CN1680448A - 一种聚乙二醇－干扰素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇－干扰素及其制备方法和应用。本发明的聚乙二醇－干扰素的抗病毒活性高，活性保留达到干扰素原料的35％～50％，其特征是：它是分子量为5000～30000的单链聚乙二醇与干扰素以酰胺键连接的产物，具有如下结构式。mPEG－O－CH₂－CO－NH－CH₂CH₂ CH₂－CO－NH－interferon

Description

一种聚乙二醇-干扰素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及用聚乙二醇(简称PEG)对干扰素进行化学修饰的PEG-干扰素复合物及其制法和应用。

背景技术

各种天然和重组蛋白质具有治疗作用，一旦将他们纯化、分离并制备成药物，就可以将它们经非肠道途径进行给药，用于不同的医疗适应症。然而，非肠道途径给药的蛋白质具有免疫原性，且血浆半衰期较短，因此，难以使药用蛋白质在患者体内保持有治疗作用的血药浓度。

通过将蛋白质与高分子聚合物结合成复合物，即化学修饰的方法，可以有效的克服这些难题。

化学修饰作为提高和改善蛋白质多肽等生物活性分子的临床和生物学性能的重要手段得到了日益广泛的研究和应用，迄今，已经有许多种类的修饰剂被相继合成和应用。代表性的修饰剂有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇及其衍生物等等。其中聚乙二醇及其衍生物由于具有下述优良性能而在化学修饰中应用最多：1.PEG具有两亲性，即可以溶解于水，又可以溶解于许多有机溶剂。2.PEG无毒，极低的免疫原性，其生物相容性也已经通过美国FDA的认证。3.PEG的分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大。4.PEG可以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物分子，有时甚至产生新的特性。

α干扰素可有效的治疗急性和慢性乙型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用。

以往公开的PEG-干扰索复合物存在几个问题，其一是PEG的结合使干扰素的生物活性降低，在使用中必须提高干扰素的剂量。另外，在形成PEG-干扰素复合物时所用的某些连接键可能在体内水解断裂，使复合物失去了由PEG带来的优点。化学修饰的效果好坏很大程度上取决于化学修饰剂的性能优劣。

PEG羧酸的活化酯是在蛋白质修饰中使用最多的酰基化试剂。活化酯与接近生理条件的一级胺反应形成稳定的酰胺键。第一种PEG羧酸衍生物不含有与PEG骨架的可降解的化学键，而是羧甲基化的PEG(CM-PEG)。这种化合物的琥珀酰亚胺酯(SCM-PEG)相当活泼(在pH8和25℃下水解半寿期是0.75min)，因此很难使用。Harris等人制备了PEG丙酸和丁酸衍生物。通过添加亚甲基单位扩大活化酯与PEG骨架的距离对于活化酯对胺和水的反应性有巨大的影响。例如，SBA-PEG，由于添加了两个亚甲基单位，其在pH8和25℃下水解半寿期是23分钟；SPA-PEG，添加了一个亚甲基单位，其在pH8和25℃下水解半寿期是16.5分钟；而这两种活化酯所对应的PEG羧酸在制备时需要经过较强的酸水解和碱水解，很容易导致PEG骨架的短裂。而且根据传统所用的修饰剂，不易准确测出修饰产物的平均修饰度，而对修饰位点的测定也存在着困难。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种聚乙二醇-干扰素及其制备方法和应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关方面的需要。

本发明采用一种新型PEG酸的活化酯对α干扰素进行修饰，此活化酯具有与SBA-PEG相似的结构，由于其结构中与丁酸结构相连接的是酰胺键，受其影响，这种活化酯具有与SPA-PEG相近的水解半寿期和活性，不仅修饰效果好，还因为其中含有γ-氨基丁酸部分，为修饰度的测定和修饰位点的确定提供了一个可行的方法。

本发明的技术方案如下：

一种聚乙二醇-干扰素，它是分子量为5000～30000的单链聚乙二醇以酰胺键修饰的干扰素，具有如下结构式：

mPEG-O-CH₂-CO-NH-CH₂CH₂CH₂-CO-NH-interferon

式中：

mPEG为聚乙二醇链，分子量为5000～30000；

interferon为干扰素；

-NH-CH₂CH₂CH₂-CO-是γ-氨基丁酸；

所说的干扰素选自干扰素α-1b、干扰素α-2a、干扰素α-2b或集成干扰素；

优选的干扰素为α-2b；

本发明的聚乙二醇-干扰素的制备方法包括如下步骤：

将干扰素的磷酸盐缓冲液与mPEG-GABA在0～25℃条件下反应0.5-4小时，加入甘氨酸终止反应，然后采用常规的方法，如色谱法进行分离，获得本发明的聚乙二醇-干扰素；

干扰素的磷酸盐缓冲液的浓度为1-10mg/mL；磷酸盐缓冲液的pH为3.0～8.0，优选为3.5～6.0；进一步优选为4.0～5.0；

干扰素∶PEG＝1∶0.5～20，摩尔比；

mPEG-GABA结构如下：

式中mPEG为聚乙二醇链；后以酰胺键连接一个γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的羧基与氮-羟基琥珀酰亚胺形成活化酯；

按照本发明，色谱法分离反应产物的方法包括如下步骤：

在反应产物中加入8～12倍体积的50mM的磷酸盐缓冲液，将反应混合物上羧甲基琼脂糖柱(CM-Sepharose)，以3～7倍体积的磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素用0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，收集含干扰素的洗脱液；

以葡聚糖G-100或者交联葡聚糖S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液为50mM磷酸缓冲液(含0.15M氯化钠)，用波长280nm紫外光吸收检测，分别收集含PEG-干扰素的洗脱液和未修饰的干扰素。

由于反应混合物中不同的产物具有不同的分子量及等电点，这些产物可用传统的分离方法如色谱法进行分离。同一个自由氨基结合形成的单PEG化的复合物是本发明的优选方案。尽管干扰素有多个自由氨基，但可以通过控制试剂比例和反应条件主要得到单条PEG修饰的产物。

当将单一干扰素分子与单一PEG结合时，所得的产物可以是位点异构物的混合物。“位点异构物的混合物”是指可以在不同干扰素分子的不同氨基酸位点连接的各个PEG-干扰素的混合物。例如：在本发明的一个实施方案中，PEG-干扰素混合物含有至少一种在干扰素分子的组氨酸残基上连接有PEG链的PEG-干扰素，同时含有PEG链被连接在干扰素分子的另一个位点(如：赖氨酸残基)的PEG-干扰索。

本发明的聚乙二醇-干扰素抗病毒活性高，由于聚乙二醇以酰胺键与干扰素连接，血浆半衰期长，作为抗病毒药物效果更好。因此本发明所述的聚乙二醇-干扰素可用于制备抗病毒药物。

由上述公开的技术方案可见，本发明的聚乙二醇-干扰素抗病毒活性高，活性保留达到干扰素原料的35％～50％，制备方法简单易行，便于实施。

附图说明

图1为实施例2～6的SDS-PAGE电泳检测的图谱。

具体实施方式

                     实施例1

合成分子量为12kD的mPEG-CH₂CONH-CH₂CH₂CH₂COOH

步骤1：

CM-PEG(羧甲基化聚乙二醇)的制备：

将分子量为12kD的单甲氧基聚乙二醇12g(1毫摩尔)溶于适量的甲苯中，蒸馏出一部分甲苯以共沸除水，然后加入2毫摩尔的叔丁醇钾回流反应2h，而后缓慢加入2毫摩尔的溴乙酸乙酯回流反应4h，然后室温反应18h，过滤除去沉淀后减压蒸去溶剂，残留物加入二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出产物，将该产物溶于去离子水中，逐渐加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液直到溶液的pH值稳定在pH10，然后用0.1mol/L的盐酸调节溶液的pH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩后用乙醚沉淀得到分子量为12kD的CM-PEG，分子式如下：

CH3O-(CH₂CH₂O)n-CH₂COOH

步骤2：

γ-氨基丁酸盐酸盐的制备：将20g γ-氨基丁酸加入到300mL无水乙醇中，在搅拌下通入干燥的氯化氢气体直到饱和，然后加入无水乙醇进行减压蒸馏，将多余的氯化氢除掉，接着将溶液浓缩至合适的体积，用干燥无水的乙醚沉淀得到γ-氨基丁酸乙酯盐酸盐。

步骤3：

合成mPEG-CH₂CONH-CH₂CH₂COOH：

取5g(1毫摩尔)步骤1中制备的CM-PEG溶于20mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2毫摩尔的二环己基碳二亚胺(DCC)、2毫摩尔的γ-氨基丁酸盐酸盐，然后用三乙胺将溶液的pH值调节到8，搅拌反应过夜，过滤除去沉淀后，加入无水乙醚沉淀产物，将产物干燥后溶于去离子水，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH在11，然后用草酸将溶液pH调节到3，用氯仿萃取溶液3次，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，得到分子量为12kD的mPEG-CH²CONH-CH₂CH₂CH₂COOH，即以酰胺键与PEG连接的PEG丁酸，IR光谱：1629cm^-1(CONH)，1740cm^-1(COOH)

步骤4：

取步骤3制备的分子量为12kD的PEG-酰γ-氨基丁酸6g(0.5毫摩尔)，溶于干燥精制的无水二氯甲烷中，加入2倍摩尔量的二环己基碳二亚胺(DCC)和2倍摩尔量的氮羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应24h，停止反应过滤掉沉淀(DCU)二环己基脲，溶液用无水乙醚沉淀得到产物分子量为12kD的PEG-酰-γ-氨基丁酸的氮羟基琥珀酰亚胺酯。分子式如下：

CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CONH-CH₂CH₂CH₂COONHS

IR光谱：1629cm^-1(CONH)，1729cm^-1(COONHS)。

                     实施例2

SDS-PAGE电泳法对产物的检测

将各洗脱峰适当浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶15％，浓缩胶5％。电泳完毕后，将胶体浸入固定液中(50％的甲醇、12％的乙酸)室温振摇浸泡30分钟；取出胶体，浸入染色剂中室温振摇浸泡30分钟(30％的甲醇、0.5％的戊二醛、0.4M乙酸钠及0.1％硫代硫酸钠)；再将胶体转移入0.4％银氨液中振摇30分钟，最后移入到显色剂(0.02％甲醛及2.5％硫酸钠)中室温振摇浸泡至标本条带清晰即可，以1％乙酸终止显色。

                     实施例3

mPEG₅₀₀₀-IFNα-2b的制备

将干扰素α-2b以50mM pH3.0的磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液10mL。按干扰素与实施例1的mPEG-GABA以1∶15的摩尔比加入mPEG-GABA(Mw＝5000)，在0℃条件下反应4小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。15分钟后，加入10倍体积的50mM pH3.0的磷酸盐缓冲液。将反应混合物上羧甲基琼脂糖柱(CM-Sepharose)，以5倍体积pH3.0的磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素α-2b和未结合PEG的干扰素用含0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含干扰素α-2b的洗脱液。

以交联葡聚糖S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素α-2b进一步纯化，以pH3.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE检测，见图1中的条带A：PEG(5000)-IFNα-2b；F条带为标准分子量蛋白。

以Bradford法测定蛋白质含量，产物PEG-IFN α-2b的产率为45％。

                     实施例4

mPEG₁₂₀₀₀-IFN α-2b的制备

将干扰素α-2b以50mM pH4.6的磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液10mL。按干扰素与实施例1的mPEG-GABA以1∶15的摩尔比加入mPEG-GABA(Mw 12000)，在10℃条件下反应2小时，加入1M甘氨酸0.5mL终止反应。15分钟后，加入10倍体积50mM pH4.6的磷酸盐缓冲液。将反应混合物上羧甲基琼脂糖柱(CM-Sepharose)，以5倍体积pH4.6的磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素用含0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含干扰素的洗脱液。

以葡聚糖G-100分子排阻色谱对PEG-干扰素α-2b进一步纯化，以pH4.6的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE检测见图1)中条带B：PEG(12000)-IFNα-2b；F条带为标准分子量蛋白。以Bradford法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNα-2b的产率为42％。

                     实施例5

mPEG₂₀₀₀₀-IFNα-2b的制备

将干扰素α-2b以50mM pH5.0的磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液10mL。按干扰素与实施例1的mPEG-GABA以1∶10的摩尔比加入mPEG-GABA(Mw＝20000)，在15℃条件下反应1小时，加入1M甘氨酸0.5mL终止反应。15分钟后，加入10倍体积50mM pH5.0的磷酸盐缓冲液。将反应混合物上羧甲基琼脂糖柱(CM-Sepharose)，以5倍体积pH5.0的磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素用含0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含干扰素的洗脱液。

以葡聚糖G-100分子排阻色谱对PEG-干扰素α-2b进一步纯化，以pH5.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE检测见图1中的条带C：PEG(20000)-IFNα-2b；F条带为标准分子量蛋白。以Bradford法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNα-2b的产率为40％。

                     实施例6

mPEG₃₀₀₀₀-IFNα-2b的制备

将干扰素α-2b以50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液10mL。按干扰素与实施例1的mPEG-GABA以1∶10的摩尔比加入mPEG-GABA(Mw＝30000)，在15℃条件下反应1小时，加入1M甘氨酸0.5mL终止反应。15分钟后，加入10倍体积50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液。将反应混合物上羧甲基琼脂糖柱(CM-Sepharose)，以5倍体积pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素用含0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含干扰素的洗脱液。

以葡聚糖G-100分子排阻色谱对PEG-干扰素α-2b进一步纯化，以pH6.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE检测见图1中的条带D：PEG(30000)-IFN α-2b：F条带：标准分子量蛋白。以Bradford法测定蛋白质含量，产物PEG-IFN α-2b的产率为38％。

                     实施例7

修饰后各组分的抗病毒活性测定

用Wish细胞(人羊膜传代细胞)-VSV病毒(滤泡性口腔炎病毒)系统测定各干扰素的抗病毒活性。采用CPE(细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每mL干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。以国际单位(IU)表示，并用国家IFNα标准品进行校正。结果见表1。

表1.干扰素及PEG-干扰素复合物的抗病毒活性

样品	抗病毒活性(IU/mg)
		IFN α-2bPEG5000-IFN α-2bPEG12000-IFN α-1bPEG20000-IFN α-1bPEG30000-IFN α-1b	1.73×1080.9×1080.8×1080.73×1080.6×108

Claims (9)

1.一种聚乙二醇-干扰素，其特征在于，具有如下结构式：

mPEG-O-CH₂-CO-NH-CH₂CH₂CH₂-CO-NH-interferon

式中：

mPEG为聚乙二醇链；

interferon为干扰素。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-干扰素，其特征在于，所说的干扰素选自干扰素α-1b、干扰素α-2a、干扰素α-2b或集成干扰素。

3.根据权利要求2所述的聚乙二醇-干扰素，其特征在于，干扰素为α-2b。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇-干扰素，其特征在于，聚乙二醇部分的分子量为5000～30000。

5.根据权利要求1所述的聚乙二醇-干扰素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将干扰素的磷酸盐缓冲液与mPEG-GABA在0～25℃条件下反应0.5-4小时，加入甘氨酸终止反应，然后采用常规的方法进行分离，获得本发明的聚乙二醇-干扰素，mPEG-GABA结构如下：

式中mPEG为聚乙二醇链。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，干扰素的磷酸盐缓冲液的浓度为1-10mg/mL，干扰素∶PEG＝1∶0.5～20，摩尔比；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用色谱法分离反应产物。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH为3.0～8.0。

9.权利要求1～4任一项所述的聚乙二醇-干扰素在制备抗病毒药物中的应用。

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