CN1879889A - 一种肾靶向药物载体及与其形成的前药、制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的肾靶向药物载体，及其作为药物载体所形成的前体药物、制备方法和应用。通过将天然的壳聚糖进行降解和衍生化得到低分子量的壳聚糖或其衍生物，其具有良好的肾靶向性，该药物载体通过化学键与抗肿瘤药物或糖皮质激素或免疫抑制剂相连，得到前体药物。药物分子与载体通过化学键相连，并涉及其制备方法和应用。体外和体内实验研究表明前体药物能够在体内到达肾脏并释放出活性药物。本发明制法简单，工艺成熟，性能稳定，适于大规模连续生产。其应用包括作为治疗肾脏疾病的免疫抑制剂，肾抑制的抗排斥反应药物，肾炎并发肾脏感染的药物及其制剂。

Description

一种肾靶向药物载体及与其形成的前药、制法和应用

                               技术领域

本发明属制药领域，特别涉及低分子量壳聚糖或其衍生物这一具有良好肾靶向效率的药物载体，及其作为药物载体形成的新型肾靶向前体药物和制备方法与应用。

                               背景技术

肾脏是人体的重要器官之一。如果肾脏生理功能发生偏差，常导致严重疾病，肾脏有关的疾病主要有各种感染炎症、糖尿病、高血压、肿瘤等，例如急、慢性肾炎，急、慢性肾功能衰竭，尿路感染，肾癌，肾母细胞瘤，肾盂肿瘤等。近年来，晚期肾疾病的发生和流行正在逐年递增，据统计，1989年美国患有肾脏晚期疾病的患者有18.7万人，而到了1998年又有将近40万人患病。这些患者不得不依靠透析或肾脏移植来维持生命，但是平均每年的死亡率还是高达20％，与某些恶性肿瘤的死亡率相当。另外又有大约10倍此数目的人群由于心血管系统的疾病而患有慢性肾功能衰竭。其中，糖尿病和高血压是导致肾脏疾病的主要原因，大约30％的糖尿病晚期患者都会出现肾功能衰竭。因为糖尿病可导致肾小球硬化、肾动脉硬化及肾盂肾炎等病变，晚期则可致肾功能衰竭。

肾脏疾病需要长期服药。然而所用药物均存在不同程度的肾外效应，靶向性不强。另外，很多药物在到达肾脏前会被其他器官(如肝等)降解；即使药物能够到达肾脏，也不一定能作用于靶细胞；当肾小球滤过和肾小管排泄等功能异常时，药物的传递亦会受到影响。因此，药物的肾脏靶向很有必要，用以增加药物的安全性和有效性。为了实现给药的肾脏靶向性，至今，人们已经对肾靶向给药系统进行了深入地研究，采用了低分子质量蛋白质(LMWP)、微粒、糖基复合物等药物转运载体，前体药物和抗体以及基因治疗等多种手段，以最终实现肾脏靶向给药的目的。

在现已研究的各种肾靶向载体中，LMWP较为理想。分子量低于30,000道尔顿的LMWP可被肾小球自由滤过并通过近端小管迅速吸收。LMWP被近端小管细胞内吞后，经内吞体迁移至溶酶体。在溶酶体内，LMWP被分解成小肽和单个氨基酸。研究表明：约占注射剂量80％的LMWP(如溶菌酶、细胞色素c、抑肽酶等)最终被肾摄取。围绕这方面的专利较多，如：US6562371，US2003211142，JP2001055343。Suzuki等人研究了烷基糖苷作为肾靶向载体的潜力。他们采用不同糖分子作探针，通过不同长度的烷基间隔基将不同的糖分子和模型药物(精氨酸抗利尿激素，AVP)结合，研究了大鼠静注AVP-糖基复合物后的组织摄取情况，发现组织分布特性很大程度上取决于结合物中的糖分子：葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和2d-Glc-C8-AVP都显示出良好的肾脏特异性分布。Glc-S-C8-衍生物具有明显的肾靶向性，提示Glc-S-C8-是肾靶向的合适载体。相关专利是：EP0953357。据Journal of Controlled Release.95(2004)：229-237报道：Yamamoto Y等人采用自由基聚合反应制备乙烯基吡咯烷酮/二甲基马来酸共聚物(PVD)，并考察分子量和电荷对PVD在小鼠体内分布的影响。分子量为6000-8000道尔顿的PVD有很好的肾靶向性，给药剂量80％左右的PVD被肾摄取。还有研究表明，由于大量的γ-谷氨酰转肽酶能够特异性浓集于肾近曲小管的刷状缘，这种酶可以将氨基酸多肽的谷氨酰基衍生物转化为γ-谷氨酰氨基酸，然后水解为谷氨酸，因此肾脏在氨基酸和肽的谷氨酰基衍生物的摄取和代谢中具有很高的活性，因此可以将γ-谷氨酰氨基酸衍生物作为肾靶向前药。

可见，目前在研究肾靶向药物载体这一领域中，国内仍处于研究较少的阶段，相关的专利未见；国际上的研究也主要是放在主动靶向这一方面，也希望能寻找更多的效果优良的肾靶向药物载体，能更好地治疗人类的肾脏疾病，服务于人类。

目前，关于壳聚糖这种聚合物的相关专利很多：专利CN1698899A中公开的壳聚糖药物载体，是将高分子壳聚糖作为药物载体，使药物到达控制释放的作用；专利CN1554267A中公开了一种制备水溶性壳聚糖的制备方法；专利CN1743008A中公开了用壳聚糖来包裹药物，形成纳米粒，被动靶向到肝脏，等等。但是，都没有提出低分子量的壳聚糖可以作为一种良好的肾靶向药物载体以及前体药物的制备方法和应用。

                               发明内容

本发明就是在以上这些研究的基础上，通过筛选大量的药物载体后，所得低分子量的壳聚糖或其衍生物，都具有良好的肾靶向性。壳聚糖来源于虾蟹的外壳，其结构和纤维素相似，是自然界含量极其丰富的一种多糖。壳聚糖价廉、易得，具有优异的生物可降解性，生物相容性，因而其制备的低分子量的壳聚糖可以作为一种理想的肾靶向药物载体。通过使用低分子量的壳聚糖作为抗肿瘤药物，或糖皮质激素或免疫抑制剂的药物载体，可以特异性的将这些药物运送至肾脏，在其他组织的分布很少，在肾脏酶的作用下，释放出药物，起到局部抗肿瘤或局部免疫抑制的作用，降低抗肿瘤药物，或糖皮质激素所引起的毒副作用，增强疗效。

本发明的目的在于公开一种新的具有良好肾靶向效率的药物载体，并通过化学键与抗肿瘤药物，或糖皮质激素或免疫抑制剂相连，形成前体药物及其制剂，使药物能够被靶向到肾，降低药物在全身其它部位的浓度和副作用，减低药物剂量，增加疗效和产生局部免疫抑制效果。

分子量在1,000-100,000道尔顿的低分子量壳聚糖(LMWC)就有良好的肾靶向性，将其静脉注射入小鼠体内后，15分钟内就快速累积到肾脏，其他组织只有少量的LMWC，注射后，LMWC逐步被体内的酶所降解，从体内排出。

LMWC是一种适宜的肾靶向载体：①载体有可供药物连接的功能基团；②LMWC在肾脏中特异性蓄积；③LMWC的理化性质决定被连接药物的理化性质；④药物-LMWC结合物在循环中稳定，但当到达肾脏后，在酶的作用下，活性药物被释放出来。⑤LMWC价廉、易得，具有优异的生物相容性，生物可降解性，不会造成药物载体在体内的蓄积。LMWC是肾靶向药物载体之一。

LMWC可通过多种方式与药物连接。药物可通过载体的糖单元上的氨基和羟基形成化学键与LMWC直接相连。通过酶水解和化学水解，母体药物从药物-间隔基-LMWC或药物-LMWC结合物中释放。

本发明的技术方案为：

按照本发明的一个方面，公开一种肾靶向药物载体：低分子量壳聚糖或其衍生物，其作为药物载体，可以将与其共价结合的药物靶向到肾脏，是一种新的肾靶向药物载体；图1给出了其结构式。

式中：

R可以是氢原子(-H)、也可以是烷基(-CH₃、-C₂H₅等)、还可以是羧甲基(-CH₂COOH)；

m、n为正整数

低分子量壳聚糖或其衍生物的分子量在1,000-100,000之间。

在本发明的优选实施方案中，低分子量壳聚糖或其衍生物是脱乙酰度在40％-60％之间的具有良好水溶性的壳聚糖。脱乙酰度是指：壳聚糖分子中，糖单元上的自由-NH2的含量，通过脱乙酰基的糖单元数占壳聚糖分子中总的糖单元数的百分数表示。其制备方法如下：

1)将壳聚糖溶于0.3-3％(w/v)的盐酸水溶液中，过滤，配制成2-10％(w/v)的壳聚糖盐酸溶液，完全溶解后，加入过氧化氢，使其浓度为0.1-1.5％(w/v)，在40-70℃搅拌反应2小时。用氢氧化钠调节pH值为13-14，4000转/分离心，得到低分子量壳聚糖沉淀，水洗至中性后，真空干燥。

2)将干燥产品溶于0.5-10％(v/v)的醋酸溶液中，配制成0.1-0.9％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后，加入醋酸酐，其摩尔数为壳聚糖中氨基摩尔数的8-12倍，常温下反应3-8小时后，用氢氧化钠调节pH值为13-14，加入相当于反应液1.5-5倍体积的丙酮沉淀产物，4000转/分离心后，得沉淀，沉淀用1mol/L的氢氧化钾的甲醇液处理5小时以上，用甲醇洗涤沉淀到中性。

3)用水溶解上述沉淀，并用凝胶渗透色谱(GPC)进一步纯化。纯化产物经冷冻干燥后即得脱乙酰度在40％-60％之间的水溶性的壳聚糖。

通式(I)(见图1)的低分子量壳聚糖或其衍生物与抗肿瘤药物或糖皮质激素或免疫抑制剂结合形成的前体药物：

其中：

LMWC为低分子量壳聚糖或其衍生物，分子量在1,000-100,000之间。

n是一整数，最大不超过LMWC上的每个糖单元上的活性官能团数；

L为连接基团，选自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺组成的组；

D为抗肿瘤药物，或糖皮质激素，或免疫抑制剂；其特征在于药物通过化学键与低分子量壳聚糖或其衍生物的糖单元中的氨基、羟基共价连接。

在本发明的优选实施方案中，所述的前体药物中，与药物载体形成结合的药物有抗肿瘤药物或糖皮质激素，或免疫抑制剂组成。其中，抗肿瘤药物选自氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异溶肉瘤素以及它们衍生物组成的组，但不局限于这些所列药物；糖皮质激素选自氢化可的松、可的松、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松，以及它们衍生物所组成的组，但不局限于这些所列药物；免疫抑制剂选自雷公藤内酯醇、环孢素A、他克莫司、雷帕霉素、吗替麦考酚酯以及它们衍生物所组成的组，但不局限于这些所列药物。前体药物中与药物载体结合的药物优选雷公藤内酯醇或苯丁酸氮芥或泼尼松龙丁二酸单酯。

在本发明的优选实施方案中，得到的前体药物为：雷公藤内酯醇丁二酸单酯-壳聚糖结构式(II)或苯丁酸氮芥-壳聚糖结构式(III)或泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖结构式(IV)(或称：泼尼松龙琥珀酸半酯-壳聚糖)结构如下：

其中：

L代表丁二酸连接基团

LMWC代表低分子量壳聚糖或其衍生物，脱乙酰度在40％-60％，分子量在1,000-100,000之间。

n是一整数，最大不超过LMWC上的每个糖单元上的活性官能团数。

采用丁二酸为间隔基将药物分子与低分子量壳聚糖载体连接。对于有羧基的药物：苯丁酸氮芥，可直接采用缩合剂脱水得到前体药物；对于没有羧基的药物：雷公藤内酯醇，需衍生化生成具有羧基的衍生物；对于已有丁二酸单酯衍生物的药物：泼尼松龙丁二酸单酯，直接采用其丁二酸单酯衍生物。前体药物制备方法简述如下：

(1)将药物通过选自酯键、碳酸酯键、酰胺键、酰胺酯键、醚键、胺键、氨基酸酯键、氨基酸酰胺键中的一种与连接基团连接；优选药物雷公藤内酯醇需要与丁二酸反应，得到雷公藤内酯醇丁二酸单酯；优选药物泼尼松龙丁二酸单酯和苯丁酸氮芥则可以直接与载体连接，无需衍生化。

(2)将药物或制得的药物衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺溶于乙醇；将低分子量壳聚糖或衍生物溶于蒸馏水或pH值在6.0-8.0MOPS缓冲液(如果低分子量壳聚糖或衍生物不溶于水，就用0.5％-10％的HCl溶液溶液溶解，然后用MOPS缓冲液调节近中性)，待完全溶解后，于搅拌条件下将乙醇混合物缓慢滴加到水相，按水∶醇＝1∶9-9∶1(v/v)计算加入，最后加入水溶性碳二亚胺为缩合剂，4℃反应过夜，加入相当于反应液1.5-5倍体积的丙酮沉淀产物，并洗涤沉淀数次后，干燥得前体药物。

(3)雷公藤内酯醇丁二酸单酯的制备方法：雷公藤内酯醇和丁二酸酐按1∶1-1∶100的比例溶于有机溶剂二氯甲烷、三氯甲烷或吡啶中，加入催化剂二甲氨基吡啶和三乙胺，室温反应完全，硅胶柱层析纯化。得到雷公藤内酯醇丁二酸单酯。

缩合剂可以包括：N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-环己基-N’-三甲胺丙基碳二亚胺碘化盐(EDCI)、N-环己基-N’-吗啡啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸甲酯。

按照本发明的一个方面，提供了上述前体药物的药学上可以接受的制剂。包括片剂、栓剂、软或硬明胶胶囊剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂、冻干粉针，优选冻干粉针剂。其中，所述的前体药物制剂可以通过口、鼻内、直肠、透皮或注射方式进行给药，优选注射方式进行给药的制剂。其制备方法为本领域人员所共知。

本发明的另一个目的是提供低分子量壳聚糖和以其作为药物载体的前体药物能够特异地积累肾脏，并能在肾脏特异释放出原药的药学证据。采用FITC标记的低分子量壳聚糖以及泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物进行了体外和体内试验，以期实现如下目的：1、确定低分子量壳聚糖具有良好的肾靶向效率；2、确保前体药物在到达肾脏之前不会在体内降解；3、前体药物到达肾脏之后能够被水解释放出药物。

1、荧光标记的低分子量壳聚糖的体内分布：

取FITC标记的低分子量壳聚糖通过小鼠尾静脉注射后，在15分钟、30分钟、60分钟和120分钟将小鼠处死，取心、肝、脾、肺、肾，称重，制成匀浆，沉淀蛋白后，用荧光分光光度计测定含量，计算出平均每只小鼠每种组织中壳聚糖的量占总注射量的百分数，结果见图2。说明低分子量壳聚糖具有良好的肾靶向效率。

2、泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物的体外释药：

体外稳定性试验证实，结合物与大鼠血浆37℃混合，振荡，高效液相色谱法(HPLC)定时测定血浆中游离药物的量。结果证实：前体药物相对稳定，2小时释放出游离药物的量不及结合药物的10％，考虑到前体药物在血液中能够迅速被肾脏摄取(＜15分钟)，避免前体药物在到达肾脏之前释放出药物。而前体药物在大鼠肾组织匀浆中能迅速释放药物，结果见附图3。图中曲线(◆)代表前体药物在大鼠血浆中的累积释药量；曲线(■)代表前体药物在大鼠肾组织匀浆中的累积释药量；曲线(▲)代表前体药物在空白对照溶液中的累积释药量。

3、泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物的体内分布：

评价一种药物或制剂靶向性的常用办法是测定在某一时间点各个器官中药物的相对浓度，即靶向效率。通过小鼠尾静脉注射前体药物以及泼尼松龙注射液，定时处死，HPLC法测定，计算出每克脏器中的药物浓度，发现注射前体药物一组中，肾脏中药物浓度远远高于其它脏器；对照组中，泼尼松龙在各个脏器组织的分布比较均衡，肾脏组织的药物浓度远远低于前体药物组。结果见图4。结果证明：泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物具有良好的靶向效率。

综上所述，低分子量壳聚糖是一种新的具有良好肾靶向效率的药物载体，模型药物与其形成的前体药物，能够将药物特异地送达肾脏，活化并释放出原药，产生局部的免疫抑制作用，有效降低其毒副作用，增强其疗效。

附图说明：

图1.低分子壳聚糖或其衍生物结构式

图2.荧光标记的壳聚糖在各个脏器组织的分布图

图3.泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物在大鼠血浆，肾组织匀浆和空白对照溶液中的释药曲线

图4.泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物以及泼尼松龙对照品在小鼠各个脏器组织中的分布图

图5.分子量为20000道尔顿的水溶性壳聚糖的400兆核磁共振氢谱图

图6.泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物(Mw＝10000)在小鼠各个脏器组织中的分布图

图7.泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物(Mw＝40000)在小鼠各个脏器组织中的分布图

                               具体实施例

下面再结合实施进一步描述本发明的药物载体、前体药物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围要求由权利要求限定。

实施例1：

低分子量水溶性壳聚糖的制备

将3g壳聚糖溶于150ml 0.45％(w/v)的盐酸水溶液中，待完全溶解后，过滤，加入1.88ml过氧化氢，在40-70℃搅拌反应2小时。用氢氧化钠调节pH值为13，沉淀析出，4000转/分离心，得到低分子量壳聚糖沉淀，水洗至中性后，真空干燥。

取干燥产品1g溶于170ml 3％的醋酸溶液中，完全溶解后，加入6ml醋酸酐，常温下搅拌反应4小时后，用氢氧化钠调节pH值为13，加入500ml丙酮，离心后，得沉淀，沉淀用1mol/L的氢氧化钾的甲醇液处理5小时，用甲醇洗涤沉淀到中性，用水溶解沉淀，并用凝胶渗透色谱(GPC)进一步纯化。冷冻干燥后，即得水溶性的壳聚糖。取5mg溶于0.5ml重水(D2O)，用400兆核磁共振测定，见附图5，脱乙酰度为56％。

实施例2：

荧光标记壳聚糖的制备及体内分布研究

精密称定壳聚糖(Mw＝20000，脱乙酰度为50％左右，水溶性)300mg溶于1mol/L HCl溶液10ml中，再用NaOH调节pH值到6.9。加入21mgFITC(异硫氰酸荧光素)，混匀后室温下反应24小时，透析。将透析后的样品冷冻干燥(壳聚糖本身就是很好的支架基，所以不必加入其他支架基)。测定荧光素含量为6.56％(w/w)。取昆明种小鼠20只，雄性，重量在25-30克之间，每5只为一组，一共4组。按注射剂量40mg/kg计算，尾静脉注射FITC-壳聚糖，分别15min，30min，60min，120min处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，称重，并制备成组织匀浆，沉淀蛋白后，用荧光分光光度计测定含量，计算出平均每只小鼠每种组织中壳聚糖的量占总注射量的百分数。结果见附图2。结果证明，低分子量壳聚糖是一种具有良好肾靶向性的药物载体。

实施例3：

泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物的制备

精密称定泼尼松龙丁二酸单酯115mg，N-羟基琥珀酰亚胺28.8mg，溶于20ml乙醇；精密称定壳聚糖100mg(Mw＝10000道尔顿，脱乙酰度为50％左右，水溶性)溶于30ml蒸馏水，待完全溶解后，在搅拌条件下将乙醇混合物缓慢滴加到水相，最后加入120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为缩合剂，4℃反应过夜，用150ml丙酮沉淀结合物并洗涤沉淀数次后，干燥得前体药物。密封低温保存。

精密称定泼尼松龙丁二酸单酯115mg，N-羟基琥珀酰亚胺28.8mg，溶于20ml乙醇；精密称定壳聚糖100mg(Mw＝20000道尔顿，水不溶性)，加入10ml 0.5％HCl溶解后，再加入20mlpH＝7.2的MOPS缓冲液，将乙醇混合物缓慢滴加到水相，最后加入120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为催化剂，4℃反应过夜，用150ml丙酮沉淀结合物并洗涤沉淀数次后，干燥得前体药物。密封低温保存。

实施例4：

泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物体外释药

理想的靶向前体药物应能在到达肾脏之前保持稳定，在到达靶器官或靶细胞之后又能释放出活性母药而发生作用。本发明详细研究了前体药物在大鼠血浆、大鼠肾组织匀浆和对照溶液中的释药行为。研究表明，前体药物在大鼠血浆中相对稳定，在15分钟内释放的药物不及总药的10％，而在大鼠肾组织匀浆中的释药速度则相对比较快。这保证前体药物能够到达肾又能释放出母药。

取SD大鼠经肝素抗凝的新鲜血浆5ml，37℃预热，加入前体药物使成浓度为200μg/mL，37℃水浴振摇，定时取样0.2ml，加入甲醇沉淀蛋白质，旋涡振摇5分钟，离心(14000转/分，15分钟)，高效液相色谱测定上清液游离药物浓度。

取SD大鼠33％的肾组织匀浆5ml，37℃预热，加入前体药物成浓度为200μg/mL，37℃水浴振摇，定时取样0.2ml，加入甲醇沉淀蛋白质，旋涡振摇5分钟，离心(14000转/分，15分钟)，高效液相色谱测定上清液游离药物浓度。发现前体药物在大鼠血浆中相对稳定，而在肾组织匀浆中能够迅速释放出母药，结果见附图3。图中曲线(◆)代表前体药物在大鼠血浆中的累积释药量；曲线(■)代表前体药物在大鼠肾组织匀浆中的累积释药量；曲线(▲)代表前体药物在空白对照溶液中的累积释药量。

实施例5：

三种不同分子量，50％左右脱乙酰度的泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物的小鼠体内组织分布研究：

取昆明种小鼠20只，雄性，重量在25-30克之间，随机每5只为一组，一共4组。按注射剂量28mg/kg计算，尾静脉注射泼尼松龙药物。分别15min，30min，60min，120min处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、血浆，并制备成33％的组织匀浆和50％的血浆，加入甲醇和10％三氯乙酸沉淀蛋白，旋涡振摇5分钟，离心(14000转/分，15分钟)，高效液相色谱测定上清液游离药物浓度，计算出平均每克脏器组织(或每ml血浆)中，泼尼松龙的含量。结果见附图4。

另取昆明种小鼠20只，雄性，重量在25-30克之间，随机每5只为一组，一共4组。尾静脉注射泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物，壳聚糖的Mw为20000道尔顿，注射剂量按前体药物中泼尼松龙的量计算，相当于泼尼松龙28mg/kg。分别15min，30min，60min，120min处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、血浆，并制备成33％的组织匀浆和50％的血浆，加入NaOH水解前体药物，再加入甲醇和10％三氯乙酸沉淀蛋白，旋涡振摇5分钟，离心(14000转/分，15分钟)，高效液相色谱测定上清液游离药物浓度，计算出平均每克脏器组织(或每ml血浆)中，泼尼松龙的含量。结果见附图4。

另取昆明种小鼠20只，雄性，重量在25-30克之间，随机每5只为一组，一共4组。尾静脉注射泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物，壳聚糖的Mw为10000道尔顿。注射剂量按前体药物中泼尼松龙的量计算，相当于泼尼松龙28mg/kg。生物样品处理方法同上，结果见附图6。

另取昆明种小鼠20只，雄性，重量在25-30克之间，随机每5只为一组，一共4组。尾静脉注射泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物，壳聚糖的Mw为40000道尔顿。注射剂量按前体药物中泼尼松龙的量计算，相当于泼尼松龙28mg/kg。生物样品处理方法同上，结果见附图7。

结果均证明，泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖前体药物具有良好的肾靶向效率。

本发明公开了一种新的具有良好肾靶向效率的药物载体，并与药物通过化学键制备得到前体药物，使药物能够被靶向到肾，降低药物在全身其它部位的浓度和副作用，减低药物剂量，增加疗效。

上述任何一种前体药物及其在临床可用的制剂形式均可应用在预防和控制肾脏疾病的急慢性肾炎，肾肿瘤，肾移植后的抗排斥反应及其他肾脏疾病中。

本发明制法简单，工艺成熟，性能稳定，适于大规模生产。

Claims (10)

1、一种肾靶向药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的靶向药物载体，是将与其共价结合的药物靶向到肾脏的低分子量壳聚糖或其衍生物，其分子量在1,000-100,000之间。

2、根据权利要求1的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的药物载体是低分子量壳聚糖或其衍生物，优选具有良好水溶性的、脱乙酰度在40％-60％之间的壳聚糖。

3、一种根据权利要求1的药物载体及与其形成的前药、制法和应用中所述的前体药物以低分子量壳聚糖或其衍生物与抗肿瘤药物或糖皮质激素或免疫抑制剂结合形成，具有通式(I)所示结构：

其中：

LMWC为低分子量壳聚糖或其衍生物；

n是一正整数，最大不超过LMWC上的每个糖单元上的活性官能团数；

L为连接基团，选自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺组成的组；

D为抗肿瘤药物，或糖皮质激素，或免疫抑制剂；

其特征在于药物通过化学键与低分子量壳聚糖或其衍生物的糖单元中的氨基、羟基共价连接。

4、根据权利要求3的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的前体药物中，与药物载体结合的药物可以由抗肿瘤药物或糖皮质激素，或免疫抑制剂组成；

其中，抗肿瘤药物选氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异溶肉瘤素以及它们衍生物组成的组；

糖皮质激素选自氢化可的松、可的松、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松，以及它们衍生物所组成的组；

免疫抑制剂选自雷公藤内酯醇、环孢素A、他克莫司、雷帕霉素、吗替麦考酚酯以及它们衍生物所组成的组。

5、根据权利要求4的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的前体药物中，与药物载体结合的药物优选雷公藤内酯醇或苯丁酸氮芥或泼尼松龙丁二酸单酯。

6、根据权利要求4-5的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的前体药物：雷公藤内酯醇丁二酸单酯-壳聚糖结构式(II)或苯丁酸氮芥-壳聚糖结构式(III)或泼尼松龙丁二酸单酯-壳聚糖结构式(IV)分别具有以下结构：

其中：

L代表丁二酸连接基团

LMWC代表低分子量壳聚糖或其衍生物，脱乙酰度在40％-60％，分子量在1,000-100,000之间。

n是一正整数，最大不超过LMWC上的每个糖单元上的活性官能团数。

7、根据权利要求3-6的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的前体药物在药物学可接受的制剂内：包括片剂、栓剂、软或硬明胶胶囊剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂、冻干粉针，优选冻干粉针剂；其中，所述的前体药物制剂可以通过口、鼻内、直肠、透皮或注射方式进行给药，优选注射方式进行给药的制剂。

8、一种根据权利要求1、4、5、6的药物载体及与其形成的前药、制法和应用中所述的前体药物的制备方法，其特征在于：

(1)将药物通过选自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺基中的一种与连接基团连接；优选药物雷公藤内酯醇需要与丁二酸反应，得到雷公藤内酯醇丁二酸单酯；优选药物泼尼松龙丁二酸单酯和苯丁酸氮芥则可以直接与载体连接，无需衍生化；

(2)将药物或制得的药物衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺溶于乙醇；将低分子量壳聚糖或衍生物溶于蒸馏水或pH值在6.0-8.0MOPS缓冲液(如果低分子量壳聚糖或衍生物不溶于水，就用0.5％-10％的HCl溶液溶液溶解，然后用MOPS缓冲液调节近中性)，待完全溶解后，于搅拌条件下将乙醇混合物缓慢滴加到水相，按水∶醇＝1∶9-9∶1(v/v)计算加入，最后加入水溶性碳二亚胺为缩合剂，4℃反应过夜，加入相当于反应液1.5-5倍体积的丙酮沉淀产物，并洗涤沉淀数次后，干燥得前体药物。

9、根据权利要求8的药物载体及与其形成的前药、制法和应用，其特征在于所述的前体药物制备方法中的缩合剂可以包括：N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-环己基-N’-三甲胺丙基碳二亚胺碘化盐(EDCI)、N-环己基-N’-吗啡啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸甲酯。

10、一种根据权利要求4-8的药物载体及与其形成的前药、制法和应用中所述的前体药物，其特征在于任一种前体药物及其临床可用的制剂形式在预防和控制肾脏疾病的急慢性肾炎，肾肿瘤，肾移植后的抗排斥反应及其他肾脏疾病中的应用。

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