CN1654478A - 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由活化聚乙二醇共价键修饰α－干扰素1b的制备方法。通过改变反应体系的酸碱度以达到选择性修饰α－干扰素1b蛋白表面的组氨酸或赖氨酸的目的。反应过程不需要对反应中的α－干扰素1b原料以及其中间产物进行分离，得到修饰后聚乙二醇α－干扰素1b新型化合物能保持原有α－干扰素1b的生物活性，但在药理，免疫原性及药代药效等方面优于原有蛋白。

Description

聚乙二醇修饰α-干扰素1b的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新颖而简易的生物蛋白大分子药物化学修饰的技术，以及由该技术所获得的产品及其产品的用途。本方法可将蛋白表面特定的氨基酸进行共价键化学修饰而不会影响或减低生物蛋白大分子药物的生物活性。这是一种特殊的聚乙二醇-生物大分子药物制备方法，特别是聚乙二醇修饰α-干扰素1b的制备方法。
背景技术
一般说来，许多由生物技术(如基因重组)表达所得到的产品(如干扰素、多肽或蛋白生物技术药物)，或经天然提取纯化而得到的生物大分子医药产品，都是通过非肠道给药途径而进入生物体内发挥其药理以及药效作用。此类由非肠道给药的生物大分子药物产品通常存在下面的一些问题：(1)生物大分子药物往往具有致敏性反应，生物体内产生的抗体会对生物体造成严重的伤害并影响治疗的进行；(2)生物大分子药物本身因受到抗体的影响或因蛋白分解酶而引发的代谢作用，而使其生物半衰期大为缩短；(3)生物大分子的稳定性差，保存困难。
目前，可以利用对生物大分子进行某种化学修饰的技术来解决上述问题。1980年，Davis等人在美国专利4,179,337中公开了利用单一分子不同聚合度的聚乙二醇对蛋白药物进行的化学修饰，在保持药物的生物活性同时，药物的抗原性降低，而其水溶性以及药物的生物半衰期等得到改善。与Davis专利类似，Verones等人在AppliedBiochem and Biotech 11，142(1985)上公开发表了用氯钾酸苯酯活化的聚乙二醇修饰核糖核酸酶和超氧化物岐化酶，增加了蛋白的生物半衰期。上述现有技术文献报导已表明聚乙二醇修饰技术的确可以解决非肠道给药生物大分子药物存在的一些问题。但该技术应用过程中也衍生出一些技术上的难题，例如：
(1)聚乙二醇对生物大分子的修饰是一种非选择性化学反应：蛋白质表面存在多处具有反应活性的氨基酸，这些有反应活性的氨基酸均可能与聚乙二醇进行反应。现有技术中聚乙二醇的修饰往往不能针对特定的氨基酸进行修饰，造成部分影响蛋白活性的氨基酸被聚乙二醇修饰，使得修饰后的产物活性降低或改变了蛋白的活性。
(2)聚乙二醇化学反应仅仅能够共价结合单一相同样链长的聚乙二醇：有些时候，单一相统一链长的聚乙二醇并不能完全达到增加生物利用度和延长生物活性半衰期的目的。此外，已有事实证明单一分子量5000的聚乙二醇和蛋白表面的组氨酸间的结合产物不稳定，已经形成的聚乙二醇-氨基酸共价键会迅速的断裂。生物大分子药物便完全丧失了聚乙二醇修饰的优势(Wang et al.，Advanced Drug Delivery Review 54，547，2002)。
目前，尚未见报道从修饰生物大分子药物制备工艺角度来改进或克服上述各个方面的问题。根据上述发表的技术文献报导可知，影响聚乙二醇-蛋白生物大分子药物的生物半衰期以及生物利用度(bioavailability)的两个主要的因素为；(1)选择蛋白表面被聚乙二醇修饰的氨基酸；(2)选择聚乙二醇的链长度、链型以及分支度。
因此，目前仍需要寻找一种能够对蛋白质分子上特定的氨基酸进行有针对性、选择性的修饰方法，并且能够使用不同结构的修饰物分别对蛋白表面不同种类氨基酸进行分别修饰。
本发明中，术语“聚乙二醇-生物大分子”表示由生物大分子(蛋白、核苷酸等)中的特定基团和活化的聚乙二醇反应经共价键联结而形成的产物，如聚乙二醇-α-干扰素。另外，聚乙二醇化生物大分子(蛋白)，聚乙二醇修饰的生物大分子(蛋白)或聚乙二醇生物大分子(蛋白)的意思等同。
“聚乙二醇”按聚合单位聚合方式的不同，分直链和支链型；按聚合度的不同，可以化分出不同分子量大小的聚乙二醇，如PEG 5000，PEG 8000，PEG 20000等等。
术语“单一相反应”是指采用相同聚合方式和聚合度(同样分子量)的聚乙二醇对生物大分子进行修饰。修饰反应可以一次完成，也可重复多次完成。
术语“多相反应”是指用不同聚合方式或不同聚合度(不同分子量)的聚乙二醇对生物大分子进行修饰。修饰反应需要经过至少两次或两次以上的重复反应才能完成。
“SS-PEG”指丁二酰亚胺基丁二酸聚乙二醇酯(SuccinimidylSuccinate Polyethelene Glycol)。
“SC-PEG”指丁二酰亚胺基碳酸聚乙二醇酯(SuccinimideCarbonate Polyethylene Glycol)。
发明内容
为了克服现有干扰素聚乙二醇修饰技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的聚乙二醇-生物大分子药物制备方法，并用于制备全新聚乙二醇-α-干扰素1b。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种经共价键结合的聚乙二醇修饰α-干扰素1b的制备方法，通过调节反应系统中的pH值，利用不同聚合方式或不同聚合链长度的活化线性聚乙二醇分步对α-干扰素1b蛋白表面的不同氨基酸进行特异性化学修饰，该活化聚乙二醇是丁二酰亚胺基C1-C6的烷酸聚乙二醇酯，包括以下两步步骤：
(A)在pH值为5-7的条件下，将活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b接触，使聚乙二醇与α-干扰素1b进行反应，对α-干扰素1b蛋白表面的组氨酸进行特异性化学修饰；
(B)在pH值为7-9的条件下，将活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b进行反应接触，对α-干扰素1b蛋白表面的赖氨酸进行特异性化学修饰；
上述(A)、(B)两步的顺序可以颠倒，两步反应之间通过pH调节剂使第一步反应系统的酸碱度调节到适合进行第二步反应的酸碱度。
上述制备方法中，步骤(A)反应pH较好的控制在5.5至6.5，优选6.0-6.5，最优选6.0±0.1；步骤(B)反应的pH较好的控制在7.5至8.5，优选8.0-8.5，最优选8.0±0.1。
所属领域技术人员根据常识可以选择聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需的用量。通过本申请所提供的制备方法，可以使不同种类的聚乙二醇对α-干扰素1b蛋白表面的不同氨基酸进行特异性修饰。本发明使用的不同的活化聚乙二醇与α-干扰素1b反应时，可以形成不同的共价键。特异性反应之间是相对独立分开进行的反应。所属领域技术人员可根据需要，通过选择聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需的用量，来调节聚乙二醇修饰后蛋白分子上聚乙二醇的含量和聚乙二醇的结构等因素，用于控制修饰后蛋白质分子的结构和性质。根据临床使用时药物蛋白的溶解性、生物半衰期、生物利用度等特性的需要，所属领域技术人员可通过本发明的方法来选择聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需的用量。通过本发明的研究发现修饰干扰素所使用的活化线性聚乙二醇较好的分子量为12,000-40,000道尔顿，优选为12,000至25,000道尔顿，最优选12,000至20,000道尔顿；上述各步骤反应中α-干扰素1b与活化线性聚乙二醇的用量比可选择为1∶10-1∶30，优选为1∶20-1∶30，最优选为1∶20。本申请特别提供了在步骤(A)所使用的活化线性聚乙二醇分子量为12,000、步骤(B)所使用的活化线性聚乙二醇分子量为20,000，以及步骤(A)和(B)所使用的活化线性聚乙二醇分子量均为20,000的方法。所属领域技术人员可以理解的是聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需用量的选择并不局限于上述特定的范围。
本申请的反应温度根据本领域技术人员的常识可选择通常蛋白质修饰反应的环境温度，优选25至30℃，特别是25±0.1℃。
本发明还涉及经本发明上述方法制得的全新聚乙二醇-α-干扰素1b，修饰后α-干扰素1b表面蛋白上组氨酸和赖氨酸分别被相同或不同的丁二酰亚胺基C1-C6的烷酸聚乙二醇酯修饰，优选活化线性聚乙二醇为SS-活化线性聚乙二醇或SC-活化线性聚乙二醇。
本发明还涉及经本发明上述全新聚乙二醇-α-干扰素1b在制备用于预防和治疗感染性疾病以及恶性肿瘤疾病如传染性急性和慢性肝炎、AIDS病毒治感染引起的机会感染传染疾病的药物中的应用，以及聚乙二醇修饰的α-干扰素1b在制备用于治疗恶性肿瘤包括哈立氏(Hairy’s)细胞白血病、卡波氏肿瘤(Kaposi)、非霍金斯鼻咽恶性T细胞淋巴肿瘤或鼻咽病毒(Epstein Barr)淋巴癌的药物中的应用。聚乙二醇修饰-α-干扰素1b临床有效药剂量至少为1.0×106至3.0×106国际单位/平方米体表面积/7天(1.0×106 to 3.0×106IU/m2/7天)。
本发明还提供一种药物组合物，其含有根据本发明的方法制得的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b，以及药学上可接受的载体。
本申请特别给出了以下两个的优选技术方案：一、基于丁二酰亚胺基丁二酸聚乙二醇酯(SS-PEG)(SuccinimidylSuccinate Polyethelene Glycol，SS-PEG)，或称SS-活化线性聚乙二醇的修饰反应。
(1)对α-干扰素蛋白表面组氨酸的共价键化学修饰：将活化线性聚乙二醇(SS-PEG)与α-干扰素接触，聚乙二醇线性链的长度范围为12000至20000道尔顿，聚乙二醇与α-干扰素反应的用量比(w/w)范围为1∶30，优选用量比为1∶20，反应的酸碱度为6.0-6.5。
(2)对α-干扰素蛋白表面赖氨酸的共价键化学修饰：将活化线性聚乙二醇(SS-PEG)与α-干扰素接触，反应使用聚乙二醇线性链的长度范围为12,000-20,000道尔顿，α-干扰素与聚乙二醇的用量比(w/w)范围为1∶10-1∶30，优选用量比为1∶20，反应的酸碱度为8.0-8.5。
在所述的步骤(1)中，优选的反应使用聚乙二醇线性链的长度为20,000道尔顿。在步骤(1)中，优选的α-干扰素与聚乙二醇的用量比为1∶20。在步骤(2)中，优选的乙二醇线性链的长度为20,000道尔顿。优选的α-干扰素与聚乙二醇的用量比为1∶20。
第(1)步反应pH范围应控制在6.0至6.5，优选为6.0±0.1；第(2)步聚乙二醇化学反应的pH范围应控制在8.0-8.5，优选为8.0±0.1。反应溶液酸碱度可由通过加入10倍浓度的磷酸钠盐缓冲液调整控制。第(1)步和第(2)步反应的温度范围应控制在25至30℃，优选的温度控制在25±0.1℃。
二、基于丁二酰亚铵聚乙二醇碳酸酯(SC-PEG)(SuccinimideCarbonate Polyethylene Glycol，SC-PEG)，称SC-活化线性聚乙二醇的修饰反应。
SC-活化聚乙二醇对生物大分子蛋白修饰的第(1)步反应是通过控制优化反应的pH值在6.0±1.0，使α-干扰素生物大分子蛋白表面的组氨酸能够充分的与活化聚乙二醇进行反应以获得特定分子量(特定链长)的聚乙二醇α-干扰素修饰产物。采用高纯度、狭窄单向分布(分子量分布在1.01-1.05之间)平均分子量为20,000的SC-活化线性聚乙二醇(SC-PEG)对α-干扰素聚生物大分子蛋白做进一步修饰，而获得经聚乙二醇修饰的α-干扰素产品。经酰胺键形成的聚乙二醇化蛋白大分子保持相对的稳定性以及生物活性，并在通常的实验室条件下不会发生断裂。反应结束后，可清除未反应的原料或溶液中其他反应副产物，或改变反应的酸碱度以进行下一步的化学反应。
第(2)步聚乙二醇化学反应为本发明最重要的控制步骤。在不需要对化学反应中蛋白质及其它中间产物进行纯化分离情况下，加入10倍浓度的磷酸钠盐缓冲液将反应的pH迅速改变并达到优化反应pH值至8.0±0.1。然后加入高纯度、狭窄单向分布(分子量分布在1.01-1.05之间)平均分子量为20,000的SC-活化线性聚乙二醇(SC-PEG)对聚乙二醇α-干扰素做进一步修饰，从而得到高反应活性但稳定的α-干扰素蛋白产物。
在第(2)步反应中，可以采用和第(1)步反应完全相同分子量的活化聚乙二醇继续和α-干扰素生物大分子蛋白反应，最终获得单一分子量(单一链长)聚乙二醇修饰的产品。另外，也可采用与第(1)步反应完全不同分子量或聚合方式不同的活化聚乙二醇对α-干扰素生物大分子蛋白做进一步的修饰，最终获得经混合聚乙二醇修饰的α-干扰素产品。
采用本发明聚乙二醇共价结合修饰制备方法，通过长链PEG修饰所制备出的新型α-干扰素1b(INFα1b)具有和α-干扰素1b不同的分子量，展现出完全不同的SDS-PAGE测定行为，并具有特定延长的生物半衰期和显著增加的生物利用度。
和目前已报道的聚乙二醇化α-干扰素2a(PEG-INFα2a)和聚乙二醇化α-干扰素2b(PEG-INFα2b)相比较，本发明得到的新型聚乙二醇化α-干扰素1b(PEG-INFα1b)在化学组织成份上以及在分子量上与PEG-INFα2a及PEG-INFα2b二种蛋白化合物绝然不相同。因此，上述三种PEG蛋白应可视为完全不同的化合物。通过使用α-干扰素1b，优选的无分支长链聚乙二醇和本专利的制备工艺得到的聚乙二醇α-干扰素1b，其聚乙二醇链长度远较α-干扰素2a(PEG-INFα2a)来的长。因此新型聚乙二醇α-干扰素1b的生物半衰期以及生物利用度将比起类似的PEG-INFα2a为佳。
从干扰素的生物活性来探讨，使用本法而得到的新型聚乙二醇化α-干扰素1b在聚乙二醇化学反应中对蛋白表面的不同氨基酸影响十分温和，α-干扰素1b的生物活性并没有因为化学作用而大量失活。和其他二者干扰素蛋白比较，本方法以及本发明得到的新型聚乙二醇化α-干扰素1b(PEG-INFα1b)与其他方法所得到的干扰素药物制剂，包括α-干扰素2a(PEG-INFα2a)，和聚乙二醇化α-干扰素2b(PEG-INFα2b)相比较，在相对的生物半衰期以及生物利用度上远优于其他类似PEG修饰的蛋白产物。
聚乙二醇修饰的α-干扰素1b可制成相应的药用剂型用于通过各种化学或非化学修饰的试剂、载体以及给药方式改进得到的粉末，液体，悬浮液和其它药用剂型供皮下，皮内，膜间，栓剂和气雾剂给药。
通过研究发现具有丁二酰亚胺基取代的C1-C6的烷酸聚乙二醇酯在特定的pH值下，具有非常好的特异性修饰功能。本发明利用丁二酰亚胺基取代的C1-C6的烷酸聚乙二醇酯作为修饰物，通过酸碱度改变带来修饰位点转移的方法可用于新型或改进的聚乙二醇-生物大分子药物的生产。聚乙二醇-生物大分子的传统的制备方法是利用均一分子量的聚乙二醇和生物大分子经单次化学反应作为主要制备工艺。本发明可以根据被修饰生物大分子的特点，采用单一分子量或不同分子量的聚乙二醇以及具有不同取代基团的聚乙二醇对生物大分子如蛋白的表面氨基酸进行不同方式和不同程度的修饰，从而延长生物大分子药物的生物活性半衰期，在各种给药条件下，特别是非肠道给药条件下获得预期的治疗效果，因而研制开发聚乙二醇修饰α-干扰素治疗药物，对满足临床治疗的迫切需要有着重要的意义。
本发明的方法利用化学反应将生物大分子蛋白和聚乙二醇间的化学反应过程简化，不必需经中间纯化分离进行多步反应，使反应在优化的条件下进行和得到有效的控制，克服了目前对蛋白质分子修饰时特异性不强的缺点，使聚乙二醇更有针对性的对蛋白分子上特定的氨基酸进行修饰。通过调节反应釜中的酸碱环境，使反应直接进行，避免了通常在反应中存在的中间步骤(如分离、纯化等)，简化了合成步骤，因而并在制备工艺上提供一条改进产品的生物活性损失和提高产品收率的途径，使整个工艺更易于在工业上大规模实施。新化合物保持α-干扰素1b原有的生物活性，但在药理，免疫原性及药代药效等方面新化合物优于α-干扰素1b；并且在稳定性、生物活性等方面也优于现有的单一相修饰或非特异性修饰的α-干扰素1b。
本发明的pH值和反应温度可以根据α-干扰素1b的稳定性和反应结果的可接受性来考虑。其结果由生物活性的保留程度衡量(见下文中表1和表2中所列结果)。
附图说明
图1是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术来分析利用相同或不同分子量的活化性聚乙二醇SS-PEG，分两步修饰α-干扰素1b(INFα1b)后所获得的蛋白分子产物。
其中：
1.凝胶带分子量(200KD，116.3KD，66.3KD，55.4KD，36.5KD，31.0KD，21.5KD，14.4KD，6.0KD)标记蛋白。
2.未经聚乙二醇化的α-干扰素标准品(INFα1b)。
3.经活化聚乙二醇12000(SS-PEG)于pH 6.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG12pH6)。
4.经活化聚乙二醇20000(SS-PEG)于pH 6.0条件下反应修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH6)。
5.经活化聚乙二醇12000(SS-PEG)于pH 8.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG12pH8)。
6.经活化聚乙二醇20000(SS-PEG)于pH 8.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH8)。
7.经活化聚乙二醇12000(SS-PEG)第一次反应条件于pH 6.0，第二次反应于pH 8.0条件下修饰后的α-干扰素(INFα1b-PEG12pH6，pH8)。
8.经活化聚乙二醇20000(SS-PEG)第一次反应条件于pH 6.0，第二次反应于pH 8.0条件下修饰后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH6，pH8)。
图2是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术来分析利用活化性聚乙二醇SC-PEG修饰α-干扰素1b(INFα1b)后所获得的蛋白分子产物。
其中
1.凝胶带分子量(200KD，116.3KD，66.3KD，55.4KD，36.5KD，31.0KD，21.5KD，14.4KD，6.0KD)标记蛋白。
2.未经聚乙二醇化的α-干扰素标准品(INFα1b)。
3.经活化聚乙二醇20000(SC-PEG)于pH 6.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH6)。
图3是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术来分析利用活化性聚乙二醇SC-PEG，用一步或分两步修饰α-干扰素1b(INFα1b)后所获得的蛋白分子产物。
其中
1.凝胶带分子量(200KD，116.3KD，66.3KD，55.4KD，36.5KD，31.0KD，21.5KD，14.4KD，6.0KD)标记蛋白。
2.未经聚乙二醇化的α-干扰素1b标准品(INFα1b)。
3.经活化聚乙二醇20000(SC-PEG)于pH 6.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH6)。
4.经活化聚乙二醇20000(SC-PEG)于pH 8.0反应条件下修饰之后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH8)。
5.经活化聚乙二醇20000(SC-PEG)于第一次反应条件于pH 6.0，第二次反应于pH 8.0条件下修饰后的α-干扰素(INFα1b-PEG20pH6，pH8)。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，但是实施例仅仅是说明的目的，而非对本发明的限定。
实施例1聚乙二醇12000/20000α-干扰素1b的制备
第(1)步反应
取1.0毫克α-干扰素溶解于1ml 100mM(pH 6.0)的磷酸钠盐缓冲液。取20毫克分子量12,000的SS-活化线性聚乙二醇(SS-PEG12000)，迅速加入上述溶液中，适当摇动而使活化线性聚乙二醇(SS-PEG12000)在30秒内完全溶解。反应于25℃进行60分钟，反应溶液经不必浓缩冲洗，可进一步纯化或进行第二步反应。
第(1)步反应的pH范围控制在6.0至6.5。
第(2)步反应
经上述1步所得到的溶液，加入0.1ml，500mM，(pH 8.0)的磷酸钠盐缓冲液。置此溶液于水浴中预热至25℃，另取20毫克分子量20000活化聚乙二醇(SS-PEG20000)迅速加入上述溶液中适当搅动而使分子量20000活化聚乙二醇于30秒内完全溶解。反应持续30分钟。反应溶液利用离心浓缩，分离纯化和无菌过滤后得到聚乙二醇化α-干扰素1b(α-干扰素-PEG12000/20,000)的终产物，并置4℃密封无菌避光保存。
第(2)步反应的SS活化线性聚乙二醇化学反应的pH范围应控制在8.0至8.5。
实施例2聚乙二醇20000/20000α-干扰素1b的制备
采用同实施例1相同的步骤，制备聚乙二醇20000/2000α-干扰素1b，不同的是将：在第一步中，线性长度范围为30毫克20,000道尔顿的SS-活化线性聚乙二醇与1毫克α-干扰素1b接触，反应使用聚乙二醇线性链的长度，即α-干扰素1b与聚乙二醇的质量比范围为1∶30。
在第二步中，线性长度范围为30毫克20,000道尔顿的SS-活化线性聚乙二醇与1毫克α-干扰素1b接触，反应使用聚乙二醇线性链的长度，即聚乙二醇与α-干扰素1b的质量比范围为1∶30。
实施例3聚乙二醇12000/20000α-干扰素1b的制备
第(1)步反应
取1.0毫克α-干扰素1b溶解于1ml 100mM(pH 6.0)的磷酸钠盐缓冲液。取30毫克分子量12,000的SC-活化线性聚乙二醇(SC-PEG12000)，迅速加入上述溶液中，适当摇动而使活化线性聚乙二醇(SC-PEG12000)在30秒内完全溶解。反应于25℃进行60分钟，反应溶液经不必浓缩冲洗，可进一步纯化或进行第二步反应。
第(1)步反应的pH范围控制在6.0至6.5。
第(2)步反应
经上述1步所得到的溶液，加入0.1ml，500mM，(pH 8.0)的磷酸钠盐缓冲液。置此溶液于水浴中预热至25℃，另取20毫克分子量20000活化聚乙二醇(SC-PEG20000)迅速加入上述溶液中适当搅动而使分子量20000活化聚乙二醇于30秒内完全溶解。反应持续30分钟。反应溶液利用离心浓缩，分离纯化和无菌过滤后得到聚乙二醇化α-干扰素(α-干扰素-PEG12000/20,000)的终产物，并置4℃密封无菌避光保存。
第(2)步反应的SC活化线性聚乙二醇化学反应的pH范围应控制在8.0至8.5。
以下实验方法中采用的测试样品为实施例1所获得。
实验例4
分析方法：蛋白浓度分析
方法1：采用Bradford-Lowry方法来测定蛋白质的浓度。该法基于测定蛋白质所结合的考马斯亮蓝(蛋白质染料)数量来确定蛋白质的浓度。首先以已知的不同浓度的标准蛋白所结合染料的量为依据，绘出标准曲线，通过测定蛋白的染料结合量推断出该蛋白质样品浓度。
方法2：取α-干扰素1b活力测定的供试品溶液，依照分光光度法(中国药典1995年版二部附录第20页)在280±1nm和260±1nm波长处测吸收度，按下式算出每毫升溶液中所含蛋白的毫克数。
蛋白含量(mg/ml)＝1.55×D280nm-0.76×D260nm
实验例5蛋白纯度分析
生物大分子，如蛋白质、酶、多肽、氨基酸等，由于带电性质不同，在同一电场条件下，有着不同的移动方向和迁移率。带电多，分子量小，则电泳速度快，因而通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可将不同分子量，不同种类的蛋白等生物大分子分开。因此，通过该方法在确定杂蛋白是否存在的同时，亦可以确定未知蛋白质的纯度和蛋白分子的大小。
实验例6高压液相—析分离法纯化聚乙二醇修饰后的α-干扰素1b
聚乙二醇化学修饰后的单一，或双分子α-干扰素1b可依蛋白分子量大小而借助分子筛高压液相析法分离纯化。分子筛柱-200可由Pharmacia Co.购买。流动相由100mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 5.0)生理盐水(150mM氯化钠)组成。流动相流速0.5毫升/分钟。分离过程可由紫外检测器在214nm监测。
实验例7α-干扰素1b-聚乙二醇生物活性的测定
干扰素的生物活性可由宿主细胞致病效应测试法的颜色反应而确定。宿主细胞致病效应(CytoPathic Effect，or CPE)测试法系由Foti提出(Methods in Enzymology，119，533，198)。本法利用人类宿主细胞经干扰素处理后产生抵抗病毒感染的活性而能防止细胞病变死亡的原理设计而成的一种简易快捷的颜色吸收反应测试方法。简易而言，宿主细胞在经干扰素处理后可抵抗病毒入侵因而可防止宿主细胞死亡。干扰素的抗病毒生物活性即可经由存活细胞所吸收的染料而直接定量测量。具体测试中，首先以已知的不同浓度的标准生物活性干扰素蛋白所产生的宿主细胞染料的抗病毒致病效应为依据，绘出存活宿主细胞吸收染料的标准效价曲线。未知的聚乙二醇修饰后的α-干扰素1b蛋白效价即可通过由宿主细胞产所产生的抗病毒致病效应而吸收的染料而直接定量测定。
实验例8
聚乙二醇修饰α-干扰素蛋白的结果
A.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白分析
一般用两种方法用来评估聚乙二醇对蛋白表面氨基酸进行化学修饰效果。第一种方法是利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定被修饰后的蛋白在电场上移动速率确定修饰程度。第二种方法是直接测定蛋白被聚乙二醇修饰前后氨基酸数量的差异而直接分析。聚乙二醇化学反应修饰后的α-干扰素1b在图1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示：α-干扰素1b经过聚乙二醇修饰而使其分子量明显升高，而使修饰后的蛋白在电泳场的移动速度降低。分子量明显升高是因为α-干扰素1b表面的氨基酸已被聚乙二醇分子的共价健结合而造成。
图1凝胶电泳的结果同时显示了另一个实验结果，即α-干扰素1b蛋白在电泳场的移动速率比较，在同样的反应条件下，α-干扰素1b经过活化分子量20,000聚乙二醇(SS-PEG)化学修饰后，与在使用分子量12,000聚乙二醇(SS-PEG修饰)化学修饰后的蛋白在电泳场的移动速度比较，前者的蛋白电泳速率，由于分子量的增加的结果比后者明显降低(比较图1第4和第3项)。
实验例9
聚乙二醇化α-干扰素1b的活性分析
聚乙二醇化α-干扰素1b的活性可由表一所列的数据而表明。表1中的实验数据同时显示可利用两步反应可以达到最终用分子量12000及20000的活化聚乙二醇(SS-PEG)化学修饰α-干扰素1b的目的，而不至于使大量的α-干扰素1b在化学反应过程中失去干扰素的活性。
由抗病毒致病效应(CPE)数据来看，α-干扰素1b在弱酸性(pH 6.0)环境下化学修饰所得到产物的活性远比在偏碱性(pH 8.0)环境下化学修饰所得到产物活性来的高(比较表一第4，第5栏；第6，第7栏)。同时在相同的酸碱度化学修饰环境下，较高分子量(SS-PEG20,000)化学反应所得产品的抗病毒活性要比低分子量(SS-PEG12,000)的化学修饰产品来的高些(比较表一第4，第6栏；第5，第7栏)。由表1实验数据而得知，在干扰素化学反应修饰过程中，化学修饰所得到产物的活性不仅受到酸碱度改变带来修饰位点转移的影响，同时还受到使用不同分子量活化聚乙二醇的影响。
              表1聚乙二醇α-干扰素1b(PEG-INFα1b)活性关系
产物item 病毒致病效应(CPE)IC50(ng/mL)     效价(titer)×106
1.标准品α-干扰素2b(INFα2b)     0.03     200
2.标准品α-干扰素1b(INFα1b)     0.46     15.2
3.标准品α-干扰素2a(INFα2a)     0.03     233
4.α-干扰素INFα1b-PEG12 pH6     1.09     6.4
5.α-干扰素INFα1b-PEG12 pH8     67.03     0.10
6.α-干扰素INFα1b-PEG20 pH6     0.53     13.2
7.α-干扰素INFα1b-PEG20 pH8     3.03     2.31
8.α-干扰素INFα1b-PEG12 pH6，pH8     1.44     4.86
9.α干扰素INFα1b-PEG20 pH6，pH8     1.07     6.53
表2中的实验数据同时显示利用分子量20000道尔顿的活化SC-PEG聚乙二醇化学反应中亦可以达到修饰α-干扰素蛋白表面氨基酸的目的而不至于使大量的α-干扰素1b在化学反应过程中失去干扰素生物活性。
             表2聚乙二醇α-干扰素1b(SC-PEG-INFα1b)活性关系
产物item   病毒致病效应(CPE)IC50(ng/mL)     效价(titer)×106
1.标准品α-干扰素2b(INFα2b)     0.03     219
2.标准品α-干扰素1b(INFα1b)     0.11     65
3.标准品α-干扰素2a(INFα2a)     0.04     171
4.α-干扰素INFα1b-PEG20 pH6     1.5     4.6
5.α-干扰素INFα1b-PEG20 pH8     1.8     3.8
6.α-干扰素INFα1b-PEG20 pH6，8     1.5     4.6

Claims (26)

1、一种经共价键结合的聚乙二醇修饰α-干扰素1b的制备方法，通过调节聚乙二醇与α-干扰素1b反应系统中的pH值，利用不同聚合方式或不同聚合链长度的活化线性聚乙二醇分步对α-干扰素1b蛋白表面的不同氨基酸进行特异性化学修饰，该活化聚乙二醇是丁二酰亚胺基C1-C6的烷酸聚乙二醇酯，包括以下两步步骤：
(A)在pH值为5-7的条件下，将活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b接触，使线性聚乙二醇与α-干扰素1b进行反应，对α-干扰素1b蛋白表面的组氨酸进行特异性化学修饰；
(B)在pH值为7-9的条件下，将活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b进行反应接触，对α-干扰素1b蛋白表面的赖氨酸进行特异性化学修饰；
上述(A)、(B)两步的顺序可以颠倒，两步反应之间通过pH调节剂使第一步反应系统的酸碱度调节到适合进行第二步反应的酸碱度。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(A)反应pH范围控制在5.5至6.5；步骤(B)反应的pH范围应控制在7.5至8.5。
3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(A)反应pH范围控制在6.0±0.1，步骤(B)反应pH范围控制在8.0±0.1。
4、据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于活化线性聚乙二醇线性链的分子量为12,000-40,000道尔顿。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的活化线性聚乙二醇分子量为12,000至25,000道尔顿。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的活化线性聚乙二醇分子量为12,000至20,000道尔顿。
7、根据权利要求1、2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(A)和(B)中α-干扰素1b与活化线性聚乙二醇的用量比为1∶10-1∶30。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(A)和(B)中α-干扰素1b与活化线性聚乙二醇反应的用量比为1∶20-1∶30。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(A)和(B)中α-干扰素1b与活化线性聚乙二醇反应的用量比为1∶20。
10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于两步反应是相对独立分开进行的反应，步骤(A)所使用的活化线性聚乙二醇分子量为12,000、步骤(B)所使用的活化线性聚乙二醇分子量为20,000，由此得到的产物活化线性聚乙二醇修饰的α-干扰素1b蛋白大分子的表面不同种类的氨基酸，分别具有12,000和20,000道尔顿聚乙二醇链长的分子。
11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(A)和(B)所使用的活化线性聚乙二醇分子量均为20,000，反应是相对独立分开进行的反应。
12、根据权利要求1所述的方法，其特征在于活化线性聚乙二醇为SS-活化线性聚乙二醇。
13、根据权利要求1所述的方法，其特征在于活化线性聚乙二醇为SC-活化线性聚乙二醇。
14、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(A)步和步骤(B)步反应的温度范围应控制在25至30℃。
15、根据权利要求14所述的方法，其特征在于步骤(A)和步骤(B)反应的温度范围控制在25±0.1℃。
16、根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下具体步骤：利用不同聚合方式或不同聚合链长度的SS-活化聚乙二醇对α-干扰素1b进行化学修饰，其特征在于，包括以下步骤：
(A1)将SS-活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b接触，反应使用聚乙二醇线性链的分子量为12,000-20,000道尔顿，α-干扰素1b与聚乙二醇的质量比范围为1∶10-1∶30；
(B1)改变反应的酸碱度后，将SS-活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b进行第二次反应接触，SS-活化聚乙二醇线性链的长度范围为12,000-20,000道尔顿，α-干扰素1b与SS-活化聚乙二醇反应的用质量比范围为1∶10-1∶30。
17、根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下具体步骤：利用不同聚合方式或不同聚合链长度的SC-活化线性聚乙二醇对α-干扰素1b进行化学修饰：
(A2)将SC-活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b接触，反应使用SC-活化线性聚乙二醇线性链的长度为12,000-20,000道尔顿，α-干扰素1b与SC-活化线性聚乙二醇的用量比范围为1∶10-1∶30；
(B2)改变反应的酸碱度后，将SC-活化线性聚乙二醇与α-干扰素1b进行第二次反应接触，SC-活化线性聚乙二醇线性链的长度为12,000-20,000道尔顿，α-干扰素1b与活化聚乙二醇反应的用量比范围为1∶10-1∶30。
18、根据权利要求16或17所述的制备方法，其特征在于，步骤(A1)、(A2)反应pH范围控制在5.5至6.5；步骤(B1)、(B2)反应的pH范围应控制在7.5至8.5。
19、根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于各步骤中α-干扰素1b与活化线性聚乙二醇反应的质量比范围为1∶20。
20、由权利要求1-19的方法制得的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b，修饰后α-干扰素1b表面蛋白上组氨酸和赖氨酸分别被相同或不同的活化线性聚乙二醇修饰，其特征在于活化线性聚乙二醇是丁二酰亚胺基C1-C6的烷酸聚乙二醇酯。
21、根据权利要求20所述的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b，其特征在于所述活化线性聚乙二醇为SS-活化线性聚乙二醇。
22、根据权利要求20所述的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b，其特征在于活化线性聚乙二醇为SC-活化线性聚乙二醇。
23、根据权利要求20所述的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b在制备药物中的应用，该药物用于预防和治疗感染性疾病以及恶性肿瘤疾病如传染性急性和慢性肝炎、AIDS病毒治感染引起的机会感染传染疾病、治疗恶性肿瘤。
24、根据权利要求23所述的应用，其特征在于所述恶性肿瘤为哈立氏细胞白血病、卡波氏肿瘤、非霍金斯鼻咽恶性T细胞淋巴肿瘤或鼻咽病毒淋巴癌。
25、根据权利要求23或24所述的应用，其特征在于所述药物中聚乙二醇修饰的α-干扰素1b临床有效药剂量至少为1.0×106至3.0×106国际单位/平方米体表面积/7天。
26、一种药物组合物，其特征在于含有根据权利要求20所述的聚乙二醇修饰的α-干扰素1b以及药学上可接受的载体。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100478359C (zh) * 2005-11-16 2009-04-15 中国科学院过程工程研究所 一种聚乙二醇-干扰素偶联物及其制备方法
CN101002944B (zh) * 2006-01-17 2012-07-25 中国科学院过程工程研究所 支链聚乙二醇-干扰素结合物及其制备方法
WO2012171429A1 (zh) * 2011-06-14 2012-12-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种聚乙二醇干扰素偶联物
CN109843972A (zh) * 2016-10-07 2019-06-04 国立大学法人东京工业大学 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100475270C (zh) 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
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CN101219219B (zh) 2007-01-10 2013-02-13 北京普罗吉生物科技发展有限公司 包含血管抑素或其片段的复合物、其制备方法及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5908621A (en) * 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0922446A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100478359C (zh) * 2005-11-16 2009-04-15 中国科学院过程工程研究所 一种聚乙二醇-干扰素偶联物及其制备方法
CN101002944B (zh) * 2006-01-17 2012-07-25 中国科学院过程工程研究所 支链聚乙二醇-干扰素结合物及其制备方法
WO2012171429A1 (zh) * 2011-06-14 2012-12-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种聚乙二醇干扰素偶联物
CN109843972A (zh) * 2016-10-07 2019-06-04 国立大学法人东京工业大学 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物

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