CN100344323C - 一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 - Google Patents
一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100344323C CN100344323C CNB2004100668974A CN200410066897A CN100344323C CN 100344323 C CN100344323 C CN 100344323C CN B2004100668974 A CNB2004100668974 A CN B2004100668974A CN 200410066897 A CN200410066897 A CN 200410066897A CN 100344323 C CN100344323 C CN 100344323C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- human glucagon
- polyethylene glycol
- methoxy polyethylene
- mpeg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法,属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。该复合物中的人胰高血糖素样肽-1指人胰高血糖素样肽-1(7-37)或人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2,该复合物由人胰高血糖素样肽-1和含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇组成,两者通过前者的氨基酸游离氨基和后者的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起。将人胰高血糖素样肽-1与含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇进行mPEG修饰反应,两者连结成人胰高血糖素样肽-1的复合物,即mPEG-GLP-1。本发明的方法操作简便,原料易得。本发明的方法制备的产物,人胰高血糖素样肽-1生物稳定性高,体内半衰期长,生物利用度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法,确切说,涉及一种单甲氧基聚乙二醇-人胰高血糖素样肽-1,即mPEG-GLP-1的复合物及其制备方法,属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术
糖尿病是世界性疾病,发病率居高不下,对人类健康构成严重威胁。据国际糖尿病研究所(IDI)2003年的最新报告预测,全球糖尿病患者已达1.94亿人,按照目前的增长速度,到2025年,患病人数将达到3.33亿。我国已有糖尿病患者4000多万,而在20世纪80年代初,我国糖尿病发病率仅为0.67%,现在北京、上海等地发病率均已超过10%,而且这个数字还在继续增加。据统计,普通糖尿病患者用于治疗的年花费为3726元,而糖尿病患者需终生用药,因此开发高效低价的糖尿病新药具有诱人前景。
人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)主要是由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌的一种31肽的多肽激素,分子量约为3.355KD。人胰高血糖素样肽-1的主要生理作用包括:(1)葡萄糖依赖性促胰岛素释放作用。其作用机制是通过与胰腺β细胞表面的特异受体相互作用,使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增加。(2)刺激生长抑素释放和抑制胰高血糖素的分泌。(3)抑制胃壁细胞分泌胃酸,延长胃的排空。(4)增加饱足感,抑制食欲,降低能量的摄取。基于上述研究结果,人胰高血糖素样肽-1有望成为治疗糖尿病尤其是II型糖尿病的多肽药物。人胰高血糖素样肽-1的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖的浓度,用其治疗糖尿病不会发生低血糖,显示其在糖尿病尤其是II型糖尿病治疗方面良好的应用前景。但人胰高血糖素样肽-1是一种生物活性小肽,在体内很容易被一种特异的二肽酰基肽酶IV(DPP IV)降解而造成生物稳定性差,体内半衰期仅为2-3分钟。皮下注射人胰高血糖素样肽-1产生的血药浓度高峰只能维持很短的时间,若用于糖尿病治疗,需每日皮下注射3-4次,给患者带来痛苦或使患者不愿意接受。因此迫切需要研制生物半衰期长的人胰高血糖素样肽-1产品。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种人胰高血糖素样肽-1的复合物,该复合物中的人胰高血糖素样肽-1指人胰高血糖素样肽-1(7-37)或人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2,该复合物由人胰高血糖素样肽-1与含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇∶单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS组成,两者通过前者的氨基酸游离氨基和后者的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起,所述的单甲氧基聚乙二醇分子量为5~40KD。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备方法。本发明通过以下技术方案使上述技术问题得到解决。将人胰高血糖素样肽-1与含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇进行mPEG修饰反应,所述的单甲氧基聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,前者的氨基酸游离氨基与后者的琥珀酰亚胺酯键将人胰高血糖素样肽-1与含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇连结成人胰高血糖素样肽-1的复合物,即mPEG-GLP-1,所述的单甲氧基聚乙二醇分子量为5~40KD。
现详细说明本发明的技术方案。一种人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备方法,其特征在于,具体操作步骤如下:
第一步,将1份重量的人胰高血糖素样肽-1溶解于500份重量的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与500份重量的200mM,pH6.0~9.0磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和,人胰高血糖素样肽-1是人胰高血糖素样肽-1(7-37);
第二步,向第一步的溶液中加入1.5~119.0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇,混和均匀,所述的单甲氧基聚乙二醇是分子量为5~40KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS;
第三步,将第二步的溶液置于4~40℃下进行mPEG修饰反应0.5~24小时;
第四步,将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应,至此,制得人胰高血糖素样肽-1的复合物粗品溶液;
第五步,取经第四步制得的粗品溶液用20mM,pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍,上Sepharose FF CM层析柱,用含0~1MNaCl的20mM,pH4.2醋酸-醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱,流速为0.1~1ml/min,在波长为280nm处收集3个吸收峰中的中间一个吸收峰的洗脱溶液;
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.2~3.9份重量的产物,即人胰高血糖素样肽-1的复合物纯品,所述产物的分子量介于8.355~43.355KD。
第六步所述的产物具有本发明提出的结构:由人胰高血糖素样肽-1和含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇组成,两者通过人胰高血糖素样肽-1的氨基酸游离氨基和单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起。
本发明的技术方案的进一步特征在于,在上述制备方法的第一步中,人胰高血糖素样肽-1是人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2。
上述制备过程中的人胰高血糖素样肽-1有化学合成或基因工程制备之分。前者可由任何生物技术公司合成;后者见本发明人的申请号和名称分别为200410054397.9和题为“高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌及其构建方法和应用”的中国发明专利申请。分子量介于5~40KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,两者均可从Nektar公司购得。
本发明的优点是:利用人胰高血糖素样肽-1的氨基酸游离氨基与单甲氧基聚乙二醇的活化琥珀酰亚胺酯键在温和的生理状态下进行反应,形成酰胺键,从而使得到的单甲氧基聚乙二醇-人胰高血糖素样肽-1的复合物的性质十分稳定,不易被水解分离;由于使用的修饰剂mPEG为高亲水性的线性无毒的高分子化合物,当其与人胰高血糖素样肽-1稳定结合后能在人胰高血糖素样肽-1分子表面形成一种屏障,使得人胰高血糖素样肽-1不易被体内的蛋白酶降解,从而提高其生物稳定性;同时由于经mPEG修饰的人胰高血糖素样肽-1分子量增大,因而在体内的半衰期延长,提高了人胰高血糖素样肽-1的生物利用度。用本方法制备人胰高血糖素样肽-1的复合物,方法简便,原料易得,生产成本低。
附图说明
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。
图1为制得的mPEG-GLP-1(7-37)的SDS-PAGE电泳图。1是GLP-1(7-37)对照;2、3和4分别是不同重量的分子量为5KD的mPEG-SPA与GLP-1(7-37)的反应结果。
图2为mPEG-GLP-1(7-37)的CM Sepharose FF层析分离纯化图。其中,5是穿透峰(含多点修饰的mPEG-GLP-1(7-37));6是单点修饰的mPEG-GLP-1(7-37)吸收峰;7是未修饰的GLP-1(7-37)吸收峰。
图3为mPEG-GLP-1(7-37)纯品(未冷冻干燥)的SDS-PAGE电泳图。其中,8是单点修饰的mPEG-GLP-1(7-37);9是多点修饰的的mPEG-GLP-1(7-37)。
图4为mPEG-GLP-1(7-37)的降血糖作用结果图。图中结果显示:
(1)用基因工程方法制备的GLP-1(7-37)保持了天然GLP-1(7-37)降血糖的生物学活性;
(2)经mPEG化的GLP-1(7-37)保持了天然GLP-1(7-37)降血糖的生物学活性;
(3)经mPEG化的GLP-1(7-37)降血糖的时间显著延长。
具体实施方式
下面通过具体实施例,进一步详述本发明。以下实施例中所用mPEG、化学试剂等,以及未注明具体条件的实验方法,按常规或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备。在本实施例中,经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA,其分子量为5KD。
第一步,将1.0mg人胰高血糖素样肽-1(7-37)溶解于0.5ml的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与0.5ml的pH6.0-9.0的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入1.5mg分子量为5KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA,混和均匀;
第三步,将第二步所得的溶液置于4℃~40℃下进行mPEG修饰反应0.5~24小时;
第四步,将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应,至此,制得人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物粗品溶液;
说明:取20ul人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物粗品溶液进行SDS-PAGE电泳,检查mPEG修饰程度,结果见图1。
第五步,取经第四步制得的粗品溶液用20mM,pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍,上Sepharose FF CM层析柱,用含0~1MNaCl的20mM,pH4.2醋酸-醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱,流速为0.1~1ml/min,在波长为280nm处收集3个吸收峰中的中间一个吸收峰的洗脱溶液;
说明:参见图2,图中,5是3个吸收峰中的第一个吸收峰,即穿透峰(含多点修饰的mPEG-GLP-1(7-37)吸收蜂);6是3个吸收峰中的中间一个吸收峰,即单点修饰的mPEG-GLP-1(7-37)吸收峰;7是3个吸收峰中的第三个吸收峰,即未修饰的GLP-1(7-37)吸收峰。从与吸收峰5、6对应的洗脱液中各取20ul进行SDS-PAGE电泳,结果示于图3,图中,8是单点修饰的mPEG-GLP-1(7-37),9是多点修饰的mPEG-GLP-1(7-37)。
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.2mg的、分子量为8.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
上述第二步中,分子量为5KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA的加入量可分别为7.5mg和15mg;上述第六步中,可分别得到0.7和0.5mg的分子量为8.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
在第一步中,用人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2代替人胰高血糖素样肽-1(7-37),也可以得到类似于上述第六步的结果。
实施例2人胰高血糖素样肽-l的复合物的制备。在本实施例中,经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇为分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,其分子量为10KD。
第一步,将1.0mg人胰高血糖素样肽-l(7-37)溶解于0.5ml的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与0.5ml的pH6.0~9.0的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入3.0mg分子量为10KD的分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,混和均匀;
第三步至第五步按实施例一中相应操作步骤进行。
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.4mg的、分子量为13.355KD的人胰高血糖素样肽-l(7-37)的复合物纯品。
上述第二步中,分子量为10KD的分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS的加入量可分别为15.0mg和30.0mg;上述第六步中,可分别得到1.2和0.8mg的分子量为13.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
在第一步中,用人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2代替人胰高血糖素样肽-1(7-37),也可以得到类似于上述第六步的结果。
实施例3人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备。在本实施例中,经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA,其分子量为20KD。
第一步,将1.0mg人胰高血糖素样肽-l(7-37)溶解于0.5ml的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与0.5ml的pH8.4的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入6.0mg分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA,混和均匀;
第三步至第五步按实施例一中相应操作步骤进行。
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.7mg的、分子量为23.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
上述第二步中,分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA的加入量可分别为30.0mg和60.0mg;上述第六步中,可分别得到2.1和1.4mg的分子量为23.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
在第一步中,用人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2代替人胰高血糖素样肽-1(7-37),也可以得到类似于上述第六步的结果。
实施例4人胰高血糖素样肽-1的制备。在本实施例中,经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇为分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,其分子量为40KD。
第一步,将1.0mg人胰高血糖素样肽-1(7-37)溶解于0.5ml的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与0.5ml的pH8.4的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入11.9mg分子量为40KD的分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,混和均匀;
第三步至第五步按实施例一中相应操作步骤进行。
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到1.3mg的、分子量为43.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
上述第二步中,分子量为40KD的分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS的加入量可分别为59.5mg和119.0mg;上述第六步中,可分别得到3.9和2.6mg的分子量为43.355KD的人胰高血糖素样肽-1(7-37)的复合物纯品。
在第一步中,用人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2代替人胰高血糖素样肽-1(7-37),也可以得到类似于上述第六步的结果。
实施例5人胰高血糖素样肽-1复合物的降血糖作用。
实验材料与方法:
雄性健康昆明小鼠(清洁级,上海复旦大学医学院动物中心提供);
50%葡萄糖溶液,0.9%NaCl溶液,GLP-1(7-37);
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司);
雄性健康昆明小鼠禁食过夜,分为4组,每组6只。第1组,生理盐水对照组;第2组,葡萄糖对照组;第3组,GLP-1(7-37)给药组;第4组,mPEG-GLP-1(7-37)给药组,所述的mPEG-GLP-1(7-37)是实施例1的制备产物。
第1组腹腔注射100ul生理盐水;第2组腹腔注射100ul 50%葡萄糖溶液;第3组腹腔注射100ul 50%葡萄糖溶液和0.4ug的GLP-1(7-37);第4组腹腔注射100ul 50%葡萄糖溶液和1ug的mPEG-GLP-1(7-37)。记此时为零时刻。分别于10、30、60、90、120、150、180、210、240分钟进行小鼠尾静脉取血10ul,用血糖测试仪测定血糖浓度。为长时间观察mPEG-GLP-1(7-37)降血糖作用,第2组、第3组和第4组的小鼠于60、150分钟尾静脉取血后立即再次给予50ul 50%葡萄糖溶液,第1组只注射50ul生理盐水,按相同时间间隔测定血糖。
结果如图4所示,所示数值均为6只小鼠的血糖平均值。与葡萄糖组小鼠相比,在给药后60分钟之内,GLP-1(7-37)给药组和mPEG-GLP-1(7-37)给药组均能降低小鼠血糖,说明按本发明方法制备出的mPEG-GLP-1(7-37)复合物保留了GLP-1(7-37)的生物学活性。90分钟后,GLP-1(7-37)组小鼠与葡萄糖组小鼠的血糖值没有区别,提示GLP-1(7-37)已代谢完,不再具有降血糖作用。而mPEG-GLP-1(7-37)给药组的小鼠血糖一直低于葡萄糖组,且基本保持稳定,说明mPEG-GLP-1(7-37)的半衰期延长,仍能有效地控制血糖浓度。
本实施例中所用的mPEG-GLP-1(7-37)也可是实施例2至实施例4所制备的产物。它们按照本实施例的方法进行活性测定,均得到了类似的实验结果。
本实施例中所用的人胰高血糖素样肽-1也可是人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2,按照本实施例的方法进行活性测定,均得到了类似的实验结果。
Claims (3)
1.一种人胰高血糖素样肽-1的复合物,其特征在于,该复合物由人胰高血糖素样肽-1与单甲氧基聚乙二醇组成,该复合物中的人胰高血糖素样肽-1指人胰高血糖素样肽-1(7-37)或人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2,该复合物中的聚乙二醇为经琥珀酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇:单甲氧基聚乙二醇-丙氨酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分支状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS,所述的经活化的单甲氧基聚乙二醇分子量为5~40KD,该复合物是通过人胰高血糖素样肽-1中的游离氨基和单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起的单点修饰产物。
2.权利要求1所述的人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备方法,其特征在于,具体操作步骤如下:
第一步,将1份重量的人胰高血糖素样肽-1(7-37)溶解于500份重量的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与500份重量的200mM,pH6.0~9.0磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入1.5~119.0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇,混和均匀,所述的单甲氧基聚乙二醇是分子量为5~40KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS;
第三步,将第二步的溶液置于4~40℃下进行mPEG修饰反应0.5~24小时;
第四步,将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应,至此,制得人胰高血糖素样肽-1的复合物粗品溶液;
第五步,取经第四步制得的粗品溶液用20mM,pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍,上Sepharose FF CM层析柱,用含0~1MNaCl的20mM,pH4.2醋酸-醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱,流速为0.1~1ml/min,在波长为280nm处收集3个吸收峰中的中间一个吸收峰的洗脱溶液;
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.2~3.9份重量的产物,即人胰高血糖素样肽-1的复合物纯品,所述产物的分子量介于8.355~43.355KD。
3.权利要求1所述的人胰高血糖素样肽-1的复合物的制备方法,其特征在于,具体操作步骤如下:
第一步,将1份重量的人胰高血糖素样肽-1(7-36)NH2溶解于500份重量的100mM,pH7.4磷酸盐缓冲液中,再与500份重量的200mM,pH6.0~9.0磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和;
第二步,向第一步的溶液中加入1.5~119.0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇,混和均匀,所述的单甲氧基聚乙二醇是分子量为5~40KD的单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺,即mPEG-SPA或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,即mPEG-NHS;
第三步,将第二步的溶液置于4~40℃下进行mPEG修饰反应0.5~24小时;
第四步,将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应,至此,制得人胰高血糖素样肽-1的复合物粗品溶液;
第五步,取经第四步制得的粗品溶液用20mM,pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍,上Sepharose FF CM层析柱,用含0~1MNaCl的20mM,pH4.2醋酸-醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱,流速为0.1~1ml/min,在波长为280nm处收集3个吸收峰中的中间一个吸收峰的洗脱溶液;
第六步,将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1~5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩,冷冻干燥,得到0.2~3.9份重量的产物,即人胰高血糖素样肽-1的复合物纯品,所述产物的分子量介于8.355~43.355KD。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100668974A CN100344323C (zh) | 2004-09-30 | 2004-09-30 | 一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100668974A CN100344323C (zh) | 2004-09-30 | 2004-09-30 | 一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1676163A CN1676163A (zh) | 2005-10-05 |
CN100344323C true CN100344323C (zh) | 2007-10-24 |
Family
ID=35049014
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2004100668974A Expired - Fee Related CN100344323C (zh) | 2004-09-30 | 2004-09-30 | 一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100344323C (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102827284B (zh) * | 2006-11-14 | 2015-07-29 | 上海仁会生物制药股份有限公司 | 带有聚乙二醇基团的Exendin或其类似物及其制剂和用途 |
CN102786590A (zh) * | 2011-05-19 | 2012-11-21 | 江苏豪森药业股份有限公司 | 分枝型peg修饰的glp-1类似物及其可药用盐 |
CN102363633B (zh) * | 2011-11-16 | 2013-11-20 | 天津拓飞生物科技有限公司 | 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用 |
CN103724424B (zh) * | 2013-12-27 | 2015-05-27 | 浙江省农业科学院 | 一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030195154A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
CN1524516A (zh) * | 2003-09-18 | 2004-09-01 | 中国人民解放军第二军医大学 | 胰高血糖素样肽-1缓释微球制剂及其用途 |
-
2004
- 2004-09-30 CN CNB2004100668974A patent/CN100344323C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030195154A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
CN1524516A (zh) * | 2003-09-18 | 2004-09-01 | 中国人民解放军第二军医大学 | 胰高血糖素样肽-1缓释微球制剂及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
壳寡糖的研究进展 中国生化药物杂志,第24卷第4期 2003 * |
治疗2型糖尿病新药胰高血糖素样肽-1的研究进展 刘青等,白求恩医科大学学报,第27卷第1期 2001 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1676163A (zh) | 2005-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1268640C (zh) | 胰高血糖素样肽-2的类似物 | |
CN101125207B (zh) | 带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途 | |
CN102026666B (zh) | 促胰岛素肽缀合物制剂 | |
CN101525386B (zh) | Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途 | |
CN102234310B (zh) | 一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法 | |
CN101993485A (zh) | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 | |
CN108640985A (zh) | 一种纯化索玛鲁肽的方法 | |
CN105061601A (zh) | 使用免疫球蛋白片段的胰岛素缀合物 | |
CN102010473A (zh) | 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用 | |
CN100344323C (zh) | 一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法 | |
CN102532303A (zh) | 聚乙二醇缀合的艾塞那肽的合成及应用 | |
CN1817904A (zh) | 截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)、制法及其应用 | |
CN1982336A (zh) | 一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用 | |
CN100392070C (zh) | 表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
CN1651463A (zh) | 一种单甲氧基聚乙二醇-胰岛素复合物及其制备方法 | |
CN106279430B (zh) | Exendin‑4类似物融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN101220088A (zh) | 人胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白及其应用 | |
CN103333238A (zh) | 一种mPEG-MAL-aGLP-1复合物 | |
CN102234331A (zh) | Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用 | |
CN1289528C (zh) | 一种重组人干扰素-α1b复合物及其制备方法 | |
CN1861635A (zh) | 人胰高血糖素相关肽-2类似物 | |
CN102212127A (zh) | 胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途 | |
CN102585015A (zh) | 含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用 | |
CN1338463A (zh) | 一种增强多肽在体内稳定性的方法及其应用 | |
CN103087174B (zh) | 一种glp-1衍生物dlg3312及其固相化学合成方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20071024 Termination date: 20150930 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |