CN1289528C - 一种重组人干扰素－α1b复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。该复合物由重组人干扰素-α1b蛋白质和mPEG衍生物mPEG-SPA组成，两者通过前者的游离氨基与后者的羟基琥珀酰亚胺活化的活性基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于24.329～39.329KD。将含游离氨基的重组人干扰素-α1b蛋白质与mPEG衍生物mPEG-SPA修饰剂进行修饰反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，经离子交换层析、收集复合物部分、离心超滤浓缩、冷冻干燥，得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品。该复合物不但具有天然重组人干扰素-α1b的抗病毒生物学活性，而且还具有体内生物稳定性高、体内半衰期长和免疫原性减少的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人干扰素-α1b复合物及其制备方法，确切说，涉及一种mPEG(单甲氧基聚乙二醇)修饰重组人干扰素-α1b复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术
人干扰素-α1b(hIFN-α1b)是由人白细胞产生的一种由166个氨基酸组成的蛋白质，(其相对)分子量为19.329KD。目前已经能通过基因工程技术制备出重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)。1987年，重组人干扰素-α1b作为我国第一个进入工业化的基因工程药物被批准上市(郭葆玉主编“基因工程药学”，第二军医大学出版社，2000年10月第一版P151)。重组人干扰素-α1b具有广谱的抗病毒作用，目前主要用于治疗乙型和丙型肝炎，还可用于治疗疱疹、宫颈炎、结膜炎、尖锐湿疣等。但重组人干扰素-α1b是一种生物活性蛋白，在体内很容易被蛋白酶降解而造成生物稳定性差；同时重组人干扰素-α1b的分子量(相对)较小，为19.329KD，容易被肾小球滤过，因而体内半衰期较短。若要治愈疾病需反复长期注射药物，如治疗乙型肝炎的临床方案为：400万单位/次，肌肉注射，每日一次，连用3个月为一个疗程，有的病人需多个疗程，这样给病人带来痛苦和不便；此外，由于病人接受长期、反复、高剂量给药又会使其体内产生抗体，使所给药物不能正常发挥药理作用，生物利用度降低。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物，其特征在于，该复合物由重组人干扰素-α1b即rhIFN-α1b蛋白质和mPEG衍生物mPEG-SPA(单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺酯)组成，两者通过前者的游离氨基与后者的羟基琥珀酰亚胺活化的活性基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于24.329～39.329KD。mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物，即mPEG-rhIFN-α1b不但具有天然重组人干扰素-α1b的抗病毒生物学活性，而且具有体内生物稳定性高、体内半衰期长和免疫原性减少的优点。
所述的人干扰素-α1b复合物的进一步特征在于，所述的游离氨基是赖氨酸的ε-NH2或N末端的α-NH2。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是将含游离氨基的重组人干扰素-α1b蛋白质与单甲氧基聚乙二醇衍生物mPEG-SPA，即mPEG修饰剂进行修饰反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，经离子交换层析、收集复合物部分、离心超滤浓缩、冷冻干燥，得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品。
现详细说明本发明的技术方案。一种mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：
第一步 将1份重量的重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于500份重量的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与500份重量的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入0.25～10份重量的mPEG-SPA修饰剂，混匀成反应液，所述的mPEG-SPA修饰剂的分子量介于5～20KD；
第三步 将第二步的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；
第四步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，取20μl反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度；
第五步 用pH4.2的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的反应液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.2的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的多态性；
第七步 将第六步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量介于24.329～39.329KD。
本发明所述的重组人干扰素-α1b蛋白质为上海生物制品研究所用基因工程技术制备出来的产品。mPEG修饰剂为含羟基琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇衍生物，NEKTAR公司有售。
上述方法制得的产物具有本发明提出的结构：该产物由重组人干扰素-α1b即rhIFN-α1b蛋白质和mPEG衍生物mPEG-SPA组成，两者通过前者的游离氨基与后者的羟基琥珀酰亚胺活化的活性基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于24.329～39.329KD。
本发明的优点是：mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物中的酰胺键极为稳定，使mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物性质稳定，不易被水解分离；修饰剂mPEG为高亲水性的线性无毒的高分子化合物，与重组人干扰素-α1b蛋白质稳定结合后，能在重组人干扰素的蛋白质分子表面形成屏障，使mPEG修饰重组人干扰素-α1b不易被体内的蛋白酶降解，提高了其生物稳定性；mPEG修饰重组人干扰素-α1b在体内的半衰期长，提高了mPEG修饰重组人干扰素-α1b的生物利用度。
附图说明
图1为用本发明方法制得的mPEG-rhIFN-α1b的SDS-PAGE电泳图谱，其中，1是蛋白质分子质量标准，2是rhIFN-α1b对照，3是分子量为5KD的mPEG-SPA与rhIFN-α1b反应混合物电泳图谱，显示修饰产物的多态性：既含单点修饰产物，也含多点修饰产物，4是分子量为20KD的mPEG-SPA与rhIFN-α1b反应混合物电泳图谱，显示修饰产物的多态性。
图2为用本发明方法制得的mPEG-rhIFN-α1b的CM Sepharose FF层析分离纯化图，其中，5是第一洗脱峰，6是第二洗脱峰，7是第三洗脱峰。mPEG-rhIFN-α1b复合物中的mPEG的分子量为20KD。第一洗脱峰5是多点修饰的mPEG-rhIFN-α1b产物，第二洗脱峰6是单点修饰的mPEG-rhIFN-α1b产物，第三洗脱峰7是未修饰的rhIFN-α1b产物。
图3为与图2中各洗脱峰纯化产物的SDS-PAGE电泳图谱，其中，8是图2中第一洗脱峰5多点修饰的mPEG-rhIFN-α1b产物，9是图2中第二洗脱峰6单点修饰的mPEG-rhIFN-α1b产物，10是图2中第三洗脱峰7未修饰的rhIFN-α1b产物，11是蛋白质分子量标准。
具体实施方式
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。所有的实施例均按照上述的制备方法进行操作。
实施例1 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG衍生物mPEG-SPA，分子量为5KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入0.25mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步 将第二步所得的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；
第四步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，取20μl反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度，结果见图1；
第五步 用pH4.2的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的粗品溶液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.2的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的多态性；
第七步 将第六步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.2～0.3mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为24.329KD。
实施例2 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG的衍生物mPEG-SPA，分子量为5KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入1.25mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步至第六步按实施例1中相应操作步骤进行；
第七步 将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.5～0.7mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为24.329KD。
实施例3 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG的衍生物mPEG-SPA，分子量为5KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入2.5mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步至第六步按实施例1中相应操作步骤进行；
第七步 将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.4～0.5mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为24.329KD。
实施例4 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG的衍生物mPEG-SPA，分子量为20KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入1.0mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步 将第二步所得的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；
第四步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，取20μl反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度，结果见图1；
第五步 取第四步制得的粗品溶液用pH4.2的20mM醋酸缓冲液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.2的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值，结果见图2；
第六步 对第五步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的多态性，结果见图3；
第七步 将第六步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.35～0.45mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为39.329KD。
实施例5 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG的衍生物mPEG-SPA，分子量为20KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步 向第一步溶液中加入5.0mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步至第六步按实施例4中相应操作步骤进行；
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到1.50～2.00mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为39.329KD。
实施例6 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG修饰剂为mPEG的衍生物mPEG-SPA，分子量为20KD。
第一步 将1.0mg重组人干扰素-α1b溶解于0.5ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与0.5ml的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入10.0mg mPEG-SPA，混匀成反应液；
第三步至第六步按实施例4中相应操作步骤进行；
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到1.20～1.80mg的单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量为39.329KD。
实施例7 mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的生物学活性测定
上述实施例4所制备的单点修饰产物和重组人干扰素-α1b蛋白质样品，按照由化学工业出版社出版(2000年版)的《中国生物制品规程》P372-P375所述“干扰素效价测定(细胞病变抑制法)”测定其生物学活性。结果示于表1。结果表明重组人干扰素-α1b的单点修饰产物保留了其生物学活性。
表1 rhIFN-α1b和单点修饰产物的生物学活性
| 单点修饰产物 | rhIFN-α1b | |
| 生物学活性IU比活性IU/mg | 1094571094570 | 2338202338200 |
本实施例所用的mPEG-rhIFN-α1b也可用实施例1至实施例3以及实施例5至实施例6所制备的修饰产物代替。它们按照本实施例的方法进行活性测定，均得到类似的结果。
Claims (3)
1.一种mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物，其特征在于，该复合物由重组人干扰素-α1b即rhIFN-α1b蛋白质和mPEG衍生物mPEG-SPA组成，两者通过前者的游离氨基与后者的羟基琥珀酰亚胺活化的活性基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于24.329～39.329KD。
2.根据权利要求1所述的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物，其特征在于，所述的游离氨基是赖氨酸的ε-NH2或N末端的α-NH2。
3.权利要求1或2所述的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：
第一步将1份重量的重组人干扰素-α1b蛋白质溶解于500份重量的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，与500份重量的pH8.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步向第一步溶液中加入0.25～10份重量的mPEG-SPA修饰剂，混均成反应液，所述的mPEG-SPA修饰剂的分子量介于5～20KD；
第三步将第二步的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；
第四步用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物粗品溶液，取20μl反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度；
第五步用pH4.2的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的反应液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.2的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；
第六步对第五步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物的多态性；
第七步将第六步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到单点修饰的mPEG修饰重组人干扰素-α1b复合物纯品，分子量介于24.329～39.329KD。
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