JP2014088384A - Peg修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体およびそれらの組成物および使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】エキセンジン及びエキセンジン類似体について現存する欠点としては,短い投与間隔,長期間注射した患者における抗体の生成,PEGで修飾した後の生物活性の低下が挙げられる。これらの欠点を克服したエキセンジン又はエキセンジン類似体の提供。
【解決手段】エキセンジンまたはエキセンジン類似体の1またはそれ以上のアミノ酸に結合していてもよい1またはそれ以上のPEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。PEG誘導体は,例えば下式Iに示される分枝構造を有することができる。PEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物,修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を製造または投与する方法,及びその種々の用途も提供される。
【選択図】なし
【解決手段】エキセンジンまたはエキセンジン類似体の1またはそれ以上のアミノ酸に結合していてもよい1またはそれ以上のPEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。PEG誘導体は,例えば下式Iに示される分枝構造を有することができる。PEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物,修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を製造または投与する方法,及びその種々の用途も提供される。
【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は,中国特許出願200610118326.X(11月14日出願2006年)および中国特許出願200710138718.7(7月23日出願2007年)に基づく優先権を主張し,これらの出願の全体を参照として本明細書に引用する。
本出願は,中国特許出願200610118326.X(11月14日出願2006年)および中国特許出願200710138718.7(7月23日出願2007年)に基づく優先権を主張し,これらの出願の全体を参照として本明細書に引用する。
グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)は,1987年に最初に発見され,グルコース依存性腸分泌性ホルモンペプチドとして同定された。GLP−1ペプチドは,G蛋白質共役レセプター(GPCR)を通してシグナルを伝達し,β島細胞を刺激してインスリンを分泌させて,グルカゴン分泌,胃内容排出および胃酸分泌を阻害し,他の生理学的機能に影響を及ぼす。
エキセンジンは,毒性トカゲであるアメリカドクトカゲおよびメキシコドクトカゲの唾液分泌に見いだされるペプチドである(J.Biol.Chem.1999,265,20259−20262;J.Biol.Chem.1992,267,7402−7405)。エキセンジン−4に代表されるこれらのエキセンジンは,GLP−1[7−36]に非常に類似している。先の研究により,エキセンジンはGLP−1レセプターに結合して,インスリン分泌の刺激,食後の血糖レベルの有効な制御,ヘモグロビンの糖化レベルの低下および胃内容排出の阻害等の,同様の薬理学的効果を示すことができることが発見された。動物における試験から,GLP−1レセプターペプチドを長期間使用すると,インスリンに対する耐性を有効に低下させることができることが見いだされ,これは糖尿病の悪化の復帰につながるかもしれない。さらに,多くのインスリン指向性アゴニスト,例えばGLP−1およびエキセンジン−4が,β島細胞の再生を刺激しうること(Nat.Biotech.2005,23,857−861),および非アルコール性脂肪肝を改善しうること(Hepatology 2006,43,173−181)が見いだされている。これらの発見により,このようなペプチドは,糖尿病および脂肪過多症の研究における人気の分野となった。Wu DengxiおよびSun Yukun(中国特許ZL01112856)は,エキセンジン−4を修飾して,天然のエキセンジン−4と同じ機能を有する一連のエキセンジン−4類似体を得た。最近,新規なエキセンジン系薬剤であるエキセンジン−4(Byetta(登録商標))が米国で上市された。この薬剤は,AmylinとEli Lillyにより共同開発され,1日に2回の注射を必要とする。この薬剤は,糖尿病および脂肪過多症の治療の分野で注目されている。しかし,臨床研究により,そのような薬剤で30週間治療した後,患者の約41%がエキセンジン−4に対する抗体を生成することが発見された(Diabetes Care.2004,27,2628−2635)。
蛋白質/ペプチド薬剤は,典型的には,短い血中半減期,物理学的および化学的安定性の低さ,およびプロテアーゼによりインビボで分解される傾向などの欠点を有する。その結果,そのような薬剤は毎日多数回注射することが必要であり,患者に多くの痛みと不便を与えている。これらの薬剤の半減期をどのようにして延長するかは,バイオテクノロジー業界の長い間の難題であった。現在,この問題に対する,普遍的に受け入れられる解決策は見いだされていない。
PEG修飾技術は1970年代に登場し,蛋白質/ペプチド薬剤を製造する技術に応用されている。ある種の蛋白質/ペプチドを直鎖または分枝鎖PEGで修飾すると,修飾は蛋白質/ペプチドに以下のような特徴を与える:(1)物理学的および化学的安定性の改良;(2)免疫原性の低下;(3)プロテアーゼ消化に対する耐性の増加;(4)腎臓クリアランスの低下につながるPEG分子量の増加による血中半減期の延長;および(5)薬剤の溶解性および細胞膜浸透の改良。A.YangおよびK.Precourtの研究によれば,エキセンジン−4は主として腎臓クリアランスを通して代謝される。したがって,彼らは,500から20,000Daの範囲の分子量を有するPEGを用いてエキセンジンを修飾して(中国特許CN1372570A),腎臓クリアランスの影響を低下させた。
しかしながら,PEG技術の主な欠点は,一般に修飾した後に修飾薬剤の生物活性が顕著に低下することである。Haim Tsuberyらは,9−ヒドロキシメチル−7−スルホフルオレン−N−ヒドロキシスクシンイミド(FMS)を用いてPEGを活性化し,エキセンジン−4と結合させた。次にPEG基はインビボ加水分解によりエキセンジン−4から放出された。すなわち,エキセンジン−4の生物活性は回復した。この方法は,PEG修飾による低い生物活性の問題の解決策を提供するが,未修飾エキセンジン−4がインビボ加水分解後に放出されること,および頻繁な注射に起因する免疫原性の問題がなお解決されていない(J.Biol.Chem.2004,279,38118−38124)。
既知のエキセンジンおよびエキセンジン類似体について現存する欠点としては,短い投与間隔,長期間注射した患者における抗体の生成,PEGで修飾した後の生物活性の低下が挙げられる。これらの欠点のため,エキセンジンおよびエキセンジン類似体を実際に適用することは困難であり,大用量のエキセンジンまたはエキセンジン類似体の投与を必要とし,このことはエキセンジン技術の応用を著しく妨げている。
J.Biol.Chem.1999,265,20259−20262
J.Biol.Chem.1992,267,7402−7405)
Nat.Biotech.2005,23,857−861
Hepatology 2006,43,173−181
Diabetes Care.2004,27,2628−2635
J.Biol.Chem.2004,279,38118−38124
ある態様においては,1またはそれ以上のポリエチレングリコール(PEG)分子または誘導体で修飾されたエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ある態様においては,エキセンジンまたはエキセンジン類似体または誘導体の1またはそれ以上のアミノ酸に連結された1またはそれ以上のPEG誘導体を有する,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。PEG誘導体は,直鎖構造を有していても分枝構造を有していてもよい。ある態様においては,PEG誘導体は,分枝構造,例えば,本明細書に記載される式(I−IV)のいずれかに示される分枝構造を有するものであってもよい。ある態様においては,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物,そのような修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を製造または投与する方法,およびこれらの種々の用途,例えば糖尿病の治療が提供される。PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,改良されたかつ予測しえない特性および特徴,例えば,血中における長い半減期,高い生物活性,および/または低い免疫原性を示す。
発明の詳細な説明
PEG修飾
以下の本発明の説明は,単に本発明の種々の態様を例示することを意図するものである。したがって,ここで議論される特定の修飾は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者には,本発明の範囲から逸脱することなく種々の同等物,変更,および改変をなしうることが明らかであり,そのような同等の態様も本発明に含まれることが理解される。
PEG修飾
以下の本発明の説明は,単に本発明の種々の態様を例示することを意図するものである。したがって,ここで議論される特定の修飾は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者には,本発明の範囲から逸脱することなく種々の同等物,変更,および改変をなしうることが明らかであり,そのような同等の態様も本発明に含まれることが理解される。
ある態様においては,1またはそれ以上のPEG誘導体により修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ある態様においては,エキセンジンおよび/またはエキセンジン類似体の新規なPEG修飾を用いて,改善された予測しえない特性および特徴を,例えば,血中における長い半減期,高い生物活性,および/または低い免疫原性を示すPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を作成する。
異なる化学構造のPEG誘導体は,そのようなPEG誘導体または分子で修飾したペプチドの生物活性に異なる影響を及ぼすであろう。PEG誘導体は,直鎖構造または分枝構造を有することができる。分枝構造としては,例えば,二重分枝鎖,ならびに多重分枝鎖が挙げられる。二重分枝鎖を有するPEG誘導体としては,例えば,限定されないが,下記の式I,II,IIIおよびIVに示される構造が挙げられる。
ある態様においては,分枝鎖PEG誘導体としては,例えば,限定されないが,下記の式Iに示される構造が挙げられる:
[式中,Xは水素または保護基である]。保護基は,PEG誘導体の遊離ヒドロキシル基と反応することができ,同時に,他の基とのさらなる反応を防止することができる任意の基であることができる。保護基の例としては,例えば,限定されないが,メチル,ジメチル,エチル,プロピルおよびイソプロピル等のアルキル基が挙げられる。
さらに,PEGは,−O(CH2CH2O)q−であり,qは正の整数であり;n1は0−5の整数であり;mは0−5の整数であり;Yは,O,S,SO,SO2またはNR1であり,ここで,R1は,水素または置換もしくは未置換の(C1−C8)アルキル基,または置換もしくは未置換のシクロアルキル基であり;kは0または1であり;pは0−6の整数である。式Iに示される構造を有するPEGは,慣用の化学的方法により合成することができる。例えば,式Iに示される構造を有するPEGの合成方法は,米国特許6,566,506に記載されている。
ある態様においては,本発明において用いられる式Iの分枝構造を含むPEG誘導体は,下記の式II:
[式中,PEGは−O(CH2CH2O)q−であり,qは正の整数であり,Meはメチル基である]
で示される特定の構造を有する。
で示される特定の構造を有する。
ある態様においては,分枝鎖PEG誘導体は,下記の式III:
[式中,Xは水素または保護基であり;PEGは−O(CH2CH2O)q−であり,qは正の整数であり;n2は0−10の整数であり;Zは,(CH2)i,(CH2)iOCO,(CH2)iNHCO,または(CH2)iCOであり,ここで,iは0−10の整数であり;R2は,水素,置換もしくは未置換の(C1−C12)アルキル基,置換されたアリール,アラルキルまたはヘテロアルキル基であり;jは1−12の整数である]
の構造を有する。上述の式IIIのPEG誘導体構造は,慣用の化学的方法により合成することができ,その1つは中国特許ZL03801105.0において提供されている。
の構造を有する。上述の式IIIのPEG誘導体構造は,慣用の化学的方法により合成することができ,その1つは中国特許ZL03801105.0において提供されている。
ある態様においては,本発明において用いられる式IIIの分枝構造を含むPEG誘導体は,下記の式IV:
[式中,PEGは−O(CH2CH2O)q−であり,qは正の整数であり,Meはメチル基である]
に示される構造を有する。
に示される構造を有する。
PEG誘導体の分子量は,PEG修飾ペプチドの生物活性に影響を及ぼしうる。ある態様においては,用いられる直鎖または分枝鎖のPEG誘導体の分子量は約200Daまたはそれ以上である。好ましくは,分子量は約5,000Daまたはそれ以上,あるいは約20,000Daまたはそれ以上である。ある態様においては,用いられるPEG誘導体の分子量は,約5,000Daから約50,000Daの範囲内である。好ましくは,用いられるPEG誘導体の分子量は,20,000Daから50,000Da,または20,000Daから45,000Da,または20,000Daから40,000Daの範囲内である。本明細書に記載されるPEG誘導体の分子量は,特に記載しないかぎり,ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)の方法により測定される平均分子量(Mn)である(Dong Yanming,Guidebook of Macromolecule Analysis,Beijing,China Petrochemical Press,2004,416−427)。種々の分子量を有するPEG誘導体は,商業的供給元から購入することができ,あるいは当該技術分野において知られる慣用的な方法を用いて合成することができる。
ある態様においては,PEG誘導体は,20,000Daより大きい分子量をもつ分枝構造を有する。好ましくは,用いられる分枝鎖PEG誘導体の分子量は20,000Daから約50,000Da,または20,000Daから約45,000Da,または20,000Daから約40,000Daの範囲である。
エキセンジンまたはエキセンジン類似体のPEG修飾は,活性化したPEG誘導体を,エキセンジンまたはエキセンジン類似体のアミノ酸のアミノ酸残基の側鎖またはN末端またはC末端に連結させることにより行う。例えば,異なる活性化基を含むPEG誘導体は,異なる側鎖,アミノ酸のN末端またはC末端,または特定のアミノ酸に結合させることができる。活性化PEG誘導体に化学的に結合させることができるアミノ酸の基としては,限定されないが,N末端のα−アミノ基,リジン残基側鎖のε−アミノ基,ペプチドのヒスチジン残基の側鎖イミダゾリル基のイミノ基,ペプチドのカルボキシル末端,アルパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基,セリンおよびトレオニンの側鎖ヒドロキシル基,システインの側鎖メルカプト基等が挙げられる。一般に,そのような化学的結合は,求電子反応および求核反応により達成される。例えば,N−ヒドロキシルスクシンイミドで活性化したPEG誘導体の,N末端のα−アミノ基,リジン側鎖ε−アミノ基および遊離アミノ基,例えば,ヒスチジン側鎖イミダゾリル基のイミノ基への結合は,そのような反応により形成される。さらに,アルデヒド活性化基を含むPEGは,還元的アルキル化によりペプチドのN末端に特異的に連結させることができる。実際に,ある態様においては,種々の活性化基を用いてPEG誘導体をエキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合させる方法,およびこれにより生成するPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。種々の活性化基を有するPEG誘導体は,商業的供給元から購入してもよく,関連する技術分野において知られる慣用の方法を用いて合成してもよい。
ある態様においては,1またはそれ以上のPEG誘導体と結合したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供され,ここで,エキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合するPEG誘導体の数は,エキセンジンまたはエキセンジン類似体上のフリーラジカル基の数,PEG誘導体の活性化基,および/またはPEG誘導体の分子量に依存する。一般に,エキセンジンまたはエキセンジン類似体が有するフリーラジカル基が多ければ多いほど,より多くのPEG誘導体がこれに結合する。また一般に,活性化されたPEG誘導体の分子量が大きければ大きいほど,より少ないPEG誘導体がペプチドに結合する。ある態様においては,エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,1,2,3または4個のPEG誘導体で修飾する。好ましくは,エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,1または2個のPEG誘導体で修飾する。
PEG誘導体をエキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合させることにより生成する混合物は,慣用の手段,例えば,イオン交換分離,ゲル濾過分離,または逆相クロマトグラフィーにより効率よく分離することができる。イオン交換クロマトグラフィーとしては,アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。異なるイオン交換法は,分離および精製の結果に異なる影響を与えるであろう。異なるエキセンジンまたはエキセンジン類似体は異なる数および種類のアミノ酸を有し,したがって異なる分子量を有するため,PEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体の最終的な分子量は,PEG誘導体の分子量とエキセンジンまたはエキセンジン類似体の分子量との合計である。分離,精製およびバッファー溶液交換の工程の後,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体をさらに加工して,医薬組成物を製造することができる。
エキセンジンまたはエキセンジン類似体
本明細書において,エキセンジンまたはエキセンジン類似体とは,天然のエキセンジンの部分配列または全配列と相同のまたは同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはペプチド誘導体を表す。エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,GLP−1レセプターに結合して細胞シグナル伝達のカスケードを刺激することができる。そのようなペプチドは,固相化学合成または遺伝子工学により取得して,次に分離および精製することができる。
本明細書において,エキセンジンまたはエキセンジン類似体とは,天然のエキセンジンの部分配列または全配列と相同のまたは同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはペプチド誘導体を表す。エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,GLP−1レセプターに結合して細胞シグナル伝達のカスケードを刺激することができる。そのようなペプチドは,固相化学合成または遺伝子工学により取得して,次に分離および精製することができる。
本明細書において,エキセンジンまたはエキセンジン類似体としては,限定されないが,天然のエキセンジン−3およびエキセンジン−4が挙げられる。天然のエキセンジン−3は下記のアミノ酸配列を有する:
[His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−OH](配列番号1)
天然のエキセンジン−4は下記のアミノ酸配列を有する:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−NH2](配列番号2)
[His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−OH](配列番号1)
天然のエキセンジン−4は下記のアミノ酸配列を有する:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−NH2](配列番号2)
ある態様においては,エキセンジンまたはエキセンジン類似体としては,限定されないが,天然のエキセンジン−3およびエキセンジン−4のアミノ酸配列へのアミノ酸置換,付加または欠失により得られるペプチド類似体が挙げられる。エキセンジン−3およびエキセンジン−4のアミノ酸置換には,天然のアミノ酸ならびに非天然アミノ酸による置換が含まれる。非天然アミノ酸としては,限定されないが,アゼチジンカルボン酸,2−アミノ−ヘキサン二酸,3−アミノ−ヘキサン二酸,β−ラクタミン酸,アミノプロピオン酸,2−アミノ酪酸,4−アミノ酪酸,6−アミノヘキサン酸,2−アミノヘプタン酸,2−アミノ−2−メチルプロパン酸,3−アミノ−2−メチルプロパン酸,2−アミノヘプタン二酸,2−アミノ−3,3−ジメチル酪酸,デスモンシン,2,2−ジアミノヘプタン二酸,2,3−ジアミノプロパン酸,N−エチルグリシン,N−エチルアスパラギン,ホモプロリン,ヒドロキシリジン,アロ−ヒドロキシリジン,3−ヒドロキシプロリン,4−ヒドロキシプロリン,イソデスモンシン,アロイソロイシン,N−メチルアラニン,N−メチルグリシン,N−メチルイソロイシン,N,N−メチルペンチルグリシン,N−メチルバリン,ナフトアラニン,ノルバリン,ノルロイシン,オルニチン,ペンチルグリシン,ピペコリン酸及びチオプロリンが挙げられる。好ましくは,エキセンジン類似体は,1個,2個,3個,4個または5個のアミノ酸置換を含む。
ある態様においては,エキセンジン類似体は,天然のエキセンジン−3またはエキセンジン−4のアミノ酸配列に1またはそれ以上のアミノ酸を加えるかまたは除去することにより得られるペプチド類似体を含む。好ましくは,エキセンジン類似体は,天然のエキセンジン−3またはエキセンジン−4のアミノ酸配列に1から12個のアミノ酸を加えるかまたは除去することにより得られるペプチド類似体を含む。ある態様においては,エキセンジン類似体は,天然のエキセンジン−3またはエキセンジン−4アミノ酸配列に1〜15個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより,または天然のエキセンジン−3またはエキセンジン−4アミノ酸配列に1〜10個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより,または天然のエキセンジン−3またはエキセンジン−4アミノ酸配列に1〜9個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより得られるペプチド類似体を含む。
エキセンジン類似体は,そのN末端,C末端,または側鎖に,可逆的または不可逆的な化学的ブロッキングまたは修飾を有していてもよい。例えば,エキセンジンまたはエキセンジン類似体のC末端をアミド化してもよい。
ある態様においては,エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号1−265のアミノ酸配列を含む。好ましくは,エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号1−2のアミノ酸配列,または配列番号3−229のアミノ酸配列,または配列番号230−265のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体の活性は,GongQiuhongらにより公開されたアッセイにしたがって,細胞レベルで試験することができる(Chinese Journal of Incretion and Metaboly,2004,20,559−560)。簡単には,アッセイは次のようにして実施することができる。グルコースおよび種々の濃度のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体をINS−1細胞に加え,4時間インキュベーションし,上清中のインスリンの量をラジオイムノアッセイにより検出し,そしてRT−PCR技術を用いてINS−1細胞中のインスリンの量を半定量的アッセイで分析する。上述の方法を用いることにより,PEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体の活性の大規模スクリーニングを行うことができる。そのようなスクリーニングはまた,マウス(例えば,C57またはdb/dbマウス)の投与後の様々な時点における血糖レベルの変化を調べることによって行うことができる。
医薬組成物およびその用途
ある態様においては,本明細書に記載されるPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む医薬組成物または化合物が提供される。本明細書に記載されるPEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体は,種々の無機および有機酸またはアルカリと反応させて,塩を形成することができる。そのような塩には,有機酸および無機酸を用いて製造される塩が含まれ,ここで,有機酸および無機酸としては,限定されないが,塩酸,臭化水素酸,硫酸,リン酸,トリフルオロ酢酸,酢酸,ギ酸,メタンスルホン酸,トルエンスルホン酸,マレイン酸,フマル酸およびカンファースルホン酸が挙げられる。アルカリを用いて製造される塩としては,限定されないが,アンモニウム塩,アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩およびカリウム塩),およびアルカリ土類金属塩(例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩)が挙げられる。好ましい塩としては,例えば,酢酸塩,塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。塩は慣用の方法により製造することができる。例えば,そのような塩は,得られる塩が不溶性である溶媒または媒体中で,または真空によるかまたは凍結乾燥により除去可能な溶媒,例えば水の中で,エキセンジンまたはエキセンジン類似体を1当量またはそれ以上の適当な酸またはアルカリと反応させることにより,または適当なイオン交換樹脂によって現存する塩のイオンを別のイオンと交換することにより,製造することができる。
ある態様においては,本明細書に記載されるPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む医薬組成物または化合物が提供される。本明細書に記載されるPEG誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体は,種々の無機および有機酸またはアルカリと反応させて,塩を形成することができる。そのような塩には,有機酸および無機酸を用いて製造される塩が含まれ,ここで,有機酸および無機酸としては,限定されないが,塩酸,臭化水素酸,硫酸,リン酸,トリフルオロ酢酸,酢酸,ギ酸,メタンスルホン酸,トルエンスルホン酸,マレイン酸,フマル酸およびカンファースルホン酸が挙げられる。アルカリを用いて製造される塩としては,限定されないが,アンモニウム塩,アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩およびカリウム塩),およびアルカリ土類金属塩(例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩)が挙げられる。好ましい塩としては,例えば,酢酸塩,塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。塩は慣用の方法により製造することができる。例えば,そのような塩は,得られる塩が不溶性である溶媒または媒体中で,または真空によるかまたは凍結乾燥により除去可能な溶媒,例えば水の中で,エキセンジンまたはエキセンジン類似体を1当量またはそれ以上の適当な酸またはアルカリと反応させることにより,または適当なイオン交換樹脂によって現存する塩のイオンを別のイオンと交換することにより,製造することができる。
ある態様においては,本明細書に記載されるPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,薬学的に許容しうる塩(例えば,酸の付加反応により得られる塩)および/またはこれらの複合体として製造することもできる。そのような塩の製造は,組成物がその生理学的効果を示すことを妨害せずに組成物の物理学的または化学的特性を変化させることにより,薬学的な使用を容易にすることができる。物理学的特性の有用な変更の例としては,融点を低下させて経粘膜投与を容易にすること,または溶解度を増加させて高濃度の薬剤の投与を容易にすることが挙げられる。
薬学的に許容しうる塩としては,例えば,酸付加塩,例えば硫酸塩,塩酸塩,リン酸塩,スルファミン酸塩,酢酸塩,クエン酸塩,乳酸塩,酒石酸塩,メタンスルホン酸塩,エタンスルホン酸塩,ベンゼンスルホン酸塩,p−トルエンスルホン酸塩,シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩が挙げられる。薬学的に許容しうる塩はまた,種々の有機酸および無機酸,例えば,塩酸,硫酸,リン酸,スルファミン酸,酢酸,クエン酸,乳酸,酒石酸,マロン酸,メタンスルホン酸,エタンスルホン酸,ベンゼンスルホン酸,p−トルエンスルホン酸,シクロヘキシルスルファミン酸,およびキナ酸を用いて製造することができる。そのような塩は,エキセンジンまたはエキセンジン類似体を,得られる塩が不溶性である溶媒または媒体中で,または水等の真空または凍結乾燥により除去可能な溶媒中で,1当量またはそれ以上の適当な酸またはアルカリと反応させることにより,または,適当なイオン交換樹脂上で現存する塩のイオンを別のイオンと交換することにより,製造することができる。
さらに,担体または賦形剤を用いて,組成物の被験者への投与を容易にすることができる。担体および賦形剤の例としては,例えば,炭酸カルシウム,リン酸カルシウム,種々の糖(例えば,ラクトース,グルコースまたはショ糖),または種々のタイプのデンプン,セルロース誘導体,ゼラチン,植物油(例えばゴマ油,ピーナツ油,オリーブ油),ポリエチレングリコールおよび生理学的に適合性の溶媒が挙げられる。組成物または医薬組成物は,種々の経路で,例えば,静脈内,腹腔内,皮下および筋肉内,経口,局所および経粘膜投与により投与することができる。
所望の場合には,本発明の組成物の溶液は,メチルセルロース等の増粘剤を用いて粘度を高めてもよい。これらは,乳濁形態(例えば油中水または水中油)で製造することができる。当該技術分野において知られる任意の薬学的に許容しうる乳濁剤を用いることができ,これには例えば,アカシアゴム粉末,非イオン性界面活性剤(例えばTween),またはイオン性界面活性剤(例えばTriton等のアルカリポリエーテルアルコールサルフェートまたはスルホネート)が含まれる。
組成物は,慣用の滅菌手法または濾過により滅菌することができる。組成物は,所望の生理学的条件とほぼ同じ条件を有する薬学的に許容しうる補助剤,例えばpH緩衝剤等を含んでいてもよい。有用なバッファーとしては,例えば,酢酸ナトリウム/酢酸バッファーが挙げられる。皮下注射またはデリバリーの後,薬学的に有効量の製剤が長時間または数日にわたって血流中に残存するように,座剤または徐放機能を有する製剤の形を用いてもよい。
所望の等張性は,塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容しうる薬剤,例えば,グルコース,ホウ酸,酒石酸ナトリウム,ポリエチレングリコール,ポリオール(例えば,マンニトールおよびソルビトール),または他の無機または有機溶媒を用いて得ることができる。ナトリウムイオンを含有するバッファー用には,塩化ナトリウムが好ましい。
1つの態様においては,約70kgの体重の患者について,化合物の有効投与量は,1日あたり約0.01または約0.03から約5mg,好ましくは1日あたり約0.01または約0.5から約2mg,より好ましくは1日あたり約0.01または約0.1から約1mgの範囲であり,1回またはそれ以上投与される。正確な投与量は,担当の医師が決定することができ,特定の化合物が上述の範囲内で存在するか否か,ならびに個々の患者の年齢,体重および症状により異なる。
ある態様においては,本明細書に記載されるPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,糖尿病を治療するために被験者に投与することができる。ある態様においては,化合物の投与は,糖尿病の症状が現れた直後か,または糖尿病と診断された直後に開始すべきである。任意に,別の態様においては,症状が現れる前に予防処置として化合物を投与してもよい。
化合物は,典型的にはヒト患者を治療するために用いられるが,他の霊長類,家畜(例えば.ブタ,ウシおよび家禽),スポーツ用動物またはペット(例えば,ウマ,イヌおよびネコ)等の他の脊椎動物において,同様のまたは同一の疾患を治療するために用いてもよい。
以下の実施例は,本発明をよりよく説明するために提供されるものであり,本発明を限定するものと解釈すべきではない。特定の物質について言及される場合,これは単に例示の目的のためであり,本発明を限定することを意図するものではない。当業者は,創作能力を発揮せずに,本発明の範囲を逸脱することなく,同等の手段または反応物を開発することができる。本明細書に記載される方法において,本発明の範囲内になお含まれる多くの変更をなしうることが理解される。そのような変更も本発明の範囲内に含まれることが意図される。
分子量5,000Daの直鎖状PEG誘導体はSigma−Aldrich Corporationから購入した。本発明で用いた他のPEG誘導体は,Beijing Jen Kem Technology Co.,Ltd.から購入した。
イオン交換実験において用いたA,B Double−Pump AKTA精製装置,および他のカラムおよび充填剤は,General Electricから購入した。関連する試薬は,Sigma−Aldrichから購入した。実施例3−9で用いた天然のエキセンジン−4およびその類似体は,Chengdu Shennuo Science and Technology Co.Ltd.から購入した。
実施例1.エキセンジン−4類似体の固相合成
実施例1は,下記のアミノ酸配列:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Arg−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Lys−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−OH](配列番号232).
を有するエキセンジン−4類似体の固相合成の方法を示す。
(1)アミノ酸残基:
Fmoc-L-Ala-OH,Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-Met-OH,Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-L-Phe-OH,Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,Fmoc-L-Pro-OH,Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-L-Ser(tBu)-OH,Fmoc-L-Gly-OH,Fmoc-L-Thr(tBu)-OH,Fmoc-L-His(Trt)-OH,Fmoc-L-Trp-OH,Fmoc-L-Ile-OH,Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-L-Leu-OH,Fmoc-L-Val-OH
上記式中:
Fmocは9−フルオレニルメトキシカルボニルを表し;
BOCはtert−ブチルオキシカルボニルを表し;
Trtはトリフェニルメチルを表し;
OtBuはtert−ブチルエステルを表し;
tBuはtert−ブチルを表す。
実施例1は,下記のアミノ酸配列:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Arg−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Lys−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−OH](配列番号232).
を有するエキセンジン−4類似体の固相合成の方法を示す。
(1)アミノ酸残基:
Fmoc-L-Ala-OH,Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-Met-OH,Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-L-Phe-OH,Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,Fmoc-L-Pro-OH,Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-L-Ser(tBu)-OH,Fmoc-L-Gly-OH,Fmoc-L-Thr(tBu)-OH,Fmoc-L-His(Trt)-OH,Fmoc-L-Trp-OH,Fmoc-L-Ile-OH,Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-L-Leu-OH,Fmoc-L-Val-OH
上記式中:
Fmocは9−フルオレニルメトキシカルボニルを表し;
BOCはtert−ブチルオキシカルボニルを表し;
Trtはトリフェニルメチルを表し;
OtBuはtert−ブチルエステルを表し;
tBuはtert−ブチルを表す。
(2)合成用の装置および試薬
ペプチド合成は,Peptide Synthesizer 433A(Applied Biosystem,USA)を用いて行った。これらの合成に用いた試薬は,N−メチルピロリドン,二塩化メチレン,ヘキサヒドロピリジン,メタノール,ジメチルアミノピリジン/DMF,N,N−ジイソプロピルエチルアミン/NMP,DMF中HBTU100mmole/0.5M HOBT,N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド/NMPである。ここで,DMFはN,N−ジメチルホルムアミドを表し,NMPはN−メチルピロリドンを表し,HOBTは1−ヒドロキシベンゾトリアゾールを表し,HBTUは2−1H−ベンゾトリアゾール−イル−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
ペプチド合成は,Peptide Synthesizer 433A(Applied Biosystem,USA)を用いて行った。これらの合成に用いた試薬は,N−メチルピロリドン,二塩化メチレン,ヘキサヒドロピリジン,メタノール,ジメチルアミノピリジン/DMF,N,N−ジイソプロピルエチルアミン/NMP,DMF中HBTU100mmole/0.5M HOBT,N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド/NMPである。ここで,DMFはN,N−ジメチルホルムアミドを表し,NMPはN−メチルピロリドンを表し,HOBTは1−ヒドロキシベンゾトリアゾールを表し,HBTUは2−1H−ベンゾトリアゾール−イル−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
(3)方法
a.合成
下記の方法において用いた試薬の量は,0.25mmolの合成スケールに基づく。0.25gのHMP樹脂を秤量し,合成反応容器に入れた。保護基を有する1mmolの種々のアミノ酸を秤量し,所望のインスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列のC末端からN末端の順番にしたがって合成機中に並べた。25℃の室温で,Fmoc保護を除去し,残基を活性化し,そして活性化した残基をHMP樹脂に結合させる反応は,コンピュータプログラムの制御下で自動的に行った。かかる反応を,全てのペプチドが合成されるまで繰り返した。合成の完了後,アミノ酸側鎖に保護基を有する合成されたペプチドが結合した樹脂をペプチド合成機中で風乾し,その後秤量した。
a.合成
下記の方法において用いた試薬の量は,0.25mmolの合成スケールに基づく。0.25gのHMP樹脂を秤量し,合成反応容器に入れた。保護基を有する1mmolの種々のアミノ酸を秤量し,所望のインスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列のC末端からN末端の順番にしたがって合成機中に並べた。25℃の室温で,Fmoc保護を除去し,残基を活性化し,そして活性化した残基をHMP樹脂に結合させる反応は,コンピュータプログラムの制御下で自動的に行った。かかる反応を,全てのペプチドが合成されるまで繰り返した。合成の完了後,アミノ酸側鎖に保護基を有する合成されたペプチドが結合した樹脂をペプチド合成機中で風乾し,その後秤量した。
b.保護基の除去および樹脂からの解離
保護基を有する合成したペプチドが結合した樹脂を,栓をした三角フラスコに入れ,下記に示す切断試薬を加えた。
試薬 量
水 0.50ml
メチル−フェノキシド 0.50ml
フェノール 0.75g
メルカプトエタノール 0.20ml
トリフルオロ酢酸(TFA) 10.0ml
保護基を有する合成したペプチドが結合した樹脂を,栓をした三角フラスコに入れ,下記に示す切断試薬を加えた。
試薬 量
水 0.50ml
メチル−フェノキシド 0.50ml
フェノール 0.75g
メルカプトエタノール 0.20ml
トリフルオロ酢酸(TFA) 10.0ml
この反応は,30℃の一定温度で連続的に撹拌しながら6時間行った。その後,混合物を濾過し,水性濾液を回収し,樹脂を少量のトリフルオロ酢酸(TFA)ですすいだ。すすぎ溶液を回収した濾液と混合した。次に,混合物をエーテルで沈殿させ,沈殿物を少量のエーテルですすいだ。沈殿物を乾燥装置で乾燥させて,粗生成物を得た。
c.HPLCおよび凍結乾燥による分離および精製
調製用HPLCで粗生成物を分離精製し,次に凍結乾燥して,最終生成物を得た。生成物の分子量は,クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて分析した。合成されたペプチドの理論的分子量は4300.6であり,測定された実際の分子量は4316.7であった。当業者は,上述の方法を用いて,他のエキセンジンまたはエキセンジン類似体を同様に合成することができる。
調製用HPLCで粗生成物を分離精製し,次に凍結乾燥して,最終生成物を得た。生成物の分子量は,クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて分析した。合成されたペプチドの理論的分子量は4300.6であり,測定された実際の分子量は4316.7であった。当業者は,上述の方法を用いて,他のエキセンジンまたはエキセンジン類似体を同様に合成することができる。
実施例2.遺伝子工学手法によるエキセンジン−4類似体の製造
この実施例は,下記のアミノ酸配列を有するエキセンジン−4類似体を遺伝子工学方法により製造する方法を説明する:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Leu−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Lys−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Arg−OH](配列番号251)
この実施例は,下記のアミノ酸配列を有するエキセンジン−4類似体を遺伝子工学方法により製造する方法を説明する:
[His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Leu−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Lys−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Arg−OH](配列番号251)
A.製造すべきエキセンジン類似体のアミノ酸配列に基づいて,下記の遺伝子フラグメントを合成した。
(1)5’AATTCCATGCACGGCGAAACCTTCACCAGCGATCTGAGCAAACAGCTGGAAGAAGAAGCGGTTAA(配列番号266)
(2)5’ACTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGAGCAGCGGCCCGCCGCCGCCGAGCCGTTAGA(配列番号267)
(3)5’AGCTTCTAACGGCTCGGCGGCGGCGCGCTGCTCGGGCCGCCGTTTTTCAGCCATTCGATGA(配列番号268)
(4)5’ACAGTTTAACCGCTTCTTCTTCCAGCTGTTTGCTCAGATCGCTGGTGAAGGTGCCTTCGCCGTGCATGG(配列番号269)
(1)5’AATTCCATGCACGGCGAAACCTTCACCAGCGATCTGAGCAAACAGCTGGAAGAAGAAGCGGTTAA(配列番号266)
(2)5’ACTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGAGCAGCGGCCCGCCGCCGCCGAGCCGTTAGA(配列番号267)
(3)5’AGCTTCTAACGGCTCGGCGGCGGCGCGCTGCTCGGGCCGCCGTTTTTCAGCCATTCGATGA(配列番号268)
(4)5’ACAGTTTAACCGCTTCTTCTTCCAGCTGTTTGCTCAGATCGCTGGTGAAGGTGCCTTCGCCGTGCATGG(配列番号269)
B.クローニング
ライゲーション:2つのチューブを用いた。遺伝子フラグメント(1)および(4)を一方のチューブに入れて混合した。遺伝子フラグメント(2)および(3)を他方のチューブに入れて混合した。ポリヌクレオチドキナーゼバッファー,ポリヌクレオチドキナーゼ,およびアデノシン三リン酸(ATP)を各チューブに入れた。反応混合物を37℃で60分間インキュベーションして,遺伝子フラグメントの5’末端をリン酸化した。2つのチューブを95℃の水浴に入れて10分間インキュベーションした。次に,チューブを自然に室温まで冷却させた。T4リガーゼバッファーおよびT4リガーゼを各チューブに加え,混合物を16℃で一晩インキュベーションして,遺伝子フラグメントをライゲーションさせた。
ライゲーション:2つのチューブを用いた。遺伝子フラグメント(1)および(4)を一方のチューブに入れて混合した。遺伝子フラグメント(2)および(3)を他方のチューブに入れて混合した。ポリヌクレオチドキナーゼバッファー,ポリヌクレオチドキナーゼ,およびアデノシン三リン酸(ATP)を各チューブに入れた。反応混合物を37℃で60分間インキュベーションして,遺伝子フラグメントの5’末端をリン酸化した。2つのチューブを95℃の水浴に入れて10分間インキュベーションした。次に,チューブを自然に室温まで冷却させた。T4リガーゼバッファーおよびT4リガーゼを各チューブに加え,混合物を16℃で一晩インキュベーションして,遺伝子フラグメントをライゲーションさせた。
プラスミド:Lacプロモーター(温度制御プロモーターPL,またはTacプロモーター)を含むプラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで消化し,フェノール/クロロホルム溶液で抽出した。混合物を遠心分離し,水性相を回収した。水性相をクロロホルムで抽出し,3回遠心分離した。得られた水性相をイソプロパノールで沈殿させ,遠心分離し,風乾した。
消化したプラスミドおよびライゲーションした遺伝子フラグメントを一緒に混合した。T4リガーゼバッファーおよびT4リガーゼを混合物に加え,室温で3−4時間インキュベーションした。
宿主細胞の培養:E.Coli JM103を,10gのペプトン,5gの酵母エキスおよび5gのNaClを含むLB培養液で37℃で振盪しながら4時間インキュベーションした。細菌培養物を遠心分離し,沈殿物をCaCl2溶液で処理し,使用するまで4℃で保存した。
トランスフォーメーション:クローニングしたプラスミドをE.Coli JM103宿主細胞にトランスフォーメーションした。トランスフォーメーションした細菌細胞を氷浴中で30分間インキュベーションし,次に42℃で2分間インキュベーションした。細菌細胞をアンピリシンを含む寒天プレートに播種し,37℃で一晩インキュベーションした。寒天プレート上に成長したコロニーを選択して組換えプラスミドを含むポジティブクローンとした。
C.発酵
所望のプラスミドを含む選択した宿主細菌株をLB培養液で振盪しながらインキュベーションした。0.5mMのイソプロピルベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に加えて,所望のペプチドの発現を誘導した。一晩インキュベーションした後,細菌細胞を遠心分離により回収した。発現したペプチドは,12%SDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により同定した。
所望のプラスミドを含む選択した宿主細菌株をLB培養液で振盪しながらインキュベーションした。0.5mMのイソプロピルベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に加えて,所望のペプチドの発現を誘導した。一晩インキュベーションした後,細菌細胞を遠心分離により回収した。発現したペプチドは,12%SDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により同定した。
D.封入体
それぞれ300mlの細菌培養物を含む10本のボトルを,上述の条件下で浸透しながらインキュベーションした。蛋白質発現を誘導した後,溶解溶液(1%NaClを含む20mMリン酸バッファー,pH7.5)およびリゾチウムを培養液に加え,30℃で30分間インキュベーションし,次に遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を6Mグアニジン塩酸塩(Gu.HCl)で処理して,封入体を溶解させた。溶液を遠心分離し,得られた上清を透析して,Gu.HClを除いた。透析により生じた沈殿物を1%NaClおよび0.1%Tween80を含む20mMリン酸バッファー(pH7.5)で3回すすいで,封入体を得た。
それぞれ300mlの細菌培養物を含む10本のボトルを,上述の条件下で浸透しながらインキュベーションした。蛋白質発現を誘導した後,溶解溶液(1%NaClを含む20mMリン酸バッファー,pH7.5)およびリゾチウムを培養液に加え,30℃で30分間インキュベーションし,次に遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を6Mグアニジン塩酸塩(Gu.HCl)で処理して,封入体を溶解させた。溶液を遠心分離し,得られた上清を透析して,Gu.HClを除いた。透析により生じた沈殿物を1%NaClおよび0.1%Tween80を含む20mMリン酸バッファー(pH7.5)で3回すすいで,封入体を得た。
E.分解
封入体を8M尿素溶液に溶解した。次に塩酸および臭化シアンを溶液に加えた。溶液中の塩酸の最終濃度は50mMであった。溶液を暗所で窒素ガス保護下で2時間撹拌して,封入体を破壊した。工程はHPLC分析を用いてモニターした。
封入体を8M尿素溶液に溶解した。次に塩酸および臭化シアンを溶液に加えた。溶液中の塩酸の最終濃度は50mMであった。溶液を暗所で窒素ガス保護下で2時間撹拌して,封入体を破壊した。工程はHPLC分析を用いてモニターした。
F.精製
封入体を破壊した後,セファロースG−25クロマトグラフィーにより粗生成物をを得た。粗生成物をHPLCによりさらに精製して,最終生成物を得た。化学工程により合成された生成物と同様に,得られたペプチドの質量分析機により測定した実験分子量は,その理論分子量と一致した。
封入体を破壊した後,セファロースG−25クロマトグラフィーにより粗生成物をを得た。粗生成物をHPLCによりさらに精製して,最終生成物を得た。化学工程により合成された生成物と同様に,得られたペプチドの質量分析機により測定した実験分子量は,その理論分子量と一致した。
実施例3.直鎖状メトキシ−ポリエチレングリコール(mPEG)誘導体(Mf:5,000Da)で修飾したエキセンジン−4
1.0mgのエキセンジン−4を3つのチューブのそれぞれに入れ,異なるpH値を有する各リン酸バッファーに溶解した。5.8mgのN−ヒドロキシスクシンイミド活性化mPEG(Mf:5,000Da)を各チューブに加えた。混合物を振盪テーブルで室温で1時間反応させた。Agilent 1100 HPLCを用いて得られた生成物を分析して,未修飾エキセンジン−4の量を測定した(分析条件:溶媒Aとして0.1%リン酸,溶媒Bとして0.1%リン酸+80%アセトニトリル,勾配:35%−70%溶媒B/25分間)。結果を以下に示す。
エキセンジン−4のPEG化に及ぼすpHの相違の影響
pH値 未修飾エキセンジン−4
6.5 52%
7.5 21%
8.5 4%
1.0mgのエキセンジン−4を3つのチューブのそれぞれに入れ,異なるpH値を有する各リン酸バッファーに溶解した。5.8mgのN−ヒドロキシスクシンイミド活性化mPEG(Mf:5,000Da)を各チューブに加えた。混合物を振盪テーブルで室温で1時間反応させた。Agilent 1100 HPLCを用いて得られた生成物を分析して,未修飾エキセンジン−4の量を測定した(分析条件:溶媒Aとして0.1%リン酸,溶媒Bとして0.1%リン酸+80%アセトニトリル,勾配:35%−70%溶媒B/25分間)。結果を以下に示す。
エキセンジン−4のPEG化に及ぼすpHの相違の影響
pH値 未修飾エキセンジン−4
6.5 52%
7.5 21%
8.5 4%
上述の逆相分離により得られた溶液からアセトニトリルを除去した後,mPEG修飾エキセンジン−4を含む溶液(pH値3−4)を得た。
実施例4.直鎖状mPEG誘導体(Mn:21,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体
1.0mgのエキセンジン−4類似体をNaBH3CNを含む2.0mlのリン酸バッファー(pH4.5)と混合した。5.0mgの分子量21,000Daのアルデヒド活性化mPEG誘導体をエキセンジン−4類似体と混合し,振盪機に入れて室温で一晩反応させた。反応溶液は,Zorbax SB−300半調製用カラムを用いてAgilent 1100クロマトグラフィーにより精製した(分析条件:溶媒Aとして0.1%リン酸;溶媒Bとして0.1%リン酸+80%アセトニトリル;勾配:35%−70%溶媒B/25分間)。このようにして,N末端でmPEGで修飾したエキセンジン−4類似体を得た。
1.0mgのエキセンジン−4類似体をNaBH3CNを含む2.0mlのリン酸バッファー(pH4.5)と混合した。5.0mgの分子量21,000Daのアルデヒド活性化mPEG誘導体をエキセンジン−4類似体と混合し,振盪機に入れて室温で一晩反応させた。反応溶液は,Zorbax SB−300半調製用カラムを用いてAgilent 1100クロマトグラフィーにより精製した(分析条件:溶媒Aとして0.1%リン酸;溶媒Bとして0.1%リン酸+80%アセトニトリル;勾配:35%−70%溶媒B/25分間)。このようにして,N末端でmPEGで修飾したエキセンジン−4類似体を得た。
上述のように回収した溶液からロータリーエバポレータによりアセトニトリルを除去した後,脱塩カラムを用いて修飾エキセンジン−4のバッファー交換を行い,次にこれを0.001−1.0%(w/v)の3−メチルフェノールを含むリン酸バッファー(pH7.0−8.0)に溶解した。
実施例5.式IVの構造を有するmPEG誘導体(Mn:40,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体
1.0mgのエキセンジン−4類似体(配列番号251)を4.0mlのリン酸バッファー(pH7.0)に加えた。280mgの分子量40,000DaのN−ヒドロキシスクシンイミド活性化mPEG誘導体(式IV)を,上で製造したエキセンジン−4類似体と混合し,振盪テーブル上に置いて,室温で1時間反応させた。その後,250mlのビーカー中で反応混合物を200mlのBristrisバッファー(pH7.0)で希釈して,以降の実験に用いた。
1.0mgのエキセンジン−4類似体(配列番号251)を4.0mlのリン酸バッファー(pH7.0)に加えた。280mgの分子量40,000DaのN−ヒドロキシスクシンイミド活性化mPEG誘導体(式IV)を,上で製造したエキセンジン−4類似体と混合し,振盪テーブル上に置いて,室温で1時間反応させた。その後,250mlのビーカー中で反応混合物を200mlのBristrisバッファー(pH7.0)で希釈して,以降の実験に用いた。
DEAE FFまたはANX FFアニオン交換カラムをBistrisバッファー(pH7.0)で平衡化した。希釈した反応混合物をアニオン交換カラムに負荷して,標的物質をアニオン交換樹脂に吸着させた。単一または複数修飾エキセンジン−4類似体は,異なる濃度のNaClの直線勾配溶出により溶出し,フラクションコレクターで溶出物を回収した。次に,1MNaClを用いて未修飾エキセンジン−4ペプチドを溶出した。分離および精製プロセスからの溶出画分を図3に示す。図中,ラベル2,3および4は,それぞれ,複数mPEG修飾エキセンジン−4類似体,単一mPEG修飾エキセンジン−4類似体および未修飾エキセンジン−4類似体の溶出ピークを示す。修飾エキセンジン−4類似体をSDS−PAGEでゲル電気泳動で分離した。SDS−PAGEにより決定された修飾エキセンジン−4類似体の分子量(理論的分子量は44,300Daである)は,43,000Daよりわずかに大きく(図4),このことは,得られた生成物が確かに単一mPEG誘導体(Mn:40,000Da)修飾エキセンジン−4類似体であることを示す。
回収された単一mPEG修飾エキセンジン−4類似体を含む溶出物を限外濾過装置(限外濾過チューブまたは限外濾過デバイス)を用いて濃縮した。濃縮した溶液を脱塩カラムに負荷して,酢酸バッファーに交換した。最後に,等張調節剤(マンニトールおよび0.9%NaCl等)および0.001−1.0%(w/v)の抗菌剤(3−メチルフェノール等)を,修飾エキセンジン−4類似体を含む酢酸バッファーに加えた。
実施例6.単一mPEG誘導体(Mf:5,000DaおよびMn:21,000Da)修飾エキセンジン類似体の24時間薬剤効果試験
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,各群につき8マウス,合計4群
対照群1:滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群2:0.025μgのエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群1:0.625μgの単一mPEG誘導体(Mf:5,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群2:単一mPEG誘導体(Mn:21,000Da)で修飾した0.625μgのエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,各群につき8マウス,合計4群
対照群1:滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群2:0.025μgのエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群1:0.625μgの単一mPEG誘導体(Mf:5,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群2:単一mPEG誘導体(Mn:21,000Da)で修飾した0.625μgのエキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤注射から4,8,12,16および24時間後に各マウス群から血液サンプルを採取した。血液サンプリングの30分前に200μlの20%グルコース溶液を各マウスの腹部に注射した。血糖レベルは,グルコース試薬キット(Shanghai Shen Suo Reagents Co.,Ltd.)を用いて測定した。図5に示すように,mPEG誘導体(Mn:21,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体は,注射の16時間後も有効であった。mPEG(Mf:5,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体の有効時間は薬剤注射後12−16時間の間であった。未修飾エキセンジン−4類似体の有効時間は12時間未満であった。血糖レベルを低下させる有効時間は,より大きい分子量の直鎖状mPEG誘導体で修飾したエキセンジン−4類似体を用いた場合,より小さい分子量の直鎖状mPEG誘導体で修飾したエキセンジン−4類似体より長かった。
実施例7.直鎖状mPEG(Mn=21,000Da)および式IVの構造を有する(Mn=40,000Da)分枝鎖mPEGで修飾したエキセンジン類似体の72−時間薬剤効果試験
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,各群につき8匹のマウス,合計5群
対照群1:滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群2:0.025μgのエキセンジン−4ペプチドを各マウスの皮下に注射した。
対照群3:0.025μgのエキセンジン類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群1:0.625μgのmPEG(Mn:21,000Da)修飾エキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群2:0.625μgのmPEG(Mn:40,000Da)修飾エキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,各群につき8匹のマウス,合計5群
対照群1:滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群2:0.025μgのエキセンジン−4ペプチドを各マウスの皮下に注射した。
対照群3:0.025μgのエキセンジン類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群1:0.625μgのmPEG(Mn:21,000Da)修飾エキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群2:0.625μgのmPEG(Mn:40,000Da)修飾エキセンジン−4類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤注射の4,8,24,48および72時間後に各マウス群から血液サンプルを採取した。それぞれの血液サンプリングの30分前に200μlの20%グルコース溶液を各マウスの腹部に注射した。血糖レベルはグルコース試薬キットを用いて測定した。図6に示されるように,分枝鎖PEG誘導体(Mn:40,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体は薬剤注射の少なくとも72時間後まで有効であった。直鎖状mPEG誘導体(Mn:21,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体は薬剤注射後約24時間有効であった。
実施例8.単一のmPEG誘導体で修飾したエキセンジン−4類似体の薬剤効果試験
試験サンプル:合計8サンプル,それぞれ21,000Da,30,000Da,40,000Daの分子量を有する単一のmPEG誘導体(式II)修飾したエキセンジン−4類似体;それぞれ21,000Da,30,000Da,40,000Daの分子量を有する単一のmPEG誘導体(式IV)で修飾したエキセンジン−4類似体;それぞれ分子量21,000Daおよび30,000Daの直鎖状mPEG誘導体で修飾したエキセンジン−4類似体
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,3サンプリング群,各サンプリング群につき24匹のマウス
試験サンプル:合計8サンプル,それぞれ21,000Da,30,000Da,40,000Daの分子量を有する単一のmPEG誘導体(式II)修飾したエキセンジン−4類似体;それぞれ21,000Da,30,000Da,40,000Daの分子量を有する単一のmPEG誘導体(式IV)で修飾したエキセンジン−4類似体;それぞれ分子量21,000Daおよび30,000Daの直鎖状mPEG誘導体で修飾したエキセンジン−4類似体
試験動物:C57マウス,20g+/−2g,3サンプリング群,各サンプリング群につき24匹のマウス
マウスは頻繁な血液サンプリングに耐えられないため,サンプルを注射した後の異なる時間にサンプリング群から血液を採取するよう設計した。薬剤注射後の血液サンプリングスケジュールは以下のとおりであった。
第1群 2,8,72時間
第2群 4,24,48時間
第3群 16,36,60時間
第1群 2,8,72時間
第2群 4,24,48時間
第3群 16,36,60時間
各サンプリング群をさらに8のサブグループに分けた。各サブグループは3匹のマウスから構成された。試験の最初に各サブグループに異なる修飾エキセンジン−4類似体を注射した。これらは,L21K,L30K(それぞれ分子量21,000Daおよび30,000Daの単一の直鎖状mPEG誘導体による修飾);Y21K,Y30K,Y40K(式IVの構造を有し,それぞれ分子量21,000Da,30,000Daおよび40,000Daの単一のmPEG誘導体による修飾),U21K,U30K,U40K(式IIの構造を有し,それぞれ分子量21,000Da,30,000Daおよび40,000Daの単一のmPEGで修飾したエキセンジン−4類似体)と称される。種々のmPEG修飾エキセンジン−4類似体はすべて0.625μgのエキセンジン−4類似体を含んでいた。薬剤注射の直後に,200μlの20%グルコースをマウスの腹部空間に注射した。30分後,血液サンプルをすべてのマウスから採取した。続く血液サンプリングは,上述のサンプリングスケジュール表にしたがって実施した。各血液サンプリングの30分前にマウスの腹部空間に200μlの20%グルコースを注射した。図7−9は,PEG誘導体の分子構造および分子量がエキセンジン−4類似体の生物活性に大きく影響することを示す。薬剤注射後72時間,式IIの構造を有する単一のmPEGで修飾したエキセンジン−4類似体の生物活性は,式IVの構造を有するPEGおよび直鎖状PEGで修飾したエキセンジン−4類似体より長時間有効であった。同じ分枝構造を有する単一のPEGで修飾したエキセンジン−4類似体については,分子量が大きければ大きいほど,72時間の間に血糖レベルを低下させるより高い生物活性を示した。L30Kは,薬剤注射の72時間後までには顕著な生物活性を有さず,このことは,より大きい分子量の直鎖状PEGは修飾エキセンジン−4類似体の生物活性に負の影響を有することを示す。
実施例9.単一のPEGで修飾したエキセンジン−4類似体の薬物動態試験
試験動物:SDマウス,雄,250g−300g,2群,各群につき4匹のマウス
薬剤群1:それぞれのマウスに,4.375μgのエキセンジン−4類似体(U30K)を含有する,単一のmPEG誘導体(式II,Mn:30,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体(配列番号251)を注射した。
薬剤群2:それぞれのマウスに,4.375μgのエキセンジン−4類似体(Y40K)を含有する,単一のmPEG誘導体(式IV,Mn:40,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体(配列番号251)を注射した。
試験動物:SDマウス,雄,250g−300g,2群,各群につき4匹のマウス
薬剤群1:それぞれのマウスに,4.375μgのエキセンジン−4類似体(U30K)を含有する,単一のmPEG誘導体(式II,Mn:30,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体(配列番号251)を注射した。
薬剤群2:それぞれのマウスに,4.375μgのエキセンジン−4類似体(Y40K)を含有する,単一のmPEG誘導体(式IV,Mn:40,000Da)で修飾したエキセンジン−4類似体(配列番号251)を注射した。
薬剤注射の0,2,4,8,12,16,24,36,48,60および72時間後にすべてのマウス群から血液サンプルを採取した。血液中のエキセンジン−4の濃度は,Phoenix Pharmaceuticals,Inc.,(California,U.S.A.)から購入した酵素イムノアッセイキット(EIA)を用いて測定した。データは,Pharmaceutical Kinetics Software 1.0.2(Shanghai Hongneng Software Co.Ltd.)を用いて分析した。結果を図10に示す。U30Kの半分が吸収されるのに要した時間は10.78時間であり,U30Kの半分が排除されるのに要した時間は21.44時間であった。Y40Kの半分が吸収されるのに要した時間は5.53時間であり,Y40Kの半分が排除されるのに要した時間は40.77時間であった。2つのサンプルが血液中でピーク濃度に到達した時間は,薬剤注射の約12時間後であった。血中の2つのサンプルのピーク濃度は約20ng/mlであった。
上で述べたように,上述の記載は単に本発明の種々の態様を例示することを意図するものである。上述した特定の修飾は,本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。当業者には,本発明の範囲から逸脱することなく種々の同等物,変更,および改変をなすことができることが明らかであり,そのような同等の態様も本明細書に含まれることが理解される。
Claims (17)
- エキセンジンまたはエキセンジン類似体の1またはそれ以上のアミノ酸に連結された1またはそれ以上のPEG誘導体を含むPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって,前記1またはそれ以上のPEG誘導体は分枝構造を含み,および前記1またはそれ以上のPEG誘導体の分子量は20,000Daを超える,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- エキセンジンまたはエキセンジン類似体の1またはそれ以上のアミノ酸に連結された1またはそれ以上のPEG誘導体を含むPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって,前記1またはそれ以上のPEG誘導体は,下記の式I:
に示される分枝構造を有することを特徴とする,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。 - エキセンジンまたはエキセンジン類似体の1またはそれ以上のアミノ酸に連結された1またはそれ以上のPEG誘導体を含むPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって,前記1またはそれ以上のPEG誘導体は,下記の式III:
に示される分枝構造を有することを特徴とする,PEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。 - エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号3−229に示される1またはそれ以上のアミノ酸配列を含む,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- エキセンジンまたはエキセンジン類似体は,配列番号230−265に示される1またはそれ以上のアミノ酸配列を含む,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 前記1またはそれ以上のPEG誘導体は,20,000Daを超えて約50,000Daまでの範囲の分子量を有する,請求項1記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 前記1またはそれ以上のPEG誘導体は,約5,000Daから約50,000Daの範囲の分子量を有する,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 前記1またはそれ以上のPEG誘導体は,N−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されて前記エキセンジンまたはエキセンジン類似体に連結される,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 1,2,3または4個の分枝鎖PEG誘導体を含む,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 1つの分枝鎖PEG誘導体を含む,請求項13記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
- 請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物。
- 糖尿病の予防または治療用の医薬品の製造における,請求項1,2,3,4,または5のいずれかに記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体の使用。
- 糖尿病を治療する方法であって,請求項1,2,3,4,または5記載のPEG修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を被験者に投与することを含む方法。
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