CN1298734C

CN1298734C - 一种聚乙二醇修饰蛋白质α－氨基的方法

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Publication number: CN1298734C
Application number: CNB2005100425873A
Authority: CN
Inventors: 张雪山; 徐宜铁
Original assignee: GELANBAIKE BIOLOGICAL PHARMACENTICAL CO Ltd SHANDONG
Current assignee: GELANBAIKE BIOLOGICAL PHARMACENTICAL CO Ltd SHANDONG
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: CN1687106A

Abstract

本发明提供了一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法。利用氨基保护剂将蛋白质中能与PEG反应的赖氨酸ε氨基封闭，以活化的具有与α氨基优势反应的PEG进行氨基修饰，再将氨基保护剂去除，得到氮端特异性PEG修饰的蛋白质衍生物。该方法所得产品转化率高，90%～95%；分子量与结构均一，均为蛋白质α-氨基N末端连接一个PEG分子，没有一个蛋白连接几个PEG的产物，也没有其他位点连接PEG的异构现象；体外活性降低很少，基本保持不变；体内活性实验明显长效，ANC升高幅度明显。

Description

一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质分子的修饰与改造，尤其是蛋白质分子的定点修饰与改造方法。

背景技术：

多肽、蛋白类药物主要通过降解、排泄、受体介导的内吞等作用在体内被清除，其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易由肾小球滤过，在通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。静脉注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的清除半衰期为1～2小时，皮下注射则为2～3小时，为维持一定的疗效需要每天应用，不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。

化学修饰是延长蛋白类药物半衰期的一个有效途径，其中应用最为广泛的修饰剂是单甲氧基聚乙二醇(methoxypoly ethyleneglycol，简称mPEG)，其次是多糖类如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等，也可应用同源蛋白质或人工合成多肽类如白蛋白、聚丙氨酸等，另外长链脂肪酸类以及聚烯属烃基化合物也可以作为修饰剂。

聚乙二醇(简称PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物HO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH，n为聚合单元的个数，PEG分子量随n的增加可由1kDa增至50kDa)，有线性和支链两种构型，已经被FDA批准作为多种药物的安全载体。PEG通过共价键与蛋白质连接，可与蛋白质分子中的α-氨基(位于氮末段)、ε氨基(位于赖氨酸残基)反应对蛋白质分子进行修饰，通过对蛋白表面氨基进行修饰以有效地改变多肽、蛋白类药物在体内的分布和药物学特性。

目前PEG修饰已应用于40多种不同蛋白的修饰，如猪血清白蛋白(BSA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-2(ILr2)等。PEG修饰后药物血浆半衰期一般可延长几倍至几十倍甚至是上百倍，但大部分蛋白的免疫原性也有所降低，而蛋白的生物活性也有不同程度降低。这可能是由于PEG大分子在蛋白分子周围形成一层外壳，阻碍了免疫细胞与蛋白的接触，保护了蛋白，掩盖了蛋白酶识别位点避免蛋白酶降解的发生，但同时也使蛋白的活性位点受到影响。

修饰后的蛋白质具有一些特殊的性质：①半衰期延长。许多目前已得到广泛应用的蛋白药物在体内半衰期很短，使用时要间歇性、经常性给药，不方便而且增加了病人的痛苦。PEG化后的蛋白分子量增大，肾小球滤过减少，PEG分子的空间位阻作用使蛋白在体内被蛋白酶降解速度减慢，从而使药物体内半衰期增长，药效更持久；②PEG化可以降低蛋白质药物抗原性，扩大药物的应用范围；③PEG化还可能导致蛋白质药物具有某些新的活性特征，比如PEG化的interleukin-6促进血小板生成的活性增加，而其他方面的活性基本不变；④PEG化可影响蛋白质药物的一些物理、化学性质(PEG的亲水性可增加溶解性，空间位阻效应减少蛋白酶解等)。

目前，修饰药用蛋白通常采用单甲基化的PEG(以防一个PEG分子连接两个蛋白质分子)，先将其OH端活化，引入亲电基团以便于和氨基的亲核基团反应。PEG化修饰的方法很多，早期的方法中PEG化是随机发生在任何可能反应的氨基上的，因此得到的反应产物是不同分子量(连接的PEG个数不同)的混合物，即使相同分子量的产物也存在修饰位点的异构。而且，某些处于蛋白质活性位点或受体结合部位的赖氨酸被修饰后大大降低蛋白质的活性。

Olaf B Kinstler等注意到蛋白质中不同氨基的化学反应性差异：α-氨基与ε氨基的pKa(解离常数)不同，α-氨基(位于氮末段)的pKa为7.8，ε氨基(位于赖氨酸残基)的pKa为10.1。如果以醛基化的PEG(mPEG-aldehyde)进行氨基修饰，pKa低的α-氨基比ε氨基更具有反应优势，优先进行反应，可以实现蛋白质氮端的优势反应。因此他们以这种具有氮端反应优势的活化PEG(mPEG-aldehyde)在低pH下(pH5.0)进行rhG-CSf的修饰，大于70％的修饰产物为氮端特异性修饰，具有确定的分子量和分子结构。但这种方法仍存在缺点：①反应缓慢，周期长，一般需要10～16小时；②反应只是优先在氮端进行PEG化，赖氨酸上氨基的PEG化仍能进行，而且随着时间的延长赖氨酸上被PEG化所占比例增加，因为这种方法只是通过降低反应体系的pH值减慢反应速度，从而拉大两种不同氨基的反应速度差，使反应便于控制，但不能杜绝赖氨酸上氨基的进一步PEG化。

目前常用PEG反应条件下生成的交联反应物为非均一的PEG-蛋白质分子(分子量不同，分子结构不同，在蛋白质分子不同的赖氨酸残基上交联PEG)，有悖于我国新药评审的有关原则，无法应用于临床，为开发出可以被接受的均一的PEG化蛋白质分子，所以有必要寻求一种PEG大分子与蛋白N末端定点交联反应的条件。

发明内容：

为了弥补现有技术的不足，开发出可以被接受的均一的PEG化蛋白质分子，本发明公开了一种PEG大分子与蛋白N末端定点交联反应的方法，可以对作为药物的小分子量的蛋白质分子进行快速的、定点的PEG化修饰的方法，得到均一的可以作为新药进入临床应用的PEG化蛋白质分子，新分子较修饰前，其半衰期应延长、体外活性降低应较少。

本发明人在对氨基的分布位置差异和化学反应性差异进行了综合分析研究的基础上，提出了采用氨基保护剂将处于蛋白质活性位点及受体结合部位易于反应的赖氨酸氨基封闭和选用具有氮端优势反应的聚乙二醇活化形式相结合的方式对蛋白质氮端进行特异性修饰技术方案，可以在更短的时间内(pH高，反应速度快)，高选择性地完成蛋白质的氮端特异性PEG化修饰。

本发明技术方案依次包括以下步骤：

(A)提供一种氨基保护剂封闭处于蛋白质活性位点及受体结合部位的ε氨基；

(B)提供一种活化后的聚乙二醇，对未封闭的蛋白质氮端α-氨基进行修饰；

(C)去除氨基保护剂；

(D)提纯。

本发明技术方案适用的蛋白质为其氮端不处于活性位点或受体结合部位的蛋白。

本发明技术方案所提供的氨基保护剂为二甲基马来酸酐(Dimethylmaleic anhydride，简称DMMAn)，该保护剂可以保护蛋白质的易于反应的非α-氨基，将处于最利于反应位置(蛋白质活性位点或受体结合部位)的赖氨酸封闭，使其后的PEG化修饰反应更专一，不必担心出现非α-氨基修饰物，得到的产物生物活性降低较小，而且PEG化修饰反应可以快速进行。

氨基保护剂二甲基马来酸酐的用量为蛋白质α-氨基与ε氨基之和的8～12倍(mol比)。

上述封闭处于蛋白质活性位点及受体结合部位的ε氨基的反应在0.1M磷酸盐缓冲液(PH8.5)中进行。更换蛋白质缓冲溶液为0.1M磷酸盐缓冲液是为了提高体系PH，满足反应所需条件。

本发明技术方案所用的聚乙二醇活化形式为醛基化的单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy PEG aldehyde，简称mPEG-aldehyde)，该活化形式的PEG具有蛋白质氮端的反应优势，与氨基保护剂结合使用，可以实现对蛋白质氮端α-氨基专一、定点的特异性修饰。

醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为蛋白质α-氨基的3～12倍(mol比)。

本发明技术方案所述的PEG化修饰反应需要有催化剂NaBH₃CN存在，其用量与PEG等量(mol)。

本发明技术方案所述的去除氨基保护剂是将反应混合物加入0.1M HCl调pH的方式实施的。

本发明所述技术方案具体操作步骤和条件如下：

a.更换蛋白质缓冲溶液为0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5)，加入8～12倍于可反应氨基数量的DMMAn，在0℃下持续30分钟。

b.在上述反应混合物中加入3～12倍于可反应氨基数量的mPEG-aldehyde和NaBH₃CN，反应0.5～1.5小时。

c.以0.1M HCl调节上述反应混合物至pH5.5～6.5，在35～40℃下持续20～40分钟。

d.反应混合物经过阳离子交换凝胶SP Sepharose Big Beads和分子筛凝胶Superdex 75提纯，去除游离的PEG、NaBH₃CN和未反应蛋白，得到纯的聚乙二醇修饰蛋白质(mPEG-Protein)。

应用本发明所述修饰蛋白质的方法可用于制备聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(mPEG-rhG-CSF)、聚乙二醇化干扰素(mPEG-IFN)、聚乙二醇化肿瘤坏死因子(mPEG-TNF)。

应用本发明所述修饰蛋白质的方法制备的mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF，分子量为39kD增加了20kD，其在体内的半衰期大大延长，达到45小时以上，药效更加持久，其体外活性为5×10⁷U/mg，几乎未降低

本发明产品mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF和rhG-CSFcsf比较：

	mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF	rhG-CSFcsf
	mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF	rhG-CSFcsf	分子量(kD)	39	19
体外活性(U/mg)	5×10⁷	1.2×10⁸	分子量(kD)	39	19
体外活性(U/mg)	5×10⁷	1.2×10⁸	平均体内半衰期(小时)^*	45.7	3.5
等电点	6.1	6.0	平均体内半衰期(小时)^*	45.7	3.5

^*肺癌病人化疗后24小时按100μg/kg剂量单次皮下注射与国外同类产品相比使用本发明方法反应时间短，转化率高，药效持效期长。

本发明产品mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF和国外同类产品比较：

	本发明	国外同类产品
	本发明	国外同类产品	反应方法	①氨基保护，②醛基PEG修饰，③去保护	醛基PEG修饰
反应时间	0.5小时(①)+1小时(②)+0.5小时(③)	16小时	反应方法	①氨基保护，②醛基PEG修饰，③去保护	醛基PEG修饰
反应时间	0.5小时(①)+1小时(②)+0.5小时(③)	16小时	反应温度(℃)	37	4
反应产物	95％mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF，5％-rhG-CSF(未反应的，可重复使用)	71％mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF，28％多修饰mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF(分子量不均一，此部分在最后是废弃的)，1％rhG-CSF(未反应的，可重复使用)	反应温度(℃)	37	4
反应产物	95％mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF，5％-rhG-CSF(未反应的，可重复使用)		产品分子量(kD)	39	39
产品体外活性(U/mg)	5×10⁷	无数据	产品分子量(kD)	39	39
产品体外活性(U/mg)	5×10⁷	无数据	平均体内半衰期(小时)^*	45.7	33.2
其它理化性质	分子结构、等电点都基本一致		平均体内半衰期(小时)^*	45.7	33.2

^*肺癌病人化疗后24小时按100μg/kg剂量单次皮下注射

由于本发明采用氨基保护剂将处于蛋白质活性位点及受体结合部位易于反应的赖氨酸氨基封闭和选用具有氮端优势反应的聚乙二醇活化形式相结合的技术方案，因而在蛋白质修饰方面获得了显著的有益效果，对采用上述方法形成的蛋白分子进行检验，得到如下结果：①反应率高，90％～95％；②分子量与结构均一，均为蛋白质α-氨基N末端连接一个PEG分子，没有一个蛋白分子连接几个PEG的产物，也没有其他位点连接PEG的异构现象；③体外比活性降低很少，基本保持不变；④体内活性实验明显长效，在正常小鼠体内药效中较rhG-CSF的ANC升高延长约2.5倍，ANC升高幅度明显。

具体实施方式：

实施例1.

mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF的制备工艺：

①超滤浓缩GC溶液，更换缓冲体系为0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5)，得到浓度5mg/ml的GC溶液1000ml。

②加入1.66gDMMAn，冰浴保持反应体系温度为0℃，维持反应30min。

③在反应体系中加入52.6g mPEG₂₀₀₀₀-acetaldehyde，搅拌溶解，升温至37℃，加入0.16g NaBH₃CN，反应1小时。以0.1M HCl调节上述反应混合物至pH6.0，37℃持续30分钟。

④将反应产物上样，经10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)平衡过的SPSepharose Big Beads离子柱，以10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)、0～0.45M氯化钠线性梯度洗脱6柱体积，收集主峰为mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF。经过Superdex 75柱去盐，并更换缓冲液为10mM乙酸钠(pH4.0)，即得到mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF原液。

转化率95％分子量39kD 半衰期45.7小时

体外活性5×10⁷U/mg。

实施例2

mPEG₃₀₀₀₀-rhG-CSF的制备工艺：

②加入1.83gDMMAn，冰浴保持反应体系温度为0℃，维持反应30min。

③在反应体系中加入86.8gmPEG₂₀₀₀₀-acetaldehyde，搅拌溶解，升温至39℃，加入0.176g NaBH₃CN，反应1.5小时。以0.1M HCl调节上述反应混合物至pH6.2，35℃持续40分钟。

④将反应产物上样，经10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)平衡过的SPSepharose Big Beads离子柱，以10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)、0～0.6M氯化钠线性梯度洗脱10柱体积，收集主峰为mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF。经过Superdex 75柱去盐，并更换缓冲液为10mM乙酸钠(pH4.0)，即得到mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF原液。

转化率90％分子量49kD 半衰期58小时

体外活性1×10⁷U/mg。

实施例3.

mPEG₂₀₀₀₀-IFNα-2b(干扰素)的制备工艺：

①以0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5)溶解干扰素IFNα-2b，得到浓度2mg/ml的IFNα-2b溶液1000ml。

②上述溶液冰浴保持温度为0℃，在缓慢搅拌的条件下加入0.664gDMMAn，溶解后维持反应30min。

③上述反应体系升温至37℃，在缓慢搅拌的条件下加入26.3gmPEG₂₀₀₀₀-acetaldehyde，溶解后加入0.032g NaBH₃CN，溶解后保持反应0.5小时。以0.1M HCl调节上述反应混合物至pH6.0，37℃持续30分钟。

④反应混合物经电泳(SDS-PAGE)和反相HPLC(C18)测定～91％IFNα-2b已经被修饰。

⑤以20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)平衡SP Sepharose Big Beads离子柱。将反应产物以20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)稀释100倍后上样，以0～45％的20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)1M氯化钠线性梯度洗脱6柱体积，收集主峰为mPEG₂₀₀₀₀-IFNα-2b。经过Superdex 75柱精提纯，并更换缓冲液为10mM磷酸钠(pH7.0)，即得到mPEG₂₀₀₀₀-IFNα-2b原液。

转化率91％分子量39kD 半衰期58小时

体外活性1×10⁷U/mg纯度99％。

Claims

1.一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法，其特征在于采用氨基保护剂将处于蛋白质活性位点及受体结合部位易于反应的赖氨酸氨基封闭和选用具有氮端优势反应的聚乙二醇活化形式相结合的方式对蛋白质氮端不处于活性位点或受体结合部位的蛋白质进行特异性修饰；

其步骤如下：

(A)用二甲基马来酸酐封闭处于蛋白质活性位点及受体结合部位的ε氨基，二甲基马来酸酐的用量为蛋白质α-氨基与ε氨基mol数之和的8～12倍；

(B)用醛基化的单甲氧基聚乙二醇对未封闭的蛋白质氮端α-氨基进行修饰，醛基化的单甲氧基聚乙二醇得用量为蛋白质α-氨基mol数的3～12倍，修饰反应需要有与聚乙二醇等量的NaBH₃CN存在；

(C)采用0.1mol/L的HCl调节pH至5.5-6.5，去除氨基保护剂；

(D)提纯。

2.如权利要求1所述一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法，其特征在于封闭处于蛋白质活性位点及受体结合部位的ε氨基的反应在0.1M磷酸盐缓冲液中，0℃下持续30分钟。

3.如权利要求1所述一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法，其特征在于将聚乙二醇修饰后的反应液以0.1M HCl调pH至5.5～6.5，35～40℃持续20～40分钟去除氨基保护剂。

4.如权利要求1所述一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法的用途，其特征在于用于制备聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子或聚乙二醇化干扰素或聚乙二醇化肿瘤坏死因子。

5.采用权利要求1所述一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法制备的产品mPEG₂₀₀₀₀-rhG-CSF，其分子量39kD，半衰期45.7小时，体外活性5×10⁷U/mg；转化率为90～95％。