JP5517844B2 - 単離された単peg化ヒト成長ホルモンタンパク質及び医薬品の製造におけるその使用 - Google Patents
単離された単peg化ヒト成長ホルモンタンパク質及び医薬品の製造におけるその使用 Download PDFInfo
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Description
請求項2に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのC−Dループにあるアミノ酸に結合され、かつ同単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、50ng/ml未満のEC50を有する、ことをその要旨とする。
請求項3に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスAのすぐ前の領域にあるアミノ酸に結合され、かつ同単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、11ng/ml未満のEC50を有する、ことをその要旨とする。
請求項4に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは直鎖ポリエチレングリコール及び分枝鎖ポリエチレングリコールからなる群より選択される、ことをその要旨とする。
請求項5に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールはシステイン反応性ポリエチレングリコールである、ことをその要旨とする。
請求項6に記載の発明は、請求項5に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、ポリエチレングリコールは、マレイミド−ポリエチレングリコール、ビニルスルホン−ポリエチレングリコール及びヨードアセチル−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、ことをその要旨とする。
請求項7に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質はヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合された少なくとも一つの付加チオール基を含む、ことをその要旨とする。
請求項8に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、a)ポリエチレングリコールがヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合する条件下にて同ヒト成長ホルモンタンパク質をポリエチレングリコールにさらす工程と、b)単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって単PEG化されていないヒト成長ホルモンタンパク質から単離する工程と、によって得られる、単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質を提供する。
請求項9に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、分子ふるい分けカラムクロマトグラフィーによって測定された場合70kDaを超える見かけの分子量を有する、ことをその要旨とする。
請求項10に記載の発明は、請求項1に記載の単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質を二つ以上含む、混合物を提供する。
請求項11に記載の発明は、ヒト成長ホルモンを用いて治療可能な症状を治療するための医薬品の製造における、請求項1に記載の単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質の使用を提供する。
請求項12に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのC−Dループにあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、ことをその要旨とする。
請求項13に記載の発明は、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質において、前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスAのすぐ前の領域にあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、ことをその要旨とする。
本発明の方法によって生産される可溶性タンパク質は、組換えタンパク質、特に、タンパク質のシステイン変異型又は変異タンパク質である。本発明の方法は、ヒト成長ホルモン、EPO及びインターフェロン、特にαインターフェロン、それらの誘導体又はアンタゴニストを含むがそれらには限定されないタンパク質の生産に有用である。他のタンパク質には、TGF−βスーパーファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−A、血小板由来増殖因子−B、神経成長因子、脳由来神経栄養性因子、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、血管内皮細胞増殖因子、又はそれらの誘導体もしくはアンタゴニストが含まれる。免疫グロブリンのH鎖又はL鎖のシステイン変異タンパク質も企図される。
(a)自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップと、
(b)宿主細胞をシステインブロック剤に暴露するステップと、
(c)宿主細胞からタンパク質を単離するステップ、によって達成される。
(a)自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップと、
(b)宿主細胞を、自由システイン残基を有するタンパク質の合成時又は合成後にシステインブロック剤に暴露するステップと、
(c)培地中の他の細胞成分からタンパク質を単離するステップ、を含む。
ウサギGH受容体で安定にトランスフェクトされたマウスFDC−P1細胞株を用いるhGH細胞増殖アッセイを開発した(Rowlinsonら,1995)。マウスFDC−P1細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)から購入し、10%ウシ胎児血清、50μg/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、及び17〜170単位/mlマウスIL−3を添加したRPMI1640培地(FDC−P1培地)において日常的に増殖させた。
A.ウサギGH受容体をコードするcDNAのクローニング
ウサギGH受容体を、順方向プライマーBB3(5’−CCCCGGATCCGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCTGTT−3’)(配列番号1)及び逆方向プライマーBB36(5’−CCCCGTCGACTCTAGAGCCATTAGATACAAAGCTCTTGGG−3’)(配列番号2)を用いたPCRによりクローニングした。BB3は、開始メチオニンと受容体のアミノ末端部分をコードするDNA配列にアニールする。BB3は、開始メチオニンの前に最適化されたKOZAK配列と、クローニング用のBamHI部位を含む。BB36は、ウサギGH受容体mRNAの3’非翻訳領域にアニールし、クローニング用のXbaI及びSalI制限部位を含む。PCR増幅用の鋳型を生成するために、ウサギ肝臓ポリ(A)+mRNA(クロンテック社(CLONTECH,Inc)から購入)を一本鎖cDNAの第一鎖合成の基質として使用した。一本鎖cDNAの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社(Boehringer Mannheim Corp)のRT−PCR(AMV)用1st Strand cDNA Synthesis Kitを用いて達成した。並列第一鎖cDNA合成を、プライマーとしてランダムヘキサマー又はBB36を用いて行った。第一鎖合成産物を鋳型として用いた次のPCR反応を、プライマーBB3及びBB36を用いて行った。ランダムヘキサマー又はBB36により増幅されたcDNAを鋳型として用いたPCR反応で、予想された約1.9kbのPCR産物が観察された。ランダムヘキサマーで増幅されたcDNAを、BamHI及びXbaIで消化した。BamHI及びXbaIは、ウサギGH受容体遺伝子が内部BamHI部位を含むので2つの断片(約365bp及び約1600bp)を生成する。両断片をゲル生成した。次いで、完全長ウサギGH受容体cDNAを2つのステップでクローニングした。最初に、約1600bp BamHI−XbaI断片を、これらの同じ2つの酵素で消化されているpCDNA3.1(+)(インビトロジェン社(Invitrogen Corporation))にクローニングした。これらのクローンは妥当な頻度で容易に得られ、制限消化及びその後の配列決定により決定される欠失の証拠を示さなかった。ウサギ受容体cDNAクローンを完全にするために、1600bp BamHI−XbaI断片を含む配列決定されたプラスミドの1つをBamHIで消化し、ウシアルカリホスファターゼで処理し、ゲル精製し、ウサギGH受容体遺伝子の5’部分を含むゲル精製された約365bpのBamHI断片と連結した。この連結物による形質転換体をつつき、制限消化及びPCRにより分析して、約365bpの断片の存在を確認し、ウサギGH受容体遺伝子の末端部分に対するその方向を決定した。次いで、1つの完全長クローンの配列を確認した。pBBT118と呼び、このプラスミドを用いて、FDC−P1細胞を安定にトランスフェクトした。
エンドトキシンを含まないpBBT118 DNAを、キアゲン社「Endo−Free Plasmid Purification Kit」を用いて調製し、これを用いてFDC−P1細胞をトランスフェクトした。マウスIL−3を、アールアンドディーシステムズ社(R&D Systems)から購入した。FDC−P1細胞を、ギブコ社(GIBCO)から購入したDMRIE−Cカチオン化脂質試薬を用い、製造業者が推奨する説明書に従って、プラスミドpBBT118でトランスフェクトした。簡単には、6ウェル組織培養ディッシュ中で45分間、4μgのプラスミドDNAを、1mlのOptiMEM培地(ギブコ社(GIBCO))に溶解した4〜30μlのDMRIE−C試薬と複合体化した。複合体形成の後、200μlのマウスIL−3添加OptiMEM培地に溶解した2×106個のFDC−P1細胞を各ウェルに添加し、混合物を37℃で4時間放置した。マウスIL−3の最終濃度は17単位/mlであった。2mlの15%ウシ胎児血清含有FDC−P1培地を各ウェルに添加し、細胞を37℃で一晩放置した。翌日、トランスフェクトされた細胞を、IL−3(17U/ml)、hGH(5nM)、及びウシ胎児血清ではなく10%ウマ血清を添加したFDC−P1培地15mlを含有するT−75組織培養フラスコに移した。ウシ胎児血清にはFDC−P1細胞の増殖促進活性が含まれるので、ウマ血清を使用した。3日後に、細胞を遠心分離し、400μg/ml G418、17U/ml IL−3、5nM hGH、10%ウシ血清を含有する新鮮なFDC−P1培地に再懸濁し、37℃でインキュベートした。2〜3日毎に、培地を交換した。各トランスフェクションからの細胞を、新鮮な培地とマウスIL−3(17U/ml)又はhGH(5nM)のいずれかを含むT−75組織培養フラスコに分けた。G418耐性細胞を、IL−3とhGHの両方を含むフラスコから得た。バイオアッセイに用いた形質転換体は、hGHを含むフラスコに由来した。12個の独立した細胞株を限界希釈により選択した。これらの細胞株のうち5個(GH−R3、−R4、−R5、−R6、及びR9)は、hGHに対して優れた増殖反応を示した。予備実験により、hGHについてのEC50は各細胞株で似ているが、増殖反応の大きさは株によって異なることが分かった。GH−R4細胞株を最も詳細に研究し、以下で示すアッセイに用いた。10%ウマ血清、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、400μg/ml G418、及び2〜5nM下垂体hGH又はrhGHを含むRPMI1640培地において、これらの細胞株を日常的に増殖させた。
Rowlinsonら(1955)により説明されたMTT細胞増殖アッセイの改良版を、hGH生物活性を測定するために開発した。本発明者らのアッセイでは、有機溶媒で可溶化しなければならない不溶性産物を生じるMTTではなく、可溶性産物を生じる色素MTSの取り込み及び減少が測定される。MTSを使用する利点は、有機溶媒で細胞を溶解する必要なくウェルの吸光度を測定できることである。
A.ヒト成長ホルモン(GH)をコードするcDNAのクローニング
ヒトGH cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術とプライマーBB1及びBB2を用いて、ヒト下垂体一本鎖cDNA(クロンテック社、パロアルト、カルフォルニア州(CLONTECH,Inc.,Palo Alto,CA)から市販されている)から増幅した。BB1の配列は、(5’−GGGGGTCGACCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG−3’)(配列番号3)である。BB2の配列は、(5’−GGGGGATCCTCACTAGAAGCCACAGCTGCCCTC−3’)(配列番号4)である。成熟GHの第1アミノ酸であるフェニルアラニンの前に開始メチオニンと、クローニング用のSalI及びNdeI部位をコードするように、プライマーBB1を設計した。逆方向プライマーBB2は、クローニング用のBamHI部位を含む。PCR反応物は、20pmolの各オリゴプライマー、IX PCR緩衝液(MgCl2を含むPerkin−Elmer緩衝液)、200μM濃度の4つの各ヌクレオチドdA、dC、dG、dT、2ngの一本鎖cDNA、2.5単位のTaqポリメラーゼ(パーキンエルマー社(Perkin−Elmer))、及び2.5単位のPfuポリメラーゼ(ストラタジーン社(Stratagene,Inc))を含んだ。PCR反応条件は、96℃3分、(95℃1分、63℃30秒、72℃1分)の35サイクル、その後、72℃10分であった。使用したサーモサイクラーは、Amplitron II Thermal Cycler(サーモライン社(Thermolyne))であった。適切な600bp PCR産物を、SalI及びBamHIで消化し、ゲル精製し、同様に消化したプラスミドpUC19(ニューイングランドバイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州(New England BioLabs,Beverly,MA)から市販されている)にクローニングした。この連結混合物でE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地上で選択した。いくつかのコロニーをLB培地で一晩増殖させ、プラスミドDNAを、キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)から購入したミニプラスミドDNA単離キットを用いて単離した。クローンLB6は、正しいDNA配列を有することが決定された。
野生型GHクローンLB6(pUC19:野生型GH)を、E.coli stIIシグナル配列を含むGHクローンを構築するための鋳型として用いた。stII配列を、その長さのために、2つの連続PCR反応により付加した。第1の反応は、順方向プライマーBB12及び逆方向プライマーBB10を用いた。BB10は、配列(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(配列番号5)を有する。BB12は、配列(5’−GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCAACCATTCCCTTATCCAG−3’)(配列番号6)を有する。PCR反応は、野生型GHの増幅について説明した通りであった。適切な630bp PCR産物を、QiaexII Gel Extraction Kit(キアゲン社(Qiagen,Inc))を用いてゲル精製し、水で50倍に希釈し、2μlを第2のPCR反応の鋳型として使用した。第2のPCR反応は、逆方向プライマーBB10及び順方向プライマーBB11を用いた。BB11は、配列(5’CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG3’)(配列番号7)を有する。プライマーBB11は、クローニング用のXbaI及びNdeI部位を含む。PCR条件は、第1の反応について説明した通りであった。約660bpのPCR産物を、XbaI及びBamHIで消化し、ゲル精製し、同様に切断したプラスミドpCDNA3.1(+)(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA))にクローニングした。クローンpCDNA3.1(+)::stII−GH(5C)又は「5C」は、正しいDNA配列を有することが決定された。
野生型GHクローンLB6(pUC19:野生型GH)を、E.coli ompAシグナル配列を含むGHクローンを構築するための鋳型として用いた。ompA配列を、その長さのために、2つの連続PCR反応により付加した。第1の反応は、順方向プライマーBB7(5’GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG3’)(配列番号8)及び逆方向プライマーBB10(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(配列番号5)を用いた。約4ngのプラスミドLB6を一本鎖cDNAではなく鋳型として用い、PCR条件が、96℃3分、(95℃1分;63℃30秒;72℃1分)の30サイクル、その後、72℃10分であったことを除いて、PCR反応は、野生型GHの増幅について説明した通りであった。約630bp PCR産物を、QiaexII Gel Extraction Kit(キアゲン社(Qiagen,Inc))を用いてゲル精製し、水で50倍に希釈し、2μlを第2のPCR反応の鋳型として使用した。第2のPCR反応は、逆方向プライマーBB10及び順方向プライマーBB6(5’CCCCGTCGACACATATGAAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTC3’)(配列番号9)を用いた。PCR条件は、第1の反応について説明した通りであった。約660bp PCR産物をゲル精製し、SalI及びBamHIで消化し、SalI及びBamHIで切断したpUC19(ニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs)、又はXhoI及びBamHIで切断したpCDNA3.1(+)(インビトロジェン社(Invitrogen))にクローニングした(SalI及びXhoIは、適合する一本鎖突出部を生じる)。いくつかのクローンを配列決定し、pUC19(8/8)クローンには全てompA配列領域に誤りが含まれることを発見した。たった1つのpCDNA3.1(+)クローンを配列決定し、このクローンには、ompA領域に配列あいまい性が含まれていた。正しいompA−GH融合を作成するために、2つの配列決定されたクローンの遺伝子部分(これらは、便利な制限部位により分離した異なる誤りを含む)を組換え、PstI部位を欠くpUC19誘導体(下記のpBBT108を参照のこと)にクローニングした。結果として生じたプラスミド(pBBT112と呼ぶ)は、NdeI−BamHI断片として、pBBT108のこれらの同じ部位にクローニングされたompA−GH融合遺伝子を有する。このプラスミドをpBBT112と呼び、下記のように、PCRに基づくGHの部位特異的変異誘発に用いる。
選択したシステイン置換変異及び挿入変異の構築のための、クローニングされたGH遺伝子の変異誘発を容易にするために、PstI部位を欠く、プラスミドpUC19(ニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs))の誘導体を以下の通りに構築した。pUC19プラスミドDNAをPstIで消化し、その後、製造業者により供給された、200μM dNTPを添加した反応緩衝液を用いて、Pfu DNAポリメラーゼ(ストラタジーン社(Stratagene))により75℃で処理した。これらの条件下で、ポリメラーゼは、PstI消化により作られた3’一本鎖突出部を消化するが、二本鎖領域を消化せず、その最終結果は、PstI認識部位の真ん中4塩基からなる一本鎖4塩基の欠失である。結果として生じる分子は、二本鎖、すなわち「平滑」末端を有する。これらの酵素反応の後、線状単量体を、QiaexII Gel Extraction Kit(キアゲン社(Qiagen,Inc))を用いてゲル精製した。この精製されたDNAを、製造業者のプロトコルに従ってT4 DNAリガーゼ(ニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs))で処理し、PstIで消化し、これを用いてE.coli DH5αを形質転換した。形質転換体をつつき、PstI及びBamHIを用いた制限消化により分析した。PstI部位で切断されなかったが、すぐ隣のBamHI部位で切断された形質転換体の1つをつつき、pBBT108と呼んだ。
met−hGHをコードするpBBT120とstII−hGHをコードするpBBT114で、E.coli W3110株を形質転換した。親ベクターpCYB1でもまたW3110を形質転換した。結果として生じる株に以下の名称を与えた。
BOB133:W3110(pBBT120)=met−hGH
BOB132:W3110(pBBT114)=stII−hGH
これらの株を、100μg/mlアンピシリンを含むLria Broth(LB)で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、A600で約0.025O.D.まで、100μg/mlアンピシリンを含むLBで希釈し、振盪フラスコ中で37℃でインキュベートした。培養O.D.が約0.25〜0.5に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、IPTGを最終濃度0.5mMまで添加した。最初の実験のために、培養物を、誘導後0、1、3、5、及び約16時間後にサンプリングした。誘導培養物と非誘導培養物のサンプルをペレット化し、SDS−PAGEサンプルバッファー(所望であれば1%β−メルカプトエタノール(BME)を添加する)に再懸濁した。サンプルを、予め成形された14%Tis−グリシンポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色するか、ウエスタンブロッティングにより分析した。
A.野生型rhGHの精製
有意な量の野生型rhGHを精製するために、BOB132(stII−hGHを発現する)の培養物330mlを誘導し、一晩培養し、Hsiungら(1986)により記載された調製手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。詳細に述べると、st−II hGHプラスミドを含むE.coli W3110株を、100μg/mlアンピシリンを含むLBにおいて37℃で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、A600で0.03O.D.まで、100μg/mlアンピシリンを含むLB 2×250ml(総体積500ml)で希釈し、2L振盪フラスコ中で37℃でインキュベートした。培養物のO.D.が約0.4に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、IPTGを最終濃度0.5mMで添加した。誘導培養物を、37℃で一晩(約16時間)インキュベートした。誘導された一晩培養物がA600で約3.8O.D.に達し、これを、Sorval RC−5遠心器及びGSAローターを用いて、4℃で5分間8,000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを混合し、磨砕により約47O.D.まで、氷冷20%スクロース、10mM Tris−HCl(pH8.0)で再懸濁し、EDTA(pH8.0)を最終濃度約25mMで添加した。再懸濁された細胞を氷上で10分間インキュベートし、854ローターを用いてIEC Centra MP4R遠心器で、4℃で7分間8,500rpmで、遠心分離した。結果として得られたペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより47O.D.で氷冷水に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。再懸濁された細胞を、前記のようにIEC遠心器で遠心分離し、結果として得られた上清可溶性ペリプラズム画分)と細胞ペレット(不溶性ペリプラズム画分及び細胞関連画分)をSDS−PAGEにより分析した。再度、ゲルは、産生されたrhGHが可溶性で、ペリプラズムにあり、下垂体hGH標準とサイズで区別できないことを示した。
親FDC−P1細胞株は、マウスIL−3に対して強い増殖反応性を示すが、下垂体hGhに対しては示さない。IL−3の非存在下で、FDC−P1細胞の大部分は死滅し、0.2未満の吸光度値を示す。対照に、ウサギ成長ホルモン受容体で形質転換されたFDC−P1細胞は、細胞数及び吸光度値の用量依存性増加により証明されるように、下垂体hGHに反応して増殖する。この効果についてのEC50(最大半分の刺激を達成するのに必要とされるタンパク質濃度)は、文献(Rowlinsonら,1995)において報告されたものと同様に、様々な実験で0.75〜1.2ng/mlの下垂体hGH(0.03〜0.05nM)の範囲である。親FDC−P1株と、ウサギ成長ホルモン受容体で形質転換されたFDC−P1細胞との著しい差は、後者の細胞がIL−3又はhGHの非存在下で生き残り、さらに高い吸光度値(アッセイと、ゼロ成長因子対照ウェルにおけるMTSとのインキュベーションの長さに応じて一般に0.6〜1.1)をもたらすことである。ウサギ成長ホルモン受容体形質転換体の最初のプールと単離された5つ全ての独立した成長ホルモン受容体細胞株は、同じ効果を示した。第2のセットの独立して単離したウサギ成長ホルモン受容体形質転換体を用いて、同様の結果が得られた。Rowlinsonら(1995)は同様の効果を観察した。このことは、IL−3/GHに依存しない生存が形質転換手順の結果であることを示唆している。成長ホルモン受容体細胞株は、成長のためにIL−3もhGHも必要としないが、IL−3及びhGHに対する強い増殖反応性をなお示した。hGH非存在下での高い吸光度値の実際の効果は、hGH反応の「ウィンドウ(window)」(最大吸光度値と最小吸光度値との差)を減らすことである。このウィンドウは、Rowlinsonら(1995)により報告されたものと同様に、一貫してゼロ成長因子値の40〜70%の範囲であった。
システイン置換変異T135Cは、次のように構築した。アミノ酸残基135をスレオニンに対するコドンACTを、システインをコードするコドンTGTに変え、近傍BGlII部位をスパンするように変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチドBB28(5>CTGCTTGAAGATCTGCCCACACCGGGGGCTGCCATC>3)(配列番号10)を設計した。このオリゴを、ompA−GH融合遺伝子の結合領域とアニールするが変異を形成しないBB34(5>GTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATT>3)(配列番号11)と一緒にPCRで使用した。PCRは、1×PCR緩衝液(1.5mM MgCl2を含むパーキンエルマー緩衝液)中に、4種類の核酸dA、dC、dG及びdT各200μM、各オリゴヌクレオチドプライマー0.5μM、鋳型としてpBBT112(上述)を5pg、AmpliTaqDNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社、Perkin−Elmer)1.25単位、及びPfuDNAポリメラーゼ(ストラタジーン社、Stratagene)0.125単位を含む反応溶液50μl中で行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント96サーマルサイクラー(ストラタジーン社、Stratagene)中で行った。用いたプログラムは、95℃3分、その後[95℃60秒、45℃又は50℃又は55℃75秒、72℃60秒]を25サイクル、その後6℃のまま。PCR反応物をアガロースゲル電気泳動で調べた結果、三つのアニーリング温度すべてで、約430bpのかなりの量の生成物が得られることがわかった。45℃での反応生成物を、QLAクイックPCR精製キット(キアゲン社、Qiagen)を用いて精製し、BglII及びPstIで消化した。推定上のT135C変異を含む、得られた278bpのBglII−PstI断片をゲルで精製し、BglII及びPstIで消化され、ゲルで精製された、stII−GH融合遺伝子(上述)を有するpUC19誘導体であるpBBT111に連結した。この連結による形質転換体は、最初にBglII及びPstIによる消化によりスクリーニングし、その後1クローンの配列を決定し、T135変異が存在すること及びPCR反応によって又は合成オリゴヌクレオチドによって潜在的に導入され得る他の変異が存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、BglII−PstI断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
E.coliW3110株を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB3ml中で一夜生育させた。一夜培養し、生育が飽和に達した培養液を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB300mlで、600nmでのO.D.が0.03になるように希釈し、2Lの振盪フラスコ中、37℃で培養した。培養液のO.D.が0.420に達した時、100mMのIPTGを1.5ml加えて最終濃度が0.5mMになるようにし、組換えタンパク質の発現を誘導した。誘導した培養液は、37℃で一夜(約16時間)培養した。
hGHシステイン変異タンパク質の単離のための標準的な手順は次の通りである。StII−hGH変異タンパク質プラスミドを含むE.coliW3110株を100μg/mlのアンピシリンを含むLB中で飽和するまで生育させる。一夜培養した培養液を通常、100μg/mlのアンピシリンを含むLB中で600nmでのO.D.が0.025〜0.030になるまで希釈し、振盪フラスコ中で37℃で生育させる。600nmでの培養液のO.D.が0.300〜0.500に達した時、IPTGを最終濃度が0.5mMになるように加え、発現を誘導する。誘導した培養液を37℃で一夜培養する。誘導して、一夜培養した培養液をソーバル社(Sorval)RC−5遠心分離機で4℃、8,000〜10,000rpmで10分間遠心分離し、得られるペレットを、培養液の量に応じて、KoshlandとBostein(1980)又はHsiungら(1986)の手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。浸透圧衝撃のために、細胞ペレットを20%スクロース、10mM Tris−HCl、pH7.5中にO.D.が25〜50になるように再懸濁した。5mMのEDTA、pH8.0及び/又は5mMのシスチン(pHを7.5〜8.0に調節)を再懸濁緩衝液に含有させる場合もあった。再懸濁したペレットを15〜30分間氷冷し、上記のように遠心分離した。上清を捨て、ペレットを600nmでのO.D.が25〜50になるように、5又は10mMのTris−HCl、pH7.5中に再懸濁した。5又は25mMのEDTA、pH8.0及び/又は5mMのシスチン(pHを7.5〜8.0に調節)を再懸濁緩衝液に含有させる場合もあった。再懸濁したペレットを15〜30分間氷冷し、上記のように遠心分離した。得られる上清は可溶性ペリプラズム成分を含み、ペレットは不溶性ペリプラズム及び細胞関連成分から成る。
10mMTris−HCl、pH8.0で平衡化した1mlのHiTrapQ−セファロースカラム(ファルマシアバイオテク社、スエーデンウプサラ所在、Pharmacia、Uppsala、Sweden)に、シスチン存在で調製した可溶性ペリプラズマ画分(実施例5)をかけ、0〜250mMのNaCl濃度の直線勾配の溶出液20カラム体積で、結合したタンパク質を溶出した。カラムにかけ、回収した画分を14%SDS−PAGEで分析した。T3Cは、170〜200mMの塩濃度で溶出し、WT−hGHよりかなり遅れた。驚いたことにT3C変異タンパク質は、カラムにかけた時には単量体として存在したが、Qカラムから溶出した後、安定なジスルフィドホモ二量体として大部分が回収された。還元された時、T3C変異タンパク質は、SDS−PAGEゲル上では野性型hGHと一緒に移動した。Qカラム精製段階の間に二量体形成が起きた。シスチンは、Qカラム緩衝液又は他のカラム段階に用いられる緩衝液中には存在しなかった。さらに、どのような濃縮又は精製段階を通過しても、T3Cは二量体のままであった。Qカラムからの保存液を、最終NaCl濃度0.5Mに調節され、10mMリン酸ナトリウム、0.5MNaCl、pH7.5で予め平衡化した1mlのNi−アガロースカラム(キアゲン社、Qiagen)にかけた。洗浄段階の後、10mMリン酸ナトリウム、0.5MNaCl、pH7.5中0〜30mMのイミダゾール濃度勾配を用いて高純度のT3C二量体を回収した。T3C二量体は、生物検定で活性であった(実施例10及び表1)。
変異タンパク質T 148Cを発現するE.Coli株W3110を、100μg/mlアンピシリンを含むLB3mlの中で一晩育成した。一晩の培養で飽和状態になった培養物を、100μg/mlアンピシリンを含むLB500mlの中で、A600において吸光度0.025になるまで希釈し、250mlずつに分割し、2基のL型振とうフラスコを使って37℃で培養した。培養物の吸光度がおよそ0.35に達すると、100mMのIPTG1.25mlをそれぞれのフラスコに加え、最終的に0.5mMにまで濃縮し、遺伝子組換えタンパク質の発現を誘発した。誘発された培養物は、37℃で一晩(約16時間)培養した。
S144C変異型を含むE.Coli株W3110を、100μg/mlのアンピシリンを含む3mlのLBで一晩培養した。一晩の培養で飽和状態になった培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含む250mlのLB内で、600nmにおいて吸光度0.03まで希釈し、二基のL型振とうフラスコを使って37℃で培養した。培養物の吸光度がおよそ0.3に達したとき、100mMのIPTG1.25mlを加えて最終濃度を0.5mMにし、遺伝子組換えタンパク質の発現を誘発した。誘発された培養物を、37℃で一晩(約16時間)培養した。
精製されたシステイン変異タンパク質T3C、S144C、T148Cの生物活性を、実施例1に説明した細胞増殖検定法を用いて測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード検定法で決定した。この三種類の変異タンパク質は生物学的に活性であった。全ての変異タンパク質は、検定の誤差内で、下垂体hGHと同じ、最大刺激レベルに達した。T3C、S144C、T148Cの変異タンパク質の平均EC50は、脳下垂体hGH及びrhGH(表1)のものと同様であったT3C、S144C、T148C。変異タンパク質T148Cの独立した見本を二つ、S144CとT3Cをそれぞれ1つずつ(全てシステインの存在下で調製された)について、複数回、検定を行った(表1)。部分的に精製された変異タンパク質A105C、T135C、stp192Cもまた検定され、生物活性を示している。
GH変異タンパク質は、システインに反応する市販のさまざまなPEG maleimide(PEG ビニルスルホン)試薬を使って、PEG化することが出来る。一般的には、タンパク質をこうした試薬でPEG化する方法は、WO9412219(コックス及びマクダーモン)、WO9422466(コックス及びラッセル)に記されているものと同一で、この両者とも本稿リファレンス中に、大きな改変なしに収められている。自由システインを最高にPEG化するためには、一般的に、遺伝子組換えタンパク質をジチオスレイトール(DTT)、トリス(2−カルボキシル)ホスファイン塩酸(TCEP)あるいはほかの還元剤によって、部分的に還元する。自由システインは、部分的な還元が行われない限り、システイン反応性PEGには比較的反応が鈍い。それぞれの変異タンパク質を部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、さまざまなpHと温度における還元剤の濃度を考慮して、経験的に決める。還元剤の濃度は、ふつう0.5モルの等モル濃度から10倍モル濃度にまでわたる。温度は4℃から37℃が望ましい。pH値は6.5乃至9.0にわたるが、7.5乃至8.5が望ましい。最適な状況もまた、還元剤の種類と暴露時間によって変化する。正当な条件下では、もっとも安定性のないジスルフィド(一般的には分子間ジスルフィドあるいは混合ジスルフィド)は、より熱力学的に安定した未変性のジルスフィドに比べ、より早く分裂する。一般的に、5乃至10倍モル濃度のDTTを室温で30分使うというのが効果的である。部分的な還元は、タンパク質が逆相カラムから離れる際の、溶解グラフの微動によって検出することが出来る。二量体hGHの場合は、分子量の変動を、非・還元的条件下で行われたSDS−PAGE分析によって見ることが出来る。この時、タンパク質を過度に還元し、余剰のシステイン残分を過度に暴露しないようにないように気をつけなければならない。過度の還元は、層HPLCによって(過度に還元したタンパク質は、完全に還元され、変性したタンパク質同様の保持時間を示す)、またPEG化反応(SDS−PAGE上の分子量変化で検出できる)に伴う二つのPEGを含むGH分子の出現によっても検出することが出来る。野生型のGHは、未変化の分子内ジスルフィドを還元しない条件下ではPEG化しないため、制御剤として機能しうるのである過剰な還元剤は、分子ふるい分けクロマトグラフィーあるいは透析によって、PEG化の前に取り除くことが出来る。TCEPは、自由チオール基を含んでいないため、PEG化試薬を添加する前に除去する必要はない。部分的に還元したタンパク質を多様な濃度のPEGマルチマイドあるいはPEGビニルスルホンに反応させ、(一般にはPEG:タンパク質分子率が、1:1、5:1、10:1、50:のものを用いる)二つの試薬の最上の率を決定する。タンパク質のPEG化は、例えば、SDS−PAGEを使用して、分子量の変化によって観察できる。2値のPEG化産物を作らずに、単値のPEG化産物を出来るだけ多く作る製品を作る最低量のPEGが、一般には最上と考えられる(80%が単価のPEG産物に変換されることが一般的には好ましいと考えられている)。一般には、単量体のPEG化タンパク質は、非PEG化タンパク質と無反応PEGから、分子ふるい分け、イオン変換、親和、逆相、疎水性の相互クロマトグラフィーなどによって精製できる。2層の生物的抽出、塩の沈殿など、他の生成プロトコルも使用できる。精製されたPEG化タンパク質は実施例1に記された細胞増殖検定によって検定でき、個別の活動を決定する。
適正な還元剤とPEG濃度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために、予備的な測定研究を行った。還元されていないSDS−PAGE上で、二量体の非還元単体種への変換によるタンパク質の部分的還元を観察した。精製したT3C二量体の分割量1μgを室温で60分間、TCEPの濃度をあげながら培養した。直後に非・還元SDS−PAGEによって、反応を分析した。過度の還元と変性なしに有効な量の単量体T3Cを生む量のTCEPが、続く実験に使われた。TCEPはPEG化反応に支障をきたさないため、タンパク質とTCEP混合物とをPEG添加の前に透析する必要がなく、小規模の実験には使いやすい還元剤である。より大きい規模の実験におけるタンパク質還元には、DTTのような値段の安い還元剤が好まれる。一般に、タンパク質は、至適時間、還元剤と共に処理される。反応のpHはジスルフィドの再組織を制限するために6.5あるいはそれ以下に調整する。還元剤は透析あるいは液体クロマトグラフィーで除去する。その後pHを6.5以上、望ましくは7.5から8.5に再調整し、PEG試薬を添加する。
実施例12でT3Cについて行ったのと同様に、適当な還元剤、PEG試薬濃度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために、S144について予備的な測定研究を行った。2倍モル濃度のTCEPと10倍モル濃度の5kDaマレイミドPEGを使い、室温で二時間、pH7.5で、より大きな規模のPEG化を実施した。反応混合物をSDS−PAGE分析すると、2つあるいはそれ以上のPEGを持つ幾つかの種を示した。これらを、実施例12と同様に、Qセファロースカラムを使用して、単価のPEG化したS144Cから分離した。別に5kDビニルサルフォンPEG(フルカ社)を使ってPEG化反応を実施し、同様の還元条件下で、単価のPEG化S144Cを生成した。
PEG−T3CとPEG−S144Cタンパク質の生物活性を、細胞増殖検出(実施例1)で測定した。PEG‐T3Cタンパク質は、垂体hGH、非PEG化したT3Cタンパク質と同様の用量応答曲線を描き、同様に最高の刺激レベルに達した。 PEG‐T3CについてのEC50平均値は、1.6ng/ml(0.07nM)(4回の実験で、それぞれ1.3、1.5、1.7、1.8ng/ml)であった。PEG−T3Cタンパク質の生物活性は、非特異的NHS−PEG試薬(クラークらにより記載された(1966)440ng/ml(20nM)のEC50)を使ってPEG化したrhGHの場合に比べ、少なくとも100倍であった。
1つ以上の「自由」システインを備えた付加的なhGH変異型を作成し、hGHについて、より高次のジスルフィド連鎖多量体を作ることが出来る。これらの多量体には、3量体、4量体、5量体、6量体、7量体、8量体及び更に高次の多量体を含む。たとえば、個々の「自由」システイン変異を起こすインビトロDNAプラスミドベクターを組替える遺伝子組換え技術を使って、2つの「自由」システイン残基を持ったhGH変異型を作成することが出来る。あるいは、hGHシステイン変異型の変異誘発を使って、付加的な「自由」システイン変異を進めることも出来る。この手続きのどちらかをさらに反復させることで、hGH変異型を作成することが出来る。
A.EPOをコードしたcDNAをクローニングするヒトのEPOをコードしたcDNAを、順方向プライマーBB45(5>CCCGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG>3)(配列番号25)と逆方向プライマーBB47(5>CCCGAATTCTATGCCCAGGTGGACACACCTG>3)(配列番号26)とを使ったPCRによってクローニングした。BB45は、EPOコーディング配列の初発因子メチオニンとアミノ酸末端とをコードした遺伝子配列をアニ−ルし、またクローニング目的のためにBam HI部位を備えている(ジェイコブズら、1985年。リン他、1985年)。BB47は、翻訳されたストップ記号のすぐ下流にあるEPO mRNAの非翻訳領域をアニ−ルし、クローニングを目的とするEco RI抑制部位を備えている。ヒトの肝臓細胞系Hep3から分離したRNA全体を、PCR用の一本鎖cDNAの第1鎖合成に使用した。
pBBT131内のEPO cDNAを、5’末端及び3’末端の双方で修飾し、昆虫細胞において発現させた。5’末端においては、配列CAAAを、イニシエーターATGのすぐ上流に加えて、翻訳を強化した。この配列は、バキュロウイルス(エアーズら 1994年;ランジャン及びハスネイン、1995年)の提唱コンセンサス翻訳開始配列である。末端3’には、8アミノ酸FLAGエピトート配列(asp−tyr−lys−asp−asp−asp−asp−lys)(配列番号27)を加え、精製システムを提供した。FLAGエピトープを、柔軟性のあるリンカーser−gly−gly−ser−gly−gly−ser(配列番号28)を通して、EPO遺伝子と融合した。こうした修飾は、望みの添加物をEPO配列に組みこむオリゴヌクレオチドプライマーを使ったPCRによりなされた。遺伝子の5’末端を修飾するためには、オリゴヌクレオチドプライマーBB63(5>CGCCGATCCAAAATGGGGGTGCACGAATGTCCT>3)(配列番号29)を使用した。BB63はCAAA配列をATGの上流に添加し、イニシエーターであるメチオニンをコードするDNA配列と、EPOコーディング配列のアミノ酸末端部とにアニ−ルし、クローニングを目的とするBam HI部位を備えている。リンカーとFLAG配列を、逆方向プライマー BB60(5>GTCTTTGTACTCCGAGCCTCCGCTTCCGCCCGATCT GTCCCCTGTCCTGCA>3)(配列番号30)及びBB61(5>CGCGAATTCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCCGAGCCTCC>3)(配列番号31)を」使って配列PCR反応に加える。BB60はEPOコーディング配列の3’末端をアニールし、融合したペプチドリンカー配列とFLAG配列の一部を含んでいる。BB61はリンカーとFLAGのジャンクションをアニ−ルするBB60配列の断片と重なり、FLAG配列の残り、ついで翻訳停止コドン(TAA)及びEcoRI部位を、クローニングのために付加した。修飾されたEPO cDNAは、Bam HI−EcoRI断片としてpUC19内でクローニングされて、この構造のDNA配列は確認された。結果として出来たプラスミドを、pBBT132と命名し、実施例17の通り、EPO変異型の作成に使用した。バキュロウイルスでの発現のため、「FLAGタッグした」EPO cDNAをpBBT132の約630bpのBamHI−EcpRI断片から切断し、ゲル精製を行い、Bam HI及びEcoRIで切断すると共にアルカリホスファターゼ処理したバキュロウイルスの伝達ベクターpBlueBac4.5(インビトロジェン社 Invitrogene)でクローニングする。クローンを後の使用のために一つ抜き出し、pBBTI38と命名する。
細胞の上清を、遠心分離と0.2μMの濾過によって精製した。野生型のBV rEPOを抗FLAG M2アフィニティゲル(イーストマン・コダック社)を用いて1段階法で精製した。簡単に言うと、M2アフィニティゲルを5カラム量の50mM トリスpH7.4、150mM NaCl(TBS)、5カラム量の0.1M グリシン pH3.5で洗い、次いでTBSで平衡化する。浄化したバキュロウイルス細胞の上清を、150mMのNaClに調整し、平衡化した樹脂を加えた。バッチローディングを、ローラボトル上で4℃で一晩続ける。一晩のインキュベーション後、ファルマシアXK16/20FPLCカラムを使って樹脂を回収し、A280が基準に達するまでTBSで洗浄した。0.1MグリシンpH3.5で結合タンパク質を溶出し、画分を集めて1.0MトリスpH9.0で中和する。必要に応じてSDS−PAGEサンプル緩衝液の中に1%BMEを加えてカラム画分を調製し、既成の14%トリスグリシン・ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。BV rEPOの大半を含むM2アフィニティカラムの画分をプールし、セントリコン10スピンコンセントレイター(アミコン社)で濃縮した。野生型BVrEPOの最終収量は、ブラッドフォードプロテインアセイキット(バイオラッドラボラトリーズ社)及びウシ血清アルブミン(BSA)を基準にして決定したが、約360μgであった。SDSゲルのクマシー−ブルー染色でタンパク質を測定すると、90%以上の純度を示した。
D.野生型バキュロウイルスrEPOのインビボ生物活性
ヒトのUT7/epo細胞系を使った細胞増殖検定(コマツ他、1991年)を開発して、野生型のBV rEPOの生物活性を測定した。ヒトのUT/epo細胞系は、ハーバード大学医学部のF.バン博士から得たものである。この細胞系は、EPOによって細胞の増殖と生存とを測定するものである(ボイセルほか、1993年)。該細胞は10%のFBS、50ユニット/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、1ユニット/ml rEPO(CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞を発現させたもの。R&Dシステムズ社で購入)によって補充した、イソコフズ改変デルベッコ培地(IMDM)内に維持した。生物検定に際し、IMDM培地で細胞を三回洗い、10%FBS、50ユニット/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを含むIMDM培地内で、1×105の細胞/mlの濃度で再懸濁した。細胞懸濁50μm(5×103細胞)を、平底96ウェル型組織培養プレートの1テストウェル当たりに当分量で割り当てた。テスト用に、タンパク質サンプルの三倍希釈液を、10% FBS、50ユニット/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを含み、フェノールレッドを含まないIMDMに溶かして調製した。50μg/ml希釈タンパク質サンプルをテストウェルに加え、加湿した5%CO2組織培養器の中で、37℃で培養した。タンパク質サンプルを三つ一組のウェル内で測定した。60から72時間後、20μlのCellTiter96AQwueous One Solution Reagent(プロメガ社)を各ウェルに加え、組織培養器で1から4時間、37℃で培養した。ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使って、490nmで測定した。コントロールウェルには培養液はいれたが、細胞は入れなかった。3つ組のコントロールウェルの平均吸光度を、3つ組のテストウェルそれぞれの組の平均値から引いた。CHO細胞で発現させたrEPOあるいは野生型のBV rEPOの連続希釈液を、並行して分析した。
A.EPOシステイン変異タンパク質の作成
実施例4に示された成長ホルモン変異タンパク質の作成に使われる方法(イニスら、1990年。ホートンら、1993年)と同じ、PCRに基づく部位特異的変異誘発方法を使用して、8つの変異EPO遺伝子を作成した。A−Bループ内にあるN結合グリコシル化部位あるいはその近くで4つの変異タンパク質(N24C、T26C、N38C及びT40C)、B−Cループ内のN結合グリコシル化部位あるいはその近くで2つの変異タンパク質(N83C、S85C)、C−Dループ内のN結合グリコシル化部位あるいはその近くで1つの変異タンパク質(S126C)、そして自然のカルボキシ末端R166残基と、ペプチドリンカーとFLAG配列からなる15アミノ酸カルボキシ末端延長部との間にシステインを加える1つの変異タンパク質(167C)を構築した。変異PCRの反応の鋳型は、プラスミドpBBT131であり、この場合、非修飾EPO遺伝子がBamHI−EcoRI断片としてpUC19でクローニングされる。PCR産物を、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、適当な制限酵素によって切り取ったpBBT132ベクターDNAとライゲートし、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製を行った。上記に詳しく述べたように、pBBT132は、クローニングした修飾(FLAGを組みこんだ)EPO遺伝子を有するpUC19変異型である。こうしたライゲーションからの形質転換体を成育し、プラスミドDNAを分離して配列決定する。クローニングした突然変異PCR断片全体の配列を決定し、問題の変異が存在することを確認すると共に、PCR反応によって、あるいは合成オリゴヌクレチドプライマーによって誘発される可能性のある任意の追加的変異が存在しないことを確認した。
発現実験では、上で説明した野生型EPOをコードするプラスミドpBBT138に関する手順を使用して、Sf9細胞を線形化したBac−N−BlucTMDNAとともに同時移入するために、変異型EPOをコードする8つのプラスミドを使用した。トランスフェクション上清は、Sf9細胞上で、青色プラーク形成について検定した。それぞれの変異型について、10個の青色プラークを取り出し、実施例16において説明するように継代培養した。10つのうち5つの上清を、SDS−PAGE及びウエスタンブロットによりスクリーニングし、EPO変異型の発現を検出した。ウエスタンブロット分析は、野生型EPOに関して実施例16で説明した方法を使用して実施した。ウェスタンの結果は、各クローンからスクリーニングした5つの上清のうち、少なくとも3つが、FLAGタグ付きEPOタンパク質を含むことを示した。ウエスタンブロットの結果によって更に、N結合グリコシル化部位(N24C、T26C、N38C、T40C、N83C、及びS85C)でのグリコシル化を防止すべき変異タンパク質をコードするプラスミドが、野生型BV rEPOよりも小さな、約2,200乃至2,800ダルトンの分子量を有するタンパク質を生成することも明らかになった。対照的に、O−結合グリコシル化部位のS126変異タンパク質、及び*167C(C末端システイン付加)は、野生型BV rEPOと共に移動するEPOタンパク質を生成した。これらの結果は、昆虫の細胞が通常、N−結合グリコシル化を行うという観察と、及びO−結合グリコシル化部位に結合する糖基が一般に小さく、これによりタンパク質の分子量が最低限しか増加しないという観察とに一致する。昆虫の細胞はO−結合グリコシル化を行うことが報告されている(Davies、1995)。
精製されたrEPO−Cys変異タンパク質の生物活性は、実施例16で説明したUT7/epo細胞増殖検定によって測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード検定を使用して決定した。サンプルの数が多いため、変異タンパク質は2種類のグループに区分し、変異タンパク質T26C、T40C、N83C、及びS126Cが一つのグループに含まれ、変異タンパク質N24C、N38C、S85C、及び*167Cが第二のグループに含まれるようにした。1グループ内の変異タンパク質は同日に分析した。野生型BV rEPO及びCHO rEPOは、検定における日による変化を制御するために同じ日に並行して分析した。すべての変異タンパク質はUT7/epo細胞の増殖をシミュレートしており、野生型rEPO制御タンパク質の3倍以内のEC50を有する。N24C、T26C、N83C、S125c、及び*167C変異タンパク質の平均EC50は、野生型BV rEPO及びCHO rEPOの平均EC50と同様で、平均0.3乃至0.8ng/mlであった(表2)。N38C及びT40Cタンパク質の平均EC50は、約1ng/mlであった(表2)。
A.EPOシステイン変異タンパク質の小規模PEG化
いくつかのシステイン変異タンパク質及び野生型EPOを、還元剤TCEPでの処理の後、5kDAシステイン反応PEGによるPEG化の能力について試験した。タンパク質の過剰還元を回避しながら、PEG化に適切なTCEP及びPEG試薬濃度を特定するために、T26C変異タンパク質による滴定研究を実行した。野生型BV rEPOを対照として使用して、SDS−PAGEによるタンパク質の部分還元を観察した。ビニルスルホン又はマレイミド5kDa PEG(フルカ)のいずれかが10乃至40倍超過モル濃度で存在する、増加するTCEP(0.5M乃至6.0M超過)濃度を試験した。反応は、非還元SDS−PAGEにより分析した。野生型BV rEPOは、単PEG化EPO−Cys変異タンパク質(EPO−Cys変異タンパク質に結合した単一のPEG分子)を大量に発生させるが、野生型BV rEPOのPEG化を発生させない部分的還元条件を特定するために、対照として、並行して処理した。5倍超過モル濃度のTCEPと30倍超過モル濃度の5kDaビニルスルホンPEGとにより、野生型BV rEPOのPEG化なしに、大量の単PEG化T26Cタンパク質が発生した。
PEG化タンパク質を生物活性測定のために精製できるように、大量のT26C及びS126Cタンパク質をPEG化した。PEG化反応は、それぞれのタンパク質75μgと、規模の小さな1μg反応において使用するのと同じモル分子比率のTCEP及び5kDa−PEGを含むように規模を大きくした。1時間後、PEG化混合物を20mM Tris−HCl、pH8.0、20%グリセロール(緩衝剤A)により10倍に希釈し、直ちに緩衝剤Aにおいて平衡化した1ml Q−セファロースカラムにロードした。カラムは平衡緩衝剤により洗浄し、結合したタンパク質を、20mM Tris−HCl、pH8.0、20%グリセロール内の0乃至150mM NaClの直線10体積増加塩勾配により溶出した。PEG部分の存在により、樹脂に関するタンパク質のアフィニティが減少し、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することが可能になった。単PEG化タンパク質を含む画分は、SDS−PAGEとその後のクマシーブルー染色により特定した。PEG−T26Cを含むが、可視非誘導化体タンパク質を含まない画分を、−80℃で冷凍保存し、その後、バイオアッセイに使用した。精製PEG−S126Cを入手するために同様の手順を使用した。バイオアッセイで使用するPEG−T26C及びPEG−S126C調製の純度を評価するために、ウエスタンブロットを実施した。ウエスタンブロットは、実施例16で説明したように実施した。ウエスタンブロットにより、PEG−T26C及びPEG−S126Cに関して予測されるサイズで強いシグナルが生じたが、非PEG化S126C及びT26Cタンパク質に関して予測される位置で移動するタンパク質は検出されなかった。これらの結果から、精製PEG化変異タンパク質の中には非PEG化タンパク質がほとんど存在していない(<5%)と結論した。
精製PEG−T26C及びPEG−S126Cタンパク質の生物活性を、実施例16で説明したUT7/epo細胞増殖検定で測定した。PEG−EPO−Cys変異タンパク質のタンパク質濃度は、製造業者が推奨する指示にしたがって、ヒトEPO ELISAキット(R&Dシステムズ)を使用して定量化した。非PEG化変異タンパク質及び野生型BV rEPOのタンパク質濃度も、ELISAによって定量化した。ELISA検定は、同日に、すべてのタンパク質に関して実施した。タンパク質サンプルの連続3倍希釈液を準備し、バイオアッセイにおいて分析した。それぞれの連続希釈液の未使用材料は−80℃で冷凍保存し、その後、ELISAで分析し、開始材料の正確なタンパク質濃度を判断した。それぞれのタンパク質サンプルのいくつかの連続希釈液を分析し、少なくとも1種類の試験サンプルでのタンパク質濃度が、標準ELISA曲線の直線範囲、つまり0.0025乃至0.2ユニット/ml又は約0.02乃至1.6ng/mlに入るようにした。それぞれのサンプルで、少なくとも2種類の連続希釈が、この直線範囲に入った。
EPOシステイン変異細胞は、哺乳類細胞でも発現させ、条件培地から精製することができる。EPOシステイン変異細胞は、哺乳類細胞の一時的トランスフェクション、又はEPOシステイン変異細胞を発現する安定に形質転換した哺乳類細胞系を構築することで、発現させることができる。ヒトの治療の用途では、EPOシステイン変異細胞は、リンカー及びFLAG配列なしに発現するのが好ましい。サルCOS細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能)は、当業者に広く知られる手順を使用する一時的トランスフェクション用に使用可能である。多くの民間の供給源、例えばGIBCO/BRLは、脂質トランスフェクション試薬を販売し、一時的トランスフェクションによってEPOシステイン変異タンパク質を発現するのに使用できる詳細なプロトコルを提供している。野生型EPOは、タンパク質を発現する安定転換チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を使用して、ヒトでの使用のために製造されている。安定トランスフェクションCHO細胞系は、組換えタンパク質の高レベル発現のために広く使用されている(Geisseら、1996;Trillら、1995)。CHO細胞では、遺伝子増幅によって、染色体が統合された異種遺伝子の高レベル発現が達成できる。通常、問題となる遺伝子は、増幅を選択可能な標識遺伝子にリンクされる。増幅の選択を提供する様々な遺伝子の記述(Kaufman、1990)があるが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)が頻繁に利用される。この遺伝子の増幅は葉酸類似メトトレキサート(MTX)に抵抗力を与え、抵抗力のレベルは、dhfr遺伝子のコピー数によって増加する(Altら、1978)。MTX選択の有用性は、dhfrが欠如したCHO細胞系の可用性によって向上する(Urlaub and Chasin、1980)。
A.IFN−α2をコードするDNA配列のクローニング
少なくとも25の異なるIFN−α遺伝子が、70%以上のアミノ酸相同性を共有するタンパク質をコードしている(Blattら、1996)。IFN−α種の間のDNA配列の相同性が高いため、IFN−α2遺伝子を2つのステップでクローニングした。第一に、IFN−α2遺伝子は、IFN−α2遺伝子の上流及び下流にある固有の配列に対応するプライマーを使用して、ヒトゲノムDNAからPCRによって増幅した。このPCR産物は、IFN−α2遺伝子をコードしていることを確認するためにクローニング及び配列決定した。その後、IFN−α2コーディング配列を、PCRによって修飾し、E.coli及び部位特異的突然変異誘発における発現に関してサブクローニングした。IFN−α2をコードするDNAは、ヒトゲノムDNA(クロンテック)からPCRによって増幅した。PCR反応は、BB93(5>CGCGAATTCGGATATGTAAA TAGATACACAGTG>3)(配列番号50)及びBB94(5>CGCAAGCTTAAAAGATTTAAATCGTGTCATGGT>3)(配列番号51)によって実施した。BB93は、IFN−α2コーディング配列の約300bp上流(つまり5’)のゲノム配列をアニールし、クローニングの目的でEco RI部位を含む。BB94は、IFN−α2コーディング配列の約100bp下流(つまり3’)のゲノム配列をアニールし、クローニングの目的でHindIII部位を含む。結果として生じた約1kbのPCR産物をEcoRI及びHindIIIで消化し、同様に消化してからアルカリホスファターゼ化したpCDNA3.1(+)(インビトロジェン)でクローニングした。IFN−α2に関して正しいDNA配列を有するクローン(Hencoら、1985)は、特定及び指定されたpBBT160だった。
IFN−α2は、ペリプラズム空間への分泌によって、E.coliにおいて、活性形態で発現できる(Vossら、1994)。分泌されたIFN−α2は、N末端メチオニンが欠如しており、天然IFN−α2と同一のアミノ酸配列を有していた。IFN−α2の分泌形態を発現するために、E.coli熱安定エンテロトキシン(STII)遺伝子のリーダー配列(Pickenら、1983)を、PCRによって、成熟IFN−α2のコーディング配列に融合した。その長さのため、STII配列は、2つの連続するPCR反応で追加した。第一の反応では順方向プライマーBB101(5>GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATGTGATCT GCCTCAAACCCAC AGC>3)(配列番号54)と逆方向プライマーBB100とをpBBT164(上述)と共に鋳型として使用した。BB101の3’終点(21bp)は、成熟IFN−α2のコーディング配列の5’終点をアニールする。BB101の5’セグメント(39ヌクレオチド)は、STIIリーダペプチドの部分をコードする。この反応の約550bpのPCR産物は、ゲル精製され、第二のPCR反応の鋳型として使用された。第二のPCR反応は、逆方向プライマーBB100と前方向プライマーBB11(5’−CCCCCTCTAGACATATGAAG AAGAACATCGCATTCCTGCTGGCAT CTATGTTCGTTTTCTC TATCG−3’)(配列番号7)を使用した。BB11は残りのSTIIリーダペプチドを追加し、STIIリーダーの開始ATGと重複するNde I部位を含む。この反応の約590bpの産物を、Nde I及びXba Iによって消化した。STIIリーダー配列とIFN−α2のアミノ末端の約30bpとを含む約100bpのNdeI−Xba I断片は、ゲル精製、Nde I及びXba Iによって消化されたpBBT168[pUC18::met−IFN−α2]によりライゲートし、アルカリホスファターゼにより処理し、ゲル精製した。このステップにおいて、met−IFN−α2遺伝子の約30bpのNde I−Xba Iアミノ終端セグメントは、STII−IFN−α2 PCR産物のPCRによって誘導された約100bpのNde I−Xba Iアミノ終端セグメントによって置換される。結果として生じたpUC18::STII−IFN−α2構成の配列は、確認され、そのプラスミドは指定pBBT177だった。E.coliにおける発現に関して、pBBT177は、Nde I及びEco RIによって消化され、STII−IFN−α2遺伝子を含む約570bpの断片はゲル精製され、iacプロモータの管理下において発現ベクターpCYB1でクローニングされた。結果として生じたプラスミドは指定pBBT178だった。
met−IFN−α2をコードするpBBT170と、親ベクターのpCYB1とは、E.coli JM109に転換された。これらの細胞株による実験では、met−IFN−α2の発現が生じた。分泌されたIFN−α2は天然IFN−α2と同じアミノ酸配列を有するため、分泌されたIFN−α2は細胞質met−IFN−α2に好適である。
野生型rIFN−α2タンパク質を精製するために、BOB202の一晩経過した新しい飽和培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB 100mM MES(pH5.5)内で、0.02OD@A600で接種した。通常は、325mlの培養物を、160乃至200rpmの旋回水槽内で、37℃の2リットル振動フラスコによって成長させた。培養物が0.3乃至0.4ODの濃度に達した時、IPTGを追加し、最終濃度を0.5mMとした。誘導した培養物を、その後約16時間培養した。培養物には、Hsuingら(1986)の手順に基づいて、浸透圧衝撃を加えた。この細胞を遠心分離によってペレット化し、氷温の20%スクロース、10mM Tris−HCl(pH8.0)において、−25OD/mlで再懸濁した。再懸濁した細胞は氷の上で15分間培養し、9500×gで10分間遠心分離した。その後、ペレットを氷温の10mM Tris−HCl(pH8.0)に再懸濁し、氷の上で15分間培養し、9500×gで10分間遠心分離した。結果として生じた上清(浸透圧衝撃溶解物)を、直ちに処理するか、或いは−60℃で保存した。
INF−αの生物活性は、インビトロ抗ウイルス検定又は細胞増殖抑制検定を使用して測定できる。我々は、野生型rINF−α2の生物活性を測定するための細胞成長抑制検定を開発した。ヒトDaudi B細胞系(アメリカンタイプカルチャーコレクションは、INF−αの成長抑制特性に対して敏感で、INF−αの生物活性の測定に一般的に利用される(Horoszewiezら、1979;Evinger and Pestka、1981)。Daudi細胞は、10%のFBS、50ユニット/mlのペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを補った、RPMI1640培地で維持した。バイオアッセイでは、RPMI1640培地によって細胞を3回洗浄し、4×105細胞/mlの濃度で、10%のFBS、50ユニット/mlのペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地に再懸濁した。50μl(2×104細胞)の細胞懸濁液を、フラットボトム96ウェル組織培養プレートの試験ウェル毎にアリコートとした。10%のFBS、50ユニット/mlのペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640羽位置において、連続する3倍の希釈の試験用タンパク質サンプルを準備した。50μlの希釈タンパク質を試験ウェルに追加し、このプレートを37℃で、加湿5%CO2組織培養インキュベータにおいて培養した。4日後、20μlのCellTiter 96 AQueous One Solution Reagent(プロメガコーポレーション)をそれぞれのウェルに追加し、このプレートを37℃で、組織培養インキュベータにおいて1乃至4時間培養した。マイクロプレートリーダーを使用して、490nmで吸収度を読み出した。対照ウェルは培地を含むが、細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウェルの平均吸収度の値は、三つ組みの試験ウェルの各組について得られた平均値から減算した。E.coli発現rIFN−α2(エンドゲン社)の連続する希釈を並行して分析した。IC50(半最大成長抑制に必要なタンパク質濃度)は、それぞれのサンプルについて計算し、タンパク質の生物活性の比較に使用した。
A.IFN−α2システイン変異タンパク質の構築
実施例4に記載のものと類似の部位特異的PCR型突然変異導入法を使用して、17種の変異型IFN−α2遺伝子を構築した。本発明者らは、ヘリックスAより近位のアミノ末端領域の変異タンパク質1種[Q5C]、A−Bループの変異タンパク質6種[N45C、Q46C、F47C、Q48C、A50C、及び43C44(残基43と残基44の間へのシステインの挿入)]、短い2残基のBCループの変異タンパク質1種[D77C]、CDループの変異タンパク質4種[Q101C、T106C、E107C及びT108C]、Eヘリックスより遠位のカルボキシ末端領域の変異タンパク質3種[S163C、E165C及び*166C(天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加)]を構築した。本発明者らは、天然の非必須のC1−C98ジスルフィド(Lydonら,1985;Moreheadら,1994)を排除する、変異タンパク質C1S及びC98Sも構築した。ヘリックスAより近位のアミノ末端領域におけるC1S置換は、Cヘリックスに自由システイン(C98)を生成させ、CヘリックスにおけるC98S置換は、ヘリックスAより近位の領域に自由システイン(C1)を生成させる。
B.rIFN−α2システイン変異タンパク質のE.coli発現
発現を調査するため、前記の野生型rIFN−α2の場合と同様にして、rIFN−α2変異タンパク質の培養物を増殖させ、誘導した。典型的には、45mlの培養物を、約180〜200rpmの旋回振とう(gyrotory shaker)水浴中で、37℃で、250mlの振とうフラスコで増殖させた。本発明者らは、振とうフラスコ培養物の激しい曝気が、浸透圧衝撃溶解物の上清中のIFN−α2タンパク質のレベルを減少させるのを観察した。従って、本発明者らは、曝気にとっては最適ではないが、可溶性rIFN−α2及びrIFN−α2変異タンパク質の産生にとっては好ましい条件を通常使用した。誘導された培養物を、約16時間インキュベートし、採集し、既に詳述した野生型rIFN−α2の場合と同様の浸透圧衝撃にかけた。ただし、浸透圧衝撃法に使用する緩衝液には、5mMという最終濃度でシスチンを添加した。浸透圧衝撃緩衝液へのシスチンの添加は、最初に分析した2つの変異タンパク質Q5C及びS163Cのためのクロマトグラフィー特性を有意に改善した。シスチンで処理していないインターフェロン変異タンパク質は、一貫して、S−セファロース(Sepharose)カラムからブロードのバンドとして溶出し、非還元SDS−PAGEにより分析した場合、予想される単量体分子量の位置、及びその周辺に複数の分子量種を示した。これらの種は、不適切に折り畳まれた、又は不完全に折り畳まれたインターフェロン異型である可能性が最も高い。対照的に、浸透圧衝撃法においてシスチンで処理したインターフェロン変異タンパク質は、シャープなバンドとしてS−セファロース(Sepharose)カラムから溶出し、非還元SDS−PAGEにより分析した場合、インターフェロン野生型標準と同じ位置に移動するただ1つのインターフェロン種からなっていた。精製されたインターフェロン変異タンパク質のS−セファロース(Sepharose)カラムからの回収も、浸透圧衝撃緩衝液中にシスチンが含まれる場合、1.5倍から2倍、大きかった。これらの結果に基づき、全てのシステイン変異タンパク質を精製するために使用する浸透圧衝撃緩衝液に、5mMシスチンを添加した。
rIFN−α2変異タンパク質を精製するため、典型的には、2リットルの振とうフラスコ中の325mlの培養物、又は2リットルのバッフル(baffled)振とうフラスコ中の500mlの培養物を、約170〜220rpmの旋回振とう水浴(ニューブランスウィックサイエンティフィック(New Brunswick Scientific))中で37℃で増殖させた。実施例20に記載のようにして、培養物を増殖させ、誘導し、回収し、浸透圧衝撃にかけた。得られた浸透圧衝撃上清は、直ちに処理するか、又は−80℃で保存した。
精製されたrIFN−α2システイン変異タンパク質Q5C及びS163Cの生物活性を、実施例20に記載のダウジ(Daudi)増殖阻害アッセイにおいて測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)タンパク質アッセイキット又はBCAタンパク質アッセイキット(バイオラドラボラトリーズ社(Bio−Rad Laboratories)及びピアース社(Pierce))を使用して決定した。アッセイにおける日間変動をコントロールするため、市販の野生型rIFN−α2及び本発明者らが調製したrIFN−α2を、同一日に平行して分析した。変異タンパク質は、アッセイの誤差内で、野生型rIFN−α2対照タンパク質と同程度にダウジ細胞の増殖を阻害した。Q5C変異タンパク質の平均IC50は、13pg/mlであり、それは、野生型rIFN−α2タンパク質の平均IC50と類似していた。S163Cタンパク質の平均IC50は、27pg/mlであった。これらのデータを表4に要約する。
A.IFN−αシステイン変異タンパク質のPEG化
タンパク質が自由システイン残基において単PEG化されうる条件を同定するため、小規模なPEG化実験を、精製されたrIFN−α2システイン変異タンパク質を用いて実施した。タンパク質の未折り畳みの結果としての、予想されるよりも高い見かけの分子量へのシフトを検索するか、又は天然型ジスルフィドの還元の結果として生成した、複数のPEG化種の出現を検索する、非還元SDS−PAGEにより、タンパク質の過剰還元をモニターした。最初の力価測定実験は、Q5Cタンパク質を用いて実施した。精製されたQ5C、1μgを、様々な量の過剰の5kDaマレイミド−PEGの存在下で、100mMトリス(pH8.5)中で、増加する濃度のTCEP[トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン]−HClと共に、室温でインキュベートした。60分後、反応を停止させ、直ちに非還元SDS−PAGEにより分析した。野生型rIFN−α2を修飾することなく、有意な量の単PEG化Q5Cタンパク質(非還元SDS−PAGEによると約28kDaの分子量)を生じるTCEP及びPEG試薬の量を、さらなる実験に使用した。力価測定実験は、10倍モル過剰のTCEP及び20倍過剰の5kDaマレイミドPEGが、検出可能なジPEG化又はトリPEG化タンパク質を生成させることなく、又は野生型rIFN−α2を修飾することなく、約60%の単PEG化タンパク質を与えることを示した。
PEG化タンパク質の生物活性を測定するため、より大量のQ5C及びS163C変異タンパク質をPEG化した。Q5Cタンパク質については、精製及び特徴決定にとって十分な材料を与えるため、小規模実験に使用したPEG化条件をタンパク質140μgの規模に拡大した。より大規模なPEG化反応を、室温で1時間実施し、20mM MES(pH5.0)で10×に希釈し、pH3.0に調整し、次いで、rIFN−α2変異タンパク質の最初の精製について記載した条件と類似の条件を使用して、迅速にS−セファロース(Sepharose)カラムへ担荷させた。PEG基の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質の非PEG化タンパク質からの分離を可能にした。S−セファロース(Sepharose)カラムからのクロマトグラムは、約190mM NaCl及び230mM NaClで溶出する2つの主要なタンパク質ピークを示した。先に溶出する主要ピーク(約190mM NaClで溶出)は、SDS−PAGEにより、単PEG化Q5Cであることが決定された。単PEG化Q5Cの見かけの分子量は、SDS−PAGEによると約28kDaである。後に溶出する主要ピーク(230mM NaClで溶出)は、未反応のQ5Cタンパク質であることが決定された。PEG化Q5Cを主に含有する、先に溶出するピークからの画分をプールし、生物活性の測定に使用した。
C.システイン変異タンパク質PEG−Q5C及びPEG−S163Cの生物活性:
精製されたPEG−Q5Cタンパク質の生物活性を、実施例20に記載のダウジ細胞アッセイにおいて測定した。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード(Bradford)色素結合アッセイを使用して決定した。PEG−Q5Cタンパク質は、アッセイの誤差内で、野生型rIFN−α2及び未修飾Q5Cタンパク質と類似の用量−反応曲線を示し、同レベルの最大増殖阻害を達成した。PEG−Q5C変異タンパク質の平均IC50は約22pg/mlであり、それは同一日に分析された野生型IFN−α2及び未修飾Q5Cタンパク質について決定されたIC50値の2倍以内であった(表5)。PEG−Q5Cタンパク質の生物活性は、非特異的なアミン反応性PEG試薬でPEG化されたrIFN−α2の生物活性よりも有意に大きかった。後者のタンパク質は、ダウジ細胞アッセイにおける164pg/mlというIC50を有している(Monkarshら,1997)。これらのデータを表5に要約する。
Claims (13)
- 単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、
前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンのC−Dループ及びヘリックスAのすぐ前の領域からなる群より選択されるタンパク質の領域に配置されるアミノ酸に結合されたポリエチレングリコールを含み、前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに応答して増殖する細胞系のインビトロでの増殖を刺激し、かつ
前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、110ng/ml未満のEC50を有する、単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。 - ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのC−Dループにあるアミノ酸に結合され、かつ前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、50ng/ml未満のEC50を有する、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスAのすぐ前の領域にあるアミノ酸に結合され、かつ前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、11ng/ml未満のEC50を有する、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 前記ポリエチレングリコールは直鎖ポリエチレングリコール及び分枝鎖ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 前記ポリエチレングリコールはシステイン反応性ポリエチレングリコールである、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 前記ポリエチレングリコールは、マレイミド−ポリエチレングリコール、ビニルスルホン−ポリエチレングリコール及びヨードアセチル−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項5に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は前記ヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合された少なくとも一つの付加チオール基を含む、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質であって、
a)ポリエチレングリコールが前記ヒト成長ホルモンタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸に結合する条件下にて同ヒト成長ホルモンタンパク質をポリエチレングリコールにさらす工程と、
b)前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって単PEG化されていないヒト成長ホルモンタンパク質から単離する工程と、
によって得られる、単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。 - 前記単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質は、分子ふるい分けカラムクロマトグラフィーによって測定された場合70kDaを超える見かけの分子量を有する、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 請求項1に記載の単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質を二つ以上含む、混合物。
- ヒト成長ホルモンを用いて治療可能な症状を治療するための医薬品の製造における、請求項1に記載の単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質の使用。
- 前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのC−Dループにあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
- 前記ポリエチレングリコールは、ヒト成長ホルモンのヘリックスAのすぐ前の領域にあるアミノ酸と置換されたシステイン残基に結合される、請求項1に記載の単離された単PEG化ヒト成長ホルモンタンパク質。
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