JP2010515678A - キトサン基材高分子接合体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明のキトサン基材高分子接合体は、プラスミドデオキシリボ核酸、小さな干渉リボ核酸など、陰電荷を帯びた核酸素材医薬と荷電度による接合体を形成して、目的する核酸医薬を細胞内に輸送する効率を上げることができるだけでなく、細胞毒性を減少させることによって、核酸素材医薬を生体または細胞内に投与する効率的な伝達体として有用に使用可能である。
【選択図】図9
Description
RNA)、プラスミドデオキシリボ核酸(DNA)等、核酸素材医薬(gene medicine)の生体投与及び細胞内の伝達のためのキトサン接合体、及びその製造方法に関し、より詳しくは、多様な分子量のキトサン(chitosan)を主型にして、ポリアルギニン(poly-L-arginine)と結合させた二重接合体、またはこれら接合体にポリエチレングリコール(poly ethylene glycol;PEG)が追加された三重接合体、及びその製造方法に関する。
Control. Release(2006)114、100−109)。また、生体内で複合体を形成して伝えられた遺伝子の血中半減期を大きく延長させられない短所がある(Gene Ther.(2001)8、1857−1592)。
50000〜150000、Fluka、スイス)、中間分子量−キトサン(MMW−キトサン;Aldrich、190,000−310,000)及び高分子量−キトサン(HMW−キトサン;Aldrich、310,000−375,000、または平均分子量600,000
Fluka、スイス)を使用して本発明のキトサン素材陽イオン性高分子を製造した。
−3−ヒドロキシ−4−ヨウ素−1、2、3−ベンゾトリアジン(HOOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(sulfo−NHS)などがあるが、これに制限されるのではない。
キトサン−ポリエチレングリコール接合体製造
LMW(低分子量、low molecular weight−キトサン(fw
50000〜150000))を0.1M HCl溶液に20mg/ml濃度に溶解させた後、PBS pH7.4緩衝溶液で2mg/ml濃度に希釈する。
of pyranose units)とmPEG5K−SC(mPEG5K−サクシニルカーボネート、fw 5000、24.84mg、4.96×10−6mol、8mol%、IDB、韓国)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG5K−LMW−キトサン接合体を(DP
8mol%;DP:the degree of PEGylation)製造する。
ポリアルギニン−ポリエチレングリコール接合体製造
20mM Tris pH8.0緩衝溶液2mlにポリ−L−アルギニン(PLR;fw 15000〜70000、10mg、2.85X10−7mol、シグマ、米国)とmPEG5K−SC(fw 5000、7.14mg、1.42X10−6mol)を混合した後、室温で2時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してPEG−ポリ−L−アルギニン接合体を製造する。
LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
1−1.Low molecular weight キトサン(LMW−キトサン;fw
50000〜150000、Fluka、スイス)を0.1M HCl溶液に20mg/ml濃度に溶解させた後、50mM MES pH4.0緩衝溶液で2mg/ml濃度に希釈する。
of pyranose units)にポリ−L−アルギニン(PLR;fw 15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol、シグマ、米国)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カーボジイミド(EDAC
fw 191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(sulfo−NHS;fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k、サトリアス、ドイツ)を使用して精製した後、凍結乾燥してLMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
of pyranose units)にPLR(fw 15000〜70000、1.4mg、0.4X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、766.8ug、0.4X10−5mol、Sulfo−NHS(fw
217.14、869ug、0.4X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してLMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合剤を製造する。
of pyranose units)にPLR(fw 15000〜70000、3.5mg、1X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、1.917mg、1X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw
217.14、2.17mg、1X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してLMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合剤を製造する。
LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
2−1.PLR(fw 15000〜70000)の代わりにPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol、シグマ、米国)を使用して実施形態1−2と同一な方法によりLMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体を製造する。
>70000)接合体を製造する。
>70000)接合体を製造する。
LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
3−1.PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、ポリ−L−ヒスチジン(PLH;fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol、シグマ、米国)を使用して実施形態1−2と同一な方法によりLMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
5000)接合体を製造する。
5000)接合体を製造する。
LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
4−1.PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、ポリ−L−ライシン(PLK;fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol、シグマ、米国)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりLMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体を製造する。
9200)接合体を製造する。
9200)接合体を製造する。
MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
5−1.Medium molecular weight−キトサン(MMW−キトサン、アルドリチ、米国)を使用して、実施形態1−1と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
of pyranose units)を使用して実施形態1−2と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
of pyranose units)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
of pyranose units)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
6−1.実施形態5−1で用意したキトサン溶液1ml(2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLR(fw >70000、2.8mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLR(fw >70000、7mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
7−1.実施形態5−1で用意したキトサン溶液1ml(2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.2mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.5mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
8−1.実施形態5−1で用意したキトサン溶液1ml(2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.368mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.92mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりMMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
9−1.High molecular weight−キトサン(HMW−キトサン;fw
〜600000、Fluka、スイス)を使用して、実施形態1−1と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
of pyranose units)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
of pyranose units)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
of pyranose units)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
10−1.実施形態9−1で用意したキトサン溶液1ml(fw 〜600000、2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLR(fw >70000、2.8mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLR(fw >70000、7mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
11−1.実施形態9−1で用意したキトサン溶液1ml(fw 〜600000、2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.2mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.5mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
12−1.実施形態9−1で用意したキトサン溶液1ml(fw 〜600000、2mg、1.24X10−5mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態1−2と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.368mg、0.4X10−7mol)を使用して、実施形態1−3と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.92mg、1X10−7mol)を使用して、実施形態1−4と同一な方法によりHMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
実施形態13
mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
13−1.LMW−キトサン(fw 50000〜150000)を0.1M HCl溶液に20mg/ml濃度に溶解させた後、PBS
pH7.4緩衝溶液で2mg/ml濃度に希釈する。
実施形態13−1で用意したキトサン溶液10ml(fw 50000〜150000、20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とmPEG2k−SG(mPEG2k−サクシミジルグルタレート、fw 2000,24.8mg、1.24X10−5mol、10mol%、IDB、韓国)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG2k−LMW−キトサン(fw
50000〜150000)接合体(DP 10mol%;DP:the degree of PEGylation)を製造する。製造されたmPEG2k−LMW−キトサン(fw
50000〜150000)接合体2mgを1mlの50mM MES pH4.0緩衝溶液に溶かした後(fw 15000〜70000、PLR 0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw
191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、sulfo−NHS(fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態13−1で用意したキトサン溶液10ml(fw 50000〜150000、20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とmPEG2k−SG(fw 2000、37.26mg、1.863X10−5mol、15mol%)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG2k−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体(DP
15mol%)を製造する。製造されたmPEG2k−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体2mgを1mlの50mM MES pH4.0緩衝溶液に溶かした後、PLR(fw
15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw
217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−LMW−キトサン−PLR(fw >70000)接合体製造
14−1.10% mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−PLR(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
15−1.10% mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
16−1.10% mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 10mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)
17−1.MMW−キトサンを使用して、実施形態13−1と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
10mol%)を製造する。
17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
15mol%)を製造する。
mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
18−1.10% mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−PLR(fw
>70000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
19−1.10% mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
20−1.10% mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 5000、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 5000、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
21−1.HMW−キトサン(fw 〜600000)を使用して、実施形態13−1と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
10mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
15mol%)を製造する。
mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
22−1.10% mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
23−1.10% mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG2k−HMW−キトサンポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
24−1.10% mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 5000、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−2と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 10mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 5000、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態13−3と同一な方法によりmPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
25−1.5% mPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体
実施形態13−1で用意したキトサン溶液10ml(fw 50000〜150000、20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とmPEG5k−SC(fw 5000、31.05mg、6.21X10−6mol、5mol%、IDB、韓国)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG5k−LMW−キトサン(fw
50000〜150000)接合体(DP 5mol%)を製造する。製造されたmPEG5k−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体2mgを1mlの50mM MES pH4.0緩衝溶液に溶かした後、PLR(fw
15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、386.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw
217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態13−1で用意したキトサン溶液10ml(fw 50000〜150000、20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とmPEG5k−SC(fw 5000、46.58mg、9.316X10−6mol、15mol%)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG5K−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体(DP
15mol%)を製造する。製造されたmPEG5k−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体2mgを1mlの50mM MES pH4.0緩衝溶液に溶かした後、PLR(fw
15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、386.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw
217.14、434.28ug.0.4X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−LMW−キトサン−PLR(fw >70000)接合体製造
26−1.5% mPEG5k−LMW−キトサン−PLR(fw >70000)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
27−1.5% mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
28−1.5% mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 5mol%)を製造する。
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
29−1.5% mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
5mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
15mol%)を製造する。
mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
30−1.5% mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
31−1.5% mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
33−1.5% mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
33−1.5% mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
5mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
15mol%)を製造する。
34−1.5% mPEG5k−HMW−キトサン−PLR(fw >70000)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
35−1.5% mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
36−1.5% mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−1と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 5mol%)を製造する。
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態25−2と同一な方法によりmPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体(DP 15mol%)を製造する。
5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
37−1.mPEG2K−COCH(CH3)Cl製造
mPEG2K−OH(0.5g、0.25mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP;91.6mg、0.75mmol)、トリエチルアミン(TEA;0.070ml、0.5mmol)を12mlのジクロロメタン(DCM)に溶かした溶液を0℃、窒素ガス下で2−クロロプロピオニルクロライド(2-chloropropionyl chloride;0.12ml、1.25mmol)を3mlのDCMに溶かした溶液を徐々に加えた後、反応温度を0℃から室温に上げて、24時間の間撹拌する。TLCで反応過程確認後、反応混合物を減圧濃縮してジエチルエテル(diethyl ether)に注いで沈殿させて濾過精製し、エタノール(ethanol)に溶かして再結晶させ、濾過精製する。この化合物の構造確認は500MHz
1H−NMRで確認した。
LMW Chitosan(phth−LMW−chitosan)製造
LMW−キトサン(LMW−chitosan Fluka、500mg、3.1mmol)、フタリック無水物(Phthalic anhydride
1.38g、9.32mmol)を10mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶かした溶液を窒素ガス下で130℃位加熱して、7時間の間撹拌する。反応物を室温に冷却し、氷水に注いで沈殿物を水で洗ってあげながら濾過する。得られた固形物はソックスレー抽出(soxhlet extraction)を通じてエタノール(ethanol)で洗ってあげる。得られた固形物は50℃で真空乾燥させてキトサン(chitosan)のアミン基を保護したphth−LMW−chitosanを得た。
実施形態37−2で製造したphth−LMW−chitosan(70mg、0.24mmol)を1mlのピリジン(Pyridine)に溶かした溶液に実施形態37−1で合成したmPEG2K−COCH(CH3)Cl(72.2mg、36.1μmol)を2mlのDMFに溶液を加えて、窒素ガス下で100℃位に加熱して24時間の間撹拌する。この反応物を室温で冷却し、エタノールに注いで沈殿させて、エタノールとエーテルで洗ってあげながら濾過して、キトサン5`CのハイドロキシにPEGを接合させた固形物5`−mPEG2K−キトサン(phth)を真空乾燥させる。この化合物5`−mPEG2K−キトサン(phth)50mgを10mlのヒドラジン水化物(hydrazine monohydrate(H2NNH2・H2O))に溶かした溶液を窒素ガス下で130℃で還流させ、24時間の間撹拌する。この反応物を室温で冷却させ、沈殿物を精製して10mlの0.1M NaOH(aq)に混合して室温で16時間の間撹拌する。この混合物のpHを50mM
HCl(aq)で10程度に下げて透析させ、真空乾燥して化合物5`−mPEG2K−LMW−キトサンを得る。この化合物は500MHz
1H−NMRで確認した。
mPEG2K−COCH(CH3)Cl(48.1mg、24.0μmol)を使用して、実施形態37−3と同一な方法により製造した。
実施形態37−3で製造した5`−mPEG2K−LMW−キトサン2mgを50mM
MES pH4.0緩衝溶液1mlに溶かした後、PLR(fw 15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw
191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥して5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態37−4で製造した5`−mPEG2K−LMW−キトサン2mgを50mM
MES pH4.0緩衝溶液1mlに溶かした後、PLR(fw 15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw
191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥して5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
38−1.15% 5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
39−1.15% 5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
40−1.15% 5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)
41−1.Phth−MMW−キトサン製造
MMW−キトサン(Aldrich)を使用して実施形態37−2のような方法により製造した。
phth−MMW−キトサンを使用して実施形態37−3と同一な方法により製造した。
phth−MMW−キトサンを使用して実施形態37−4と同一な方法により製造した。
実施形態41−2で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgを使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態41−3で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgを使用して実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
42−1.15% 5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
実施形態41−2で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
実施形態41−3で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
43−1.15% 5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)
実施形態41−2で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体を製造した。
実施形態41−3で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
44−1.15% 5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態41−2で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
実施形態41−3で製造した5`−mPEG2K−MMW−キトサン2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
45−1.Phth−HMW−キトサン製造
HMW−キトサン(Fluka)を使用して実施形態37−2のような方法により製造した。
phth−HMW−キトサンを使用して実施形態37−3と同一な方法により製造した。
phth−HMW−キトサンを使用して実施形態37−4と同一な方法により製造した。
実施形態45−2で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgを使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態45−3で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgを使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
46−1.15% 5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
実施形態45−2で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
実施形態45−3で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
47−1.15% 5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
実施形態45−2で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
実施形態45−3で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
48−1.15% 5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
実施形態45−2で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−5と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
実施形態45−3で製造した5`−mPEG2K−HMW−キトサン2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態37−6と同一な方法により5`−mPEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
5`−mPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw1500〜70000)
49−1.mPEG5K−COCH(CH3)Cl製造
mPEG2K−OH(1.0g、0.2mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP;73.3mg、0.18mmol)、トリエチルアミン(TEA;0.056ml、0.4mmol)と2−クロロプロピオニルクロライド(2-chloropropionyl chloride;0.097ml、1.0mmol)を使用して、実施形態37−1のような方法により製造した。
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Cl(180mg、36.1μmol)と実施形態37−2で製造したキトサンを使用して、実施形態37−3と同一な方法により製造した。
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Cl(120mg、24.0μmol)と実施形態37−2で製造したキトサンを使用して実施形態37−4のような方法により製造した。
実施形態49−2で製造した5`−mPEG5K−LMW−キトサン2mgを50mM
MES pH4.0緩衝溶液1mlに溶かした後、PLR(fw 15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw
191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥して5`−mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態49−3で製造した5`−mPEG5K−LMW−キトサン2mgを50mM
MES pH4.0緩衝溶液1mlに溶かした後、PLR(fw 15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw
191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw 217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥して5` −mPEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
50−1.15% 5`−mPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5K−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
51−1.15% 5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLH(fw 5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
52−1.15% 5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
PLR(fw 15000〜150000)の代わりに、PLK(fw 9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−LMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 1500〜70000)接合体製造
53−1.15mol% PEGylationされた5`−mPEG5K−MMW−キトサン製造
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Clと実施形態41−1で製造したキトサンを使用して、実施形態49−2のような方法により製造した。
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Clと実施形態41−1で製造したキトサンを使用して、実施形態49−3と同一な方法により製造した。
実施形態53−1で製造した5`−mPEG5K−MMW−キトサン2mgを使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態53−2で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgを使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
54−1.15% 5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
実施形態53−1で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
実施形態53−2で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
55−1.15% 5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)
実施形態53−1で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
実施形態53−2で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
56−1.15% 5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態53−1で製造した5`−mPEG5K−MMW−chitosan2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
実施形態53−2で製造した5`−mPEG5k−MMW−chitosan2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−MMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 1500〜70000)
57−1.15mol% PEGylationされた5`−mPEG5K−HMW−chitosan製造
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Clと実施形態45−1で製造したキトサンを使用して、実施形態49−2のような方法により製造した。
実施形態49−1で製造したmPEG5K−COCH(CH3)Clと実施形態45−1で製造したキトサンを使用して実施形態49−3と同一な方法により製造した。
実施形態57−1で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgを使用して実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
実施形態57−2で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgを使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000〜70000)接合体を製造する。
5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
58−1.15% 5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)
実施形態57−1で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
実施形態57−2で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLR(fw
>70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造した。
5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体製造
59−1.15% 5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw 5000)接合体
実施形態57−1で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
実施形態57−2で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLH(fw
5000、0.1mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ヒスチジン(fw
5000)接合体を製造した。
5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体製造
60−1.15% 5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw 9200)接合体
実施形態57−1で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−4と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
実施形態57−2で製造した5`−mPEG5K−HMW−chitosan2mgとPLK(fw
9200、0.184mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態49−5と同一な方法により5`−mPEG5k−HMW−キトサン−ポリ−L−ライシン(fw
9200)接合体を製造した。
Man−PEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000−70000)接合体製造
61−1.Man−PEG2K−NHS製造
PEG2K−diamine(0.5g、25μmol)を25mlのDCMに溶かし、0℃でFmoc−OSu(12.6mg、37.5μmol)を添加し、TLCで確認してPEG−diamineが消耗されるまで撹拌する。減圧蒸留装置によりDCMを除去する。少量のDCMを使用して溶かし、エーテル(ether)に沈殿させて精製して(Fmoc)2−PEGを含むFmoc−PEG−NH2を得る。このPEG−化合物Fmoc−PEG−NH2はTLCにより反応モニタリングした。製造したFmoc−PEG−NH2(0.46g、23μmol)を23mlのDCMに溶かし、スクシニック無水物(succinic anhydride;23.0mg、230μmol)とピリジン(22.3μl、276μmol)を入れて、窒素ガス下で40−60℃位で還流させ、一晩中撹拌する。室温に低めて、DCMで抽出し、飽和されたNH4Cl(aq)で洗ってあげる。DCM層は、MgSO4で水分を除去し、減圧蒸留装置でDCMを除去する。少量のDCMに溶かして過量のエーテル(ether)に注いで沈殿させて精製して反応に関与せず、残った(Fmoc)2−PEGを含むFmoc−PEG−COOHを得る。化合物Fmoc−PEG−COOHはTLCで反応モニタリングし、D2Oに溶かして500MHz1H
NMRで確認した。この化合物Fmoc−PEG−COOH(0.45g、22.5μmol)を50%ピペリジン/DMFに溶かし、1.5時間位撹拌してFmoc deprotection反応をする。過量のエーテルに注いで沈殿させ、エーテル(ether)で十分に洗いながら濾過し精製して、PEG−diamineを含むH2N−PEG−COOHを得る。得られた化合物H2N−PEG−COOH(0.4g、20μmol)とマンノーズ(mannose;10.8mg、60μmol)、イミダゾール(imidazole;8.2mg、120μmol)を2mlのN−メチルピロリドン(NMP)に溶かし、60℃位に加熱して20hr位撹拌する。室温に低めて、DCMで抽出し、飽和されたNH4Cl(aq)で洗ってあげる。DCM層はMgSO4で水分を除去し、減圧蒸留装置でDCMを除去する。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、DCM/MeOH/NH4OHでPEGを回収した後、減圧蒸留装置で溶媒を除去する。少量のDCMに溶かして過量のエーテルに注いで沈殿させて精製して、(Man)2−PEGを含むMan−PEG−COOHを得る。マンノーズの確認はMan−PEG−NHS化合物でNMRで確認した。
NMRで確認した。
実施形態13−1で用意したキトサン溶液10ml(fw 50000〜150000、20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)と実施形態61−1で製造したMan−PEG2K−NHS(fw 2000,37.26mg、1.863X10−5mol、15mol%)を混合した後、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter;MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してMan−PEG2K−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体(DP
15mol%)を製造する。製造されたMan−PEG2K−LMW−キトサン(fw 50000〜150000)接合体2mgを1mlの50mM MES pH4.0緩衝溶液に溶かした後、PLR(fw
15000〜70000、0.7mg、0.2X10−7mol)、EDAC(fw 191.7、383.4ug、0.2X10−5mol)、Sulfo−NHS(fw
217.14、434.28ug、0.2X10−5mol)を混合して、室温で24時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機(centrifugal filter、MWCO 30k)を使用して精製した後、凍結乾燥してMan−PEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
15000−70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
15% Man−PEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
PLR(fw 15000〜70000)の代わりに、PLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して実施形態61−2と同一な方法によりMan−PEG2k−LMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
15% Man−PEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)
17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態61−2と同一な方法によりMan−PEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体を製造する。
15% Man−PEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
実施形態17−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態61−2と同一な方法によりMan−PEG2k−MMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体(DP 15mol%)を製造する。
15% Man−PEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体製造
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)を使用して、実施形態61−2と同一な方法によりMan−PEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw 15000〜70000)接合体(DP
15mol%)を製造する。
15% Man−PEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw >70000)接合体製造
実施形態21−1で用意したキトサン溶液10ml(20mg、1.24X10−4mol
of pyranose units)とPLR(fw >70000、1.4mg、0.2X10−7mol)を使用して、実施形態61−2と同一な方法によりMan−PEG2k−HMW−キトサン−ポリ−L−アルギニン(fw
>70000)接合体を製造する。
キトサン素材接合体と小さな干渉リボ核酸の複合体(complex)製造
67−1.陽イオン性高分子伝達体と小さな干渉リボ核酸の複合体製造
ネズミ(Mus musculus)のサバイビン(survivin、mouse由来、NCBI accession
number NM_001168)遺伝子のたんぱく質発現を阻害するサバイビン特異的な小さな干渉リボ核酸序列は、siRNA鎖デザインプログラムを用いて決定したし、三千里製薬(ソウル、韓国)から注文製作した。陽イオン性高分子伝達体は、キトサン(Sigma、米国)、ポリアルギニン(Sigma、米国)、比較例1、2及び上記実施形態に記載されたキトサン−ポリアルギニン、及びキトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコールを全て水溶液状態で製造して使用した。
小さな干渉リボ核酸と陽イオン性高分子の複合体を製造するために、キトサン、ポリアルギニン、比較例1、比較例2、実施形態6−2で製造されたキトサン−ポリアルギニン、または実施形態45−5で製造されたキトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコール溶液とサバイビンに対する小さな干渉リボ核酸を多様な割合で加え、混合した後、37℃で30分間放置させた後、アガロースゼルに電気泳動して複合体の形成を確認した。
蛍光標識リボ核酸物質を用いたキトサン高分子接合体の細胞内伝達効率評価
蛍光印字により標識されたリボ核酸(Flu-dsRNA、Invitrogen、米国)とキトサン、キトサンとポリエチレングリコール接合体(比較例1)、ポリアルギニン、ポリアルギニンとポリエチレングリコールの2重接合体(比較例2)、キトサンとポリアルギニンの2重接合体(実施形態2−3)、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの3重接合体(実施形態14−1)を各々混合した後、37℃で30分間放置させた後、肝がん細胞株であるHepa 1−6細胞株(American Tissue Culture Collection、米国)(図7参照)と上皮細胞株であるVK2細胞株(American Tissue Culture
Collection、米国)(図8参照)に各々処理し、24時間が経過した後、 蛍光顕微鏡下で細胞内に伝えられた蛍光標識リボ核酸の量を比較した。図7に表れるように、キトサン自体を伝達体として使用した場合やキトサンとポリエチレングリコールのみの2重接合体(比較例1)の場合、細胞内伝達効率が比較群のうち、最も低かったし、ポリアルギニンのみを処理した場合、キトサンのみを使用した場合よりは細胞内伝達効率が高かったが、キトサンとポリアルギニンが接合体を形成した場合(実施形態2−3)、細胞内伝達効率が増加した。また、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの3重接合体(実施形態14−1)は、ポリアルギニンとポリエチレングリコールのみの2重接合体(比較例2)に比較する時は、細胞内伝達効率で高い効率を表した。図7と他の細胞株を対象にして伝達効率を評価した図8の場合にも、実施形態2−2及び実施形態17−2は、キトサン、ポリアルギニン、及び比較例1、2に比べて高い伝達効率を表した。
キトサン高分子接合体の小さな干渉リボ核酸細胞内伝達効率評価:標的たんぱく質の発現低下度による細胞内伝達度評価
実施形態68において、蛍光標識リボ核酸を使用して、いろいろな比較群のうち、キトサン−ポリアルギニン、キトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコールの接合体が細胞内伝達程度が高いものと評価されたが、これに追加的に、細胞内に伝えられた小さな干渉リボ核酸物質が細胞内で所期の生物学的機能を達成するかを特定の小さな干渉リボ核酸が細胞内で標的たんぱく質の発現を低下させるか否かにより評価した。細胞内伝達対象には、サバイビンたんぱく質に特異的な小さな干渉リボ核酸を使用したし、細胞株としては肝がん細胞株であるHepa 1−6細胞を使用した。伝達体としては、キトサン、キトサンとポリエチレングリコールとの接合体(比較例1)、ポリアルギニン、ポリアルギニンとポリエチレングリコールとの接合体(比較例2)、キトサンとポリアルギニンとの2重接合体(実施形態5−3)、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの3重接合体(実施形態42−2)を各々使用した。
modified eagles medium)に牛血清が10%添加された培地を製造して培養した。Hepa
1−6細胞株に陽イオン性高分子キトサン誘導体とsiRNAの複合体を製造して加え、24時間の間培養した後に水洗し、トリゾール(TRIzolTM、インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)を使用して、細胞内で転写遺伝子(mRNA)を分離精製した後、サバイビンに対する転写遺伝子(mRNA)の発現減少率をサバイビンに対する特定プライマー及び比較遺伝子であるglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)に対するプライマーを用いて逆転写連鎖酵素重合反応(RT−PCR)を通じ定量的に確認した。
density)をイメージ分析器を使用して定量化して比較評価した。
腫瘍細胞株における細胞毒性評価
小さな干渉リボ核酸と遺伝子を含む陽イオン性高分子キトサン誘導体からなる複合体の細胞毒性に関する評価をするために、下記のような過程で実験を遂行した。Hepa 1−6肝がん細胞株とVK2上皮細胞株を対象にして陽イオン性高分子キトサン誘導体とsiRNA遺伝子の複合体を製造し、細胞毒性を評価した。
tetrazolium bromide(MTT)試薬を用いた方法を使用した。細胞を1ウェル(well)当たり1×105細胞になるように分株(seeding)し培養した後、陽イオン性高分子キトサン誘導体(各々15ug)とsiRNA(100pmole)遺伝子の複合体、またはsiRNA遺伝子自体の形態で各々添加した。複合体を処理し、24時間経過後、各々のMTT溶液を培地の10%になるように加え、4時間更に培養した後、上層液を除去し、0.04N塩酸イソプロパノール溶液を添加した後、ELISAリーダー(ELISA reader、Tecan社、米国)を用いて590nmでその吸光度を測定した。対照群には、小さな干渉リボ核酸を処理していない細胞が使われたし、細胞の生存率(cell viability)は下記のような数式で計算された。
細胞の生存率(%)=(実験群のOD/対照群のOD)×100
動物モデルにおけるキトサン高分子接合体による小さな干渉リボ核酸の血中滞留性評価
実験用マウス(ICR mice)を対象にして2重鎖の5`方向ニュクレオタイドの5番目の炭素に連結された燐酸化グループに各々バイオチン(biotin)とジナイトロフェノール
(dinitrophenol;DNP)を結合させたsiRNAと輸送体としてキトサン−ポリエチレングリコール(比較例1)、ポリアルギニン−ポリエチレングリコール(比較例2)、キトサン−ポリアルギニンの接合体(実施形態2−1)を各々使用して複合体(complex)を形成させた後、尾静脈に静脈注射し、一定時間の後に血液を取って免疫活性測定法によりsiRNAを定量した。詳細な実験過程としては、比較例1、比較例2、実施形態2−1の高分子と小さな干渉リボ核酸を20分間常温で結合させ、対照群に何にも処理せず、血液のみを取ったグループと、キトサン誘導体を使用せず、小さな干渉リボ核酸のみをインスリン注射器を用いて注射したグループを利用した。30秒、2分、5分にネズミの尾から血液を取ってヘパリンを添加した後、ストレプタビジン(streptavidin)がコーティングされたプレートに入れた後、37℃で1時間反応させた。プレートを3回水洗した後、1次抗体(monoclonal
mouse anti-DNP IgE;Sigma、Saint Louis、MO、USA)を5000対1に希釈して100μl処理し、37℃で1時間放置した。ジエチルピロカーボネート及び0.1%ツイン20を含有した燐酸緩衝液で3回水洗した後、2次抗体(goat anti-mouse IgE conjugate HRP;Serotec、Oxford、UK)を1000対1に希釈して100μl入れて、37℃で1時間放置した後、ジエチルピロカーボネート及び0.1%ツイン20を含有した燐酸緩衝液で水洗し、horseradish peroxidase酵素基質である3、3'、5、5`‐tetramethyl benzidine(Turbo TMBTM、Pierce、Rockford、USA)溶液100μlを入れて、15分間発色させた後、同一量の1N H2SO4100μlを入れて反応を中止させた。図12に示すように、キトサンとポリアルギニンとの接合体(実施形態2−1)と複合体形態で生体内に注入された小さな干渉リボ核酸は、複合体を形成しないで投与された小さな干渉リボ核酸やキトサンとポリエチレングリコールとの接合体(比較例1)、ポリアルギニンとポリエチレングリコールとの接合体(比較例2)を輸送体として使用した場合に比べて血中濃度が高い状態に持続されることが観察された。
陽イオン性高分子ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンと目的siRNAの複合体製造を用いたネズミの肝繊維化(Liver fibrosis)治療実験
ネズミ(Mus musculus)のTGF−β1(mouse由来、NCBI accession
number NM_011577)遺伝子に対する小さな干渉リボ核酸序列は、文献を通じて知られたsiRNA鎖を用いて決定したし、三千里製薬から注文製作した。siRNA鎖の序列情報は次の通りである。5`末端−AACUGUAUUCCGUCUCCUUGG−3'末端と、5`末端−AACCAAGGAGACGGAAUACAG−3'末端から構成された。実施形態37−6の方法により製造されたポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンは、10mg/mlの溶液になるように製造して使用したし、上記siRNAは、1mg/mlの溶液になるように製造して使用した。
PBS溶液で20分間複合体を形成する)して8回血管注射した。一方、対照群として本発明に従うポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン無しでsiRNA単独注射した場合も実験した。
Claims (19)
- キトサンのアミン基に共有結合されたポリアミンを含むことを特徴とするキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
- キトサンに共有結合されたポリエチレングリコールを更に含むことを特徴とする請求項1に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
- 前記ポリアミンが、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンであることを特徴とする請求項1に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
- 前記ポリエチレングリコールが、キトサンのアミン基またはハイドロキシ基に結合されることを特徴とする請求項2に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
- 前記ポリエチレングリコールが糖成分(sugar moiety)により修飾されたものであることを特徴とする請求項2に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
- 請求項1乃至5のうち、いずれか1つのキトサン基材陽イオン性高分子接合体及び核酸素材医薬を含むことを特徴とする核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物。
- 前記核酸素材医薬は、小さな干渉RNAまたはプラスミドDNA であることを特徴とする請求項6に記載の組成物。
- 前記細胞は、粘膜部位または粘膜組織を構成する細胞であることを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- 請求項1乃至5のうち、いずれか1つのキトサン基材陽イオン性高分子接合体及び核酸素材医薬を含むことを特徴とする核酸素材医薬の血中滞留増加用輸送体組成物。
- 前記核酸素材医薬は、小さな干渉RNAまたはプラスミド
DNA であることを特徴とする請求項9に記載の組成物。 - 水溶液内カルボキシル基カップリング化剤の存在下にキトサン及びポリアミンを混合及び撹拌するステップを含む請求項1乃至5のうち、いずれか1つのキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- キトサン:ポリアミンのモル比が1:1乃至1:10で結合されることを特徴とする請求項11に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- キトサンとポリアミンとの混合前に活性化されたポリエチレングリコールをキトサンと混合及び撹拌するか、またはキトサンとポリアミンとの混合及び撹拌後に生成されたキトサン−ポリアミン共有結合接合体に活性化されたポリエチレングリコールを混合及び撹拌するステップを更に含むことを特徴とする請求項11に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- キトサン:ポリエチレングリコールのモル比が1:1乃至1:50で結合されることを特徴とする請求項13に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- 前記ポリアミンは、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンであることを特徴とする請求項11に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- 前記活性化されたポリエチレングリコールは、糖成分(sugar moiety)により修飾されたものであることを特徴とする請求項13に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
- (1)カルボキシル基カップリング化剤の存在下にキトサン及びポリアミンを混合及び撹拌してキトサンのアミン基にポリアミンが共有結合されたキトサン基材陽イオン性高分子を生産するステップと、
(2)ステップ(1)で生産されたキトサン基材陽イオン性高分子接合体を核酸素材医薬と混合するステップと、
を含むことを特徴とする核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。 - 前記キトサン基材陽イオン性高分子接合体がキトサンに共有結合されたポリエチレングリコールを更に含むものであって、前記製造方法は、前記ステップ(1)でキトサンとポリアミンとの混合前に活性化されたポリエチレングリコールをキトサンと混合及び撹拌するか、またはキトサンとポリアミンの混合及び撹拌後に生成されたキトサン−ポリアミン共有結合接合体に活性化されたポリエチレングリコールを混合及び撹拌するステップを更に含んで製造されることを特徴とする請求項17に記載の核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。
- 前記核酸素材医薬は、小さな干渉RNAまたはプラスミド
DNAであることを特徴とする請求項17に記載の核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。
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