JP2015501791A - 新規な遺伝子伝達用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、（i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸またはその薬学的に許容される塩、（iv）プロタミンまたはその薬学的に許容される塩、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する、遺伝子伝達用薬学的組成物を提供する。該組成物は、安全かつ効果的に遺伝子を細胞内に伝えることができる。非毒性であり、注射可能な成分で構成されているので、該組成物は、人体にとって安全で、有利に商業化することができる。特に本発明の組成物は、インビトロだけでなく、インビボでも優れた遺伝子伝達効果を示し、優れた血清内安定性を示す。【選択図】図７
Description
本発明は、陽イオン性ポリマーとしてキトサンを用いた遺伝子伝達用ナノ粒子組成物に関する。
現在まで、細胞内に遺伝子を伝達するための研究が行われてきた。また、このような研究成果を実際に使用できる治療剤の開発につなげるための努力も続けられている。遺伝子とは、ヌクレオチド(nucleotide)およびヌクレオチドの重合体たる核酸を含む物質であって、すなわち、核酸である。遺伝子は、核酸単位体に起因する強い陰電荷を有する。遺伝子は、生体内および生体外に存在する多様な遺伝子分解酵素によって容易に分解され、細胞或いは生体内で短い半減期を有する。よって、全ての核酸基盤の遺伝子治療剤は、その治療剤の開発と治療剤伝達技術の開発が行われなければならない。
トランスフェクション(transfection)は、遺伝子薬物を真核生物の細胞内に導入するプロセスである。これは、細胞および分子生物学、遺伝子機能研究、薬物ターゲット研究などの基礎科学分野で要求される技術である。また、これは、実際に医薬品の開発のための薬物学および薬剤学などの応用科学分野においても核心技術として重要な位置を占めている。遺伝子を細胞内に伝達するための技術に関し、ウイルス伝達体を用いる方法と、非ウイルス伝達体を用いる方法について研究が行われてきた。
現在は、ウイルスベクターは一般的に使用される。ウイルス媒介遺伝子伝達は、遺伝子伝達効率が非常に高いが、免疫反応による長期投与の難しさがあり、また、未だ病原性を有するウイルスの複製の可能性を完全に排除することはできないという限界がある。対照的に、非ウイルス性伝達体は、ウイルス性伝達体の危険要因なしに遺伝子を伝達することができるという利点を持つ(The AAPS Journal, 2010; 12: 492-503)。このようなウイルス性伝達体の危険性を克服するために、陰イオン性の遺伝子に結合できる陽イオン性脂質または陽イオン性ポリマーが非ウイルス伝達方法に使用される。
米国特許公報ＵＳ７,３６１,６４０号は、少なくとも一つの陽イオン性脂質(cationic lipid)と多価陽イオン性物質(polycation)により構成される溶液に遺伝子を添加して形成された、特許請求の範囲に係る遺伝子／脂質／多価陽イオンの非共有結合性複合体を開示している。しかし、上記で使用された複合体内陽イオン性脂質は、細胞毒性を示す(Pharmaceutical Research 1994; 11: 1127-1131)。
また、陽イオン性脂質は、物質の合成と高純度を必要とするため量産に不適であり、品質管理が難しい。また、保管および流通過程の安定性が低いという欠点のため製品化に適さない。
米国特許出願公開公報ＵＳ２０１１／００３８９４１号は、オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、脂質、および複合体化剤(complex agent)から構成されたオリゴヌクレオチド−脂質ナノ粒子の製造方法であって、（１）脂質、複合体化剤、および陽イオン性ポリマーを水混和性有機溶媒で混合し、（２）オリゴヌクレオチドを水溶液に溶かした後、（３）工程（１）の混合物を工程（２）の混合物に注入し、或いは工程（１）の混合物と工程（２）の混合物を加圧の下で混ぜて最終溶液を製造し、（４）この最終溶液から有機溶媒を除去することによりオリゴヌクレオチド-脂質ナノ粒子を形成させる製造方法を開示している。このような製造方法は、品質管理が難しく、製造過程で特別な機械が要求され、量産化が困難であるため、産業的な技術の実施が難しいなどの欠点がある。
米国特許出願公開公報ＵＳ２００３／００６８２７７号は、プロタミン、スペルミン、スペルミジン或いはキトサンを含む多価陽イオン性複合体化剤と、リン脂質の複合体組成物の製造方法を開示しているが、これは肺吸入によるタンパク質伝達を目的としたものである。
遺伝子伝達複合体の製造において、キトサンは、量産に有利な天然の陽イオン性素材であり、生体適合性に優れている。キトサンは、遺伝子伝達に使用される非ウイルス性伝達体の候補として注目されている。
キトサンは、生体内に投入された後、リゾチームによってアミノ糖に分解される物質である。キトサンは、現在ラットにおけるＬＤ５０が１６ｇ／ｋｇであるとして知られており、安全なポリマー物質である(Trends in Food Science & Technology, 2007; 18: 117-131)。
キトサンは、遺伝子とのイオン結合によって遺伝子複合体を形成することができ、遺伝子を細胞内に伝達することが可能な非ウイルス性伝達体として有力な候補であるが、生理学的ｐＨ（ｐＨ７〜７．４）で陽イオン性電荷が弱くなるため、遺伝子との結合力に劣るという問題がある。結果として、生理学的ｐＨで、キトサンは遺伝子との複合体を維持せずに解離し、遺伝子を細胞内に伝達する伝達力が著しく低くなるおそれがあるという限界がある。
Ｔｈｅｅｒａｓａｋ Ｒｏｊａｎａｒａｔａらは、生理的ｐＨ条件で不溶性を示すキトサンを溶解させるために、酸性物質として過剰量のチアミンピロリン酸を用いてキトサン−チアミンピロリン酸を製造し、そのキトサン−チアミンピロリン酸遺伝子伝達体を提示する(Pharmaceutical Research 2008; 25: 2807-2814)。
Ｔｈｅｅｒａｓａｋ Ｒｏｊａｎａｒａｔａらの文献に開示されたキトサンとチアミンピロリン酸からなるナノ粒子は、インビトロ(in vitro)では良好な遺伝子伝達力を示すが、インビボ(in vivo)ではそうではない。インビボでは、インビトロとは異なり、多様な血清タンパク質および細胞滲出物が存在する。したがって、キトサンナノ粒子が生体内に投与されるとき、インビボ環境の血清タンパク質などと凝集し、結果として沈殿現象が起こって遺伝子伝達力を失う。このような理由により、従来のキトサン複合体は生体内で低い遺伝子伝達力を示し、遺伝子伝達体として製品化に成功していないと継続的に報告されている(Expert Opinion on Drug Delivery, 2011; 8: 343-357)。
［開示］
本発明は、生体内安定性および遺伝子伝達効率に優れる遺伝子伝達用組成物およびその製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、試験管内だけでなく、生体内における安定性を持ち、遺伝子伝達効率に優れるうえ、人体に無害であって、実際に医薬品としての商業化が可能な遺伝子伝達用組成物を提供するために、組成物を鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミン、および中性または陰イオン性リン脂質の組み合わせからなるナノ粒子を含有する組成物が、試験管内だけでなく生体内においても安定したナノ粒子構造を維持し、それにより優れた遺伝子伝達効果を示した。
［発明の要約］
本発明は、（i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸、（iv）プロタミン、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する遺伝子伝達用薬学的組成物、およびその製造方法を提供する。
本発明は、（i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸、（iv）プロタミン、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する遺伝子伝達用薬学的組成物、およびその製造方法を提供する。
前述したように、キトサンナノ粒子が遺伝子伝達のための製品として商用化されるためには、遺伝子結合力だけでなく、血液内の安定性が同時に確保されなければならない。いずれか一方でも確保されなければ人体への投与が不可能である。本発明のナノ粒子は、従来のキトサンナノ粒子の欠点である、生理学的ｐＨで遺伝子結合力が減少するという問題を解決すると同時に、複合体が血清内でタンパク質および細胞滲出物と凝集することを防止する。したがって、本発明のナノ粒子は、優れた血清内粒子安定性を示す。このような素晴らしい本発明のナノ粒子の効果は、従来から知られている数多くのキトサンを用いた遺伝子伝達に関する研究においても解明されたことがなかった。
そこで、本発明は、キトサンが優れた天然素材であるにも拘らず、遺伝子伝達体として商用化できない問題点を克服し、高効率の遺伝子伝達力と共に優れた安定性を有する新規な遺伝子伝達用組成物を提供する。
［構成］
本発明は、（i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸、（iv）プロタミン、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する遺伝子伝達用薬学的組成物を提供する。また、本発明は、前述した遺伝子伝達用薬学的組成物の製造方法を提供する。
本発明は、（i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸、（iv）プロタミン、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する遺伝子伝達用薬学的組成物を提供する。また、本発明は、前述した遺伝子伝達用薬学的組成物の製造方法を提供する。
本発明で使用される用語「遺伝子」は、ヌクレオチド(nucleotide)およびヌクレオチドの重合体たる核酸を含む遺伝物質であって、すなわち、核酸である。これは、細胞内に導入されたときに、生体において所望の機能または効果を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む任意の遺伝子を意味する。このような遺伝子は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ(ribonucleic acid)、プラスミド型ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドの中から選ばれた１種以上であり得る。好ましくは、前記遺伝子はプラスミド型ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選ばれた１種以上である。前記遺伝子は遺伝子薬物であり得る。ここで、遺伝子薬物は１種以上の疾病治療または予防に有用な遺伝子を意味する。
本発明で使用されるキトサン(chitosan)は、（１→４）２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカンの構造を持つ、天然に存在する陽イオン性多糖類であり人体に対し非常に安全である。キトサンは、甲殻類などから得られるキチン(chitin)を脱アセチル化して遊離アミン基を生成させたポリマーとして製造される。ここで、キトサンは、１〜５００ｋＤａの分子量および５０％以上の遊離アミン基を有することができ、好ましくは１５０〜４００ｋＤａの分子量および８０％以上の遊離アミン基を有するが、本発明はこれに限定されるものではない。
キトサンの可溶化の観点から、水溶性キトサン、不溶性キトサン、およびキトサン誘導体も本発明のキトサンの範疇に含まれるが、好ましくは水溶性キトサンが選択できる。本発明の水溶性キトサンは、キトサンＨＣｌ、キトサン酢酸塩、キトサングルタミン酸塩およびキトサン乳酸塩の中から選ばれた１種以上であり得る。水溶性キトサンは、分子構造内のアミン基が塩酸または酢酸、グルタミン酸、乳酸などの酸性物質と塩を形成しているため、水に溶解可能である。水溶性キトサンは、注射剤製造過程で除菌および異物を除去することによって精製することができるが、不溶性キトサンは、水または有機溶媒に溶けていないとき除菌または異物除去が難しい。従って、不溶性キトサンは、研究段階では使用可能であるが、人体対象の注射剤形医薬品としての適用が難しい。
本発明で使用されるチアミンピロリン酸(thiamine pyrophosphate)は、ビタミンＢ１を体内に投与したとき、生成される。チアミンピロリン酸は、生体内で形成されるビタミンＢ１の活性型形態であって安定な物質である。チアミンピロリン酸は陽イオンと陰イオンを共に持っているため、キトサンと遺伝子間の弱い結合を補完する機能を果たす。本発明のチアミンピロリン酸は、チアミンピロリン酸自体および薬学的に許容される塩を全て含む。
本発明で使用されるプロタミン(protamine)は、アルギニンに富む天然の陽イオン性タンパク質であって、動物の精子、特にサケを含む魚類の精子核に多く存在する。プロタミンは、遺伝子との会合または遺伝子からの解離を介してヒストンのように機能をする。通常、魚類の精子核から抽出されるプロタミンの分子量は約４，０００〜１０，０００であり、構成アミノ酸の７０％以上がアルギニンとして存在するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明のプロタミンは、プロタミン自体およびその薬学的に許容される塩を全て含む。具体的に、本発明のプロタミンの塩は、塩酸塩または硫酸塩のような酸付加塩を含んでいる。
プロタミンは、塩形成なしにも水に溶解可能であり、塩形態も水に溶解可能であるので、いずれの形態であれ本発明の遺伝子伝達用組成物に適用可能である。
本発明で使用されるリン脂質(phospholipid)は、非極性尾部としてのアルキルエステル基と極性頭部としてリン酸を構造的に含んでいる。中性リン脂質は、極性頭部が電気的に中性状態であるリン脂質を意味し、陰イオン性リン脂質は、極性頭部が陰電荷を持っているリン脂質を意味する。陽イオン性リン脂質は、遺伝子伝達力を持っているが、毒性が高いため、医薬品賦形剤として活用が難しい。本発明の中性または陰イオン性リン脂質は、非極性尾部として、炭素数４〜３０の飽和または不飽和アルキルエステル基を有し、極性頭部として、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)、ホスファチジルグリセリン(phosphatidylglycerine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)、ホスファチジン酸(phosphatidic acid)、スフィンゴミエリン(sphingomyelin)、ホスファチジルコリン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジルセリン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジン酸メトキシポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の中から選ばれるリン酸を有する。また、中性または陰イオン性リン脂質は、豆などの植物や卵などの動物に由来するものであり得る。中性または陰イオン性リン脂質に結合するアルキルエステル基は、モノ−およびジ−パルミトイル、モノ−およびジ−ミリストイル、モノ−およびジ−ラウリル、モノ−およびジ−ステアリルなどの飽和脂肪酸エステル、またはモノ−およびジ−リノレイル、モノ−およびジ−オレイル、モノ−およびジ−パルミトレイル、モノ−およびジ−ミリストレイルなどの不飽和脂肪酸エステルがあり、或いは飽和脂肪酸エステルと不飽和脂肪酸エステルの混合であり得る。
前述した構成成分を含有する本発明の遺伝子伝達用組成物は次のように製造できるが、本発明はこれに限定されない。一例として、本発明の組成物は、以下の工程により製造することができる；（１）遺伝子とプロタミンを適切な溶媒、好ましくは滅菌蒸留水または食塩水で混合して前複合体(pre-complex)を製造する工程と、（２）ここにキトサンとチアミンピロリン酸、中性または陰イオン性リン脂質を添加して最終的なナノ粒子形態が形成される工程。他の例として、本発明の組成物は、以下の工程により製造することができる;（１）遺伝子とキトサン、チアミンピロリン酸を水で混合して前複合体を製造する工程と、（２）ここにプロタミンと中性または陰イオン性リン脂質を添加して最終的なナノ粒子形態が形成される工程。ここで、使用される溶媒の量は、遺伝子１ｍｇに対して約１ｍｌまたはそれ未満である。こうして形成されるナノ粒子は、細胞内への導入の際に要求される粒子径を満足することができるように１０〜５００ｎｍのサイズを持つことができ、好ましくは１０〜３００ｎｍのサイズを持つ。ナノ粒子を形成するための、本発明の組成物内の構成成分の含量は、遺伝子１００重量部に対して、キトサン１０〜３，０００重量部、チアミンピロリン酸１〜１，０００重量部、プロタミン１０〜１，０００重量部、および中性または陰イオン性リン脂質１００〜５，０００重量部である。好ましくは、遺伝子１００重量部に対して、キトサン４０〜２，０００重量部、チアミンピロリン酸２０〜５００重量部、プロタミン１０〜７００重量部、および中性または陰イオン性リン脂質５００〜５，０００重量部である。
本発明のナノ粒子形態の遺伝子伝達用組成物は、ナノ粒子形態で形成された組成物それ自体で利用できるうえ、薬学的に許容される担体と共に剤形化されて使用できる。例えば、本発明の遺伝子伝達用組成物は、注射剤、点滴溶剤、吸入剤などの多様な形態に剤形化できる。前述した薬学的に許容される担体と剤形化に関する事項は、当該分野における通常の知識を有する者の技術水準の範囲内にある。
また、本発明の遺伝子伝達用組成物は、保管および流通過程上のナノ粒子の変質または変形を防止する目的で糖類をさらに含有することができる。糖類として、マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、およびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの中から選ばれた１種以上の糖類が選択できる。
また、本発明の遺伝子伝達用組成物は、保管および流通過程上のナノ粒子の変質または変形を防止する目的で糖類をさらに含有することができる。糖類として、マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、およびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの中から選ばれた１種以上の糖類が選択できる。
また、本発明の遺伝子伝達用組成物は、さらに、薬学的に許容される添加剤として、安定化剤または緩衝剤、保存剤、無痛化剤、等張化剤などを含有することができる。ここで、薬学的に許容される添加剤として、安定化剤は抗酸化剤、還元剤、およびキレート剤などを含む。緩衝剤はｐＨ調節のための有機または無機塩類などを含む。保存剤の例は、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール、およびベンジルアルコールを含む。無痛化剤はベンジルアルコールおよびクロロブタノールなどの局所麻酔成分を含む。等張化剤は浸透圧調節ために使用され、糖類および無機塩類成分などを含み得る。
本発明の遺伝子伝達用組成物は、また、前述した糖類などを含んで凍結乾燥した形態に剤形化できる。組成物が凍結乾燥形態として提供される場合、これらは使用前に適切な緩衝液、例えば滅菌食塩水内に再水和できる。静脈内投与用に再構成される場合、適切な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および増粘および可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物を含む溶液が含まれる。
本発明の遺伝子伝達用組成物は、ヒトなどの哺乳動物に適切な経路、例えば注射、経肺、経鼻、経口、直腸投与により適用できる。好ましくは、注射投与形態で静脈、筋肉、皮下、子宮内頚膜、脳血管などに投与する。必要に応じて特定の組織臓器および癌組織に直接投与できる。
本発明の遺伝子伝達用組成物の投与量は、投与形態、投与経路および目的、治療しようとする患者の年齢、体重および症状などの多様な因子によって変更できる。一般に、本発明の遺伝子伝達用組成物は、一日の投与量１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ範囲の活性成分量で投与することができる。このような投与量は様々な因子によって変更できる。
本発明のすべてのコンポーネントは細胞毒性がなく、注射できる安全な物質から構成されているため人体に安全であり、医薬品として商用化に有利である。
本発明の遺伝子伝達用組成物は、遺伝子を安全かつ効率的に細胞内に伝達する。構成成分が無毒かつ注射可能な物質であるため、組成物は人体への適用が容易であり、商用化に有利である。特に、本発明の遺伝子伝達用組成物は、インビトロだけでなく、インビボでも優れた遺伝子伝達効果を示し、優れた血液内安定性を持つ。
本発明のよりよい理解は、下記の実施例に基づいて説明することができるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１〜４＞Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ伝達用組成物の製造
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ４ｍｇ（ＦＭＣ ＣＬ２１４、ＦＭＣ社製）、チアミンピロリン酸２ｍｇ（Thiamine pyrophosphate、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、プロタミン０．５ｍｇ（Protamine sulfate、Ａｌｐｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）をそれぞれ滅菌蒸留水１ｍｌに溶かした溶液を製造し、これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子（バイオニア社製）は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度で製造した。リン脂質としてのＬｉｐｏｉｄ Ｓ−１００（Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００、Ｌｉｐｏｉｄ社製）および distearoyl-glycero-phosphoethanolamine-methyl polyethyleneglycol-2000(ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００)（Ｌｉｐｏｉｄ ＰＥ １８：０／１８：０−ＰＥＧ ２０００、Ｌｉｐｏｉｄ社製）はリン脂質の全量が３０ｍｇとなるようにして、エタノール１ｍｌに溶かして、表1に指定された割合に応じて溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表１の重量比となるようにＳｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合し、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡのシークエンスは、センス：５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＵＣ ＡＡＣ ＡＵＵ ＵＵＣ Ａ（ｄＴｄＴ）−３’、アンチセンス：５’−ＵＧＡ ＡＡＡ ＵＧＵ ＵＧＡ ＵＣＵ ＣＣＵ Ｕ（ｄＴｄＴ）−３’を使用した。
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ４ｍｇ（ＦＭＣ ＣＬ２１４、ＦＭＣ社製）、チアミンピロリン酸２ｍｇ（Thiamine pyrophosphate、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、プロタミン０．５ｍｇ（Protamine sulfate、Ａｌｐｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）をそれぞれ滅菌蒸留水１ｍｌに溶かした溶液を製造し、これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子（バイオニア社製）は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度で製造した。リン脂質としてのＬｉｐｏｉｄ Ｓ−１００（Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００、Ｌｉｐｏｉｄ社製）および distearoyl-glycero-phosphoethanolamine-methyl polyethyleneglycol-2000(ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００)（Ｌｉｐｏｉｄ ＰＥ １８：０／１８：０−ＰＥＧ ２０００、Ｌｉｐｏｉｄ社製）はリン脂質の全量が３０ｍｇとなるようにして、エタノール１ｍｌに溶かして、表1に指定された割合に応じて溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表１の重量比となるようにＳｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合し、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡのシークエンスは、センス：５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＵＣ ＡＡＣ ＡＵＵ ＵＵＣ Ａ（ｄＴｄＴ）−３’、アンチセンス：５’−ＵＧＡ ＡＡＡ ＵＧＵ ＵＧＡ ＵＣＵ ＣＣＵ Ｕ（ｄＴｄＴ）−３’を使用した。
下記表１において、単位は重量（μｇ）である。
１）Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００は、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phospatidylethanolamine)、ホスファチジルイノシトール(phospatidylinositol)およびリソホスファチジルコリン(lysophosphatidylcholine)から構成されており、ホスファチジルコリン(phsphatidylcholine)を９４％以上含有する。
＜実施例５〜８＞ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ伝達用組成物の製造
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ４ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン０．５ｍｇをそれぞれ滅菌蒸留水１ｍＬに溶かした溶液を製造した。これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Vascular endothelial growth factor(ＶＥＧＦ) ｓｉＲＮＡ遺伝子（バイオニア社製）は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度で製造した。リン脂質としてのＬｉｐｏｉｄ Ｓ−１００および ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００はリン脂質の全量が３０ｍｇとなるようにして、エタノール１ｍｌに溶かして、表２に指定された割合に応じて溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表２の重量比となるように、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ遺伝子水溶液と水溶性キトサンおよびチアミンピロリン酸溶液を混合して前複合体を形成させた後、プロタミンおよびリン脂質溶液を混合することにより、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡのシークエンスは、５’−ＧＧＡ ＧＵＡ ＣＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＡＵ Ｃ（ｄＴｄＴ）−３’を使用した。
下記表２において、単位は重量（μｇ）である。
＜実施例９〜１４＞Ｇａｔａｐａｒｓｅｎ伝達用組成物の製造
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ ４ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン硫酸(Alps Pharmaceutical社製)０．５ｍｇをそれぞれ滅菌蒸留水１ｍＬに溶かした溶液を製造した。これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｇａｔａｐａｒｓｅｎ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）遺伝子（バイオニア社製）は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度で製造した。Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００およびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００はリン脂質の全量が３０ｍｇとなるようにして、エタノール１ｍｌに溶かして、表３に指定された割合に応じて溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表３の重量比となるように、Ｇａｔａｐａｒｓｅｎ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合し、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、Ｇａｔａｐａｒｓｅｎのシークエンスは、３’−ｄ（Ｐ−ｔｈｉｏ）（［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＧ−ｍ５Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−ｍ５Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−ｍｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｍ５ｒＵ］−５’を使用した。
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ ４ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン硫酸(Alps Pharmaceutical社製)０．５ｍｇをそれぞれ滅菌蒸留水１ｍＬに溶かした溶液を製造した。これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｇａｔａｐａｒｓｅｎ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）遺伝子（バイオニア社製）は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度で製造した。Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００およびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００はリン脂質の全量が３０ｍｇとなるようにして、エタノール１ｍｌに溶かして、表３に指定された割合に応じて溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表３の重量比となるように、Ｇａｔａｐａｒｓｅｎ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合し、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、Ｇａｔａｐａｒｓｅｎのシークエンスは、３’−ｄ（Ｐ−ｔｈｉｏ）（［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＧ−ｍ５Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−ｍ５Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−ｍｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）］ｍ５ｒＵ−［２’−Ｏ−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｍ５ｒＵ］−５’を使用した。
下記表３において、単位は重量（μｇ）である。
＜実施例１５〜１７＞Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ伝達用組成物の凍結乾燥物の製造
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ ４ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン硫酸(Alps Pharmaceutical 社製)０．５ｍｇをそれぞれ滅菌蒸留水１ｍＬに溶かした溶液を製造した。これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度で製造した。３０ｍｇのＬｉｐｏｉｄ Ｓ−１００をエタノール１ｍＬに溶かした溶液を製造し、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表４の重量比となるように、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合することにより、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡのシークエンスは、実施例１〜４と同様のものを使用した。滅菌蒸留水で、３０％の溶液として製造した糖類の賦形剤（トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ＳＧ、林原社製）、グルコース）を下記表４の重量比のように混合した。これを−７０℃に冷凍させ、凍結乾燥させて固体状の凍結乾燥物を得た。
分子量１５０〜４００ｋＤａのキトサンＨＣｌ ４ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン硫酸(Alps Pharmaceutical 社製)０．５ｍｇをそれぞれ滅菌蒸留水１ｍＬに溶かした溶液を製造した。これらの溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子は滅菌蒸留水を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度で製造した。３０ｍｇのＬｉｐｏｉｄ Ｓ−１００をエタノール１ｍＬに溶かした溶液を製造し、０．２２μｍのフィルターで濾過した。下記表４の重量比となるように、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子水溶液とプロタミン溶液を混合して前複合体を形成させた後、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質溶液を混合することにより、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。ここで、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡのシークエンスは、実施例１〜４と同様のものを使用した。滅菌蒸留水で、３０％の溶液として製造した糖類の賦形剤（トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ＳＧ、林原社製）、グルコース）を下記表４の重量比のように混合した。これを−７０℃に冷凍させ、凍結乾燥させて固体状の凍結乾燥物を得た。
下記表４において、単位は重量（μｇ）である。
［比較例］
＜比較例１＞遺伝子、プロタミン、チアミンピロリン酸およびリン脂質で構成される組成物の製造
組成成分のうちキトサンＨＣｌを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表５のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例１＞遺伝子、プロタミン、チアミンピロリン酸およびリン脂質で構成される組成物の製造
組成成分のうちキトサンＨＣｌを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表５のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例２＞遺伝子、水溶性キトサン、プロタミンおよびリン脂質で構成される組成物の製造
組成成分のうちチアミンピロリン酸を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表６のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
組成成分のうちチアミンピロリン酸を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表６のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例３＞遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびリン脂質で構成される組成物の製造
組成成分のうちプロタミンを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表７のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
組成成分のうちプロタミンを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表７のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例４＞遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸およびプロタミンで構成される組成物の製造
組成成分のうちリン脂質を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表８のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
組成成分のうちリン脂質を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表８のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例５＞遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミンおよびリン脂質で構成される組成物の製造
腫瘍増殖抑制活性を確認するために、組成成分のうちＳｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子の代わりにＦＬ ｄｓＲＮＡ（Fluorescein-labeled dsRNA oligomer、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）遺伝子を使用した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表９のとおりである（単位：μｇ）。ここで、ＦＬ ｄｓＲＮＡのシークエンスは、５’−ＵＵＧ ＵＵＵ ＵＧＧ ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＡＡ Ａ（ｄＴｄＴ）−３’を使用した。
腫瘍増殖抑制活性を確認するために、組成成分のうちＳｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ遺伝子の代わりにＦＬ ｄｓＲＮＡ（Fluorescein-labeled dsRNA oligomer、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）遺伝子を使用した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表９のとおりである（単位：μｇ）。ここで、ＦＬ ｄｓＲＮＡのシークエンスは、５’−ＵＵＧ ＵＵＵ ＵＧＧ ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＡＡ Ａ（ｄＴｄＴ）−３’を使用した。
＜比較例６＞遺伝子、水溶性キトサンおよびチアミンピロリン酸で構成される組成物の製造
組成成分のうちプロタミンとリン脂質を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成成分の含量は下記表１０のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
組成成分のうちプロタミンとリン脂質を除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成成分の含量は下記表１０のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
＜比較例７＞遺伝子、水溶性キトサンおよびリン脂質で構成される組成物の製造
組成成分のうちチアミンピロリン酸とプロタミンを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表１１のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
組成成分のうちチアミンピロリン酸とプロタミンを除外した以外は実施例１と同様の方法で、ナノ粒子を含有する組成物を製造した。その組成は下記表１１のとおりである（単位：μｇ）。これを本発明の遺伝子伝達用組成物（実施例１）との効果対比のための対照群として使用した。
［実験例］
＜実験例１＞遺伝子伝達用組成物中のナノ粒子形成の確認
前記実施例１で製造された組成物に対してクライオ電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ１２ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｐｈｉｌｉｐｓ社製、オランダ）を用いてナノ粒子形成を観察した。実施例１で製造された組成物を薄い水膜形態でグリッド上に載置した後、−１７０℃で急速凍結させた。次いで、製造社の説明書に従ってグリッド(grid)上の急速凍結した組成物を電子顕微鏡によって観察した（図１）。
＜実験例１＞遺伝子伝達用組成物中のナノ粒子形成の確認
前記実施例１で製造された組成物に対してクライオ電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ１２ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｐｈｉｌｉｐｓ社製、オランダ）を用いてナノ粒子形成を観察した。実施例１で製造された組成物を薄い水膜形態でグリッド上に載置した後、−１７０℃で急速凍結させた。次いで、製造社の説明書に従ってグリッド(grid)上の急速凍結した組成物を電子顕微鏡によって観察した（図１）。
図１に示すように、本発明の遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミンおよびリン脂質を含む遺伝子伝達用組成物中に球状の典型的なナノ粒子が形成されたことを確認した。
＜実験例２＞遺伝子伝達用組成物中に形成されたナノ粒子の粒子径の測定
前記実施例１〜４および１１で製造された組成物中に形成されたナノ粒子について、粒度分析器および電荷分析器ＥＬＳ-Z(ectrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)（大塚、日本）を用いて直径を測定した。実施例１〜４および１１で製造された組成物の粒子径は、製造会社の説明書に従ってｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌを用いて測定された。（図２）。
前記実施例１〜４および１１で製造された組成物中に形成されたナノ粒子について、粒度分析器および電荷分析器ＥＬＳ-Z(ectrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)（大塚、日本）を用いて直径を測定した。実施例１〜４および１１で製造された組成物の粒子径は、製造会社の説明書に従ってｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌを用いて測定された。（図２）。
図２に示すように、遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミンおよびリン脂質を含む遺伝子伝達用組成物（実施例１〜４）はいずれも、２００〜３００ｎｍの均一な粒子径を有するナノ粒子を含有することを確認した。このような結果は、粒子が遺伝子伝達のための用途に適合するように細胞透過に適した小さいサイズを持つことを意味する。
＜実験例３＞遺伝子伝達用組成物内ナノ粒子の表面電荷の測定
前記実施例１、３および１１で製造された組成物に対して、ＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて表面電荷を測定した。実施例１、３および１１で製造した組成物の表面電荷は、製造会社の説明書に従ってｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌを用いて測定された（図３）。
前記実施例１、３および１１で製造された組成物に対して、ＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて表面電荷を測定した。実施例１、３および１１で製造した組成物の表面電荷は、製造会社の説明書に従ってｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌを用いて測定された（図３）。
図３に示すように、本発明の遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミンおよびリン脂質を含む遺伝子伝達用組成物中のナノ粒子は１５ｍＶ以上の陽性(cationic)の表面電荷を有することを確認した。このような結果は、本発明の組成物が、細胞に遺伝子を伝達するように細胞透過に適した陽イオン性の表面電荷を有するイオン複合体を形成することを意味する。
＜実験例４＞組成物の標的タンパク質発現抑制活性のインビトロでの確認
実験は、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＳＶＥ００）を用いて標的タンパク質発現について前記実施例１および１１と比較例１、２および７の組成物処理群と遺伝子単独処理群の抑制活性について行われた。
実験は、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＳＶＥ００）を用いて標的タンパク質発現について前記実施例１および１１と比較例１、２および７の組成物処理群と遺伝子単独処理群の抑制活性について行われた。
ヒトの前立腺癌細胞株（ＰＣ−３、ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートにウェルあたり１×１０５個ずつ播種し、１０％ＦＢＳ(fatal bovine serum)培地組成（ｐＨ７．２）で３７℃、５％ＣＯ２の条件で細胞を４８時間培養した。遺伝子薬物を投与する前に、１０％ＦＢＳが含まれた新しい培地（ｐＨ７．２）で取り替えた後、２時間安定化させた。その後、実施例１および１１の組成物、比較例１、２および７の組成物（それぞれ実施例１および１１と比較例１、２および７の処理群）、および遺伝子単独（遺伝子単独処理群）をそれぞれ前立腺癌細胞株に添加した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で細胞を４８時間培養した。この際、投与される遺伝子薬物は２μｇ／ウェルである。培養終了後、培地を除去し、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）５００μＬを添加して前立腺癌細胞株を溶解した。その後、溶解物から細胞残骸物と上層液を分離するために、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞残骸物から分離された上層液１００μＬを、製造会社の説明書に従ってｓｕｒｖｉｖｉｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを使用してsurvivinの発現量について検定した（図４）。
図４に示すように、本発明の遺伝子、水溶性キトサン、チアミンピロリン酸、プロタミンおよびリン脂質を含む遺伝子伝達用組成物（実施例１、実施例１１）は、標的タンパク質の発現を著しく抑制した。これは本発明の組成物が遺伝子伝達効能に優れることを意味する。これに対し、遺伝子単独処理群と本発明の組成からキトサンが除去された比較例１の場合、標的タンパク質の発現を全く抑制させることができないものと確認された。これはキトサンが遺伝子伝達に重要な役割を果たし、本発明の組成物からキトサンが除外される場合、遺伝子伝達機能が完全に失われることがあることを示す。
本発明の組成物からチアミンピロリン酸が除外された比較例２は、６０％の標的タンパク質発現率を示した。これは、本発明の組成からチアミンピロリン酸が除外される場合、生理学的ｐＨ条件（ｐＨ７〜７．４）で遺伝子とキトサンの結合力が弱くなって遺伝子伝達効果が本発明の組成物に比べて著しく減少することを示す。また、チアミンピロリン酸とプロタミンが除外された比較例７の場合も、６８％の標的タンパク質発現率を示し、遺伝子伝達効果が本発明の組成に比べて著しく減少することを確認することができた。
＜実験例５＞遺伝子伝達用組成物の血清における粒子の安定性評価
前記実施例１、３および１１の組成物と比較例２、３、４および６の組成物を同じ体積の血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合した。３時間後にＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて粒子径の変化を測定した。これに関連して、ｐａｒｔｉｃｅｌ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌはＥＬＳ製造会社の説明書に従って使用した（図５）。
前記実施例１、３および１１の組成物と比較例２、３、４および６の組成物を同じ体積の血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合した。３時間後にＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて粒子径の変化を測定した。これに関連して、ｐａｒｔｉｃｅｌ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌはＥＬＳ製造会社の説明書に従って使用した（図５）。
図５に示すように、本発明の組成物（実施例１、３および１１）において形成されたナノ粒子は、蒸留水中と同様に血清中においても、最初に製造されたときの２００〜３００ｎｍの粒子径をそのまま維持した。
これに対し、本発明の組成物からプロタミンが除外された比較例３の場合は、１，５００ｎｍ以上の粒子サイズが測定されるため、血清タンパク質と凝集が激しく起こって粒子安定性が維持できないものと確認された。また、本発明の組成物からリン脂質が除外された比較例４の場合も、４，０００ｎｍ以上の粒子サイズが観察されるため、血清タンパク質と凝集がさらに激しく起こって粒子安定性に劣ることが分かった。また、本発明の組成物からプロタミンとリン脂質が除外された比較例６の場合も、３，０００ｎｍ以上の粒子サイズが観察されるため、血清タンパク質と凝集が非常に激しく起こって粒子安定性に劣ることを確認することができた。これらのデータは、本発明の組成物のすべての構成成分が、血清タンパク質と凝集する現象を防止するだけでなく、キトサン−ベースのナノ粒子の安定性を確保するために必要なことを示している。
本発明の組成物からチアミンピロリン酸が除外された比較例２の場合も、１，０００ｎｍ以上の粒子サイズが観察されるため、血液における粒子安定性が維持できないことを確認した。これは、本発明の組成物が遺伝子、水溶性キトサン、プロタミンおよびリン脂質で組成されても、遺伝子とキトサン間の結合力を維持させるチアミンピロリン酸が除外されると、血清において複合体が容易に解離し、結果として粒子安定性が維持できないためである。
結論として、キトサンが遺伝子伝達体として生体内に適用されるためには血清内における粒子安定性が確保されなければならないが、これを達成するためには本発明の組成物のすべての構成要素が必要である。
＜実験例６＞遺伝子伝達用組成物の凍結乾燥および粒子径の測定
前記実施例１５、１６および１７で製造された遺伝子伝達用組成物の凍結乾燥物を遺伝子として１００μｇ／ｍＬとなるように精製水で再分散させた後、ＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて粒子径を観察した。これに関連して、ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌは、製造会社の説明書に従って使用した（図６）。
前記実施例１５、１６および１７で製造された遺伝子伝達用組成物の凍結乾燥物を遺伝子として１００μｇ／ｍＬとなるように精製水で再分散させた後、ＥＬＳ(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)粒度分析器および電荷分析器（ＥＬＳ−Ｚ、大塚、日本）を用いて粒子径を観察した。これに関連して、ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌは、製造会社の説明書に従って使用した（図６）。
図６に示すように、実施例１５〜１７の組成物中のナノ粒子は凍結乾燥後に再水和しても約３００ｎｍの粒子径を維持することができることを確認した。すなわち、ナノ粒子は、分散と保存をしている間、糖類の存在下、凍結乾燥形態で安全に保存することができる。また、生体への適用の際に再分散させて使用することができることを意味する。
＜実験例７＞組成物のインビボ腫瘍増殖抑制活性の評価
前記実施例１の組成物および比較例５および７の組成物の生体内における遺伝子薬物伝達能を評価するために、前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルを使用した。これに関連して、ＲＰＭＩ培養液５０μＬに再分散した前立腺癌細胞株２×１０６個をマトリゲル（Matrigel、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬと混合し、これを５週齢の免疫不全雄マウスの皮下に注射した。腫瘍サイズを１００ｍｍ３まで増大させた後、３グループのマウスに対して（グループ当たり８匹）、それぞれ遺伝子量が１００μｇ／ｍＬとなるように実施例１の組成物、比較例５および７の組成物をマウスの尾静脈に注射した。対照群には組成物を投与しなかった（無処理群）。１回に投与される各遺伝子薬物は４０μｇであり、２週間で合計６回投与した。腫瘍サイズはカリパースを用いて腫瘍中部の幅（短い方）と長さ（長い方）を測定した後、下記の公式で算出した(Biomaterials, 2011; 32: 9786-9795)。
前記実施例１の組成物および比較例５および７の組成物の生体内における遺伝子薬物伝達能を評価するために、前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルを使用した。これに関連して、ＲＰＭＩ培養液５０μＬに再分散した前立腺癌細胞株２×１０６個をマトリゲル（Matrigel、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬと混合し、これを５週齢の免疫不全雄マウスの皮下に注射した。腫瘍サイズを１００ｍｍ３まで増大させた後、３グループのマウスに対して（グループ当たり８匹）、それぞれ遺伝子量が１００μｇ／ｍＬとなるように実施例１の組成物、比較例５および７の組成物をマウスの尾静脈に注射した。対照群には組成物を投与しなかった（無処理群）。１回に投与される各遺伝子薬物は４０μｇであり、２週間で合計６回投与した。腫瘍サイズはカリパースを用いて腫瘍中部の幅（短い方）と長さ（長い方）を測定した後、下記の公式で算出した(Biomaterials, 2011; 32: 9786-9795)。
腫瘍サイズ（ｍｍ２）＝（幅２×長さ）／２
その結果を図７に示した。図７に示すように、実施例１の遺伝子伝達用組成物はインビボでの腫瘍増殖を著しく抑制することが確認された。特に、前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルに実施例１の組成物が静脈注射された群は未処理群と比較して１４日目と１８日目にそれぞれ約７７％と約７４％の優れた腫瘍増殖抑制効果を示した。これに対し、未処理群と腫瘍増殖抑制活性のない遺伝子を含む比較例５の場合は、腫瘍の増殖が抑制されずに増殖し続けることを確認した。そして、本発明の組成物からチアミンピロリン酸とプロタミンが除外された比較例７の場合は、投与初日から１週までは実施例１の組成物と類似した水準の効果を示したが、１８日目には未処理群と比べて約３２％以下の腫瘍増殖抑制効果を示し、本発明の組成物に比べて遺伝子伝達効能が著しく低いことが確認された。
また、この結果は、本発明の遺伝子伝達用組成物がインビボ静脈注射によっても優れた遺伝子伝達効果を示すことを証明する。
既存のキトサン素材は、低い遺伝子結合力と血液内の不安定性のため、遺伝子伝達用医薬品として実際に生体に適用できないという問題点を抱えていた。そこで、本発明者は、前述した問題点を全て克服可能な遺伝子伝達用組成物に着目した。本実験を通じて本発明の組成物がインビボ全身投与において優れた遺伝子伝達効果を示すことを証明した。
Claims (10)
- （i）遺伝子、（ii）水溶性キトサン、（iii）チアミンピロリン酸またはその薬学的に許容される塩、（iv）プロタミンまたはその薬学的に許容される塩、および（v）中性または陰イオン性リン脂質を含有する、遺伝子伝達用薬学的組成物。
- 水溶性キトサンが、キトサンＨＣｌ、キトサン酢酸塩、キトサングルタミン酸塩、またはキトサン乳酸塩の中から選ばれる、請求項１に記載の薬学的組成物。
- プロタミンの薬学的に許容される塩が、プロタミン塩酸塩またはプロタミン硫酸塩である、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 中性または陰イオン性リン脂質が、非極性尾部として、炭素数４〜３０の飽和または不飽和アルキルエステル基を有し、極性頭部として、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)、ホスファチジルグリセリン(phosphatidylglycerine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)、ホスファチジン酸(phosphatidic acid)、スフィンゴミエリン(sphingomyelin)、ホスファチジルコリン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジルセリン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール、ホスファチジン酸メトキシポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の中から選ばれる極性頭部を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 遺伝子が、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、プラスミド型ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、触媒的ＲＮＡまたはヌクレオチドの中から選ばれる、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 遺伝子伝達のための粒子径１０〜５００ｎｍのナノ粒子を含有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 遺伝子１００重量部に対して、キトサン１０〜３，０００重量部、チアミンピロリン酸１〜１，０００重量部、プロタミン１０〜１，０００重量部、および中性または陰イオン性リン脂質１００〜５，０００重量部を含有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
- マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、およびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの中から選ばれる１種以上の糖類をさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 安定化剤、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、または等張化剤の中から選ばれる１種以上をさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 注射剤、点滴溶剤、吸入剤、または凍結乾燥形態に剤形化された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
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