BR122013003013B1 - Proteína isolada monopeguilada do hormônio do crescimento e método para sua obtenção - Google Patents

Description

"PROTEÍNA ISOLADA MONOPEGUILADA DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO E MÉTODO PARA SUA OBTENÇÃO”.

Dividido do PI 0008759-9 depositado em 14/01/2000. A presente invenção refere-se a um método para a ligação da metade PEG à proteína solúvel, para formar proteínas PEGuiladas, nas quais a metade PEG é ligada à proteína solúvel através da cisteína livre. Proteínas multiméricas de maior ordem, que envolvem o acoplamento de duas ou mais proteínas solúveis também estão no escopo da presente invenção. A presente invenção também refere-se as proteínas solúveis e seus derivados, incluindo as proteínas PEGuiladas, feitas pelos métodos ora revelados. Essas proteínas PEGuiladas incluem o hGH monoPEGuilado, o EPO e o alfa interferon. A presente invenção também inclui métodos para PEGuilação das proteínas solúveis obtidas pelos métodos ora descritos. Esses métodos incluem a purificação da proteína, a redução pelo menos parcial da proteína com um agente redutor de dissulfeto e a exposição da proteína a um meio cisteinoreativo. Opcionalmente, a proteína cisteína modificada pode ser isolada a partir da proteína não modificada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Histórico da Invenção Existe um considerável interesse por parte de pacientes e dos provedores médicos no desenvolvimetno de uma terapêutica de proteína de baixo custo, longa ação e “amiga do usuário”. As proteínas têm fabricação cara e, diferentemente de medicamentos convencionais de pequenas moléculas, não são prontamente absorvidas pelo corpo. Mais ainda, são digeridas se forem tomadas de forma oral. Portanto, as proteínas devem ser normalmente admistradas através de injeções. Após a injeção, a maioria das proteínas é rapidamente eliminada do corpo, necessitando injeções frequentes, normalmente diárias. Os pacientes não gostam das injeções, o que leva a uma reduzida observância e reduzida eficiência do medicamento. Algumas proteínas como a eritropoietina (EPO) são efetivas quando administradas menos frequentemente (três vezes por semana para EPO), porém, isso se deve ao fato de que as proteínas são glicosiladas. A glicosilação exige que as proteínas recombinantes sejam fabricadas usando sistemas de expressão de células de mamíferos, o que se torna caro e aumenta o custo dos produtos farmacêuticos das proteínas.

Assim, existe uma grande necessidade para o desenvolvimento de tecnologia de fabricação de proteínas que reduzam os custos da terapêutica da proteína para os pacientes e para os provedores médicos. Uma solução para esse problema é o desenvolvimento de métodos que prolonguem as meias-vidas de circulação da terapêutica de proteínas no corpo, de forma que as proteínas não tenham que ser injetadas frequentemente. Essa solução também satisfaz as necessidades e os desejos de pacientes, já que as terapêuticas de proteínas são “amigas do usuário”, isto é, terapêuticas de proteínas que não exigem injeções frequentes. A modificação covalente de proteínas com polietilenoglicol (PEG) provou ser um método útil para a extensão das meias-vidas de circulação de proteínas no corpo (Abuchowski et al; 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al; 1991). A ligação covalente do PEG à proteína aumenta o tamanho efetivo da proteína e reduz sua taxa de clearance do corpo. Os PEGs são disponíveis comercialmente em vários tamanhos, permitindo que as meias-vidas de circulação das proteínas modificadas com PEG sejam dimensionadas para as indicações individuais através do uso de PEGs de diferentes tamanhos. Outros benefícios documentados in vivo da modificação PEG, são um aumento na solubilidade da proteína, estabilidade (possivelmente devido a proteção da proteína das proteases) e uma redução na imunogenicidade da proteína (Katre et al; 1987; Katre, 1990).

Um método conhecido para proteínas PEGuiladas usa compostos como a N-hidroxi succinimida (NHS)-PEG para ligar o PEG a aminas livres, comumente em resíduos de lisina ou nos aminoácidos N-terminais. Uma grande limitação dessa abordagem é que a proteína contém comumente várias lisinas, além do aminoácido N-terminal e a metade do PEG se liga à proteína de forma não específica em qualquer das aminas livres disponíveis, resultando em uma mistura de produto heterogêneo. Muitas das proteínas NHS-PEGuiladas não são adequadas para o uso comercial, devido às baixas atividades específicas e heterogeneidade. Resultados de inativação da modificação covalente de um ou mais resíduos de lisina ou dos aminoácidos N-terminais necessários para a atividade biológica ou de ligação covalente da metade PEG perto do local ativo da proteína.

De particular relevância para essa aplicação, é a descoberta que a modificação do hormônio do crescimento humano (hGH) com reagentes amino-reativos, incluindo os reagentes NHS-PEG, reduz a atividade biológica da proteína em mais de 10 vezes (Teh and Chapman, 1988; Clark et al; 1996). O GH é uma proteína 22 kDa secretada pela glândula pituitária. O GH estimula o metabolismo ósseo, das cartilagens e músculos sendo o hormônio primário do corpo para a estimulação do crescimento somático durante a infância. O GH humano recombinante (rhGH) é usado para o tratamento da baixa estatura resultante da inadequação do GH, da Síndrome de Turner e da insuficiência renal em crianças. O GH não é glicosilado, sendo totalmente ativo quando produzido em bactéria. A proteína tem uma curta meia-vida in vivo e deve ser administrada através de injeções subcutâneas diárias para atingir efetividade máxima (MacGillivray et al; 1996).

Existe um considerável interesse no desenvolvimento de formas de longa ação de hGH. Tentativas para a criação de formas de longa ação de hGH através da PEGuilação da proteína com reagentes PEG amino-reativos tiveram sucesso limitado, devido a reduções significativas na bioatividade na PEGuilação. Além disso, a proteína se torna PEGuilada em vários locais (Clark et al; 1996). O hGH contém nove lisinas, em adição ao aminoácido N-terminal. Algumas dessas lisinas estão localizadas em regiões da proteína conhecida como sendo crítica para a ligação do receptor (Cunningham et al; 1989); Cunningham and Wells, 1989). A modificação desses resíduos de lisina reduz significativamente a ligação do recptor e a bioatividade da proteína (de Ia Llosa et al; 1985; Martal et al; 1985; Teh and Chapman, 1988; Cunningham and Wells, 1989). O hGH é prontamente modificado pelos reagentes NHS-PEG, porém a atividade biológica da proteína NHS-PEG fica muito comprometida, representando somente 1% da atividade biológica do GH do tipo silvestre para uma proteína GH modificada com cinco moléculas 5kDa PEG (Clark et al; 1996). O EC50 dessa proteína GH multiplamente PEGuilada é de 440 ng/ml ou de aproximadamente 20 nM (Clark et al; 1996). Além de ter a atividade biológica significativamente reduzida, o NHS-PEG-hGH é muito heterogêneo devido aos diferentes números de moléculas PEG ligadas à proteína e em diferentes resíduos aminoácidos o que têm um impacto em sua utilidade como terapêutica potencial. Clark et al. (1996) mostrou que a meia-vida de circulação do NHS-PEG-hGH em animais é significativamente prolongada com relação ao GH não modificado. Apesar de possuir atividade biológica in vitro significativamente reduzida, o NHS-PEG-hGH foi efetivo e pôde ser administrado menos frequentemente do que o hGH não modificado em modelo de rato com deficiência GH (Clark et al; 1996). Entretanto, altas doses de NHS-PEG-hGH (60-180 pg por injeção por rato) foram necessárias para a eficácia nos modelos animais, devido à baixa atividade específica da proteína modificada. Existe uma clara necessidade de melhores métodos para criar proteínas hGH PEGuiladas que retenham maior bioatividade. Existe também uma necessidade do desenvolvimento de métodos para o hGH PEGuilado, de forma que crie um produto PEG-hGH homogêneo.

As atividades biológicas de várias outras proteínas comercialmente importantes são significativamente reduzidas pelos reagentes PEG amino-reativos. O EPO contém vários resíduos de lisina que são críticos para a bioatividade da proteína (Boissel et al; 1993; Matthews et al; 1996) e a modificação dos resíduos de lisina em EPO resulta na perda quase completa da atividade biológica (Wojchowski and Caslake, 1989). A modificação covalente de alfa-interferon-2 com PEGs amino-reativos resulta em 40-75% de perda de bioatividade (Goodson and Katre, 1990; Karaslewicz et al; 1995). A perda de atividade biológica é maior com grandes PEGs (exemplo de 10 kDa) ( Karasiewicz et al; 1995). A modificação covalente de G-CSF com PEGs amino-reativos resulta em perda de atividade biológica maior que 60% (Tanaka et al; 1991). A modificação extensiva de IL-2 com PEGs amino-reativos resulta uma perda de bioatividade maior que 90% (Goodson and Katre, 1990).

Um segundo método conhecido para a PEGuilação de proteínas liga de forma covalente o PEG a resíduos de cisteína usando PEGs cisteíno-reativos. Existe no comércio um número de PEGs altamente específicos, cisteíno-reativos, com diferentes grupos reativos (exemplo, maleimida, vinilsulfona) e PEGs de diferentes tamanhos (2-40 kDA). Em pH neutro, esses reagentes PEG se ligam, de maneira seletiva, a resíduos de cisteína “livres”, isto é, resíduos de cisteína não envolvidos em ligações de dissulfeto. Os resíduos de cisteína, na maioria das proteínas, participam das ligações de dissulfeto e não estão disponíveis para PEGuilação usando PEGs cisteíno-reativos. Através de Mutagênese in vitro, usando técnicas de DNA recombinante, podem ser introduzidos outros resíduos de cisteína em qualquer lugar na proteína. As cisteínas “livres” recém-adicionadas podem servir como locais para a ligação específica de uma molécula PEG usando PEGs cisteíno-reativos. O resíduo de cisteína adicionado pode ser uma substituição para um aminoácido existente em uma proteína, adicionado antes do amino-término da proteína ou após o carboxi-término da proteína, ou inserido entre dois aminoácidos na proteína. De maneira alternativa, uma das duas cisteínas envolvidas em uma ligação nativa de dissulfeto pode ser eliminada ou substituída por outro aminoácido, deixando livre uma cisteína nativa (o resíduo de cisteína na proteína que normalmente formaria uma ligação de dissulfeto com o resíduo de cisteína eliminado ou substituído) e disponível para modificação química. De preferência, o aminoácido substituído, já que a cisteína seria um aminoácido neutro como a serina ou a alanina. O hormônio do crescimento tem duas ligações de dissulfeto que podem ser reduzidas e alquiladas com iodoacetimida, sem comprometer a atividade biológica (Bewley et al; 1969). Todas as quatro cisteínas seriam razoáveis alvos para eliminação ou substituição por outro aminoácido. Várias proteínas de ocorrência natural são conhecidas por conterem um ou mais resíduos de cisteína “livres”. Os exemplos dessas proteínas de ocorrência natural incluem a Interleucina humana (IL)-2, o beta interferon (Mark et al; 1984), G-CSF (Lu et al; 1989) e fator básico de crescimento fibroblasto (Thompson, 1992). O IL-2, o G-CSF e o beta interferon contém um estranho número de resíduos de cisteína, considerando que o fator básico de crescimento fibroblasto contém um número igual de resíduos de cisteína.

Entretanto, a expressão das proteínas recombinantes que contém resíduos livres de cisteína tem sido problemática, devido à reatividade do sulfidril livre em condições fisiológicas. Várias proteínas recombinantes contendo cisteínas livres têm sido expressas como proteínas intracelulares em bactérias do tipo E. coli. Os exemplos incluem proteínas naturais como a IL-2, beta interferon, G-CSF, fator básico de crescimento fibroblasto e cisteínas muteínas manipuladas de IL-2 (Goodson and Katre, 1990), IL-3 (Shaw et al; 1992), Proteína de Ligação do Fator de Necrose Tumoral (Tuma et al; 1995), IGF-I (Cox and McDermott, 1994), IGFBP-1 (Van Den Berg et al; 1997) e protease nexina e proteínas relacionadas (Braxton, 1998). Todas essas proteínas foram insolúveis quando expressas intracelularmente em bactéria. As proteínas insolúveis puderam ser redobradas em suas conformações nativas através da realização de uma série de desnaturação, redução e procedimentos de redobramento. Essas etapas adicionam tempo e custos ao processo de fabricação das proteínas em bactérias. Foram obtidas estabilidade melhorada e produções de IL-2 (Mark et al; 1985) e beta interferon (DeChiara et al; 1986) pela substituição de outro aminoácido, por exemplo, a serina para o resíduo de cisteína livre. Seria preferível expressar as proteínas recombinantes em uma forma solúvel e biologicamente ativa para a eliminação dessas etapas adicionais.

Um método conhecido para expressar as proteínas recombinantes solúveis em bactéria, é secretá-las em um espaço periplásmico ou no meio. É sabido que certas proteínas recombinantes como o GH são expressas em uma forma ativa solúvel quando são secretadas no periplasma da E. co//, considerando que são insolúveis quando expressas intracelularmente na E. coli. A secreção é conseguida pela fusão das sequências de DNA que codificam o hormônio do crescimento ou outras proteínas de interesse para sequências de DNA que codificam as sequências de sinal bacteriano como as derivadas do stll (Fujimoto et al; 1988) e proteínas ompA (Ghrayeb et al; 1984). A secreção de proteínas recombinantes na bactéria é desejável, já que o N-término natural da proteína recombinante pode ser mantido. A expressão intracelular das proteínas recombinantes exige que uma metionina N-terminal esteja presente no amino-término da proteína recombinante. A metionina não está normalmente presente no amino-término das formas maduras de muitas proteínas humanas. Por exemplo, o aminoácido amino- terminal da forma madura do hormônio do crescimento humano é a fenilalanina. Deve ser adicionada uma metionina amino-terminal ao amino-término de uma proteína recombinante caso não existir uma metionina nessa posição, de forma que a proteína seja expressa eficientemente na bactéria. Normalmente, a adição da metionina amino-terminal é conseguida pela adição de um codon de metionina ATG precedendo a sequência de DNA que codifica a proteína recombinante. A metionina N-terminal adicionada geralmente não é removida da proteína recombinante, particularmente se a proteína recombinante for insolúvel. Esse é o caso do hGH, em que a metionina N-terminal não é removida quando a proteína é expressa intracelularmente em E. coli. A metionina N-terminal adicionada cria uma proteína “não natural” que pode estimular potencialmente uma resposta imune em uma pessoa. Em contraste, não existe metionina adicionada em hGH que seja secretada no espaço periplásmico usando sequência de sinais stll (Chang et al; 1987) ou ompA (Cheah et al; 1994); a proteína recombinante inicia com a fenilalanina do aminoácido amino-terminal. A sequência da proteína hGH nativa é mantida, porque as enzimas bacterianas clivam a proteína stll-hGH (ou proteína ompA-hGH) entre a sequência de sinais stll (ou ompA) e o início da proteína hGH madura. Como se acredita que o espaço periplásmico seja um ambiente oxidante que deve promover a formação de ligações de dissulfeto, a co-expressão da isomerase de dissulfeto da proteína com o inibidor de tripsina pancreática bovina resultou em um aumento de seis vezes na produção da proteína corretamente dobrada a partir do periplasma E. coli (Ostermeier et al; 1996). Esse resultado sugere que o dobramento da proteína periplásmica pode, por vezes, ser ineficiente e necessita aperfeiçoamentos para a produção de proteínas em grande escala. O hGH possui quatro cisteínas que formam dois dissulfetos. O hGH pode ser secretado no periplasma E.coli usando as sequências de sinal stll ou ompA. A proteína secretada é solúvel e biologicamente ativa (Hsiung et al; 1986). A forma predominantemente secretada de hGH é um monômero com um peso molecular aparente de 22 kDa por eletroforese de gel poliacrilamida sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE). O hGH recombinante pode ser isolado do espaço periplásmico pelo uso de um procedimento de choque osmótico (Koshland and Botstein, 1980), que preferencialmente libera as proteínas periplásmicas, mas não as intracelulares, no tampão de choque osmótico. A proteína hGH liberada é então purificada por cromatografia de coluna (Hsiung et al; 1986).

Quando foram tentados procedimentos similares para secretar variantes de hGH que continham resíduo de cisteína livre (cinco cisteínas; 2N+1), descobriu-se que as variantes do hGH recombinante formaram multímeros e agregados quando isoladas usando o choque osmótico padrão e procedimentos de purificação desenvolvidos para o hGH. Muito poucas proteínas variantes de hGH monomérico puderam ser detectadas por SDS-PAGE não reduzido nos lisados de choque osmótico ou durante a purificação das proteínas por cromatogradia de coluna. O Alfa interferon (IFN- a2) também contém quatro resíduos de cisteína que formam duas ligações de dissulfeto. O IFN- a2 pode também ser secretado no periplasma E. coli usando a sequência de sinais stll (Voss et al; 1994). A proteína secretada é solúvel e bilogicamente ativa (Voss et al; 1994). A forma predominante secretada do IFN- a2 é um monômero com um peso molecular aparente de 19 kDa por SDS-PAGE. O IFN- a2 recombinante secretado pode ser purificado por cromatografia de coluna (Voss et al; 1994).

Quando são tentados procedimentos similares para secretar variantes IFN- a2 contendo um resíduo de cisteína livre (cinco cisteínas; 2N+1), foi descoberto que as variantes do IFN-a2 recombinante formavam multímeros e agregados quando isoladas, usando procedimentos padrão de purificação desenvolvidas para o IFN- a2. As variantes IFN- a2 eluíram das colunas de forma muito diferente do IFN- a2 e muito poucas das proteínas variantes IFN- a2 monoméricas puderam ser purificadas usando os procedimentos de cromatografia de coluna desenvolvidos para IFN- a2.

Um método alternativo para a sintetização de uma proteína contendo resíduo de cisteína livre, é o de introduzir um grupo tiol em uma proteína pós-translacionalmente através de uma reação química com succinimidil 6-[3-2-piridilditio) propionamido] hexanoato (LC-SPDP, comercialmente disponível na Pierce Chemical Company). O LC-SPDP reage com os resíduos de Lisina para criar um grupo de sulfidril livre. O EPO dimérico com ligação cruzada quimicamente foi preparado usando esse reagente em conjunto com um reagente modificador de proteína maleimida (Sytkowsk et al; 1998). Foi recuperada uma mistura heteróloga de proteínas EPO com ligação cruzada quimicamente após a purificação, devido à modificação não específica dos vários resíduos de lisina no EPO. Foi observada uma farmacocinética e potência in vivo aumentadas das proteínas EPO com ligação cruzada quimicamente.

Outro método que foi usado para aumentar o tamanho de uma proteína e melhorar sua potência in vivo, envolve a dimerização da proteína usando reagentes químicos de ligação cruzada. Acredita-se que o GH transduza um sinal celular pela ligação cruzada de dois receptores GH. Um dímero GH-GH pode facilitar a dimerização ampliada do receptor e a subsequente amplificação do sinal intracelular.

Mockridge et al. (1998) descreveu as proteínas hGH diméricas com ligação cruzada quimicamente. Usando um reagente de ligação cruzada solúvel em água 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), o GH foi derivado randomicamente a fim de fornecer predominantemente dímeros com ligação amida, mas também multímeros com ligação amida, dependendo da concentração do reagente EDC usado. Com foi observado um aumento na potência in vivo, a preparação da proteína final foi heterogênea devido à reação não específica do reagente EDC com vários aminoácidos na proteína, incluindo resíduos de lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico e terminais amino e carboxi. A injeção dessa preparação em humanos seria indesejável, devido à natureza tóxica do EDC, a resposta imunogênica potencial à ligação amida não natural formada entre as proteínas. Seria também difícil a geração de lotes consistentes de proteína purificada em escala de produção.

Portanto, apesar do considerável esforço, ainda existe a necessidade de um processo para a geração de preparações homogêneas de proteínas recombinantes de longa ação pela ampliação do peso molecular da proteína. Existe também a necessidade de métodos que permitam a secreção e a recuperação de proteínas recombinantes que contenham resíduos de cisteína livre em alta produção. A presente invenção satisfaz essas necessidades e fornece também as vantagens relativas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a ligação da metade PEG à proteína solúvel, para formar proteínas PEGuiladas, nas quais a metade PEG é ligada à proteína solúvel através da cisteína livre. Proteínas multiméricas de maior ordem, que envolvem o acoplamento de duas ou mais proteínas solúveis também estão no escopo da presente invenção. A presente invenção também refere-se a proteínas solúveis e seus derivados, incluindo as proteínas PEGuiladas, feitas pelos métodos ora revelados. Essas proteínas PEGuiladas incluem o hGH monoPEGuilado, o EPO e o alfa interferon. A presente invenção também inclui métodos para a PEGuilação das proteínas solúveis obtidas pelos métodos ora descritos. Esses métodos incluem a purificação da proteína, a redução pelo menos parcial com um agente redutor de dissulfeto e a exposição da proteína a um meio cisteíno reativo. Opcionalmente, a proteína cisteína modificada pode ser isolada a partir da proteína não modificada.

Também constam da presente invenção os métodos para o tratamento das condições que possam ser tratadas com o hormônio do crescimento, EPO e alfa interferon. As proteínas solúveis ou seus derivados, incluindo os derivados PEGuilados, são administrados aos pacientes que sofrem de condições com tratamento efetivo pelo hormônio do crescimento, EPO ou alfa interferon.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS DA INVENÇÃO A presente invenção ainda provê novos métodos para a produção de interferon solúvel, particularmente do alfa interferon, o que resulta em um aumento significativo na porcentagem do interferon recuperado que foi adequadamente processado. Esses métodos incluem a cultura de células hospedeiras capazes de expressar o interferon em uma faixa de pH de cerca de 5 a 6,5 e preferencialmente entre 5,5 e 6,5. Relatórios publicados (Voss et al. (1994) usando um pH mais alto somente resultaram em 50% de interferon processado adequadamente, considerando que os novos métodos da presente invenção em pHs mais baixos recuperaram cerca de 80-90%.

Foi feita uma descoberta sobre certas variantes de cisteína hGH monoméricas que formam proteínas hGH diméricas com ligação de dissulfeto durante os procedimentos de cromatografia usados para purificar essas proteínas. Os dímeros hGH com ligação de dissulfeto se formaram quando a cistina foi removida dos tampões de coluna. Foram desenvolvidos novos procedimentos para purificar as proteínas hGH diméricas com ligação de dissulfeto porque essas proteínas se comportavam diferentemente das proteínas hGH monoméricas durante as etapas de cromatografia de coluna usadas para purificar as proteínas. De maneira não esperada, descobriu-se que as proteínas hGH diméricas com ligação de dissulfeto eram biologicamente ativas nos bioensaios in vitro. As proteínas hGH diméricas com ligação de dissulfeto biologicamente ativas e homogêneas são novas. Assim, a presente invenção ainda se relaciona a essas proteínas hGH diméricas, biologicamente ativas, homogêneas e também com revestimento de dissulfeto. Os multímeros de maiores ordens também foram contemplados, incluindo trímeros, tetrâmeros e similares, como descritos nos exemplos abaixo.

As proteínas purificadas podem ser ainda mais processadas, se desejado. Por exemplo, as proteínas podem ser PEGuiladas no local da cisteína livre com vários reagentes PEG cisteíno-reativos e subsequentemente purificadas como proteínas monPEGuiladas. O termo “monoPEGuiladas” é definido para significar uma proteína modificada por ligação covalente de uma única molécula PEG em um local específico da proteína. Qualquer método conhecido pelos peritos na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, os métodos descritos nos exemplos abaixo.

Braxton (1998) ensina métodos para PEGuilar as cisteínas muteínas de proteínas, e em particular cisteínas muteínas de GH e eritropoietina. Braxton (1998) ensina de maneira específica que os tampões usados para PEGuilar as cisteínas muteínas não devem conter um agente redutor. Os exemplos de agentes redutores fornecidos por Braxton (1998) são o beta-mercaptoetanol (BME) e o ditiotreitol (DTT). Quando procedimentos similares foram usados para PEGuilar cisteínas muteínas de GH, eritropoietina e alfa interferon, foi descoberto que as cisteínas muteínas não realizam a PEGuilação.

Foi agora descoberto que o tratamento das cisteínas muteínas purificadas com um agente redutor é necessário para que as proteínas realizem a PEGuilação. Apesar de não desejar se ater a nenhuma teoria em particular, os inventores acreditam que ao agente redutor é necessário para reduzir o dissulfeto misto e expor o resíduo de cisteína livre na proteína, de forma que a cisteína livre possa reagir com o reagente PEG. Assim, a presente invenção também se realciona com métodos para a PEGuilação de cisteínas muteínas GH, eritropoietina, alfa interferon e outras proteínas que contenham 2N+1 resíduos de cisteína, proteínas contendo 2N resíduos de cisteína, em que dois ou mais resíduos de cisteína são livres, particularmente aquelas muteínas e proteínas onde o resíduo de cisteína livre é bloqueado por um dissulfeto misto. A presente invenção ainda se relaciona a variantes de proteínas monoPEGuiladas purificadas produzidas pelos métodos ora revelados, que não são somente biologicamente ativos, mas que também retém alta atividade específica em ensaios proteíno-dependentes de proliferação de células de mamíferos. Essas variantes de proteínas incluem, por exemplo, as seguintes cisteínas muteínas monoPEGuiladas purificadas: hGH, EPO e alfa IFN. Por exemplo, as atividades biológicas in vitro das variantes hGH monoPEGuiladas foram de 10 a 100 vezes maiores que a atividade biológica do hGH que foi PEGuilado usando reagentes NHS-PEG.

Em uma configuração do hGH monoPEGuilado o polietilenoglicol é ligado a loop C-D de hGH, e o hGH monoPEGuilado resultante tem um EC50 menor que cerca de 110 ng/ml (5 nM), preferivelmente menos do que 50 ng/ml (2.3 nM). De forma alternativa, o meio polietilenoglicol pode ser ligado a uma região próxima à Hélice A de hGH, e o hGH monoPEGuilado resultante tem um EC50 inferior a cerca de 110 ng/ml (5nM), preferivelmente menor que 11 ng/ml (0,5nM), e preferivelmente menor que cerca de 2.2 ng/ml (0.1 nM).

Em uma configuração do EPO monoPEGuilado, o polietilenoglicol é ligado ao loop C-D de EPO, e ο EPO monoPEGuilado resultante tem um EC50 menor que 1000 ng/ml (21 nM), preferivelmente menor que 100 ng/ml (aproximadamente 6 nM), mais preferivelmente menor que 10 ng/ml (aproximadamente 0.6 nM) e mais preferivelmente menor que 1 ng/ml (aproximadamente 0.06 nM). De forma alternativa, o meio polietilenoglicol pode ser ligado ao loop A-B de EPO, e o EPO monoPEGuilado resultante tem um EC50 inferior a cerca de 100 ng/ml (aproximadamente 5nM), preferivelmente menor que 20 ng/ml (aproximadamente 1 nM), e mais preferivelmente menor que 1 ng/ml (aproximadamente 0,05 nM).

Em uma configuração do IFN alfa monoPEGuilado, o polietilenoglicol é ligado à região próxima à Hélice A do IFN alfa, e o IFN alfa monoPEGuilado resultante tem um IC50 inferior a cerca de 100 pg/ml (aproximadamente 5 pM), mais preferivelmente menor que 50 pg/ml (aproximadamente 2,5 pM) e mais preferivelmente cerca de 22 ng/ml (aproximadamente 1,2 pM). De forma alternativa, o meio polietilenoglicol pode ser ligado ao loop C-D de IFN-a2, e o IFN-a2 monoPEGuilado resultante tem um EC50 menor que cerca de 100 pg/ml (aproximadamente 5 pM).

Existem cerca de 25 genes IFN-α distintos (Pestka et al; 1987). Os membros da família IFN-α compartilham vários graus de homologia de aminoácidos e exibem conjuntos sobrepostos de atividades biológicas. Os IFN-as recombinantes não-naturais criados através de uniões de regiões de diferentes proteínas IFN-α estão nos vários estágios de desenvolvimento clínico (Horisberger and DiMarco, 1995). Foi também descrito um interferon “de consenso” não-natural (Blatt et al; 1996), que incorpora o aminoácido mais comum em cada posição de IFN-α. Os locais adequados para a PEGuilação de cisteínas muteínas de IFN-a2 devem ser diretamente aplicáveis a outros membros da família de genes IFN-α e aos IFN-as não-naturais. Kinstler et al; (1996) descreveu um interferon de consenso monoPEGuilado, no qual a proteína é preferencialmente monoPEGuilada no resíduo não-natural N-terminal. A bioatividade da proteína PEGuilada foi reduzida em aproximadamente 5 vezes relativamente ao interferon de consenso não-modificado (Kinstler et al; 1996). A presente invenção ainda provê variantes de proteínas que podem ser ligadas de forma covalente ou conjugadas entre si ou a um grupo químico para produzirem multímeros de maiores ordens, tais como dímeros, trímeros e tetrâmeros. Esses multímeros de maiores ordens podem ser produzidos de acordo com os métodos conhecidos pelos peritos na técnica ou como descritos no Exemplo 15 abaixo. Por exemplo, tal conjugação pode produzir uma adução hGH, EPO ou alfa IFN tendo um maior peso molecular do que a correspondente proteína nativa. Os grupos químicos adequados para a ligação são, preferivelmente, não-tóxicos e não-imunogênicos. Esses grupos químicos incluiriam os carboidratos e os polímeros como os polióis.

A “metade PEG”, útil para a ligação das variantes de cisteína da presente invenção para a formação de proteínas “PEGuiladas” inclui qualquer polímero adequado, por exemplo, um poliol de cadeia linear ou derivada. Um poliol preferido é o polietilenoglicol, que é um polímero sintético composto por unidades óxido etileno. As unidades óxido etileno podem variar de forma que as variantes da proteína PEGuilada possam ser obtidas com pesos moleculares aparentes por cromatografia por exclusão de tamanho variando entre 30-500.000. O tamanho da metade PEG impacta diretamente em sua meia-vida de circulação Yamaoka et al. (1994). Assim, poderia-se manipular variantes de proteínas com diferentes meias-vidas de circulação para aplicações terapêuticas específicas ou regimes preferidos de dosagem, variando o tamanho ou a estrutura do meio PEG. Portanto, a presente invenção engloba as variantes de proteína GH com peso molecular aparente maior que cerca de 30 kDa, e mais preferivelmente maior que cerca de 70 kDa, como determinado na cromatografia por exclusão de tamanho, com um EC50 menor que cerca de 400 ng/ml (18 nM), preferivelmente menor que 10 ng/ml (5 nM), mais preferivelmente menor que cerca de 10 ng/ml (0,5 nM), e ainda mais preferivelmente menor que cerca de 2,2 ng/ml (0,1 nM). A presente invenção ainda engloba as variantes de proteína EPO dotadas de um peso molecular aparente maior que cerca de 30kDa, e mais preferivelmente maior que cerca de 70 kDa, como determinado pela cromatografia por exclusão de tamanho, com um EC50 menor que cerca de 1000 ng/ml (21 nM), preferivelmente menor que 100 ng/ml (6 nM), mais preferivelmente menor que cerca de 10 ng/ml (0,6 nM), e ainda mais preferivelmente menor que cerca de 1 ng/ml (0,06 nM). A presente invenção ainda engloba as variantes da proteína alfa IFN (IFN-α) dotadas de um peso molecular aparente maior que cerca de 30 kDa, e mais preferivelmente maior que cerca de 70 kDa como determinado na cromatografia por exclusão de tamanho, com um IC50 menor que cerca de 1900 pg/ml (100 pM), preferencialmente menor que 400 pg/ml (21 pM), mais preferivelmente menor que 100 pg/ml (5nM), e ainda mais preferivelmente menor que cerca de 38 pg/ml (2 pM). O grupo final PEG reativo para a modificação de cisteína inclui, mas não está limitado, a vinilsulfona, a maleimida os meios iodoacetil. O Grupo final PEG deve ser específico para tióis livres com a reação ocorrendo sob condições que não prejudiquem a proteína.

As variantes hGH antagonistas também podem ser preparadas usando o GH variante com cisteína adicionada, em que a derivação química não interfere com a ligação do receptor, mas impede o processo de sinalização. As condições que se beneficiariam pela administração de um antagonista GH incluem a agromegalia, doenças oculares vasculares, neuropatia diabética, restenose acompanhada de malignidades responsivas de angioplastia e do hormônio do crescimento.

Como ora usado, o termo “derivação” se refere a qualquer variante de uma proteína expressa e recuperada pelos presentes métodos. Essas variantes incluem, mas não estão limitadas, às versões PEGuiladas, dímeros e outras variantes de maiores ordens, variantes de aminoácidos, proteínas de fusão, alterações de carboidratos, fosforilação e outros grupos de ligação encontrados nas proteínas naturais, e outras variantes ora reveladas.

Os compostos produzidos pelos presentes métodos podem ser usados para uma variedade de usos in vitro e in vivo. As proteínas e seus derivados da presente invenção podem ser usados para pesquisas, diagnósticos e outros propósitos terapêuticos que são conhecidos em suas contra-partes do tipo silvestre, natural ou modificada com conhecimento anterior. Os usos in vitro incluem, por exemplo, o uso da proteína para triagem, detecção e/ou purificação de outras proteínas.

Para usos terapêuticos, os peritos na técnica podem prontamente determinar a dose adequada, a frequência de dosagem e a via de administração. Os fatores para essa determinação incluem, sem limitações, a natureza da proteína a ser administrada, a condição a ser tratada, a conformidade potencial do paciente, a idade e o peso do paciente e afins. Os compostos da presente invenção podem também ser usados como veículos de administração para a ampliação da meia-vida de circulação da terapêutica que estiver correlacionada ou para direcionar a administração a um alvo específico no corpo.

Os exemplos a seguir não pretendem ser limitativos, porém servir somente como ilustrações das configurações específicas da invenção. As referências ora citadas foram incorporadas a partir da patente dividida inicial.

Exemplo 1 - Métodos Gerais para a PEGuilacão e a Purificação de Cisteínas Muteínas As muteínas GH podem ser PEGuiladas usando uma variedade de reagentes PEG-maleimidas (ou PEG-vinilsulfona) cisteína-reativos, comercialmente disponíveis. Em geral, os métodos para PEGuilar as proteínas com esses reagentes serão similares aos descritos em WO 9412219 (Cox and McDermott) e WO 9422466 (Cox and Russell), ambos incorporados ao presente como referência, com pequenas modificações. As proteínas recombinantes são geralmente parcialmente reduzidas com ditiotreitol (DTT), Tris (2-carboxietil) fosfina-HCL (TCEP) ou outro agente redutor, de maneira a atingir a PEGuilação ideal da cisteína livre. A cisteína livre é relativamente não reativa aos PEGs cisteíno-reativos, a menos que essa etapa de redução parcial seja realizada. A quantidade necessária de agente redutor para reduzir parcialmente cada muteína pode ser empiricamente determinada, usando uma gama de concentração de agentes redutores em diferentes pHs e temperaturas. As concentrações dos agentes redutores variam tipicamente de 0,5 molar igual a 10 vezes em excesso. As temperaturas de preferência são 4°C a 37°C. O pH pode variar entre 6,5 e 9,0, porém deve estar preferivelmente entre 7,5 a 8,5. As condições ideiais também variarão dependendo do redutor e do tempo de exposição. Sob condições adequadas, os dissulfetos menos estáveis (tipicamente os dissulfetos intermoleculares e os dissulfetos misturados) são rompidos primeiramente do que os dissulfetos nativos termodinamicamente estáveis. Tipicamente, um excesso molar de 5-10 vezes de DTT por 30 minutos à temperatura ambiente, é efetivo. A redução parcial pode ser detectada por uma pequena alteração no perfil de eluição da proteína a partir de uma coluna de fase reversa. No caso de um hGH dimérico, é visível uma alteração do peso molecular por análise sob condições não redutoras. Deve ser tomado cuidado para não super-reduzir a proteína e expor os resíduos adicionais de cisteína. A super-redução pode ser detectada por HPLC de fase reversa (a proteína super-reduzida terá um tempo de retenção similar ao da proteína totalmente reduzida e desnaturada) e pela aparência das moléculas GH contendo dois PEGs que seguem a reação de PEGuilação (detectável por uma alteração de peso molecular em SDS-PAGE). O GH do tipo silvestre pode servir como controle, já que não deve PEGuilar sob condições que não reduzam os dissulfetos intramoleculares nativos. O agente redutor de excesso pode ser removido antes da PEGuilação por cromatografia por exclusão de tamanho ou por diálise. O TCEP não precisa ser removido antes da adição do reagente de PEGuilação, já que não contém um grupo tiol livre. A proteína parcialmente reduzida pode reagir com várias concentrações de PEG-maleimidas ou PEG- vinilsulfonas (tipicamente razões molares PEG: proteína de 1:1, 5:1, 10:1 e 50:1) para determinar a razão ideal dos dois reagentes. A PEGuilação da proteína pode ser monitorada por uma alteração do peso molecular, por exemplo, usando SDS-PAGE. A menor quantidade de PEG que proporciona quantidades significativas de produto monoPEGuilado sem produzir produto di-PEGuilado é tipicamente considerada ideal (80% de conversão para produto monoPEGuilado é geralmente considerada boa). Geralmente, a proteína monoPEGuilada pode ser purificada a partir de proteína não-PEGuilada e PEG não reagido por exclusão de tamanho, troca iônica, afinidade, fase reversa, ou cromatografia de interação hidrofóbica. Podem ser usados outros protocolos de purificação, como a extração orgânica de 2 fases ou a precipitação salina. A proteína PEGuilada purificada pode ser testada no ensaio de proliferação celular descrito no Exemplo 1, para determinar sua atividade específica.

Podem ser feitos experimentos para confirmar que a molécula PEG está ligada à proteína no local adequado. Isso pode ser feito por digestão química ou proteolítica do peptídeo PEGuilado (que terá um grande peso molecular) por exclusão de tamanho, troca iônica ou cromatografia de fase reversa, seguido por sequenciamento de aminoácido. O aminoácido PEG-acoplado aparecerá como vazio na operação de sequenciamento do aminoácido.

Exemplo 2 - Preparação e Purificação de PEG-T3C

Foi realizado um estudo preliminar de titulação para determinar o agente redutor adequado e as concentrações de reagente PEG, assim como para evitar a super- redução da proteína. Monitoramos a redução parcial da proteína por conversão de dímero para a espécie de monômero não reduzido em SDS-PAGE não redutor. Alíquotas de um pg do dímero T3C purificado foram incubadas com concentrações crescentes de TCEP por 60 minutos em temperatura ambiente. As reações foram imediatamente analisadas por SDS-PAGE não redutor. A quantidade de TCEP que produziu significativas quantidades de monômero T3C sem a super-redução ou desnaturação da proteína foi usada para subsequentes experimentos. O TCEP é um conveniente agente redutor para experimentos em pequena escala, porque não interfere com a reação de PEGuilação; assim, a proteína; mistura TCEP não teve que ser dializada antes da adição do PEG. Em maior escala, são preferidos agentes redutores de baixo custo, como o DTT para a redução de proteínas. Em geral, a proteína é tratada com um agente redutor por um tempo ideal. O pH da reação é então ajustado em 6,5 ou menor para limitar os rearranjos de dissulfeto. O agente redutor é retirado por diálise ou cromatografia líquida. O pH é então reajustado maior que 6,5, ou, de preferência 7,5 a 8,5 e o reagente PEG é adicionado.

Os experimentos de titulação em pH 7,5 indicaram que um excesso molar de cinco vezes de TCEP por 0 minutos em temperatura ambiente converteu a maior parte da espécie dímera T3C em monômero com adequada ligação dissulfeto, sem super-reduzir a proteína. Experimentos de controle indicaram que, como esperado, o dímero T3C precisou ser reduzido com TCEP para ser PEGuilado. Essas condições de reação foram então medidas em escala de reação de 100 pg. Foi adicionado um excesso molar de 10 vezes de 5 kDa maleimida-PEG (Fluka) à mistura T3C:TCEP após 10 minutos e reação de PEGuilação continuou por 60 minutos em temperatura ambiente. A amostra foi carregada rapidamente em uma coluna 1 ml Q-Sepharose equilibrada em 20 mM Tris-HCL, pH 8,0. A coluna foi lavada com 20 mM Tris-HCL, pH 8,0 e as proteínas ligadas eluíram com um gradiente salino linear crescente de 10 volumes de 0 a 250 mM NaCL em 20 mM Tris-HCL, pH 8,0. As frações contendo T3C monoPEGuilado (uma única molécula PEG ligada ao monômero T3C) foram identificadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Essas frações foram combinadas e guardadas congeladas. A presença da metade PEG reduz a afinidade da proteína com a resina, permitindo que a proteína PEGuilada se separe da proteína não PEGuilada.

Exemplo 3 - PEGuilacão de S144C e outras Cisteínas Muteínas Foi também feito um estudo preliminar de titulação para o S144C para determinar o agente redutor adequado, as concentrações de reagente PEG e para evitar a super-redução da proteína na forma descrita no Exemplo 12 para T3C. A PEGuilação em maior escala foi feita em pH 7,5 em temperatura ambiente por 2 h, usando um excesso molar de 2 vezes de TCEP e um excesso molar de 10 vezes de 5 kDa maleimida-PEG. A análise SDS-PAGE para a mistura da reação indicou algumas espécies com dois ou mais PEGs presentes. Esses foram separados do S144C monoPEGuilado, usando uma coluna Q-Sepharose como descrito no Exemplo 12. Separadamente, realizamos uma reação de PEGuilação usando 5 kDa vinilsulfona-PEG (Fluka), que resultou em S144C monoPEGuilado sob idênticas condições redutoras.

Também realizamos reações de PEGuilação em pequena escala em T148C, stp192C e T135C, e todas produziram proteína monoPEGuilada com 5 kDa maleimida-PEG e/ou vinilsulfona-PEG 5 kDa.

Exemplo 4 - Bioatividade das Proteínas PEG-T3C e PEG-S144C hGH a atividade biológica das proteínas PEG-T3C e PEG-S144C foi medida em ensaio de proliferação celular anterior. A proteína PEG-T3C mostrou uma curva dose-reposta similar à da proteína hGH pituitária e T3C não-PEGuilada e atingiu o mesmo nível de estimulação máxima. O valor EC50 médio da PEG-T3C foi de 1,6 ng/ml (0.07 nM) (valores de 1,3; 1,5; 1,7; 1,8 ng/ml em quatro experimentos). A bioatividade da proteína PEG-T3C é no mínimo 100 vezes maior que a da rhGH que foi PEGuilada usando reagentes NHS-PEG não específicos (EC50 de 440 ng/ml (20 nM) como descrito em Clark et al; (1996). O valor EC50 médio de PEG-S144C foi de 43 ng/ml (1 nM) (40 e 45 ng/ml em dois experimentos). A bioatividade da proteína PEG-S144C é de aproximadamente 10 vezes maior que o do rhGH que foi PEGuilado usando reagentes NHS-PEG não específicos (EC50 de 440 ng/ml (20 nM); Clark et al; 1996).

Exemplo 5 - Construção de Trímeros com Ligações de Dissulfeto e de Multímeros de hGH de Maiores Ordens com Ligações de Dissulfeto Outras variantes hGH dotadas de mais de uma cisteína “livre” podem ser construídas e usadas para a criação de multímeros de hGH de maiores ordens com ligações de dissulfeto. Esses multímeros podem incluir trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, septâmeros, octâmeros e quaisquer multímeros de maiores ordens.

Por exemplo, pode ser construída uma variante hGH dotada de dois resíduos de cisteína “livre” usando a tecnologia DNA recombinante, para recombinar os vetores plasmídeos DNA in vitro que portam mutações individuais de cisteína “livre”. De forma alternativa, a mutagênese de uma variante de cisteína hGH pode ser empregada para adicionar uma outra mutação de cisteína “livre”. Outras interações de qualquer um desses dois procedimentos podem ser usadas para construir variantes hGH dotadas de três ou mais cisteínas “livres”.

Uma variante hGH dotada de dois resíduos de cisteína “livre” pode ser usada para gerar trímeros hGH e multímeros de maiores ordens como segue. Essa variante seria expressa em E. coli e recuperada como um monômero no sobrenadante de um lisado de choque osmótico.

As etapas subsequentes de processamento poderíam então ser empregadas para induzir a formação de ligação dissulfeto, por exemplo, cromatografia Q-Sepharose.

Sob tais condições, algumas variantes hGH dotadas de uma cisteína livre, como T3C e stp192C, são convertidas de forma virtualmente quantitativa em dímeros com ligação dissulfeto. Sob as mesmas ou similares condições, a formação de dissulfeto intermolecular por uma variante hGH dotada de duas cisteínas livres, por exemplo, um duplo mutante que combinado com T3C e stp192C resultaria em uma polimerização de moléculas hGH e o comprimento da cadeia desses polímeros seria, em princípio, ilimitado. O comprimento da cadeia poderia ser limitado e, controlado até certo ponto, pela adição à reação de polimerização de hGH de moléculas dotadas de somente uma cisteína livre, como a variante T3C e/ou a variante stp192C. A formação de ligação dissulfeto entre o polímero em crescimento e uma molécula dotada de somente uma cisteína livre “encaparia” ou evitaria novas extensões de um dos dois locais de polimerização do polímero em nascimento. Uma reação subsequente de uma segunda molécula hGH que tem somente uma cisteína livre com outro local de polimerização do polímero nascente termina a polimerização e fixa o comprimento daquela molécula polimérica. O comprimento médio do polímero pode ser controlado por estequiometria dos reagentes, isto é, a razão das moléculas hGH com duas cisteínas livres em relação às moléculas hGH com uma cisteína livre. Os polímeros comuns mais curtos seriam favorecidos pelas menores razões e os polímeros comuns mais longos seriam favorecidos por maiores razões. Polímeros com “derivações” mais complexas seriam construídos a partir de reações envolvendo variantes hGH com 3 ou mais cisteínas livres com variantes hGH dotadas de somente uma cisteína livre.

Classes de certos polímeros de tamanho discreto podem ser subsequentemente purificadas por métodos cromatográficos, como a cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e similares. Podem ser usados procedimentos similares aos descritos para GH, a fim de criar dímeros com ligações dissulfeto e multímeros de maiores ordens de EPO e alfa interferon.

Usando procedimentos similares aos ora descritos, pode-se construir outras cisteínas muteínas de EPO. As cisteínas muteínas podem ser mutações de substituição da cisteína por um resíduo amino natural na sequência de codificação EPO, mutações de inserção que inserem um resíduo de cisteína entre dois aminoácidos de corrência natural na sequência de codificação EPO, ou mutações de adição que adicionam um resíduo de cisteína antecedendo o primeiro aminoácido, A1, da sequência de codificação EPO ou adicionam um resíduo de cisteína após o resíduo terminal de aminoácido, R166, da sequência de codificação EPO. Os resíduos de cisteína podem ser substituídos por qualquer aminoácido, ou inseridos entre quaisquer dois aminoácidos, em qualquer lugar da sequência de codificação EPO.

Os locais preferidos para a substituição ou a inserção dos resíduos de cisteína na EPO são na região que antecede a Hélice A, o loop A-B, o loop B-C, o loop C-D e a região distai da Hélice D. Outros locais de preferência são os primeiros ou os últimos três Aminoácidos das Hélices A, B, C e D.

Os resíduos preferidos nessas regiões para a criação das substituições de cisteína são: A1, P2, P3, R4, L5, D8, S9, I25, T27, G28, A30, E31, H32, S34, N36, I39, D43, T44, K45, N47, Y49, A50, K52, R53, M54, E55, G57, Q58, G77, Q78, A79, S84, Q86, W88, E89, T107, R110, A111, G113, A114, Q115, K116, E117, A118, S120, P121, P122, D123, A124, A125, A127, A128, R131, T132, K154, Y156, T157, G158, E159, A160, T163, G164, D165, R166.

Os resíduos de cisteína também podem ser inseridos precedendo imediatamente ou após esses aminoácidos. Outro local preferido para adição de um resíduo de cisteína seria antecedendo A1, que denominamos de *-LC. Pode-se construir muteínas EPO contendo uma cisteína livre substituindo outro aminoácido por um dos resíduos de cisteína de ocorrência natural na EPO. O resíduo de cisteína de ocorrência natural e que forma normalmente uma ligação dissulfeto com o resíduo de cisteína substituído, está agora livre. O resíduo de cisteína não essencial pode ser substiuído por qualquer dos outros 19 aminoácidos, mas preferencialmente por um resíduo de serina ou alanina. Um resíduo de cisteína livre também pode ser introduzido na EPO por modificação química de um aminoácido de ocorrência natural, usando procedimento como os descritos por Sytkowski et al. (1998).

As muteínas podem ser divididas em dois grupos para análise: as muteínas T26C, T40C, N83C e S126C compreenderam um grupo e as muteínas N24C, N38C, S85C e *167C compreenderam o segundo grupo. As muteínas de um grupo foram analisadas no mesmo dia. A rEPO BV do tipo silvestre e a rEPO CHO foram analisadas em paralelo nos mesmos dias, de forma a controlar a variabilidade entre os dias nos ensaios. Todas as muteínas estimularam a proliferação de células de UT7/EPO e tiveram EC50s dentro de três vezes das proteínas de controle rEPO do tipo silvestre.

Os EC50s médios das muteínas N24C, T26C, N83C, S85C, S126 e *1670 foram similares aos EC50s médios da rEPO BV e rEPO CHO, atingindo 0,3-08ng/L (Tabela 2). Os EC50s médios das proteínas N38C e T40C foram de 1ng/mL (Tabela 2).

Bill et al; (1995) comunicaram a expressão das cisteínas muteínas EPO N24C, N38C e N83C, em E. coli. Em contraste com nossos resultados, comunicaram que as bioatividades dessas cisteínas muteínas foram significativamente reduzidas com relação à EPO do tipo silvestre. A bioatividade da muteína N38C foi reduzida a menos de 20% da bioatividade da EPO do tipo silvestre e as bioatividades das muteínas N24C e N83C foram reduzidas a menos de 5% da bioatividade da EPO do tipo silvestre. Os EC50s não foram comunicados. Bill et al. (1995) postularam que as atividades reduzidas das cisteínas muteínas se deveram à dobragem inadequadas devido à formação incorreta das pontes de dissulfeto que resultaram dos resíduos extras de cisteína que foram introduzidos nas proteínas. Eles não empregaram cistina ou outros agentes bloqueadores de cisteína nas soluções usadas para purificarem as muteínas.

Com base nos resultados de Bill et al. (1995), foi surpreendente que nossas muteínas purificadas N24C, N38C e N83C tivessem atividades biológicas iguais ou dentro de 3 vezes à da EPO do tipo silvestre.

Os dados indicam que nossos métodos para a expressão e purificação das cisteínas muteínas EPO resultam em proteínas com atividades biológicas in vitro superiores, quando comparadas com os métodos empregados por Bill et al. (1995).

Tabela 2 - Propriedades das cisteínas muteínas EPO Humanas 1Dado de experimentos individuais. É mostrada uma faixa quando N>3 Como várias configurações da presente invenção foram descritas em detalhes, é aparente que as modificações e adaptações dessas configurações ocorrerão para os peritos na técnica. Deve ser expressamente compreendido entretanto, que estas modificações e adaptações fazem parte do escopo da presente invenção.

Claims (21)

1. Proteína isolada monoPEGuilada do hormônio do crescimento, caracterizada pelo fato da referida proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento compreender um polietileno glicol ligado a um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo aminoácido 2, 3, 5, 132, 133, 134, 137, 140, 141, 143, 144, 147, 148 e 149 do hormônio de crescimento e, onde a proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento é biologicamente ativa.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado a um aminoácido selecionado a partir de um grupo consistindo de aminoácidos 2, 3 e 5 do hormônio do crescimento.

3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado ao aminoácido 132 do hormônio do crescimento.

4. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado ao aminoácido 133 do hormônio do crescimento.

5. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado ao aminoácido 134 do hormônio do crescimento.

6. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado ao aminoácido 137 do hormônio do crescimento.

7. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado ao aminoácido 141 do hormônio do crescimento.

8. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado a um aminoácido selecionado a partir de um grupo consistindo de aminoácidos 144 do hormônio do crescimento.

9. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do polietileno glicol ser ligado a um aminoácido selecionado a partir de um grupo consistindo de aminoácidos 140, 143, 147, 148 e 149 do hormônio de crescimento.

10. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína do hormônio do crescimento monoPEGuilada possui um EC50 menor do que cerca de 110 ng/ml.

11. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento possui um EC50 menor do que cerca de 50 ng/ml.

12 Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento possui um EC50 menor do que cerca de 11 ng/ml.

13. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento, contém menos do que 5% de proteína unPEGuilada do hormônio do crescimento.

14. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que 0 referido polietileno glicol ter uma massa molecular entre 2 kDA e 40 kDA.

15. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que 0 referido polietileno glicol é selecionado a partir de um grupo consistindo de polietileno glicol linear e um polietileno glicol ramificado.

16. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido polietileno glicol é um polietileno glicol cisteíno-reativo.

17. Proteína, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polietileno glicol é selecionado a partir do grupo consistindo de maleimida de polietileno glicol, vinisulfona de polietileno glicol, iodoacetil de polietileno glicol.

18. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento compreende pelo menos um grupo de tiol adicionado ligado a pelo menos um aminoácido na referida proteína do hormônio do crescimento.

19. Método para obtenção de uma proteína isolada monoPEGuilada do hormônio do crescimento da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: a) expor a proteína do hormônio do crescimento a um polietileno glicol sob tais condições que um polietileno glicol é anexo a pelo menos um aminoácido na referida proteína do hormônio do crescimento; e b) isolar a proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento, a partir da proteína unPEGuilada do hormônio do crescimento, por meio de cromatografia de coluna.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a proteína monoPEGuilada do hormônio do crescimento tem um peso molecular aparente maior do que cerca de 70 kDA, conforme medida pelo tamanho da coluna de cromatografia de exclusão.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura compreendendo duas ou mais proteínas monoPEGuiladas do hormônio do crescimento da reivindicação 1.