた。米国仮出願番号６０／２０４，６１７の全体を引用により本明細書に組み込む。
上述のように、上記方法の第一ステップは、遊離システイン残基を含有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させることである。適当な宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。組み換えタンパク質を発現させるのに用いることができる適当な宿主細胞の例には、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞が含まれる。細菌細胞は具体的に、大腸菌が特に有用である。宿主細胞にタンパク質を発現させる方法は当技術分野で良く知られており、諸例を本明細書中に示す。
本明細書では、用語「遊離システイン残基を有するタンパク質」は、２Ｎ＋１個のシステイン残基を含有し、Ｎが０またはどのような整数でもよい天然または組み換えタンパク質またはペプチド、および２Ｎ個のシステインを含有し、２個以上のシステインが通常はジスルフィド結合に関与していない天然または組み換えタンパク質またはペプチドを意味する。したがって、本発明の方法は、遊離のシステインを有するタンパク質またはペプチド、具体的には１個または複数の遊離システインを有するシステイン付加変異体組み換えタンパク質（本明細書では「システイン・ムテイン」または「システイン変異体」と呼ぶ）の発現、回収および精製を促進するのに有用である。天然宿主細胞によって発現される遊離システインを有する天然タンパク質の発現、回収および精製も、本発明の方法によって促進できるが、本明細書中の説明は主に、例示の目的でのみ組み換えタンパク質に言及する。さらに、タンパク質は、ヒト、コンパニオン・アニマルおよび家畜を含むいかなる動物種からも誘導することができる。タンパク質はまた、植物種または微生物からも誘導することができる。
したがって、本発明は多種多様の組み換えタンパク質、およびこれらのタンパク質のシ
ステイン変異体を包含する。これらのタンパク質には、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、およびこれらのタンパク質のシステイン変異体が含まれる。以下のタンパク質（「まとめてＧＨスーパー遺伝子ファミリーと呼ぶ」）がＧＨスーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされる（Ｂａｚａｎ（１９９０；１９９１；１９９２）；ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）；ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎ他（１９９０）；Ｈａｎｎｕｍ他（１９９４）；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ他、２００１）：ＧＨ、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−ＴＩＦ、ＭＤＡ−７、ＡＫ−１５５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、幹細胞刺激因子およびｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド。将来的には遺伝子クローニングおよびシークエンシングによりＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーがさらに同定されることが予想される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般的にはアミノ酸またはＤＮＡ配列の同一性が限られているかかわらず類似した二次および三次構造を有している。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの共有する構造的特徴はＢａｚａｎ（１９９０；１９９１；１９９２）、ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）およびＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ（１９９６）に記載されており、遺伝子ファミリーの新しいメンバーの同定を容易にしている。Ｓｈａｎａｆｅｌｔ他（２０００）によって記載された選択的ＩＬ−２拮抗薬などのこれらのタンパク質の変異体も本発明に包含される。
本発明はまた、ＴＧＦ−β−スーパーファミリーのメンバーを含む追加の組み換えタンパク質の発現、回収および精製を促進することができる。ＴＧＦ−β−スーパーファミリーのメンバーには、グリア細胞由来の神経成長因子（ＧＤＮＦ）、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、インヒビンＡ、インヒビンＢ、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、インヒビンα、ミューラー阻害物質（ＭＩＳ）、およびＯＰ−１（骨形成タンパク質１）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの単量体サブユニットは、このファミリーの他のメンバーを容易に同定できるようにするある種の構造的特徴を共有しており、一般的に４個の分子内スルフィドを形成する８個の高度に保存されたシステイン残基を含有する。通常は、９番目の保存システインは、タンパク質の単量体では遊離しているが、単量体サブユニットのホモ二量体化またはヘテロ二量体化に形成される分子間ジスルフィド結合に関与する。ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの他のメンバーは、引用により本明細書に組み込むＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）、Ｄａｏｐｉｎ他（１９９２）、Ｋｉｎｇｓｌｅｙ（１９９４）、Ｋｕｔｔｙ他（１９９８）、およびＬａｗｔｏｎ他（１９９７）によって記載されている。
免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および軽鎖単量体もまた、分子内ジスルフィドに関与するシステイン残基ならびに遊離システインを含有する（Ｒｏｉｔｔ他、１９８９およびＰａｕｌ、１９８９）。これらの遊離システインは通常、重鎖ホモ二量体化、重鎖−軽鎖ヘテロ二量体化、（重鎖−軽鎖）ヘテロ二量体のホモ二量体化などの多量体化、およびＩｇＭの場合には（重鎖−軽鎖）ヘテロ二量体の五量体化などの他の高次の集合の結果としてジスルフィド結合に関与するに過ぎない。したがって、本発明の方法を用い、ヒト免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ならびにこれらのタンパク質のシステイン変異体またはそのフラグメントなどの重鎖および／または軽鎖（またはその様々な領域）の発現
、回収および精製を促進することができる。他の種に由来する免疫グロブリンも同様に、発現、回収および精製することができる。ＣｈａｍｏｗおよびＡｓｈｋｅｎａｚｉ（１９９６）に記載されているように、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン領域と遺伝的に融合したタンパク質も同様に、発現、回収および精製することができる。
タンパク質のグループは、「シスチンノット」と呼ばれる共有構造的モチーフに基づいて構造上のスーパーファミリーとして分類されてきた。シスチンノットは、位相的に「結ばれた」３個の分子内ジスルフィド結合を形成する６個の保存システイン残基によって定義される（ＭｃＤｏｎａｌｄおよびＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３）。これらのタンパク質はまた、ホモまたはヘテロ二量体を形成し、すべてではないが一部の例では、二量体化が分子間ジスルフィド形成を含んでいる。このファミリーのメンバーには、ＴＧＦ−β−スーパーファミリーのメンバー、および血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの他のタンパク質が含まれる。システイン・ブロッキング剤もまた、この構造モチーフを有するタンパク質、およびこれらのタンパク質のシステイン付加変異体の発現、回収および精製を促進すると考えられる。
本発明はまた、他の組み換えタンパク質および／またはそれらのタンパク質のシステイン付加変異体の発現、回収および精製を促進することができる。本発明が有用であると思われるタンパク質の種類には、プロテアーゼおよび他の酵素、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、サイトカイン拮抗薬、サイトカイン「選択的作動薬」、アレルゲン、ケモカイン、ゴナドトロフィン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）、ケモタクチン、脂質結合タンパク質、下垂体ホルモン、増殖因子、ソマトメジン、免疫グロブリン、インターロイキン、インターフェロン、可溶性受容体、細胞表面受容体の細胞外領域、ワクチン、単鎖抗体およびヘモグロビンが含まれる。タンパク質の具体的な例には、例えばレプチン、インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、線維芽細胞増殖因子、アルギナーゼ、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、インターロイキン１受容体拮抗薬、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン放出因子、カルシトニン、ＶＥＧＦ受容体の細胞外領域、プロテアーゼ・ネキシンおよびアンチトロンビンＩＩＩが含まれる。
ＰＥＧ化による恩恵を受け、したがってシステイン付加修飾に適当な候補と思われる他のタンパク質変異体には、溶解性が不十分か凝集する傾向のあるタンパク質もしくはペプチド、タンパク質分解を受けやすいタンパク質もしくはペプチド、機械的安定性を改善する必要があるタンパク質もしくはペプチド、身体から急速に消失するタンパク質もしくはペプチド、または望ましくない免疫原性もしくは抗原性（ａｎｔｉｇｅｎｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｔｙ）を有するタンパク質もしくはペプチドが含まれる。
所望の場合には、これらのタンパク質のシステインまたは他のアミノ酸ムテインを一般的に、以下の実施例およびそれぞれの全体を引用により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されているように、部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発を用いて構築することができる。ＰＣＲをベースとするＰＣＲ手順を用いてムテインを構築する方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ａ．（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪおよびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｉｎｎｉｓ、Ｍ．Ａ．他（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡに一般論として記載されている。
当技術分野で知られている方法を用い、例えば以下の実施例に記載する方法のように、細胞の起源に応じて細胞質中でタンパク質の発現を誘発し、またはタンパク質の分泌を誘導することができる。多種多様のシグナルペプチドを用いて、タンパク質を大腸菌の周辺質空間まで運ぶことに成功してきた。これらの例には、ｏｍｐＡ、ｓｔＩＩ、ＰｈｏＡシグナル（Ｄｅｎｅｆｌｅ他、１９８９）、ＯｍｐＴ（Ｊｏｈｎｓｏｎ他、１９９６）、ＬａｍＢおよびＯｍｇＦ（ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｒｉｇｈｔ、１９８５）、ベータ−ラクタマーゼ（Ｋａｄｏｎａｇａ他、１９８４）、エンテロトキシンＬＴ−Ａ、ＬＴ−Ｂ（Ｍｏｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏ他、１９９１）、および黄色ブドウ球菌由来のタンパク質Ａ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ他、１９８６）などの原核生物のシグナル配列が含まれる。ある種のタンパク質の分泌を容易にする多くの非天然、合成シグナル配列も当業者には知られている。
次に、宿主細胞を溶解する。細胞溶解は、以下に述べる可溶化手順の前、または同時に行うことができる。細胞溶解は、例えばフレンチ圧力セルなどの機械的せん断、酵素消化、音波処理、均質化、ガラス・ビーズ・ボルテックス、界面活性剤処理、有機溶媒、凍結解凍、アルミナまたは砂による粉砕、以下に定義する変性剤による処理などによって行うことができる（Ｂｏｌｌａｇ他、１９９６）。任意選択で、変性剤、ジスルフィド還元剤、またはシステイン・ブロッキング剤の存在下で細胞を溶解することができる。任意選択で、不溶性または凝集性材料を、遠心分離、濾過（限外濾過を含む）、沈殿反応、凝集（ｆｌｏｃｕｌａｔｉｏｎ）、または沈降などの様々な方法によって可溶性タンパク質から分離することができる。
次に、不溶性または凝集性材料（または事前に溶解しない細胞全体）を変性剤、およびシステイン・ブロッキング剤でもあるジスルフィド還元剤に暴露することにより不溶性または凝集性材料（または事前に溶解しない細胞全体）を可溶性または単量体にする。有用な変性剤には、尿素、グアンジン（ｇｕａｎｄｉｎｅ）、アルギニン、チオシアン酸ナトリウム、極端なｐＨ（希酸または希塩基）、界面活性剤（ＳＤＳ、サルコシル）、塩（塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、セチルメチルアンモニウム塩、トリクロロ酢酸塩）、化学的誘導体化（亜硫酸分解、シトラコン酸無水物との反応）、溶媒（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールまたは他のアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ）、またはＱ−セファロースなどの強陰イオン交換樹脂が含まれる。尿素の有用な濃度は１〜８Ｍであり、５〜８Ｍが好ましい濃度である。グアニジンの有用な濃度は１〜８Ｍであり、４〜８Ｍが好ましい濃度である。システイン・ブロッキング剤でもある有用なジスルフィド還元剤には、システイン、チオグリコール酸、還元型グルタチオンおよびシステアミンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は０．５〜２００ｍＭの範囲で用いることができ、１〜５０ｍＭが好ましい濃度である。システイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸およびシステアミンが好ましい還元剤であるのは、それらがシステイン・ブロッキング剤でもあるため、すなわちタンパク質中の遊離システイン残基と反応して可逆的にブロックされた遊離システイン残基を生成するためである。可溶化ステップ中にシステイン・ブロッキング剤でもあるジスルフィド還元剤を使用すると、不溶性または凝集性タンパク質を可溶性の活性型にリフォールディングする全過程に必要な化合物数およびステップ数が減少する。さらに、システイン・ブロッキング剤を使用すると、後述する様々なシステイン反応性部分および手順を用いる遊離システイン残基における誘導体化に適したリフォールディングされたタンパク質の形が得られる。変性／還元混合物のｐＨはｐＨ６とｐＨ１０の間であることが好ましい。
手順中の次のステップは、タンパク質をリフォールディングしてタンパク質の天然の立
体配置および天然のジスルフィド結合を得ることである。リフォールディングは、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで変性剤および還元剤の濃度を低下させることにより行われる。これは、透析、希釈、ゲル濾過、タンパク質の沈殿を介して、または樹脂上への固定化と続く緩衝液洗浄によって行うことができる。このステップの条件は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の再生が行えるように選択する。これは、ジスルフィド交換反応を触媒するために、酸化剤、または酸化剤と還元剤の酸化還元混合物を添加することによって行うことができる。天然のジスルフィド結合形成および可逆的にブロックされた遊離システイン残基をもたらす試薬または試薬の組合せが選択される、すなわち試薬および試薬の組合せがシステイン・ブロッキング剤としての役割を果たすことが好ましい。有用な酸化剤の例には、酸素、シスチン、酸化型グルタチオン、シスタミン、およびジチオグリコール酸が含まれる。有用な酸化還元混合物の例には、システイン／酸素、システイン／シスチン、システイン／シスタミン、システアミン／シスタミン、還元型グルタチオン／酸化型グルタチオンなどが含まれる。任意選択で、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールなどの還元剤をリフォールド混合物に添加し、ジスルフィド交換を促進することができる。任意選択で、銅（Ｃｕ＋＋）またはコバルト（Ｃｏ＋＋）などの金属イオンをリフォールド混合物に添加し、タンパク質酸化を促進することができる。リフォールド混合物中の金属イオンの有用な濃度は１μＭから１ｍＭであり、４０μＭが好ましい濃度である。リフォールド混合物のｐＨはｐＨ６とｐＨ１０の間であることが好ましい。
あるいは、変性剤、およびシステイン・ブロッキング剤であってもなくてもよいジスルフィド還元剤を用いることにより、不溶性または凝集性材料（または前もって溶解しない細胞全体）を可溶性または単量体にする。有用な変性剤には上述の変性剤が含まれるが、それらに限定されるものではない。有用なジスルフィド還元剤の例には、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウム、三級ホスフィンならびにシステイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸およびシステアミンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＤＴＴおよび２−メルカプトエタノールは０．５〜２００ｍＭの範囲で用いることができ、１〜５０ｍＭが好ましい濃度である。次いで、変性および還元されたタンパク質を、還元された場合にシステイン・ブロッキング剤としての役割を果たすモル過剰（還元剤の濃度に対して）のジチオール試薬と混ぜる。還元された場合にシステイン・ブロッキング剤としての役割を果たす有用なジチオール試薬には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸（Ｅｌｌｍａｎ′ｓ試薬））、ピリジンジスルフィドなどのジスルフィド結合を含む化合物、Ｒが有機化合物であるタイプＲ−Ｓ−Ｓ−ＣＯ−ＯＣＨ３の化合物、ジホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシスチン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチン、ジチオジプロピオン酸、ジメチルシスチンなどのシスチンの他の誘導体、またはジスルフィド交換反応を受けることができるいずれのジチオールもしくは化学薬品も含まれる。タンパク質のリフォールディングは、変性剤の濃度を低下させ（後述の方法を用い）、システイン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、チオグリコール酸または他のチオールなどの還元剤を添加することによってジスルフィド交換を促進することによって開始させる。天然のジスルフィド結合形成および可逆的にブロックされた遊離システイン残基をもたらす試薬および試薬の組合せが選択されることが好ましい。任意選択で、銅（Ｃｕ＋＋）またはコバルト（Ｃｏ＋＋）などの金属イオンをリフォールド混合物に添加し、タンパク質酸化を促進することができる。任意選択で、グリセロールをリフォールド混合物に添加し、リフォールディングされたタンパク質の収率を向上することができる。リフォールド混合物中のグリセロールの有用な濃度は１〜５０％（体積／体積）であり、１０〜２０％が好ましい範囲である。リフォールド混合物のｐＨは６〜１０であることが好ましい。
いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明の方法で用いるシステイン・ブロッキング剤は、「遊離」システイン残基と共有結合し、混合ジスルフィドを形成することにより、遊離システイン残基を安定化し、タンパク質の多量体化および凝集を防ぐと考えられる。多くのチオール反応性化合物をシステイン・ブロッキング剤として用い、遊離システインを含有するタンパク質を安定化することができる。システイン、システアミン、チオグリコール酸および還元型グルタチオンの他に、システイン・ブロッキング剤には、シスチン、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化型グルタチオン、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸（Ｅｌｌｍａｎ′ｓ試薬））、ピリジンジスルフィドなどのジスルフィド結合を含む試薬、Ｒ−Ｓ−Ｓ−ＣＯ−ＯＣＨ３型の化合物、ジホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシスチン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチン、ジチオプロピオン酸、ジメチルシスチンなどのシスチンの他の誘導体、またはジスルフィド交換反応を受けることができるいずれのジチオールもしくは化学物質も含まれる。ハロゲン化スルフェニルも混合ジスルフィドの調製に用いることができる。遊離システイン残基を含有するタンパク質を安定化するのに使用法が見いだされる他のチオールブロッキング剤には、遊離チオールと可逆的に反応できる化合物が含まれる。これらの試剤には、ある種の重金属塩または亜鉛、水銀および銀の有機誘導体が含まれる。他のメルカプチド生成剤または可逆的チオール反応性化合物はＣｅｃｉｌおよびＭｃＰｈｅｅ（１９５９）ならびにＴｏｒｃｈｉｎｓｋｉｉ（１９７１）によって述べられている。
任意選択で、遊離システイン残基を含有するリフォールディングされた可溶性タンパク質は、リフォールド混合物の可溶性分画中の他のタンパク質から回収および単離される。このような回収および精製方法は、当業者に知られているか容易に決定され、例えば遠心分離、濾過、透析、ならびにサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用およびアフィニティ・クロマトグラフィ処理を含むクロマトグラフィなどが含まれる。所望のタンパク質の回収および精製に適している方法は、タンパク質の性質および意図する使用法によってある程度異なる。
本発明はまた、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦタンパク質、特に野生型Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）、ならびにシステイン変異体を含むＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）変異体（まとめて「Ｇ−ＣＳＦタンパク質」と呼ぶ）を製造する新規な方法であって、適切にプロセシングされ生物学的に活性な回収Ｇ−ＣＳＦタンパク質の割合に著しい増加をもたらす方法も提供する。これらの新規な方法には、ｓｔＩＩシグナル配列を用いて大腸菌周辺質中にＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌させること、不溶性または凝集性Ｇ−ＣＳＦタンパク質を変性およびリフォールディングすること、および再生／リフォールド混合物の可溶性分画中の他のタンパク質から可溶性でリフォールディングされたＧ−ＣＳＦタンパク質を精製することが含まれる。回収Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦタンパク質が大腸菌の細胞内で発現された場合に存在する非天然Ｎ末端メチオニン残基を欠く。公表された報告（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ他、１９９５）は、修飾ｏｍｐＡリーダー配列を用いる大腸菌周辺質へのＧ−ＣＳＦの分泌について記載している。しかしながら、発現したｏｍｐ−Ａ−Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質が適切にプロセシングされて得られる成熟Ｇ−ＣＳＦは極めてわずかであった。適切にプロセシングされたＧ−ＣＳＦタンパク質の割合は、大腸菌ｄｎａＪおよびｄｎａＫタンパク質の同時発現により発現された全Ｇ−ＣＳＦタンパク質の１０〜３０％まで増加すると考えられる。いずれの場合にも、分泌したＧ−ＣＳＦタンパク質は極めて不溶性で生物学的に不活性である。本発明の方法では、適切にプロセシングされたＧ−ＣＳＦタンパク質が少なくとも８０〜１００％得られ、ｄｎａＫおよびｄｎａＪタンパク質の同時発現を必要としない。本発明はまた、不溶性の分泌Ｇ−ＣＳＦタンパク質を生物学的に活性な形に変性およびリフォールディングする方法を
初めて提供する。
これらの方法に従って得られる精製タンパク質は、所望の場合にはさらに処理することができる。例えば、単離されたタンパク質を、様々なシステイン反応性部分により遊離システイン残基で修飾することができる。例えば、タンパク質を様々なシステイン反応性ＰＥＧ試薬により遊離システイン残基でＰＥＧ化し、続いてモノＰＥＧ化タンパク質として精製することができる。用語「モノＰＥＧ化」は、タンパク質への単一のＰＥＧ分子の共有結合により修飾されたタンパク質を意味すると定義される。当業者に知られているいずれの方法を用いても非修飾タンパク質および未反応ＰＥＧ試薬からＰＥＧ化タンパク質を精製でき、その方法には、以下の実施例、ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の方法が含まれる。他の有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性デキストラン、システイン反応性炭水化物およびシステイン反応性ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）である。
本発明はまた、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、α−インターフェロンおよび２Ｎ＋１個のシステイン残基を含有する他のタンパク質、ならびに２Ｎ個のシステイン残基を含有し、２個以上のシステイン残基が遊離している他のタンパク質のシステイン・ムテイン、特に遊離システイン残基が混合ジスルフィドでブロックされているそれらのムテインおよびタンパク質をＰＥＧ化する方法を提供する。
本発明はさらに、生物学的に活性であるばかりでなく、タンパク質依存性の哺乳動物細胞増殖アッセイで高い特異的活性を保持する、本明細書に記載された方法によって製造される精製モノＰＥＧ化タンパク質変異体に関する。このようなタンパク質変異体には、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−α２の精製モノＰＥＧ化システイン・ムテインが含まれる。例えば、本明細書に記載のある種のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のインビトロにおける生物活性は、アミン反応性ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を用いてＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの生物活性に比べて３〜５０倍大きい。
２５個以上の異なるＩＦＮ−α遺伝子がある（Ｐｅｓｔｋａ他、１９８７）。ＩＦＮ−αファミリーのメンバーは、様々なアミノ酸相同性を共有し、重複する生物活性を示す。様々なＩＦＮ−αタンパク質の領域を結合することにより作成された非天然組み換えＩＦＮ−αが様々な臨床開発段階にある（ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒおよびＤｉＭａｒｃｏ、１９９５）。ＩＦＮ−αの各位置に最も一般的なアミノ酸を組み入れた非天然「コンセンサス」インターフェロン（Ｂｌａｔｔ他、１９９６）も記載されている。本発明の方法はまた、他のα−インターフェロン分子種および遊離システイン残基を含有する非天然α−インターフェロンタンパク質をリフォールディングするのに有用である。ＩＦＮ−α２のシステイン・ムテインをＰＥＧ化するのに有用な部位および領域は、ＩＦＮ−α遺伝子ファミリーの他のメンバーおよび非天然ＩＦＮ−αに直接適用できる。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（１９９６）は、アミンまたはアミド結合を介して、タンパク質がＮ末端非天然メチオニン残基で優先的にモノＰＥＧ化されるモノＰＥＧ化コンセンサス・インターフェロンについて記載した。ＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、非修飾コンセンサス・インターフェロンに比べて約５分の１に低下した（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他、１９９６）。
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの一実施形態では、Ｇ−ＣＳＦのへリックスＡに近接する領域にポリエチレン・グリコールが結合され、得られるモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、約１０００ｐｇ／ｍｌ（約５０ｐＭ）未満、好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満、より好ましくは約２０ｐｇ／ｍｌ（約１ｐＭ）未満および最も好ましくは約１５ｐｇ／ｍｌ（約０．７ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、Ｇ−ＣＳＦのＣ−Ｄループにポリエチレン・グリコール部分を結合させることができ、得られるモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、約１０００ｐｇ／ｍｌ（約５０ｐＭ）未満、好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ
）未満、より好ましくは約２０ｐｇ／ｍｌ（約１ｐＭ）未満および最も好ましくは約１５ｐｇ／ｍｌ（約０．７ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、Ｇ−ＣＳＦのヘリックスＤに対して遠位の領域にポリエチレン・グリコール部分を結合させることができ、得られるモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、約１０００ｐｇ／ｍｌ（約５０ｐＭ）未満、好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満、より好ましくは約２０ｐｇ／ｍｌ（約１ｐＭ）未満および最も好ましくは約１５ｐｇ／ｍｌ（約０．７ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（１９９６）は、アミンまたはアミド結合を介して、タンパク質がＮ末端非天然メチオニン残基で優先的にモノＰＥＧ化されるモノＰＥＧ化野生型Ｇ−ＣＳＦについて記載した。モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性は、非修飾Ｇ−ＣＳＦに比べて約３０％低下したと報告されているが、ＥＣ５０は示されなかった（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他、１９９６）。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（１９９６）は、Ｇ−ＣＳＦ中のヘリックスＡに近接する領域の他のアミノ酸を修飾することが、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦタンパク質をもたらすか否かについては解決していない。本発明の一目的は、ＰＥＧを結合させることができるＧ−ＣＳＦ中のヘリックスＡに近接する領域、および他の領域にあり、生物学的に活性なモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦタンパク質をもたらす他のアミノ酸位置を開示することである。
モノＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦの一実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦのヘリックスＡに近接する領域にポリエチレン・グリコールが結合され、得られるモノＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦは、約１４０００ｐｇ／ｍｌ（約１０００ｐＭ）未満、好ましくは約１４００ｐｇ／ｍｌ（約１００ｐＭ）未満、より好ましくは約２８０ｐｇ／ｍｌ（約２０ｐＭ）未満および最も好ましくは約１４０ｐｇ／ｍｌ（約１０ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦのＢ−Ｃループにポリエチレン・グリコール部分を結合させることができ、得られるモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、約１４０００ｐｇ／ｍｌ（約１０００ｐＭ）未満、好ましくは約１４００ｐｇ／ｍｌ（約１００ｐＭ）未満、より好ましくは約２８０ｐｇ／ｍｌ（約２０ｐＭ）未満および最も好ましくは約１４０ｐｇ／ｍｌ（約１０ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦのＣ−Ｄループにポリエチレン・グリコール部分を結合させることができ、得られるモノＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦは、約１４０００ｐｇ／ｍｌ（約１０００ｐＭ）未満、好ましくは約１４００ｐｇ／ｍｌ（約１００ｐＭ）未満、より好ましくは約２８０ｐｇ／ｍｌ（約２０ｐＭ）未満および最も好ましくは約１４０ｐｇ／ｍｌ（約１０ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。
モノＰＥＧ化ＧＨの一実施形態では、ＧＨのヘリックスＡに近接する領域にポリエチレン・グリコールが結合され、得られるモノＰＥＧ化ＧＨは、約２０００ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎＭ）未満、好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ（約１０ｎＭ）未満、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ（約１ｎＭ）未満および最も好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ（約０．１ｎＭ）未満のＥＣ５０を有する。
本発明はさらに、二量体、三量体および四量体などの高次の多量体を製造するために互いと、または化学基と共有結合または抱合させることができるタンパク質変異体を提供する。このような高次の多量体は、当業者に知られている方法に従い、または実施例２および２０に記載のように製造することができる。例えば、このような抱合は、対応する天然タンパク質よりも大きな分子量を有するＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはα−ＩＦＮ付加物を製造することができる。カップリングに適している化学基は、非毒性および非免疫原性であることが好ましい。これらの化学基には炭水化物、またはポリオールなどのポリマーが含まれるであろう。
本発明のシステイン変異体に結合させて「ＰＥＧ化」タンパク質を形成するのに有用な「ＰＥＧ部分」には、適当なポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリオールが含まれる。好ましいポリオールは、ポリエチレン・グリコールであり、これはエチレンオキシド単位
からなる合成ポリマーである。エチレンオキシド単位は、約１０，０００から５００，０００ｋＤａ以上までのサイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量でＰＥＧ化タンパク質変異体を得ることができるように変えることができる。ＰＥＧ部分のサイズは循環半減期に直接影響する（Ｙａｍａｏｋａ他、１９９４）。したがって、一般にはＰＥＧ部分のサイズまたは構造を変えることにより特定の治療応用または好ましい投与計画のために異なる循環半減期を有するタンパク質変異体を設計することになる。すなわち、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約３０ｋＤａ以上、より好ましくは約７０ｋＤａ以上の見かけの分子量を有し、ＥＣ５０が約４００ｎｇ／ｍｌ（約１８ｎＭ）未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（約５ｎＭ）未満、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（約０．５ｎＭ）未満およびさらにより好ましくは約２．２ｎｇ／ｍｌ（約０．１ｎＭ）であるＧＨタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約３０ｋＤａより大きい、より好ましくは約７０ｋＤａより大きい見かけの分子量を有し、ＥＣ５０が約１００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満、好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌ（５０ｐＭ）未満、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ（６ｐＭ）未満およびさらにより好ましくは約１５ｐｇ／ｍｌ（０．７ｐＭ）であるＧ−ＣＳＦタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約３０ｋＤａより大きい、より好ましくは約７０ｋＤａより大きい見かけの分子量を有し、ＩＣ５０が約１９００ｐｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）未満、好ましくは４００ｐｇ／ｍｌ（２１ｐＭ）未満、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ（５ｐＭ）未満、およびさらにより好ましくは約３８ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）であるアルファＩＦＮ（ＩＦＮ−α）タンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約３０ｋＤａより大きい、より好ましくは約７０ｋＤａより大きい見かけの分子量を有し、ＥＣ５０が約１４，０００ｐｇ／ｍｌ（約１０００ｐＭ）未満、好ましくは１４００ｐｇ／ｍｌ（約１００ｐＭ）未満、より好ましくは２８０ｐｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）未満、およびさらにより好ましくは約１４０ｐｇ／ｍｌ（約１ｐＭ）であるＧＭ−ＣＳＦタンパク質変異体を包含する。
システイン修飾用の反応性ＰＥＧ末端基には、ビニルスルホン、マレイミドおよびヨードアセチル成分が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＥＧ末端基はチオールに特異的で、タンパク質を損なわない条件下で反応が起きなければならない。
拮抗薬のｈＧＨ変異体も、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されているように、システイン付加変異体ＧＨを用いて調製することができる。ＧＨ拮抗薬の投与から恩恵を受けると考えられる状態には、末端肥大症、血管性眼疾患、糖尿病性ネフロパシー、血管形成術後の再狭窄および成長ホルモン感受性悪性腫瘍が含まれる。
本明細書では、用語「誘導体」は、本方法によって発現および回収されるタンパク質のいかなる変異体も意味する。このような変異体には、ＰＥＧ化バージョン、二量体および他の高次変異体、アミノ酸変異体、切断変異体、融合タンパク質、炭水化物の変化、天然タンパク質上に見いだされるリン酸化または他の結合基、および本明細書に開示された他のいかなる変異体も含まれるが、これらに限定されない。
本方法によって製造される化合物は、インビトロおよびインビボにおける様々な使用法に用いることができる。本発明のタンパク質およびそれらの誘導体は、それらの野生型、天然、または従来から知られている修飾対応物について知られている研究、診断または治療目的に用いることができる。インビトロにおける使用法には、例えば、他のタンパク質をスクリーニング、検出かつ／または精製するためのタンパク質の使用法が含まれる。
治療に使用する場合には、当業者は適当な投与量、投与回数および投与経路を容易に決
定することができる。このような決定を行うに際しての要素には、投与するタンパク質の性質、治療される状態、潜在的な患者のコンプライアンス、患者の年齢および体重などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の化合物はまた、結合した治療薬の循環半減期を高めるための送達手段として、または体内の特異的標的への直接的送達のために使用することができる。
以下の実施例は、限定することは意図しておらず、本発明の特定の実施形態の例示に過ぎない。
実施例
実施例１
成長ホルモン・ムテインＴ３Ｃのリフォールディング
組み換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびｈＧＨシステイン・ムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されている。ｈＧＨのシステイン・ムテインを構築する方法もＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されている。大腸菌でｈＧＨを発現するための好ましい方法の一つは、ＳＴＩＩリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌されたｈＧＨは可溶性であり、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されているようにカラム・クロマトグラフィにより精製することができる。ｈＧＨのある種のシステイン・ムテインは、ＳＴＩＩリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。不溶性の分泌ｈＧＨタンパク質をリフォールディングする方法はこれまで記載されたことは未だない。不溶性のｈＧＨシステイン・ムテインを生物学的に活性な形にリフォールディングするために以下のプロトコルを開発した。
不溶性のＧＨ Ｔ３Ｃムテイン（３位のスレオニンをシステインに変えた；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載）は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したように、ｓｔＩＩリーダー配列を用いて周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現させた。Ｔ３Ｃタンパク質は、以下の２手順を用いて可溶化およびリフォールディングしたが、どちらも還元剤および遊離システイン残基を安定化するためのシステイン・ブロッキング剤としてシステインを用いる。Ｔ３Ｃムテインを発現する大腸菌株の培養液（２００ｍｌ）を培養し、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したようにＴ３Ｃの発現を誘導した。細胞を溶解し、実施例１４に記載したように不溶性部分を遠心分離によって単離した。Ｔ３Ｃを含有する不溶性材料を８Ｍ尿素、２０ｍＭシステイン、２０ｍＭトリス、ｐＨ９ ２０ｍＬに溶かし、振とうすることにより室温で１時間混ぜた。次に可溶化混合物を２つに分割し、半分は１０％グリセロール、２０ｍＭトリス、ｐＨ８ ５０ｍＬ中に希釈し、別の半分は０．５％ＴＷＥＥＮ２０、２０ｍＭトリス、ｐＨ８ ５０ｍＬ中に希釈した。リフォールドを４℃に２４時間保ち、遠心分離によって透明にし、２０ｍＭトリス、０．５％ＴＷＥＥＮ２０、ｐＨ７．６で予め平衡化したＱ−セファロースＨｉ Ｔｒａｐカラム５ｍＬに載せた。リフォールディングされた可溶性Ｔ３Ｃは、０．５％ＴＷＥＥＮ２０、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６に溶かした０〜３００ｍＭ ＮａＣｌの２０カラム体積グラジエント中にカラムから溶出された。回収されたカラム分画を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。単量体Ｔ３Ｃは、およそ１６０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。再生緩衝液中のグリセロールを含有するリフォールドから単量体Ｔ３Ｃ約７９０μｇが回収された。再生緩衝液中にＴｗｅｅｎ２０が存在する場合には、リフォールドから単量体Ｔ３Ｃ約２８４μｇが回収された。この結果は、どちらのリフォールド／再生手順を用いても可溶性単量体Ｔ３Ｃタンパク質を得ることができることを示している。単量体Ｔ３Ｃタンパク質がより高い回収率であったことから、続くリフォールド実験では安定剤としてグリセロールを用いた。
実施例２
成長ホルモンＴ３Ｃムテインをリフォールディングするために使用した還元剤の比較
Ｔ３Ｃムテインを発現する大腸菌株の培養液（２００ｍｌ）を培養し、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したようにＴ３Ｃを発現させた。実施例５および１４に記載のように、細胞の界面活性剤／リゾチーム処理で細胞を溶解することにより不溶性Ｔ３Ｃを単離した。この材料を８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ９
２０ｍＬに懸濁し、３管に等分した。第一管（「リフォールド Ａ」）には還元剤を加えず、第二管（「リフォールド Ｂ」）には５ｍＭＤＴＴを加え、第三管（「リフォールド Ｃ」）には２０ｍＭシステインを加えた。室温で１時間混ぜた後、可溶化物を１０％グリセロール、２０ｍＭトリス、ｐＨ８ ３０ｍＬ中に希釈した。リフォールドを一夜４℃に保った。翌日、遠心分離によってリフォールドを透明にし、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したようにＱ−セファロース Ｈｉ Ｔｒａｐカラム５ｍＬに載せた。回収されたカラム分画を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。「リフォールドＡ」（還元剤なし）から回収されたＴ３Ｃタンパク質は、Ｑ−セファロース・カラムからいくつかの幅広いピークとして溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、回収タンパク質生成物には多少の単量体Ｔ３Ｃタンパク質が存在したが、大部分は凝集性Ｔ３Ｃ二量体（２１０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する）およびＴ３Ｃ三量体（３００ｍＭと１０００ｍＭ
ＮａＣｌの間で溶出する）からなっていた。単量体および二量体Ｔ３Ｃタンパク質の最終的な回収率を表１に示す。「リフォールドＢ」（５ｍＭ ＤＴＴを含む）から回収されたＴ３Ｃタンパク質は、Ｑ−セファロース・カラムから単一の幅広いピークとして溶出したが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると不均一であった。単量体Ｔ３Ｃバンドは、下垂体ｈＧＨバンドよりはるかに幅広く、Ｔ３Ｃの様々なジスルフィド・アイソフォームに相当すると思われる多くの異なる分子量の単量体分子種を含んでいた。いくつかの分画では少量の二量体Ｔ３Ｃタンパク質も検出された。「リフォールドＣ」（還元剤としてシステインを使用）からは主に単量体Ｔ３Ｃタンパク質が得られ、１６０ｍＭ ＮａＣｌでＱ−セファロース・カラムから溶出するピークの鋭さおよび非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した場合の正しい分子量（標準の下垂体ｈＧＨに対して）におけるタンパク質バンドの鋭さによって立証されるように、単一で均一な分子種であるように見えた。単量体および二量体形態のＴ３Ｃの各リフォールドからの最終的な回収率を表１に示す。データは、システインの存在下でＴ３Ｃタンパク質を可溶化／リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはＤＴＴの存在下でタンパク質を可溶化／リフォールディングするよりも可溶性単量体Ｔ３Ｃタンパク質が高収率で得られることを示している。この結果はまた、システインの存在下でＴ３Ｃタンパク質を可溶化／リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはＤＴＴの存在下でタンパク質を可溶化／リフォールディングするよりも可溶性単量体Ｔ３Ｃタンパク質がより安定で均一な調製物として得られることを示している。
Figure 2011173911
可溶化混合物中にＤＴＴを含有するリフォールドＢから回収された単量体Ｔ３Ｃタンパク質は、タンパク質をジスルフィド結合形成が可能な条件下に置くことによって安定なジスルフィド結合のホモ二量体Ｔ３Ｃタンパク質に変換することができる。これらには、酸
化剤をタンパク質に添加する条件、またはｐＨが中性もしくはアルカリ性に近い場合にジスルフィド転位を受けることができる第二のジスルフィド結合試薬の添加による条件が含まれる。使用することができた酸化剤の例には、テトラチオン酸ナトリウムまたは酸素が含まれる。任意選択で、銅またはコバルトなどの微量の二価金属イオンを添加して反応を触媒することができる。有用なジスルフィド結合試薬には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸、または他の低分子量ジチオールが含まれる。あるいは、単量体Ｔ３Ｃタンパク質を酸性ｐＨで維持し、凝集および望ましくないジスルフィド転位を防ぐことができる。
実施例１および２に記載の手順に従って調製された可溶性でリフォールディングされたＧＨシステイン・ムテインは、当業者に知られている様々なクロマトグラフィ手順によって精製することができる。これらのクロマトグラフ手順には、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、金属キレート化アフィニティ・クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、逆相クロマトグラフィまたはこれらの技術の組合せが含まれる。一例としては、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＱ−セファロース・ファスト・フロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、リフォールド混合物の可溶性分画からＧＨムテインを捕捉することができる。カラムを２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶かした０から２５０ｍＭ ＮａＣｌ １０〜２０体積の線形漸増塩グラジエントにより結合タンパク質を溶出することができる。任意選択で、グリセロール（１０％の最終濃度）をカラム緩衝液に加えることができる。ｈＧＨムテインを含有する分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット法により同定することができる。リフォールド／再生混合物の可溶性分画からｈＧＨムテインを捕捉するのに用いることができる代わりの樹脂には、ＨＩＣ、他のイオン交換樹脂または親和性樹脂が含まれる。
システイン・ムテインは、疎水性相互作用クロマトグラフィによりさらに精製することができる。ＧＨムテインを含有するＱ−セファロース・カラム分画をプールし、２Ｍの最終濃度までＮａＣｌを加えることができる。このプールを、予め２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したブチル−セファロース・ファスト・フロー樹脂上に載せることができる。２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５に溶かした２Ｍから０Ｍ ＮａＣｌの逆塩グラジエントを用い、樹脂からＧＨムテインを溶出することができる。ＧＨムテインを含有する分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット法により同定し、プールすることができる。あるいは、ＧＨムテインを含有するＱ−セファロース分画をプールし、フェニル−セファロース・カラム上に載せる前に２Ｍの最終濃度まで硫酸アンモニウムを加えることができる。２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶かした２Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆塩グラジエントを用い、樹脂からＧＨムテインを溶出することができる。ＧＨムテインを含有する分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット法により同定し、プールすることができる。
さらに精製が求められる場合には、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化したニッケル・キレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上に、ＧＨムテインを含有するＨＩＣプールを直接載せることができる。洗浄ステップの後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に溶かした０〜３０ｍＭイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）を用いてＧＨムテインを回収することができる。ＧＨは、おそらくＨ１８、Ｈ２１およびＥ１７４により形成された二価金属結合部位を介してニッケルに対する高い親和性を有している。結果として、金属キレート化カラムを用い、ＧＨを高純度で得ることができる（Ｍａｉｓａｎｏ他、１９８９）。ＧＨムテインはニッケル・カラムに固く結合し、野生型ＧＨと同様のイミダゾール濃度（約１５ｍＭ）で溶出するはずである。あるいは、銅キレート樹脂をニッケル・キレート樹脂の代わりに用いることができる。
精製されたＧＨシステイン・ムテインの生物活性は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて決定することができる。
Ｔ３Ｃムテインを以下の通り精製した。大腸菌培養液６００ｍＬを培養し、上述のようにＴ３Ｃタンパク質の発現を誘導した。実施例５および１４に記載するように界面活性剤／リゾチーム混合物（Ｂ−Ｐｅｒ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）で細胞を処理することにより不溶性Ｔ３Ｃを単離した。不溶性材料を８Ｍ尿素、２０ｍＭ トリス、２０ｍＭシステイン、ｐＨ９ ４０ｍＬに懸濁した。室温で１時間混ぜた後、可溶化混合物を１５％グリセロール、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、４０μＭ硫酸銅２００ｍＬ中に希釈した。リフォールドを一夜４℃に保った。翌日、遠心分離によってリフォールドを透明にし、１０％グリセロール、２０ｍＭトリス、ｐＨ８で平衡化したＱ−セファロースＨｉ Ｔｒａｐカラム５ｍＬ上に載せた。２０ｍＭトリス、ｐＨ８、１０％グリセロールに溶かした０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌの２０カラム体積のグラジエントによる溶出でＴ３Ｃを回収した。回収された分画を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。正しい見かけ分子量のＴ３Ｃタンパク質を主に含有する分画をプールした。プールした分画から精製されたＴ３Ｃタンパク質４．６ｍｇが得られた。この材料を実施例３に記載のＰＥＧ化研究に用いた。精製されたＴ３Ｃタンパク質の生物活性は、実施例１および２ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＧＨ−Ｒ４細胞増殖アッセイで測定した。Ｔ３Ｃタンパク質は、１．３５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０でＧＨ−Ｒ４細胞の増殖を促進した。
この手順によって調製した他のシステイン・ムテインには、＊−１Ｃ、Ｐ２Ｃ、Ｐ５Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｋ４１Ｃ、Ｓ５５Ｃ、Ｓ５７Ｃ、Ｔ６０Ｃ、Ｑ６９Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｎ９９Ｃ、Ｌ１０１Ｃ、Ｖ１０２Ｃ、Ｙ１０３Ｃ、Ｄ１３０Ｃ、Ｓ１３２Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、Ｒ１３４Ｃ、Ｔ１３５Ｃ、Ｑ１３７Ｃ、Ｋ１４０Ｃ、Ｑ１４１Ｃ、Ｔ１４２Ｃ、Ｙ１４３Ｃ、Ｋ１４５Ｃ、Ｄ１４７Ｃ、Ｎ１４９Ｃ、Ｓ１５０Ｃ、Ｈ１５１Ｃ、Ｎ１５２Ｃ、Ｄ１５３Ｃ、Ｅ１８６Ｃ、およびＧ１８７Ｃが含まれる。特定の精製ＧＨシステイン・ムテインの生物活性は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＧＨ−Ｒ４細胞増殖アッセイで測定した。ムテイン＊−１Ｃ、Ｐ２Ｃ、Ｐ５Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｓ５５Ｃ、Ｎ９９Ｃ、Ｌ１０１Ｃ、Ｖ１０２Ｃ、Ｙ１０３Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、Ｑ１３７Ｃ、Ｋ１４０Ｃ、Ｙ１４３Ｃ、Ｄ１４７Ｃ、Ｎ１４９Ｃ、Ｅ１８６Ｃ、およびＧ１８７Ｃで実測されたＥＣ５０は、０．７ｎｇ／ｍｌから２．２ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった。これらの値はすべて、これらのアッセイで０．３ｎｇ／ｍｌから１．５ｎｇ／ｍｌの範囲である野生型ＧＨ対照で実測されたＥＣ５０とほぼ等しかった。
実施例３
ＰＥＧ化および遊離システイン残基を含有するＰＥＧ化形のタンパク質を精製するための一般法
遊離システイン残基を含有するタンパク質は、市販されている様々なシステイン反応性ＰＥＧ−マレイミド（またはＰＥＧ−ビニルスルホン）を用いてＰＥＧ化することができる。組み換えタンパク質は一般的に、遊離システインの最適なＰＥＧ化を行うためにジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−ＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、またはいくつかの他の還元剤で部分的に還元する。この部分的還元ステップを行わない場合には、遊離システインはシステイン反応性ＰＥＧに対して比較的非反応性である。各ムテインを部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、様々なｐＨおよび温度における還元剤濃度の範囲を用いて経験的に決定することができる。還元剤濃度は通常、０．５モル当量から１０倍モル過剰量まで変化する。好ましい温度は４℃から３７℃である。ｐＨは６．５から９．０までの範囲でよいが、７．５から８．５であることが好ましい。
最適条件は、還元剤および暴露時間によって異なる。適切な条件下では、熱力学的により安定な天然ジスルフィドではなくて最も安定性の低いジスルフィド（通常は分子間ジスルフィドおよび混合ジスルフィド）が最初に切断される。通常、室温で３０分間のＤＴＴ５〜１０倍モル過剰が効果的である。部分的還元は、逆相カラムからのタンパク質の溶出プロフィールにおける僅かなシフトによって検出することができる。部分的還元はまた、タンパク質試料の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による見かけの分子量の僅かなシフトによっても検出することができる。タンパク質を「過還元（ｏｖｅｒ−ｒｅｄｕｃｅ）」したり別のシステイン残基を暴露しないように注意しなければならない。過還元は、逆相ＨＰＬＣにより（過還元されたタンパク質は完全に還元され変性したタンパク質に類似した保持時間を有するはずである）、およびＰＥＧ化反応後に２個のＰＥＧを含有するタンパク質分子の出現により（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけ分子量の変化により検出可能）検出することができる。システイン・ムテインの場合には、対応する野生型タンパク質が対照としての役割を果たすが、それは天然の分子内ジスルフィドを還元しない条件下でＰＥＧ化してはならないからである。過剰の還元剤は、ＰＥＧ化の前にサイズ排除クロマトグラフィまたは透析によって除去することができる。ＴＣＥＰは、遊離チオール基を含有しないことからＰＥＧ化試薬の添加前に除去する必要はない。部分的に還元されたタンパク質を様々な濃度のＰＥＧ−マレイミドまたはＰＥＧ−ビニルスルホン（通常、ＰＥＧ：タンパク質モル比は１：１、５：１、１０：１および５０：１）と反応させ、２種類の試薬の最適な比を決定する。タンパク質のＰＥＧ化は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量シフトによってモニターすることができる。ジＰＥＧ化生成物を与えることなく有意な量のモノＰＥＧ化生成物をもたらす最少量のＰＥＧが通常望ましいと考えられる。一部の例では、ある種の添加物がＰＥＧ化収率を向上することがある。これらの添加物には、ＥＤＴＡ、ホウ酸塩、カオトロープ（尿素、グアニジン、有機溶媒）、界面活性剤、浸透圧分解（ｏｓｍｏｌｙｔｉｃ）安定剤（ポリオール、糖、ポリマー、アミノ酸およびその誘導体）、および他のイオン性化合物（クエン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、四級アミン、塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、他）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＥＤＴＡの有用な濃度は０．０１〜１０ｍＭであり、０．５〜１ｍＭが好ましい濃度である。一般的に、モノＰＥＧ化タンパク質は、サイズ排除、イオン交換、アフィニティ、逆相、または疎水性相互作用クロマトグラフィによって非ＰＥＧ化タンパク質および未反応ＰＥＧから精製することができる。モノＰＥＧ化タンパク質（単一ＰＥＧ分子がシステイン・ムテインに結合した）に富んだ分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロット法により同定することができる。これらの分画をプールし、冷凍保存することができる。ＰＥＧ部分の存在は一般的に、樹脂に対するタンパク質の親和性を変化させ、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することを可能にしている。２相有機抽出または塩沈殿などの他の精製プロトコルを用いることもできる。精製されたＰＥＧ化タンパク質は、本明細書に記載の様々な実施例ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の細胞増殖／阻害アッセイで試験することができる。ＰＥＧ化タンパク質のインビボにおける有効性は、本明細書に示す実施例ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したように決定することができる。ＰＥＧ分子が適切な部位でタンパク質と結合していることを確認するための実験を行うことができる。この実験は、タンパク質の化学的またはタンパク質分解的消化、サイズ排除、イオン交換または逆相クロマトグラフィによるＰＥＧ化ペプチド（大きな分子量を有しているはずの）の精製と、続くアミノ酸配列決定によって行う。ＰＥＧとカップリングしたアミノ酸は、アミノ酸配列決定実行中にブランクとして出現するはずである。
以下の条件を用いてＧＨムテインＴ３ＣをＰＥＧ化し、ＰＥＧ化Ｔ３Ｃタンパク質を精製した。最初のＰＥＧ化反応条件は、実施例２に記載したように調製した（還元剤ならびにタンパク質を可溶化およびリフォールディングするためのシステイン・ブロッキング剤としてシステインを用い）リフォールディングされたＴ３Ｃタンパク質の一部、還元剤と
してのＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン］−ＨＣｌ、およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）製の５ｋＤａシステイン反応性ＰＥＧを用いて決定した。精製されたＴ３Ｃの一部２μｇを、様々な過剰量の５ｋＤＡマレイミド−ＰＥＧまたは５ｋＤａビニルスルホン−ＰＥＧの存在下で１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中室温でＴＣＥＰ濃度を増加させながらインキュベートした。１２０分後、反応物の一部を直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｐＨ８．５では、５倍モル過剰量のＴＣＥＰおよび１５倍モル過剰量の５ｋＤＡマレイミドまたは５ｋＤａビニルスルホンＰＥＧにより２時間後に、ジまたはトリＰＥＧ化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノＰＥＧ化Ｔ３Ｃタンパク質が得られた。ＰＥＧ化のためにＴＣＥＰなどの還元剤で処理することによりＴ３Ｃムテインを部分的に還元する必要があった。野生型ＧＨは同一の部分的還元条件下でＰＥＧ化されず、このことはＰＥＧ部分がムテインに導入されたシステイン残基に結合していることを示している。これらの条件を用い、精製および生物活性の評価のためにＰＥＧ化反応をスケール・アップした。５倍過剰量のＴＣＥＰおよび１５倍の１０ｋＤａマレイミドＰＥＧを用い、より大きなＰＥＧ化反応（３００μｇ）を室温で２時間行った。反応時間の終了時にＰＥＧ化混合物を氷冷２０ｍＭトリス、１５％グリセロール、ｐＨ８．０で２倍に希釈し、直ちにＱ−セファロース・カラム（１ｍＬ、ＨｉＴｒａｐ）上に載せた。２０ｍＭトリス、１５％グリセロール、ｐＨ８．０に溶かした０〜０．２Ｍ ＮａＣｌ２０ｍＬグラジエントを実行することによりカラムからＰＥＧ化Ｔ３Ｃを溶出した。ＰＥＧ部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することを可能にしている。モノＰＥＧ化Ｔ３Ｃ（単一ＰＥＧ分子がＴ３Ｃ単量体に結合した）に富んだ分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、プールして冷凍した。モノＰＥＧ化Ｔ３Ｃタンパク質は８０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は約３０ｋＤａであった。
上述の方法により１０Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３Ｃ、２０Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３Ｃ、および４０Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３Ｃも調製した。精製されたＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質の生物活性は、実施例１および２ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の細胞増殖アッセイで測定し、その比活性を決定した。ＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質は、野生型ＧＨおよび非ＰＥＧ化Ｔ３Ｃタンパク質と同様にＧＨ−Ｒ４細胞の増殖を促進した。５Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質のＥＣ５０は１．２ｎｇ／ｍｌであり、１０Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３ＣのＥＣ５０は１．２ｎｇ／ｍｌであり、２０Ｋ ＰＥＧ−Ｔ３ＣのＥＣ５０は３〜４ｎｇ／ｍｌであった。４０Ｋ−ＰＥＧ−Ｔ３ＣのＥＣ５０は、実施例１および２ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の細胞増殖アッセイを用いて決定することができた。ＰＥＧ−Ｔ３Ｃおよび他のＰＥＧ化ＧＨシステイン・ムテインのインビボにおける有効性は、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１および実施例４に記載したように決定することができる。
上記で概要を説明した手順に従ってＰＥＧ化および精製されたＧＨの他のシステイン・ムテインには、Ｐ２Ｃ、Ｐ５Ｃ、Ｓ１３２Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、およびＲ１３４Ｃが含まれる。２０ｋＤａ−ＰＥＧ部分で修飾されたこれらのムテインの生物活性は、実施例１および２ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の細胞増殖アッセイを用いて測定した。これらのＰＥＧ化ムテイン・ムテインで実測されたＥＣ５０は、１．７ｎｇ／ｍｌから６．０ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった。これらの値はすべて、並行して行われた野生型ＧＨ対照アッセイで実測されたＥＣ５０と類似していたが、僅かに大きかった。これらの野生型ＧＨ対照のＥＣ５０は、０．６ｎｇ／ｍｌから１．２ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった。
実施例４
ＰＥＧ−Ｔ３Ｃ成長ホルモンは、成長ホルモン欠損ラットにおける体成長を促進する
Ａ．ＰＥＧ−Ｔ３Ｃの体成長を促進する能力は、下垂体の除去により成長ホルモンの合成ができない下垂体摘出（ＨＹＰＯＸ）ラットで測定した。ＨＹＰＯＸ雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは民間の供給メーカーから購入し、体重は約９０ｇであった。ラットを１３日間馴化させた。馴化の間に４ｇ以上増加した動物は試験から除いた。体重測定は毎日同じ時間に行った（９：３０ＡＭ）。ラットを体重別に様々な試験群に無作為割り付けした。１群当たり５匹のラットとしたが、ただし２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃを毎日投与する群は４匹のラットのみであった。ラットの体重を毎日測定し、プラセボ（ラット血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）２００μｇ／ｍｌを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））、市販の組み換えヒト成長ホルモン、ニュートロピン（登録商標）、または様々な投与量の実施例３に記載のように調製した２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃを毎日または１日おきに皮下注射で投与した。すべてのタンパク質溶液は、ラット血清アルブミン２００μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ中で調製した。動物は連続９日間処理した。１０日目に動物を屠殺し頸骨を採取した。頸骨を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。５％ギ酸中で固定した頸骨から石灰質を除き、前面の近接端部で分割した。頸骨をパラフィン包埋のために加工して８ミクロンの薄片を作り、トルイジンブルーで染色した。頸骨の骨端幅を左の脛骨で測定した（１頸骨当たり５回測定）。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端測定を表２に示す。この結果は、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。
Figure 2011173911
Ｂ．試験化合物を毎日または２日おきに皮下注射により投与したことを除いては実施例４のＡについて記載したように第二の実験を行った。さらに、４０ｋＤａ−ＰＥＧで修飾したＴ３Ｃの一用量を試験した。ＨＹＰＯＸ雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは民間の供給メーカーから購入し、体重は約１００ｇであった。体重測定は毎日同じ時間に行った。ラットを体重別に様々な試験群に無作為割り付けした。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃを投与した試験群を除いては、１群当たり５匹のラットとした。ラットの体重を毎日測定し、プラセボ（ラット血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）２００μｇ／ｍｌを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））、市販の組み換えヒト成長ホルモン、ニュートロピン（登録商標）、様々な投与量の２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃまたは４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃを毎日または２日おきに皮下注射で投与した。ＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質は実施例３に記載したように調製した。すべてのタンパク質溶液は、
ラット血清アルブミン２００μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ中で調製した。動物は連続９日間処理した。１０日目に動物を屠殺し頸骨を採取し、実施例４のＡに記載したように薄片を作るために調製した。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端幅を表３に示す。この結果は、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃおよび４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｔ３Ｃが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。
Figure 2011173911
実施例５
ＩＦＮ−α２システイン・ムテインのリフォールディングおよび精製
組み換えヒト・α−インターフェロン２（ＩＦＮ−α２）およびＩＦＮ−α２システイン・ムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されている。ＩＦＮ−α２のシステイン・ムテインを構築する方法および付加システイン残基の位置として好ましいＩＦＮ−α２タンパク質内の部位もＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されている。これらの方法を用い、大腸菌中で以下のムテインを構築した。Ｃ１Ｓ、Ｑ５Ｃ、４３Ｃ４４、Ｎ４５Ｃ、Ｑ４６Ｃ、Ｆ４７Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、Ｄ７７Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｔ１０８Ｃ、Ｓ１６３Ｃ、Ｅ１６５Ｃ、＊１６６Ｃ、Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｔ５２Ｃ、Ｇ１０２Ｃ、Ｖ１０３Ｃ、Ｇ１０４Ｃ、Ｖ１０５Ｃ、Ｐ１０９Ｃ、Ｌ１１０Ｃ、Ｍ１１１Ｃ、Ｓ１６０Ｃ、Ｌ１６１Ｃ、Ｒ１６２ＣおよびＫ１６４Ｃ。大腸菌でＩＦＮ−α２を発現するための好ましい方法の一つは、ＳＴＩＩリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌したＩＦＮ−α２の分画は可溶性であり、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されているようにカラム・クロマトグラフィにより精製することができる。ＩＦＮ−α２のある種のシステイン・ムテインは、ＳＴＩＩリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。ムテインの浸透圧衝撃上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分が１９ｋＤａ ｒＩＦＮ−α２バンドのレベルを低下（野生型に比べて）させたことを示した。浸透圧衝撃からの全細胞溶解物および不溶性材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらのムテインが比較的高レベルで分泌されたが、主に不溶性の形でおそらく周辺質中に蓄積したことを示した。これらのタンパク質は還元条件下で野生型ｒＩＦＮ−α２標準品と一緒に移動し、ＳＴＩＩリーダーが除去されたことを示した。ムテインの相対的発現レベルの定性的評価を表４に要約する。不溶性の分泌ＩＦＮ−α２タンパク質をリフォールディングする手順がこれまで記載されたことは未だない。ＩＦＮ−α２システイン・ムテインを生物学的に活性な形で発現しリフォールディングするために以下のプロト
コル（ここでは「プロトコルＩ」と呼ぶ）を開発した。
ＩＦＮ−α２システイン・ムテインおよびＩＦＮ−α２の発現には通常、２リットルの振とうフラスコ中の培養液３２５ｍｌ、または２リットルのバッフル付き（ｂａｆｆｌｅｄ）振とうフラスコ中の培養液５００ｍｌを３７℃で、ジャイロトリー（ｇｙｒｏｔｏｒｙ）シェーカー用バス中約１７０〜２２０ｒｐｍで培養した。培養液は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したように培養し、誘導し、採取し、浸透圧衝撃に供した。得られた上清およびペレットを直ちに処理、または−８０℃で保存した。
浸透圧衝撃ペレット中の不溶性タンパク質として回収されたＩＦＮ−α２システイン・ムテインを変性し、還元し、以下のリフォールド手順を用いてそれらの適切な立体配置にリフォールディングした。浸透圧衝撃溶解物からのペレットはまず、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）により記載されたようにＢ−ＰＥＲ（商標）細菌タンパク質抽出試薬で処理した。Ｂ−ＰＥＲは、大腸菌細胞膜を破壊して細胞の細胞質内容物を放出させる緩和な界面活性剤混合物である。不溶性材料は遠心分離によって回収し、水に懸濁し、再度遠心分離した。得られたペレットは、２０ｍＭトリス・ベースに溶かした６Ｍグアニジン、５０ｍＭシステイン５ｍＬ中に可溶化した。混合物を３０分間撹拌した後、４０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ ４００ｍＬに対して４℃で一夜透析した。翌日、リフォールド混合物のｐＨを３．０に調整し、混合物を遠心分離した後、浸透圧衝撃上清からのｒＩＦＮ−α２の精製についてＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載したように、Ｓ−セファロース・カラムと、続いてＣｕ＋＋ＩＭＡＣカラム上に載せた。これらの手順を用い、６種類のＩＦＮ−α２システイン・ムテインＱ５Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃおよび＊１６６Ｃをリフォールディングして精製した。同様の手順を用いて不溶性の野生型ＩＦＮ−α２をリフォールディングして精製することができる。
精製されたＱ５Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、および＊１６６Ｃシステイン・ムテインの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ムテインが主に単量体として回収され、予想どおりの分子量１９ｋＤａまでで移動することを示した。Ｃ９８Ｓは、天然のＣｙｓ１−Ｃｙｓ−９８ジスルフィド結合の欠如のために他のｒＩＮＦ−α２ムテインより僅かに大きな分子量で移動した。一部の精製ムテインは少量のジスルフィド結合のｒＩＮＦ−α２二量体を含んでいた。この二量体分子種の分子量は約３７〜３８ｋＤａであった。
ＩＮＦ−α２の多くのシステイン・ムテインをプロセシングするときに、ある種のシステイン・ムテインが細胞溶解後の可溶性および不溶性分画の両方に存在するらしいことを発見した。可溶性と不溶性ＩＦＮ−α２タンパク質の比は、突然変異体間で変化した。したがって、ＩＦＮ−αシステイン・ムテインの回収率を向上させるため、細胞全体の可溶化ステップを含む代替の可溶化／リフォールディング手順（ここでは、「プロトコルＩＩ」と呼ぶ）を開発した。培養方法の改良がＳＴＩＩリーダー配列のプロセシングの効率を改善することが分かり、以下に詳述するようにリフォールディングおよび精製のためにＩＦＮ−αシステイン・ムテインを発現するのに用いた。改良方法では、１００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０、および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地中で培養液３２５〜４００ｍｌを、３７℃で激しく振とうしながら、例えばＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｃ２５ＫＣの環境保護のシェーカー中２２０〜２５０ｒｐｍで６００ｎｍで０．５〜０．７ＯＤの細胞密度まで培養した。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度０．５ｍＭまで添加することにより培養液を誘導し、誘導したら温度を２８℃まで下げ、シェーカー速度を１４０ｒｐｍに落とした。誘導された培養液を一夜（１４〜１８時間）インキュベートし、遠心分離によって採取した。細胞ペレットを直ちに処理し、プロセシングまで−２０℃または−８０℃で保存した。誘導培養液３２５〜４００ｍＬからの細胞ペレットはまず、８Ｍグアニジン、２０ｍＭシステイン、
２０ｍＭ
Ｍｅｓ、２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３の１０ｍＬに懸濁し、均一な懸濁液が存在するまで混ぜる。次いで、ｐＨをｐＨ８〜９に上げ、可溶化混合物を３時間撹拌する。次に、細胞溶解物を氷冷した再生緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ ０．３Ｍグアニジン、１Ｍ尿素、４０μｍ硫酸銅、ｐＨ８）で１：２０に希釈した。濁った懸濁液を４℃で１〜２日放置した。リフォールドを遠心分離と、続く３へのｐＨ調整および２回目の遠心分離により透明にする。上清を冷水で１：４に希釈し、Ｓ−Ｓｅｐｈ Ｈｉ Ｔｒａｐ５ｍＬ上に載せる。イオン交換カラムを、緩衝液Ａが２０ｍＭ Ｍｅｓ、ｐＨ５で緩衝液Ｂが１０％エチレングリコール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｍｅｓ、ｐＨ５である０〜７０％緩衝液Ｂの１００ｍＬグラジエントで溶出する。あるいは、リフォールディングされたＩＦＮ−αシステイン・ムテインは、フェニル−セファロース・カラムなどのＨＩＣカラムを用いてリフォールド混合物から捕捉することができる。リフォールド混合物をまず遠心分離し、上清に硫酸アンモニウムを最終濃度１０％まで加え、混合物を遠心分離し、１０％硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８で平衡化したフェニル・セファロース・カラム１０ｍＬ上に載せる。１０％硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリスｐＨ８から３０％エチレングリコール、２０ｍＭトリス、ｐＨ８までの線形グラジエント１００ｍＬを用いてＩＦＮ−αシステイン・ムテインをカラムから溶出する。フェニル−セファロース・カラムからのインターフェロン・プールは、銅キレート・カラム、Ｓ−セファロース・カラムまたは両方を用いてさらに精製することができる。
インターフェロン・システイン・ムテインはまた、システイン・ブロッキング剤の役割を果たす他の還元剤を用いて可溶化およびリフォールディングすることができる。可溶化／リフォールド混合物中のシステインを還元型グルタチオン、チオグリコール酸またはシステアミンに置き換えると、実施例７に記載の手順に従って精製およびＰＥＧ化できるリフォールディングされた可溶性ＩＦＮシステイン変異体が得られた。還元剤がないか、可溶化／リフォールド混合物中のシステインを２０ｍＭ ＤＴＴで置き換えた場合には、リフォールディングされた可溶性ＩＦＮシステイン・ムテインの収率は、リフォールド混合物を逆相ＨＰＬＣにより分析したときに検出できないレベルまで低下した。さらに、還元剤がないか、可溶化／リフォールド混合物中のシステインを２０ｍＭ ＤＴＴで置き換えた場合には、リフォールド混合物のＳ−セファロース・クロマトグラフィ後にリフォールディングされた可溶性ＩＦＮシステイン・ムテインはまったく回収されなかった。
プロトコルＩＩを用い、以下のムテインを大腸菌中で発現させ、リフォールディングして精製した：Ｃ１Ｓ、Ｑ５Ｃ、４３Ｃ４４、Ｎ４５Ｃ、Ｆ４７Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｓ１６３Ｃ、Ｅ１６５Ｃ、＊１６６Ｃ、Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｔ５２Ｃ、Ｇ１０２Ｃ、Ｖ１０３Ｃ、Ｇ１０４Ｃ、Ｖ１０５Ｃ、Ｐ１０９Ｃ、Ｌ１１０Ｃ、Ｍ１１１Ｃ、Ｓ１６０Ｃ、Ｌ１６１Ｃ、Ｒ１６２ＣおよびＫ１６４Ｃ。これらのリフォールドは、ｐＨ８または一部の例では７．５で行った。
実施例６
ＩＦＮ−α２システイン・ムテインの生物活性
実施例５のプロトコルＩを用いて精製した精製Ｑ５Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、および＊１６６Ｃ ＩＦＮ−α２システイン・ムテインの生物活性をＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＤａｕｄｉ増殖阻害アッセイで測定した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄまたはＢＣＡタンパク質アッセイ・キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＰｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。市販の野生型ｒＩＦＮ−α２およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載されたように調製したｒＩＦＮ−α２は、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。ムテインは、アッセイの誤差の範囲内で野生型ｒＩＦＮ−α２対照タンパク質と同程度にＤａｕｄｉ細胞
の増殖を阻害した。ムテインのうち５種類（Ｑ５Ｃ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃおよび＊１６６Ｃ）の平均ＩＣ５０は、野生型ｒＩＦＮ−α２タンパク質の平均ＩＣ５０と類似しており、１５〜１８ｐｇ／ｍｌの範囲であった。Ｃ９８Ｓタンパク質の平均ＩＣ５０は２８ｐｇ／ｍｌであった。これらのデータを表４に要約する。
Figure 2011173911
実施例５のプロトコルＩＩを用いて精製した以下のムテインの生物活性を、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＤａｕｄｉ増殖阻害アッセイで測定した：Ｃ１Ｓ、Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｎ４５Ｃ、Ｆ４７Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｖ１０３Ｃ、Ｖ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｍ１１１Ｃ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１６３Ｃ、Ｋ１６４Ｃ、Ｅ１６５Ｃおよび＊１６６Ｃ。実測されたＩＣ５０を、同一実験で用いた野生型ｒＩＦＮ−αタンパク質のＩＣ５０と共に表５に列挙する。
Figure 2011173911
実施例７
ＩＦＮ−α２システイン・ムテインのＰＥＧ化
実施例３ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の手順を用いて、精製ＩＦＮ−α２システイン・ムテインをＰＥＧ化することができる。遊離システイン残基で精製ＩＦＮ−α２システイン・ムテインをモノＰＥＧ化することができる条件を特定するために、２種類の精製ＩＦＮ−α２システイン・ムテインについて小スケールのＰＥＧ化実験を行った。タンパク質の過還元は、タンパク質のアンフォールディングによる予想より大きな見かけ分子量へのシフト、または天然ジスルフィドの還元により生じるいくつもがＰＥＧ化された分子種の出現を探索する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。精製野生型およびｒＩＦＮ−α２ムテインＴ１０６ＣおよびＥ１０７Ｃの一部１μｇを、１０倍モル過剰のＴＣＥＰおよび２０倍モル過剰の５ｋＤＡａマレイミドＰＥＧと共に室温で１時間、ｐＨ８．５でインキュベートした。６０分後反応を止めてすぐに非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、両ムテインともこれらの条件下でモノＰＥＧ化タンパク質を与えた。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、モノＰＥＧ化タンパク質の見かけの分子量は約２８ｋＤａであった。野生型ｒＩＦＮ−α２には、これらの条件下で検出可能なＰＥＧ化は見られなかった。対照実験は、Ｔ１０６ＣおよびＥ１０７Ｃシステイン・ムテインをＰＥＧ化するには、ＴＣＥＰなどの還元剤で部分的に還元する必要があることを示した。これらのデータは、Ｔ１０６ＣおよびＥ１０７Ｃタンパク質に導入されたシステイン残基にＰＥＧ分子が結合することを示している。
大量のＩＦＮ−α２システイン・ムテインを様々なサイズのシステイン反応性ＰＥＧで修飾して精製すると生物活性測定に十分な材料を得ることができる。ＰＥＧ化タンパク質
の精製には、大量のＰＥＧ化反応を上述のように室温で１時間行い、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０で１０倍に希釈し、ｐＨ３．０に調整し、次いで、ｒＩＦＮ−α２ムテインの最初の精製について記載した条件と類似した条件を用いＳ−セファロース・カラム上に素早く載せなければならない。ＰＥＧ部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することを可能にしている。Ｓ−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、２本の主要なタンパク質ピークを示すはずである。早く溶出する主要ピーク（２３０ｍＭ未満のＮａＣｌ濃度で溶出する）はモノＰＥＧ化ＩＦＮ−αタンパク質のはずであり、これは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認することができる。５ｋＤａシステイン反応性ＰＥＧで修飾されたモノＰＥＧ化ＩＦＮ−α２の見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば約２８ｋＤａである。後に溶出する主要ピーク（約２３０ｍＭＮａＣｌで溶出する）は未反応ＩＦＮ−α２タンパク質のはずである。主にＰＥＧ−ＩＦＮ−α２を含有する早く溶出するピークからの分画をプールし、生物活性測定に使用することができる。精製ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２タンパク質の生物活性は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＤａｕｄｉ細胞アッセイで測定することができる。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて決定することができる。ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン・ムテインのインビボにおける生物活性は、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のように決定することができる。
Ｑ５ＣムテインのＰＥＧ化の場合は、精製タンパク質を１００ｍＭトリス、ｐＨ８でタンパク質１００μｇ／ｍｌまで希釈した。１５倍過剰の５ｋＤａ−マレイミドＰＥＧと、続いて１０〜１５倍モル過剰のＴＣＥＰを加える。ＥＤＴＡも加えて（０．５ｍＭの最終濃度）、タンパク質が部分的に還元されたときのジスルフィド形成を抑える。混合物を室温で２時間保つ。良好なＰＥＧ化効率も得られる代替法には、ＰＥＧおよびＴＣＥＰ試薬の繰返し添加が関係した。発明者らは、１０倍モル過剰のＰＥＧ試薬および１０倍モル過剰のＴＣＥＰを２時間にわたり３回添加すると、８０％を超すＰＥＧ化効率が得られることを見いだした。ＰＥＧおよびＴＣＥＰを繰り返し添加するこの後者の手順を用い、１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧで修飾したＱ５Ｃを調製することに成功した。実施例５に記載のＳ−セファロース・プロトコルを用いるイオン交換クロマトグラフィにより、ＰＥＧ化タンパク質を未反応のＱ５Ｃ出発材料およびＰＥＧ化試薬から分離した。他のイオン交換体（Ｑ、ＤＥＡＥ、ＣＭ）、ＨＩＣ樹脂（フェニル、ブチル）、アフィニティ・カラム、サイズ排除カラム、またはキレート樹脂などの代替法を用いてＰＥＧ化タンパク質を精製することができる。
１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の生物活性は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のＤａｕｄｉ細胞アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて決定した。１０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ、および４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の平均ＩＣ５０は、それぞれ７０ｐｇ／ｍｌ（Ｎ＝２アッセイ）、１００ｐｇ／ｍｌ（Ｎ＝８アッセイ）、および１０８ｐｇ／ｍｌ（Ｎ＝８アッセイ）であると決定された。
実施例８
野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）のクローニング、発現および精製
Ａ．Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列のクローニング。
Ｇ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを、ヒト膀胱癌細胞株５６３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から単離した全ＲＮＡからＰＣＲにより増幅した。１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した。Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から購入したＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＲＮ
Ａ単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成は、Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ製のＲＴ−ＰＣＲ用１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ９１（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ＞３；配列番号１）および逆方向プライマーＢＢ９２（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴ ＧＧＣＧＴＡＧ＞３；配列番号２）で行った。プライマーＢＢ９１は、Ｇ−ＣＳＦ分泌シグナル用のコード配列の５′末端とアニールし、逆方向プライマーＢＢ９２は、Ｇ−ＣＳＦコード配列の３′末端とアニールする。得られた約６４０ｂｐのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいＤＮＡ配列のクローン（Ｓｏｕｚａ他、１９８６；Ｎａｇａｔａ他、１９８６ａ、ｂ）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦｆｕｓまたはｐＢＢＴ１６５と名付けた。
ＰＣＲを用い、野生型Ｇ−ＣＳＦ（野生型）および天然に存在する１７位の遊離システインがセリンによって置き換えられた変異体（Ｃ１７Ｓ）の大腸菌における周辺質および細胞質発現のために、このＧ−ＣＳＦクローンを修飾した。野生型Ｇ−ＣＳＦタンパク質は５個のシステインを含有し、そのうち２個は重要なジスルフィド結合に関与し、部分的に覆い隠されている１個の遊離システイン（Ｃ１７）は活性に必要ではない（Ｉｓｈｉｋａｗａ他、１９９２、Ｋｕｇａ他、１９８９、Ｌｕ他、１９９２、Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ他、１９８８）。対になっていないシステインによる潜在的困難を避けるため、発明者らは、プラットフォーム分子として１７位におけるＣｙｓからＳｅｒへの置換を含む変異体（Ｃ１７Ｓ）を構築した。この後のシステイン・ムテインはすべて、Ｃ１７Ｓ置換が存在するもとで調製した。Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、野生型Ｇ−ＣＳＦと同一の生物活性を有することが報告されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ他、１９９２、Ｌｕ他、１９９２）。
分泌Ｇ−ＣＳＦは付加的Ｎ末端メチオニンを含んでおらず、天然に存在するＧ−ＣＳＦと同一のアミノ配列を有する（Ｓｏｕｚａ他、１９８６）。分泌型のＧ−ＣＳＦを発現させるために、ＰＣＲを用い、大腸菌の耐熱性エンテロトキシン（ＳＴＩＩ）遺伝子（Ｐｉｃｋｅｎ他、１９８３）のリーダー配列を成熟Ｇ−ＣＳＦのコード配列に融合させ、カルボキシ末端残基、Ｐ１７４の後ろにＴＡＡ終止コドンを付加した。同時に、Ｇ−ＣＳＦコード配列のアミノ末端部分も修飾した。２、５、および１０位のプロリンのコドンをすべてＣＣＧに変え、次の変異誘発手順を容易にするためにＴＴＡからＣＴＣにＬ１８コドンを変えることによってＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入した。
これらの構築は野生型およびＣ１７Ｓ遺伝子について並行して行い、続く３種類のＰＣＲ反応に用いた。Ｃ１７Ｓ構築物の場合には、第一の反応は、順方向プライマーＢＢ１１６（５＞ＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＧＡＴＣＣＡＧ＞３；配列番号３）および逆方向プライマーＢＢ１１４（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧ＞３；配列番号４）を用い、テンプレートしてクローン化Ｇ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを用いた。ＢＢ１１６は、成熟Ｇ−ＣＳＦのコード配列の５′末端とアニールし、コードされるアミノ酸を変化させないＰ２、Ｐ５、Ｐ１０，およびＬ１８における上述のコドン変化を導入する。ＢＢ１１６はまた、Ｃ１７Ｓ変異（ＴＧＣ＝＞ＡＧＣ）を導入し、１５位のロイシン・コドンを好ましいＣＴＧトリプレットに変化させる。ＢＢ１１４は、Ｇ−ＣＳＦコード配列の３′末端（１８ｂｐ）とアニールし、カルボキシ末端残基Ｐ１７４の直ぐ後にＴＡＡの翻訳終止コドンを導入する。ＢＢ１１４はまた、クローニング目的用のＥｃｏＲＩ部位を含む。野生型構築物の場合には、第一の反応は、順方向プライ
マーＢＢ１１７（５＞ＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＧＡＴＣＣＡＧ＞３；配列番号５）および逆方向プライマーＢＢ１１４（配列は上記のとおり）と、テンプレートとしてクローン化Ｇ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを用いた。ＢＢ１１７は、天然に存在するＣ１７コドン、ＴＧＣが存在し、使用されるＬ１５コドンがＣＴＴであることを除けばＢＢ１１６と同一である。このＣＴＴは、ＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位を生み出し、Ｃ１７Ｓ変異体から野生型Ｃ１７クローンを区別するための迅速かつ便利な方法を提供する。このＣ１７Ｓクローンは、１５位にＣＴＧコドンを有し、したがってＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位を欠く。これらの反応の各々からの約５３０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、第二のＰＣＲ反応用テンプレートとして用いた。
第二の反応用に、ゲル精製した約５３０ｂｐの産物を、順方向プライマーＢＢ１１５（５＞ＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧ＞３；配列番号６）および逆方向プライマーＢＢ１１４（配列は上記のとおり）で増幅した。ＢＢ１１５の３′部分（２７個のヌクレオチド）を、野生型とＣ１７Ｓ ＰＣＲ産物の双方と一致する成熟Ｇ−ＣＳＦの修飾コード配列の５′末端とアニールする。ＢＢ１１５の５′セグメント（３６個のヌクレオチド）はＳＴＩＩリーダー・ペプチドの部分をコードする。これらの二次反応の約５５０ｂｐの各ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰＣＲの第三および最終回用テンプレートとして用いた。
第三の反応では、約５５０ｂｐの各ゲル精製産物を、順方向プライマーＢＢ１１（５＞ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧ＞３；配列番号７）および逆方向プライマーＢＢ１１４（配列は上記のとおり）で増幅した。ＢＢ１１は、ＳＴＩＩリーダー・ペプチドの残部を付加し、ＳＴＩＩリーダーの開始ＡＴＧと重なるＮｄｅＩ部位ならびにクローニング目的用のＸｂａＩ部位を含む。これらの反応の約６２０ｂｐの産物をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化した配列決定用プラスミド・ベクターｐＢＣ−ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。
野生型構築物については、ｐＢＢＴ１８７と名付けた１種類のクローンが、ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦコード配列を含有する６２０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩセグメントに対する正しい配列を含んでいることが分かった。次いで、このフラグメントを、（ＮｄｅＩ＋ＥｃｏＲＩ）カット（ｃｕｔ）発現ベクターｐＣＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＢＴ１８８と名付けた。Ｃ１７Ｓ構築物の場合には、配列決定した３種類のクローンはいずれも正しい配列を含んでいないことが分かった。すべてが１個または複数の誤りを有していた。１種類のクローンは、ＳＴＩＩリーダーのＡ１０位に単一のミスセンス変異を含んでおり、６２０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩセグメントの配列の残部は正しかった。このクローンとプラスミドｐＢＢＴ１８８の間のインビトロにおける組換えを用い、ｐＣＹＢ１において正しい配列のＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）構築物を作成した。ｐＢＢＴ１８８とＳＴＩＩリーダーのＡ１０位に単一のミスセンス変異を含むＣ１７Ｓクローンを共に、ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。どちらか一方のプラスミド中に存在するＥｃｏＲＩ部位のみがＧ−ＣＳＦ翻訳終止コドンに続く部位である。ＢｓｉＷＩはまた、ＳＴＩＩリーダー・ペプチドのコード配列内の部位で、成熟Ｇ−ＣＳＦコード配列の先頭から７ｂｐを一度だけ切断する。したがって、ｐＢＢＴ１８８の約５３５ｂｐのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを正しいＣ１７Ｓ構築物配列を有する約５３５ｂｐのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと置き換えることにより、発明者らは、ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）コード配列を発現するｐＣＹＢ１誘導体を作成した。このプラスミドをｐＢＢＴ２２３と名付けた。
大腸菌中の細胞質発現の場合には、クローン化ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）遺伝子をＰＣＲによって修飾してＳＴＩＩリーダー配列を削除し、成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端アミノ酸（Ｔ１）のコドンの直ぐ前にイニシエータのメチオニン・コドン（ＡＴＧ）を付加した。配列が確認されたＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）クローンは、プライマーＢＢ１６６（５＞ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧ＞３；配列番号８）およびＢＢ１４４（配列は上記のとおり）で増幅した。ＢＢ１６６は成熟Ｇ−ＣＳＦのコード配列の５′末端にアニールし、成熟Ｇ−ＣＳＦの最初のアミノ酸の前のイニシエータ・メチオニンをコードする。ＡＴＧと重なり合うＮｄｅＩ部位がクローニング目的用に含まれていた。これらのＰＣＲ反応の約５４０ｂｐの産物をＮｄｅＩ部位の下流で約４００ｂｐを切断するＮｄｅＩとＡａｔＩＩで消化した。これらの約４００ｂｐのフラグメントをゲル精製し、ＮｄｅＩとＡａｔＩＩで切断された上述のｐＢＢＴ１８７、ｐＢＣ−ＳＫ（＋）：：ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ構築物中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼで処理してゲル精製した。１種類のＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ野生型および１種類のＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）クローンを配列決定し、両者とも正しい配列を含んでいることが分かった。これらのＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）遺伝子を、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、上述のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩカット発現ベクターｐＣＹＢ１中にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＢＴ２２５＝ｐＣＹＢ１：：Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦおよびｐＢＢＴ２２６＝ｐＣＹＢ１：：Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）と名付けた。
Ｂ．大腸菌における野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の発現。
Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ野生型をコードするｐＢＢＴ２２５、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）をコードするｐＢＢＴ２２６およびｐＣＹＢ１親ベクターを大腸菌ＪＭ１０９中にトランスフォームした。これらの菌株による実験の結果、Ｇ−ＣＳＦタンパク質が発現した。分泌したＧ−ＣＳＦの野生型およびＣ１７Ｓ形双方が優れているのは、それらが細胞質で発現したＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦタンパク質のＮ末端における非天然メチオニン残基を欠いているからである。
分泌Ｇ−ＣＳＦの発現には、ｐＢＢＴ１８８［ｐＣＹＢ１：：ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ］、ｐＢＢＴ２２３［ｐＣＹＢ１：：ＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）］および親ベクターｐＣＹＢ１を大腸菌Ｗ３１１０中にトランスフォームした。得られた菌株をＢＯＢ１３０：Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）、ＢＯＢ２１３：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１８８）、およびＢＯＢ２６８：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ２２３）と名付けた。予備的スクリーニング実験では、回転培養管中、３７℃で１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）中で一夜、菌株を培養した。飽和した前夜の培養液を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ中、Ａ６００で約０．０２５Ｏ．Ｄ．まで希釈し、振とうフラスコ中２８、３７、または４２℃でインキュベートした。通常どおり、培養液２５ｍｌを２５０ｍｌ振とうフラスコ中で培養した。培養液のＯ．Ｄ．が約０．３〜０．５に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えてＧ−ＣＳＦの発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後０、１、３、５および約１６時間に培養液をサンプリングした。誘導および非誘導培養液の試料を既製の１４％トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。ＢＯＢ２１３（野生型）とＢＯＢ２６８（Ｃ１７Ｓ）の誘導培養液は共に、約１９ｋＤａにバンドを示し、これは成熟Ｇ−ＣＳＦの分子量と一致する。このバンドは、ＢＯＢ２１３およびＢＯＢ２６８の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるＢＯＢ１３０の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。ウェスタン・ブロット分析は、ＢＯＢ２１３およびＢＯＢ２６８溶解物中の約１９ｋＤａのバ
ンドが抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗血清（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と強力に反応することを示した。この抗体は、ＢＯＢ２１３およびＢＯＢ２６８の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるＢＯＢ１３０の誘導および非誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタン・ブロットはまた、この約１９ｋＤａのバンドがＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した市販のヒトＧ−ＣＳＦ標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、ＳＴＩＩリーダー・ペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。実施例１０に示すＮ末端配列決定試験は、ＳＴＩＩシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。
２８℃および３７℃の培養液からの誘導後１６時間の試料を、ＫｏｓｈｌａｎｄおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ（１９８０）の手順に基づき浸透圧衝撃に供した。この手順は、大腸菌の外膜を破裂させ、周囲の培地中に周辺質の内容物を放出する。続く遠心分離により細胞質成分、不溶性周辺質成分、および細胞関連成分（ペレット中に回収される）から可溶性の周辺質成分（上清中に回収される）を分離する。両方の温度で、ＢＯＢ２１３による野生型、およびＢＯＢ２６８によるＣ１７Ｓのいずれの場合も、合成された一部のＧ−ＣＳＦタンパク質が上清中に回収されるが、Ｇ−ＣＳＦの大部分はペレットと結びついたままであった。このことは、タンパク質がプロセシングされ周辺質に分泌されたように見えるが、主に不溶性の形でそこに蓄積していることを示す。
Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＣ１７Ｓ変異体についての発現条件の予備的スクリーニングは、様々な条件下で両タンパク質が比較的満足に発現することを示した。大スケールの発現および精製の場合には、培養液を２８℃で培養し、約１６時間誘導した。
Ｃ．野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の精製。
野生型およびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を同一のプロトコルを用いてより大きなスケールで発現させて精製した。ＢＯＢ２１３（野生型）およびＢＯＢ２６８（Ｃ１７Ｓ）の新鮮な飽和一夜培養液を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ中にＡ６００おいて約０．０５ＯＤで接種した。通常、２Ｌのバッフル付き振とうフラスコ中で培養液４００ｍｌを２８℃で、ジャイロトリー・シェーカー用水浴中２５０ｒｐｍで培養した。培養液の密度が約０．５〜０．７ＯＤに達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えた。次いで、誘導培養液を約１６時間一夜インキュベートした。遠心分離により細胞をペレットにし、−８０℃で冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）のプロトコルに従ってＢ−ＰＥＲ（商標）細菌タンパク質抽出試薬５ｍＬで処理した。Ｇ−ＣＳＦタンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、Ｂ−ＰＥＲ中に懸濁した。この混合物をリゾチーム（２００μｇ／ｍｌ）で１０分間処理して細胞壁をさらに破壊し、ＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）およびプロテアーゼ非含有ＤＮＡｓｅ（２μｇ／ｍｌ）を加えた。不溶性のＧ−ＣＳＦを遠心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞の破片を除去した。不溶性のＧ−ＣＳＦを含有する得られたペレットを、２０ｍＭトリス・ベース中の８Ｍ尿素、２５ｍＭシステイン２０ｍｌに溶かした。この混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで４０ｍＭリン酸ナトリウム、４０μＭ硫酸銅、１５％グリセロール、ｐＨ８．０ １００ｍｌ中に希釈した。このリフォールド混合物を４℃に２日間保った。次いで、リフォールド混合物のｐＨを希ＨＣｌで４．０に調整し、混合物を遠心分離した後、４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ４．０（緩衝液Ａ）で平衡化したＳ−セファロース・カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｉ Ｔｒａｐ）５ｍｌ上に載せた。０〜１００％緩衝液Ｂ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）の線形塩グラジエントで結合したタンパク質を溶出した。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、塩濃度約３００〜３２５ｍＭ ＮａＣｌで単一の主ピークとしてＳ−セファロース・カラムから溶出した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりカラム分画を分析した。Ｇ−ＣＳＦを含有し目に見える不純物を含有しない分画
をプールした。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の最終的な収量をＢｒａｄｆｏｒｄ分析により測定すると、それぞれ培養液４００ｍｌから約１．１ｍｇおよび３．３ｍｇであった。精製野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元および非還元条件下で一緒に移動した。誘導および非誘導Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の見かけの分子量は、それぞれ約１９および１７ｋＤａであった。
Ｄ．野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）のインビトロにおける生物活性。
マウスＮＦＳ６０細胞株を用いる細胞増殖アッセイを開発し、野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の生物活性を測定した。ＮＦＳ６０細胞株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ ＴｅｎｎｅｓｓｅｅのＪ．Ｉｈｌｅ博士から入手した。この細胞株は、ヒトもしくはマウスのＧ−ＣＳＦまたはＩＬ−３に反応して増殖する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、１９８６）。この細胞を、１０％ＦＢＳ，５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１７〜１７０単位／ｍｌマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。バイオアッセイは、ＩＬ−３を除いた細胞維持培地中で行った。一般的に、ＮＦＳ６０細胞をＲＰＭＩ培地（添加物なし）で３回洗浄し、ＩＬ−３を除いた細胞維持培地中に０．５〜１×１０５／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁することによってバイオアッセイを開始した。細胞懸濁液５０μｌ（２．５〜５×１０３個の細胞）を、平底の９６ウエル組織培養プレートの試験ウエルに等分した。試験するタンパク質試料の段階希釈液をＩＬ−３を除いた維持培地中で調製した。組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（大腸菌による発現；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の段階希釈液を並行して分析した。希釈したタンパク質試料５０μｌを試験ウエルに加え、加湿した５％ＣＯ２組織培養インキュベータ中３７℃でプレートをインキュベートした。タンパク質試料は、三つ組みのウエル中でアッセイした。約４８〜７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２０μｌを各ウエルに加え、組織培養インキュベータ中３７℃で１〜４時間プレートをインキュベートした。マイクロプレート・リーダーを用いて４９０ｎｍでウエルの吸光度を読みとった。対照ウエルは培地を含み細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウエルの平均吸光度値を、試験ウエルについて得られた平均値から差し引いた。各試料について、ＥＣ５０、最大刺激半減濃度を算出した。
ＮＦＳ６０細胞株は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により明らかなように、Ｇ−ＣＳＦに対して強い増殖反応を示す。市販のＧ−ＣＳＦおよび発明者らにより調製されたＧ−ＣＳＦは、バイオアッセイにおいてそれぞれ１９および１０ｐｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０を有していた（表６）。意外にも、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は７ｐｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０を有しており、バイオアッセイにおいて再現性よく、発明者らの野生型Ｇ−ＣＳＦ標準品よりも１．５から２倍強力であり、市販の野生型Ｇ−ＣＳＦより約３倍強力であった（表３）。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は同一の活性を有すると報告されているため（Ｌｕ他、１９９２）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の活性が優れているのは意外であった。
実施例９
Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの構築、発現、精製および生物活性
Ａ．Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの構築
ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１ならびにＩｎｎｉｓ他（１９９０）およびＷｈｉｔｅ（１９９３）に記載の手順と類似した、部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発手順を用い、１５種類の変異Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を構築した。発明者らは、ヘリックスＡから近位のアミノ末端領域中の５種類のムテイン［＊−１Ｃ（天然アミノ末端へのシステイン残基の
付加）、Ｔ１Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ａ６ＣおよびＳ７Ｃ］；Ｂ−Ｃループ中の２種類のムテイン［Ｅ９３ＣおよびＳ９６Ｃ］；Ｃ−Ｄループ中の６種類のムテイン［Ａ１２９Ｃ、Ｔ１３３Ｃ、Ａ１３６、Ａ１３９Ｃ、Ａ１４１ＣおよびＳ１４２Ｃ］；およびヘリックスＤから遠位のカルボキシ末端領域中の２種類のムテイン［Ｑ１７３Ｃおよび＊１７５Ｃ（天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加）を構築した。Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインはすべて、野生型Ｇ−ＣＳＦ中の１７位に通常存在する無対のシステインによって引き起こされる可能性のある潜在的な困難および／またはあいまい性を避けるためにＣ１７Ｓバックグラウンドで構築した。Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、既に報告されているように完全な生物活性を有しており（Ｉｓｈｉｋａｗａ他、１９９２；Ｌｕ他、１９９２）、発明者らの大腸菌発現系においても、精製Ｃ１７Ｓの収率が精製野生型Ｇ−ＣＳＦの収率よりも高いことを発見している。さらに、インビトロにおけるアッセイでも、発明者らの組み換えＣ１７Ｓは、発明者らによって製造された野生型Ｇ−ＣＳＦおよび民間供給メーカー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）から入手した大腸菌発現による組み換え野生型Ｇ−ＣＳＦよりも活性である。
変異誘発性ＰＣＲ反応に用いるテンプレートは、ｐＢＢＴ２２３（実施例８に記載）由来のＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）遺伝子をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩカットｐＵＣ１８中にクローニングしたプラスミドｐＢＢＴ２２７とした。ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、これらと同一の制限酵素により切断されたｐＢＢＴ２２７ベクターＤＮＡと連結し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたＰＣＲフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびＰＣＲ反応または合成オリゴヌクレオチド・プライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。
システイン置換変異Ｌ３Ｃは、以下のように構築した。変異誘発性順方向・オリゴヌクレオチドＢＢ１７２（５＞ＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣ＞３；配列番号９）は、成熟Ｇ−ＣＳＦの３位にあるロイシン用のコドンＣＴＧをシステインをコードするＴＧＴに変え、すぐ近くのＭｌｕＩ部位に橋を架けるように設計した。このオリゴを、ｐＢＢＴ２２７中で成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基２１〜２７をコードするＤＮＡ配列にアニールする逆方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１８８（５＞ＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＡＣＧ＞３；配列番号１０）と共にＰＣＲで用いた。ＰＣＲ反応１００μｌは、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．４μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ２２７（上記）３ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２．５単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．５単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中で行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクルおよび４℃保持とした。ＰＣＲ反応物のアリコート１０μｌをアガロース・ゲル電気泳動で分析し、予想サイズ約１００ｂｐの単一フラグメントを生成することが分かった。反応物の残りを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従って「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢＢＴ２７７と消化生成物を連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。Ｌ３Ｃ変異および約７０ｂｐのＭｌｕＩ−ＸｈｏＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定
した。
置換変異Ｔ１Ｃは、Ｌ３Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｔ１のＡＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変え、すぐ近くのＭｌｕＩ部位に橋を架ける変異誘発性オリゴヌクレオチドＢＢ１７１（５＞ＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣ＞３；配列番号１１）をＢＢ１７２の代わりにＰＣＲ反応で用いた。
置換変異Ｑ１７３Ｃは、Ｌ３Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｑ１７３のＣＡＧコドンをシステインのＴＧＴコドンに変え、すぐ近くのＥｃｏＲＩ部位に橋を架ける変異誘発性逆方向・オリゴヌクレオチドＢＢ１８５（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧ＞３；配列番号１２）をＢＢ１７２の代わりにＰＣＲ反応で用いた。ｐＢＢＴ２２７中で成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基７８〜８４をコードするＤＮＡ配列にアニールする順方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１８７（５＞ＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＡＣＧ＞３；配列番号１３）を、ＢＢ１８８の代わりに用いた。ＰＣＲ反応物のアリコート１０μｌをアガロース・ゲル電気泳動で分析し、予想サイズ約３００ｂｐの単一フラグメントを生成することが分かった。反応物の残りを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従って「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＳｔｙＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を１．５％アガロース・ゲル上に展開し、約２２０ｂｐの当該ＳｔｙＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってゲル精製した。ゲル精製したフラグメントを、ＳｔｙＩおよびＥｃｏＲＩで切断されたｐＢＢＴ２２７と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。Ｑ１７３Ｃ変異および約２２０ｂｐのＳｔｙＩ−ＥｃｏＲＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
Ｇ−ＣＳＦコード配列のカルボキシ末端アミノ酸の後ろにシステインを付加した変異も構築した。＊１７５Ｃと呼ぶこの変異体は、Ｑ１７３Ｃ変異体の構築について上記に記載したプロトコルを用いて構築したが、以下の相違点を有している。Ｐ１７４のＣＣＣコドンとＴＡＡ終止コドンの間にシステインのＴＧＴコドンを挿入し、すぐ近くのＥｃｏＲＩに橋を架ける変異誘発性オリゴヌクレオチドＢＢ１８６（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ＞３；配列番号１４）をＢＢ１８５の代わりにＰＣＲ反応で用いた。
置換変異Ａ６Ｃは、Ｈｏｒｔｏｎ他（１９９３）およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のように「オーバーラップ・エクステンション（ｏｖｅｒｌａｐ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）による変異誘発」の技術を用いて構築した。Ａ６Ｃ構築の最初の、すなわち「一次」ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．４μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ２２７ １ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．５単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．２５単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中、反応体積５０μｌで行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクルおよび４℃保持とした。用いたプライマー対は、［ＢＢ１７３×ＢＢ１８
８］および［ＢＢ１７４×ＢＢ１２５］とした。ＢＢ１８８（５＞ＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＡＣＧ＞３；配列番号１０）はｐＢＢＴ２２７中で成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基２１−２７をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ１２５（５＞ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＡ＞３；配列番号１７）は、クローン化Ｇ−ＣＳＦ配列の約２０ｂｐ上流のｐＵＣ１８ベクター配列にアニールする。ＢＢ１７３およびＢＢ１７４は、Ａ６のＧＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。ＢＢ１７３の配列は（５＞ＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧ＞３；配列番号１５）であり、ＢＢ１７４の配列は、（５＞ＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧ＞３；配列番号１６）である。ＰＣＲ産物を２％アガロース・ゲル上で展開すると、［ＢＢ１７３×ＢＢ１８８］および［ＢＢ１７４×ＢＢ１２５］ＰＣＲ反応で［ＢＢ１７３×ＢＢ１８８］については約８０ｂｐおよび［ＢＢ１７４×ＢＢ１２５］については約１４０ｂｐである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロース・ゲル切片から一緒に溶出し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）３０μｌ中に回収した。次いで、これら２種類の変異誘発されたフラグメントを、次の、すなわち「二次」ＰＣＲ反応で一緒に「スプライシング」した。この反応では、ゲル精製した一次反応のＰＣＲ産物３μｌをテンプレートとして用い、ＢＢ１２５およびＢＢ１８８をプライマーとして用いた。反応体積は１００μｌとし、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．５単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次ＰＣＲのアリコートをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、予想した約１９０ｂｐのバンドを観察した。二次ＰＣＲ反応の全体を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢＢＴ２２７と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、Ａ６Ｃ変異を含み約１３０ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｓ７Ｃは、Ａ６Ｃについて上記に記載したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｓ７のＡＧＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ１７５（５＞ＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧ＞３；配列番号１８）およびＢＢ１７６（５＞ＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧ＞３；配列番号１９）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。
成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端残基Ｔ１のコドンの前にシステイン・コドンを付加した変異を構築し、配列確認した。＊−１Ｃと呼ぶこの変異は、Ａ６Ｃの構築について上記に記載したプロトコルを用いて構築したが、以下の相違点を有している。ＳＴＩＩリーダー配列のカルボキシ末端残基のＧＣＡコドンとｐＢＢＴ２２７中の成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端残基のＡＣＣコドンとの間にシステインのＴＧＣコドンを挿入する相補的変異誘発性プライマーＢＢ２０６（５＞ＡＡＣＣＣＧＴＡＣＧＣＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣ＞３；配列番号２０）およびＢＢ２０７（５＞ＧＣＣＣＡＧＣＧＧＧＧＴＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＴ＞３；配列番号２１）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。一次ＰＣＲ反応は、反応体積２０μｌで行った。各プライマーは０．５μＭ存在させた。反応物には、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ２２７ ０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ２単位、およびＰｆｕポリメラーゼ０．２５単位が含ま
れていた。反応プログラムは、９５℃３分、［９４℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクルおよび４℃保持とした。一次反応の産物は、調製用２％アガロース・ゲル上に直接ロードした。一次反応により、［ＢＢ２０６×ＢＢ１８８］については約１００ｂｐおよび［ＢＢ２０７×ＢＢ１２５］については約１２５ｂｐである予想サイズの産物が得られた。二次ＰＣＲでは、反応体積を１００μｌとし、ゲル精製した一次反応のＰＣＲ産物５μｌをテンプレートとして用い、ＢＢ１８７およびＢＢ１２６をプライマーとして用い、Ｔａｑポリメラーゼ４単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．２５単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。
置換変異Ａ１２９Ｃは、Ａ６Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。一次ＰＣＲ反応は、プライマー対［ＢＢ１７７×ＢＢ１２６］および［ＢＢ１７８×ＢＢ１８７］を用いた。逆方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１２６（５＞ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ＞３；配列番号２２）は、クローン化Ｇ−ＣＳＦ配列の約４０ｂｐ下流のｐＵＣ１８ベクター配列にアニールする。順方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１８７（５＞ＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＡＣＧ＞３；配列番号１３）は、ｐＢＢＴ２２７中で成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基７８〜８４をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ１７７およびＢＢ１７８は、Ａ１２９ＣのＧＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。ＢＢ１７７の配列は（５＞ＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣ＞３；配列番号２３）であり、ＢＢ１７８の配列は（５＞ＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣ＞３；配列番号２４）である。一次反応の産物からは、［ＢＢ１７７×ＢＢ１２６］については約２２０ｂｐおよび［ＢＢ１７８×ＢＢ１８７］については約１７０ｂｐである予想サイズの産物が得られた。二次ＰＣＲは、ＢＢ１８７およびＢＢ１２６をプライマーとして用い、予想サイズ約３６０ｂｐの産物を生成した。この産物を供給メーカーのプロトコルに従いＳｔｙＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、ＳｔｙＩ−ＥｃｏＲＩで切断されたｐＢＢＴ２２７と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、Ａ１２９Ｃ変異を含み約２３０ｂｐのＳｔｙＩ−ＥｃｏＲＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｔ１３３Ｃは、Ａ１２９Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｔ１３３のＡＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ１７９（５＞ＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＴＧ＞３；配列番号２５）およびＢＢ１８０（５＞ＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣ＞３；配列番号２６）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。一次反応の産物からは、［ＢＢ１７９×ＢＢ１２６］については約２０５ｂｐおよび［ＢＢ１８０×ＢＢ１８７］については約１８０ｂｐである予想サイズの産物が得られた。
置換変異Ａ１３９Ｃは、Ａ１２９Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ａ１３９のＧＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ１８１（５＞ＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴ＞３；配列番号２７）およびＢＢ１８２（５＞ＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＣ＞３；配列番号２８）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。一次反応の産物からは、［ＢＢ１８１×ＢＢ１２６］については約１８５ｂｐおよび［ＢＢ１８２×ＢＢ１８７］については約２００ｂｐである予想サイズの産物が得られた。
置換変異Ｓ１４２Ｃは、Ａ１２９Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｓ１４２のＴＣＴコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ１８３（５＞ＣＣＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣ＞３；配列番号２９）およびＢＢ１８４（５＞ＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧ＞３；配列番号３０）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。一次反応の産物からは、［ＢＢ１８３×ＢＢ１２６］については約１８０ｂｐおよび［ＢＢ１８４×ＢＢ１８７］については約２１０ｂｐである予想サイズの産物が得られた。
置換変異Ａ１３６Ｃは、Ａ１２９Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ａ１３６のＧＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ２２４（５＞ＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＣ＞３；配列番号３１）およびＢＢ２２５（５＞ＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧ＞３；配列番号３２）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ１７３およびＢＢ１７４と置き換えた。一次ＰＣＲ反応は、反応体積２０μｌで行った。各プライマーは０．５μＭ存在した。反応物には、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ２２７ ０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ２単位、およびＰｆｕポリメラーゼ０．２５単位が含まれていた。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９５℃３分、［９４℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクルおよび４℃保持とした。一次反応の産物は、調製用２％アガロース・ゲル上に直接ロードした。一次反応の産物からは、［ＢＢ２２４×ＢＢ１２６］については約１９５ｂｐおよび［ＢＢ２２５×ＢＢ１８７］については約１９０ｂｐである予想サイズの産物が得られた。二次反応では、反応体積を１００μｌとし、ゲル精製した一次反応のＰＣＲ産物５μｌをテンプレートとして用い、ＢＢ１８７およびＢＢ１２６をプライマーとして用い、Ｔａｑポリメラーゼ４単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．２５単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。
置換変異Ａ１４１Ｃは、Ａ１３６Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ａ１４１のＧＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ２２６（５＞ＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧ＞３；配列番号３３）およびＢＢ２２７（５＞ＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴ＞３；配列番号３４）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ２２４およびＢＢ２２５と置き換えた。一次反応の産物からは、［ＢＢ２２６×ＢＢ１２６］については約１８０ｂｐおよび［ＢＢ２２７×ＢＢ１８７］については約２０５ｂｐである予想サイズの産物が得られた。
置換変異Ｅ９３Ｃは、「オーバーラップ・エクステンションによる変異誘発」の技術を用いて構築した。Ｅ９３Ｃ構築の一次ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．５μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ２２７ ０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．２５単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中、反応体積２０μｌで行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９５℃３分、［９４℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクルおよび４℃保持とした。用いたプライマー対は、［ＢＢ２１８×ＢＢ２１１］および［ＢＢ２１９×ＢＢ２１０］とした。逆方向の非変異誘発性プライマーＢＢ２１１（５＞ＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴ＞３；配列番号３５）は、ｐＢＢＴ２２７中で成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸残基１２１−１２７をコード
するＤＮＡ配列にアニールする。順方向の非変異誘発性プライマーＢＢ２１０（５＞ＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣ＞３；配列番号３６）は、ｐＢＢＴ２２７中でＳＴＩＩリーダー・ペプチドのアミノ酸残基１３〜２０をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ２１８およびＢＢ２１９は、Ｅ９３のＧＡＡコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。ＢＢ２１８の配列は（５＞ＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＣ＞３；配列番号３７）であり、ＢＢ２１９の配列は、（５＞ＧＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧ＞３；配列番号３８）である。一次反応の産物を、調製用２％アガロース・ゲル上に直接ロードすると、ＰＣＲ反応により［ＢＢ２１８×ＢＢ２１１］については約１１５ｂｐおよび［ＢＢ２１９×ＢＢ２１０］については約３２５ｂｐである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロース・ゲル切片から一緒に溶出し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）３０μｌ中に回収した。二次ＰＣＲ反応では、ゲル精製した一次反応のＰＣＲ生成物プール５μｌをテンプレートとして用い、ＢＢ２１１およびＢＢ２１０をプライマーとして用いた。反応体積は１００μｌとし、Ｔａｑポリメラーゼ４単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．２５単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次ＰＣＲのアリコートをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、予想した約４１５ｂｐのバンドを観察した。二次ＰＣＲ反応の全体を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＳｔｙＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、ＳｔｙＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢＢＴ２２７と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、Ｅ９３Ｃ変異を含み約２６０ｂｐのＳｔｙＩ−ＸｈｏＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｓ９６Ｃは、Ｅ９３Ｃについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Ｓ９６のＴＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異誘発性プライマーＢＢ２２０（５＞ＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＧＧＴ＞３；配列番号３９）およびＢＢ２２１（５＞ＡＣＣＣＡＡＣＴＣＧＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧ＞３；配列番号４０）を、それぞれ一次ＰＣＲ反応におけるＢＢ２１８およびＢＢ２１９と置き換えた。一次反応の産物からは、［ＢＢ２２０×ＢＢ２１１］については約１１０ｂｐおよび［ＢＢ２２１×ＢＢ２１０］については約３３０ｂｐである予想サイズの産物が得られた。
周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現するには、ムテインをコードするＳＴＩＩ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）遺伝子を、約６００ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ１８ベースのｐＢＢＴ２２７誘導体から切り取り、ｐＣＹＢ１発現ベクター中にサブクローニングし、大腸菌Ｗ３１１０中に形質転換した。
本明細書に記載した手順に類似した手順を用い、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の他のシステイン・ムテインを一般的に構築することができる。システイン・ムテインは、Ｇ−ＣＳＦコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換える置換変異、Ｇ−ＣＳＦコード配列中の天然に存在する２個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはＧ−ＣＳＦコード配列の一番目のアミノ酸Ｔ１の前にシステイン残基を付加する、もしくはＧ−ＣＳＦコード配列の末端アミノ酸残基Ｐ１７４の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置
き換えても、またはＧ−ＣＳＦコード配列中のどこか、２個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。Ｇ−ＣＳＦにシステイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスＡ、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループに先行する領域、およびＤヘリックスから遠位の領域中である。他の好ましい部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤヘリックスの最初または最後の３個のアミノ酸である。上述した変異の他に、システイン置換を作成するためにこれらの領域中で好ましい他の残基は、Ｐ２、Ｇ４、Ｐ５、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｔ３８、Ｋ４０、Ｓ５３、Ｇ５５、Ｉ５６、Ｗ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｌ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｑ７０、Ａ７２、Ｑ９０、Ａ９１、Ｌ９２、Ｇ９４、Ｉ９５、Ｓ９６、Ｅ９８、Ｇ１００、Ｇ１２５、Ｍ１２６、Ａ１２７、Ｑ１３１，Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｑ１４５、およびＰ１７４である。本実施例に記載の変異体はすべて、天然タンパク質配列または天然に存在する「遊離」システイン残基（システイン−１７）が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変えられた変異体タンパク質であるという状況で提供される。
一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するＧ−ＣＳＦ中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は今や遊離である。システイン残基は、他の１９個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。これらの変異体は、天然タンパク質配列または天然に存在する「遊離」システイン残基（システイン−１７）が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変えられた変異体タンパク質であるという状況で提供される。遊離システイン残基はまた、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ他（１９９８）によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってＧ−ＣＳＦに導入することもできる。
実施例８、９、１０、１１および１３に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にタンパク質を大腸菌中で発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をＰＥＧ化し、インビトロおよびインビボにおけるバイオアッセイでそれらの生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然Ｇ−ＣＳＦシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。
Ｂ．Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの発現および精製。
１３種類のＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）ムテイン（＊−１Ｃ、Ｔ１Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ａ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｅ９３Ｃ、Ａ１２９Ｃ、Ｔ１３３Ｃ、Ａ１３６Ｃ、Ａ１３９Ｃ、Ａ１４１Ｃ、Ｑ１７３Ｃ、および＊１７５Ｃ）を発現する大腸菌株を培養し、ＢＯＢ２１３（野生型）およびＢＯＢ２６８（Ｄ１７Ｓ）の場合に用いた実施例８に記載のプロトコルを用いて誘導し、採取した。ムテインはすべて極めて不溶性であった。Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）について実施例８に記載したプロトコルを用いてムテインをリフォールディングして精製した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１３種類の精製システイン・ムテインが主に単量体として回収され、約１７ｋＤａで移動することを示した。精製ムテインは、野生型Ｇ−ＣＳＦよりわずかに遅く移動する＊−１Ｃムテインを除き、野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）と同時に移動した。１種類だけ除いてすべてのムテインは、野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）に類似した塩濃度でイオン交換カ
ラムから溶出した。一つの例外Ｅ９３Ｃは、グラジエント中の後半で（ＮａＣｌ濃度約４００ｍＭ）溶出したが、これは荷電アミノ酸であるグルタミン酸でシステインを置換したためと思われる。
Ｃ．Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの生物活性。
１３種類の精製Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインは、実施例８に記載のＮＦＳ６０細胞増殖アッセイでアッセイした。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ・キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。市販の野生型Ｇ−ＣＳＦならびに発明者らによって調製された野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。１３種類のムテインはすべて、アッセイの誤差の範囲内で野生型Ｇ−ＣＳＦ対照タンパク質と同程度にＮＦＳ６０細胞の増殖を刺激した。１３種類のムテインの平均ＥＣ５０は、５〜９ｐｇ／ｍｌの範囲であった。システイン・ムテインの平均ＥＣ５０は、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）対照タンパク質の平均ＥＣ５０に類似しており、発明者らの野生型Ｇ−ＣＳＦ対照タンパク質の平均ＥＣ５０に比べて１．５から２分の１、すなわちより強力であり、市販の野生型Ｇ−ＣＳＦタンパク質の平均ＥＣ５０に比べて約３分の１であった。これらのデータを表６に要約する。
Figure 2011173911
Ｄ．Ｇ−ＣＳＦ二重システイン変異体の構築
２個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、実施例９、１４および１５に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは２個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、ＰＥＧ化された場合に各々が高活性を維持する２個以上のシステイン・ムテインが組み合わされた変異体であろう。その例は、Ｌ３ＣプラスＴ１３３Ｃ、Ｌ３Ｃプラス＊１７５Ｃ、ならびにＴ１３３Ｃおよび＊１７５Ｃであろう。他の好ましい多重変異体は、表３お
よび表４からのデータに基づいて推論でき、Ｌ３Ｃ、Ｔ１３３Ｃ、Ａ１４１Ｃおよび＊１７５Ｃからなる群から選択される２個以上の変異を含有する組合せが含まれるであろう。
発明者らは、以下のＧ−ＣＳＦ二重システイ・ムテイン：Ｌ３Ｃ／Ｔ１３３Ｃ、Ｌ３Ｃ／＊１７５Ｃ、およびＴ１３３Ｃ／＊１７５Ｃを構築した。Ｌ３Ｃ／Ｔ１３３Ｃを製造するためには、ｐＢＢＴ２２７のＬ３Ｃ誘導体（ｐＵＣ１８中のＧ−ＣＳＦ Ｃ１７Ｓ）をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼで処理した。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップ・キットを用いて抽出し、Ｇ−ＣＳＦ Ｌ３Ｃ Ｘ−Ｒ１−Ｃｉｐベクターと呼ぶ。次に、ｐＢＢＴ２２７のＴ１３３Ｃ誘導体をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、約４８０ｂｐのフラグメントをゲル精製し、Ｇ−ＣＳＦ
Ｌ３Ｃ Ｘ−Ｒ１−Ｃｉｐベクターと連結した。連結反応で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。
Ｌ３Ｃ／＊１７５Ｃを製造するためには、ｐＢＢＴ２２７の＊１７５Ｃ誘導体をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、約４８０ｂｐのフラグメントをゲル精製し、Ｇ−ＣＳＦ Ｌ３Ｃ Ｘ−Ｒ１−Ｃｉｐベクター（上記参照）と連結した。連結反応で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。
Ｔ１３３Ｃ／＊１７５Ｃを製造するためには、ｐＢＢＴ２２７のＴ１３３Ｃ誘導体は、逆方向変異誘発性オリゴヌクレオチド・プライマーＢＢ１８６（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ＞３；配列番号１４）およびＧ−ＣＳＦ挿入の上流のｐＵＣ１８ベクター配列にアニールする順方向非変異誘発性オリゴヌクレオチドＢＢ１２５を用いるＰＣＲ反応におけるテンプレートの役割を果たした。ＰＣＲは５０μｌ反応で、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．４μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・フラグメント０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．１単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中で行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９５℃５分、［９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒］２２サイクル、７２℃保持７分および４℃保持とした。ＰＣＲ２０μｌをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、約６３０ｂｐのフラグメントをゲルから単離した。このフラグメントをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップ・キットを用いて抽出した。このＤＮＡを、ｐＢＢＴ２２７のＴ１３３Ｃ誘導体をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによって調製したベクターに連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼで処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップ・キットを用いて抽出した。連結反応で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。
実施例１０
Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインのＰＥＧ化、精製および生物活性
Ａ．予備的ＰＥＧ化試験。
最初のＰＥＧ化反応条件は、試験タンパク質としてＴ１Ｃ、還元剤としてＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン］−ＨＣｌ、およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．製の５ｋＤａシステイン反応性ＰＥＧを用いて決定した。タンパク質の過還元は、タンパク質のアンフォールディングによる予想より大きな見かけ分子量へのシフト、または天然ジスルフィドの還元により生じるいくつもがＰＥＧ化された分子種の出現を探索する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。精製Ｔ１Ｃのアリコート１μｇを、様々な過剰量の５ｋＤＡマレイミド−ＰＥＧまたは５ｋＤａビニルスルホン−ＰＥＧの存在下で１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中室温でＴＣＥＰ濃度を増加させな
がらインキュベートした。６０分後、反応物を直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。野生型Ｇ−ＣＳＦを修飾することなく有意な量のモノＰＥＧ化Ｔ１Ｃタンパク質を与えたＴＣＥＰおよび特定のＰＥＧ試薬の量を、他の実験に使用した。滴定実験は、ｐＨ８．５では、１０倍モル過剰のＴＣＥＰおよび２０倍過剰の５ｋＤＡマレイミドＰＥＧにより、ジまたはトリＰＥＧ化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノＰＥＧ化Ｔ１Ｃタンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量２８ｋＤａ）が得られたことを示した。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は同一のＰＥＧ化条件で修飾されなかった。これらの反応条件を用い、他のＧ−ＣＳＦムテインのＰＥＧ化をスケール・アップした。対照実験は、Ｔ１Ｃタンパク質をＰＥＧ化するには、ＴＣＥＰなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があることを示した。
Ｂ．ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの調製および精製
１３種類の精製Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインのアリコート２００から３００μｇを５ｋＤａマレイミドＰＥＧでＰＥＧ化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大規模のＰＥＧ化反応はまた、上述の条件を用いて室温で１時間行った。これらの反応条件により、すべてのムテインについてモノＰＥＧ化タンパク質が得られた。モノＰＥＧ化ムテインのうち１１種類は、以下に記載する手順を用いて精製した。反応時間の終了時に、ＰＥＧ化混合物を４０ｍＭリン酸ナトリウム（一塩基）で１０倍に希釈し、ｐＨを４．０に調製した後、Ｇ−ＣＳＦムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件（２０ｍＬグラジエント、４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ４に溶かした０〜０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用い、Ｓ−セファロース・カラム（１ｍＬ、ＨｉＴｒａｐ）上に素早く載せた。ＰＥＧ部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することを可能にしている。Ｓ−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、大部分のムテインについて約２７５ｍＭ ＮａＣｌおよび３００〜３２５ｍＭ ＮａＣｌで溶出する２本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）ムテインであると決定した。後に溶出する主要ピークは、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）ムテインであると決定した。ＰＥＧ−Ｅ９３Ｃムテインは約３２５ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、これに対して未反応Ｅ９３Ｃタンパク質の場合は約４００ｍＭ ＮａＣｌであった。モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）ムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。５種類のシステイン・ムテイン（Ｌ３Ｃ、Ｔ１３３Ｃ、Ａ１４１Ｃ、Ｑ１７３Ｃおよび＊１７５Ｃ）もまた、２０ｋＤａ ＰＥＧ−マレイミドならびに上述のＰＥＧ化および精製手順を用いてＰＥＧ化した。２０ｋＤａ−ＰＥＧ化タンパク質は、約２５０ｍＭ ＮａＣｌでＳ−セファロース・カラムから溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製ＰＥＧ化タンパク質が１０％未満およびおそらく５％未満の非ＰＥＧ化タンパク質を含んでいることを示した。システイン・ムテインをＰＥＧ化するには、ＴＣＥＰなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があった。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は同一の部分還元条件ではＰＥＧ化されず、ムテインに導入されたシステイン残基にＰＥＧ部分が結合していることを示している。
Ｃ．Ｌ３Ｃ Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの精製およびＰＥＧ化
Ｌ３Ｃについて、リフォールドおよびＰＥＧ化反応の時間的経過を追った。この特定ムテインのリフォールドは、４時間までに完了することが分かった。リフォールド反応の進行は、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム）によりモニターした。収量は、実施例８に記載のように培養した培養液４００ｍＬ当たり約１０ｍｇであった。１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび４０ｋＤａ ＰＥＧでＬ３ＣムテインのＰＥＧ化について時間的経過を追った。０．５ｍＭ ＥＤＴＡをＰＥＧ化緩衝液に含有させたことを除いて、ＰＥＧ化反応条件は、実施例１０で上述した通りとした。反応物０．５〜１ｍｇの場合には、室温で２〜４時間の長い反応時間で多量のＰＥＧ化生成物が得られた。ＰＥＧ化の効率は、時間延長で約８０％であった。大量の（５ｍｇまで）ＰＥＧ化反応を同等な効率で行った。実施例１０で既に記
載した精製方法を用い、Ｓ−セファロース・カラム５ｍＬ上の非ＰＥＧ化タンパク質からＰＥＧ化タンパク質を精製した。２０ｋＤａのＰＥＧ化タンパク質は、約２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、４０ｋＤａ−ＰＥＧタンパク質および１０ｋＤａ−ＰＥＧタンパク質は、それぞれ約１５０ｍＭおよび約２２０ｍＭで溶出した。非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｌ３Ｃムテインは、約２６０ｍＭで溶出した。ＥＤＴＡの存在は、ＰＥＧ化反応におけるタンパク質二量体の生成を有意に減少させた。
Ｄ．２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ３ＣのＮ末端配列決定。
天然Ｇ−ＣＳＦのＮ末端アミノ酸はスレオニンである（Ｓｏｕｚａ他、１９８６）。自動Ｅｄｍａｎ分解化学反応を用いる精製２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ３Ｃタンパク質のＮ末端配列決定により配列ＴＰＸＧＰＡＳが得られ、Ｎ末端が正しくプロセシングされＰＥＧ化された３番目の残基と一致していることを示している。ＰＥＧ化アミノ酸は、Ｘによって示されるように、配列決定の実行ではブランクとして出現する。
Ｅ．円二色性（ＣＤ）分析によるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの構造決定
ＣＤ分析は、光路長１ｃｍの３００μｌセル中、周囲温度でＪａｓｃｏ ７２０ ＣＤ分光偏光計で行った。データは、感度５０ｍ゜および３２回の積算により２６０ｎｍ〜２００ｎｍから集めた。最初の実験は、Ｌ３Ｃムテインおよび１０Ｋ ＰＥＧ−Ｌ３Ｃタンパク質について行った。どちらも野生型Ｇ−ＣＳＦについて文献に見られるスペクトルと極めて類似したＣＤスペクトルを有していた。同様の分析は、他のＧ−ＣＳＦシステイン・ムテインおよびそれらのＰＥＧ化誘導体に対しても行うことができる。
Ｆ．ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの生物活性：１１種類の精製５ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインおよび５種類の精製２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの生物活性は、実施例８に記載のＮＦＳ６０細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて測定した。すべてのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインは類似の用量反応曲線を示し、アッセイの誤差の範囲内でＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）と同じレベルの最大増殖刺激に達した。５ｋＤａ−ＰＥＧ修飾システイン・ムテインの平均ＥＣ５０は、２〜１１ｐｇ／ｍｌの範囲であった。これらのＰＥＧ化ムテインは、バイオアッセイにおいて、発明者らの野生型Ｇ−ＣＳＦよりも１．５から２倍強力であり、市販の野生型Ｇ−ＣＳＦよりも約３倍強力であった。２０ｋＤａ−修飾システイン・ムテインの平均ＥＣ５０は、９〜１４ｐｇ／ｍｌの範囲であった。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの生物活性は、野生型Ｇ−ＣＳＦの生物活性に等しいか、優れていた。５ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ３ＣのＮＦＳ６０細胞刺激活性はすべて、Ｇ−ＣＳＦに対する中和モノクローナル抗体（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）によって取り除かれると考えられ、成長促進活性がタンパク質調製物中の不純物ではなくＰＥＧ−Ｌ３Ｃ Ｇ−ＣＳＦタンパク質によるものであることを示している。生物活性データを表７に要約する。４０ｋＤａ−ＰＥＧで修飾したＬ３ＣのＥＣ５０をＮＦＳ６０細胞増殖アッセイを用いて測定すると、３０〜５０ｐｇ／ｍｌであった。
本明細書に記載のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）システイン・ムテインの生物活性は、そのすべてが野生型Ｇ−ＣＳＦに比べて低下した生物活性を有している既に記載したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦタンパク質（Ｔａｎａｋａ他、１９９１；Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他、１９９６ａ；Ｂｏｗｅｎ他、１９９９）の活性より優れている。Ｔａｎａｋａ他（１９９１）は、アミン反応性１０ｋＤａ ＮＨＳ−ＰＥＧで修飾したＧ−ＣＳＦが、様々なリジン基またはＮ末端アミノ酸において修飾された複数の分子量の分子種および複数のアイソフォームからなっていると報告した。このＮＨＳ−ＰＥＧ混合物の生物活性を測定すると、非修飾Ｇ−ＣＳＦに比べて約３分の１に低下していた（Ｔａｎａｋａ他、１９９１；Ｓａｔａ
ｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａ他、１９９２）。Ｂｏｗｅｎ他（１９９９）は、５ｋＤａ−、１０ｋＤａ−および２０ｋＤａ−アミン反応性ＰＥＧで修飾したＧ−ＣＳＦ変異体は、非修飾Ｇ−ＣＳＦに比べて約６分の１、１０分の１、２０分の１に低下したと報告した。Ｂｏｗｅｎ他（１９９９）は、２０ｋＤａ−アミン反応性ＰＥＧで修飾したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の単一分子量分子種を精製し、その生物活性が非修飾Ｇ−ＣＳＦに比べて約４分の１に低下していることを見いだした。Ｂｏｗｅｎ他（１９９９）によって単離された単一分子量分子種は単一ＰＥＧ分子で修飾されたＧ−ＣＳＦ変異体に対応するが、複数の部位でタンパク質に結合したＰＥＧ分子のためにＰＥＧタンパク質調製物は不均一であった。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（１９９６）は、アミンまたはアミド結合を介して、大腸菌発現のＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（細胞質中発現）の非天然アミノ末端メチオニン残基において優先的に修飾されるＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ分子種を精製した。このＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、野生型Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのインビトロにおける生物活性の６８％を有しているに過ぎなかった（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他、１９９６）。
Figure 2011173911
実施例１１
システイン・ブロッキング剤の使用は、適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦシステイン・ムテインの回収率を改善する
不溶性、大腸菌発現野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）は、触媒量の硫酸銅の存在下および非存在下に還元剤の量およびタイプを変化させる手順によってリフォールディングした。Ｇ−ＣＳＦについての最適化リフォールド・プロトコル（Ｋｕｇａ他、１９８９）でその使用法を記載する参考文献に基づき、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を標準的還元剤として選択した。Ｌｕ他（１９９２）は、可溶化ステップ中は還元剤を存在させないが再生緩衝液中には４０μＭ硫酸銅を含める、不溶性Ｇ−ＣＳＦをリフォールディング／再生するプロトコルについて記載している。
実施例８に記載したように、大腸菌培養液（４００ｍＬ）を培養し、各Ｇ−ＣＳＦタンパク質の発現を誘導した。細胞を溶解し、実施例８に記載したように不溶性部分を遠心分離によって単離した。大部分の不溶性Ｇ−ＣＳＦタンパク質を含有する不溶性材料を、８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８ ２０ｍＬに懸濁し、均一になるまで撹拌した。混合物を６本の管に等分し、実施例６に記載したように５ｍＭ ＤＴＴまたは２５ｍＭシステインをそれぞれの管に加えた。１時間後、可溶化混合物を、４０μＭ硫酸銅を含む、および
含まない４０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％グリセロール、ｐＨ８ ２５ｍＬ中に希釈した。リフォールドを４℃に２日間保った。この時点で各々のｐＨを４に調整した。リフォールドを遠心分離し、上清をＳ−セファロース・カラム上に載せ、実施例８に記載したようにＧ−ＣＳＦ野生型およびＱ１７３Ｃタンパク質を精製した。実施例８に記載したように、カラム分画を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールした。クロマトグラフィ後に回収された各タンパク質の量を表５に示す。
Figure 2011173911
表８に示すように、Ｇ−ＣＳＦ野生型およびＧ−ＣＳＦシステイン・ムテインの最高収量は、可溶化ステップ中に還元剤としてシステインを用いた場合に達成された。硫酸銅（４０μＭ）の存在は、還元剤と併せて用いた場合、わずかに収量を向上するように見えた。リフォールド・プロトコルＡ〜Ｆを用いて回収された野生型Ｇ−ＣＳＦタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各々が、単量体Ｇ−ＣＳＦで予想されるサイズの単一分子量分子種（非還元条件下で約１７ｋＤａ）を主に含んでいることを示した。対照的に、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）リフォールドＡ〜ＤからのＳ−セファロース・カラム・プールを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合には、最終生成物バンドは幅広く、単量体範囲で多数の様々に異なる見かけ分子量の分子種を含んでいた。おそらく、様々な分子量の単量体分子種は、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）タンパク質の様々なジスルフィド・アイソフォームに相当している。リフォールドＥおよびＦから回収されたＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）タンパク質は、野生型Ｇ−ＣＳＦと同時に移動する単一の鋭いバンドとして動き、単一で過半が折り畳まれた分子種が回収されたことを示した。このデータは、可溶化およびリフォールディングステップ中のシステインの添加が、適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）タンパク質の収率を著しく向上させることを示している。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、発明者らは、添加したシステインがムテイン中の遊離システイン残基と混合ジスルフィドを形成すると仮定している。この混合ジスルフィドは、遊離システイン残基が関係して起きる可能性のあるジスルフィド転位を制限する。システインがＤＴＴより有効なのは、ＤＴＴが通常、酸化されて形成する熱力学的に好ましい分子内結合のために混合ジスルフィドを形成しないからである。
実施例１２
システインの存在下および非存在下で調製されたＧ−ＣＳＦタンパク質安定性の比較
リフォールド手順Ａ（還元剤なし、硫酸銅なし）およびリフォールド手順Ｆ（２５ｍＭシステイン、４０μＭ硫酸銅）を用いて実施例１１に記載のように調製された野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）タンパク質をｐＨ４およびｐＨ８で５０℃に置いた。０、５分、３０分、１、２、３、４、５、および２０時間目に、タンパク質試料を遠心分離して変性したタンパク質沈殿をすべて除去した。アリコートを上清から抜き取り冷凍した。実験の終了時に非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってすべてのアリコート
を分析し、元のＧ−ＣＳＦタンパク質試料のうちどれほどの部分が溶液中にあり、かつ単量体であるかを測定した。ゲル上の目に見える相対的バンド強度に基づき、各タンパク質の可溶性半減期を測定した。
Figure 2011173911
結果は、野生型Ｇ−ＣＳＦがｐＨ４ではｐＨ８よりも長い可溶性半減期を有し、Ａｒａｋａｗａ他（１９９３）によって既に報告された結果と一致する。野生型Ｇ−ＣＳＦの可溶性半減期は、タンパク質がリフォールド手順ＡかあるいはＦを用いてリフォールディングされたかで実質的な差はなかった。対照的に、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ／Ｑ１７３Ｃ）は、タンパク質が手順Ａ（３０分未満）を用いた場合よりも手順Ｆ（２０時間超）を用いてリフォールディングされた場合の方がはるかに長い可溶性半減期を有していた。したがって、可溶化／リフォールディング過程におけるシステインの使用は、適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦシステイン・ムテインの回収率を向上させる他に、最終生成物の熱安定性を向上させる。
追加の試験を行い、Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインと野生型Ｇ−ＣＳＦの安定性を比較することができる。例えば、タンパク質を様々なｐＨ、温度および血清濃度に暴露することによりマトリックス状の実験を行うことができる。様々な時点で、実施例８に記載のＮＦＳ６０インビトロ細胞増殖生物活性アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィ、円二色性、ＥＬＩＳＡアッセイおよびウエスタン・ブロット分析などであって、これに限定されないアッセイにより、タンパク質の完全性をモニターすることができる。
実施例１３
ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインのインビボにおける有効性
各々が約３２０ｇの体重である３匹の雄生Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからなる群に、１回の静注（外側尾静脈）で野生型組み換えＧ−ＣＳＦ（Ｂｏｌｄｅｒ Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより調製）、ニューポジェン（登録商標）（Ａｍｇｅｎ、Ｉｎｃ．より販売の組み換えＧ−ＣＳＦ）またはＰＥＧ−Ｌ３Ｃを１００μｇ／ｋｇの用量で投与した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて測定した。選択された時点に、血液試料（０．３から０．４ｍｌ）をラットからＥＤＴＡ抗凝血管中に採取した。血液試料のアリコートを、全血球（ＣＢＣ）計算のために民間会社に送った。血液試料の残りを遠心分離し、血漿を−８０℃で冷凍した。注射して０．２５、１．５、４、８、１２、１６、２４、４８、７２、９６、１２０および１４４時間後に血液試料を採取した。０時間の基準値試料は、試験化合物の注射約２４時間前に入手した。表１０および１１は、様々な試験群についての経時的な平均血中好中球および全白血球数を示す。３種類の試験化合物はすべて、ベースライン値を上回る末梢性白血球および好中球の増加を刺激した。野生型組み換えＧ−ＣＳＦおよびニューポジェン（登録商標）を投与された試験群の白血球および好中球数は注射後約２４時間で最高になり、約４８時間までに基準値に戻った。対照的に、ＰＥＧ−Ｌ３Ｃを投与されたラットの白血球および好中球数は注
射後約４８〜７２時間で最高になり、注射後約１２０時間まで基準値に戻らなかった。ＰＥＧ−Ｌ３Ｃを投与されたラットで観察された最高白血球および好中球レベルは、野生型組み換えＧ−ＣＳＦまたはニューポジェン（登録商標）を投与された群よりも有意に高値であった（ｐ＜０．０５）。このデータは、ＰＥＧ−Ｌ３Ｃには循環する好中球および白血球の増加を刺激する能力があり、その末梢白血球数および好中球における絶対的増加は、野生型Ｇ−ＣＳＦまたはニューポジェン（登録商標）で見られるよりも大きく持続性であることを示している。同様の実験を行い、他のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテイン（Ｃ１７またはＣ１７Ｓバージョン）の有効性を証明することができる。同様の試験はまた、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。
Figure 2011173911
Figure 2011173911
血漿中のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインタンパク質は、市販のＧ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を用いて定量
することができる。滴定実験を行い、野生型Ｇ−ＣＳＦ、非修飾Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインを検出するためのＥＬＩＳＡの相対的感度を測定することができる。同様の実験は、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。
実施例１３で上記のように概説した有効性実験からの血漿中タンパク質濃度は、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から購入したヒトＧ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果を表１２に示す。この結果は、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ３Ｃが、ラットにタンパク質を静脈内投与した後に野生型Ｇ−ＣＳＦまたはニューポジェン（登録商標）よりも有意に長い循環半減期を有していることを示している。
Figure 2011173911
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテイン（Ｃ１７またはＣ１７Ｓバージョン）のインビボにおける有効性は、正常または好中球減少症のマウスまたはラットなどの齧歯動物において、媒体処理動物に比べ、タンパク質が循環好中球レベルおよび顆粒球生成の増加を刺激することを証明することにより測定することができる。Ｇ−ＣＳＦは、１００μｇ／ｋｇの用量で正常または好中球減少症の齧歯動物における好中球レベルを刺激する（Ｋｕｂｏｔａ他、１９９０；Ｋａｎｇ他、１９９５）。正常マウスにおける有効性を証明する場合には、５匹のマウス（各々の体重約２０ｇ）からなる群に、規定の間隔で５日間までＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインまたはプラセボ（媒体溶液）を皮下注射で投与することができる。ＩＣＲマウスなどの正常マウスは、民間供給メーカーから購入した。６日目に動物を屠殺し、全血球計算（ＣＢＣ）分析用に血液試料を集めることができる。造血組織（肝臓および脾臓）を集め、秤量し、組織病理学分析のためにホルマリン中に固定して顆粒球生成増加の証拠を探索することができる。骨髄を様々な長骨および胸骨からユニット・パーティクル・プレップ（ｕｎｉｔ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｅｐｓ）および組織病理学分析のために摘出し、顆粒球生成増加の証拠を探索することができる。群間比較は、単一の比較のためにはＳｔｕｄｅｎｔｓ Ｔ検定を、複数の比較のた
めには一元配置分散分析を用いて行うこととした。Ｐ＜０．０５を有意と見なすこととした。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインは、媒体処置のマウスに比べ、マウスの循環好中球レベルおよび顆粒球形成の大きな増加を刺激するはずである。５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの有効性は、１回、１日１回、１日おき、または２日おきに投与してテストすることができる。最初の実験では、マウスの様々な群に、１回の注射でＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテイン０．００３２，０．０１６、０．０８、０．４および２μｇを皮下注射で投与することができる。対照マウスには、媒体溶液のみを投与することができる。追加の対照群には、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインと同一の投与計画を用い、野生型Ｇ−ＣＳＦ（２μｇ／毎日（ＥＤ）を５日間）および野生型Ｇ−ＣＳＦ２μｇを投与することができる。
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの有効性はまた、好中球減少症のマウスで証明することもできる。好中球減少症は、一般的に使用される骨髄抑制化学療法剤でありヒトの臨床場面に関係のあるシクロホスファミド（ＣＰＡ；１００ｍｇ／ｋｇ）で処理することによって誘発することができる。Ｇ−ＣＳＦは、シクロホスファミド処置動物において正常な好中球レベルの回復を加速する（Ｋｕｂｏｔａ他、１９９０；Ｋａｎｇ他、１９９５；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ他、１９９６）。０日目に、シクロホスファミドの腹腔内注射をマウス（約２０ｇ）に投与し、好中球減少症を誘発することができる。動物を様々な群に分割し、規定の間隔で５日間までＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインまたはプラセボを皮下注射で投与することとする。一つの対照群にはシクロホスファミドを投与せず、プラセボ注射を投与することとする。５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの有効性は、１回、１日おき、または２日おきに投与してテストすることができる。最初の実験では、マウスの様々な群に、１回の注射でＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテイン０．００３２，０．０１６、０．０８、０．４および２μｇを皮下注射で投与することができる。対照マウスには、媒体溶液のみを投与することができる。追加の対照群には、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインと同一の投与計画を用い、野生型Ｇ−ＣＳＦ（２μｇ／毎日（ＥＤ）を５日間）および野生型Ｇ−ＣＳＦ２μｇを投与することができる。０〜１０日目に、１群当たり５匹のマウスを屠殺し、血液および組織試料を上記の正常マウス実験について記載したように分析した。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインは、媒体注射、ＣＰＡ注射対照群に比べて、マウスにおける循環する好中球および白血球の増加を刺激して加速するはずである。
あるいは、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの有効性は、ラットモデルを用いる好中球減少症試験で証明することができる。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄抑制化学療法剤で処置したラットにおいて正常な好中球レベルの回復を加速する。この場合には、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（各々の体重は約３００ｇ）に、ＣＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を０日目に腹腔内投与し、好中球減少症を誘発することができる。動物を３群に分割し、それらの群に、規定の間隔で１０日間までＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインまたはプラセボを皮下注射で投与することができる。一つの対照群にはシクロホスファミドではなくプラセボ注射液を投与することができる。１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインの有効性は、約０．１μｇ〜５００μｇ／ｋｇ（好ましい範囲は１〜１００μｇ／ｋｇ）の皮下投与を行い、各分量を１回、毎日、１日おき、または２日おきに投与して測定するすることができる。追加の対照群には、毎日、５日間市販の野生型Ｇ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）を投与することができ、他の対照群には、ＰＥＧ化Ｇ−ＳＣＦシステイン変異体と同一の投与量および投与計画で野生型Ｇ−ＣＳＦを投与することができる。対照ラットには、媒体溶液のみを投与することができる。０〜６、８、１０、１２、および１４日目に、ＣＢＣ分析のために血液試料を集めることができる。時間的経過の終了時に、造血組織および骨
髄の採取のためにラットを屠殺し、顆粒球生成増加の証拠を調べることができる。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン変異体は、媒体注射、ＣＰＡ注射対照群に比べて、ラットにおける循環する好中球レベルおよび顆粒球生成の増加を刺激して加速するはずである。
実施例１４
野生型ＧＭ−ＣＳＦのクローニング、発現、精製および生物活性
Ａ．ＧＭ−ＣＳＦをコードするクローン化ＤＮＡ配列
発明者らは、ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを、ヒト膀胱癌細胞株５６３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによりクローニングして配列決定した。Ｇ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡは、ヒト膀胱癌細胞系５６３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から単離した全ＲＮＡのＰＣＲにより増幅した。１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した。Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から購入したＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成は、Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ製のＲＴ−ＰＣＲ用１ｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ２６７（５＞ＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧ＞３；配列番号７５）および逆方向プライマーＢＢ２６８（５＞ＣＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧ＞３；配列番号７６）で行った。プライマーＢＢ２６８は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌シグナル用のコード配列の５′末端にアニールし、逆方向プライマーＢＢ２６８は、ＧＭ−ＣＳＦコード配列の３′末端にアニールする。得られた約４５０ｂｐのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいＤＮＡ配列のクローンは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＧＭ−ＣＳＦｆｕｓまたはｐＢＢＴ２６７と名付けた。発明者らはＰＣＲを用い、大腸菌における周辺質発現のためにこのＧＭ−ＣＳＦクローンを修飾した。周辺質への分泌を介して大腸菌で発現させる場合に、ＧＭ−ＣＳＦは、付加的Ｎ末端メチオニンを含まず、天然に存在するＧＭ−ＣＳＦと同一なアミノ酸配列を有する（Ｌｅｅ他、１９８５）。分泌型のＧＭ−ＣＳＦを発現させるためにＰＣＲを用い、ＮｄｅＩ制限酵素認識部位の後ろの大腸菌の耐熱性エンテロトキシン（ＳＴＩＩ）遺伝子（Ｐｉｃｋｅｎ他、１９８３）のリーダー配列を、成熟ＧＭ−ＣＳＦのアミノ末端コード配列に融合させた。さらに、カルボキシ末端残基Ｅ１２７の後に、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位に直ぐ続けてＴＡＡ終止コドンを付加した。同時に、２、６、８、１２、１１７および１２４位のプロリンのコドンをすべてＣＣＧに変え、１１４位のロイシンのコドンをＣＴＧに変えた。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ３００（５＞ＣＧＣＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧ＞３；配列番号７７）および逆方向プライマーＢＢ３０１（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡ＞３；配列番号７８）を用い、ｐＢＢＴ２６７をテンプレートとして行った。得られた約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、上記実施例９に記載のｐＢＢＴ２２７中にクローニングした。ｐＢＢＴ２２７ ＤＮＡをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、１％アガロース・ゲル上に展開させた。約２．４ｋｂのベクター・フラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はＧＭ−ＣＳＦに融合した完全ｓｔＩＩリーダーを有し、この「ｓｔＩＩ−ＧＭ−ＣＳＦ」構築物を約４５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローンは、ｐＵＣ１８：：ｓｔＩＩ−ＧＭ−ＣＳＦと名付けた。発現試験の場合には、このプラスミドのＮｄ
ｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを発現ベクターｐＢＢＴ２５７中にサブクローニングしたが、それを以下に記載する。得られたプラスミドｐＢＢＴ２５７；ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ、すなわちｐＢＢＴ２７１を発現用の大腸菌Ｗ３１１０中に導入した。
プラスミドｐＢＢＴ２５７は、ｐＣＹＢ１のアンピシリン耐性遺伝子を削除し、それを古典的クローン化ベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ他、１９７７）に由来するテトラサイクリン耐性遺伝子と置き換えることにより発現ベクターｐＣＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）から誘導した。ｐＢＢＴ２５７とｐＣＹＢ１のいずれにおいても、クローン化遺伝子の発現はｔａｃプロモーターの制御下とし、プラスミド性ｌａｃＩｑ遺伝子の産物によって調節される。これらのベクターは、非融合タンパク質として、またはキチン結合領域との融合物として遺伝子を発現させることができる。発明者らの構築物は、タンパク質が非融合タンパク質として発現するように作成した。プラスミドｐＢＢＴ２５７を以下の通りに構築した。プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入）のテトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ遺伝子）は、プライマーＢＢ２２８（５＞ＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣ＞３；配列番号４１）およびＢＢ２２９（５＞ＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴ＞３；配列番号４２）を用いるＰＣＲによって増幅した。順方向プライマーＢＢ２２８は、ＴｃＲ遺伝子の上流に位置し、ＴｃＲ遺伝子プロモーターの「−３５」部分を含む、ｐＢＲ３２２配列のヌクレオチド１から２５（ＧｅｎＢＡｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｊ０１７４９）にアニールする。オリゴＢＢ２２８は、クローニング目的用の付加ＰｓｔＩ部位を含む。逆方向プライマーＢＢ２２９は、ＴｃＲ遺伝子のコード配列に続く翻訳終止コドンの直ぐ下流に位置するヌクレオチド１２７７から１３００にアニールする。ＢＢ２２９は、クローニング目的用の付加ＤｒａＩ部位を含む。ＰＣＲ反応４０μｌは、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、２５℃）、０．１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２中で行い、各２００μＭのｄＮＴＰ、各プライマー２０ｐｍｏｌｅ、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２．５単位、およびＰＦＵポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．５単位を含んでいた。ＰＣＲ反応は、９５℃３分、［９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃９０秒］２５サイクルと、続く４℃保持で構成した。得られた約１３００ｂｐの産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＤｒａＩで消化し、以下に記載する連結反応に用いた。精製ｐＣＹＢ１ ＤＮＡをＰｓｔＩおよびＳｗａＩで消化し、供給メーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）のプロトコルに従って子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼで処理した。ＰｓｔＩおよびＳｗａＩは、それぞれベクターを１回切断し、アンピシリン耐性（ＡｐＲ）遺伝子を隣接する。消化生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従って「クリーン・アップ」し、続いて１％アガロース・ゲル上に展開した。ＡｐＲ遺伝子を削除された約５．３ｋｂのベクター・フラグメントをゲル精製し、ＴｃＲ遺伝子を含むＰｓｔＩ−ＤｒａＩカットＰＣＲ産物と連結した。ＤｒａＩとＳｗａＩは共に、互いと連結することができる平滑末端消化生成物を生成する。連結反応を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、テトラサイクリン耐性形質転換体を選択した。続いて、３種類の分離株を分析し、すべてがアンピシリンに感受性であることが分かった。これらの分離株から得られた制限エンドヌクレアーゼ消化生成物は、ＡｐＲ遺伝子を含む約１５００ｂｐのＰｓｔＩおよびＳｗａＩフラグメントの欠失およびＴｃＲ遺伝子を運ぶ約１３００ｂｐのＰｓｔＩ−ＤｒａＩフラグメントによるその置換とも一致した。ｐＢＢＴ２５７と名付けた一分離株を組み換えタンパク質の発現に使用するために選択した。
Ｂ．大腸菌における野生型ＧＭ−ＣＳＦの発現。
分泌ＧＭ−ＣＳＦの発現の場合には、ｐＢＢＴ２７１［ｐＢＢＴ２５７：：ＳＴＩＩ−
ＧＭ−ＣＳＦ］およびｐＢＢＴ２５７親ベクターを大腸菌Ｗ３１１０中に形質転換した。得られた菌株をＢＯＢ３４０：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ２５７）、およびＢＯＢ３５０：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ２７１）と名付けた。新鮮な飽和した前夜の培養液を、Ａ６００におけるＯ．Ｄ．約０．０５で１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中に接種した。これらの培養液１００ｍｌを、５００ｍＬのバッフル付き振とうフラスコ中２８℃で、約２５０ｒｐｍのジャイロトリー・シェーカー用水浴中で培養した。培養液の密度が約０．６ＯＤに達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えた。次いで、誘導培養液を約１６時間一夜インキュベートした。誘導および非誘導培養液の試料を既製の１６％トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。ＢＯＢ３５０（野生型）の誘導培養液は、約１４ｋＤａにバンドを示し、これは成熟ＧＭ−ＣＳＦの分子量と一致する。このバンドは、ＢＯＢ３５０の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるＢＯＢ３４０の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。ウェスタン・ブロット分析は、この約１４ｋＤａのバンドが抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗血清（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と強力に反応することを示した。この抗血清は、ＢＯＢ３４０およびＢＯＢ３５０の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるＢＯＢ３４０の誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタン・ブロットはまた、この約１４ｋＤａのバンドがＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した市販の大腸菌由来のヒトＧＭ−ＣＳＦ標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、ＳＴＩＩリーダー・ペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。以下に示すＮ末端配列決定試験は、ＳＴＩＩシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。
これらの培養液からの誘導後１６時間の試料を、ＫｏｓｈｌａｎｄおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ（１９８０）の手順に基づき浸透圧衝撃に供した。この手順は、大腸菌の外膜を破裂させ、周囲の培地中に周辺質の内容物を放出する。続く遠心分離により、細胞質成分、不溶性周辺質成分、および細胞関連成分（ペレット中に回収される）から可溶性の周辺質成分（上清中に回収される）を分離する。合成されたＧＭ−ＣＳＦタンパク質が上清中に回収されることはほとんどなかった。ＧＭ−ＣＳＦの大部分はペレットと結びついたままであった。このことは、タンパク質がプロセシングされ周辺質に分泌されたように見えるが、主に不溶性の形でそこに蓄積していることを示す。同様の結果は、大腸菌周辺質に分泌されたＧＭ−ＣＳＦに関して他の研究者によって報告されている（Ｌｉｂｂｙ他、１９８７；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他、１９８８）。
Ｃ．野生型ＧＭ−ＣＳＦの精製。
野生型ＧＭ−ＣＳＦを、以下のプロトコルを用いてより大きなスケールで発現させて精製した。ＢＯＢ３５０（野生型）の新鮮な飽和一夜培養液を、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中にＡ６００おけるＯＤ約０．０５で接種した。２Ｌのバッフル付き振とうフラスコ中で培養液４００ｍｌを２８℃で、約２５０ｒｐｍのジャイロトリー・シェーカー用水浴内で培養した。培養液の密度が約０．６ＯＤに達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えた。次いで、誘導培養液を約１６時間一夜インキュベートした。遠心分離により細胞をペレットにし、−８０℃で冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）のプロトコルに従ってＢ−ＰＥＲ（商標）細菌タンパク質抽出試薬５ｍＬで処理した。ＧＭ−ＣＳＦタンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、Ｂ−ＰＥＲ中に懸濁した。この混合物をリゾチーム（２００μｇ／ｍｌ）で１０分間処理して細胞壁をさらに破壊し、ＭｇＣｌ２（最終１０ｍＭ）およびプロテアーゼ非含有ＤＮＡｓｅ（２μｇ／ｍｌ）を加えた。不溶性のＧＭ−ＣＳＦを遠心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞破片の大部分を除去した。リフォールディングのため、不溶性のＧＭ−ＣＳＦを含有する得られたペレットを、２０ｍＭトリス・ベース中の８Ｍ尿素、２５ｍＭシステイン１０ｍｌに溶かした。
この混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで２０ｍＭトリス、４０μＭ硫酸銅、１５％グリセロール、ｐＨ８．０ １００ｍｌ中に希釈した。このリフォールド混合物を４℃に２日間保ち、次いで遠心分離し、２０ｍＭトリスｐＨ８．０（緩衝液Ａ）で平衡化したＱ−セファロース・カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｉ Ｔｒａｐ）５ｍｌ上に載せた。０〜３５％緩衝液Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ８）の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりカラム分画を分析した。ＧＭ−ＣＳＦは約２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。主にＧＭ−ＣＳＦを含有する分画をプールした。
Ｑ−セファロース・プールを等体積の３０％硫酸アンモニウムで希釈し、室温まで温めた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶かした１５％硫酸アンモニウムで予め平衡化したフェニルＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐ）１ｍＬ上に載せた。逆塩グラジエント（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶かした１５％硫酸アンモニウムから０％硫酸アンモニウム）で溶出することにより、精製ＧＭ−ＣＳＦをカラムから回収した。ＧＭ−ＣＳＦに関するフェニルＨＰカラム溶出プロフィールは、約６．５％硫酸アンモニウムで溶出する単一主ピークを示した。ピーク全体のカラム分画を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＧＭ−ＣＳＦを含有し目に見える不純物を含有しない分画をプールした。野生型ＧＭ−ＣＳＦの最終的な収量をＢｒａｄｆｏｒｄ分析により測定すると、培養液４００ｍｌから約２．６ｍｇであった。自動Ｅｄｍａｎ分解化学反応を用いる野生型ＧＭ−ＣＳＦのＮ末端配列決定により配列ＡＰＡＲＳＰＳが得られ、成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦの最初の７個のアミノ酸と同じく一致し、Ｎ末端が正しくプロセシングされていることを示している（Ｌｅｅ他、１９８５）。精製野生型ＧＭ−ＣＳＦおよび市販のＧＭ−ＣＳＦ（大腸菌発現；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ウエスタンブロット分析で示されるように還元および非還元条件下で一緒に移動した。両方のタンパク質は、分子内ジスルフィド結合の破壊により、還元条件下では予想されたより大きな見かけ分子量への移動性シフトを示した。
Ｄ．野生型ＧＭ−ＣＳＦのインビトロにおける生物活性。
ヒトＴＦ−１赤白血病細胞株（Ｋｉｔａｍｕｒａ他、１９８９）を用いる細胞増殖アッセイを開発し、野生型ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を測定した。ヒトＴＦ−１細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。この細胞を、１０％ＦＢＳ，５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（大腸菌発現；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。一般的に、ＴＦ−１細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（添加物なし）で３回洗浄し、１０％ＦＢＳ，５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（アッセイ培地）中に１×１０５／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁することによってバイオアッセイを開始した。細胞懸濁液５０μｌ（５×１０３個の細胞）を、平底の９６ウエル組織培養プレートの試験ウエルに等分した。試験するタンパク質試料の段階希釈液をアッセイ培地中で調製した。市販の組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（大腸菌発現；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の段階希釈液を並行して分析した。希釈したタンパク質試料５０μｌを試験ウエルに加え、加湿した５％ＣＯ２組織培養インキュベータ中３７℃でプレートをインキュベートした。タンパク質試料は、三つ組みのウエル中でアッセイした。約３日後、ＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｌを各ウエルに加え、組織培養インキュベータ中３７℃で１〜４時間プレートをインキュベートした。マイクロプレート・リーダーを用いて４９０ｎｍでウエルの吸光度を読みとった。対照ウエルは培地を含み細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウエルの平均吸光度値を、試験ウエルについて得られた平均値から差し引いた。各試料について、ＥＣ５０、最大刺激半減濃度を算出し、タンパク質の生物活性を比較した。
ＴＦ−１細胞株は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により明らかなように、ＧＭ−ＣＳＦに対して強い増殖反応を示す。市販のＧＭ−ＣＳＦおよび発明者らにより調製されたＧＭ−ＣＳＦは、バイオアッセイにおいてそれぞれ９７および１０５ｐｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０を有していた（表１３）。
実施例１５ ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの構築、発現、精製および生物活性
Ａ．ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの構築。
Ｉｎｎｉｓ他（１９９０）およびＨｏｒｔｏｎ他（１９９３）ならびに実施例９で一般的に記載されている部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発を用い、１３種類の変異体ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を構築した。発明者らは、ヘリックスＡから近位のアミノ末端領域中の５種類のムテイン［＊−１Ｃ（天然アミノ末端へのシステイン残基の付加）、Ａ１Ｃ、Ａ３Ｃ、Ｓ５ＣおよびＳ７Ｃ］；Ｂ−Ｃループ中の１種類のムテイン［Ｓ６９Ｃ］；Ｃ−Ｄループ中の３種類のムテイン［Ｅ９３Ｃ、Ｔ９４Ｃ、およびＴ１０２Ｃ］；およびヘリックスＤから遠位のカルボキシ末端領域中の３種類のムテイン［Ｖ１２５Ｃ、Ｑ１２６Ｃおよび＊１２８Ｃ（天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加）を構築した。発明者らはまた、ヘリックスＡの遠位末端に位置する推定上のＮ結合グリコシル化部位における１種類のムテイン［Ｎ２７Ｃ］も構築した。変異誘発性ＰＣＲ反応に用いたテンプレートは、ＳＴＩＩ−ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子がｐＵＣ１８中のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングされているプラスミドｐＢＢＴ２６８とした。ＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、これらと同一の制限酵素により切断されたｐＢＢＴ２６８ベクターＤＮＡと連結し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたＰＣＲフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびＰＣＲ反応または合成オリゴヌクレオチド・プライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。
周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現するには、１３種類のムテインをコードするＳＴＩＩ−ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を、約４５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ１８ベースのｐＢＢＴ２６８から切り取り、ｐＢＢＴ２５７発現ベクター中にサブクローニングし、大腸菌Ｗ３１１０中に形質転換した。
本明細書に記載した手順に類似した手順を用い、ＧＭ−ＣＳＦの他のシステイン・ムテインを一般的に構築することができる。システイン・ムテインは、ＧＭ−ＣＳＦコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換える置換変異、ＧＭ−ＣＳＦコード配列中の天然に存在する２個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはＧＭ−ＣＳＦコード配列の一番目のアミノ酸Ａ１の前にシステイン残基を付加する、もしくはＧＭ−ＣＳＦコード配列の末端アミノ酸残基Ｅ１２７の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはＧＭ−ＣＳＦコード配列中のどこか、２個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。ＧＭ−ＣＳＦにシステイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスＡ、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループに先行する領域、およびヘリックスＤから遠位の領域中にある。他の好ましい部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤヘリックスの一番目または最後の３個のアミノ酸である。システイン変異に好ましいいくつかの位置を、表１３に記載する。他の好ましい位置には、Ｒ６７Ｃ、Ｇ６８Ｃ、Ｌ７０Ｃ、Ｒ３０Ｃ、Ｔ３２Ｃ、Ａ３３Ｃ、Ｅ３５Ｃ、Ｎ３７Ｃ、Ｔ３９Ｃ、Ｅ４５Ｃ、Ｄ４８Ｃ、Ｑ５０Ｃ、Ｅ５１Ｃ、Ｑ９９Ｃ、Ｔ９８Ｃ、Ｅ１１３ＣおよびＥ１２７Ｃが含まれる。上述の変異の他に、システイン置換を作成するためにこれらの領域中で好ましい他の残基は、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７に記載されている。
一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するＧＭ−ＣＳＦ中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するＧＭ−ＣＳＦを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、今や遊離している。システイン残基は、他の１９個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。遊離システイン残基はまた、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ他（１９９８）によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってＧＭ−ＣＳＦに導入することもできる。
２個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、実施例８、９、１４および１５に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは２個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、ＰＥＧ化された場合に各々が高活性を維持する２個以上のシステイン・ムテインが組み合わされた変異体、例えばＡ３ＣプラスＳ６９Ｃ、Ｓ６９ＣプラスＥ９３Ｃ、およびＡ３ＣプラスＥ９３Ｃであろう。他の好ましい多重変異体は、表９および表１０からのデータに基づいて推論でき、＊−１Ｃ、Ａ１Ｃ、Ａ３Ｃ、Ｓ５Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｓ６９ＣおよびＥ９３Ｃからなる群から選択される２個以上の変異を含有する組合せが含まれるであろう。
実施例１４〜１６に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にタンパク質を大腸菌中で発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をＰＥＧ化し、インビトロにおけるバイオアッセイでそれらの生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然ＧＭ−ＣＳＦシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。
Ｂ．ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの発現および精製。
１３種類のＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインを発現する大腸菌株を培養し、実施例１４で野生型ＧＭ−ＣＳＦについて記載したプロトコルを用いて誘導し、採取した。野生型ＧＭ−ＣＳＦについて実施例１４に記載したプロトコルを用いてムテインをリフォールディングして精製した。ムテインは、約２００〜２３０ｍＭ ＮａＣｌでＱ−セファロース・カラムから、約６〜８％硫酸アンモニウムでフェニルＨＰカラムから溶出した。ムテインは主に単量体として回収され、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は約１４ｋＤａであった。
Ｃ．ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの生物活性。
１３種類の精製ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインは、ＴＦ−１細胞増殖アッセイでアッセイした。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ・キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。市販の野生型ＧＭ−ＣＳＦおよび発明者らによって調製された野生型ＧＭ−ＣＳＦは、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。１３種類のムテインはすべて、野生型ＧＭ−ＣＳＦ対照タンパク質と同程度にＴＦ−１細胞の増殖を刺激した。１３種類のムテインの平均ＥＣ５０は、８０から１３４ｐｇ／ｍｌの範囲であった（表１３）。
Figure 2011173911
実施例１６
ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインのＰＥＧ化、精製および生物活性
Ａ．予備的ＰＥＧ化試験。 最初のＰＥＧ化反応条件は、試験タンパク質としてＡ１Ｃ、Ｓ７ＣおよびＳ６９Ｃ、還元剤としてＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン］−ＨＣｌ、およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ製の５ｋＤａシステイン反応性ＰＥＧを用いて決定した。精製システイン・ムテインまたは野生型ＧＭ−ＣＳＦのアリコート３μｇを、過剰の５ｋＤＡマレイミド−ＰＥＧまたは５ｋＤａビニルスルホン−ＰＥＧ（ポリマー末端の一方に反応性マレイミドまたはビニルスルホン基を有する平均分子量５ｋＤａの直線型ポリエチレン・グリコール・ポリマー）の存在下で１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中室温でＴＣＥＰ濃度を増加させながらインキュベートした。マレイミドおよびビニルスルホン基は、Ｍｉｃｈａｅｌ求核試薬と反応し、システイン側鎖上にあるようなメルカプタン基に高い選択性がある。９０分後、反応物を直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。野生型Ｇ−ＣＳＦを修飾することなく有意な量のモノＰＥＧ化Ｔ１Ｃタンパク質を与えたＴＣＥＰおよび特定のＰＥＧ試薬の量を、続く実験に使用するため選択した。滴定実験は、ｐＨ８．５では、１５倍モル過剰のＴＣＥＰおよび２０倍過剰の５ｋＤＡマレイミドＰＥＧにより、ジまたはトリＰＥＧ化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノＰＥＧ化Ａ１Ｃタンパク質が得られたことを示した。ＧＭ−ＣＳＦ Ｓ６９Ｃの場合には、５ｋＤａビニルスルホン−ＰＥＧが５ｋＤＡマレイミド−ＰＥＧより好ましく、有意な量のモノＰＥＧ化Ｓ６９Ｃタンパク質を与える。組み換え野生型ＧＭ−ＣＳＦは、５０倍モル過剰のＴＣＥＰが存在してもＰＥＧと反応しなかった。対照実験は、ムテインをＰＥＧ化するには、部分的に還元する必要があることを示した。
Ｂ．ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの調製および精製
１０種類の精製ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインのアリコート２００から３００μｇをＰＥＧ化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大量のＰＥＧ化反応はまた、室温で１．５時間行った。各変異体の場合、１５倍過剰のＴＣＥＰおよび２０倍過剰の５ｋＤＡマレイミド−ＰＥＧを用いた。唯一の例外は、５ｋＤａビニルスルホン−ＰＥＧを用いたＳ６９Ｃであった。これらの反応条件により、１０種類のすべてのムテインについて
モノＰＥＧ化タンパク質が得られた。反応時間の終了時に、ＰＥＧ化混合物を氷冷２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で２０倍に希釈した後、ＧＭ−ＣＳＦムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件（２５ｍＬグラジエント、２０ｍＭトリスｐＨ８に溶かした０〜０．３５Ｍ ＮａＣｌ）を用い、Ｑ−セファロース・カラム（１ｍＬ、ＨｉＴｒａｐ）上に素早く載せた。ＰＥＧ部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することを可能にしている。ＰＥＧ化反応の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、唯一のＰＥＧ化分子種が、見かけの分子量約２６ｋＤａで移動するＰＥＧ−ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテイン単量体であることを示していた。Ｑ−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、２本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピーク（１６０〜２００ｍＭ ＮａＣｌ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモノＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦタンパク質であると決定した。二番目の主要ピーク（２００〜２３０ｍＭ ＮａＣｌ）は、未反応ＧＭ−ＣＳＦタンパク質であると決定した。モノＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。すべてのＧＭ−ＣＳＦムテインを同一のプロトコルによりＰＥＧ化し、精製した。ＰＥＧ化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより類似した見かけの分子量を示したが、ＰＥＧ−Ｅ９３ＣムテインおよびＰＥＧ−Ｔ９４Ｃムテインは例外で、わずかに小さな見かけ分子量を示した。Ｎ末端領域における４種類のシステイン・ムテイン（＊−１Ｃ、Ａ１Ｃ、Ａ３Ｃ、およびＳ７Ｃ）も、１０−および２０ｋＤａマレイミドＰＥＧを用い、小スケールでＰＥＧ化した。これらの反応は、上述の条件を用いて各ムテイン３μｇについて行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。これらの各ムテインは、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａＰＥＧ試薬と容易に反応し、モノＰＥＧ化タンパク質が得られた。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ａ３Ｃも上述のプロトコルに従って調製した。このプロトコルをスケール・アップすると多量の１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ａ３Ｃタンパク質が得られた。
Ｃ．ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの生物活性。
発明者らは、正確なタンパク質濃度および特異的生物活性測定のために５ｋＤａ ＰＥＧで修飾した十分量の７種類のムテイン（＊−１Ｃ，Ａ１Ｃ、Ａ３Ｃ、Ｓ５Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｓ６９ＣおよびＥ９３Ｃ）を精製した。７種類の精製５ｋＤａ−ＰＥＧ−ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの生物活性は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて測定した。すべてのＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインは類似した用量反応曲線を示し、野生型ＧＭ−ＣＳＦと同一レベルの最大増殖刺激に達した。ＰＥＧ−ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの平均ＥＣ５０は、８０〜１２３ｐｇ／ｍｌの範囲であった（表１４）。
Figure 2011173911
１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ分子で修飾したＡ３Ｃムテインの生物活性は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合アッセイを用いて測定した。各ＰＥＧ−Ａ３Ｃタンパク質は、ＴＦ−１細胞の増殖を刺激した。１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ Ａ３Ｃシステイン・ムテインの平均ＥＣ５０は、それぞれ７８＋／−３ｐｇ／ｍｌ、１１３＋／−５ｐｇ／ｍｌ、および３００＋／−５０ｐｇ／ｍｌであった（Ｎ＝各タンパク質につき４回のアッセイ）。
Ｄ．５ｋＤａ−、１０ｋＤａ−、２０ｋＤａ−および４０ｋＤａ−Ｋ ＰＥＧで修飾したＡ３Ｃの見かけ分子量。
ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦ Ａ３Ｃタンパク質の見かけの分子量は、Ｂｉｏｒａｄ Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ−４００−５カラムを用いるサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）によりＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣで測定した。リン酸緩衝食塩水からなる定組成グラジエントを溶出液として用いた。各タンパク質の保持時間を用い、ゲル濾過タンパク質標準品（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で作成した標準曲線に基づいて分子量を算出した。ＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦに比べて見かけ分子量の劇的な増加を示した（表１５）。大きなＰＥＧは小さなＰＥＧよりもタンパク質の見かけ分子量を増加させた。同様のデータは、ＧＨ、ＩＦＮ−α２、およびＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化システイン・ムテインの場合にも記録された。
Figure 2011173911
実施例１７
野生型マウスＧＭ−ＣＳＦおよびマウスＧＭ−ＣＳＦのシステイン・ムテインのクローニング、発現、精製および生物活性
発明者らは、成熟マウスＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手したマウスＥＬ４．ＩＬ−２細胞株（カタログ番号ＴＩＢ−１８１）から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによりクローニングして配列決定した。１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で細胞を培養した。ＲＮＡ単離の前に、ＤＭＥＭ培地中の１μｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号Ｌ−４１４４）および１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号Ｐ−１５８５）、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンにより３７℃で６または２４時間、細胞を誘導した。Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から購入したＲＮｅａｓｙ
Ｍｉｎｉ ＲＮＡ単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成は、Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ製のＲＴ−ＰＣＲ用１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生
成物をテンプレートとして用いる続くＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ４８１（５＞ＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴ＞３；配列番号４３）および逆方向プライマーＢＢ４８２で行った。ＢＢ４８１は、成熟マウスＧＭ−ＣＳＦの最初の８個のアミノ酸をコードする２４個のヌクレオチドにアニールする。ＢＢ４８１はまた、上記の実施例７およびＰｉｃｋｅｎ他（１９８３）に記載の大腸菌ｓｔＩＩシグナル配列のカルボキシ末端の４個のアミノ酸をコードする配列と重なり合うヌクレオチドを、自身の配列の５′へ直に付加する。１１個のこれらのヌクレオチドには、ＭｌｕＩ制限酵素認識部位が含まれる。ＢＢ４８２（５＞ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧ＞３；配列番号４４）は、マウスＧＭ−ＣＳＦの１０個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドにアニールし、コード配列の直後にＴＡＡ翻訳終止コドンおよびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を付加する。６時間と２４時間ＲＮＡ試料は共に、ＧＭ−ＣＳＦ ＲＴ−ＰＣＲ産物を与えた。６時間ＲＮＡ試料から得られた約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、上記実施例８に記載のｐＢＢＴ２２７［ｐＵＣ１８：：ｓｔＩＩ−ＧＭ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）］中にクローニングした。ｐＢＢＴ２２７ ＤＮＡをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、１％アガロース・ゲル上に展開した。約２．４ｋｂのベクター・フラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はマウスＧＭ−ＣＳＦに融合した完全ｓｔＩＩリーダーを有し、この「ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ」構築物を約４５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローン（Ｇｏｕｇｈ他、１９８４）は、ｐＵＣ１８：：ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦまたはｐＢＢＴ４３５と名付けた。発現試験の場合には、ｐＢＢＴ４３５のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、上記の実施例１４に記載する発現ベクターｐＢＢＴ２５７中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＢＢＴ２５７：：ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ、すなわちｐＢＢＴ４５６を発現用の大腸菌Ｗ３１１０中に導入した。上記実施例１４に記載のヒトＧＭ−ＣＳＦの発現および精製用のプロトコルを用い、野生型マウスＧＭ−ＣＳＦを発現させ精製した。
Ｉｎｎｉｓ他（１９９０）およびＨｏｒｔｏｎ他（１９９３）ならびに上記の他の実施例で一般的に記載されている部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発を用い、変異体マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を構築した。１種類のムテインＴ３Ｃは、ヘリックスＡから近位のアミノ末端領域中に構築した。変異誘発性ＰＣＲ反応は、テンプレートとしてのプラスミドｐＢＢＴ４３５（実施例１７に記載）ならびに順方向プライマーＢＢ５０４（５＞ＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴ＞３；配列番号４５）および逆方向プライマーＢＢ４８２（５＞ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧ＞３；配列番号４６）を用いて行った。ＢＢ５０４は、成熟マウスＧＭ−ＣＳＦの３位スレオニンのＡＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える。得られた約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢＢＴ４３５中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しい配列の一クローンは、ｐＵＣ１８：：ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｔ３Ｃ）と名付けた。発現試験の場合には、このプラスミドのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、上記の実施例１４に記載する発現ベクターｐＢＢＴ２５７中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＢＢＴ２５７：：ｓｔＩＩ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｔ３Ｃ）、すなわちｐＢＢＴ４６９を発現用の大腸菌ＪＭ１０９中に導入した。上記実施例１４に記載のヒトＧＭ−ＣＳＦの発現および精製用のプロトコルを用い、マウスＧＭ−ＣＳＦのＴ３Ｃムテインを発現させ精製した。
本明細書、ならびに上記実施例９および１５に記載した手順に類似した手順を用い、マウスＧＭ−ＣＳＦの他のシステイン・ムテインを一般的に構築することができる。システイン・ムテインは、ＧＭ−ＣＳＦコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換え
る置換変異、マウスＧＭ−ＣＳＦコード配列中の天然に存在する２個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはマウスＧＭ−ＣＳＦコード配列の一番目のアミノ酸の前にシステイン残基を付加する、もしくはマウスＧＭ−ＣＳＦコード配列の末端アミノ酸残基の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはマウスＧＭ−ＣＳＦコード配列中のどこか、２個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。システイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスＡ、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループに先行する領域、およびヘリックスＤから遠位の領域中にある。他の好ましい部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤヘリックスの最初または最後の３個のアミノ酸である。一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するＧＭ−ＣＳＦ中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するムテインを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は今や遊離である。システイン残基は、他の１９個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。遊離システイン残基はまた、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ他（１９９８）によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってＧＭ−ＣＳＦに導入することもできる。
２個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、上記の実施例９および１５に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは２個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、ＰＥＧ化された場合に各々が高い、または完全な比活性を維持する２個以上のシステイン・ムテインが組み合わされた変異体であろう。
実施例１２〜１４、１５および１６に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にマウスＧＭ−ＣＳＦムテインを発現させて精製し、ＰＥＧ化し、インビトロにおけるバイオアッセイおよびインビボにおける有効性モデルでそれらのタンパク質の生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然ＧＭ−ＣＳＦシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。
精製マウスＧＭ−ＣＳＦ野生型タンパク質、システイン・ムテイン、およびＰＥＧ化型のシステイン・ムテインは、上記実施例８および９に記載したように、ＮＦＳ６０細胞株を用いる細胞増殖アッセイで生物活性をアッセイすることができる。
マウス野生型ＧＭ−ＣＳＦおよびマウスＴ３ＣＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインは、ヒトＷＴ−ＧＭ−ＣＳＦについて記載した手順（実施例１４〜１６）に従って大腸菌から単離したが、ただしヒトＧＭ−ＣＳＦについて記載した１５％ではなく３０％硫酸アンモニウムを用いてマウスタンパク質をフェニル−セファロース・カラムに結合させた。マウスＴ３Ｃ変異体は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ Ａ３Ｃシステイン・ムテインについて上記で記載したプロトコルを用い、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび４０ｋＤａにより容易にＰＥＧ化された。これらのＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、実施例８および９に記載のように、ＮＦＳ６０細胞増殖アッセイで測定した。
実施例１８
野生型ヒトエリスロポエチンの大腸菌発現および精製
Ａ．大腸菌中への分泌によるエリスロポエチンの発現。
野生型ヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）をコードするＤＮＡは、昆虫細胞中のＥｐｏの発現に用いられてきたベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５中のＥｐｏ用遺伝子（インビトロｇｅｎ）を含むプラスミドｐＢＢＴ３５８（下記参照）からＰＣＲによって増幅した。ｐＢＢＴ３５８中のＥｐｏ用遺伝子は、変異誘発過程を容易にするためのＸｈｏＩ制限酵素認識部位を作成する（成熟Ｅｐｏの）アミノ酸８４および８５のコドンにおける３個のサイレント変異を除いては、天然ｃＤＮＡと類似している。
ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を作成する３個の変異は、Ｈｏｒｔｏｎ他（１９９３）およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のように「オーバーラップ・エクステンションによる変異誘発」の技術を用いて構築した。ＸｈｏＩ構築の最初の、すなわち「一次」ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．４μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・プラスミドｐＢＢＴ１３２（ｐＵＣ１９中のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントしてクローニングされた野生型Ｅｐｏ−Ｆｌａｇ遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載））１ｎｇ、Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＢＲＬ）２単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．２５単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中、反応体積５０μｌで行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９５℃５分、［９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃４５秒］２５サイクル、７２℃保持７分および４℃保持とした。用いたプライマー対は、［ＢＢ３６１×ＢＢ１２５］および［ＢＢ３６２×ＢＢ１２６］とした。ＢＢ３６１（５＞ＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧ＞３；配列番号７９）は、成熟Ｅｐｏのアミノ酸残基８１−８９をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ１２５（５＞ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＡ＞３；配列番号１７）は、クローン化Ｅｐｏ配列の約２０ｂｐ上流のｐＵＣ１９ベクター配列にアニールする。ＰＣＲ産物を１．５％アガロース・ゲル上に展開し、ゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従って単離した。次いで、これら２種類の変異誘発されたフラグメントを、次の、すなわち「二次」ＰＣＲ反応で一緒に「スプライシング」した。この反応では、ゲル精製した一次反応の各ＰＣＲ産物０．３μｌをテンプレートとして用い、ＢＢ１２５およびＢＢ１２６をプライマーとして用いた。反応体積は５０μｌとし、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．５単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次ＰＣＲのアリコートをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、予想した約１９０ｂｐのバンドを観察した。二次ＰＣＲ反応の全体を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＫｐｎＩおよびＳｔｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、ＫｐｎＩおよびＳｔｕＩで切断されたｐＢＢＴ１３８（ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５中のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングされた野生型Ｅｐｏ−Ｆｌａｇ遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１））と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、ＸｈｏＩ部位を含み４３３ｂｐのＫｐｎＩおよびＳｔｕＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
成熟タンパク質の分泌を大腸菌周辺質に導くペプチド配列であるＳＴＩＩシグナルペプチドに融合したＥｐｏの発現の場合、ＰＣＲ反応に用いるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のＮ末端コード領域にアニールするＢＢ５８３（５＞ＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣ
ＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣ＞３；配列番号４６）、および遺伝子のＣ末端コード領域にアニールするＢＢ５８５（５＞ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣ＞３；配列番号４７）あるいはＢＢ５８６（５＞ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣ＞３；配列番号４８）とした。ＢＢ５８５には、ｃＤＮＡ配列によって予測されるＣ末端アミノ酸であるＡｒｇ１６６のコドンが含まれるが、ＢＢ５８６はＡｒｇ１６６コドンを削除し、Ｃ末端アミノ酸としてＡｓｐ１６５をコードする。得られた約６００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化したｐＢＢＴ２２７（実施例９）ベクター中にクローニングし、ＳＴＩＩリーダー配列と野生型Ｅｐｏのアミノ末端コード配列との間の融合物を作成した。ＢＢ５８３およびＢＢ５８５を用いるＰＣＲによって形成される遺伝子をＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−完全長（ＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−ＦＬ）と呼び、ＢＢ５８３およびＢＢ５８６を用いるＰＣＲによって形成される遺伝子をＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−ｄｅｓＡｒｇ（ＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−ｄＲ）と呼ぶ。次いで、正しい配列のＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−ＦＬクローンおよびＳＴＩＩ−Ｅｐｏ−ｄＲクローンをＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＢＴ２５７（実施例１４に記載）中にサブクローニングし、それぞれｐＢＢＴ４７７およびｐＢＢＴ４７８を作成した。
ｐＢＢＴ４７７およびｐＢＢＴ４７８をＪＭ１０９中に形質転換し、菌株ＢＯＢ５７８およびＢＯＢ５７９を作成した。これらの菌株は、ＢＯＢ４９０（ｐＢＢＴ２５７／ＪＭ１０９）と併せ、回転培養管中、３７℃で１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ媒地中、Ａ６００におけるＯ．Ｄ．約０．０２５まで希釈し、振とうフラスコ中３７℃でインキュベートした。通常、培養液２５ｍｌを２５０ｍｌ振とうフラスコ中で培養した。培養液のＯ．Ｄ．が約０．３〜０．５に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えてＥｐｏ野性型あるいはＥｐｏ ｄｅｓ Ａｒｇ１６６の発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後４および約１９時間に培養液をサンプリングした。試料を既製の１４％トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。ＢＯＢ５７８とＢＯＢ５７９の誘導培養液は共に、約２０ｋＤａにバンドを示し、これは野性型Ｅｐｏの分子量と一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるＢＯＢ４９０の誘導培養液では検出されなかった。
Ｂ．大腸菌の細胞質でのＭｅｔ−エリスロポエチンの発現。
実施例１８のＡ．に記載したように、野生型ヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）をコードするＤＮＡは、野性型Ｅｐｏの遺伝子を含むプラスミドｐＢＢＴ３５８からＰＣＲによって増幅した。大腸菌の細胞質中におけるｍｅｔ−Ｅｐｏの発現の場合、ＰＣＲ反応に用いるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のＮ末端コード領域にアニールするＢＢ５８４（５＞ＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣ＞３；配列番号４９）、および上述のＢＢ５８５（５＞ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣ＞３；配列番号４７）あるいはＢＢ５８６（５＞ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣ＞３；配列番号４８）とした。得られた約６００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化したｐＢＢＴ２２７（実施例９）ベクター中にクローニングし、メチオニル−Ｅｐｏをコードする遺伝子を作成した。ＢＢ５８３およびＢＢ５８５を用いるＰＣＲによって形成される遺伝子をｍｅｔ−Ｅｐｏ−完全長（ｍｅｔ−Ｅｐｏ−ＦＬ）と呼び、ＢＢ５８３およびＢＢ５８６を用いるＰＣＲによって形成される遺伝子をｍｅｔ−Ｅｐｏ−ｄｅｓＡｒｇ（ｍｅｔ−Ｅｐｏ−ｄＲ）と呼ぶ。次いで、正しい配列のｍｅｔ−Ｅｐｏ−ＦＬおよびｍｅｔ−Ｅｐｏ−ｄＲを、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＢＴ２５７（実施例１４に記載）中にサブクローニングし、それ
ぞれｐＢＢＴ４７９およびｐＢＢＴ４８０を作成した。
ｐＢＢＴ４７９およびｐＢＢＴ４８０をＪＭ１０９中に形質転換し、菌株ＢＯＢ５８０およびＢＯＢ５８１を作成した。これらの菌株について、ＢＯＢ４９０（ｐＢＢＴ２５７／ＪＭ１０９）と併せた発現実験は、ＳＴＩＩ−Ｅｐｏ構築物についての上述した実験と同一であった。ＢＯＢ５８０とＢＯＢ５８１の誘導培養液は共に、約２０ｋＤａにバンドを示し、これは野性型Ｅｐｏの分子量と一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるＢＯＢ４９０の誘導培養液では検出されなかった。
実施例１９
エリスロポエチン・システイン・ムテインの構築、大腸菌発現、精製および生物活性
Ａ．Ｅｐｏシステイン・ムテインの構築。
部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発手順を用いてＥｐｏシステイン・ムテインを構築する方法およびＥＰＯ中のシステイン・ムテインの位置として好ましい部位は、ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７、ならびにＩｎｎｉｓ他（１９９０）およびＷｈｉｔｅ（１９９３）ならびに本明細書に示す様々な実施例に記載されている。さらに、Ｌ８０は、システイン置換ムテインに好ましいもう一つの部位である。
組み換えエリスロポエチンおよびエリスロポエチンのシステイン・ムテインは、野性型ＥＰＯについて実施例１８に記載の手順を用い、大腸菌で発現させることができる。Ｂ−ｐｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、製造者のプロトコルに従って細菌を溶解し、不溶性の部分を遠心分離により単離した。ペレットを、２０ｍＭシステイン、６Ｍグアニジン、２０ｍＭトリスを用いて可溶化する。混合物を室温で１〜２時間撹拌した後、２０ｍトリス、ｐＨ８、４０μｍ硫酸銅、２％ラウロイル・サルコシンで１：２０（体積／体積）に希釈する。再生物を４℃で２４〜４８時間放置する。リフォールディングされたＥＰＯおよびＥＰＯシステイン・ムテインは、２０ｍＭ Ｍｅｓ、ｐＨ５、０．０１％Ｔｗｅｅｎおよび２０％グリセロール（緩衝液Ａ）で平衡化したＳ−セファロース・カラムを用いて精製する。緩衝液Ａに溶かした０〜１Ｍ ＮａＣｌの線形グラジエントを用い、Ｓ−セファロース・カラムからＥＰＯを溶出することができる。組み換えＥＰＯをさらに精製するために二次カラムが必要な場合には、ＳＥＣ、Ｂｌｕｅ−セファロース、ヒドロキシアパタイト、またはＨＩＣ樹脂（フェニル、ブチル）が含まれる。
実施例２０
システイン・ムテインのジスルフィド結合性三量体およびジスルフィド結合性高次多量体の構築
２個以上の「遊離」システインを有するＧＨ変異体を構築し、それらを用いてＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のようにｈＧＨの高次ジスルフィド結合性多量体を作成できると考えられる。このような変異体は、実施例１および２ならびにＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のように、大腸菌中で発現させ、リフォールディングして精製することができるであろう。次いで、続くプロセシングステップを用い、実施例２およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１に記載のように、ジスルフィド結合形成を誘導することができるであろう。このような条件下では、Ｔ３Ｃなどの１個の遊離システインを有するいくつかのｈＧＨ変異体は、ほぼ定量的にジスルフィド結合性二量体に変換される。同一または類似の条件下では、２個の遊離システインを有するｈＧＨ変異体、例えばＴ３Ｃと別のシステイン・ムテインを組み合わせた二重変異体による分子間ジスルフィド形成により、ｈＧＨ分子の重合が起こり、このようなポリマーの鎖長は原則として無制限と考えられる。Ｔ３Ｃ変異体および／または他のシステイン・ムテインなどのただ１個の遊離システインを有するｈＧＨ分子を重合反応に加えることにより、鎖長を制限したりある程度制御することができるであろう。成長するポリマーとただ１個の遊離システインを有する分子との間のジ
スルフィド結合形成が、未完成ポリマー中の２個の重合部位のうちの１個を「キャップする」か、それ以上の伸長を防いでくれるはずである。続いてのただ１個の遊離システインを有する第二のｈＧＨ分子と未完成ポリマーの他の重合部位との反応は、重合を終了させてポリマー分子の長さを確定する。平均ポリマー長は、反応剤の化学量論、すなわち２個の遊離システインを含むｈＧＨ分子と１個の遊離システインを含むｈＧＨ分子との比率によって制御できると考えられる。平均して短めのポリマーは小さな比率によることが好ましく、平均して長めのポリマーが大きな比率によるのが好ましい。より複雑な「分枝」ポリマーは、３個以上の遊離システインを含むｈＧＨ変異体とただ１個の遊離システインを有するｈＧＨ変異体が関与する反応から構築されると考えられる。
続いて、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィなどのクロマトグラフ法により、個別のサイズのポリマーを精製できると考えられる。ＧＨについて記載された手順と同様の手順を用い、Ｇ−ＣＳＦ、α−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦおよび他のタンパク質のジスルフィド結合性二量体および高次の多量体を作成できると考えられる。
実施例２１
野性型ヒト・エンドスタチンのクローニング、発現および精製
Ａ．エンドスタチンをコードするクローン化ＤＮＡ配列。
エンドスタチンをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ３８３（５＞ＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧ＞３；配列番号５０）および逆方向プライマーＢＢ３８４（５＞ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴ＞３；配列番号５１）で行った。プライマーＢＢ３８３は、ヒト・エンドスタチンのコード配列の５′末端にアニールし、逆方向プライマーＢＢ９２は、エンドスタチン・コード配列の３′末端にアニールする。得られた約６００ｂｐのＰＣＲ産物をＭｕｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化したｐＢＢＴ２２７（実施例９）ベクター中にクローニングし、ＳＴＩＩリーダー配列とヒト・エンドスタチンのアミノ末端コード配列との間の融合物を作成した。その配列を確認した後、順方向プライマーＢＢ４３４（５＞ＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣ＞３；配列番号５２）およびＢＢ３８４（配列番号５１）によるＰＣＲ増幅により、細胞内発現のために遺伝子を修飾した。ＢＢ４３４は、メチオニン（ｍｅｔ）コドンをエンドスタチンのアミノ末端に融合する。得られた約６３０ｂｐのフラグメントをＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで消化し、同様に消化した上記のＳＴＩＩ−エンドスタチン−ｐＵＣ１８プラスミド中にクローニングした。次いで、正しい配列のｍｅｔ−エンドスタチン・クローン（ｐＢＢＴ３７０）をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＢＴ２５７（実施例１４に記載）中にサブクローニングし、ｐＢＢＴ３７１を作成した。
Ｂ．大腸菌ｐＢＢＴ３７１における野性型ｍｅｔ−エンドスタチンの発現。
Ｍｅｔ−エンドスタチン野性型をコードするｐＢＢＴ３７１、および親ベクターであるｐＢＢＴ２５７を、大腸菌ＪＭ１０９中に形質転換して菌株ＢＯＢ４６０およびＢＯＢ４９０を作成し、Ｗ３１１０中に形質転換して菌株ＢＯＢ４６１およびＢＯＢ３４０を作成した。これらの菌株は、回転培養管中、３７℃で１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中、Ａ６００におけるＯ．Ｄ．で約０．０２５まで希釈し、振とうフラスコ中３７℃でインキュベートした。通常、培養液２５ｍｌ
を２５０ｍｌ振とうフラスコ中で培養した。培養液のＯ．Ｄ．が約０．３〜０．５に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えてヒトｍｅｔ−エンドスタチンの発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後０、４および約１９時間に培養液をサンプリングした。試料を既製の１４％トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。ＢＯＢ４６０とＢＯＢ４６１の誘導培養液は共に、約２０ｋＤａにバンドを示し、これは成熟ヒト・エンドスタチンと一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるＢＯＢ４６０とＢＯＢ４６１の非誘導培養液ならびにＢＯＢ４９０およびＢＯＢ３４０の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。約２０ｋＤＡのバンドは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した商品として調製されたヒト・エンドスタチンと同時に移動した。
実施例２２
ヒト・エンドスタチン・システイン・ムテインの構築、発現、精製および生物活性
Ａ．エンドスタチン・システイン・ムテインの構築。
ＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１ならびにＩｎｎｉｓ他（１９９０）およびＷｈｉｔｅ他（１９９３）に記載の手順と類似した部位特異的ＰＣＲをベースとする変異誘発手順を用い、１１種類の変異体ヒト・エンドスタチン遺伝子を構築した。４種類のムテイン［＊−１Ｃ、Ｈ２Ｃ、Ｒ５Ｃ、およびＦ７Ｃ］はアミノ末端領域中で構築した（アミノ酸残基は、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ他（１９９８）において番号付けされた残基から１３０を引くことによって番号が付けられている）。３種類のムテインは、遺伝子の中心の周囲にある配列によってコードされる残基で構築した［Ｇ９０Ｃ、Ｇ９８Ｃ、およびＨ１１２Ｃ］。３種類のムテインは、カルボキシ末端領域中で構築した［Ｌ１５４Ｃ、Ｒ１５７Ｃ、およびＳ１６２Ｃ］。さらに１種類のムテイン［Ｒ２８Ｃ］は、エンドスタチンの活性部位内の残基で構築した。これは、バイオアッセイにおける対照タンパク質として役割を果たす。
変異誘発性ＰＣＲ反応に用いるテンプレート・フラグメント源はｐＢＢＴ３７０とした。ＰＣＲ産物を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｑｉａｇｅｎ
ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて抽出し、これらと同一の制限酵素により切断されたｐＢＢＴ３７０ベクターＤＮＡと連結し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて抽出した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたＰＣＲフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびＰＣＲ反応または合成オリゴヌクレオチド・プライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。
システイン置換変異＊−１Ｃは、３回のＰＣＲ増幅を用いて以下のように構築した。変異誘発性順方向・オリゴヌクレオチドＢＢ５３１（５＞ＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＡＣＴＴＣＣ＞３；配列番号５３）は、Ｎ末端ＡＴＧメチオニン・コドンと１番目のＣＡＣヒスチジン・コドンの間にＴＧＣシステイン・コドンが挿入するように設計した。このオリゴを、エンドスタチン・コード配列の下流６０ｂｐ内のｐＵＣ１８ベクター配列にアニールする逆方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１２６（５＞ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡ＞３；配列番号５４）と共にＰＣＲ＃１で用いた。このＰＣＲ用テンプレートは、ｐＢＢＴ３７０に由来する精製１２６４ｂｐ ＮｈｅＩ−ＡｐａＬＩフラグメントとした。このフラグメントは、全エンドスタチン・コード配列およびエンドスタチン遺伝子の下流にある６７０ｂｐのｐＵＣ１８配列を含み、ＢＢ１２６がアニールする配列が含まれる。ＰＣＲ＃１は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各プライマー０．４μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各２００μＭ、テンプレート・フラグメント０．５ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１
単位、およびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．１単位を含有する１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液中、２５μｌ反応で行った。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、９５℃５分、［９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒］２２サイクル、７２℃保持７分および４℃保持とした。
ＰＣＲ＃２は、ＢＢ５３１の逆相補体である変異誘発性逆方向・オリゴヌクレオチドＢＢ５３２（５＞ＧＧＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＣ＞３；配列番号５５）、およびＮｄｅＩ部位の４０ｂｐ上流のｐＵＣ１８配列にアニールする非変異誘発性プライマーＢＢ１２５（５＞ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴ＞３；配列番号１７）を用いて行った。ＰＣＲ＃２用テンプレートは、全エンドスタチン・コード配列およびエンドスタチン遺伝子フラグメントの５′末端にあるＮｄｅＩ部位の上流にある３６７ｂｐのｐＵＣ１８配列を含み、ｐＢＢＴ３７０に由来する精製９９０ｂｐ ＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとし、ＢＢ１２５がアニールする配列が含まれる。ＰＣＲ＃２の構成成分およびプログラムはＰＣＲ＃１と同一である。ＰＣＲ＃１および＃２のアリコート１０μｌをアガロース・ゲル電気泳動により分析し、各々が予想したサイズの単一フラグメントを生成したことが分かった。
ＰＣＲ＃３は、非変異誘発性プライマーＢＢ１２５およびＢＢ１２６を用い、５０μｌ反応で行った。このＰＣＲ用のテンプレートは、ＰＣＲ＃１ １μｌおよびＰＣＲ＃２ ０．３μｌとした。ＰＣＲ＃３の構成成分は、反応１および２と同一である。反応プログラムは、９５℃５分、［９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分］２３サイクル、７２℃保持７分および４℃保持とした。ＰＣＲ＃３のアリコート１０μｌをアガロース・ゲル電気泳動により分析し、予想した通りに７４０ｂｐのフラグメントを生成したことが分かった。反応の残りを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、供給メーカーのプロトコルに従って「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＮｈｅＩおよびＢｓｒＧＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップ・ステップの後、消化生成物を、ＮｈｅＩおよびＢｓｒＧＩで切断されたｐＢＢＴ３７０と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて「クリーン・アップ」した。連結反応を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。＊−１Ｃ変異を有し、２０５ｂｐＮｈｅＩ−ＢｓｒＧＩセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｈ２Ｃ、Ｒ５Ｃ、Ｆ７Ｃ、およびＲ２８Ｃ（すなわち、２位のヒスチジンをシステインに変えたなど）は、異なる変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いたことを除いては（表１６）、＊−１Ｃについて上記に詳述したプロトコルを用いて構築し、配列決定した。順方向変異誘発性オリゴヌクレオチドは、常に逆方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１２６およびテンプレートとしての精製１２６４ｂｐＮｈｅＩ−ＡｐａＬＩフラグメントと共に用い、逆方向変異誘発性オリゴヌクレオチドは、常に順方向の非変異誘発性プライマーＢＢ１２５およびテンプレートとしての精製９９０ｂｐＳｓｐ−ＥｃｏＲＩフラグメントと共に用いた。
Figure 2011173911
ムテインＧ９０ＣおよびＧ９８Ｃは、変異誘発性オリゴヌクレオチドが異なり（表１６）、ＰＣＲ＃３用のテンプレートがＰＣＲ＃１ ０．５μｌおよびＰＣＲ＃２ ０．５μｌであることを除いては、＊−１Ｃについて記載した方法に類似した方法を用いて構築した。さらに、「クリーン・アップ」後、ＰＣＲ＃３をＢｓｒＧＩおよびＢｓｕ３６Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、追加のクリーン・アップ・ステップに続いて、消化生成物を、ＢｓｒＧＩおよびＢｓｕ３６Ｉで切断したｐＢＢＴ３７０と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて「クリーン・アップ」した。
ムテインＬ１５４Ｃ、Ｒ１５７Ｃ、およびＳ１６２Ｃは、変異誘発性オリゴヌクレオチドが異なり（表１６）、ＰＣＲ＃３用のテンプレートがＰＣＲ＃１ ０．３μｌおよびＰＣＲ＃２ １μｌであることを除いては、＊−１Ｃについて記載した方法に類似した方法を用いて構築した。さらに、「クリーン・アップ」後、ＰＣＲ＃３をＢｓｕ３６ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、追加のクリーン・アップ・ステップに続いて、消化生成物を、Ｂｓ
ｕ３６ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＢＢＴ３７０と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて「クリーン・アップ」した。
ムテインＨ１１２Ｃは、＊−１Ｃについて記載した方法といくつかの点で異なる方法によって構築した。まず、ＰＣＲ＃１で用いる順方向変異誘発性オリゴヌクレオチドの配列が異なり（表１６）、反応の体積は２５μｌではなく５０μｌとした。ＰＣＲ＃２およびＰＣＲ＃３は必要がないために行わなかった。代わりに、アリコート１０μｌをゲル電気泳動により分析し、この反応物をＰＣＲ＃３を通常処理するのとほぼ同様に処理した。すなわち、反応物の残りをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってＢｓｕ３６ＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる追加のクリーン・アップ・ステップに続いて、消化生成物を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＢＢＴ３７０と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて「クリーン・アップ」した。連結反応を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。
Ｂ．大腸菌におけるｍｅｔ−エンドスタチンのシステイン・ムテインの発現。
正しい配列の各ｍｅｔ−エンドスタチン・システイン・ムテインをＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＢＴ２５７（実施例１４に記載）中にサブクローニングし、一組の発現プラスミドを作成し、これをＪＭ１０９中に形質転換して発現試験で用いる菌株を作成した。
これらの菌株は、回転培養管中、３７℃で１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中、Ａ６００におけるＯ．Ｄ．で約０．０２５まで希釈し、振とうフラスコ中３７℃でインキュベートした。通常、培養液２５ｍｌを２５０ｍｌ振とうフラスコ中で培養した。培養液のＯ．Ｄ．が約０．３〜０．５に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加え、その菌株に特異的なエンドスタチン・システイン・ムテインの発現を誘導した。誘導前、誘導後４時間および誘導後１６時間に試料を集めた。試料を既製の１４％トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。エンドスタチン・システイン・ムテイン菌株の誘導培養液は、約２０ｋＤａにバンドを示し、これは成熟ヒト・エンドスタチンと一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるＢＯＢ４９０誘導および非誘導培養液では検出されなかった。約２０ｋＤＡのバンドは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した商品として調製されたヒト・エンドスタチンと同時に移動した。
Ｃ．エンドスタチンおよびエンドスタチン・システイン・ムテインの発現および精製。
発現した野生型エンドスタチンまたはエンドスタチン・システイン・ムテインＲ５Ｃを含む大腸菌を遠心分離によってペレット化し、−８０℃で冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）のプロトコルに従ってＢ−ＰＥＲ（商標）細菌タンパク質抽出試薬５ｍＬで処理した。エンドスタチン・タンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、Ｂ−ＰＥＲ中に懸濁した。この混合物をリゾチーム（２００μｇ／ｍｌ）で１０分間処理して細胞壁をさらに破壊し、ＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）およびプロテアーゼ非含有ＤＮＡｓｅ（２μｇ／ｍｌ）を加えた。不溶性のエンドスタチンを遠
心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞の破片の大部分を除去した。リフォールディングのために、不溶性のエンドスタチンを含有する得られたペレットを、２０ｍＭトリス・ベース中の８Ｍ尿素、１０ｍＭシステイン２０ｍｌに溶かした。この混合物を室温で１２０分間撹拌した。シスチンを最終濃度１０ｍＭまで加えた後、氷冷した３Ｍ尿素、４０μＭ硫酸銅、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５
２００ｍｌ中に希釈した。このリフォールド混合物を４℃で３日間ゆっくりと撹拌した。リフォールド混合物のｐＨを希ＨＣｌで５．０に調整し、混合物を遠心分離した後、４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で平衡化したＳ−セファロース・カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐ）５ｍｌ上に載せた。０〜１００％緩衝液Ｂ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。主にエンドスタチンを含有するＳ−セファロース分画をプールし、ｐＨを７．４に調整した後、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中で予め平衡化したヘパリン−セファロース（Ｈｉ ｔｒａｐ）カラム上に載せた。このカラムを０〜１Ｍ
ＮａＣｌ塩グラジエントで溶出した。純粋なエンドスタチンを含むヘパリン・カラム分画を集めて冷凍した。エンドスタチン・システイン変異体Ｇ９０Ｃ、Ｇ９８Ｃ、Ｈ１１２Ｃ、およびＲ１５７Ｃも、ヘパリン・カラムのステップを省略した上記のプロトコルを用いて部分的に精製した。
Ｒ５Ｃエンドスタチン・システイン・ムテインは、１５倍過剰の５ｋＤａ ＰＥＧマレイミドおよび１０〜１５倍過剰のＴＣＥＰを用いてＰＥＧ化した。反応によりモノＰＥＧ化Ｒ５Ｃタンパク質が得られた。
Ｄ．エンドスタチン・バイオアッセイ：リフォールディングされた野生型組み換えエンドスタチンおよびリフォールディングされたＲ５Ｃエンドスタチン・システイン・ムテインは、Ｋｉｍ他（２０００）によって記載されたＭＭＰ−２阻害アッセイを用いて生物学的に活性であることが判明した。
タンパク質の生物活性はまた、内皮細胞増殖阻害アッセイで測定することができる。内皮細胞増殖のインビトロにおける阻害は、以下のように行うことができる。５０００個のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）をゼラチンで覆った９６ウエル培養プレート上にプレートし、ｂＦＧＦを含有するＨＭＶＥＣ−Ｌ培地１００μｌ中で２４時間インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２）することができる。次いで、エンドスタチン、エンドスタチン・システイン・ムテインまたはＰＥＧ化エンドスタチン・システイン・ムテインの段階希釈液を含有する培地２０μｌで培地を置き換え、２０分間インキュベートする。次いで、ｂＦＧＦを含有する新鮮なＨＭＶＥＣ−Ｌ培地８０μｌをウエルに加える。７２時間後、細胞数を測定することができる。様々なエンドスタチンは、アッセイの終了時における内皮細胞数の用量依存的減少によって明らかなように、内皮細胞の増殖を阻害するはずである。
実施例２３
組み換えアンジオスタチン・システイン・ムテインのリフォールディング
アンジオスタチンは、グリコシル化されていない場合にも十分に活性であり、したがってその製造に真核生物の発現系を必要としない。ヒト・プラスミノーゲンの最初の４個のクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）・サブユニットからなるヒト・アンジオスタチンのコード配列は、ヒト・プラスミノーゲンｃＤＮＡテンプレート（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手できる）からＰＣＲ増殖させることができる。野生型アンジオスタチンおよびアンジオスタチン・システイン・ムテインは、周辺質空間にタンパク質を運ぶためにＳＴＩＩまたはｏｍｐＡタンパク質由来の細菌シグナル配列を成熟アンジオスタチンのＮ末端上に融合することにより、大腸菌から分泌させることができる。この方法はまた、アンジオスタチンのフラグメ
ント（クリングル（Ｋ）１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ２−３、（Ｃａｏ他、１９９６））についてもうまく用いられている。あるいは、アンジオスタチンおよびアンジオスタチン・システイン・ムテインは、大腸菌または他の宿主細胞の細胞質に発現させることができる。アンジオスタチンは、１３個のジスルフィドを形成する２６個のシステインを有する。したがって、システイン・ブロッキングを付加しない従来のリフォールド・プロトコルは、アンジオスタチンのようにシステインに富んだタンパク質では成功しないであろう。アンジオスタチン中にシステイン残基を導入する好ましい部位には、Ｋ９７Ｃ（成熟アンジオスタチンのＮ末端上に付加されたシステイン残基）、Ｔ３６５Ｃ、３７１Ｃ、Ｓ４６０Ｃ、Ａ４６３Ｃ、および＊４６６Ｃ（成熟アンジオスタチンタンパク質のＣ末端上に付加されたシステイン残基）が含まれる。
組み換えアンジオスタチンまたはアンジオスタチン・システイン・ムテインを発現する細菌細胞は、製造者のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）によって記載されたように、Ｂ−ｐｅｒを用いて溶解することができる。不溶性部分は遠心分離によって単離することができる。ペレットは、２０ｍＭシステイン、６Ｍグアニジン、２０ｍＭＴρισの混合物を用いて可溶化することができる。混合物を室温で２時間撹拌した後、２０ｍＭトリス中に１０倍希釈することができる。このリフォールドを４℃で１〜２日間保持することができる。この時間の終了時に、リフォールドを遠心分離し、リジン−セファロース・カラムを用いることによりアンジオスタチンタンパク質（すなわちシステイン・ムテイン）を精製することができる。リフォールド混合物は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で予め平衡化したカラム上に直接載せることができる。０〜１２ｍＭ ε−アミノカプロン酸（Ｅ−ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ ａｃｉｄ）のグラジエントを用い、樹脂からアンジオスタチン（またはアンジオスタチン・システイン・ムテイン）を遊離させることができる。さらに精製が必要な場合には、様々なイオン交換またはＨＩＣ樹脂を用いて行うことができる。
実施例２４
ＰＥＧ化タンパク質のペプチド・マッピング
多くの場合、ペプチド・マップを用いてＰＥＧ化の部位を確認することができる。通常、ＰＥＧ化タンパク質は、システイン・ムテインが他にシステイン残基を含まないペプチド中に存在するように特異的に消化される。ペプチドと共有結合したＰＥＧの存在は、消化混合物を逆相ＨＰＬＣによりアッセイする場合に保持時間を劇的に変えるはずである。文献（Ｃｌａｒｋ他、１９９６）による条件を用いてトリプシンでＧＨを消化した場合、可能性のあるトリプシンによって生じた２１種類のペプチド（Ｔ１〜Ｔ２１、連続して番号付けされた）を単離することができる。変異Ｔ３Ｃを含む残基１〜８に相当するＴ１は、野生型（６４分）すなわち下垂体成長ホルモンに対してシステイン変異体（６１分）のわずかに早い保持時間にシフトする。５Ｋ ＰＥＧでＰＥＧ化された場合には、Ｔ１ペプチドはクロマトグラムの最後に移動し、保持時間は１００分を超える。ＧＨをエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化する場合には、１０種類のペプチド（Ｌ１〜１０、連続して番号付けした）残基１〜３８に相当するＬ１は、野生型ＧＨの場合には約５９分に、ムテインＴ３Ｃの場合には６１分に溶出する。２０Ｋ ＰＥＧでＰＥＧ化された場合には、Ｌ１はクロマトグラムから消える。これらのデータは、ＰＥＧ部分が天然システインではなく、予想通りに３位のシステイン残基に結合していることを支持している。ＰＥＧ化前後のＩＦＮ（トリプシンおよびエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ）、ＧＭ−ＣＳＦ（エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ）、およびＧ−ＣＳＦ（エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ）のシステイン・ムテインの酵素的消化およびＲＰ ＨＰＬＣ分析もまた、新たに導入されたシステイン残基における単一部位のＰＥＧ化に一致するデータを示した。
実施例２５ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインによって開始される末梢血前駆細胞動員
組み換えＧ−ＣＳＦおよび組み換えＧＭ−ＣＳＦによる処理は、化学療法後の好中球および血小板のより急激な産生および移植を引き起こす末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）を動員することが分かっている。ＰＢＰＣ動員（および潜在的動員速度）の亢進は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの存在下で評価することができる。明確な骨髄細胞プロフィールおよび増殖速度を有することが知られている脾臓摘出（ｓｐｌｅｅｎｃｔｏｍｉｚｅｄ）マウスに、Ｇ−ＣＳＦ（野生型またはニューポジェン（登録商標））またはＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインを静脈内または皮下で１回または１日１回（７日まで）投与することができる。各実験はまた、等張性食塩水に懸濁したマウス血清アルブミンからなる担体のみで処理される一群のマウスを含むことができる。処理後、末梢血を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡ含有試験管中に集めることができる。ＣＢＣ分析を行うことができる。大腿骨および骨髄の内容物を洗い流すことにより骨髄細胞を採取することができる。クリスタル・バイオレットによる染色および血球計計数により白血球数を測定することができる。血液密度勾配分画を用いて低密度細胞を単離し、前駆細胞アッセイで用いることができる。前駆細胞アッセイのプロトコルは、Ｂｒｉｄｄｅｌｌ他（１９９３）に概略が述べられている。基本的には、二重層寒天をベースとするシステム（Ｂｒａｄｌｅｙ他、１９７８）を用い、原始的（高増殖性コロニー形成細胞）前駆細胞と成熟（顆粒球マクロファージ・コロニー形成細胞）前駆細胞を共に評価することができる。Ｉｓｃｏｖｅ他（１９７４）によって開発されたメチルセルロースをベースとするアッセイ系を用い、赤芽球コロニー形成を評価することができる。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦシステイン・ムテインは前駆細胞および幹細胞の動員を促進するはずである。同様の試験は、ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインおよび野生型ＧＭ−ＣＳＦについても行うことができる。最終的には、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦシステイン・ムテインの存在下における致命的に照射を受けたマウスにおける移植の効率および移植過程を促進する能力を検討することができる。
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本発明の様々な実施形態を詳細に述べてきたが、これらの実施形態の修正形態および適応形態が当業者の頭に浮かぶことは明らかである。しかしながら、そのような修正形態および適応形態が本発明の範囲内にあることは明確に理解されるであろう。

Claims (2)

  1. 単離モノＰＥＧ化ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）システインムテインであって、
    ポリエチレングリコールが、Ｇ−ＣＳＦ成熟タンパク質のＴ１（１番目の位置のスレオニン：以下同様に、アルファベットはアミノ酸の一文字記号を指し、数字は成熟タンパク質内の置換されるアミノ酸の位置を指す）、Ｐ２、Ｌ３、Ａ６、Ｓ７、Ｗ５８、Ａ６８、Ｅ９３、Ａ１２９、Ｔ１３３、Ａ１３６、Ａ１３９、Ａ１４１およびＱ１７３から選択されたアミノ酸と置換されたシステイン残基に取り付けられるか、または
    ポリエチレングリコールが、Ｇ−ＣＳＦ成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されたシステインに取り付けられており、
    前記ムテインはヒトＧ−ＣＳＦに応答して増殖する細胞系統を用いたインビトロ増殖バイオアッセイで１００ｐｇ／ｍＬ以下のＥＣ50を有する、単離モノＰＥＧ化ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）システインムテイン。
  2. 単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）システインムテインであって、
    システインが、Ｇ−ＣＳＦ成熟タンパク質のＰ２（２番目の位置のプロリン：以下同様に、アルファベットはアミノ酸の一文字記号を指し、数字は成熟タンパク質内の置換されるアミノ酸の位置を指す）、Ａ６、Ｓ７、Ｗ５８、Ａ６８、Ｅ９３、Ａ１２９、Ｔ１３３、Ａ１３６、Ａ１３９、Ａ１４１およびＱ１７３から選択されたアミノ酸と置換されているか、または
    システインが、Ｇ−ＣＳＦ成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されており、
    前記ムテインはヒトＧ−ＣＳＦに応答して増殖する細胞系統を用いたインビトロ増殖バイオアッセイで１００ｐｇ／ｍＬ以下のＥＣ50を有する、単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）システインムテイン。
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