JP5517844B2 - 単離された単ｐｅｇ化ヒト成長ホルモンタンパク質及び医薬品の製造におけるその使用 - Google Patents

単離された単ｐｅｇ化ヒト成長ホルモンタンパク質及び医薬品の製造におけるその使用 Download PDF

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Description

本発明は、一般的にはタンパク質の製造法、より特定的には、ジスルフィド結合を形成していない「自由」システインを含む組換えタンパク質に関する。
低コストの作用持続型「ユーザーフレンドリー」タンパク質製剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の開発には患者やヘルスケアプロバイダーから大きな関心が寄せられている。タンパク質は、製造コストが高く、かつ、通常の小分子薬とは異なり、一般に体内に吸収されにくい。さらにタンパク質は経口摂取すると消化される。したがって、タンパク質は、典型的には注射による投与を必要とする。注射後、ほとんどのタンパク質は急速に体外に排泄されるので、頻繁に、多くの場合毎日、注射する必要がある。患者は注射を嫌がり、その結果、注射の回数が減り、薬効が低下する。エリスロポエチン（ＥＰＯ）などのある種のタンパク質は、投与回数が少なくても（ＥＰＯの場合には毎週３回）有効であるが、これは、それらのタンパク質がグリコシル化されるからである。グリコシル化には、哺乳動物細胞発現系を用いて組換えタンパク質を製造する必要があるが、これには費用がかかるので、タンパク質医薬品のコストが増大する。
したがって、患者やヘルスケアプロバイダーに対してタンパク質製剤のコストを低減させるタンパク質送出技術の開発が大いに求められている。この問題に対する１つの解決法は、タンパク質を頻繁に注射しなくてすむように、体内におけるタンパク質製剤の循環半減期を延ばす方法を開発することである。また、この解決法は、［ユーザーフレンドリー］タンパク質製剤、すなわち、頻繁に注射する必要の無いタンパク質製剤に対する患者の要求及び要望をも満足させる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるタンパク質の共有結合修飾は、体内におけるタンパク質の循環半減期を延ばす有用な方法であることが証明された（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，１９８４；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，１９８７；Ｍｅｙｅｒｓら，１９９１）。タンパク質にＰＥＧを共有結合させると、タンパク質の有効サイズが増大すると共に、タンパク質の体外へのクリアランス速度が低下する。ＰＥＧは数種のサイズで市販されており、異なるサイズのＰＥＧを用いることにより、ＰＥＧ修飾タンパク質の循環半減期を個々の適用に合わせることができる。文献に記載されているＰＥＧ修飾の他のインビボ利点は、（タンパク質をプロテアーゼから保護することによると考えられる）タンパク質の溶解度、安定性の増大、及びタンパク質の免疫原性の低下である（Ｋａｔｒｅら，１９８７；Ｋａｔｒｅ，１９９０）。
ＰＥＧ化タンパク質を得るための１つの公知方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ＰＥＧなどの化合物を用いて、典型的にはリシン残基又はＮ末端アミノ酸でＰＥＧを自由アミンに結合させる。この方法の重大な弱点は、通常、タンパク質がＮ末端アミノ酸のほかに数個のリシンを含んでおり、ＰＥＧ部分は任意の利用可能な自由アミンで非特異的にタンパク質に結合するために、不均一な産物混合物が生成することである。多くのＮＨＳ−ＰＥＧ化タンパク質は、比活性が低くかつ不均一性であるために商業用には不適である。不活化は、生物活性に必要な１つ以上のリシン残基又はＮ末端アミノ酸を共有結合修飾するか、又はタンパク質の活性部位近くでＰＥＧ部分を共有結合させた結果として生じる。
本出願に特に関連性があるのは、ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を含めたアミン反応性試薬でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を修飾すると、このタンパク質の生物活性が１０分の１未満に低下するという知見である（Ｔｅｈ及びＣｈａｐｍａｎ，１９８８；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。ＧＨは下垂体から分泌される２２ｋＤａのタンパク質である。ＧＨは、骨、軟骨及び筋肉の代謝を促進し、幼児期の身体成長を促進する生体の主要ホルモンである。小児のＧＨ機能不全、ターナー症候群、腎機能不全に起因する小人症（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）の治療には組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）が用いられる。ＧＨは、細菌中で産生させると、グリコシル化されず、完全に活性である。このタンパク質はインビボでは半減期が短いので、最大効力を得るためには毎日皮下注射により投与しなければならない（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら，１９９６）。
作用持続型ｈＧＨの開発には大きな関心が寄せられている。ｈＧＨをアミン反応性ＰＥＧ試薬でＰＥＧ化して作用持続型ｈＧＨを創出しようとする試みは、ＰＥＧ化すると生物活性が著しく低下してしまうためにあまり成功をおさめていない。さらに、ｈＧＨは多重部位でＰＥＧ化される（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。ｈＧＨは、Ｎ末端アミノ酸のほかに９個のリシンを含んでいる。これらのリシンのいくつかは、受容体の結合に不可欠であることが知られているタンパク質領域に位置している（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９８９；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，１９８９）。これらのリシン残基を修飾すると、ｈＧＨの受容体結合及び生物活性が有意に低下する（ｄｅｌａ Ｌｌｏｓａら，１９８５；Ｍａｒｔａｌら，１９８５；Ｔｅｈ及びＣｈａｐｍａｎ，１９８８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，１９８９）。ｈＧＨをＮＨＳ−ＰＥＧ試薬で修飾するのは容易だが、ＮＨＳ−ＰＥＧタンパク質の生物活性がひどく低下し、５個の５ｋＤａのＰＥＧ分子で修飾したＧＨタンパク質の場合には野生型ＧＨの生物活性のわずか１％になってしまう（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。この多重ＰＥＧ化ＧＨタンパク質のＥＣ５０は、４４０ｎｇ／ｍｌすなわち約２０ｎＭである（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨは、有意に低下した生物活性を有することに加えて、ＰＥＧ分子の異なるメンバーが異なるアミノ酸残基でタンパク質に結合するために極めて不均一性となり、それがこのタンパク質の潜在的治療剤としての有用性に影響を与える。Ｃｌａｒｋら（１９９６）は、動物におけるＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨの循環半減期を非修飾ＧＨに比べて有意に延長できることを証明した。ラットＧＨ欠失モデルでは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨは、有意に低下したインビトロ生物活性を有しているにもかかわらず有効であり、非修飾ｈＧＨより投与回数を少なくすることができた（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。しかし、動物モデルで効力を得るためには、修飾タンパク質の比活性の低さから、高用量のＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（ラット１匹当たり１回の注射毎に６０〜１８０μｇ）が必要であった。より高い生物活性を保持するＰＥＧ化ｈＧＨタンパク質を創出するさらに良い方法が必要なことは明らかである。また、均一なＰＥＧ−ｈＧＨ産物を創出するようにｈＧＨをＰＥＧ化する方法の開発も必要である。
数種の他の重要な市販タンパク質の生物活性は、アミン反応性ＰＥＧ試薬により有意に低下する。ＥＰＯは、タンパク質の生物活性に不可欠な数個のリシン残基を含んでいる（Ｂｏｉｓｓｅｌら，１９９３；Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９９６）が、ＥＰＯのリシン残基を修飾すると、生物活性がほぼ完全に失われる（Ｗｏｊｅｈｏｗｓｋｉ及びＣａｓｌａｋｅ，１９８９）。αインターフェロン−２をアミン反応性ＰＥＧで共有結合修飾すると、生物活性が４０〜７５％失われる（Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ，１９９０；Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら，１９９５）。生物活性の喪失は、大型（例えば、１０ｋＤａ）ＰＥＧを用いると最大になる（Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら，１９９５）。Ｇ−ＣＳｆをアミン反応性ＰＥＧで共有結合修飾すると、６０％を超える生物活性の喪失が生じる（Ｔａｎａｋａら，１９９１）。ＩＬ−２をアミン反応性ＰＥＧで広範囲に修飾すると、９０％を超える生物活性の喪失が生じる（Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ，１９９０）。
第２の公知タンパク質ＰＥＧ化法は、システイン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧをシステイン残基に共有結合させる。種々の反応性基（例えば、マレイミド、ビニルスルホン）を有する多くの高特異的システイン反応性ＰＥＧや種々のサイズのＰＥＧ（２〜４０ｋＤａ）が市販されている。これらのＰＥＧ試薬は、中性ｐＨでは、「自由」システイン残基、すなわち、ジスルフィド結合に関与していないシステイン残基に選択的に結合する。大部分のタンパク質のシステイン残基はジスルフィド結合に参加しているので、システイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧ化には利用できない。組換えＤＮＡ技術を用いたインビトロ突然変異誘発によって、追加のシステイン残基をタンパク質のどこにでも導入することができる。新たに付加された「自由」システインは、システイン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧ分子を特異的に結合させるための部位として使うことができる。付加システイン残基は、タンパク質のアミノ末端の前もしくはタンパク質のカルボキシ末端の後に付加されるか、又はタンパク質の２個のアミノ酸の間に挿入されて、タンパク質中に存在するアミノ酸の代替物となり得る。あるいは、天然型（ｎａｔｉｖｅ）ジスルフィド結合に関与する２個のシステインのうちの１個を欠失させるか又は別のアミノ酸と置き換えて、天然型システイン（通常なら、欠失又は置換されたシステイン残基と一緒にジスルフィド結合を形成しているタンパク質中のシステイン残基）を自由にして、化学修飾に利用できるようにしてもよい。システインと置換されるアミノ酸は、セリン又はアラニンなどの中性アミノ酸であるのが好ましい。成長ホルモンは２個のジスルフィド結合を有しており、これらのジスルフィド結合は、生物活性に影響を与えることなく、ヨードアセトイミドで還元して、アルキル化することができる（Ｂｅｗｌｅｙら，１９６９）。４個のシステインはいずれも欠失又は別のアミノ酸による置換の適当な標的である。
数種の天然タンパク質は１個以上の「自由」システイン残基を含むことが知られている。そのような天然タンパク質の例としては、ヒトインターロイキン（ＩＬ）−２、βインターフェロン（Ｍａｒｋら，１９８４）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｌｕら，１９８９）及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９２）が挙げられる。ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びβインターフェロンが奇数のシステイン残基を含んでいるのに対し、塩基性繊維芽細胞増殖因子は偶数のシステイン残基を含んでいる。
しかし、自由システイン残基を含む組換えタンパク質の発現は、生理的条件下では遊離スルフヒドリルの反応性のために問題が多かった。自由システインを含む数種の組換えタンパク質がＥ．ｃｏｌｉなどの細菌中で細胞内タンパク質として発現された。例としては、ＩＬ−２、βインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、塩基性繊維芽細胞増殖因子などの天然タンパク質や、ＩＬ−２（Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ，１９９０）、ＩＬ−３（Ｓｈａｗら，１９９２）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（Ｔｕｍａら，１９９５）、ＩＧＦ−Ｉ（Ｃｏｘ及びＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，１９９４）、ＩＧＦＢＰ−１（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇら，１９９７）ならびにプロテアーゼネキシン及び関連タンパク質（Ｂｒａｘｔｏｎ，１９９８）の人工設計システイン変異タンパク質がある。これらのタンパク質はすべて細菌中で細胞内発現させると不溶性であった。不溶性タンパク質は、一連の変性、還元、再折りたたみ手順を実施すると、天然型コンフォメーションを再生することができる。これらのステップによって、細菌中でタンパク質を産生させる製造プロセスの時間とコストが増大する。自由システイン残基を別のアミノ酸、例えばセリンに置き換えることにより、安定性と収率が改良されたＩＬ−２（Ｍａｒｋら，１９８５）及びβインターフェロン（ＤｅＣｈｉａｒａら，１９８６）が得られた。上記の余分なステップを排除するために、組換えタンパク質を可溶性かつ生物学的活性形態で発現させることが望ましいであろう。
細菌中で可溶性組換えタンパク質を発現させる１つの公知方法は、これらのタンパク質をペリプラズム空間又は培地中に分泌させる方法である。ＧＨなどのある種の組換えタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム中に分泌させると可溶性の活性形態で発現するが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で細胞内発現させると不溶性になることが知られている。分泌は、成長ホルモン又は他の目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列をｓｔＩＩ（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９８８）及びｏｍｐＡタンパク質（Ｇｈｒａｙｅｂら，１９８４）由来のものなどの細菌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列と融合させることにより達成される。細菌中で組換えタンパク質を発現させることは、組換えタンパク質の天然Ｎ末端を維持することができるので望ましい。組換えタンパク質を細胞内発現させるには、組換えタンパク質のアミノ末端にＮ末端メチオニンが存在することが必要である。メチオニンは、多くのヒトタンパク質の成熟型のアミノ末端には通常存在していない。例えば、成熟型ヒト成長ホルモンのアミノ末端アミノ酸はフェニルアラニンである。組換えタンパク質を細菌中で効率的に発現させるためには、組換えタンパク質のアミノ末端にアミノ末端メチオニンが存在しない場合、メチオニンをこの位置に付加しなければならない。典型的には、アミノ末端メチオニンの付加は、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列の前にＡＴＧメチオニンコドンを付加して行う。付加されたＮ末端メチオニンは、特に組換えタンパク質が不溶性である場合、組換えタンパク質から取り除かれないことが多い。ｈＧＨの場合がこれにあたり、この場合、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で細胞内発現させるとＮ末端メチオニンは取り除かれない。付加Ｎ末端メチオニンは、潜在的にヒトの免疫反応を促進し得る「非天然」タンパク質を生成する。これに反し、ｓｔＩＩ（Ｃｈａｎｇら，１９８７）又はｏｍｐＡ（Ｃｈｅａｈら，１９９４）シグナル配列を用いてペリプラズム空間中に分泌されるｈＧＨには付加メチオニンは存在せず、組換えタンパク質は、天然型アミノ末端アミノ酸フェニルアラニンから始まる。天然型ｈＧＨタンパク質配列は、ｓｔＩＩ（又はｏｍｐＡ）シグナル配列と成熟ｈＧＨタンパク質の開始部分との間でｓｔＩＩ−ｈＧＨタンパク質（又はｏｍｐＡ−ｈＧＨタンパク質）を切断する細菌酵素のために維持される。ペリプラズム空間は、ジスルフィド結合の形成を促進する酸化的環境であると考えられているが、タンパク質のジスルフィドイソメラーゼとウシ膵臓トリプシンインヒビターとを共発現させると、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムからの正しく折りたたまれたタンパク質の収率が６倍も増大した（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，１９９６）。この結果は、ペリプラズムタンパク質の折りたたみがときどき非能率的になることがあるので、タンパク質を大規模生産するためには改良の余地があることを示唆しているといえよう。
ｈＧＨは、２個のジスルフィド結合を形成する４個のシステインを有している。ｈＧＨは、ｓｔＩＩ又はｏｍｐＡシグナル配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム中に分泌させることができる。分泌されたタンパク質は可溶性かつ生物学的に活性である（Ｈｓｉｕｎｇら，１９８６）。ｈＧＨの主要分泌形態は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基づく見かけ分子量２２ｋＤａを有する単量体である。組換えｈＧＨは、浸透ショック法（Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｏｔｓｔｅｉｎ，１９８０）を用いてペリプラズム空間から単離することができるが、浸透ショック法は、選択的に、細胞内タンパク質ではなくペリプラズムタンパク質を浸透ショック緩衝液中に放出する。次いで、放出されたｈＧＨをカラムクロマトグラフィーにかけて精製する（Ｈｓｉｕｎｇら，１９８６）。
自由システイン残基（５システイン；２Ｎ＋１）を含むｈＧＨ変異型を分泌させるために類似の方法を試みたときに、組換えｈＧＨ変異型は、ｈＧＨ用に開発された標準浸透ショック法及び精製法を用いて単離すると多量体や集塊を形成することがわかった。浸透ショック溶解物中で非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うか又はカラムクロマトグラフィーによるタンパク質精製中に、極くわずかな単量体ＧＨ変異タンパク質を検出することができた。
αインターフェロン（ＩＦＮ−α２）も２個のジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を含んでいる。ＩＦＮ−α２は、ｓｔＩＩシグナル配列を用いてＥ．ｃｏｌｉペリプラズム中に分泌させることができる（Ｖｏｓｓら，１９９４）。分泌されたタンパク質は可溶性かつ生物学的に活性である（Ｖｏｓｓら，１９９４）。ＩＦＮ−α２の主要分泌形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく見かけ分子量１９ｋＤａを有する単量体である。分泌された組換えＩＦＮ−α２は、カラムクロマトグラフィーにかけて精製することができる（Ｖｏｓｓら，１９９４）。
自由システイン残基（５システイン；２Ｎ＋１）を含むＩＦＮ−α２変異型を分泌させるために類似の方法を試みたとき、組換えＩＦＮ−α２変異型は、ＩＦＮ−α２用に開発された標準精製法を用いて単離すると、多量体及び集塊を形成することがわかった。ＩＦＮ−α２変異型は、ＩＦＮ−α２とは極めて異なる態様でカラムから溶出され、ＩＦＮ−α２用に開発されたカラムクロマトグラフィー法を用いて、極くわずかな単量体ＩＦＮ−α２タンパク質を精製することができた。
自由システイン残基を含むタンパク質の代替合成法は、翻訳後に、スクシンイミジル６−［（３−２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート〔ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から市販されているＬＣ−ＳＰＤＰ〕との化学反応を経てチオール基をタンパク質中に導入する方法である。ＬＣ−ＳＰＤＰはリシン残基と反応して遊離スルフヒドリル基を生成する。この試薬をマレイミドタンパク質修飾試薬（Ｓｙｔｋｏｗｓｋら，１９９８）と共に用いて、化学架橋された二量体ＥＰＯを調製した。ＥＰＯ中の種々のリシン残基が非特異的に修飾されるために、精製後、化学架橋ＥＰＯタンパク質のヘテロロガスな混合物が回収された。化学架橋ＥＰＯタンパク質の薬物動態学及びインビボ効力が強化されていることが観測された。
タンパク質のサイズを増大させかつタンパク質のインビボ効力を高めるために用いられている別の方法は、化学架橋試薬を用いてタンパク質を二量重合することを含む。ＧＨは、２個のＧＨ受容体を架橋させて細胞シグナルを形質導入すると考えられている。ＧＨ−ＧＨ二量体は、受容体の二量重合の強化及びその後の細胞内シグナルの増幅を促進し得る。
化学架橋二量体ｈＧＨタンパク質は、Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅら（１９９８）によって記載されている。水溶性架橋試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてＧＨをランダムに誘導体化し、主生成物としてアミド結合二量体を得たが、用いたＥＤＣ試薬の濃度によっては、アミド結合多量体も生成した。最終タンパク質製剤は、インビボ効力の増強が観測されたもの、ＥＤＣ試薬と、タンパク質中のリシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基ならびにアミノ末端及びカルボキシ末端を含めた種々のアミノ酸との非特異的反応のために不均一であった。そのような製剤をヒトに注射することは、ＥＤＣの毒性や、タンパク質間に形成された非天然アミド結合に対する免疫原性応答の可能性のために望ましくないであろう。精製タンパク質のばらつきのないバッチを生成することも製造規模の点で困難であろう。
したがって、多大な努力が費やされたにもかかわらず、依然として、タンパク質分子量を拡大することにより作用持続型組換えタンパク質の均一製剤を生成す方法が必要とされている。また、自由システイン残基を含む組換えタンパク質を高収率で分泌、回収し得る方法も必要である。本発明は、これらの要求を満たすだけでなく、関連利点をも提供する。
上記した課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、同単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループ及びヘリックスＡのすぐ前の領域からなる群より選択されるタンパク質の領域に配置されるアミノ酸に結合されたポリエチレングリコールを含み、同単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに応答して増殖する細胞系のインビトロでの増殖を刺激し、かつ同単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、１１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質、を提供する。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループにあるアミノ酸に結合され、かつ同単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、ことをその要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスＡのすぐ前の領域にあるアミノ酸に結合され、かつ同単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、１１ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、ことをその要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは直鎖ポリエチレングリコール及び分枝鎖ポリエチレングリコールからなる群より選択される、ことをその要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールはシステイン反応性ポリエチレングリコールである、ことをその要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、マレイミド−ポリエチレングリコール、ビニルスルホン−ポリエチレングリコール及びヨードアセチル−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、ことをその要旨とする。
請求項７に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質はヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合された少なくとも一つの付加チオール基を含む、ことをその要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、ａ）ポリエチレングリコールがヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合する条件下にて同ヒト成長ホルモンタンパク質をポリエチレングリコールにさらす工程と、ｂ）単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって単ＰＥＧ化されていないヒト成長ホルモンタンパク質から単離する工程と、によって得られる、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質を提供する。
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、分子ふるい分けカラムクロマトグラフィーによって測定された場合７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有する、ことをその要旨とする。
請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質を二つ以上含む、混合物を提供する。
請求項１１に記載の発明は、ヒト成長ホルモンを用いて治療可能な症状を治療するための医薬品の製造における、請求項１に記載の単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質の使用を提供する。
請求項１２に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループにあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、ことをその要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質において、前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスＡのすぐ前の領域にあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、ことをその要旨とする。
本発明は、自由システインを有する可溶性タンパク質を得る方法に関する。本発明の方法は、一般に、可溶性タンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップと、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露するステップと、宿主細胞から可溶性タンパク質を単離するステップとによって成就される。１つの実施態様において、タンパク質は、宿主細胞によって培地中に分泌されるのではなく、システインブロック剤の存在下に宿主細胞を破壊し、破壊された宿主細胞の可溶性画分から可溶性タンパク質を単離又は精製する。別の実施態様では、可溶性タンパク質は宿主細胞によって培地中に分泌され、宿主細胞は、可溶性タンパク質の合成前、合成時又は合成後にシステインブロック剤に暴露される。
適当な宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞が挙げられる。宿主細胞は細菌細胞、特にＥ．ｃｏｌｉであるのが好ましい。
本発明の方法によって生産される可溶性タンパク質は、組換えタンパク質、特に、タンパク質のシステイン変異型又は変異タンパク質である。本発明の方法は、ヒト成長ホルモン、ＥＰＯ及びインターフェロン、特にαインターフェロン、それらの誘導体又はアンタゴニストを含むがそれらには限定されないタンパク質の生産に有用である。他のタンパク質には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−Ａ、血小板由来増殖因子−Ｂ、神経成長因子、脳由来神経栄養性因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、血管内皮細胞増殖因子、又はそれらの誘導体もしくはアンタゴニストが含まれる。免疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖のシステイン変異タンパク質も企図される。
有用なシステインブロック剤としては、例えば、金属イオン存在下の、シスチン、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化グルタチオン、ヨウ素、過酸化水素、ジヒドロアスコルビン酸、テトラチオネート、Ｏ−ヨードソベンゾエート又は酸素を含めた任意のチオール反応性化合物などがある。
さらに、本発明の方法は、ＰＥＧ部分を可溶性タンパク質に結合させて、ＰＥＧ部分が自由システインを介して可溶性タンパク質に結合しているＰＥＧ化タンパク質を生成する種々の方法をも包含する。２個以上の可溶性タンパク質の共役を含む高次多量体タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。
さらに、本発明は、本明細書に開示されている方法によって製造されたＰＥＧ化タンパク質を含めた可溶性タンパク質及びそれらの誘導体を包含する。そのようなＰＥＧ化タンパク質としては、単ＰＥＧ化ｈＧＨ、ＥＰＯ及びαインターフェロンがある。
また、本発明は、本明細書に記載の方法により得られた可溶性タンパク質をＰＥＧ化する方法をも提供する。そのような方法は、タンパク質を精製するステップと、ジスルフィド還元剤を用いてタンパク質を少なくとも部分的に還元するステップと、タンパク質をシステイン反応性部分に暴露するステップとを含む。場合により、修飾システインタンパク質を非修飾タンパク質から分離することができる。
成長ホルモン、ＥＰＯ及びαインターフェロンによって治療可能な症状を治療する方法も本発明の範囲内に含まれる。可溶性タンパク質又はＰＥＧ化誘導体を含めたそれらの誘導体を、公知の成長ホルモン、ＥＰＯ又はαインターフェロンが有効である症状に罹患している患者に投与する。
以上、本発明によれば、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質が提供された。
標的ＤＮＡセグメントから２つの別個の断片を増幅させる、オーバーラップ延長による突然変異誘発の図。
本発明は、自由システイン残基を有するタンパク質を得る新規方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規方法によって生産された新規タンパク質、特に組換えタンパク質と共に、そのような組換えタンパク質の誘導体をも提供する。上記タンパク質を製造するための新規方法は、一般に、
（ａ）自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップと、
（ｂ）宿主細胞をシステインブロック剤に暴露するステップと、
（ｃ）宿主細胞からタンパク質を単離するステップ、によって達成される。
１つの実施態様において、本発明の方法は、システインブロック剤の存在下に宿主細胞を破壊するステップと、その後で、破壊された細胞の可溶性画分からタンパク質を単離するステップとを含む。
タンパク質が原核生物又は真核生物宿主細胞によって培地中に分泌される他の実施態様において、本発明の方法は、
（ａ）自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップと、
（ｂ）宿主細胞を、自由システイン残基を有するタンパク質の合成時又は合成後にシステインブロック剤に暴露するステップと、
（ｃ）培地中の他の細胞成分からタンパク質を単離するステップ、を含む。
上述のように、これらの方法の第１ステップは、自由システイン残基を有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得ることである。適当な宿主細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞であってよい。組換えタンパク質の発現に用い得る適当な宿主細胞の例としては、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞がある。細菌細胞、なかでもＥ．ｃｏｌｉが特に有用である。
本明細書に用いられている限りにおいて、用語「自由システイン残基を有するタンパク質」とは、２Ｎ＋１個のシステイン残基（ここで、Ｎは０もしくは任意の整数）を含む任意の天然又は組換えタンパク質ペプチド、及び２Ｎ個のシステイン（ここで、通常、２個以上のシステインはジスルフィド結合に参加していない）を含むタンパク質又はペプチドを意味する。したがって、本発明の方法は、自由システインを有する任意のタンパク質又はペプチド、特に、１個以上の自由システインを有するか及び／又は天然ではジスルフィド結合を形成している２個以上のシステインを有する（本明細書では、「システイン変異タンパク質」もしくは「システイン変異型」と称される）システイン付加変異組換えタンパク質の発現、回収及び精製の強化に有用である。本発明の方法により、天然宿主細胞が発現する自由システインを有する天然タンパク質の発現、回収及び精製を強化することもできるが、本明細書の説明は、主として例証目的のみのために、組換えタンパク質に言及している。さらに、組換えタンパク質は、ヒト、ペット動物及び家畜を含めた任意の動物種由来であってよい。
したがって、本発明は多様な組換えタンパク質を包含する。これらのタンパク質には、グリア由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、インヒビンＡ、インヒビンＢ、骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、インヒビンα、ミューレル管抑制物質（ＭＩＳ）、ＯＰ−１（骨原性タンパク質−１）が含まれるがそれらには限定されず、これらはすべて、ＴＦＧ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの単量体サブユニットは、ある種の構造的特徴を共有している。これらの単量体サブユニットは、一般に、４個の分子内ジスルフィドを形成する高度に保存された８個のシステイン残基を含んでいる。典型的には、保存された９番目のシステインは、単量体形態のタンパク質中では自由であるが、単量体サブユニットのホモ二量重合又はヘテロ二量重合時に形成される細胞間ジスルフィド結合に参加する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーは、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０）、Ｄａｏｐｉｎら（１９９２）、Ｋｉｎｇｓｌｅｙ（１９９４）、Ｋｕｔｔｙら（１９９８）及びＬａｗｔｏｎら（１９９７）によって記載されており、これらの文献は本明細書に文献援用される。
免疫グロブリンのＨ鎖単量体及びＬ鎖単量体も、細胞内ジスルフィドに参加するシステイン残基と共に自由システインを含んでいる（Ｒｏｉｔｔら，１９８９及びＰａｕｌ，１９８９）。これらの自由システインは、通常、Ｈ鎖ホモ二量重合、Ｈ鎖−Ｌ鎖ヘテロ二量重合、（Ｈ鎖−Ｌ鎖）へテロ二量体のホモ二量重合などの多量重合事象や、ＩｇＭの場合における（Ｈ鎖−Ｌ鎖）へテロ二量体の五量重合などの高次アセンブリーの結果としてジスルフィド結合に参加するに過ぎない。したがって、本発明の方法は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥなどのヒト免疫グロブリンのＨ鎖及び／もしくはＬ鎖（又はそれらの種々のドメイン）の発現、回収及び精製の強化に用いることができる。他の種由来の免疫グロブリンも同様に、発現、回収、精製し得る。Ｃｈａｍｏｗ ＆ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（１９９６）に記載されているような免疫グロブリン又は免疫グロブリンドメインに遺伝子融合されたタンパク質も同様に、発現、回収、精製することができる。
本発明の方法は、成長ホルモンスーパーファミリーのメンバーを含めた追加の組換えタンパク質の発現、回収、精製を強化することもできる。以下のタンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリー〔Ｂａｚａｎ（１９９０）；Ｂａｚａｎ（１９９１）；Ｍｏｔｔ及びＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ及びＩｈｌｅ（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎら（１９９０）；Ｈａｎｎｕｍら（１９９４）〕の遺伝子によってコードされる：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養性因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、Ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、幹細胞因子及びｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）。遺伝子クローニング及びシーケンシングによって、将来、この遺伝子ファミリーの追加のメンバーが同定されると予想される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般に限られたアミノ酸又はＤＮＡ配列同一性しか有していないという事実にもかかわらず、類似した二次及び三次構造を有している。構造的特徴を共有することにより、この遺伝子ファミリーの新規なメンバーの同定が容易になる。
１群のタンパク質が、「シスチンノット」と称される共有構造モチーフに基づいて構造的スーパーファミリーとして分類されている。シスチンノットは、位相的に「結ばれた」３個の細胞内ジスルフィド結合を形成する保存された６個のシステイン残基によって規定されている（ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，１９９３）。また、これらのタンパク質は、ホモ二量体又はヘテロ二量体も形成し、場合によって、二量重合は、分子間ジスルフィドの形成を伴うことがある。このファミリーのメンバーには、ＴＧＦ−βスーパーファミリーや、血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの他のタンパク質が含まれる。システイン及び他のシステインブロック試薬も、この構造モチーフを有するタンパク質の発現、回収、精製を強化することができる。
さらに、本発明の方法は、他の組換えタンパク質及び／又はそれらのタンパク質のシステイン付加変異型の発現、回収、精製を強化することもできる。タンパク質群には、プロテアーゼや他の酵素、プロテアーゼ阻害剤、部位カイン、部位カインアンタゴニスト、アレルゲン、ケモカイン、ゴナドトロピン、ケモタクチン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎｓ）、脂質結合タンパク質、下垂体ホルモン、成長因子、ソマトメダン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄａｎｓ）、免疫グロブリン、インターロイキン、インターフェロン、可溶性受容体、ワクチン及びヘモグロビンが含まれる。タンパク質の特定の例としては、例えば、レプチン、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、スーパーオキシドジムスターゼ、カタラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、繊維芽細胞増殖因子、アルギナーゼ、フェニルアラニンアンモニア、アンギオスタチン、エンドスタチン、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、プロテアーゼネキシン及び抗トロンビンＩＩＩが挙げられる。
ＰＥＧ化から利益を得る、したがって、システイン付加修飾の適当な候補となる他のタンパク質変異型としては、低溶解度又は凝集傾向を有するタンパク質もしくはペプチド、タンパク分解を受けやすいタンパク質もしくはペプチド、機械的安定性の改良を必要とするタンパク質もしくはペプチド、体外に急速に排泄されるタンパク質もしくはペプチド、又は望ましくない免疫原性もしくは抗原性を有するタンパク質もしくはペプチドが挙げられる。
所望の場合、天然タンパク質の変異タンパク質は、一般に、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに概説されているような部位特異的ＰＣＲベース突然変異誘発を用いて構築することができる。典型的には、タンパク質のコード配列にタンパク質内の特定の位置でアミノ酸がシステイン残基に置き換わるヌクレオチド変化を組み込むようにＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを設計する。また、そのような突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質のコード配列のカルボキシ末端又はアミノ末端に追加のシステイン残基１個を組み込むように設計することもできる。後者の場合、所望なら、１個以上の追加のアミノ酸残基を付加システイン残基のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に組み込むこともできる。さらに、望ましい場合、タンパク質コード配列内の特定の位置に挿入変異としてシステイン残基を組み込むようにオリゴヌクレオチドを設計し得る。この場合も、１つ以上の追加のアミノ酸をシステイン残基と一緒に挿入してもよく、これらのアミノ酸はシステイン残基のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に配置し得る。
突然変異誘発性オリゴを得るための配列の選択は、所望のシステイン残基が配置される位置及び有用な制限エンドヌクレアーゼ部位の近さによって決められる。一般に、鋳型へのオリゴのアニーリングを促進するために、変異、すなわちミスマッチセグメントを、オリゴの真中近くに配置するのが望ましい。また、突然変異誘発性オリゴは、適当なベクター中にすぐにクローニングし得る断片を生成するようにＰＣＲ産物を切断し得るように、唯一の制限部位にわたるのが望ましい。１例としては、変異タンパク質の発現に用い得るもの、又は変異遺伝子を切り出して、直ぐにこの遺伝子を上記発現ベクター中にクローニングするのに都合の良い制限部位を提供するものがある。一般に、突然変異誘発性オリゴは、８０塩基長以下のものを用いるのが望ましく、３０〜４０塩基長であればなお好ましい。変異部位と制限部位とは、合成オリゴヌクレオチドの合成に望ましい間隔よりもっと離れている場合がある。そのような場合には、ＰＣＲを何回も実施して、ＰＣＲ産物が所望の有用な制限部位を含むか又は適切な位置に制限部位を組み込むべく突然変異誘発の目標に設定された遺伝子を再設計もしくは再合成し得るように、ＰＣＲ産物の長さを増分延長させることができる。あるいは、いわゆる「Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ」（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻，２７７−２８６ページ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）又は「Ｇｅｎｅ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｎｓｉｏｎ」（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻，２５１−２６１ページ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）（これらの文献はどちらも本明細書に文献援用される）などの変型ＰＣＲ突然変異誘発プロトコルを用いてそのような突然変異を構築することもできる。
次いで、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する。１つの実施態様において、ブロック剤は、細胞破壊時に存在し、好ましくは細胞を破壊する前に添加する。細胞破壊は、例えば、フレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ）などの機械的破壊、酵素消化、音波処理、ホモジナイゼーション、ガラスビーズ渦動（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、界面活性剤処理、有機溶剤、凍結融解、アルミナ又は砂による粉砕などによって実施し得る（Ｂｏｌｌａｇら，１９９６）。
代替実施態様において、システインブロック剤は、宿主細胞が所望タンパク質を発現するように誘導される前、間又は後に宿主細胞に暴露し得る。例えば、宿主細胞は、システインブロック剤の存在下に培養してもよく、これは、培地中に分泌されるタンパク質、例えばエリスロポエチンなどを発現させる場合に好ましいであろう。あるいは、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する前又は暴露しているときに、所望のタンパク質を、ペリプラズムもしくは培地中に分泌されるタンパク質又は細胞質タンパク質として発現するように、宿主細胞を誘導してもよい。細胞の起源に応じて、そのような発現を細胞質中で誘発させるか又は分泌を誘導したりするために、例えば、以下の実施例に記載の方法を含めた当業において公知の方法を用いることができる。タンパク質をペリプラズム空間に輸送するために多様なシグナルペプチドが用いられ、成功をおさめている。そのようなシグナルペプチドの例としては、ｏｍｐＡ、ｓｔＩＩ、ＰｈｏＡシグナル（Ｄｅｎｅｆｉｅら，１９８９）、ＯｍｐＴ（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６）、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦ（Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷｒｉｇｈｔ，１９８５）、β−ラクタマーゼ（Ｋａｄｏｎａｇａら，１９８４）、エンテロトキシン ＬＴ−Ａ、ＬＴ−Ｂ（Ｍｏｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９９１）及びＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，１９８６）などの原核生物シグナル配列がある。ある種のタンパク質の分泌を促進する多くの非天然合成シグナル配列も当業者には公知である。
ペリプラズム中に分泌されるタンパク質の場合、浸透ショック処理を用いて宿主細胞の外層膜を選択的に破壊し、ペリプラズムタンパク質を放出させることができる。浸透ショック緩衝液は、例えば、Ｈｓｉｕｎｇら（１９８６）に記載されているか、又は以下の実施例に記載されている浸透ショック緩衝液及び手順を含めた、当業では公知の任意のものであってよい。培地中に分泌されるタンパク質の場合、培地は、細胞が発現してタンパク質を分泌している間、システインブロック剤を含んでいるのが好ましい。システインブロック剤は、タンパク質分泌後に培地に添加することもできるが、但しタンパク質の精製前に添加する。
システインブロック剤は、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で培地に添加し得る。培地中のシステインブロック剤の濃度は、約５０μＭ〜約５ｍＭであるのが好ましい。
特定の定理に拘束されるのは本意ではないが、本発明の方法に用いられるシステインブロック剤は、「自由」システイン残基に共有結合して混合ジスルフィドを形成することにより、自由システイン残基を安定化し、タンパク質の多量重合及び集合を阻止すると考えられる。あるいは、浸透ショック緩衝液中の酸化剤の存在は、タンパク質がペリプラズム空間に分泌された後で不完全変性が生じた場合には、タンパク質の再折りたたみプロセスを増加させるかもしれない。しかし、上述のように、ペリプラズムタンパク質の再折りたたみは非能率的になることがある。この理由から、浸透ショック緩衝液にシステインを添加すると、たとえシステインが通常はジスルフィド結合を形成するにしても、整数のシステイン残基を含む組換えタンパク質の回収が増大すると考えられる。さらに、本発明者らは、細菌増殖時に発酵培地にシステイン又は類似化合物を添加するのは有利であると考える。何故なら、細菌の外層膜が多孔質性であるために、これらの化合物はペリプラズム中に拡散する筈だからである。タンパク質の折りたたみ及び自由システインのブロッキングは、細胞の回収及び溶解の前に実施し得る。タンパク質の早期安定化は、タンパク分解を防ぎ、組換えタンパク質の高回収率に寄与し得る。
自由システインを含むタンパク質を安定化するシステインブロック剤として多くのチオール反応性化合物を用いることができる。ブロック剤は、システインのほかに、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化グルタチオン、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）、ピリジンジスルフィドなどのジスルフィド結合を含む試薬、Ｒ−Ｓ−Ｓ−ＣＯ−ＯＣＨ３タイプの化合物、ジホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシスチン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチン、ジチオジプロピオン酸、ジメチルシスチンなどの他のシスチン誘導体、又は、ジスルフィド交換反応を受け得る任意のジチオールもしくは化学物質をさらに含み得る。混合ジスルフィドの製造には、スルフェニルハロゲン化物を用いてもよい。システイン付加タンパク質変異型の安定化に利用できる他のチオールブロック剤としては、遊離チオールと可逆反応し得る化合物が含まれる。これらの作用物質には、ある種の重金属塩又は亜鉛、水銀及び銀の有機誘導体が含まれる。他のメルカプチド生成剤又は可逆的チオール反応性化合物が、Ｒ．Ｃｅｃｉｌ及びＪ．Ｒ．ＭｃＰｈｅｅ（１９５９）ならびにＴｏｒｃｈｉｎｓｋｉｉ（１９７１）により記載されている。
一般方法の最終ステップでは、所望のタンパク質を、可溶性細胞質画分、可溶性ペリプラズム画分、又は培地の可溶性画分から回収及び精製する。培地、細胞質画分、又はペリプラズム画分からタンパク質を回収及び精製する任意の方法を用いることができる。このような回収法及び精製法（例えば、遠心分離、濾過、透析、（分子ふるい分け手順を含む）クロマトグラフィーなどを含む）は当業者に周知であるか、又は当業者により容易に決定される。所望のタンパク質を回収及び精製するのに適した方法は、そのタンパク質の性質と意図した用途によってある程度決まる。
本発明は、適切に処理されている回収されたインターフェロンのパーセントを著しく増加させる、可溶性インターフェロン、特にαインターフェロンを産生する新規の方法をさらに提供する。これらの方法は、インターフェロンを発現することができる宿主細胞を、約５〜約６．５、好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨ範囲で培養することを含む。高ｐＨを用いた公表済みの報告（Ｖｏｓｓら（１９９４））でしか５０％の適切に処理されたインターフェロンが得られなかったが、低ｐＨでの本発明の新たな方法を用いて約８０〜９０％が回収された。
単量体ｈＧＨシステイン変異型のいくつかが、これらのタンパク質を精製するために用いられたクロマトグラフィー手順の間にジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質を形成したことを発見した。システインをカラム緩衝液から除去した場合に、ジスルフィド結合ｈＧＨ２量体は形成した。ジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質は、このタンパク質を精製するために用いられたカラムクロマトグラフィーステップの間に、単量体ｈＧＨタンパク質とは異なる挙動を示すので、ジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質を精製するために新たな手順を開発した。思いがけずに、ジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質はインビトロバイオアッセイにおいて生物学的に活性であることを発見した。生物学的に活性であり均一なジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質は新規である。従って、さらに、本発明は、これらの生物学的に活性であり均一なジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質にも関する。以下の実施例で説明するように、３量体、４量体などのさらに上位のマルチマーも意図される。
次いで、所望であれば、精製されたタンパク質をさらに処理することができる。例えば、このタンパク質を、様々なシステイン反応性ＰＥＧ試薬を用いて自由システイン部位でＰＥＧ化し、その後、単ＰＥＧ化タンパク質を精製することができる。用語「単ＰＥＧ化」は、タンパク質の特定部位での単一ＰＥＧ分子の共有結合により修飾されたタンパク質を意味すると定義される。当業者に周知の任意の方法（例えば、以下の実施例、特に、実施例１１に記載の方法を含む）を使用することができる。
Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）は、タンパク質のシステイン変異タンパク質、特に、ＧＨ及びエリスロポエチンのシステイン変異タンパク質をＰＥＧ化する方法を教示している。特に、Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）は、システイン変異タンパク質をＰＥＧ化するために用いられる緩衝液には還元剤が含まれるべきではないことを教示している。Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）により示された還元剤の例は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。同様の方法を用いて、ＧＨ、エリスロポエチン、及びαインターフェロンのシステイン変異タンパク質をＰＥＧ化すると、これらのシステイン変異タンパク質はＰＥＧ化しないことを発見した。今や、これらの精製システイン変異タンパク質の還元剤による処理が、これらのタンパク質のＰＥＧ化に必要とされることが発見された。特定のどの理論にも縛られることを望まないが、本発明者らは、混合ジスルフィドを還元し、自由システインがＰＥＧ試薬と反応できるようにタンパク質中の自由システイン残基を暴露するために還元剤が必要とされると考えている。従って、本発明はまた、ＧＨ、エリスロポエチン、αインターフェロン、及び２Ｎ＋１システイン残基を含有する他のタンパク質、２Ｎシステイン残基を含有するタンパク質（２Ｎシステイン残基の２つ以上が自由である）のシステイン変異タンパク質（特に、自由システイン残基が混合ジスルフィドによりブロックされている変異タンパク質及びタンパク質）をＰＥＧ化する方法に関する。
さらに、本発明は、本明細書中に開示された方法により産生された精製単ＰＥＧ化タンパク質変異型に関する。前記変異型は、生物学的に活性であるだけでなく、タンパク質依存性哺乳動物細胞増殖アッセイにおいて高い比活性を保持している。このようなタンパク質変異型として、例えば、以下の精製された単ＰＥＧ化システイン変異タンパク質：ｈＧＨ、ＥＰＯ、及びαＩＦＮが挙げられる。例えば、単ＰＥＧ化ｈＧＨ変異型のインビトロ生物活性は、ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を用いてＰＥＧ化されているｈＧＨの生物活性より１０〜１００倍高い。
単ＰＥＧ化ｈＧＨの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをｈＧＨのＣ−Ｄループに接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化ｈＧＨは、約１１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満の、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌ（２．３ｎＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、ポリエチレングリコール部分をｈＧＨのへリックスＡに近接する領域に接着させることができ、結果として生じる単ＰＥＧ化ｈＧＨは、約１１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満の、好ましくは約１１ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）未満の、より好ましくは約２．２ｎｇ／ｍｌ（０．１ｎＭ）未満のＥＣ５０を有する。
単ＰＥＧ化ＥＰＯの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをＥＰＯのＣ−Ｄループに接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化ＥＰＯは、約１０００ｎｇ／ｍｌ（２１ｎＭ）未満の、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ（約６ｎＭ）未満の、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（約０．６ｎＭ）未満の、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ（約０．０６ｎＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、ポリエチレングリコール部分をＥＰＯのＡ−Ｂループに接着させることができ、結果として生じる単ＰＥＧ化ＥＰＯは、約１００ｎｇ／ｍｌ（約５ｎＭ）未満の、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ（約１ｎＭ）未満の、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ（約０．０５ｎＭ）未満のＥＣ５０を有する。
単ＰＥＧ化αＩＦＮの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをαＩＦＮのへリックスＡに近接する領域に接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化αＩＦＮは、約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満の、より好ましくは約５０ｐｇ／ｍｌ（約２．５ｐＭ）未満の、最も好ましくは約２２ｎｇ／ｍｌ（約１．２ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。あるいは、ポリエチレングリコール部分をＩＦＮ−α２のＣ−Ｄループに接着することができ、結果として生じる単ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２は、約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満のＥＣ５０を有する。
２５を超える別個のＩＦＮ−α遺伝子がある（Ｐｅｓｔｋａ，１９８７）。ＩＦＮ−αファミリーのメンバーは様々な程度のアミノ酸相同性を有し、一部重複する生物活性を示す。異なるＩＦＮ−αタンパク質の領域を結合することにより作成された非天然組換えＩＦＮ−αは、様々な臨床開発段階にある（Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ及びＤｉＭａｒｃｏ，１９９５）。ＩＦＮ−αの各位置で最もよく見られるアミノ酸を組み込んでいる非天然「コンセンサス」インターフェロン（Ｂｌａｔｔら，１９９６）もまた説明されている。ＩＦＮ−α２のシステイン変異タンパク質をＰＥＧ化するのに適した部位は、ＩＦＮ−α遺伝子ファミリーの他のメンバー及び非天然ＩＦＮ−αに直接適用できなければならない。Ｋｉｎｓｔｌｅｒら（１９９６）は、単ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンについて述べた。ここで、このタンパク質は、Ｎ末端にある非天然メニオニン残基で選択的に単ＰＥＧ化されている。ＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、非修飾コンセンサスインターフェロンと比較して約１／５に減少した（Ｋｉｎｓｔｌｅｒら，１９９６）。
さらに、本発明は、互いに、又は化学基と共有結合又は結合して、上位のマルチマー（例えば、２量体、３量体、及び４量体）を生成することができるタンパク質変異型を提供する。このような上位のマルチマーは、当業者に周知の方法に従って、又は以下の実施例１５に記載のように生成することができる。例えば、このような結合は、対応する未変性タンパク質より大きな分子量を有するｈＧＨ、ＥＰＯ、又はαＩＦＮ付加物を生成することができる。結合に適した化学基は、好ましくは、無毒かつ非免疫原性の化学基である。これらの化学基として、炭水化物又はポリオールなどのポリマーが挙げられる。
本発明のシステイン変異タンパク質に接着して、「ＰＥＧ化」タンパク質を形成するのに有用な「ＰＥＧ部分」として、任意の適切なポリマー（例えば、直鎖又は分枝鎖ポリオール）が挙げられる。好ましいポリオールは、エチレンオキシド単位からなる合成ポリマーであるポリエチレングリコールである。分子ふるい分けクロマトグラフィーにより約３０〜５００，０００の見かけの分子量を有するＰＥＧ化タンパク質変異型を得ることができるように、エチレンオキシド単位は変化してもよい。ＰＥＧ部分のサイズは、その循環半減期に直接影響する（Ｙａｍａｏｋａら（１９９４））。従って、特定の治療用途又は好ましい投与計画のために、ＰＥＧ部分のサイズ又は構造を変えることにより、異なる循環半減期を有するタンパク質変異型を作成することができる。従って、本発明は、分子ふるい分けクロマトグラフィーにより決定されるように約３０ｋＤａを超える、より好ましくは約７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有し、ＥＣ５０が約４００ｎｇ／ｍｌ（１８ｎＭ）未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）未満、さらにより好ましくは約２．２ｎｇ／ｍｌ（０．１ｎＭ）未満である、ＧＨタンパク質変異型を含む。さらに、本発明は、分子ふるい分けクロマトグラフィーにより決定されるように約３０ｋＤａを超える、より好ましくは約７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有し、ＥＣ５０が約１０００ｎｇ／ｍｌ（２１ｎＭ）未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（６ｎＭ）未満、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（０．６ｎＭ）未満、さらにより好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ（０．０６ｎＭ）未満である、ＥＰＯタンパク質変異型を含む。さらに、本発明は、分子ふるい分けクロマトグラフィーにより決定されるように約３０ｋＤａを超える、より好ましくは約７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有し、ＩＣ５０が約１９００ｐｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）未満、好ましくは４００ｐｇ／ｍｌ（２１ｐＭ）未満、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満、さらにより好ましくは約３８ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）未満である、αＩＦＮ（ＩＦＮ−α）タンパク質変異型を含む。
システイン修飾のための反応性ＰＥＧ末端基として、ビニルスルホン、マレイミド、及びヨードアセチル部分が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ末端基は自由チオールに特異的であり、その反応がタンパク質に無害な条件下で起こるべきである。
アンタゴニストｈＧＨ変異型はまた、化学的誘導体化が受容体結合を妨げないが、シグナリングプロセスを阻害するシステイン付加変異型ＧＨを用いて調製することができる。ＧＨアンタゴニストの投与によって利益を得る疾患として、先端肥大症、血管性眼疾患、糖尿病性腎障害、血管形成術後の再狭窄、及び成長ホルモン反応性悪性腫瘍などが挙げられる。
本明細書中で使用する用語「誘導体」は、本方法により発現及び回収されたタンパク質の任意の変異型を意味する。このような変異型として、ＰＥＧ化バージョン、２量体及び上位の変異型、アミノ酸変異型、融合タンパク質、炭水化物の変化、リン酸化又は天然タンパク質で見られる他の付着基、及び本明細書中に開示される他の任意の変異型が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明により産生される化合物は、様々なインビトロ及びインビボでの用途に用いることができる。本発明のタンパク質及びその誘導体は、野生型、天然、又は以前から知られている修飾された対応物について周知の研究、診断、又は治療目的に用いることができる。インビトロでの用途として、例えば、本発明のタンパク質を用いて、他のタンパク質をスクリーニング、検出、及び／又は精製することが挙げられる。
治療用途のために、当業者は、適切な用量、投与回数、及び投与経路を容易に決定することができる。このような決定を下す要因として、投与しようとするタンパク質の性質、治療しようとする疾患、患者の服薬遵守の可能性、患者の年齢及び体重などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物はまた、身体内の特定の標的に付着するか、又は標的への送達を指向する、治療薬の循環半減期を増すための送達ビヒクルとして使用することができる。
以下の実施例は制限するものとして意図されず、本発明の特定の実施態様を例示するだけである。
ヒト成長ホルモンのインビトロバイオアッセイの開発
ウサギＧＨ受容体で安定にトランスフェクトされたマウスＦＤＣ−Ｐ１細胞株を用いるｈＧＨ細胞増殖アッセイを開発した（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら，１９９５）。マウスＦＤＣ−Ｐ１細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、及び１７〜１７０単位／ｍｌマウスＩＬ−３を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＤＣ−Ｐ１培地）において日常的に増殖させた。
Ａ．ウサギＧＨ受容体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ウサギＧＨ受容体を、順方向プライマーＢＢ３（５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴ−３’）（配列番号１）及び逆方向プライマーＢＢ３６（５’−ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’）（配列番号２）を用いたＰＣＲによりクローニングした。ＢＢ３は、開始メチオニンと受容体のアミノ末端部分をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ３は、開始メチオニンの前に最適化されたＫＯＺＡＫ配列と、クローニング用のＢａｍＨＩ部位を含む。ＢＢ３６は、ウサギＧＨ受容体ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にアニールし、クローニング用のＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限部位を含む。ＰＣＲ増幅用の鋳型を生成するために、ウサギ肝臓ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ）から購入）を一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成の基質として使用した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ）のＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）用１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて達成した。並列第一鎖ｃＤＮＡ合成を、プライマーとしてランダムヘキサマー又はＢＢ３６を用いて行った。第一鎖合成産物を鋳型として用いた次のＰＣＲ反応を、プライマーＢＢ３及びＢＢ３６を用いて行った。ランダムヘキサマー又はＢＢ３６により増幅されたｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ反応で、予想された約１．９ｋｂのＰＣＲ産物が観察された。ランダムヘキサマーで増幅されたｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化した。ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩは、ウサギＧＨ受容体遺伝子が内部ＢａｍＨＩ部位を含むので２つの断片（約３６５ｂｐ及び約１６００ｂｐ）を生成する。両断片をゲル生成した。次いで、完全長ウサギＧＨ受容体ｃＤＮＡを２つのステップでクローニングした。最初に、約１６００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を、これらの同じ２つの酵素で消化されているｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））にクローニングした。これらのクローンは妥当な頻度で容易に得られ、制限消化及びその後の配列決定により決定される欠失の証拠を示さなかった。ウサギ受容体ｃＤＮＡクローンを完全にするために、１６００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を含む配列決定されたプラスミドの１つをＢａｍＨＩで消化し、ウシアルカリホスファターゼで処理し、ゲル精製し、ウサギＧＨ受容体遺伝子の５’部分を含むゲル精製された約３６５ｂｐのＢａｍＨＩ断片と連結した。この連結物による形質転換体をつつき、制限消化及びＰＣＲにより分析して、約３６５ｂｐの断片の存在を確認し、ウサギＧＨ受容体遺伝子の末端部分に対するその方向を決定した。次いで、１つの完全長クローンの配列を確認した。ｐＢＢＴ１１８と呼び、このプラスミドを用いて、ＦＤＣ−Ｐ１細胞を安定にトランスフェクトした。
Ｂ．ウサギＧＨ受容体を発現する、安定にトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞の選択
エンドトキシンを含まないｐＢＢＴ１１８ ＤＮＡを、キアゲン社「Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を用いて調製し、これを用いてＦＤＣ−Ｐ１細胞をトランスフェクトした。マウスＩＬ−３を、アールアンドディーシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。ＦＤＣ−Ｐ１細胞を、ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）から購入したＤＭＲＩＥ−Ｃカチオン化脂質試薬を用い、製造業者が推奨する説明書に従って、プラスミドｐＢＢＴ１１８でトランスフェクトした。簡単には、６ウェル組織培養ディッシュ中で４５分間、４μｇのプラスミドＤＮＡを、１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（ギブコ社（ＧＩＢＣＯ））に溶解した４〜３０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬と複合体化した。複合体形成の後、２００μｌのマウスＩＬ−３添加ＯｐｔｉＭＥＭ培地に溶解した２×１０６個のＦＤＣ−Ｐ１細胞を各ウェルに添加し、混合物を３７℃で４時間放置した。マウスＩＬ−３の最終濃度は１７単位／ｍｌであった。２ｍｌの１５％ウシ胎児血清含有ＦＤＣ−Ｐ１培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で一晩放置した。翌日、トランスフェクトされた細胞を、ＩＬ−３（１７Ｕ／ｍｌ）、ｈＧＨ（５ｎＭ）、及びウシ胎児血清ではなく１０％ウマ血清を添加したＦＤＣ−Ｐ１培地１５ｍｌを含有するＴ−７５組織培養フラスコに移した。ウシ胎児血清にはＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖促進活性が含まれるので、ウマ血清を使用した。３日後に、細胞を遠心分離し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１７Ｕ／ｍｌ ＩＬ−３、５ｎＭ ｈＧＨ、１０％ウシ血清を含有する新鮮なＦＤＣ−Ｐ１培地に再懸濁し、３７℃でインキュベートした。２〜３日毎に、培地を交換した。各トランスフェクションからの細胞を、新鮮な培地とマウスＩＬ−３（１７Ｕ／ｍｌ）又はｈＧＨ（５ｎＭ）のいずれかを含むＴ−７５組織培養フラスコに分けた。Ｇ４１８耐性細胞を、ＩＬ−３とｈＧＨの両方を含むフラスコから得た。バイオアッセイに用いた形質転換体は、ｈＧＨを含むフラスコに由来した。１２個の独立した細胞株を限界希釈により選択した。これらの細胞株のうち５個（ＧＨ−Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、及びＲ９）は、ｈＧＨに対して優れた増殖反応を示した。予備実験により、ｈＧＨについてのＥＣ５０は各細胞株で似ているが、増殖反応の大きさは株によって異なることが分かった。ＧＨ−Ｒ４細胞株を最も詳細に研究し、以下で示すアッセイに用いた。１０％ウマ血清、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、及び２〜５ｎＭ下垂体ｈＧＨ又はｒｈＧＨを含むＲＰＭＩ１６４０培地において、これらの細胞株を日常的に増殖させた。
Ｃ．ウサギＧＨ受容体を発現するＦＤＣ−Ｐ１を用いたｈＧＨバイオアッセイの開発
Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９５５）により説明されたＭＴＴ細胞増殖アッセイの改良版を、ｈＧＨ生物活性を測定するために開発した。本発明者らのアッセイでは、有機溶媒で可溶化しなければならない不溶性産物を生じるＭＴＴではなく、可溶性産物を生じる色素ＭＴＳの取り込み及び減少が測定される。ＭＴＳを使用する利点は、有機溶媒で細胞を溶解する必要なくウェルの吸光度を測定できることである。
ＧＨ−Ｒ４細胞を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１×１０５個細胞／ｍｌの濃度で、アッセイ培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウマ血清、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）に懸濁した。４０ｍｌマイクロリットルの細胞懸濁液（５×１０３個細胞）を、９６ウェル平底組織培養プレートのウェルに添加した。タンパク質サンプルの３倍連続希釈物をアッセイ培地で調製し、５０μｌの体積でマイクロ力価ウェルに添加し、ウェルあたり１００μｌの最終体積にした。タンパク質サンプルを、トリプリケートウェルでアッセイした。プレートを、加湿５％ＣＯ２組織培養インキュベータにおいて３７℃で６６〜７２時間インキュベートした。このとき、２０μｌのＭＴＳ／ＰＥＳ（ＰＥＳは電子結合剤（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｕｐｌｅｒ）である）試薬混合物（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬，プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を各ウェルに添加した。４９０ｎｍでのウェルの吸光度を２〜４時間後に測定した。トリプリケートウェルの吸光度値（平均＋／−標準偏差）を計算した。対照ウェルには培地が含まれたが、細胞は含まれなかった。サンプルウェルの吸光度値から対照ウェルの吸光度値（一般に０．０６〜０．２吸光度単位）を引いた。対照実験により、吸光度の信号が２の吸光度値まで細胞数と相関することが証明された。全てのアッセイに、ヒト下垂体ＧＨ標準が含まれた。アッセイ培地にＧ４１８が含まれず、ウマ血清の代わりにウシ胎児血清を使用したことを除いて、親ＦＤＣ−Ｐ１細胞株を用いた実験を前記のように行った。
ｒｈＧＨのクローニング及び発現
Ａ．ヒト成長ホルモン（ＧＨ）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＧＨ ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術とプライマーＢＢ１及びＢＢ２を用いて、ヒト下垂体一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社、パロアルト、カルフォルニア州（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されている）から増幅した。ＢＢ１の配列は、（５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号３）である。ＢＢ２の配列は、（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣ−３’）（配列番号４）である。成熟ＧＨの第１アミノ酸であるフェニルアラニンの前に開始メチオニンと、クローニング用のＳａｌＩ及びＮｄｅＩ部位をコードするように、プライマーＢＢ１を設計した。逆方向プライマーＢＢ２は、クローニング用のＢａｍＨＩ部位を含む。ＰＣＲ反応物は、２０ｐｍｏｌの各オリゴプライマー、ＩＸ ＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ２を含むＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ緩衝液）、２００μＭ濃度の４つの各ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、２ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡ、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））、及び２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ））を含んだ。ＰＣＲ反応条件は、９６℃３分、（９５℃１分、６３℃３０秒、７２℃１分）の３５サイクル、その後、７２℃１０分であった。使用したサーモサイクラーは、Ａｍｐｌｉｔｒｏｎ ＩＩ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモライン社（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ））であった。適切な６００ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている）にクローニングした。この連結混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地上で選択した。いくつかのコロニーをＬＢ培地で一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを、キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入したミニプラスミドＤＮＡ単離キットを用いて単離した。クローンＬＢ６は、正しいＤＮＡ配列を有することが決定された。
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、クローンＬＢ６をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、適切な６００ｂｐ断片をゲル精製し、同じ酵素で消化され、ウシアルカリホスファターゼで処理されているプラスミドｐＣＹＢ１（ニューイングランドバイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている）にクローニングした。この連結混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを、いくつかの形質転換体から単離し、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりスクリーニングした。正しいクローンを同定し、ｐＣＹＢ１：ｗｔＧＨ（ｐＢＢＴ１２０）と名付けた。このプラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株又はＷ３１１０株（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）及びアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を形質転換した。
Ｂ．ｓｔＩＩ−ＧＨの構築
野生型ＧＨクローンＬＢ６（ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔＩＩシグナル配列を含むＧＨクローンを構築するための鋳型として用いた。ｓｔＩＩ配列を、その長さのために、２つの連続ＰＣＲ反応により付加した。第１の反応は、順方向プライマーＢＢ１２及び逆方向プライマーＢＢ１０を用いた。ＢＢ１０は、配列（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣ３’）（配列番号５）を有する。ＢＢ１２は、配列（５’−ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号６）を有する。ＰＣＲ反応は、野生型ＧＨの増幅について説明した通りであった。適切な６３０ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いてゲル精製し、水で５０倍に希釈し、２μｌを第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。第２のＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１０及び順方向プライマーＢＢ１１を用いた。ＢＢ１１は、配列（５’ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧ３’）（配列番号７）を有する。プライマーＢＢ１１は、クローニング用のＸｂａＩ及びＮｄｅＩ部位を含む。ＰＣＲ条件は、第１の反応について説明した通りであった。約６６０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、同様に切断したプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングした。クローンｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｓｔＩＩ−ＧＨ（５Ｃ）又は「５Ｃ」は、正しいＤＮＡ配列を有することが決定された。
クローン「５Ｃ」をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同様に切断したｐＢＢＴ１０８（ＰｓｔＩ部位を欠く、ｐＵＣ１９の誘導体。このプラスミドを以下で説明する）にクローニングした。正しいインサートを有するクローンを、これらの酵素での消化後に同定した。このクローン（ｐＢＢＴ１１１と呼ぶ）を、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ｓｔＩＩ−ＧＨ融合遺伝子を含む６６０ｂｐ断片をゲル精製し、同じ酵素で消化され、ウシアルカリホスファターゼで処理されているプラスミド発現ベクターｐＣＹＢ１（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））にクローニングした。ｓｔＩＩ−ＧＨ挿入物を含む組換えプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。さらなる研究のために１つの単離物を選択し、ｐＢＢＴ１１４と呼んだ。このプラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株又はＷ３１１０株（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）及びアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を形質転換した。
Ｃ．ｏｍｐＡ−ＧＨの構築
野生型ＧＨクローンＬＢ６（ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡシグナル配列を含むＧＨクローンを構築するための鋳型として用いた。ｏｍｐＡ配列を、その長さのために、２つの連続ＰＣＲ反応により付加した。第１の反応は、順方向プライマーＢＢ７（５’ＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ３’）（配列番号８）及び逆方向プライマーＢＢ１０（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣ３’）（配列番号５）を用いた。約４ｎｇのプラスミドＬＢ６を一本鎖ｃＤＮＡではなく鋳型として用い、ＰＣＲ条件が、９６℃３分、（９５℃１分；６３℃３０秒；７２℃１分）の３０サイクル、その後、７２℃１０分であったことを除いて、ＰＣＲ反応は、野生型ＧＨの増幅について説明した通りであった。約６３０ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いてゲル精製し、水で５０倍に希釈し、２μｌを第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。第２のＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１０及び順方向プライマーＢＢ６（５’ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣ３’）（配列番号９）を用いた。ＰＣＲ条件は、第１の反応について説明した通りであった。約６６０ｂｐ ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、又はＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした（ＳａｌＩ及びＸｈｏＩは、適合する一本鎖突出部を生じる）。いくつかのクローンを配列決定し、ｐＵＣ１９（８／８）クローンには全てｏｍｐＡ配列領域に誤りが含まれることを発見した。たった１つのｐＣＤＮＡ３．１（＋）クローンを配列決定し、このクローンには、ｏｍｐＡ領域に配列あいまい性が含まれていた。正しいｏｍｐＡ−ＧＨ融合を作成するために、２つの配列決定されたクローンの遺伝子部分（これらは、便利な制限部位により分離した異なる誤りを含む）を組換え、ＰｓｔＩ部位を欠くｐＵＣ１９誘導体（下記のｐＢＢＴ１０８を参照のこと）にクローニングした。結果として生じたプラスミド（ｐＢＢＴ１１２と呼ぶ）は、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片として、ｐＢＢＴ１０８のこれらの同じ部位にクローニングされたｏｍｐＡ−ＧＨ融合遺伝子を有する。このプラスミドをｐＢＢＴ１１２と呼び、下記のように、ＰＣＲに基づくＧＨの部位特異的変異誘発に用いる。
Ｄ．ＰｓｔＩ ｐＵＣ１９（ｐＢＢＴ１０８）の構築
選択したシステイン置換変異及び挿入変異の構築のための、クローニングされたＧＨ遺伝子の変異誘発を容易にするために、ＰｓｔＩ部位を欠く、プラスミドｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））の誘導体を以下の通りに構築した。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、その後、製造業者により供給された、２００μＭ ｄＮＴＰを添加した反応緩衝液を用いて、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により７５℃で処理した。これらの条件下で、ポリメラーゼは、ＰｓｔＩ消化により作られた３’一本鎖突出部を消化するが、二本鎖領域を消化せず、その最終結果は、ＰｓｔＩ認識部位の真ん中４塩基からなる一本鎖４塩基の欠失である。結果として生じる分子は、二本鎖、すなわち「平滑」末端を有する。これらの酵素反応の後、線状単量体を、ＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いてゲル精製した。この精製されたＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））で処理し、ＰｓｔＩで消化し、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体をつつき、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩを用いた制限消化により分析した。ＰｓｔＩ部位で切断されなかったが、すぐ隣のＢａｍＨＩ部位で切断された形質転換体の１つをつつき、ｐＢＢＴ１０８と呼んだ。
Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｅｔ−ｈＧＨ及びｓｔＩＩ−ｈＧＨの発現
ｍｅｔ−ｈＧＨをコードするｐＢＢＴ１２０とｓｔＩＩ−ｈＧＨをコードするｐＢＢＴ１１４で、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換した。親ベクターｐＣＹＢ１でもまたＷ３１１０を形質転換した。結果として生じる株に以下の名称を与えた。
ＢＯＢ１３０：Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）＝ベクターのみ
ＢＯＢ１３３：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１２０）＝ｍｅｔ−ｈＧＨ
ＢＯＢ１３２：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１１４）＝ｓｔＩＩ−ｈＧＨ
これらの株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、Ａ６００で約０．０２５Ｏ．Ｄ．まで、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢで希釈し、振盪フラスコ中で３７℃でインキュベートした。培養Ｏ．Ｄ．が約０．２５〜０．５に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加した。最初の実験のために、培養物を、誘導後０、１、３、５、及び約１６時間後にサンプリングした。誘導培養物と非誘導培養物のサンプルをペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（所望であれば１％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を添加する）に再懸濁した。サンプルを、予め成形された１４％Ｔｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色するか、ウエスタンブロッティングにより分析した。
ｍｅｔ−ｈＧＨを発現するＢＯＢ１３３株と、ｓｔＩＩ−ｈＧＨを発現するＢＯＢ１３２からの全細胞溶解物のクマシー染色により、リサーチダイアグノスティクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）から購入した精製ｒｈＧＨ標準と共に移動した約２２ｋＤａのバンドが示された。ｒｈＧＨバンドは、一晩誘導後の誘導培養物において最も顕著であった。ユナイテッドステイツバイオロジカル社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）から購入したポリクローナルウサギ抗ｈＧＨ抗血清を用いたウエスタンブロットにより、誘導後３時間及び１６時間でのＢＯＢ１３２及びＢＯＢ１３３の誘導培養物の溶解物中にｒｈＧＨが存在することが確認された。ｒｈＧＨは、誘導後３でも１６時間でも対照ＢＯＢ１３０株（ベクターのみ）誘導培養物のウエスタンブロッティングにより検出されなかった。
ＢＯＢ１３２（ｓｔＩＩ−ｈＧＨを発現する）の誘導培養物を前記のように調製し、Ｋｏｄｈｌａｎｄ及びＢｏｔｓｔｅｉｎ（１９８０）の分析手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。この手順は、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜を破壊し、ペリプラズムの内容物を周囲の培地に放出する。その後の遠心分離により、可溶性ペリプラズム成分（上清に回収される）が、細胞質性不溶性ペリプラズム成分及び細胞関連成分（ペレットに回収される）から分離される。詳細に述べると、ｓｔＩＩ−ｈＧＨプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢにおいて３７℃で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、Ａ６００で約０．０３Ｏ．Ｄ．まで１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ ２５ｍｌで希釈し、２５０ｍｌ振盪フラスコ中で３７℃でインキュベートした。培養Ｏ．Ｄ．が約０．４に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、１００ｍＭ ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。次いで、誘導培養物を、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。誘導された一晩培養物はＡ６００で３．３Ｏ．Ｄ．に達し、４Ｏ．Ｄ．（１．２ｍｌ）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５モデル微量遠心器において４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより氷冷２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に約１０Ｏ．Ｄ．まで再懸濁し、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度１７ｍＭで添加した。再懸濁された細胞を、氷上で１０分間インキュベートし、前記のように遠心分離した。結果として得られたペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより１０Ｏ．Ｄ．で氷冷水に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、再懸濁された細胞を前記のように遠心分離し、結果として得られた上清（可溶性ペリプラズム画分）と細胞ペレット（不溶性ペリプラズム画分及び細胞関連画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＢＯＢ１３２により合成されたｒｈＧＨの大部分は可溶性であり、ペリプラズムに局在することを発見した。ペリプラズムｒｈＧＨタンパク質は、精製された下垂体ｈＧＨ標準とはサイズで区別がつかなかった。このことから、ｓｔＩＩシグナル配列はタンパク質分泌間に除去されたことが分かる。
ｒｈＧＨの精製及び生物活性
Ａ．野生型ｒｈＧＨの精製
有意な量の野生型ｒｈＧＨを精製するために、ＢＯＢ１３２（ｓｔＩＩ−ｈＧＨを発現する）の培養物３３０ｍｌを誘導し、一晩培養し、Ｈｓｉｕｎｇら（１９８６）により記載された調製手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。詳細に述べると、ｓｔ−ＩＩ ｈＧＨプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢにおいて３７℃で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、Ａ６００で０．０３Ｏ．Ｄ．まで、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ ２×２５０ｍｌ（総体積５００ｍｌ）で希釈し、２Ｌ振盪フラスコ中で３７℃でインキュベートした。培養物のＯ．Ｄ．が約０．４に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。誘導培養物を、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。誘導された一晩培養物がＡ６００で約３．８Ｏ．Ｄ．に達し、これを、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５遠心器及びＧＳＡローターを用いて、４℃で５分間８，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを混合し、磨砕により約４７Ｏ．Ｄ．まで、氷冷２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度約２５ｍＭで添加した。再懸濁された細胞を氷上で１０分間インキュベートし、８５４ローターを用いてＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ ＭＰ４Ｒ遠心器で、４℃で７分間８，５００ｒｐｍで、遠心分離した。結果として得られたペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより４７Ｏ．Ｄ．で氷冷水に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。再懸濁された細胞を、前記のようにＩＥＣ遠心器で遠心分離し、結果として得られた上清可溶性ペリプラズム画分）と細胞ペレット（不溶性ペリプラズム画分及び細胞関連画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。再度、ゲルは、産生されたｒｈＧＨが可溶性で、ペリプラズムにあり、下垂体ｈＧＨ標準とサイズで区別できないことを示した。
ｒｈＧＨを、Ｂｅｃｋｅｒ及びＨｓｉｕｎｇ（１９８６）により説明された手順に従って２つのステップで精製した。浸透圧衝撃からの上清を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した５ｍｌ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードし、結合タンパク質を、１５カラム体積の５０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ直線勾配を用いて溶出した。カラム画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約１００〜１２５ｍＭの塩濃度で溶出する画分２２〜２５をｈＧＨについて濃縮し、プールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０サイズ画分（ｓｉｚｉｎｇ）カラムによりさらに画分した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムからの画分３４〜３６（ＭＷ標準の溶出プロフィールに基づいて約２１〜２２ｋＤａのＭＷを示す）にはｒｈＧＨの大部分が含まれ、これらの画分をプールし、凍結アリコートとして−８０℃で保存した。２８０ｎｍでの吸光度により、及びＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（バイオラドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いることにより決定された、ｒｈＧＨの最終収率は約２ｍｇであった。非還元型下垂体ｈＧＨは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、還元型下垂体ｈＧＨよりわずかに小さな見かけの分子量で移動した。この分子量変化は、適切なジスルフィド結合形成を表している。本発明者らの精製ｒｈＧＨは、還元及び非還元条件下で下垂体ｈＧＨと共に移動した。このことから、ｒｈＧＨは適切にフォールディングされ、ジスルフィド結合していることが分かる。以下に示したデータから、ｒｈＧＨの生物活性は下垂体ｈＧＨの生物活性と区別がつかないことが分かる。
Ｂ．下垂体ｈＧＨ及びｒｈＧＨのバイオアッセイ結果
親ＦＤＣ−Ｐ１細胞株は、マウスＩＬ−３に対して強い増殖反応性を示すが、下垂体ｈＧｈに対しては示さない。ＩＬ−３の非存在下で、ＦＤＣ−Ｐ１細胞の大部分は死滅し、０．２未満の吸光度値を示す。対照に、ウサギ成長ホルモン受容体で形質転換されたＦＤＣ−Ｐ１細胞は、細胞数及び吸光度値の用量依存性増加により証明されるように、下垂体ｈＧＨに反応して増殖する。この効果についてのＥＣ５０（最大半分の刺激を達成するのに必要とされるタンパク質濃度）は、文献（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら，１９９５）において報告されたものと同様に、様々な実験で０．７５〜１．２ｎｇ／ｍｌの下垂体ｈＧＨ（０．０３〜０．０５ｎＭ）の範囲である。親ＦＤＣ−Ｐ１株と、ウサギ成長ホルモン受容体で形質転換されたＦＤＣ−Ｐ１細胞との著しい差は、後者の細胞がＩＬ−３又はｈＧＨの非存在下で生き残り、さらに高い吸光度値（アッセイと、ゼロ成長因子対照ウェルにおけるＭＴＳとのインキュベーションの長さに応じて一般に０．６〜１．１）をもたらすことである。ウサギ成長ホルモン受容体形質転換体の最初のプールと単離された５つ全ての独立した成長ホルモン受容体細胞株は、同じ効果を示した。第２のセットの独立して単離したウサギ成長ホルモン受容体形質転換体を用いて、同様の結果が得られた。Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９９５）は同様の効果を観察した。このことは、ＩＬ−３／ＧＨに依存しない生存が形質転換手順の結果であることを示唆している。成長ホルモン受容体細胞株は、成長のためにＩＬ−３もｈＧＨも必要としないが、ＩＬ−３及びｈＧＨに対する強い増殖反応性をなお示した。ｈＧＨ非存在下での高い吸光度値の実際の効果は、ｈＧＨ反応の「ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）」（最大吸光度値と最小吸光度値との差）を減らすことである。このウィンドウは、Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９９５）により報告されたものと同様に、一貫してゼロ成長因子値の４０〜７０％の範囲であった。
本発明者により調製された下垂体ＧＨ及び野生型ｒｈＧＨは、バイオアッセイにおいて同様の用量反応曲線を有し、ＥＣ５０は、様々な実験で０．６〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲であった（表１）。
Figure 0005517844
ｈＧＨシステイン変異タンパク質の構築
システイン置換変異Ｔ１３５Ｃは、次のように構築した。アミノ酸残基１３５をスレオニンに対するコドンＡＣＴを、システインをコードするコドンＴＧＴに変え、近傍ＢＧｌＩＩ部位をスパンするように変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２８（５＞ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣ＞３）（配列番号１０）を設計した。このオリゴを、ｏｍｐＡ−ＧＨ融合遺伝子の結合領域とアニールするが変異を形成しないＢＢ３４（５＞ＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ＞３）（配列番号１１）と一緒にＰＣＲで使用した。ＰＣＲは、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むパーキンエルマー緩衝液）中に、４種類の核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ各２００μＭ、各オリゴヌクレオチドプライマー０．５μＭ、鋳型としてｐＢＢＴ１１２（上述）を５ｐｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）１．２５単位、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．１２５単位を含む反応溶液５０μｌ中で行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で行った。用いたプログラムは、９５℃３分、その後［９５℃６０秒、４５℃又は５０℃又は５５℃７５秒、７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動で調べた結果、三つのアニーリング温度すべてで、約４３０ｂｐのかなりの量の生成物が得られることがわかった。４５℃での反応生成物を、ＱＬＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＴ１３５Ｃ変異を含む、得られた２７８ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化され、ゲルで精製された、ｓｔＩＩ−ＧＨ融合遺伝子（上述）を有するｐＵＣ１９誘導体であるｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質転換体は、最初にＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩによる消化によりスクリーニングし、その後１クローンの配列を決定し、Ｔ１３５変異が存在すること及びＰＣＲ反応によって又は合成オリゴヌクレオチドによって潜在的に導入され得る他の変異が存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、ＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
ＢＢ２８の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２９（５＞ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣ＞３）（配列番号１２）を用い、クローニングのためにＰＣＲ反応をアニーリング温度５０℃で行った点を除いて、Ｔ１３５Ｃについて上述した手順を用いて、置換変異Ｓ１３２Ｃを構築した。配列を決定した２クローンのうちの一つが正しい配列を有することがわかった。
似た手順を用い、しかし異なるクローニング戦略を用いて、置換変異Ｔ１４８Ｃを構築した。変異形成順方向オリゴヌクレオチドＢＢ３０（５＞ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣ＞３）（配列番号１３）を、ＧＨコード領域の大部分の３´末端にアニールし、すぐ下流のＢａｍＨＩ部位にスパンする非変異形成逆方向プライマーＢＢ３３（５＞ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴ＞３）（配列番号１４）を用いるＰＣＲで使用した。ＰＣＲは、アニーリング温度を４６、５１及び５６℃とした以外は上述のように行った。上述のようにＰＣＲ及びゲル分析を行った後、４６及び５１℃での反応生成物をクローニング用に保存した。これらをＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、得られる１８８ｂｐの断片をゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化されたｐＢＢＴ１１１にクローニングし、メーカー指示の手順に従って、子ウシアルカリホスファターゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、ゲルで精製した。この連結による形質転換体を、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによる消化で分析し、１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片が正しい方向にクローニングされているクローンを同定した。何故ならＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩは適合する末端を生成するからであり、このクローニング段階は方向特異的ではない。調べた六つのクローンのうちの五つが正しい方向を向いていることがわかった。これらの一つの配列が決定され、Ｔ１４８Ｃ変異を含むことが示された。このクローンの１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片の残りの配列は正しいことが確認された。
置換変異Ｓ１４４Ｃの構築は、ＢＢ３０の代わりに変異形成順方向オリゴヌクレオチドＢＢ３１（５＞ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣ＞３）（配列番号１５）を用いた以外、Ｔ１４８Ｃ変異の構築と同じであった。六つのクローンのうちの二つが正しい方向を向いていることがわかった。これらの一つの配列を決定し、望むＳ１４４Ｃ変異を含むことがわかった。このクローンの１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片の残りの配列もまた正しいことが確認された。
ＧＨの天然のカルボキシ末端にシステイン残基を加える変異もまた構築された。ｓｔｐ１９２Ｃと名付けたこの変異の構築は、Ｔ１４８Ｃ変異タンパク質の構築に関して上記の手順を用いて実施しが、異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。ＧＨのカルボキシ末端ｐｈｅ残基のコドンとＴＡＡ翻訳停止コドン間にシステイン用のコドンＴＧＣを挿入し、近接ＢａｍＨＩ部位をスパンする変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ３２（５＞ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ＞３）（配列番号１６）を、上記のＢＢ３４と一緒に用いた。上述のようにＰＣＲ及びゲル分析の後、クローニングのために４６℃の反応を用いた。調べた六つのクローンのうち三つが、正しい方向を向いていることがわかった。これらのうちの一つの配列が決定され、望むｓｔｐ１９２Ｃ変異を含むことが示された。このクローンの１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片の残りの配列は正しいことが確認された。
置換変異Ｓ１００Ｃは、アミノ酸残基１００のセリンのコドンＡＧＣを、システインをコードするコドンＴＧＣに変える変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２５（５＞ＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣ＞３）（配列番号１７）を用いて構築した。ＢＢ２５もまた、近接ＮａｒＩ部位にスパンする。ＢＢ２５及びＢＢ３４を用いるＰＣＲ反応は、Ｔ１３５Ｃ変異の構築のために上述したＰＣＲ手順を用いて行った。ＰＣＲ産物をゲル分析した後、５０℃でのアニーリング反応の生成物を、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＰｓｔＩとＮａｒＩで消化した。得られる１７８ｂｐの断片をゲルで精製し、ＰｓｔＩとＮａｒＩで消化し、ゲルで精製されたｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質転換体から単離されたプラスミドを、ＰｓｔＩ及びＮａｒＩでの消化でスクリーニングし、一つのプラスミドの配列を決定し、１７８ｂｐのＰｓｔＩ−ＮａｒＩ断片には、Ｓ１００Ｃ変異が存在し、他のいかなる変異も存在しないことを確認した。
ＰＣＲでＢＢ２５の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２６（５＞ＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＴ＞３）（配列番号１８）を用い、クローニングのためにアニーリング温度４５℃でＰＣＲ反応を行った点を除いて、Ｓ１００Ｃのための上記の手順を用いて置換変異Ａ９８Ｃを構築した。一つのクローンの配列を決定し、正しい配列を有することがわかった。
置換変異Ａ３４Ｃは、次のように構築した。アミノ酸残基３４のアラニンをコードするコドンＧＣＣを、システインをコードするコドンＴＧＣに変え、ＰｓｔＩ部位をスパンするように、変異形成逆方向オリゴＢＢ２３（５＞ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣ＞３）（配列番号１９）を設計した。ＳｔＩＩリーダー配列のコード配列の５’末端にアニールし、イニシエーターメチオニンコドンと重なるＮｄｅＩ部位をスパンするＢＢ１１（５＞ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧ＞３）（配列番号２０）と一緒に、このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に用いた。
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、四つの核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ各２００μＭ、各オリゴヌクレオチドプライマー０．２μＭ、鋳型としてｐＢＢＴ１１１（上述）を１ｎｇ、ＴａｃＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）０．８単位、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．３３単位を含む１×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌ中でＰＣＲ反応を行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。用いたプログラムは、９６℃３分、その後［９５℃６０秒、５０℃又は５５℃又は６０℃７５秒、７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果、三つの異なるアニーリング温度すべてで期待した大きさ（約２２０ｂｐ）の意味のある生産物を与えた。５０℃及び５５℃での反応生成物を保存し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＡ４３Ｃ変異を含む、得られた２０７ｂｐのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化されたｐＢＢＴ１１１に連結し、アルカリホスファターゼで処理し、ゲルで精製した。この連結反応による形質転換体を、始めにＮｄｅＩ及びＰｓｔＩでの消化でスクリーニングし、次に一つのクローンの配列を決定し、Ａ３４Ｃ変異が存在し、ＰＣＲ反応によって、又は合成オリゴヌクレオチドによってもたらされ得る、それ以外の変異が存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片の全部に正しい配列を持つことがわかった。
ＢＢ２３の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２４（５＞ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧ＞３）（配列番号２１）を用いる点を除いて、Ａ３４Ｃについて上で述べた手順を用いて置換変異Ｓ４３Ｃを構築した。
置換変異Ｔ３Ｃは、二つの連続するＰＣＲ段階で構築した。第一段階で望む変異を作り、第二段階で最初の反応のＰＣＲ産物を延長し、有用なクローニング部位を含ませた。アミノ酸残基３のスレオニンのコドンＡＣＣを、システインをコードするコドンＴＧＣに変え、ｓｔＩＩ−ｈＧＨ融合遺伝子の結合部分にスパンしアニールするように、変異形成順方向オリゴヌクレオチドＢＢ７８（５＞ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ＞３）（配列番号２２）を設計した。上述したＢＢ３３と一緒に第一段階のＰＣＲでＢＢ７８を使用した。
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、四つの核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ各２００μＭ、各オリゴヌクレオチドプライマー０．２μＭ、鋳型としてｐＢＢＴ１１１（上述）を１ｎｇ、ＴａｃＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）１．５単位、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．２５単位を含む１×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌ中で第一段階のＰＣＲ反応を行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。用いたプログラムは、９６℃３分、その後［９４℃６０秒、６０℃７５秒、７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応生成物をエタノールで析出させ、約６３０ｂｐの生成物をゲルで精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２０μｌ中に溶かした。このゲル精製断片を１００倍に希釈し、希釈した断片２μｌを第二のＰＣＲ段階の鋳型として用いた。第二のＰＣＲ段階は、オリゴヌクレオチドＢＢ１１及びＢＢ３３（ともに上述）を使用し、第一段階のＰＣＲ反応で使用した反応条件を用いた。第二段階ＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動で精製し、期待される約６７０ｂｐの断片を観察した。ＰＣＲ反応生成物はＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＴ３Ｃ変異を含む、得られた２０７ｂｐのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化され、アルカリホスファターゼで処理され、ゲルで精製されたｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質転換体を、最初にＮｄｅＩ及びＰｓｔＩによる消化でスクリーニングし、次に一つのクローンの配列を決定し、Ｔ３Ｃ変異が存在し、ＰＣＲ反応により、又は合成オリゴヌクレオチドによりもたらされ得る、その他の変異が存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
置換変異Ａ１０５Ｃは、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ中ｐ．２５１−２６１のＨｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．によって一般的に記述された「重なり延長による変異形成」の技術を用いて構築された。この技術を用いれば、図１に示すように、標的ＤＮＡ断片から、二つの異なる断片が増幅される。一つの断片は、プライマーａ及びｂを用いて生成し、生成物ＡＢとなる。プライマーｂとｃは、それぞれ生成物ＡＢとＣＤの右端と左端に同じ配列の変化をもたらす。生成物ＡＢとＣＤは、ＡＢの上部の鎖をＣＤの底部の鎖にアニールさせる「重なり」と、その逆という同じ（変異）配列の断片を共有する。プライマーａとｄを用い、生成物ＡＢとＣＤを鋳型として加えた、次のＰＣＲ反応で、ＤＮＡポリメラーゼによる、これらのアニールした重なりの伸長は、全長変異分子ＡＤを作る。
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する点を除いて、Ａ１０５Ｃ構築のための最初のＰＣＲ反応は、上記のＴ３Ｃの構築で述べた反応と同様に行った。用いたプライマー対は、（ＢＢ２７＋ＢＢ３３）及び（ＢＢ１１＋ＢＢ７９）である。ＢＢ１１とＢＢ３３は、上で説明した。ＢＢ２７とＢＢ７９は、アミノ酸残基１０５のアラニンのコドンＧＣＣを、システインをコードするコドンＴＧＣに変える、相補的変異形成オリゴヌクレオチドである。ＢＢ２７の配列は５＞ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣ＞３（配列番号２３）であり、ＢＢ７８の配列は５＞ＧＡＣＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴ＞３（配列番号２４）である。（ＢＢ２７×ＢＢ３３）及び（ＢＢ１１×ＢＢ７９）のＰＣＲ反応生成物をエタノールで析出し、ゲルで精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２０μｌに溶解した。分離用ゲルは、各ＰＣＲ反応からの主な生成物が、（ＢＢ２７×ＢＢ３３）反応では期待される大きさ約２９０ｂｐ、（ＢＢ１１×ＢＢ７９）反応では期待される大きさ約４０８ｂｐであることを示した。これらの二つの変異形成断片を次に、次のＰＣＲ反応で一緒に「スプライシング」した。この反応では、最初の反応生成物からのゲル精製断片各１μｌを鋳型として加え、ＢＢ１１及びＢＢ３３をプライマーとして用いた。又は、最初の（ＢＢ２７×ＢＢ３３）及び（ＢＢ１１×ＢＢ７９）反応に用いたのと同じ条件でＰＣＲ反応を行った。第二のＰＣＲ反応生成物の一部をアガロースゲル電気泳動で分析し、期待される約６７０ｂｐのバンドが観察された。ＰＣＲ反応生成物の大半を、次にＱＩＡクイック精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＡ１０５Ｃ変異を含む、得られ２７６ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化され、ゲルで精製されたｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結反応からの形質転換体を最初にＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、次に一つのクローンの配列を決定し、Ａ１０５Ｃ変異が存在し、ＰＣＲ反応によって、又は合成オリゴヌクレオチドによってもたらされ得る他の変異は存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、ＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
ペリプラズムに分泌されるタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉに発現させるために、１１の変異タンパク質をコードするｓｔＩＩ−ｈＧＨ遺伝子を、ｐＵＣ１９系ｐＢＢＴ１１１誘導体から約６５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片として切り出し、ｒｈＧＨを発現させるために用いられてきたｐＣＹＢ１発現ベクターにサブクローニングした。発現実験のために、これらのプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０に導入した。
実施例４及び２３で述べる手順に似た手順を用いて、ＧＨの他のシステイン変異タンパク質を構築することができる。システイン変異タンパク質は、ＧＨコード配列における天然アミノ残基をシステインに置換する置換変異、ＧＨコード配列における二つの天然アミノ酸間にシステインを挿入する挿入変異、又はＧＨコード配列の最初のアミノ酸Ｆ１の前にシステイン残基を加える又はＧＨコード配列の最後のアミノ酸Ｆ１９１の後にシステイン残基を加える付加変異の可能性がある。システイン残基は、ＧＨコード配列のどこにおいても、どのアミノ酸とも置換でき、どの二つのアミノ酸の間にも挿入できる。ＧＨのシステイン残基を置換又は挿入する好ましい部位は、ヘリックスＡのすぐ前の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ及びヘリックスＤから末端の領域である。他の好ましい部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤヘリックスの最初の又は最後の三つのアミノ酸である。この領域でシステイン置換を行うのに好ましい部位は、Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｅ３３、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｑ４０、Ｑ４６、Ｎ４７、Ｐ４８、Ｑ４９、Ｔ５０、Ｓ５１、Ｓ５５、Ｓ５７、Ｔ６０、Ｑ６９、Ｎ７２、Ｎ９９、Ｌ１０１、Ｖ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｓ１０６、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｇ１３１、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｇ１３６、Ｑ１３７、Ｋ１４０、Ｑ１４１、Ｔ１４２、Ｙ１４３、Ｋ１４５、Ｄ１４７、Ｎ１４９、Ｓ１５０、Ｈ１５１、Ｎ１５２、Ｄ１５３、Ｓ１８４、Ｅ１８６、Ｇ１８７及びＧ１９０である。システイン残基は、これらのアミノ酸の直前又は直後にも挿入できる。システイン残基を付加できる一つの好ましい部位は、本実施例で＊−１Ｃと呼ぶＦ１の前であろう。
ＧＨの天然システイン残基の一つを他のアミノ酸に置換することによって自由システインを含むＧＨ変異タンパク質を構築することもできる。置換される前のシステイン残基とジスルフィド結合を形成していた天然システイン残基は、今や自由になる。この必須でないシステイン残基は、他の１９のアミノ酸のどれで置換してもよいが、セリン又はアラニン残基と置換するのが好ましい。自由システイン残基は、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら（１９９８）による手順のような手順を用いて、天然アミノ酸の化学修飾によってＧＨに導入することもできる。
実施例１〜１５で述べた手順に似た手順を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞中でタンパク質を発現し、それらのタンパク質を精製し、それらのタンパク質をＰＥＧ化し、インビトロ生物検定における生物活性を測定することができる。ＧＨ変異タンパク質は、実施例１６〜１９で述べる手順に似た手順又は本技術に習熟した者が熟知する他の手順を用いて、昆虫又は哺乳類のような真核細胞中でも発現できる。もし分泌が必要ならば、真核細胞由来のタンパク質を分泌させるために天然のＧＨシグナル配列又は他のシグナル配列を用いてもよい。
シスチン付加はシステイン変異タンパク質Ｔ３Ｃの回収率を改善する
Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ３ｍｌ中で一夜生育させた。一夜培養し、生育が飽和に達した培養液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ３００ｍｌで、６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．０３になるように希釈し、２Ｌの振盪フラスコ中、３７℃で培養した。培養液のＯ．Ｄ．が０．４２０に達した時、１００ｍＭのＩＰＴＧを１．５ｍｌ加えて最終濃度が０．５ｍＭになるようにし、組換えタンパク質の発現を誘導した。誘導した培養液は、３７℃で一夜（約１６時間）培養した。
誘導し一夜培養した培養液の６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が３．６に達した時、１３５ｍｌ×２本に分け、ソーバル社（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５遠心分離機のＧＳＡローターを用い、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを次のように浸透圧衝撃処理にかけた。細胞ペレットを氷冷緩衝液Ａ［２０％スクロース、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ７．５］又は緩衝液Ｂ［２０％スクロース、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ７．５、５．５ｍＭシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）］１０ｍｌ中Ｏ．Ｄ．が４９になるように再懸濁した。ペレットを崩壊させて再懸濁し、撹拌し、０．２５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を１ｍｌ加え、最終濃度が約２５ｍＭになるようにした。再懸濁した細胞を３０分間氷冷し、ＳＳ−３４ローターで、４℃、８５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを崩壊させて再懸濁し、氷冷した緩衝液Ｃ［５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］又は緩衝液Ｄ［５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）］１０ｍｌ中で撹拌した。再懸濁しった細胞ペレットを、ＳＳ−３４ローターで、４℃、８５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られる上清（可溶性ペリプラズム画分）を回収し、−８０℃で保存した。種々の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果、可溶性ペリプラズム画分中に回収される単量体ｈＧＨ種の量がかなり改善できることがわかった。シスチンで処理したサンプルで、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約２２ｋＤａの単一バンドとしてｈＧＨの大部分が泳動すること、そしてそのバンドは脳下垂体ｈＧＨと同じ速度で泳動することが観察された。シスチンが存在しない場合には、単量体の範囲に多くの異なる分子量の分子種が観察された。ウエスタンブロッティングを用いてゲルを展開すると、より大きい分子量のタンパク質集合体が見える。
ＧＨシステインを加えた変異型の発現及び精製のための一般的な方法
ｈＧＨシステイン変異タンパク質の単離のための標準的な手順は次の通りである。ＳｔＩＩ−ｈＧＨ変異タンパク質プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で飽和するまで生育させる。一夜培養した培養液を通常、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．０２５〜０．０３０になるまで希釈し、振盪フラスコ中で３７℃で生育させる。６００ｎｍでの培養液のＯ．Ｄ．が０．３００〜０．５００に達した時、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるように加え、発現を誘導する。誘導した培養液を３７℃で一夜培養する。誘導して、一夜培養した培養液をソーバル社（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５遠心分離機で４℃、８，０００〜１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られるペレットを、培養液の量に応じて、ＫｏｓｈｌａｎｄとＢｏｓｔｅｉｎ（１９８０）又はＨｓｉｕｎｇら（１９８６）の手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。浸透圧衝撃のために、細胞ペレットを２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中にＯ．Ｄ．が２５〜５０になるように再懸濁した。５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び／又は５ｍＭのシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）を再懸濁緩衝液に含有させる場合もあった。再懸濁したペレットを１５〜３０分間氷冷し、上記のように遠心分離した。上清を捨て、ペレットを６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が２５〜５０になるように、５又は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に再懸濁した。５又は２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び／又は５ｍＭのシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）を再懸濁緩衝液に含有させる場合もあった。再懸濁したペレットを１５〜３０分間氷冷し、上記のように遠心分離した。得られる上清は可溶性ペリプラズム成分を含み、ペレットは不溶性ペリプラズム及び細胞関連成分から成る。
シスチンを浸透圧衝撃緩衝液に添加すると、システイン変異タンパク質の多くの回収率をかなり改善し、安定化した。シスチンが存在するとシステイン変異タンパク質は、大部分が単量体であったが、シスチンが存在しないとｈＧＨの単量体、二量体及び、より高次の集合体の混合物が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで観察された。それらは大部分還元されている又は野性型ｒｈＧＨには存在しないので、より高次の集合体は恐らくタンパク質中に加えられたシステイン残基の結果であろう。浸透圧衝撃緩衝液にシスチンを添加すると、この問題がほとんど解決された。シスチンが、変異タンパク質中の自由システイン残基と反応し、安定な混合ジスルフィド結合を形成し、ジスルフィド結合の混合と凝集を阻止したものと我々は考えている。我々はまた、第二のジチオール、シスタミンも試験し、ｈＧＨのシステイン変異タンパク質に似た安定効果を有することを認めた。酸化型グルタチオンのような他のジチオールもまた恐らく、自由システインを含むタンパク質の回収率も向上させるであろう。
分析した１１のｈＧＨ変異タンパク質のうちの六つが、単離と精製のために充分なレベルで発現した。Ａ３４Ｃ、Ｓ４３Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｓ１００Ｃ及びＳ１３２Ｃに関する浸透圧衝撃の上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、正しい分子量の位置には、ほとんど又はまったくタンパク質が存在しなかった。これらの変異タンパク質の発現レベルは比較的低いので、回収率が改善されたかどうかを観察するのが困難である。全細胞溶解物の予備的分析の結果、これらの変異型のタンパク質は発現されているが不溶性であることがわかった。Ｔ３Ｃ、Ａ１０５Ｃ、Ｔ１３５Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃ変異タンパク質は、浸透圧衝撃緩衝液中にシスチンが存在する場合には、回収率がかなり改善することがわかった。シスチンが存在しない場合には、Ａ１０５Ｃは試験しなかった。一般的なタンパク質精製手順を下で説明する。
ＷＴ−ｒｈＧＨは、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。システイン変異タンパク質は、イオン交換、疎水的相互作用（ＨＩＣ）、金属キレート化親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はこれらの技術の組み合わせを含む種々のクロマト手順によって精製した。一般的に、ｈＧＨ変異タンパク質は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＱ−セファロース高流速樹脂（ファルマシア社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる新鮮な浸透圧衝撃上清から得た。カラムは、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗い、結合したタンパク質を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中０から２５０ｍＭまでＮａＣｌ濃度を直線的に増加させながら１０倍の体積で溶出させた。ｈＧＨ変異タンパク質を含む画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングで同定した。これらの画分を集め、凍結状態で保存した。浸透圧衝撃混合物からｈＧＨ変異タンパク質を得るには、代わりの樹脂を用いることができる。すなわちＨＩＣ、陽イオン交換樹脂又は親和性樹脂である。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のためには、Ｑカラムを室温まで暖め、ＮａＣｌを最終濃度が２Ｍになるように加えた。予め２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化しておいたブチル−セファロース高流速樹脂に保存サンプルをかけた。２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５中２Ｍから０ＭへのＮａＣｌ濃度の逆勾配を用いて、樹脂からｈＧＨ変異タンパク質を溶出した。ｈＧＨ変異タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングで同定し保存した。
１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化したニッケルキレート化樹脂（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）に直接ＨＩＣ保存溶液をかけた場合もあった。洗浄段階の後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５中０〜３０ｍＭのイミダゾール濃度勾配を用いて変異タンパク質を回収した。恐らくＨ１８、Ｈ２１及びＥ１７４によって形成される二価金属結合部位によって、ｈＧＨはニッケルに高い親和性を持つのであろう。結果として、金属キレート化カラムを用いることによって非常に高い純度でｈＧＨを得ることができる（Ｍａｉｓａｎｏら、１９８９）。試験した全ての変異タンパク質が、ニッケルカラムにしっかり結合し、野性型ｒｈＧＨに似たイミダゾール濃度（約１５ｎＭ）で溶出した。
Ｔ３Ｃの精製
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＱ−セファロースカラム（ファルマシアバイオテク社、スエーデンウプサラ所在、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に、シスチン存在で調製した可溶性ペリプラズマ画分（実施例５）をかけ、０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度の直線勾配の溶出液２０カラム体積で、結合したタンパク質を溶出した。カラムにかけ、回収した画分を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｔ３Ｃは、１７０〜２００ｍＭの塩濃度で溶出し、ＷＴ−ｈＧＨよりかなり遅れた。驚いたことにＴ３Ｃ変異タンパク質は、カラムにかけた時には単量体として存在したが、Ｑカラムから溶出した後、安定なジスルフィドホモ二量体として大部分が回収された。還元された時、Ｔ３Ｃ変異タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では野性型ｈＧＨと一緒に移動した。Ｑカラム精製段階の間に二量体形成が起きた。シスチンは、Ｑカラム緩衝液又は他のカラム段階に用いられる緩衝液中には存在しなかった。さらに、どのような濃縮又は精製段階を通過しても、Ｔ３Ｃは二量体のままであった。Ｑカラムからの保存液を、最終ＮａＣｌ濃度０．５Ｍに調節され、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で予め平衡化した１ｍｌのＮｉ−アガロースカラム（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）にかけた。洗浄段階の後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５中０〜３０ｍＭのイミダゾール濃度勾配を用いて高純度のＴ３Ｃ二量体を回収した。Ｔ３Ｃ二量体は、生物検定で活性であった（実施例１０及び表１）。
Ａ１０５Ｃ、Ｔ１３５Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃ変異タンパク質もまたＱカラムからジスルフィド結合二量体として回収された。一度シスチンが除かれると、恐らく加えられたシステイン残基によって、ある変異タンパク質は安定なジスルフィド結合二量体を形成できるようにみえる。これらのタンパク質の単量体形は、すべてのカラム緩衝液中にシスチン又は他のジチオール化合物及び／又はシステインブロック剤を含有させることによって、そして／又はジスルフィド再結合を避けるために緩衝液のｐＨを７より低く維持することによって安定化され得たと我々は確信する。
Ｔ１４８Ｃの精製
変異タンパク質Ｔ １４８Ｃを発現するＥ．Ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ３ｍｌの中で一晩育成した。一晩の培養で飽和状態になった培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ５００ｍｌの中で、Ａ６００において吸光度０．０２５になるまで希釈し、２５０ｍｌずつに分割し、２基のＬ型振とうフラスコを使って３７℃で培養した。培養物の吸光度がおよそ０．３５に達すると、１００ｍＭのＩＰＴＧ１．２５ｍｌをそれぞれのフラスコに加え、最終的に０．５ｍＭにまで濃縮し、遺伝子組換えタンパク質の発現を誘発した。誘発された培養物は、３７℃で一晩（約１６時間）培養した。
一晩の培養で誘発された培養物は、６００ｎｍにおける吸光度がおよそ３．５に達したが、これをＧＳＡローターを備えたソーバルＲＣ−５の遠心機を使って、４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り去り、細胞ペレットに以下のような浸透性衝撃処理を施した。細胞ペレットを０度の２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５．０ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５乃至８．０に調節）内で、磨砕と攪拌によって、吸光度およそ４３まで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、氷上で１５分間培養し、ＳＳ−３４ローターを備えたソーバル遠心機を使用して、４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、０℃に冷やした１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ、ｐＨ ８．０のＥＤＴＡ、５ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５から８．０に調整）内で、磨砕と攪拌によって吸光度がおよそ４３になるまで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、氷上で３０分間培養し、ＳＳ−３４ローター内で、４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離し、その結果できた上清（溶解性細胞周辺画分）を取りだし、−８０℃で保存した。
Ｔ１４８Ｃの二次培養については、次の２点以外は同様に行われた。１）誘発する培養物の量を２００ｍｌとし、３７℃で一晩培養した後、６００ｎｍにおける吸光度がおよそ４．０に達した。２）細胞ペレットの懸濁の際に、Ａ６００における吸光度がおよそ３０になった。
上記の調整品から得られた水溶性細胞周辺画分を結合し、１０ｍＭ、ｐＨ８．０のトリス溶液１リットルを使って、４℃で一晩透析した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０ｐＨの緩衝液内で平衡化した５ｍｌのハイトラップＱセファロース１カラム（ファルマシア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市所在）に透析保持物を入れ、０乃至２５０ｍＭの線状勾配のＮａＣｌを２０カラム使用して、結合タンパク質を溶出した。次いでカラム画分を１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス社、カリフォルニア州サンディエゴ所在 Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって分析した。塩濃度６０乃至８０ｍＭにおいて、溶出した変異タンパク質Ｔ１４８Ｃは急激にピークに達した。適当な画分をプールし、セントリコン１０濃縮機（アミックス社、マサチューセッツ州ビバリー所在）で濃縮した。濃縮したプールを、２０ｍＭ、ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ内で平衡化したスーパーデクス２００ＨＲ １０／３０カラム（ファルマシア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市）によって、更に精製した。このカラム画分を、再びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、変異タンパク質Ｔ１４８Ｃを含む画分をプールした。観察の結果、Ｑセファロースのカラムから回収後も、変異タンパク質Ｔ１４８Ｃは単量体のままであり、またスーパーデクスのカラムから溶出の際、分子量は野生型のｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）と同様であった。Ｑセファロース及び分子ふるい分けクロマトグラフィーによって調製された変異タンパク質Ｔ１４８Ｃを、ＬｏｔＡと呼ぶ。
この他、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍ、ｐＨ７．５のＮａＣｌで平衡化したニッケルキレート樹脂（キアゲン社Ｑｕｉａｇｅｎ）に、Ｑプールを直接加えることも出来る。洗浄ステップに従い、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍ、ｐＨ７．５のＮａＣｌ内にある０乃至３０ｍＭのイミジゾール成分を使ってＴ１４８Ｃを回収した。Ｑセファロースとニッケル親和性クロマトグラフィーで製造したタンパク質Ｔ１４８ＣをＬｏｔＢと呼ぶ。システインを使わずに、浸透圧衝撃によってＴ１４８Ｃの上清を、Ｑセファロースカラムで精製することも試みられた。浸透性衝撃緩衝液にシステインが含まれていないことを除き、前回と同じ方法が用いられた。しかし、Ｔ１４８Ｃタンパク質生成物は、広範囲の塩濃度でＱカラムから溶出し、回収率は低く、タンパク質製品の純度もシステインを使ったＴ１４８Ｃサンプルよりも劣っていた。
Ｓ１４４Ｃの精製
Ｓ１４４Ｃ変異型を含むＥ．Ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢで一晩培養した。一晩の培養で飽和状態になった培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５０ｍｌのＬＢ内で、６００ｎｍにおいて吸光度０．０３まで希釈し、二基のＬ型振とうフラスコを使って３７℃で培養した。培養物の吸光度がおよそ０．３に達したとき、１００ｍＭのＩＰＴＧ１．２５ｍｌを加えて最終濃度を０．５ｍＭにし、遺伝子組換えタンパク質の発現を誘発した。誘発された培養物を、３７℃で一晩（約１６時間）培養した。
一晩の培養で誘発された培養物は６００ｎｍにおいておよそ吸光度３．３に達したが、これをＧＳＡロータを備えたソーバルｒＣ−５遠心分離機を使って、４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り去り、細胞ペレットに以下のような浸透圧衝撃処理を施した。細胞ペレットを０度の２０％スクロース、１０ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５．０ｍＭ、ｐＨ８．０のＥＤＴＡ、５．０ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５から８．０に調節）内で、磨砕と攪拌によって、吸光度およそ３３まで再懸濁させ、０．２５Ｍ、ｐＨ８．０のＭＤＴＡを加えて、最終濃度を２５ｍＭにした。再懸濁した細胞を、氷上で３０分間培養し、ＳＳ−３４ローターを備えたソーバル遠心機を使用して、４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、０℃に冷やした１ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ、５ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５乃至８．０に調整）内で、磨砕と攪拌によって吸光度がおよそ３３になるまで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、氷上で３０分間培養し、ＳＳ−３４ローター内で、４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離し、その結果できた上清（溶解性細胞周辺画分）を回収し、−８０℃で保存した。
上記調製物から得た水溶性細胞質画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０ｐＨで平衡化した５ｍｌのハイトラップＱセファロース１カラム（ファルマシア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市所在）に入れ、２０カラム容量の０乃至２５０ｍＭＮａＣｌの線形勾配を利用して、結合タンパク質を溶出した。次いでカラム画分を１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス社、カリフォルニア州サンディエゴ所在 Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって分析し、Ｓ１１４Ｃ変異タンパク質を含む画分、１２５乃至１５０ｍＭのＮａＣｌ部分をプールして凍結させた。Ｓ１４４Ｃ変異タンパク質は単量体であった。
ｈＧＨのシステイン変異タンパク質の生物活性
精製されたシステイン変異タンパク質Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃの生物活性を、実施例１に説明した細胞増殖検定法を用いて測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード検定法で決定した。この三種類の変異タンパク質は生物学的に活性であった。全ての変異タンパク質は、検定の誤差内で、下垂体ｈＧＨと同じ、最大刺激レベルに達した。Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃの変異タンパク質の平均ＥＣ５０は、脳下垂体ｈＧＨ及びｒｈＧＨ（表１）のものと同様であったＴ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃ。変異タンパク質Ｔ１４８Ｃの独立した見本を二つ、Ｓ１４４ＣとＴ３Ｃをそれぞれ１つずつ（全てシステインの存在下で調製された）について、複数回、検定を行った（表１）。部分的に精製された変異タンパク質Ａ１０５Ｃ、Ｔ１３５Ｃ、ｓｔｐ１９２Ｃもまた検定され、生物活性を示している。
システイン変異タンパク質のＰＥＧ化と精製とに関する一般的方法
ＧＨ変異タンパク質は、システインに反応する市販のさまざまなＰＥＧ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＰＥＧ ビニルスルホン）試薬を使って、ＰＥＧ化することが出来る。一般的には、タンパク質をこうした試薬でＰＥＧ化する方法は、ＷＯ９４１２２１９（コックス及びマクダーモン）、ＷＯ９４２２４６６（コックス及びラッセル）に記されているものと同一で、この両者とも本稿リファレンス中に、大きな改変なしに収められている。自由システインを最高にＰＥＧ化するためには、一般的に、遺伝子組換えタンパク質をジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシル）ホスファイン塩酸（ＴＣＥＰ）あるいはほかの還元剤によって、部分的に還元する。自由システインは、部分的な還元が行われない限り、システイン反応性ＰＥＧには比較的反応が鈍い。それぞれの変異タンパク質を部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、さまざまなｐＨと温度における還元剤の濃度を考慮して、経験的に決める。還元剤の濃度は、ふつう０．５モルの等モル濃度から１０倍モル濃度にまでわたる。温度は４℃から３７℃が望ましい。ｐＨ値は６．５乃至９．０にわたるが、７．５乃至８．５が望ましい。最適な状況もまた、還元剤の種類と暴露時間によって変化する。正当な条件下では、もっとも安定性のないジスルフィド（一般的には分子間ジスルフィドあるいは混合ジスルフィド）は、より熱力学的に安定した未変性のジルスフィドに比べ、より早く分裂する。一般的に、５乃至１０倍モル濃度のＤＴＴを室温で３０分使うというのが効果的である。部分的な還元は、タンパク質が逆相カラムから離れる際の、溶解グラフの微動によって検出することが出来る。二量体ｈＧＨの場合は、分子量の変動を、非・還元的条件下で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって見ることが出来る。この時、タンパク質を過度に還元し、余剰のシステイン残分を過度に暴露しないようにないように気をつけなければならない。過度の還元は、層ＨＰＬＣによって（過度に還元したタンパク質は、完全に還元され、変性したタンパク質同様の保持時間を示す）、またＰＥＧ化反応（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分子量変化で検出できる）に伴う二つのＰＥＧを含むＧＨ分子の出現によっても検出することが出来る。野生型のＧＨは、未変化の分子内ジスルフィドを還元しない条件下ではＰＥＧ化しないため、制御剤として機能しうるのである過剰な還元剤は、分子ふるい分けクロマトグラフィーあるいは透析によって、ＰＥＧ化の前に取り除くことが出来る。ＴＣＥＰは、自由チオール基を含んでいないため、ＰＥＧ化試薬を添加する前に除去する必要はない。部分的に還元したタンパク質を多様な濃度のＰＥＧマルチマイドあるいはＰＥＧビニルスルホンに反応させ、（一般にはＰＥＧ：タンパク質分子率が、１：１、５：１、１０：１、５０：のものを用いる）二つの試薬の最上の率を決定する。タンパク質のＰＥＧ化は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、分子量の変化によって観察できる。２値のＰＥＧ化産物を作らずに、単値のＰＥＧ化産物を出来るだけ多く作る製品を作る最低量のＰＥＧが、一般には最上と考えられる（８０％が単価のＰＥＧ産物に変換されることが一般的には好ましいと考えられている）。一般には、単量体のＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質と無反応ＰＥＧから、分子ふるい分け、イオン変換、親和、逆相、疎水性の相互クロマトグラフィーなどによって精製できる。２層の生物的抽出、塩の沈殿など、他の生成プロトコルも使用できる。精製されたＰＥＧ化タンパク質は実施例１に記された細胞増殖検定によって検定でき、個別の活動を決定する。
実験の実施によって、ＰＥＧ分子が正しい部位においてタンパク質に付着することを証明することが出来る。これは化学的なあるいは分解によるタンパク質の消化と、分子ふるい分け・イオン変換・逆相クロマトグラフィー及びそれに続くアミノ酸配列によるＰＥＧ化ペプチド（分子量が大きい）の精製とによってなされる。ＰＥＧと共役するアミノ酸は、アミノ酸配列中に、空白として現れる。
ＰＥＧ−Ｔ３Ｃの調製と精製
適正な還元剤とＰＥＧ濃度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために、予備的な測定研究を行った。還元されていないＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、二量体の非還元単体種への変換によるタンパク質の部分的還元を観察した。精製したＴ３Ｃ二量体の分割量１μｇを室温で６０分間、ＴＣＥＰの濃度をあげながら培養した。直後に非・還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、反応を分析した。過度の還元と変性なしに有効な量の単量体Ｔ３Ｃを生む量のＴＣＥＰが、続く実験に使われた。ＴＣＥＰはＰＥＧ化反応に支障をきたさないため、タンパク質とＴＣＥＰ混合物とをＰＥＧ添加の前に透析する必要がなく、小規模の実験には使いやすい還元剤である。より大きい規模の実験におけるタンパク質還元には、ＤＴＴのような値段の安い還元剤が好まれる。一般に、タンパク質は、至適時間、還元剤と共に処理される。反応のｐＨはジスルフィドの再組織を制限するために６．５あるいはそれ以下に調整する。還元剤は透析あるいは液体クロマトグラフィーで除去する。その後ｐＨを６．５以上、望ましくは７．５から８．５に再調整し、ＰＥＧ試薬を添加する。
ｐＨ７．５における測定実験は、室温で６０分間使われた５倍モル濃度のＴＣＥＰが、タンパク質を過度に還元することなしに、Ｔ３Ｃ二量体種の大半を、適当なジスルフィド結合をした単量体に変換することを示した。制御実験は、予想通り、Ｔ３Ｃ二量体種がＰＥＧ化されるためには、ＴＣＥＰと共に還元される必要があることを示した。こうした反応コンディションは、反応スケール１００μｇに達する。１０分後に１０倍モル濃度のマレイミドＰＥＧ（フルカ社）５ｋＤａをＴ３Ｃ、ＴＣＥＰに添加し、ＰＥＧ化反応を室温で６０分間行った。サンプルをすばやく、２０ｍＭ、ｐＨ８．０のトリス液で平衡化した１ｍｌのＱセルファースのカラムに入れた。カラムを２０ｍＭ、ｐＨ８．０のトリス液で洗い、１０容量のＮａＣｌを線形勾配させながら、２０ｍＭ、ｐＨ８．のトリス液内にある０乃至２５０ｍのＮａＣｌから、結合タンパク質を溶出した。単価のＰＥＧ化したＴ３を含む画分（Ｔ３Ｃに付着したＰＥＧ単分子）は、ＳＥＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって確認した。こうした画分をプールし、凍らせて保存した。ＰＥＧ部分の存在は、タンパク質の樹脂への親和性を弱め、ＰＥＧ化したタンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離させた。
Ｓ１４４Ｃ及び他のシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化
実施例１２でＴ３Ｃについて行ったのと同様に、適当な還元剤、ＰＥＧ試薬濃度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために、Ｓ１４４について予備的な測定研究を行った。２倍モル濃度のＴＣＥＰと１０倍モル濃度の５ｋＤａマレイミドＰＥＧを使い、室温で二時間、ｐＨ７．５で、より大きな規模のＰＥＧ化を実施した。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、２つあるいはそれ以上のＰＥＧを持つ幾つかの種を示した。これらを、実施例１２と同様に、Ｑセファロースカラムを使用して、単価のＰＥＧ化したＳ１４４Ｃから分離した。別に５ｋＤビニルサルフォンＰＥＧ（フルカ社）を使ってＰＥＧ化反応を実施し、同様の還元条件下で、単価のＰＥＧ化Ｓ１４４Ｃを生成した。
またＴ１４８Ｃ、ｓｔｐ １９２Ｃ、Ｔ１３５Ｃに関して、小規模のＰＥＧ化反応を行った。すべてが５ｋＤマレイミドＰＥＧ及び／或いは５ｋＤａのビニルサルフォンＰＥＧによって単体のＰＥＧ化タンパク質を生じた。
ＰＥＧ−Ｔ３ＣとＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃ ｈＧＨタンパク質の生物活性
ＰＥＧ−Ｔ３ＣとＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃタンパク質の生物活性を、細胞増殖検出（実施例１）で測定した。ＰＥＧ‐Ｔ３Ｃタンパク質は、垂体ｈＧＨ、非ＰＥＧ化したＴ３Ｃタンパク質と同様の用量応答曲線を描き、同様に最高の刺激レベルに達した。 ＰＥＧ‐Ｔ３ＣについてのＥＣ５０平均値は、１．６ｎｇ／ｍｌ（０．０７ｎＭ）（４回の実験で、それぞれ１．３、１．５、１．７、１．８ｎｇ／ｍｌ）であった。ＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質の生物活性は、非特異的ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（クラークらにより記載された（１９６６）４４０ｎｇ／ｍｌ（２０ｎＭ）のＥＣ５０）を使ってＰＥＧ化したｒｈＧＨの場合に比べ、少なくとも１００倍であった。
ＰＥＧ−Ｓ１４４ＣについてのＥＣ５０平均値は、４３ｎｇ／ｍｌ（２ｎＭ）（二回の実験で４０、４５ｎｇ／ｍｌ）であった。ＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃの生物活性は、非特異的ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（クラークらにより記載された（１９６６）４４０ｎｇ／ｍｌ（２０ｎＭ）のＥＣ５０）を使ってＰＥＧ化したｒｈＧＨの場合に比べ、およそ１０倍であった。
ｈＧＨのジスルフィド連鎖３量体、ジスルフィド連鎖高次多量体の作成
１つ以上の「自由」システインを備えた付加的なｈＧＨ変異型を作成し、ｈＧＨについて、より高次のジスルフィド連鎖多量体を作ることが出来る。これらの多量体には、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体及び更に高次の多量体を含む。たとえば、個々の「自由」システイン変異を起こすインビトロＤＮＡプラスミドベクターを組替える遺伝子組換え技術を使って、２つの「自由」システイン残基を持ったｈＧＨ変異型を作成することが出来る。あるいは、ｈＧＨシステイン変異型の変異誘発を使って、付加的な「自由」システイン変異を進めることも出来る。この手続きのどちらかをさらに反復させることで、ｈＧＨ変異型を作成することが出来る。
二個の自由システイン残基を持つｈＧＨ変異型を使って、ｈＧＨ３量体とより高次の多量体を、以下のように作ることが出来る。こうした変異型は、実施例５から９に述べたように、Ｅ．Ｃｏｌｉ内に発現することがあり、浸透圧衝撃溶解物の上清の中にある単量体として回収できる。さらに処理を進め、実施例６から９に示したＱセファロース・クロマトグラフィーのようなジスルフィド結合生成物を誘発した。こうした条件下では、ｔ３Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃなど一つの自由システインを持ったｈＧＨ変異型の幾つかは、ジスルフィド連鎖の２量体に、実質上量的な変換をする。同じあるいは類似の条件下で、例えばｔ３Ｃとｓｔｐ１９２Ｃを結合させる２価の変異型のような、２つの自由システインを持つｈＧＨ変異型による分子間ジスルフィド生成物が生まれ、その結果としてｈＧＨ分子の重合化が生じ、こうした高分子の鎖の長さは原則として制限がない。ｔ３Ｃ変異型及び／或いはｓｔｐ１９２Ｃ変異型のような、ただ一つの自由システインを持つｈＧＨ分子を重合反応に加えることで、鎖の長さは制限、及びある程度まで抑制できる。成長する高分子とただ一つの自由システインを持つ分子との間にできたジスルフィド結合生成物は、未熟な高分子の持つ２つの高分子化部位のうち、一方の伸長を「キャップ」つまり防止する。ただ一つの自由システインを持つ第二のｈＧＨ分子と、未熟な高分子のもう一方の高分子化部位との反応は、高分子化を終了させ、高分子の長さを決定させる。高分子の平均長さは、反応の科学量論、つまり２つの自由システインを持つｈＧＨ分子と一つの自由システインを持つｈＧＨ分子との比率によって制御できる。比率が低いと平均的に短めの高分子となり、ひり津が高いと長めの高分子となる。より複雑な「分岐した」高分子は、三つあるいはそれ以上の自由システインを持つｈＧＨ変異型と、一つだけの自由システインを持つｈＧＨ体との反応から作成される。
それぞれ異なる大きさを持つ高分子は、引き続き分子ふるい分けクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーその他により精製される。ＧＨについて記されたのと同じ手法により、ジスルフィド連鎖二量体と、より高度の多量体ＥＰＯとアルファインターフェロンが作り出される。
バキュロウイルス（ＢＶ）に発現した遺伝子組換えヒトエリスロポエチン（ｒＥＰＯ）のクローニング、発現、精製
Ａ．ＥＰＯをコードしたｃＤＮＡをクローニングするヒトのＥＰＯをコードしたｃＤＮＡを、順方向プライマーＢＢ４５（５＞ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ＞３）（配列番号２５）と逆方向プライマーＢＢ４７（５＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧ＞３）（配列番号２６）とを使ったＰＣＲによってクローニングした。ＢＢ４５は、ＥＰＯコーディング配列の初発因子メチオニンとアミノ酸末端とをコードした遺伝子配列をアニ−ルし、またクローニング目的のためにＢａｍ ＨＩ部位を備えている（ジェイコブズら、１９８５年。リン他、１９８５年）。ＢＢ４７は、翻訳されたストップ記号のすぐ下流にあるＥＰＯ ｍＲＮＡの非翻訳領域をアニ−ルし、クローニングを目的とするＥｃｏ ＲＩ抑制部位を備えている。ヒトの肝臓細胞系Ｈｅｐ３から分離したＲＮＡ全体を、ＰＣＲ用の一本鎖ｃＤＮＡの第１鎖合成に使用した。
細胞全体のＲＮＡ全体を調製するには、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション）を、デルベッコ・モディファイド・イーグルズ・培地（ＤＭＥＭ）内で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使って成長させた。細胞を１８時間、１３０μＭのＤｅｆｏｒｏｘａｍｉｎｅあるいは１００μＭ塩化コバルトを使って処理し、ＥＰＯ発現を誘発した。どちらの複合物もＨｅｐ３Ｂ細胞内の、ＥＰＯ ｍＲＮＡとタンパク質との発現を誘発することが知られている（ワン及びセメンザ、１９９３年）。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を使い、製造者の指示通りに細胞から単離した。塩化コバルト処理した１．４×１０７細胞からおよそ３２０μｇの全ＲＮＡを単離し、Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅで処理した１．４×１０７細胞からおよそ２７０μｇの全ＲＮＡを遊離した。一本鎖ｃＤＮＡの第１鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社のファースト・ストランド・ｃＤＮＡ・シンセシス・キット・フォア・ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）を使って完成し、プライマーとしてランダムヘキサマーを使った。続いて鋳型として第１鎖合成物の生成物を、プライマーとしてＢＢ４５、ＢＢ４７を使い、ＰＣＲ反応を実行した。反応生成物を、アガロースゲル上に注いだ際、予期どおりの約６００ｂｐのＰＣＲ産物が観察された。ＰＣＲ産物はＢａｍ ＨＩとＥｃｏ ＲＩによって消化し、Ｂａｍ ＨＩとＥｃｏＲＩによって切り取られたベクターｐＵＣ１９内でクローニングし、アルカリ性ホスフォターゼで処理した。ＤＮＡシークエンシングにより、ＥＰＯ遺伝子を作る正しいシグナル配列を含むクローンを確認した。プラスミドをｐ ＢＢＴ１３１と名付け、実施例１７の記述通り、部位特異的突然変異誘発によるＥＰＯ変異型の構築に使用した。
Ｂ．昆虫の細胞におけるＢｖ ｒＥＰＯの発現
ｐＢＢＴ１３１内のＥＰＯ ｃＤＮＡを、５’末端及び３’末端の双方で修飾し、昆虫細胞において発現させた。５’末端においては、配列ＣＡＡＡを、イニシエーターＡＴＧのすぐ上流に加えて、翻訳を強化した。この配列は、バキュロウイルス（エアーズら １９９４年；ランジャン及びハスネイン、１９９５年）の提唱コンセンサス翻訳開始配列である。末端３’には、８アミノ酸ＦＬＡＧエピトート配列（ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ）（配列番号２７）を加え、精製システムを提供した。ＦＬＡＧエピトープを、柔軟性のあるリンカーｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号２８）を通して、ＥＰＯ遺伝子と融合した。こうした修飾は、望みの添加物をＥＰＯ配列に組みこむオリゴヌクレオチドプライマーを使ったＰＣＲによりなされた。遺伝子の５’末端を修飾するためには、オリゴヌクレオチドプライマーＢＢ６３（５＞ＣＧＣＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴ＞３）（配列番号２９）を使用した。ＢＢ６３はＣＡＡＡ配列をＡＴＧの上流に添加し、イニシエーターであるメチオニンをコードするＤＮＡ配列と、ＥＰＯコーディング配列のアミノ酸末端部とにアニ−ルし、クローニングを目的とするＢａｍ ＨＩ部位を備えている。リンカーとＦＬＡＧ配列を、逆方向プライマー ＢＢ６０（５＞ＧＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴ ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ＞３）（配列番号３０）及びＢＢ６１（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣ＞３）（配列番号３１）を」使って配列ＰＣＲ反応に加える。ＢＢ６０はＥＰＯコーディング配列の３’末端をアニールし、融合したペプチドリンカー配列とＦＬＡＧ配列の一部を含んでいる。ＢＢ６１はリンカーとＦＬＡＧのジャンクションをアニ−ルするＢＢ６０配列の断片と重なり、ＦＬＡＧ配列の残り、ついで翻訳停止コドン（ＴＡＡ）及びＥｃｏＲＩ部位を、クローニングのために付加した。修飾されたＥＰＯ ｃＤＮＡは、Ｂａｍ ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１９内でクローニングされて、この構造のＤＮＡ配列は確認された。結果として出来たプラスミドを、ｐＢＢＴ１３２と命名し、実施例１７の通り、ＥＰＯ変異型の作成に使用した。バキュロウイルスでの発現のため、「ＦＬＡＧタッグした」ＥＰＯ ｃＤＮＡをｐＢＢＴ１３２の約６３０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｐＲＩ断片から切断し、ゲル精製を行い、Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断すると共にアルカリホスファターゼ処理したバキュロウイルスの伝達ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロジェン社 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）でクローニングする。クローンを後の使用のために一つ抜き出し、ｐＢＢＴＩ３８と命名する。
ｐＢＢＴ１３８ＤＮＡを使って、スポドプテラ・フルジペルダ由来の細胞系Ｓｆ９と、線状化した（Ｂｓｕ３６Ｉで消化）Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ（インビトロジェン社 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）バキュロウイルスＤＮＡとを、細胞内に同時移入する。Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭゲノムの設計によって、プラーク形成ウイルス粒子生成物は、線状Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭＤＮＡと、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクターとの間の遺伝子組換えが必要となり、結果として、クローニングしたＥＰＯ遺伝子がバキュロウイルスゲノムに組み込まれる。この義務的組み込みにより、機能的なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子もバキュロウイルスゲノムに組み込まれる。この同時移入は、インビトロジェン社の「Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭキット」のプロトコルに従ってなされる。２×１０６個のＳｆ９細胞を使って約１ｍｌの上清を作る。この上清の希釈物を、Ｓｆ９細胞について青色プラークの形成に関し、２７℃で検出した。１０個の青色プラークを取り上げ、サブ培養した。それぞれのプラークを使って、１０％のＰＢＳを補充したグレイス昆虫培地５ｍｌを含むＴ２５フラスコ内でＳＦ９細胞２．５×１０６を接種する。５日後、これらの感染細胞（ＰＩストック）からの上清を収集し、ウエスタンブロットによってＥＰＯの発現を検出した。上清１０個を１％のβメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を加えたＳＤＳサンプル緩衝剤にいれて、１４％のトリス・グリシン・ポリアクリルアミド（ノヴェックス社 Ｎｏｖｅｘ）によって電気泳動した。未感染のＳＦ９細胞の上清をネガティブコントロールとして含めた。電気泳動の後、タンパク質を０．４５μｍニトロセルロース（ノヴェックス社 Ｎｏｖｅｘ）に転移させた。ニトロセルロース膜を、０．０５％のトウィーン２０、４％と粉末ミルクを加えたトリス緩衝生理ＮａＣｌ水（ＴＢＳ）（ブロッキング緩衝剤）に入れてブロックした。抗ＦＬＡＧ Ｍ２マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（イーストマン・コダック社 Ｅａｓｔｍａｎ ＫＯＤＡＫ）をブロッキング緩衝剤の中で、１：１５００あるいは１：２５００に希釈して使い、ブロットを手順にしたがって４℃で一晩培養した。アルカリ性ホスファターゼ共役ヒツジ抗マウスＩｇＧ１（バインディング部位社）をブロッキング緩衝剤の中で１：１０００に希釈し、ブロットを室温で１時間培養した。ウエスタンブロットを、ＮＢＴＢＣＩＰカラーディベロップメントサブスタンス（プロメガ社）を使って展開させた。１０の分離体の内９が、ＥＰＯ発現に陽性反応を示した。ＢＶ ｒＥＰＯタンパク質の分子量は、還元条件下でおよそ３０ｋＤａであり、この分子量の範囲内で、１本の大きいバンドと１ないし２本の小さいバンドを備え、これはグリコシル化されたタンパク質一般に認められる。
陽性反応を示す２つの上清を、下記実施例１６のＤに記したインビトロのＥＰＯ生物検定で調べた。双方の上清が、ＥＰＯ依存細胞系の増加を用量依存性に刺激し、ＥＰＯ活性を持っていることを示した。擬似感染をしたＳｆ ９細胞のコントロール上清と、ウエスタンブロットによりＥＰＯ発現が陰性であったバキュロウイルスの１つの上清は、ＥＰＯ生物検定において、検出し得る活性は示さなかった。
大量の野生型ＢＶ ｒＥＰＯを生成し精製するために、ｂｖＢＢＴ１３８Ａと名づけた、１つの陽性の組替えバキュロウイルスを更なる増幅用に選択した。分離体１３８ｎｍのＰ１ストックを、５００ｍｌのスピナーフラスコ培養基内の１０％のＰＢＳを補充したグレイス昆虫培地内で２７℃でサブ培養することにより、高力価のウイルスストック５００ｍｌを用意した。グレイス昆虫培地は、およそ１００μＭのＬ−システインを含む。培養物の上清を７日後に採取し、約１０８のプラーク形成ユニット／ｍｌの力価を有していることを見出した。この溶解物のアリコートをＰ２ストックと名づけ、これを使って５００ｍｌの培養物を感染させ、野生型ＢＶ ｒＥＰＯのより大規模な製造を行った。１０％のＰＢＳを補充したグレイス昆虫培地中の５００ｍｌのＳｆ９細胞の培養物を、スピナーフラスコ内で１．０×１０６の力価まで成長させ、次いで１つのさまざまな感染法でＢＢＴ１３８Ａに感染させた。３日後に培養物から上清を採取し、野生型のＢＶ ｒＥＰＯ−１３８Ａタンパク質を実施例１６ｃの通りに精製した。
Ｃ．野生型バキュロウイルス製造のｒＥＰＯのアフィニティ精製
細胞の上清を、遠心分離と０．２μＭの濾過によって精製した。野生型のＢＶ ｒＥＰＯを抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（イーストマン・コダック社）を用いて１段階法で精製した。簡単に言うと、Ｍ２アフィニティゲルを５カラム量の５０ｍＭ トリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）、５カラム量の０．１Ｍ グリシン ｐＨ３．５で洗い、次いでＴＢＳで平衡化する。浄化したバキュロウイルス細胞の上清を、１５０ｍＭのＮａＣｌに調整し、平衡化した樹脂を加えた。バッチローディングを、ローラボトル上で４℃で一晩続ける。一晩のインキュベーション後、ファルマシアＸＫ１６／２０ＦＰＬＣカラムを使って樹脂を回収し、Ａ２８０が基準に達するまでＴＢＳで洗浄した。０．１ＭグリシンｐＨ３．５で結合タンパク質を溶出し、画分を集めて１．０ＭトリスｐＨ９．０で中和する。必要に応じてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の中に１％ＢＭＥを加えてカラム画分を調製し、既成の１４％トリスグリシン・ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＢＶ ｒＥＰＯの大半を含むＭ２アフィニティカラムの画分をプールし、セントリコン１０スピンコンセントレイター（アミコン社）で濃縮した。野生型ＢＶｒＥＰＯの最終収量は、ブラッドフォードプロテインアセイキット（バイオラッドラボラトリーズ社）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準にして決定したが、約３６０μｇであった。ＳＤＳゲルのクマシー−ブルー染色でタンパク質を測定すると、９０％以上の純度を示した。
Ｄ．野生型バキュロウイルスｒＥＰＯのインビボ生物活性
ヒトのＵＴ７／ｅｐｏ細胞系を使った細胞増殖検定（コマツ他、１９９１年）を開発して、野生型のＢＶ ｒＥＰＯの生物活性を測定した。ヒトのＵＴ／ｅｐｏ細胞系は、ハーバード大学医学部のＦ．バン博士から得たものである。この細胞系は、ＥＰＯによって細胞の増殖と生存とを測定するものである（ボイセルほか、１９９３年）。該細胞は１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ユニット／ｍｌ ｒＥＰＯ（ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を発現させたもの。Ｒ＆Ｄシステムズ社で購入）によって補充した、イソコフズ改変デルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内に維持した。生物検定に際し、ＩＭＤＭ培地で細胞を三回洗い、１０％ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地内で、１×１０５の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞懸濁５０μｍ（５×１０３細胞）を、平底９６ウェル型組織培養プレートの１テストウェル当たりに当分量で割り当てた。テスト用に、タンパク質サンプルの三倍希釈液を、１０％ ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含み、フェノールレッドを含まないＩＭＤＭに溶かして調製した。５０μｇ／ｍｌ希釈タンパク質サンプルをテストウェルに加え、加湿した５％ＣＯ２組織培養器の中で、３７℃で培養した。タンパク質サンプルを三つ一組のウェル内で測定した。６０から７２時間後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱｗｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を各ウェルに加え、組織培養器で１から４時間、３７℃で培養した。ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使って、４９０ｎｍで測定した。コントロールウェルには培養液はいれたが、細胞は入れなかった。３つ組のコントロールウェルの平均吸光度を、３つ組のテストウェルそれぞれの組の平均値から引いた。ＣＨＯ細胞で発現させたｒＥＰＯあるいは野生型のＢＶ ｒＥＰＯの連続希釈液を、並行して分析した。
ＵＴ７／ｅｐｏ細胞系は、細胞数と吸光度における用量依存性増加が示すとおり、ｒＥＰＯに対し、強い増殖反応を見せた。吸光度は、数値２．０まで細胞の数に比例した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）。ｒＥＰＯが存在しない場合には、多くのＵＴ７／ｅｐｏ細胞 は死に、吸光度は０．１以下になった。市販のＣＨＯ細胞発現ｒＥＰＯと我々の用意した野生型ＢＶ ｒＥＰＯは、検定の誤差範囲内で同じ最高刺激レベルに達し、生物検定における平均ＥＣ５０は、約０．４から０．５ｎｇ／ｍｌ（表２）であった。異なる日に行った検定でのこれらタンパク質についてのＥＣ５０の値は０．２１から０．６５５ｎｇ／ｍｌにわたった（表２）。従ってこれらのタンパク質サンプル間の比較は、同日に分析されたサンプルについて行った。それらのＥＣ５０値は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＣＨＯ ｒＥＰＯで報告されている値（０．０５−０．１ユニット／ｍｌ又は約０．４−０．８ｎｇ／ｍｌ）と一致する。
ＥＰＯシステイン変異タンパク質の構築、発現、精製、生物活性
Ａ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の作成
実施例４に示された成長ホルモン変異タンパク質の作成に使われる方法（イニスら、１９９０年。ホートンら、１９９３年）と同じ、ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発方法を使用して、８つの変異ＥＰＯ遺伝子を作成した。Ａ−Ｂループ内にあるＮ結合グリコシル化部位あるいはその近くで４つの変異タンパク質（Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｎ３８Ｃ及びＴ４０Ｃ）、Ｂ−Ｃループ内のＮ結合グリコシル化部位あるいはその近くで２つの変異タンパク質（Ｎ８３Ｃ、Ｓ８５Ｃ）、Ｃ−Ｄループ内のＮ結合グリコシル化部位あるいはその近くで１つの変異タンパク質（Ｓ１２６Ｃ）、そして自然のカルボキシ末端Ｒ１６６残基と、ペプチドリンカーとＦＬＡＧ配列からなる１５アミノ酸カルボキシ末端延長部との間にシステインを加える１つの変異タンパク質（１６７Ｃ）を構築した。変異ＰＣＲの反応の鋳型は、プラスミドｐＢＢＴ１３１であり、この場合、非修飾ＥＰＯ遺伝子がＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１９でクローニングされる。ＰＣＲ産物を、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、適当な制限酵素によって切り取ったｐＢＢＴ１３２ベクターＤＮＡとライゲートし、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製を行った。上記に詳しく述べたように、ｐＢＢＴ１３２は、クローニングした修飾（ＦＬＡＧを組みこんだ）ＥＰＯ遺伝子を有するｐＵＣ１９変異型である。こうしたライゲーションからの形質転換体を成育し、プラスミドＤＮＡを分離して配列決定する。クローニングした突然変異ＰＣＲ断片全体の配列を決定し、問題の変異が存在することを確認すると共に、ＰＣＲ反応によって、あるいは合成オリゴヌクレチドプライマーによって誘発される可能性のある任意の追加的変異が存在しないことを確認した。
システイン置換変異Ｎ２４Ｃを、以下のように構築した。変異順方向オリゴヌクレチドＢＢ６４（５＞ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＴ＞３）（配列番号３２）は、位置２４におけるアスパラギンをコドンＡＴＴと変化させて、システインをコードするＴＧＴにし、近くにあるＳｔｙｕ １部位 にも影響を及ぼす。このオリゴをＥＰＯのシグナル配列に至るＤＮＡ配列３’にアニールするプライマー逆方向の非変異性プライマーＢＢ４７（５＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣ＞３）（配列番号３３）と共に、ＰＣＲで使用した。１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各プライマーを０．２μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰをそれぞれ２００μＭ、１ｎｇの鋳型プラスミドｐＢＢＴ１１３（実施例１６に記述）、１．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社）、０．２５ユニットのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）を含む１ＸＰｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ緩衝液で５０μｌ ＰＣＲ反応を行った。反応は、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社）で行った。反応のプログラムは次ぎの通りである：９６℃で三分間、［９５℃で１分間、６０℃で１．２５分間、７２℃で１分間］を２５サイクル、次いで６℃で保持。ＰＣＲ反応の５μｌアリコートを、アガロースゲル電気泳動によって分析し、予期した大きさ約４７０ｂｐの１つの断片を見出した。反応の残りは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（キアゲン社）を使って、業者のプロトコル通りに「片付け」、業者のプロトコル通りのＳｔｙＩとＢｓｒＧＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、エタノール沈殿させ、２０μｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８の中で再懸濁し、２％のアガロースゲルの上に注いだ。約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片は、ＱＵＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使用して業者のプロトコル通りにゲル精製した。この断片を、ＳｔｙＩとＢｓｒＧＩによって切断したｐＢＢＴ１３２（実施例１６に記述）とライゲートし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランド、バイオラブズ社）によって処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応を使ってＥ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来た形質転換体から得たプラスミドの配列を決定して、Ｎ２４Ｃ変異と、正しい配列と備えたクローンを、約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片の残りを通じて確認する。
置換突然変異型Ｔ２６Ｃを作成して、その配列を、変異順方向オリゴＢＢ６５（５＞ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＴ＞３）（配列番号３４）をＢＢ６４の代わりに使用することを除き、上記のＮ２４Ｃのものと同様なプロトコルを用いて確認した。
置換突然変異型Ｎ３８Ｃを、実施例４に示した「オーバーラップ延長による突然変異」技術を使って作成する。異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する点を除き、Ｎ３８Ｃの構築のための最初のあるいは「一次」のＰＣＲ反応は、上記Ｎ２４Ｃの構築に記されているのと同様の方法で行った。使用したプライマーの組は、（ＢＢ６６６＋ＢＢ４７）及び（ＢＢ６７＋ＢＢ４５）であった。ＢＢ４７については上記に説明がある。順方向非変異性のプライマーＢＢ４５（５＞ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ＞３）（配列番号３５）はＥＰＯの最初の７つのアミノ酸をコードするＥＰＯ配列にアニールする。ＢＢ６６とＢＢ６７は、Ｎ３８のＡＡＴコドンをシステインのＴＧＴコードに変化させる。相補的な突然変異オリゴヌクレオチドである。ＢＢ６６の配列は（５＞ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣ＞３）（配列番号３６）であり、ＢＢ６７の配列は（５＞ＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＴ＞３）（配列番号３７）である。（ＢＢ６６×ＢＢ４７）と（ＢＢ６７×ＢＢ４５）のＰＣＲ反応は、予期通り、（ＢＢ６７×ＢＢ４７）は約４２０ｂｐ、（ＢＢ６７×ＢＢ４５）は約２２０ｂｐの大きさの産物を与えた。ＰＣＲ産物はエタノール沈殿、ゲル精製を行い、上記に詳しく述べたように、２０μｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌで回収した。こうした突然変異画分を、後のあるいは「二次の」ＰＣＲ反応の中で一緒に「スプライシング」する。この反応において、１次反応のゲル精製したＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌ使用し、ＢＢ４５とＢＢ４７をプライマーとして使う。ほかの点では、第１次反応で使われている反応条件と同様である。二次のＰＣＲのアリコートをアガロースゲルの電気泳動で分析し、予期されたー約６３０ｂｐのバンドを観察した。二次ＰＣＲ反応のバルクを、ＱＩＡＱｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（キアゲン社）を使い、業者のプロトコルに従って「片付け」、ＳｔｙＩ及びＢｓｒＧＩ（ニューイングランドバイオラブ社）で業者のプロトコルに従って消化し、エタノール沈殿し、２０μｌの１０ｍＭ ｐＨ８．５ トリスに再懸濁させ、２％のアガロースゲルにかけた。約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩの問題の画分を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使い、業者のプロトコルに従ってゲル精製した。この画分を、ＳｔｙＩとＢｓｒＧＩを使って切り取ったｐＢＢＴ１３２（実施例１６に説明）とライゲートし、コウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブ社）で処理し、ゲル精製を行った。ライゲーション反応を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来る形質変換体からのプラスミドを配列決定して、Ｎ３８Ｃ変異を含み、正しい配列を有するクローンを、約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片を通じて確認した。
置換変異Ｔ４０Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｔ４０のＡＣＴコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ６８（５＞ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣ（配列番号３８）及びＢＢ６９（５＞ＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴ＞３）（配列番号３９）が、１次ＰＣＲ反応でのＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。
置換変異Ｎ８３Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｎ８３のＡＡＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ７０（５＞ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号４０）及びＢＢ７１（５＞ＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣ＞３）（配列番号４１）が、１次ＰＣＲ反応でのＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物の大きさは、さまざまであった。（ＢＢ７０×ＢＢ４７）反応では、予想通り約３００ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７１×ＢＢ４５）反応では、予想通り約３６０ｂｐの産物が生じた。
置換変異Ｓ８５Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｎ８５のＴＣＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ７２（５＞ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号４２）及びＢＢ７３（５＞ＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣ＞３）（配列番号４３）が、１次ＰＣＲ反応内でのＢＢ６６とＢＢ ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物の大きさは、さまざまであった。（ＢＢ７２×ＢＢ４７）反応では、予想通り約３００ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７３×ＢＢ４５）反応では、予想通り約３６０ｂｐの産物が生じた。
置換変異Ｓ１２６Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｓ１２６ＣのＴＣＡコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ７４（５＞ＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣ＞３）（配列番号４４）及びＢＢ７５（５＞ＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣ＞３）（配列番号４５）が、１次ＰＣＲ反応でのＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物の大きさは、さまざまであった。（ＢＢ７４×ＢＢ４７）反応では予想通り約１７５ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７５×ＢＢ４５）反応では、予想通り約４８０ｂｐの産物が生じた。
さらにＥＰＯコーディング配列のカルボキシ末端アミノ酸のあとにシステインを加えた変異型を作成した。＊１６７Ｃと名付けたこの変異型は、次のように作成される。上記に、Ｎ２４Ｃ変異型構築について記したのと同じ条件下でＰＣＲ反応を行った。ただし、オリゴヌクレチドＢＢ４５（上記参照）と逆方向変異オリゴヌクレチドＢＢ７７（５＞ＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ＞３）（配列番号４６）を使い、Ｔａｑポリメラ−ゼ２．５単位とＰｆｕポリメラーゼ０．５単位を使用した。ＢＢ７７は、ＥＰＯコーディング配列の末端２１残基にアニールし、Ｒ１６６のＡＧＡコドンの後でシステインのＴＧＴコドンが加わったが、これはＥＰＯコーディング配列の末端アミノ酸である。ＢＢ７７にはまた、７つのアミノ酸リンカー（−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）（配列番号２７）をコードする配列と、ＦＬＡＧエピトープ配列の一部が加わった。このＰＣＲ反応の約６３０ｂｐ産物をゲル精製し、続くＰＣＲ反応での鋳型として使った。続くＰＣＲ反応では、プライマーＢＢ４７とＢＢ６１（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣ＞３）（配列番号３０）を使用する以外、同じ反応を使用した。ＢＢ６１には、ＴＡＡ停止コドンとＥｃｏ ＲＩクローニング部位が続くＦＬＡＧエピトープ配列の残りが加わっている。約６７５ｂｐのＰＣＲ反応産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎ（キアゲン社）を使用して業者のプロトコルに従って「片付け」、ＳｔｙＩ及びＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラブ社）を使って消化し、エタノール沈殿を行い、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５に再懸濁させ、２％のアガロースゲルにかけた。約８６ｂｐの問題のＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩ断片を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使い、業者のプロトコルに従ってゲル精製した。この断片をＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩで切り取ったｐＢＢＴ１３２（実施例１６に記述）にライゲートし、コウシ腸アルカリホスフォターゼ（ニューイングランドバイオラブ社）で処理し、ゲル精製した。
ライゲーション反応を使ってＥ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来た形質変換体からのプラスミドを配列決定して、＊１６７Ｃ変異型と、正しい配列を有するクローンを、約８６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩ断片を通じて確認した。
バキュロウイルスの発現のため、ｐＵＣ １９に基づく派生物ｐＢＢＴ１３２から、８つの変異型をコードするＥＰＯ遺伝子を、約６３０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、野生型のＥＰＯの発現に使用したｐＢｌｕｅＢａｃ４．５バクロウイルス移入ベクターでサブクローニングした。
ここに記されたのと同様の手法をつかって、ほかのＥＰＯシステイン変異タンパク質をつくることもできる。システイン変異タンパク質は、システインをＥＰＯコーディング配列内の天然アミノ残基に置きかえる置換変異型、ＥＰＯコーディング配列内の２つの天然アミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異型、ＥＰＯコーディング配列内の第１のアミノ酸Ａ１に先行するシステイン残基を付加し、あるいはＥＰＯコーディング配列内の末端アミノ酸残基Ｒ１６６の後に来るシステイン残基を付加する付加変異型などがある。システイン残基は、いかなるアミノ酸とも置換でき、ＥＰＯコーディング配列のどこにおいても、どの２つのアミノ酸の間にも挿入できるのである。ＥＰＯ中のシステイン残基の置換あるいは挿入の部位として望ましいのは、ＨｅｌｉｘＡより前の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、へリックスＤより後の領域がある。ほかに望ましい部位としては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄへリックスの最初か最後の三つのアミノ酸がある。これらの領域にある残基で、システイン置換体を作るのに望ましいものは、以下の通りである。Ａ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｄ８、Ｓ９、Ｉ２５、Ｔ２７、Ｇ２８、Ａ３０、Ｅ３１、Ｈ３２、Ｓ３４、Ｎ３６、Ｉ３９、Ｄ４３、Ｔ４４、Ｋ４５、Ｎ４７、Ｙ４９、Ａ５０、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｇ５７、Ｑ５８、Ｇ７７、Ｑ７８、Ａ７９、Ｓ８４、Ｑ８６、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｔ１０７、Ｒ１１０、Ａ１１１、Ｇ１１３、Ａ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ａ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ａ１２４、Ａ１２５、Ａ１２７、Ａ１２８、Ｒ１３１、Ｔ１３２、Ｋ１５４、Ｙ１５６、Ｔ１５７、Ｇ１５８、Ｅ１５９、Ａ１６０、Ｔ１６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、Ｒ１６６である。システイン残基はまた、これらのアミノ酸の直前か直後にも直接挿入することも出来る。システイン残基を付加するのに望ましいもう一つの部位は、Ａ１の前で、＊−１Ｃと呼ばれている。
また、別のアミノ酸を、ＥＰＯ内で天然システイン残基を置換することで、ＥＰＯ変異タンパク質を構築できる。通常、置換されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成する天然システイン残基は、自由である。非必須システイン残基はほかの１９のアミノ酸のいずれとでも入れ替えられるが、セリンあるいはアラニン残基が望ましい。また、自由システインの残基を、シトコウスキーら（１９８８）によって記述されたような方法を使い、天然アミノ酸の化学的修飾によって、ＥＰＯに導入することができる。
実施例１６−１９に記されたのと同様の方法を使い、真核細胞（昆虫細胞や哺乳類の細胞）、の中にタンパク質を発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をＰＥＧ化し、インビトロ生物検定において、生物活性を測定することが出来る。また実施例１−１５記されたのと同様の手法を使い、あるいは関係者によく知られた関連の方法を使って、Ｅ．Ｃｏｌｉのような原核細胞の中に、ＥＰＯ変異タンパク質を発現させることが出来る。
Ｂ．ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質の昆虫細胞での発現
発現実験では、上で説明した野生型ＥＰＯをコードするプラスミドｐＢＢＴ１３８に関する手順を使用して、Ｓｆ９細胞を線形化したＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｃＴＭＤＮＡとともに同時移入するために、変異型ＥＰＯをコードする８つのプラスミドを使用した。トランスフェクション上清は、Ｓｆ９細胞上で、青色プラーク形成について検定した。それぞれの変異型について、１０個の青色プラークを取り出し、実施例１６において説明するように継代培養した。１０つのうち５つの上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによりスクリーニングし、ＥＰＯ変異型の発現を検出した。ウエスタンブロット分析は、野生型ＥＰＯに関して実施例１６で説明した方法を使用して実施した。ウェスタンの結果は、各クローンからスクリーニングした５つの上清のうち、少なくとも３つが、ＦＬＡＧタグ付きＥＰＯタンパク質を含むことを示した。ウエスタンブロットの結果によって更に、Ｎ結合グリコシル化部位（Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｎ３８Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ８３Ｃ、及びＳ８５Ｃ）でのグリコシル化を防止すべき変異タンパク質をコードするプラスミドが、野生型ＢＶ ｒＥＰＯよりも小さな、約２，２００乃至２，８００ダルトンの分子量を有するタンパク質を生成することも明らかになった。対照的に、Ｏ−結合グリコシル化部位のＳ１２６変異タンパク質、及び＊１６７Ｃ（Ｃ末端システイン付加）は、野生型ＢＶ ｒＥＰＯと共に移動するＥＰＯタンパク質を生成した。これらの結果は、昆虫の細胞が通常、Ｎ−結合グリコシル化を行うという観察と、及びＯ−結合グリコシル化部位に結合する糖基が一般に小さく、これによりタンパク質の分子量が最低限しか増加しないという観察とに一致する。昆虫の細胞はＯ−結合グリコシル化を行うことが報告されている（Ｄａｖｉｅｓ、１９９５）。
更に多くの量のＥＰＯ変異タンパク質を精製する目的で、各変異タンパク質をコードする一つの正の組換えバキュロウイルス単離体を更なる増幅のために選択した。野生型単離体に関して上で説明した継代培養によって、それぞれの変異型Ｐ１から、５００ｍｌの高滴定濃度ウイルス株を準備した。こうしたそれぞれのＰ２溶解物のアリコートを、その後、実施例１６の野生型ＥＰＯに関して説明した手順を使用して、それぞれのＥＰＯ変異タンパク質の大規模な生成に関して、５００ｍｌ培養物に伝染させるために使用した。バキュウロウィルス感染細胞からの５００ｍｌの上清は、その後、滅菌濾過を行い、４℃で保管した。ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌカラム（イーストマン コダック）を使用し、交差汚染が発生しないように各変異タンパク質に異なる樹脂のバッチを使用して精製した。５ｍｌの樹脂は、最初に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）で洗浄し、その後０．１ＭグリシンｐＨ３．０で洗浄し、最後にＴＢＳ内で再び平衡状態にした。ＮａＣｌをバキュウロウィルス培養濾過物に追加し、アフィニティ樹脂を加える前に、０．１５Ｍの最終濃度にした。この樹脂は、ローラボトル器具上で一晩、４℃でバッチロードした。翌朝、ＸＫ１６ Ｐｈａｒｍａｃｉａカラムを使用して、この樹脂を取り出し、Ａ２８０が基準に達するまでＴＢＳで洗浄した。ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質は、０．１Ｍグリシン ｐＨ３．０で溶出した。画分（１．５ｍｌ）は、２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ ｐＨ９．０を含むチューブに収集し、溶液を中和した。クロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき、主に精製ｒＥＰＯ−Ｃｙｓタンパク質を含む画分をプールし、凍結させた。５００ｍｌ上清培養物からのタンパク質回収には、変異タンパク質に応じて、７５乃至８００μｇの幅があった（表２）。
精製ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質は、非還元条件下で、２７乃至３０ｋＤａの見かけ分子量で移動し、単量体であるタンパク質と一致する。ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質の見かけ分子量は、２つのクラスに分かれ、これはおそらくグリコシル化の違いが原因である。Ｏ−グリコシル化部位（Ｓ１２６Ｃ）及びＣ終端（＊１６７Ｃ）での変異を含むｒＥＰＯ−Ｃｙｓタンパク質は、野生型ＢＶ ｔＥＰＯと同様の位置で移動する。Ｎ−結合グリコシル化部位の一つでのグリコシル化を防止する変異を含むタンパク質（Ｎ３８Ｔ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ８３Ｃ、及びＳ８５Ｃタンパク質）は、２７乃至２８ｋＤａの見かけ分子量で移動し、野生型ＢＶ ｒＥＰＯより僅かに小さい。驚くべきことに、Ｓ８５Ｃタンパク質は、還元及び非還元条件下の両方でダブレットとして移動し、ダブレットの大きなバンドはＮ−結合グリコシル化部位の一つでのグリコシル化に関して予測されたサイズで、小さなバンドは完全にグリコシル化した野生型ＢＶ ｒＥＰＯに関して予測されるサイズだった。Ｓ８５Ｃに関して単離されたオリジナルの組換えバキュロウィルスプラークすべてが、ダブレットとして移動するｒＥＰＯタンパク質を生成しており、このダブレットが、野生型ＢＶ ＥＰＯ又はＳ１２６Ｃ又は＊１６７ＣプロテインによるＳ８５Ｃの汚染ではなく、Ｎ８３（又は別のアミノ酸）での部分的なグリコシル化によるものであることを示唆している。いくつかの変異タンパク質、例えば、Ｓ１２６Ｃ、＊１６７Ｃは、変異タンパク質に応じて、４５乃至５５ｋＤａの見かけ分子量で移動する少量の第二のタンパク質を有する。これは、ジスルフィド結合したｒＥＰＯ二量体に関して予測される分子量である。これらのバンドはウエスタンブロットにおいて抗ＦＬＡＧ抗体と反応し、ＳＤＳゲルが還元条件下で実行される時には存在しない。これらのデータは、４５乃至５５ｋＤａがジスルフィド結合したｒＥＰＯ−Ｃｙｓ二量体を表すことを示している。
Ｃ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の生物活性
精製されたｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質の生物活性は、実施例１６で説明したＵＴ７／ｅｐｏ細胞増殖検定によって測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード検定を使用して決定した。サンプルの数が多いため、変異タンパク質は２種類のグループに区分し、変異タンパク質Ｔ２６Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ８３Ｃ、及びＳ１２６Ｃが一つのグループに含まれ、変異タンパク質Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、Ｓ８５Ｃ、及び＊１６７Ｃが第二のグループに含まれるようにした。１グループ内の変異タンパク質は同日に分析した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯ及びＣＨＯ ｒＥＰＯは、検定における日による変化を制御するために同じ日に並行して分析した。すべての変異タンパク質はＵＴ７／ｅｐｏ細胞の増殖をシミュレートしており、野生型ｒＥＰＯ制御タンパク質の３倍以内のＥＣ５０を有する。Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｎ８３Ｃ、Ｓ１２５ｃ、及び＊１６７Ｃ変異タンパク質の平均ＥＣ５０は、野生型ＢＶ ｒＥＰＯ及びＣＨＯ ｒＥＰＯの平均ＥＣ５０と同様で、平均０．３乃至０．８ｎｇ／ｍｌであった（表２）。Ｎ３８Ｃ及びＴ４０Ｃタンパク質の平均ＥＣ５０は、約１ｎｇ／ｍｌであった（表２）。
Ｂｉｌｌら（１９９５）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、ＥＰＯシステイン変異タンパク質、Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、及びＮ８３Ｃの発現を報告している。我々の結果とは対照的に、彼らは、これらのシステイン変異タンパク質の生物活性が、野生型ＥＰＯと比較して、大幅に減少すると報告している。Ｎ３８Ｃ変異タンパク質の生物活性は、野生型ＥＰＯの生物活性の２０％未満に減少し、Ｎ２４Ｃ及びＮ８３Ｃ変異タンパク質の生物活性は、野生型ＥＰＯの生物活性の５％未満に減少した。ＥＣ５０は報告されていない。Ｂｉｌｌら（１９９５）は、システイン変異タンパク質の活性減少は、タンパク質に導入された余分なシステイン残基から生じたジスルフィド架橋の不正確な形成による不適当なフォールディングが原因であると仮定した。彼らは、システイン変異タンパク質を精製するために使用する溶液に、システイン又はシステインブロック剤を使用していない。
Ｂｉｌｌら（１９９５）の結果に基づくと、我々の精製Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、及びＮ８３Ｃ変異タンパク質が、野生型ＥＰＯと等しい、又は３倍以内の生物活性を有するのは驚くべきことである。このデータは、ＥＰＯシステイン変異タンパク質の発現及び精製に関する我々の方法により、Ｂｉｌｌら（１９９５）が利用した方法に比べて、優れたインビトロ生物活性を有するタンパク質が生じたことを示している。
Figure 0005517844
ＥＰＯシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化
Ａ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の小規模ＰＥＧ化
いくつかのシステイン変異タンパク質及び野生型ＥＰＯを、還元剤ＴＣＥＰでの処理の後、５ｋＤＡシステイン反応ＰＥＧによるＰＥＧ化の能力について試験した。タンパク質の過剰還元を回避しながら、ＰＥＧ化に適切なＴＣＥＰ及びＰＥＧ試薬濃度を特定するために、Ｔ２６Ｃ変異タンパク質による滴定研究を実行した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯを対照として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の部分還元を観察した。ビニルスルホン又はマレイミド５ｋＤａ ＰＥＧ（フルカ）のいずれかが１０乃至４０倍超過モル濃度で存在する、増加するＴＣＥＰ（０．５Ｍ乃至６．０Ｍ超過）濃度を試験した。反応は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯは、単ＰＥＧ化ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質（ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質に結合した単一のＰＥＧ分子）を大量に発生させるが、野生型ＢＶ ｒＥＰＯのＰＥＧ化を発生させない部分的還元条件を特定するために、対照として、並行して処理した。５倍超過モル濃度のＴＣＥＰと３０倍超過モル濃度の５ｋＤａビニルスルホンＰＥＧとにより、野生型ＢＶ ｒＥＰＯのＰＥＧ化なしに、大量の単ＰＥＧ化Ｔ２６Ｃタンパク質が発生した。
Ｔ２６Ｃ変異タンパク質での発見に基づき、他のいくつかのシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化に以下の条件を使用した。精製したＢＶ ｒＥＰＯ及びＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質のアリコート（１乃至２μｇ）を、５倍超過モル濃度のＴＣＥＰと３０倍超過モル濃度の５ｋＤａビニルスルホンＰＥＧにより、ｐＨ８．０で、１時間室温で培養した。反応は、ＳＤＳサンプル緩衝剤（還元剤なし）で希釈することで停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。４つのシステイン変異タンパク質（Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｓ１２６Ｃ、及び＊１６７Ｃ）が、この条件下で容易に単ＰＥＧ化されたが、これは約３５ｋＤａで移動する新しいタンパク質バンドの出現により明らかとなった。３５ｋＤａ種は単ＰＥＧ化ＥＰＯに関して予測されるサイズであり、約４０ｋＤａの分子量を有することが予測される二重ＰＥＧ化種は、この反応条件下では、いずれのＥＰＯ−ｃｙｓ変異タンパク質についても検出されなかった。コントロール実験によると、ＰＥＧ化のためにシステイン変異タンパク質をＴＣＥＰにより還元する必要があることが示された。野生型ＢＶ ＥＰＯは、同一の部分還元条件下ではＰＥＧ化しなかった。これらのデータは、ＰＥＧ分子が、Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｓ１２６Ｃ、及び＊１６７Ｃｙｓ変異タンパク質に導入された自由システインに取り付けられることを示している。
Ｂ．生物活性測定のためのＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃの調製
ＰＥＧ化タンパク質を生物活性測定のために精製できるように、大量のＴ２６Ｃ及びＳ１２６Ｃタンパク質をＰＥＧ化した。ＰＥＧ化反応は、それぞれのタンパク質７５μｇと、規模の小さな１μｇ反応において使用するのと同じモル分子比率のＴＣＥＰ及び５ｋＤａ−ＰＥＧを含むように規模を大きくした。１時間後、ＰＥＧ化混合物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール（緩衝剤Ａ）により１０倍に希釈し、直ちに緩衝剤Ａにおいて平衡化した１ｍｌ Ｑ−セファロースカラムにロードした。カラムは平衡緩衝剤により洗浄し、結合したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール内の０乃至１５０ｍＭ ＮａＣｌの直線１０体積増加塩勾配により溶出した。ＰＥＧ部分の存在により、樹脂に関するタンパク質のアフィニティが減少し、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することが可能になった。単ＰＥＧ化タンパク質を含む画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクマシーブルー染色により特定した。ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃを含むが、可視非誘導化体タンパク質を含まない画分を、−８０℃で冷凍保存し、その後、バイオアッセイに使用した。精製ＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃを入手するために同様の手順を使用した。バイオアッセイで使用するＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ調製の純度を評価するために、ウエスタンブロットを実施した。ウエスタンブロットは、実施例１６で説明したように実施した。ウエスタンブロットにより、ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃに関して予測されるサイズで強いシグナルが生じたが、非ＰＥＧ化Ｓ１２６Ｃ及びＴ２６Ｃタンパク質に関して予測される位置で移動するタンパク質は検出されなかった。これらの結果から、精製ＰＥＧ化変異タンパク質の中には非ＰＥＧ化タンパク質がほとんど存在していない（＜５％）と結論した。
Ｃ．ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃシステイン変異タンパク質の生物活性
精製ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃタンパク質の生物活性を、実施例１６で説明したＵＴ７／ｅｐｏ細胞増殖検定で測定した。ＰＥＧ−ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質のタンパク質濃度は、製造業者が推奨する指示にしたがって、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用して定量化した。非ＰＥＧ化変異タンパク質及び野生型ＢＶ ｒＥＰＯのタンパク質濃度も、ＥＬＩＳＡによって定量化した。ＥＬＩＳＡ検定は、同日に、すべてのタンパク質に関して実施した。タンパク質サンプルの連続３倍希釈液を準備し、バイオアッセイにおいて分析した。それぞれの連続希釈液の未使用材料は−８０℃で冷凍保存し、その後、ＥＬＩＳＡで分析し、開始材料の正確なタンパク質濃度を判断した。それぞれのタンパク質サンプルのいくつかの連続希釈液を分析し、少なくとも１種類の試験サンプルでのタンパク質濃度が、標準ＥＬＩＳＡ曲線の直線範囲、つまり０．００２５乃至０．２ユニット／ｍｌ又は約０．０２乃至１．６ｎｇ／ｍｌに入るようにした。それぞれのサンプルで、少なくとも２種類の連続希釈が、この直線範囲に入った。
ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ変異タンパク質の生物活性は、非修飾Ｔ２６Ｃ及びＳ１２６Ｃタンパク質及び野生型ＢＶ ｒＥＰＯのものと同様だった。ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ変異タンパク質の平均ＥＣ５０は、非ＰＥＧ化Ｔ２６Ｃ及びＳ１２６Ｃ変異タンパク質と野生型ＢＶ ｒＥＰＯとに関して決定した平均ＥＣ５０値と同様で、０．４８乃至０．８２ｎｇ／ｍｌの範囲だった（表３）。生物活性のあるＰＥＧ化ＥＰＯタンパク質は、これまでに記述されていない。
Figure 0005517844
哺乳類細胞でのＥＰＯシステイン変異細胞の発現及び精製
ＥＰＯシステイン変異細胞は、哺乳類細胞でも発現させ、条件培地から精製することができる。ＥＰＯシステイン変異細胞は、哺乳類細胞の一時的トランスフェクション、又はＥＰＯシステイン変異細胞を発現する安定に形質転換した哺乳類細胞系を構築することで、発現させることができる。ヒトの治療の用途では、ＥＰＯシステイン変異細胞は、リンカー及びＦＬＡＧ配列なしに発現するのが好ましい。サルＣＯＳ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能）は、当業者に広く知られる手順を使用する一時的トランスフェクション用に使用可能である。多くの民間の供給源、例えばＧＩＢＣＯ／ＢＲＬは、脂質トランスフェクション試薬を販売し、一時的トランスフェクションによってＥＰＯシステイン変異タンパク質を発現するのに使用できる詳細なプロトコルを提供している。野生型ＥＰＯは、タンパク質を発現する安定転換チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して、ヒトでの使用のために製造されている。安定トランスフェクションＣＨＯ細胞系は、組換えタンパク質の高レベル発現のために広く使用されている（Ｇｅｉｓｓｅら、１９９６；Ｔｒｉｌｌら、１９９５）。ＣＨＯ細胞では、遺伝子増幅によって、染色体が統合された異種遺伝子の高レベル発現が達成できる。通常、問題となる遺伝子は、増幅を選択可能な標識遺伝子にリンクされる。増幅の選択を提供する様々な遺伝子の記述（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）があるが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）が頻繁に利用される。この遺伝子の増幅は葉酸類似メトトレキサート（ＭＴＸ）に抵抗力を与え、抵抗力のレベルは、ｄｈｆｒ遺伝子のコピー数によって増加する（Ａｌｔら、１９７８）。ＭＴＸ選択の有用性は、ｄｈｆｒが欠如したＣＨＯ細胞系の可用性によって向上する（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、１９８０）。
当業者は、マウスｄｈｆｒ遺伝子を市販のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロジェン）に組み込んだＥＰＯシステイン変異細胞用の発現ベクターを構築可能であり、これはＧ４１８に抵抗力を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子を含む。マウスｄｈｆｒ発現ベクターｐｄｈｆｒ２．９は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手する（カタログ番号３７１６５）。このｄｈｆｒ遺伝子はｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系において選択可能であり、ＭＴＸ抵抗力に関する標準の選択によって増幅できる（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３）。ｄｈｆｒコーディング配列は、約９００ｂｐのＢｇｌ ＩＩ断片としてｐｄｈｆｒ２．５から切除し、発現ベクターｐＲＥＰ４（インビトロジェン）のポリリンカーの固有ＢａｍＨＩ部位でクローニングできる。この構成では、遺伝子が、ＣＨＯ細胞において機能することが知られている（Ｔｒｉｌｌら、１９９５）強力なＲＳＶプロモータの下流、及びＳＶ４０から誘導されるポリアデニル化部位の上流に配置される。このｄｈｆｒ発現カセットは、その後、ＳａｌＩ断片としてｐＲＥＰ４から切除することが可能であり、これはＳａｌＩ部位がプロモータとポリＡ追加部位の側面近くに存在するためである。オリゴヌクレオチドリンカを使用して、このＳａｌＩ断片を、ｐＣＤＮＡ３．１の固有ＢｇｌＩＩ部位においてクローニングできる。
ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞における発現では、ＥＰＯシステイン変異タンパク質ｃＤＮＡは、ＰＣＲに基づく変異誘発によって修飾できる。５’終点において、哺乳類細胞での翻訳を促進させるために、翻訳開始ＡＴＧコドンの前にコザックのコンセンサス配列を追加できる。３’終点において、リンカー及びＦＬＡＧ配列を削除することが可能で、自然コード配列及び翻訳終了信号が修復される。これらの修飾ＥＰＯ ｃＤＮＡは、その後、一時的トランスフェクション実験のために、ｐＣＤＮＡ３．１のポリリンカーで、Ｂａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片としてクローニング可能であり、或いは哺乳類細胞での安定発現のために、ｐＣＤＮＡ３．１：：ｄｈｆｒベクターのポリリンカーでクローニングできる。哺乳類細胞の発現に関して、システイン変異タンパク質をコードする変異ＥＰＯ遺伝子は、哺乳類細胞での翻訳を促進するために、５’終点にて修飾し、翻訳開始ＡＴＧコドンの直前のコザックのコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）に組み込む。３’終点では、リンカー及びＦＬＡＧ配列が削除され、自然コード配列及び翻訳終了信号が修復される。これらの修飾は、当業者に広く知られているさまざまな変異誘発手法によって達成できる。実施例４及び１７で説明したものに基づくＰＣＲに基づく変異誘発手順を利用可能である。ＰＣＲプライマーＢＢ３０２（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴ＞３）（配列番号４７）及びＢＢ３０３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ＞３）（配列番号４８）を鋳型として、ｐＵＣ１９又はｐＢｌｕｅＢａｃ４．５でクローニングされる変異ＥＰＯ遺伝子のＰＣＲに使用できる。順方向プライマーＢＢ３０２は、ＥＰＯ分泌信号の最初の７個のアミノ酸をコードするＥＰＯ遺伝子配列をアニーリングし、翻訳開始ＡＴＧコドンの直前にコザックのコンセンサス配列ＧＣＣＡＣＣを追加し、クローニングの目的でＢａｍ ＨＩ部位を含める。逆方向プライマーＢＢ３０３は、ＥＰＯコーディング配列のカルボキシ終端の７個のアミノ酸をコードする配列をアニールし、ＥＰＯコーディング配列の後にＴＧＡ翻訳停止コドンを追加し、クローニングの目的でＥｃｏＲＩ部位を含める。これらのプライマーと、これら２種類のプライマー間での変異を有する任意の変異ＥＰＯ遺伝子鋳型、例えば成熟したＥＰＯコーディング配列のアミノ酸１乃至１５９でのアミノ酸置換等を使用した個々のＰＣＲ反応の生成物は、精製可能なＰＣＲ産物を生成し、これはＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン）等の哺乳類細胞での発現に適したベクターでクローニングされる。ＰＣＲプライマー３０２及び３０３もＥＰＯシステイン変異タンパク質の修飾に使用可能で、この場合は、成熟ＥＰＯコーディング配列の最初のアミノ酸Ａｌより前にシステイン残基が追加されるが、ＥＰＯシグナル配列より後ろには追加されない。カルボキシル終端の７個のアミノ酸をコードするＥＰＯ配列の変異、又は実施例１７で説明した＊１６７Ｃ変異では、ＢＢ３０３の位置で代替の逆方向プライマーを使用する必要がある。これらのプライマーは、変異システインコドンと、鋳型ターゲットと正確に一致するオリゴの３’終点での少なくとも２１のヌクレオチドと、クローニングを目的とするＥｃｏ ＲＩ部位とを含むように個別に設計される。例えば、逆方向プライマーＢＢ３０４（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴ ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧ ＣＡＧＣＣ＞３）（配列番号４９）及びＢＢ３０２を、哺乳類細胞発現系での発現に適した＊１６７Ｃ変異タンパク質をコードする修飾変異ＥＰＯ遺伝子を生成する鋳型として、ｐＵＣ１９又はｐＢｌｕｅＢａｃ４．５でクローニングされるＥＰＯ＊１６７Ｃ遺伝子と共に、ＰＣＲ反応において使用できる。
ＣＯＳ又はｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞のトランスフェクションには、内毒素のないプラスミドＤＮＡが好適である。ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系は、コロンビア大学のＤｒ．Ｌ．Ｃｈａｓｉｎ（ＣＨＯ ＫＩ ＤＵＫＸ ＢＩＩ）等の多数のソース、又は（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＨＯ ｄｕｋ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６）から入手できる。この細胞は、１０％ＦＢＳ、グルタミン、グリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを補ったＦ１２／ＤＭＥＭ培地で培養できる（Ｌｕｃａｓら、１９９６）。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ギブコＢＲＬ）等の当業者に広く知られるトランスフェクション試薬の使用により、ベンダプロトコル及び又は文献で説明されているものを使用して実施できる（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）。７％透析ＦＣＳを補うと共にグルタミン、グリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンが欠如させたＦ１２／ＤＭＥＭにおけるｄｈｆｒ＋のトランスフェクタントを選択できる（Ｌｕｃａｓら、１９９６）。或いは、Ｇ４１８抵抗（ｐＣＤＮＡ３．１のＮＰＴ遺伝子によりコードされる）を選択し、その後、ｄｈｆｒ＋表現型のトランスフェクタントを選別することができる。ｄｈｆｒ＋クローンは、選択培地で拡張し、市販のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズから入手可能）を使用して、又は抗ＥＰＯ抗血清（Ｒ＆Ｄシステムズから入手可能）を使用したウエスタンブロットによって、ＥＰＯシステイン変異タンパク質生成のためにスクリーニングした上清を培養できる。ＥＰＯシステイン変異タンパク質を発現するクローンは、その後プールし、Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０）が説明するように、増加させた薬品濃度におけるＭＴＸ抵抗に関して、複数回の選択を行うことができる。各回のＭＴＸ選択後、ＥＰＯシステイン変異タンパク質生成に関して、個々のクローンをテストできる。これらの手順は文献に詳しく説明されており、ＣＨＯ細胞における様々な異種タンパク質の発現に使用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０において検討されている）。
好ましくは、ＥＰＯシステイン変異タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の成長には使用する培地は、システイン又は他のシステインブロック剤を含むべきである。ＥＰＯシステイン変異タンパク質は、Ｉｍａｉら（１９９０）が説明したものと同様のプロトコルを使用して、ＣＨＯ細胞の条件培地から精製できる。遠心分離によってＣＨＯ細胞を除去した後、当業者に広く知られる手法を使用して、カラムクロマトグラフィーによって上清からＥＰＯシステイン変異タンパク質を精製できる。ＥＰＯシステイン変異タンパク質の精製に利用できるカラムクロマトグラフィーステップには、ブルーセファロース、ヒドロキシアパタイト、逆相、疎水的相互作用、分子ふるい分け、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
ＩＦＮ−α２のクローニング、発現、及び精製
Ａ．ＩＦＮ−α２をコードするＤＮＡ配列のクローニング
少なくとも２５の異なるＩＦＮ−α遺伝子が、７０％以上のアミノ酸相同性を共有するタンパク質をコードしている（Ｂｌａｔｔら、１９９６）。ＩＦＮ−α種の間のＤＮＡ配列の相同性が高いため、ＩＦＮ−α２遺伝子を２つのステップでクローニングした。第一に、ＩＦＮ−α２遺伝子は、ＩＦＮ−α２遺伝子の上流及び下流にある固有の配列に対応するプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物は、ＩＦＮ−α２遺伝子をコードしていることを確認するためにクローニング及び配列決定した。その後、ＩＦＮ−α２コーディング配列を、ＰＣＲによって修飾し、Ｅ．ｃｏｌｉ及び部位特異的突然変異誘発における発現に関してサブクローニングした。ＩＦＮ−α２をコードするＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応は、ＢＢ９３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＡ ＴＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＧ＞３）（配列番号５０）及びＢＢ９４（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴ＞３）（配列番号５１）によって実施した。ＢＢ９３は、ＩＦＮ−α２コーディング配列の約３００ｂｐ上流（つまり５’）のゲノム配列をアニールし、クローニングの目的でＥｃｏ ＲＩ部位を含む。ＢＢ９４は、ＩＦＮ−α２コーディング配列の約１００ｂｐ下流（つまり３’）のゲノム配列をアニールし、クローニングの目的でＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。結果として生じた約１ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化してからアルカリホスファターゼ化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン）でクローニングした。ＩＦＮ−α２に関して正しいＤＮＡ配列を有するクローン（Ｈｅｎｃｏら、１９８５）は、特定及び指定されたｐＢＢＴ１６０だった。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞質発現に関して、ｐＢＢＴ１６０のクローニングＩＦＮ−α２遺伝子は、ＰＣＲによって修飾され、ＩＦＮ−α２タンパク質の第一の残基（Ｃ１）の直前のメチオニンコドンに組み込まれた。ＴＡＡ停止コドンはカルボキシ終端残基、Ｅ１６５の後に追加された。同時に、その後の変異誘発に便利な制限部位を提供するために、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ部位が追加され、ＢｇｌＩＩが除去された。この反応において、ｐＢＢＴ１６０が鋳型として使用され、プライマーＢＢ９９（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＴＣ＞３）（配列番号５２）及びＢＢ１００（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴ＞３）によって増幅された。ＢＢ９９は、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列の５’終点をアニールし、成熟ＩＦＮ−α２の第一のアミノ酸の前の開始メチオニンをコードする。ＢＢ９９は、開始ＡＴＧの約３０ｂｐ下流のＸｂａ部位を導入するが、タンパク質のアミノ酸配列は変化しない。ＡＴＧと重複するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位及びＮｄｅ Ｉ部位は、クローニングの目的で含めた。逆プライマー、ＢＢ１００は、コーディング配列の３’終点をアニールし、ＴＡＡ停止コドンを追加する。ＢＢ１００は、ＴＡＡコドンの約３０ｂｐ上流のＳａｌ Ｉ部位を導入し、更に約１５ｂｐ上流の天然Ｂｇｌ ＩＩ部位を排除する。その結果、開始ＡＴＧの約１８５ｂｐ下流に位置する天然Ｂｇｌ ＩＩ部位は、固有の部位となる。これらすべての変更によって、アミノ酸配列は変化しない。Ｅｃｏ ＲＩ部位は、クローニングの目的で、停止コドンのすぐ下流に追加された。約５２０ｂｐのＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏ ＲＩにより消化され、ゲル精製され、同様に消化されるプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）でクローニングされた。一つのクローンは、正しいＤＮＡ配列を持つと判断された。このプラスミドは指定ｐＢＢＴ１６４だった。Ｅ．ｃｏｌｉでの細胞質発現に関して。ｐＢＢＴ１６４の約５２０ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片が、同様に消化される発現ベクター、ｐＣＹＢ１（ニューイングランドバイオラブス）でクローニングされた。プラスミドベクターｐＣＹＢ１により、遺伝子を非融合タンパク質又は融合タンパク質として発現することが可能になり、この構成は、タンパク質が非融合タンパク質として発現するように作成された。結果として生じたプラスミドはｐＢＢＴ１７０と呼ばれ、ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２をコードする。ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２を含むｐＢＢＴ１６４のＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片も、Ｎｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩに消化されるｐＵＣ１８もサブクローニングされ、プラスミドｐＢＢＴ１６８が生成された
ＩＦＮ−α２は、ペリプラズム空間への分泌によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、活性形態で発現できる（Ｖｏｓｓら、１９９４）。分泌されたＩＦＮ−α２は、Ｎ末端メチオニンが欠如しており、天然ＩＦＮ−α２と同一のアミノ酸配列を有していた。ＩＦＮ−α２の分泌形態を発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉ熱安定エンテロトキシン（ＳＴＩＩ）遺伝子のリーダー配列（Ｐｉｃｋｅｎら、１９８３）を、ＰＣＲによって、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列に融合した。その長さのため、ＳＴＩＩ配列は、２つの連続するＰＣＲ反応で追加した。第一の反応では順方向プライマーＢＢ１０１（５＞ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＧＡＴＣＴ ＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣ ＡＧＣ＞３）（配列番号５４）と逆方向プライマーＢＢ１００とをｐＢＢＴ１６４（上述）と共に鋳型として使用した。ＢＢ１０１の３’終点（２１ｂｐ）は、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列の５’終点をアニールする。ＢＢ１０１の５’セグメント（３９ヌクレオチド）は、ＳＴＩＩリーダペプチドの部分をコードする。この反応の約５５０ｂｐのＰＣＲ産物は、ゲル精製され、第二のＰＣＲ反応の鋳型として使用された。第二のＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１００と前方向プライマーＢＢ１１（５’−ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧ ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴ ＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣ ＴＡＴＣＧ−３’）（配列番号７）を使用した。ＢＢ１１は残りのＳＴＩＩリーダペプチドを追加し、ＳＴＩＩリーダーの開始ＡＴＧと重複するＮｄｅ Ｉ部位を含む。この反応の約５９０ｂｐの産物を、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉによって消化した。ＳＴＩＩリーダー配列とＩＦＮ−α２のアミノ末端の約３０ｂｐとを含む約１００ｂｐのＮｄｅＩ−Ｘｂａ Ｉ断片は、ゲル精製、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉによって消化されたｐＢＢＴ１６８［ｐＵＣ１８：：ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２］によりライゲートし、アルカリホスファターゼにより処理し、ゲル精製した。このステップにおいて、ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２遺伝子の約３０ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｘｂａ Ｉアミノ終端セグメントは、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２ ＰＣＲ産物のＰＣＲによって誘導された約１００ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｘｂａ Ｉアミノ終端セグメントによって置換される。結果として生じたｐＵＣ１８：：ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２構成の配列は、確認され、そのプラスミドは指定ｐＢＢＴ１７７だった。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関して、ｐＢＢＴ１７７は、Ｎｄｅ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩによって消化され、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子を含む約５７０ｂｐの断片はゲル精製され、ｉａｃプロモータの管理下において発現ベクターｐＣＹＢ１でクローニングされた。結果として生じたプラスミドは指定ｐＢＢＴ１７８だった。
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒＩＦＮ−α２の発現
ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２をコードするｐＢＢＴ１７０と、親ベクターのｐＣＹＢ１とは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に転換された。これらの細胞株による実験では、ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２の発現が生じた。分泌されたＩＦＮ−α２は天然ＩＦＮ−α２と同じアミノ酸配列を有するため、分泌されたＩＦＮ−α２は細胞質ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２に好適である。
分泌されたｒＩＦＮ−α２の発現に関して、ｐＢＢＴ１７８［ｐＣＹＢ１：：ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２］及び親ベクターのｐＣＹＢ１はＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に転換された。結果として生じた細胞株は、指定ＢＯＢ２０２：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１７８）及びＢＯＢ１３０：Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）だった。我々は、５．０乃至７．０の範囲の初期ｐＨにおいて、リン酸及びＭＥＳ緩衝ＬＢ培地でのＢＯＢ２０２の成長及びｒ−ＩＦＮ−α２発現を試験する一連の実験を実施した。一晩経過した飽和培地を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む緩衝ＬＢにおいて、Ａ６００で０．００２５Ｏ．Ｄ．まで希釈し、振動フラスコ内において３７℃で培養した。培養Ｏ．Ｄ．が０．３乃至０．５まで達した時、ＩＰＴＧを追加して最終濃度を０．５ｍＭとし、ｒＩＦＮ−α２の発現を誘導した。最初の実験では、誘導後０、１、３、５、及び約１６時間後に培養物をサンプルとした。誘導及び非誘導培養物のサンプルは、クマシーブルーで染色したプレキャスト１４％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。予測されたＩＦＮ−α２の約１９ｋＤａの処理形態に加え、予測よりも高い分子量（約２１．５ｋＤａ）形態のタンパク質が観察された。高い分子量形態は、ＳＴＩＩリーダペプチドのタンパク質分解処理の欠如から生じる可能性があり、リーダペプチドの分子量はこの仮説と一致する。我々の結果は、低いｐＨが正しいサイズのｒＩＦＮ−α２バンドの蓄積を促進することを示している。ｐＨ６．５以上では２１．５ｋＤａ形態が支配的で、ｐＨ６．０以下では、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｒＩＦＮ−α２標準（エンドゲン社（Ｅｎｄｏｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．））と共に移動する約１９ｋＤａのバンドが、タンパク質の支配的な形態となることが観察された。ｐＨ６．０以下では、１９ｋＤａバンドが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によって発現するＩＦＮ−α２の少なくとも８０％、おそらくは９０％以上を占める。この発見に基づき、更なる発現実験では、１００ｍＭ ＭＥＳによって緩衝処理し、ｐＨを５．５にしたＬＢ培地を使用した。Ｖｏｓｓら（１９９４）も、ＳＴＩＩリーダー配列を使用したＥ．ｃｏｌｉペリプラズムへのＩＦＮ−α２の分泌を報告している。彼らは更に、培養ｐＨを７．０ではなく６．７に維持した時、２１．５ｋＤａバンドに存在するｒＩＦＮ−α２の割合が減少し、１９ｋＤａで移動する割合が増加したことを観察している。ｐＨ７．０では、Ｖｏｓｓら（１９９４）は、ＳＴＩＩ：ＩＦＮ−α２融合タンパク質の１０乃至３０％が処理され、１９ｋＤａ成熟ＩＦＮ−α２タンパク質が発生したと報告している。正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２タンパク質のパーセンテージは、ｐＨ６．７でＥ．ｃｏｌｉを成長させることで５０乃至６０％増加する可能性がある。しかしながら、このｐＨでも、大量（４０乃至５０％）のＳＴＩＩ：ＩＦＮ−α２融合タンパク質が未処理のまま残り、正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２の生成量が減少する。Ｖｏｓｓら（１９９４）は、１９ｋＤａで移動する分泌ｒＩＦＮ−α２の量を最大にするには、ｐＨ６．７が最適であると提案している。Ｖｏｓｓら（１９９４）は、いくつかの成長パラメータを変化させ、正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２タンパク質のパーセンテージを高め、５０乃至６０％より大きくすることを試みたが、成功しなかった。我々のデータは、ｐＨを６．５未満、好ましくは５．５乃至６．０に低下させることで、非分割（２１．５ｋＤａ）ｒＩＦＮ−α２生成物に対する分割（１９ｋＤａ）されたものの比率が最大になることを示している。こうした低いｐＨでは、正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２のパーセントは、細胞によって合成されたＩＦＮ−α２全体の少なくとも８０％、おそらくは９０乃至１００％までに増加する。
ｒＩＦＮ−α２を発現した培養物には、Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｅｔｓｔｅｉｎ（１９８０）の手順に基づいて、浸透圧衝撃を加えた。この手順により、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜が破裂し、ペリプラズムの内容物が周囲の培地に放出される。その後の遠心分離により、細胞質からの可溶性ペリプラズム構成要素（上清内で回収）、不溶性ペリプラズム構成要素、及び細胞に関連する構成要素（ペレット内で回収）が分離される。ＢＯＢ２０２によって合成された１９ｋＤａ ｒＩＦＮ−α２の約２５乃至５０％が上清内で回収された。２１．５ｋＤａのｒＩＦＮ−α２は、可溶性ペリプラズム断片では観察されなかった。
Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒＩＦＮ−α２の大規模な発現及び精製
野生型ｒＩＦＮ−α２タンパク質を精製するために、ＢＯＢ２０２の一晩経過した新しい飽和培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ １００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）内で、０．０２ＯＤ＠Ａ６００で接種した。通常は、３２５ｍｌの培養物を、１６０乃至２００ｒｐｍの旋回水槽内で、３７℃の２リットル振動フラスコによって成長させた。培養物が０．３乃至０．４ＯＤの濃度に達した時、ＩＰＴＧを追加し、最終濃度を０．５ｍＭとした。誘導した培養物を、その後約１６時間培養した。培養物には、Ｈｓｕｉｎｇら（１９８６）の手順に基づいて、浸透圧衝撃を加えた。この細胞を遠心分離によってペレット化し、氷温の２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）において、−２５ＯＤ／ｍｌで再懸濁した。再懸濁した細胞は氷の上で１５分間培養し、９５００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、ペレットを氷温の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、氷の上で１５分間培養し、９５００×ｇで１０分間遠心分離した。結果として生じた上清（浸透圧衝撃溶解物）を、直ちに処理するか、或いは−６０℃で保存した。
ｒＩＮＦ−α２は以下のように精製した。浸透圧衝撃の上清のｐＨは３に調整し、沈殿物をすべて除去するために遠心分離を行い、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０（緩衝剤Ａ）により平衡化した５ｍｌ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐ Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。結合タンパク質は、０乃至１００％の緩衝剤Ｂでの直線塩勾配（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、１０％エチレングリコール）により溶出させた。カラム断片は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｒＩＮＦ−α２は約２２５乃至２３５ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。ｒＩＮＦ−α２の濃度が高くなった断片をプールし、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０において先に平衡化した１ｍＬ Ｃｕ＋＋ ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティクロマトグラフィー）Ｈｉ Ｔｒａｐカラムで更に断片化した。ｒＩＮＦ−α２は、４０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０における５．５乃至４．１の逆ｐＨ勾配により溶出させた。ｒＩＮＦ−α２は、勾配が１００％緩衝剤Ｂに達した後、溶出液のｐＨが最終的にｐＨ４．１に達した時に溶出した。精製され、適切に畳まれたｒＩＮＦ−α２を含むＣｕ＋＋ＩＭＡＣカラムからの断片をプールし、冷凍したアリコートを−８０℃で保存した。初期の溶出断片の一部では、少量のｒＩＮＦ−α２バリアントが検出できた。このバリアントは、不完全なジスルフィド形成の結果で、生物活性があり、以前に記述されている（Ｋｈａｎ ａｎｄ Ｒａｉ、１９９０）。このバリアントを含む断片は、精製ｒＩＮＦ−α２の最終プールに追加しなかった。ｒＩＮＦ−α２の最終的な生成量は、２８０ｎｍでの吸収度とブラッドフォード分析とによって決定され、２５０ｍｌの培養物で約４００μｇだった。還元ＩＮＦ−α２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した時、非還元ＩＮＦ−α２よりも僅かに大きな見かけ分子量で移動する（ｍｏｒｅｈｅａｄら、１９８４）この見かけ分子量の変化は、ＩＮＦ−α２における自然ジスルフィドの還元によるものである。我々のＩＮＦ−α２は、還元及び非還元条件の両方で、市販のｒＩＮＦ−α２標準と共に移動する。
Ｄ．野生型ｒＩＮＦ−α２のインビトロ生物活性
ＩＮＦ−αの生物活性は、インビトロ抗ウイルス検定又は細胞増殖抑制検定を使用して測定できる。我々は、野生型ｒＩＮＦ−α２の生物活性を測定するための細胞成長抑制検定を開発した。ヒトＤａｕｄｉ Ｂ細胞系（アメリカンタイプカルチャーコレクションは、ＩＮＦ−αの成長抑制特性に対して敏感で、ＩＮＦ−αの生物活性の測定に一般的に利用される（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｅｚら、１９７９；Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ、１９８１）。Ｄａｕｄｉ細胞は、１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補った、ＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。バイオアッセイでは、ＲＰＭＩ１６４０培地によって細胞を３回洗浄し、４×１０５細胞／ｍｌの濃度で、１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。５０μｌ（２×１０４細胞）の細胞懸濁液を、フラットボトム９６ウェル組織培養プレートの試験ウェル毎にアリコートとした。１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０羽位置において、連続する３倍の希釈の試験用タンパク質サンプルを準備した。５０μｌの希釈タンパク質を試験ウェルに追加し、このプレートを３７℃で、加湿５％ＣＯ２組織培養インキュベータにおいて培養した。４日後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガコーポレーション）をそれぞれのウェルに追加し、このプレートを３７℃で、組織培養インキュベータにおいて１乃至４時間培養した。マイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍで吸収度を読み出した。対照ウェルは培地を含むが、細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウェルの平均吸収度の値は、三つ組みの試験ウェルの各組について得られた平均値から減算した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｒＩＦＮ−α２（エンドゲン社）の連続する希釈を並行して分析した。ＩＣ５０（半最大成長抑制に必要なタンパク質濃度）は、それぞれのサンプルについて計算し、タンパク質の生物活性の比較に使用した。
Ｄａｕｄｉ細胞系の増殖は、ｒＩＮＦ−α２によって強く抑制され、これは吸収度の値が投与量に従属して減少することにより明らかとなる。我々が準備した市販のｒＩＦＮ−α２（エンドゲン）及び野生型ｒＩＦＮ−α２は、検定の誤差内で、同じ成長抑制の最大レベルに達し、同じ平均ＩＣ５０値である１３乃至１６ｐｇ／ｍｌ（表４）を有した。これらのタンパク質のＩＣ５０値は、別の日に実施した検定では７乃至２９ｐｇ／ｍｌの範囲だったため（表４）、タンパク質の間の比較は、同じ日に分析したサンプルに関して行った。
ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の構築、発現、精製及び生物活性
Ａ．ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の構築
実施例４に記載のものと類似の部位特異的ＰＣＲ型突然変異導入法を使用して、１７種の変異型ＩＦＮ−α２遺伝子を構築した。本発明者らは、ヘリックスＡより近位のアミノ末端領域の変異タンパク質１種［Ｑ５Ｃ］、Ａ−Ｂループの変異タンパク質６種［Ｎ４５Ｃ、Ｑ４６Ｃ、Ｆ４７Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、及び４３Ｃ４４（残基４３と残基４４の間へのシステインの挿入）］、短い２残基のＢＣループの変異タンパク質１種［Ｄ７７Ｃ］、ＣＤループの変異タンパク質４種［Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＴ１０８Ｃ］、Ｅヘリックスより遠位のカルボキシ末端領域の変異タンパク質３種［Ｓ１６３Ｃ、Ｅ１６５Ｃ及び＊１６６Ｃ（天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加）］を構築した。本発明者らは、天然の非必須のＣ１−Ｃ９８ジスルフィド（Ｌｙｄｏｎら，１９８５；Ｍｏｒｅｈｅａｄら，１９９４）を排除する、変異タンパク質Ｃ１Ｓ及びＣ９８Ｓも構築した。ヘリックスＡより近位のアミノ末端領域におけるＣ１Ｓ置換は、Ｃヘリックスに自由システイン（Ｃ９８）を生成させ、ＣヘリックスにおけるＣ９８Ｓ置換は、ヘリックスＡより近位の領域に自由システイン（Ｃ１）を生成させる。
突然変異導入のため、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の選択された位置へのシステイン残基の取り込みを起こすヌクレオチド変化を取り込ませるためのＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを設計した。可能な場合には、突然変異を導入されたＰＣＲ断片を適切なプラスミドへクローニングするために使用される近傍の制限部位も含まれるよう、突然変異導入オリゴを設計した。突然変異の位置の十分近くに有用な制限部位が位置していない場合には、「オーバーラップ伸長による突然変異導入」の技術を利用した（Ｈｏｒｔｏｎら，１９９３）。突然変異導入ＰＣＲ反応に使用した鋳型は、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子がＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１８へとクローニングされているプラスミドｐＢＢＴ１７７（実施例２０に記載）であった。ＰＣＲ産物を、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、同制限酵素で切断しておいたｐＢＢＴ１７７ベクターＤＮＡとライゲートさせ、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。これらのライゲーションからの形質転換体を増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。目的の突然変異の存在を確認するため、そして、ＰＣＲ反応又は合成オリゴヌクレオチドプライマーにより導入される可能性がある付加的な突然変異が存在しないことを確認するため、クローニングされた、突然変異を導入されたＰＣＲ断片の全体の配列を決定した。
置換変異Ｑ５Ｃは、実施例４に記載されたような「オーバーラップ伸長による突然変異導入」の技術を使用して構築した。Ｑ５Ｃ構築のための第一の、又は「一次」ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２μＭの各プライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、１ｎｇの鋳型プラスミドｐＢＢＴ１７７（実施例２０に記載）、１．５単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社）並びに０．２５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）を含有する１×プロメガＰＣＲ緩衝液中で、５０μｌという反応容量で実施した。反応は、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社）で実施した。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃１分、６０℃１．２５分、７２℃１分］を２５サイクル、その後６℃で維持、であった。使用したプライマー対は、［ＢＢ１２５×ＢＢ１３０］及び［ＢＢ１２６×ＢＢ１２９］であった。ＢＢ１２５（５＞ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＡ＞３）（配列番号５５）は、クローニングされたＩＦＮ−α２配列の約２０ｂｐ上流のｐＵＣ１８ベクター配列とアニールする。ＢＢ１２６（５＞ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ＞３）（配列番号５６）は、クローニングされたＩＦＮ−α２配列の約４０ｂｐ下流のｐＵＣ１８ベクター配列とアニールする。ＢＢ１２９及びＢＢ１３０は、Ｑ５に対応するＣＡＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる、相補的な突然変異導入オリゴヌクレオチドである。ＢＢ１２９の配列は、（５＞ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧ＞３）（配列番号５７）であり、ＢＢ１３０の配列は、（５＞ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡ＞３）（配列番号５８）である。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３０］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約１４０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１２９］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約５６０ｂｐであった。ＰＣＲ産物は、発売元のプロトコルに従いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけ、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２０μｌ中に回収した。次いで、突然変異を導入されたこれら２つの断片を、それに続く、すなわち「２次」ＰＣＲ反応において共に「スプライシング」した。この反応においては、ゲル精製された、一次反応の各ＰＣＲ産物２μｌを鋳型として使用し、ＢＢ１２５及びＢＢ１２６をプライマーとして使用した。反応容量は１００μｌであり、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ及び０．５単位のＰｆｕポリメラーゼを利用した。その他の反応条件は、一次反応において使用した条件と同一であった。２次ＰＣＲの一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、約６７０ｂｐの予想されたバンドを観察した。２次ＰＣＲ反応のバルクをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＮｄｅＩ及びＸｂａＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的の約１００ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用して「精製」した。この断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＢＴ１７７（実施例２０に記載）とライゲートさせ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｑ５Ｃ変異を含有し、かつ約１００ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩセグメント全体に正確な配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｃ１Ｓは、Ｃ１に対応するＴＧＴコドンをセリンに対応するＴＣＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１２８（５＞ＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣ＞３）（配列番号５９）及びＢＢ１２７（５＞ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴ＞３）（配列番号６０）を、それぞれＢＢ１３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用したことを除けば、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを使用して、構築し、配列を確認した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１１２８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約１２０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１２７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約５７０ｂｐであった。
置換変異Ｎ４５Ｃは、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｎ４５に対応するＡＡＣコドンを、システインに対応するＴＧＣコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１３４（５＞ＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣ＞３）（配列番号６１）及びＢＢ１３３（５＞ＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧ＞３）（配列番号６２）を、それぞれＢＢ１３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５５ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐであった。二次ＰＣＲ反応の産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的の約１５５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製した。この断片を、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで切断しておいたｐＢＢＴ１７７とライゲートさせ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｎ４５Ｃ変異を含有し、かつ約１５５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩセグメント全体に正確な配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｆ４７Ｃは、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｆ４７に対応するＴＴＣコドンを、システインに対応するＴＧＣコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１３６（５＞ＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＡ＞３）（配列番号６３）及びＢＢ１３５（５＞ＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡ＞３）（配列番号６４）を、それぞれＢＢ１３４及びＢＢ１３３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３６］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３５］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐであった。
挿入変異４３Ｃ４４は、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。アミノ酸残基４３をコードするコドンとアミノ酸残基４４をコードするコドンとの間に、システインに対応するＴＧＣコドンを挿入する相補的突然変異導入プライマーＢＢ１３２（５＞ＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＡ＞３）（配列番号６５）及びＢＢ１３１（５＞ＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡ＞３）（配列番号６６）を、それぞれＢＢ１３４及びＢＢ１３３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３２］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３１］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４５ｂｐであった。
置換変異Ｑ４６Ｃは、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ４６に対応するＣＡＧコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１５４（５＞ＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣ＞３）（配列番号６７）及びＢＢ１５３（５＞ＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴ＞３）（配列番号６８）を、それぞれＢＢ１３４及びＢＢ１３３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。一次反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。反応プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］を３０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。［ＢＢ１２５×ＢＢ１５４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１５３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐであった。二次ＰＣＲ反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。この反応プログラムは、９６℃５分、［９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分］を２５サイクル、４℃で維持、であった。ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩによる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、ゲル精製はせずに、ライゲーションを行った。
置換変異Ｑ４８Ｃは、既に詳述したＱ４６Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ４８に対応するＣＡＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１５６（５＞ＧＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣ＞３）（配列番号６９）及びＢＢ１５５（５＞ＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＣＣ＞３）（配列番号７０）を、それぞれＢＢ１５４及びＢＢ１５３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１５６］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６５ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１５５］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐであった。
置換変異Ａ５０Ｃは、既に詳述したＱ４６Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ａ５０に対応するＧＣＴコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１５８（５＞ＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧ＞３）（配列番号７１）及びＢＢ１５７（５＞ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴ＞３）（配列番号７２）を、それぞれＢＢ１５４及びＢＢ１５３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１５８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２７０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１５７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐであった。
置換変異Ｄ７７Ｃは、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｄ７７に対応するＧＡＴコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１３８（５＞ＴＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ＞３）（配列番号７３）及びＢＢ１３７（５＞ＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡ＞３）（配列番号７４）を、それぞれＢＢ１３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約３５０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約３４５ｂｐであった。二次ＰＣＲ反応の産物は、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的の約２７５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製した。この断片を、ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩで切断しておいたｐＢＢＴ１７７とライゲートさせ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｄ７７Ｃ変異を含有し、かつ約２７５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩセグメント全体に正確な配列を有するクローンを同定した。
置換変異Ｔ１０６Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｔ１０６に対応するＡＣＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１４０（５＞ＣＡＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣ＞３）（配列番号７５）及びＢＢ１３９（５＞ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＴＣＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号７６）を、それぞれＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１４０］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３９］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂｐであった。
置換変異Ｔ１０８Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｔ１０８に対応するＡＣＴコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１４２（５＞ＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣ＞３）（配列番号７８）及びＢＢ１４１（５＞ＧＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧ＞３）（配列番号７９）を、それぞれＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１４２］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１４１］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５０ｂｐであった。
置換変異Ｑ１０１Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ１０１に対応するＣＡＧコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１６２（５＞ＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＣ＞３）（配列番号８０）及びＢＢ１６１（５＞ＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧ＞３）（配列番号８１）を、それぞれＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。一次反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。反応プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］を３０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。［ＢＢ１２５×ＢＢ１６２］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４２５ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１６１］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２７５ｂｐであった。二次ＰＣＲ反応も、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。この反応プログラムは、９６℃５分、［９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分］を２５サイクル、４℃で維持、であった。ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩによる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、ゲル精製はせずに、ライゲーションを行った。
置換変異Ｅ１０７Ｃは、既に詳述したＱ１０１Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｅ１０７に対応するＧＡＧコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１６４（５＞ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣ＞３）（配列番号８１）及びＢＢ１６３（５＞ＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧ＞３）（配列番号８２）を、それぞれＢＢ１６２及びＢＢ１６１の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１６４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１６３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５５ｂｐであった。
置換変異Ｃ９８Ｓは、既に詳述したＱ１０１Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｃ９８Ｓに対応するＴＧＴコドンを、セリンに対応するＴＣＴコドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１６０（５＞ＣＣＣＣＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣ＞３）（配列番号８３）及びＢＢ１５９（５＞ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧ＞３）（配列番号８４）を、それぞれＢＢ１６２及びＢＢ１６１の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１６０］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４１５ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１５９］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２８５ｂｐであった。
システイン置換変異Ｓ１６３Ｃは、以下のようにして構築した。１６３位のセリンに対応するコドンＡＧＴを、システインをコードするＴＧＴに変化させる、近傍のＥｃｏＲＩ部位を含む突然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１４３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ＞３）（配列番号８５）を設計した。このオリゴを、順向き非突然変異導入プライマーＢＢ１２５と共に、ＰＣＲにおいて使用した。５０μｌのＰＣＲ反応を、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２μＭの各プライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、１ｎｇの鋳型プラスミドｐＢＢＴ１３１、１．５単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））並びに０．２５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を含有する１×プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲ緩衝液中で実施した。反応は、ロボサイクラーグラジエント（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で実施した。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃１分、６０℃１．２５分、７２℃１分］を２５サイクル、その後６℃で維持、であった。ＰＣＲ反応物の一部５μｌを、アガロースゲル電気泳動により分析し、約６１０ｂｐと予想されるサイズの単一断片が生成するのを見出した。反応物の残りは、発売元のプロトコルに従いキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、エタノール沈殿し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２０μｌ中に再懸濁させ、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的の約４２ｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製した。この断片を、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断しておいたｐＢＢＴ１３２とライゲートさせ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｅ１０７Ｃ変異を含有し、かつ約４２ｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩセグメント全体に正確な配列を有するクローンを同定した。
ＩＦＮ−α２コーディング配列のカルボキシ末端アミノ酸の後にシステインを付加する変異も構築した。＊１６７Ｃと名付けられたこの変異型は、前記のＳ１６３Ｃ変異型の構築のためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築した。Ｅ１６５に対応するＧＡＡコドンとＴＡＡ終止コドンとの間に、システインに対応するＴＧＴコドンを付加する、近傍のＥｃｏＲＩ部位を含む突然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１４４（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ＞３）（配列番号８６）を、ＢＢ１４３の代わりにＰＣＲ反応において使用した。
置換変異Ｅ１６５Ｃは、既に詳述したＳ１６３Ｃのためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｅ１６５に対応するＧＡＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる、近傍のＥｃｏＲＩ部位を含む突然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１６５（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴ＞３）（配列番号８７）を、ＢＢ１４３の代わりに、ＰＣＲ反応において使用した。ＰＣＲ反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。反応プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］を３０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩによる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製を使用して精製した。
細胞ペリプラズムへ分泌されるタンパク質としてのＥ．ｃｏｌｉにおける発現のため、１７種の変異タンパク質をコードするＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子を、ｐＵＣ１８を基本としたｐＢＢＴ１７７誘導体から、約５９０ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、野生型ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２を発現させるために使用したｐＣＹＢ１発現ベクターへサブクローニングした。発現実験のため、これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０へ導入した。
本明細書に記載の方法と類似した方法を使用して、ＩＦＮ−α２のその他のシステイン変異タンパク質を構築することが可能である。システイン変異タンパク質は、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の天然アミノ残基をシステインに置換する置換変異、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の２つの天然アミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、又はＩＦＮ−α２コーディング配列の最初のアミノ酸Ｃ１より前にシステイン残基を付加するか、もしくはＩＦＮ−α２コーディング配列の末端アミノ酸残基Ｅ１６５より後にシステインを付加する付加変異でありうる。システイン残基は、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の任意の位置において、任意のアミノ酸と置換されるか、又は任意の２つのアミノ酸の間に挿入されうる。ＩＦＮ−α２中のシステインを置換又は挿入するための好ましい部位は、ヘリックスＡより前の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、Ｄ−Ｅループ、及びヘリックスＥより遠位の領域である。その他の好ましい部位は、Ａヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス及びＥヘリックスの最初又は最後の３つのアミノ酸である。システイン置換を作出するための、これらの領域内の好ましい残基は、Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｑ２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｆ３８、Ｑ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｆ４３、Ｇ４４、Ｋ４９、Ｔ５２、Ｎ６５、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｋ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｓ７３、Ａ７４、Ａ７５、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｑ９１、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｅ９６、Ａ９７、Ｇ１０２、Ｖ１０３、Ｇ１０４、Ｖ１０５、Ｐ１０９、Ｍ１１１、Ｋ１１２、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｓ１１５、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｙ１３５、Ｓ１３６、Ａ１３９、Ｓ１５２、Ｓ１５４、Ｔ１５５、Ｎ１５６、Ｌ１５７、Ｑ１５８、Ｅ１５９、Ｓ１６０、Ｌ１６１、Ｒ１６２及びＫ１６４である。システイン残基は、これらのアミノ酸の直ぐ前又は後にも挿入されうる。システイン残基を付加するためのもう一つの好ましい部位は、本発明者らが＊−１Ｃと呼ぶ、Ｃ１の前であろう。
ＩＦＮ−α２内の天然システイン残基のうちの１つを、他のアミノ酸と置換することにより、自由システインを含有するＩＦＮ−α２変異タンパク質を構築することもできる。その際、置換されたシステイン残基と、通常、ジスルフィド結合を形成している天然システイン残基は、自由となる。非必須のシステイン残基は、他の１９アミノ酸のうちの任意のものと交換されうるが、好ましくは、セリン残基又はアラニン残基と交換される。自由システイン残基は、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら（１９９８）により記載された方法のような方法を使用した、天然アミノ酸の化学的修飾によっても、ＩＦＮ−α２へ導入されうる。
実施例２０〜２２に記載された方法と類似した方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質を発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をＰＥＧ化し、それらの生物活性をインビトロのバイオアッセイにおいて測定することができる。ＩＦＮ−α２変異タンパク質は、実施例１６〜２０に記載された方法と類似の方法、又は当業者に周知の関連した方法を使用して、昆虫又は哺乳動物の細胞のような真核細胞においても発現されうる。
Ｂ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ発現
発現を調査するため、前記の野生型ｒＩＦＮ−α２の場合と同様にして、ｒＩＦＮ−α２変異タンパク質の培養物を増殖させ、誘導した。典型的には、４５ｍｌの培養物を、約１８０〜２００ｒｐｍの旋回振とう（ｇｙｒｏｔｏｒｙ ｓｈａｋｅｒ）水浴中で、３７℃で、２５０ｍｌの振とうフラスコで増殖させた。本発明者らは、振とうフラスコ培養物の激しい曝気が、浸透圧衝撃溶解物の上清中のＩＦＮ−α２タンパク質のレベルを減少させるのを観察した。従って、本発明者らは、曝気にとっては最適ではないが、可溶性ｒＩＦＮ−α２及びｒＩＦＮ−α２変異タンパク質の産生にとっては好ましい条件を通常使用した。誘導された培養物を、約１６時間インキュベートし、採集し、既に詳述した野生型ｒＩＦＮ−α２の場合と同様の浸透圧衝撃にかけた。ただし、浸透圧衝撃法に使用する緩衝液には、５ｍＭという最終濃度でシスチンを添加した。浸透圧衝撃緩衝液へのシスチンの添加は、最初に分析した２つの変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃのためのクロマトグラフィー特性を有意に改善した。シスチンで処理していないインターフェロン変異タンパク質は、一貫して、Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムからブロードのバンドとして溶出し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、予想される単量体分子量の位置、及びその周辺に複数の分子量種を示した。これらの種は、不適切に折り畳まれた、又は不完全に折り畳まれたインターフェロン異型である可能性が最も高い。対照的に、浸透圧衝撃法においてシスチンで処理したインターフェロン変異タンパク質は、シャープなバンドとしてＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムから溶出し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、インターフェロン野生型標準と同じ位置に移動するただ１つのインターフェロン種からなっていた。精製されたインターフェロン変異タンパク質のＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムからの回収も、浸透圧衝撃緩衝液中にシスチンが含まれる場合、１．５倍から２倍、大きかった。これらの結果に基づき、全てのシステイン変異タンパク質を精製するために使用する浸透圧衝撃緩衝液に、５ｍＭシスチンを添加した。
変異タンパク質の浸透圧衝撃上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分が、１９ｋＤａのｒＩＦＮ−α２バンドのレベルが（野生型と比較して）減少していることを示した。２つの変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃは、野生型インターフェロンと等価なレベルで発現し、これらの各変異タンパク質、数百マイクログラムが、以下に詳述するように、容易に精製された。８種の変異タンパク質（Ｃ１Ｓ、４３Ｃ４４、Ｎ４５Ｃ、Ｑ４６Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、Ｄ７７Ｃ及びＴ１０８Ｃ）は、浸透圧衝撃上清中に本質的に検出不可能であった。残りの７種の変異タンパク質（Ｆ４７Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１６５Ｃ、＊１６６Ｃ）は、浸透圧衝撃上清中に、様々な程度に（野生型と比較して）減少したレベルで検出された。これらの変異タンパク質のうちのいくつか（Ｔ１０６Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｅ１０７Ｃ及びＱ１０１Ｃ）は、浸透圧衝撃上清から精製されたが、少量の純粋タンパク質しか回収されなかった。いくつかの変異タンパク質Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及び＊１６６Ｃは、比較的高いレベルで発現したが、主に不溶型で、おそらく細胞ペリプラズムに蓄積していた。これらのタンパク質は、還元条件下で、野生型ｒＩＦＮ−α２標準と同じ位置に移動し、そのことはＳＴＩＩリーダーが除去されていることを示している。変異タンパク質の相対発現レベルの定量的調査を、表４に要約する。
Ｃ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の精製
ｒＩＦＮ−α２変異タンパク質を精製するため、典型的には、２リットルの振とうフラスコ中の３２５ｍｌの培養物、又は２リットルのバッフル（ｂａｆｆｌｅｄ）振とうフラスコ中の５００ｍｌの培養物を、約１７０〜２２０ｒｐｍの旋回振とう水浴（ニューブランスウィックサイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で３７℃で増殖させた。実施例２０に記載のようにして、培養物を増殖させ、誘導し、回収し、浸透圧衝撃にかけた。得られた浸透圧衝撃上清は、直ちに処理するか、又は−８０℃で保存した。
既に詳述したような野生型ｒＩＦＮ−α２の精製と同様にして、浸透圧衝撃上清中の可溶性ＩＦＮ−α２変異タンパク質を、Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）及びＣｕ＋＋ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用して精製した。試験した変異タンパク質全てが、銅カラムと強く結合し、野生型ｒＩＦＮ−α２と同様の条件下で溶出した。この結果は、システイン変異タンパク質のコンフォメーションが、少なくとも金属結合ポケットを含む領域においては、天然型ｒＩＦＮ−α２のコンフォメーションと類似していることを示している。
精製されたシステイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｓ１６３Ｃ及び＊１６６Ｃの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、変異タンパク質が、約１９ｋＤａという予想分子量の位置に移動する単量体として主に回収されることを示した。Ｃ９８Ｓは、天然型Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ−９８ジスルフィド結合が存在しないために、他のｒＩＦＮ−α２変異タンパク質より、わずかに高分子量の位置に移動した。精製された変異タンパク質のいくつかは、少量のジスルフィド結合ｒＩＦＮ−α２二量体を含有していた。二量体種の分子量は、約３７〜３８ｋＤａであった。
Ｄ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の生物活性
精製されたｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃの生物活性を、実施例２０に記載のダウジ（Ｄａｕｄｉ）増殖阻害アッセイにおいて測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイキット又はＢＣＡタンパク質アッセイキット（バイオラドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して決定した。アッセイにおける日間変動をコントロールするため、市販の野生型ｒＩＦＮ−α２及び本発明者らが調製したｒＩＦＮ−α２を、同一日に平行して分析した。変異タンパク質は、アッセイの誤差内で、野生型ｒＩＦＮ−α２対照タンパク質と同程度にダウジ細胞の増殖を阻害した。Ｑ５Ｃ変異タンパク質の平均ＩＣ５０は、１３ｐｇ／ｍｌであり、それは、野生型ｒＩＦＮ−α２タンパク質の平均ＩＣ５０と類似していた。Ｓ１６３Ｃタンパク質の平均ＩＣ５０は、２７ｐｇ／ｍｌであった。これらのデータを表４に要約する。
Figure 0005517844
ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１６３ＣのＰＥＧ化、精製及び生物活性
Ａ．ＩＦＮ−αシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化
タンパク質が自由システイン残基において単ＰＥＧ化されうる条件を同定するため、小規模なＰＥＧ化実験を、精製されたｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質を用いて実施した。タンパク質の未折り畳みの結果としての、予想されるよりも高い見かけの分子量へのシフトを検索するか、又は天然型ジスルフィドの還元の結果として生成した、複数のＰＥＧ化種の出現を検索する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質の過剰還元をモニターした。最初の力価測定実験は、Ｑ５Ｃタンパク質を用いて実施した。精製されたＱ５Ｃ、１μｇを、様々な量の過剰の５ｋＤａマレイミド−ＰＥＧの存在下で、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）中で、増加する濃度のＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン］−ＨＣｌと共に、室温でインキュベートした。６０分後、反応を停止させ、直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。野生型ｒＩＦＮ−α２を修飾することなく、有意な量の単ＰＥＧ化Ｑ５Ｃタンパク質（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると約２８ｋＤａの分子量）を生じるＴＣＥＰ及びＰＥＧ試薬の量を、さらなる実験に使用した。力価測定実験は、１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及び２０倍過剰の５ｋＤａマレイミドＰＥＧが、検出可能なジＰＥＧ化又はトリＰＥＧ化タンパク質を生成させることなく、又は野生型ｒＩＦＮ−α２を修飾することなく、約６０％の単ＰＥＧ化タンパク質を与えることを示した。
これらの条件を使用して、いくつかの他のｒＩＦＮ−α２変異タンパク質もＰＥＧ化した。精製された野生型ｒＩＦＮ−α２及びｒＩＦＮ−α２変異タンパク質（Ｑ５Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｓ１６３Ｃ）１μｇを、室温で、ｐＨ８．５で、１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及び２０倍モル過剰の５ｋＤＡマレイミドＰＥＧと共に１時間インキュベートした。４種の変異タンパク質は、反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと、様々な程度（３０〜６０％と推定される）に単ＰＥＧ化された。野生型ｒＩＦＮ−α２は、これらの条件下で、検出可能なＰＥＧ化を示さなかった。対照実験は、システイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＳ１６３Ｃが、ＰＥＧ化されるには、ＴＣＥＰによる還元を必要とすることを示した。これらのデータは、ＰＥＧ分子が、Ｑ５Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＳ１６３Ｃのタンパク質に導入されたシステイン残基と接着していることを示している。
Ｂ．ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ ＩＦＮ−α２及びＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃの調製及び精製：
ＰＥＧ化タンパク質の生物活性を測定するため、より大量のＱ５Ｃ及びＳ１６３Ｃ変異タンパク質をＰＥＧ化した。Ｑ５Ｃタンパク質については、精製及び特徴決定にとって十分な材料を与えるため、小規模実験に使用したＰＥＧ化条件をタンパク質１４０μｇの規模に拡大した。より大規模なＰＥＧ化反応を、室温で１時間実施し、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）で１０×に希釈し、ｐＨ３．０に調整し、次いで、ｒＩＦＮ−α２変異タンパク質の最初の精製について記載した条件と類似の条件を使用して、迅速にＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムへ担荷させた。ＰＥＧ基の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、ＰＥＧ化タンパク質の非ＰＥＧ化タンパク質からの分離を可能にした。Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムからのクロマトグラムは、約１９０ｍＭ ＮａＣｌ及び２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する２つの主要なタンパク質ピークを示した。先に溶出する主要ピーク（約１９０ｍＭ ＮａＣｌで溶出）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単ＰＥＧ化Ｑ５Ｃであることが決定された。単ＰＥＧ化Ｑ５Ｃの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると約２８ｋＤａである。後に溶出する主要ピーク（２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出）は、未反応のＱ５Ｃタンパク質であることが決定された。ＰＥＧ化Ｑ５Ｃを主に含有する、先に溶出するピークからの画分をプールし、生物活性の測定に使用した。
ＰＥＧ−Ｑ５Ｃについて記載したプロトコルと本質的に同一のプロトコルを使用して、Ｓ１６３Ｃシステイン変異タンパク質を９０μｇの規模でＰＥＧ化し、精製した。
Ｃ．システイン変異タンパク質ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃの生物活性：
精製されたＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の生物活性を、実施例２０に記載のダウジ細胞アッセイにおいて測定した。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）色素結合アッセイを使用して決定した。ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質は、アッセイの誤差内で、野生型ｒＩＦＮ−α２及び未修飾Ｑ５Ｃタンパク質と類似の用量−反応曲線を示し、同レベルの最大増殖阻害を達成した。ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ変異タンパク質の平均ＩＣ５０は約２２ｐｇ／ｍｌであり、それは同一日に分析された野生型ＩＦＮ−α２及び未修飾Ｑ５Ｃタンパク質について決定されたＩＣ５０値の２倍以内であった（表５）。ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の生物活性は、非特異的なアミン反応性ＰＥＧ試薬でＰＥＧ化されたｒＩＦＮ−α２の生物活性よりも有意に大きかった。後者のタンパク質は、ダウジ細胞アッセイにおける１６４ｐｇ／ｍｌというＩＣ５０を有している（Ｍｏｎｋａｒｓｈら，１９９７）。これらのデータを表５に要約する。
ＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃタンパク質を用いた生物活性実験も実施した。ＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃタンパク質も、生物学的に活性であり、アッセイの誤差内で、野生型ｒＩＦＮ−α２と同程度にダウジ細胞増殖を阻害した。ＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃタンパク質の平均ＩＣ５０は、約４２ｐｇ／ｍｌであり、それはアミン−ＰＥＧ化ＩＦＮ−αよりも優れていた。
Figure 0005517844
ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質のインビボ効率は、下垂体切除（ＨＹＰＯＸ）ラットにおいて試験することができる。これは、よく特徴決定されているＧＨ欠損のモデルである（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。ＧＨは、ＨＹＰＯＸラットにおいて体重増加並びに骨及び軟骨の成長を刺激する（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。下垂体切除スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットは、チャールズリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（マサチューセッツ州ウィルミントン所在（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））のような商業的な供給元から購入することができる。典型的には、ラットは、４０〜５０日齢の間に下垂体切除を受け、体重は約１２０ｇである。８匹のラットの群に、特定の間隔で、ｒｈＧＨ、ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＧＨ又はプラセボ（媒体溶液）の皮下注射を与え、１０日間にわたり毎日、体重増加を測定するべきである。摂食と関連した可能性のある変数を排除するため、１日のうちの同じ時刻に毎日ラットを計量するべきである。全体的な体重増加に加え、骨の成長（頸骨骨端の幅）を測定してもよい。屠殺時に、左右の近位頸骨骨端を取り出し、ホルマリン固定する。固定された頸骨を、近位末端で矢状面で分割し、硝酸銀で染色し、強い光に曝すことができる（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら，１９４９）。骨端軟骨板の幅は、マイクロメーター接眼レンズを備えた実体顕微鏡を使用して測定することができる。各骨端について１０回の測定を行い、左右頸骨の値の組み合わせについて平均＋／−ＳＥＭを計算するべきである。群間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較については一元配置分散分析を使用して行うべきである。Ｐ＜０．０５を有意と見なすべきである。
１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＧＨシステイン変異タンパク質の効率は、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、又は１回の注射により、ラットにタンパク質を投与することにより試験することができる。皮下注射により１日２回投与した非ＰＥＧ化ｈＧＨ５μｇ（１０μｇ ＢＩＤ）は、ＨＹＰＯＸラットモデルにおいて強い成長反応を与える（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。最初の実験においては、異なるラット群に、１匹当たり１回当たり０．０８、０．４、２、１０又は５０μｇのＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質の皮下注射を与えるべきである。対照ラットには、媒体溶液のみを与えるべきである。付加的な対照群には、ＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質と同じ投薬計画を使用して、非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（１０μｇ／ＢＩＤ）及び非ＰＥＧ化ｈＧＨ１０μｇを与えるべきである。ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質のＨＹＰＯＸラットへの投与は、媒体処理群と比較して、体重増加及び頸骨骨端幅成長の増加をもたらすはずである。
ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質の効率は、齧歯類悪液質モデルにおいても試験することができる。体重減少を誘導するため、デキサメタゾン（ＤＥＸ）を、ラットに投与することができる。正常スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（２００〜２２５ｇ）の群に、デキサメタゾン（２００μｇ／匹；約１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を毎日与えるべきである。この量のデキサメタゾンは、８日間に約５〜６ｇの減少を誘導するはずである。異なる実験において、１回、毎日、２日毎、３日毎又は４日毎に、媒体、又は様々な用量のＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質をラットに投与することができる。異なるラット群に、１匹当たり１回当たり０．０８、０．４、２、１０又は５０μｇのＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質の皮下注射を与えるべきである。付加的な対照は、ＤＥＸ又は注射を与えないラット群、ＤＥＸ及び非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（１０μｇ ＢＩＤ）を与えるラット群、並びにＤＥＸ及び非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（実験に応じて、毎日、２日毎、３日毎又は４日毎、即ちＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質を投与する頻度で１０μｇ）を与えるラット群を含む。毎日、動物を計量するべきである。飼料及び水の消費量を、毎日監視するべきである。屠殺時に、内部臓器を計量するべきである。統計分析は、ＨＹＰＯＸラット研究に関する記載と同様にして実施するべきである。ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質で処理した動物の体重減少は、媒体処理動物よりも、少ないはずである。
ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質のインビボ効率は、媒体処理動物と比較したヘマトクリット及び赤血球生成の増加を、タンパク質が刺激することを証明することにより、正常ラットにおいて測定することができる。ＥＰＯは、毎日投薬した場合、ラットにおけるヘマトクリットの有意な増加を刺激する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９８）。スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットは、チャールズリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（マサチューセッツ州ウィルミントン所在（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））のような商業的な供給元から購入することができる。５匹のラットの群に、最大５日間、特定の間隔で、ＢＶｒＥＰＯ、ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質又はプラセボ（媒体溶液）の皮下注射を与えるべきである。６日目に、動物を屠殺し、商業的な実験施設により実施されうるヘマトクリット及び総血球数（ＣＢＣ）の分析のため、血液サンプルを収集するべきである。赤血球生成増加の証拠を検索するための組織病理学的分析のため、赤血球生成組織（肝臓及び脾臓）を収集し、計量し、ホルマリン固定するべきである。赤血球生成増加の証拠を検索するための単位粒子調製及び組織病理学的分析のため、様々な長骨及び胸骨から骨髄を摘出するべきである。群間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較については一元配置分散分析を使用して行うべきである。Ｐ＜０．０５を有意と見なすべきである。ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質は、媒体処理動物と比較して、ラットにおけるヘマトクリット及び赤血球生成の増加を刺激するはずである。１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質の効率は、毎日、２日毎又は３日毎に投与した場合に、試験することができる。皮下注射により１日１回投与した非ＰＥＧ化ＥＰＯ、１００ＩＵ／ｋｇ（約８００ｎｇ／ｋｇ）（ラット２００ｇ当たり１６０ｎｇ ＳＩＤ）は、ヘマトクリットの有意な増加を与える（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９８）。最初の実験においては、異なるラット群に、０．３２、１．６、８、４０又は１６０ｎｇのＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質の皮下注射を与えるべきである。対照ラットには、媒体溶液のみを与えるべきである。付加的な対照群には、非ＰＥＧ化ｒＥＰＯ（１６０ｎｇ／ＳＩＤ）及び非ＰＥＧ化ｒＥＰＯ、１６０ｎｇを、ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質と同じ投薬計画を使用して与えるべきである。
ＰＥＧ化ＥＰＯ変異タンパク質の効率は、化学療法により誘導された貧血モデルにおいても試験することができる。シスプラチンにより誘導された貧血は、化学療法により誘導された貧血の、よく特徴決定されている齧歯類モデルであり、ヒト臨床環境との直接的な関連性を有している。ｒＥＰＯは、１００単位／ｋｇの１日用量で投与した場合、このモデルにおける貧血を回復させる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９８）。スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（約２００ｇ）を、０日目に、貧血を誘導するためのシスプラチンの腹腔内注射（３．５ｍｇ／ｋｇ）により処理し、様々な処理群に無作為に分類するべきである。１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質の効率は、１回（１日目）、２日毎又は３日毎に投与した場合に、試験することができる。異なるラット群に、１回当たり０．３２、１．６、８、４０又は１６０ｎｇのＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質の皮下注射を与えるべきである。最大８日間、ラットに試験化合物を注射するべきである。１つの対照ラット群には、ｒＥＰＯ（１００単位／ｋｇ）の皮下注射を毎日与えるべきである。もう１つの対照群には、最初のシスプラチン注射は与えず、ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質と同じ投薬スケジュールを使用して、生理ＮａＣｌ水の注射を与えるべきである。９日目、ラットを屠殺し、総ＣＢＣ及び組織病理学の分析のため、血液及び組織サンプルを得るべきである。ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質は、媒体注射対照群と比較して、ラットにおけるヘマトクリット及び赤血球生成の増加を刺激するはずである。
ＩＦＮ−α生物活性は、比較的種特異的であり、そのことが、研究されうる臨床前動物モデルの範囲を制限している。ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質のインビボ効率を測定するために使用されうる１つのモデルは、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片増殖の阻害である。ヒトＩＦＮ−α２は、マウス細胞に対しては活性を示さず、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片増殖の阻害は、ヒト腫瘍細胞に対する直接的な抗増殖効果を介して起こる。ＩＦＮ−α２は、無胸腺マウスにおいて、多様な一次ヒト腫瘍異種移植片及びヒト腫瘍細胞系の増殖を阻害する（Ｂａｌｋｗｉｌｌら，１９８５；Ｂａｌｋｗｉｌｌら，１９８６；Ｊｏｈｎｓら，１９９２；Ｌｉｎｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９９７）。研究の第一終点は、処理マウスにける腫瘍の体積であるべきである。ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の投与は、媒体処理動物と比較して、マウスにおける腫瘍増殖（腫瘍の体積により測定される）を阻害することが予想される。無胸腺ヌードマウスは、チャールズリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）のような商業的な発売元から購入することができる。各マウスに、０日目に、ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３又はＭＣＦ−７腫瘍細胞（細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能）２×１０６個を注射し、無作為に、それぞれ１０匹からなる試験群に割り当てるべきである。腫瘍細胞は、腋窩に最も近い乳腺を覆う真皮に注射するべきである。異なる試験群に、特定の間隔で、即ち、毎日（ＳＩＤ）、２日毎（ＥＯＤ）又は３日毎（ＥＴＤ）に、様々な用量の野生型ｒＩＦＮ−α２、１０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質、２０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質又はプラセボ（媒体溶液）の皮下注射を与えるべきである。腫瘍の体積は、Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ（１９９７）に記載のようにして、カリパスで腫瘍の長さ及び幅を測定することにより４日間隔で決定するべきである。屠殺時に、腫瘍を切除し、計量するべきである。各試験群についての平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを、各サンプル採取点について計算するべきである。群間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較については一元配置分散分析を使用して行うべきである。皮下注射により１日１回投与した非ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２、５μｇは、６週間後、無胸腺マウスにおけるＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３細胞及びＭＣＦ−７細胞の増殖を８０％阻害する（Ｌｉｎｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９９７）。いずれかの細胞系がこれらの研究に使用されうる。ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３細胞（ＡＴＣＣより入手可能）は、ＭＣＦ−７細胞とは異なり、増殖にエストロゲンを必要としない。ＭＣＦ−７細胞を用いた異種移植片実験は、マウスに卵巣摘出を施し、エストロゲンペレットを移植することを必要とする（Ｌｉｎｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９９７）。最初の実験においては、異なるマウス群に、毎日、２日毎又は３日毎の投薬スケジュールを使用して、ｒＩＦＮ−α２、１０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質又は２０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の１回につき１又は５μｇの皮下注射を与えるべきである。投薬は、腫瘍細胞のマウスへの注射後、２日目に開始するべきである。対照マウスには、媒体溶液のみを与えるべきである。２日毎及び３日毎の投薬実験においては、付加的な陽性対照群に、未修飾ｒＩＦＮ−α２、５μｇの皮下注射を毎日与えるべきである。
参考文献
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本発明の種々の実施形態を詳細に述べてきたが、そのような実施形態の修飾及び適合が生じうることは当業者には明らかである。しかしながら、そのような修正及び適合が本発明の範囲内にあることは当然である。

Claims (13)

  1. 単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、
    前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループ及びヘリックスＡのすぐ前の領域からなる群より選択されるタンパク質の領域に配置されるアミノ酸に結合されたポリエチレングリコールを含み、前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに応答して増殖する細胞系のインビトロでの増殖を刺激し、かつ
    前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、１１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  2. ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループにあるアミノ酸に結合され、かつ前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  3. ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスＡのすぐ前の領域にあるアミノ酸に結合され、かつ前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、１１ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  4. 前記ポリエチレングリコールは直鎖ポリエチレングリコール及び分枝鎖ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  5. 前記ポリエチレングリコールはシステイン反応性ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  6. 前記ポリエチレングリコールは、マレイミド−ポリエチレングリコール、ビニルスルホン−ポリエチレングリコール及びヨードアセチル−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項５に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  7. 前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は前記ヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合された少なくとも一つの付加チオール基を含む、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  8. 請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、
    ａ）ポリエチレングリコールが前記ヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合する条件下にて同ヒト成長ホルモンタンパク質をポリエチレングリコールにさらす工程と、
    ｂ）前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって単ＰＥＧ化されていないヒト成長ホルモンタンパク質から単離する工程と、
    によって得られる、単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  9. 前記単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質は、分子ふるい分けカラムクロマトグラフィーによって測定された場合７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有する、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  10. 請求項１に記載の単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質を二つ以上含む、混合物。
  11. ヒト成長ホルモンを用いて治療可能な症状を治療するための医薬品の製造における、請求項１に記載の単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質の使用。
  12. 前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのＣ−Ｄループにあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
  13. 前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスＡのすぐ前の領域にあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、請求項１に記載の単離された単ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンタンパク質。
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