JP2023522103A - 生物学的に活性な乾燥粉末組成物ならびにその製造および使用の方法 - Google Patents

生物学的に活性な乾燥粉末組成物ならびにその製造および使用の方法 Download PDF

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Abstract

生物学的に活性なポリヌクレオチド分子を含む乾燥粉末組成物、およびかかる乾燥粉末の製造のための方法を提供する。いくつかの局面において、本態様の乾燥粉末は、ナノ粒子と複合体形成された、発現可能なまたは調節性の（例えば、siRNA）ポリヌクレオチド分子を含む。また、生存能力のあるウイルスおよび細菌を含む乾燥粉末も提供する。

Description

本願は、2020年4月20日に出願された米国仮特許出願第63/012,792号に基づく優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
1. 発明の分野
本開示は概して、薬学的製剤、生物製剤およびその製造の分野に関する。より具体的には、ウイルス、細菌およびポリヌクレオチド分子を含む乾燥粉末組成物、ならびに例えば薄膜凍結による粉末組成物の調製方法に関する。
2. 関連技術の説明
最近の医薬品開発は、新たな処置用部分、例えば、生物学的に活性なポリヌクレオチドを含む組成物に対して利用されている。例えば、mRNAが、治療用タンパク質および抗原の送達について試験されている。同様に、CRISPR技術が遺伝子置換のために探索されており、低分子干渉RNA（siRNA）が、望ましくない遺伝子活性のノックダウンのために開発されている。さらに、全細胞（例えば、細菌細胞）組成物およびウイルス組成物は、新たな治療用部分およびワクチン接種用部分の潜在的可能性を提供する。しかしながら、このような場合ではすべて、組成物が安定化されていることおよび生物学的活性を維持していることを可能にする新たな製剤および製剤化方法が必要とされる。同様に、治療薬を必要とする患者へのその効率的な送達様式をもたらす新たな製剤および方法論が必要とされる。
いくつかの態様において、本開示により、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子および少なくとも第1の賦形剤を含む乾燥粉末組成物であって、前記乾燥粉末が超急速凍結プロセス（URF）によって作製されており、該ポリヌクレオチド分子が、実質的な生物学的活性を保持している、および/または該URFプロセスによって安定化されている、乾燥粉末組成物を提供する。いくつかの局面において、ポリヌクレオチド分子は、URFプロセス前の溶解状態の等量の該ポリヌクレオチド分子と比べて少なくとも約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％または50％の生物学的活性を保持している。いくつかの局面において、溶液中の同じポリヌクレオチド分子と比べて粉末中のポリヌクレオチド分子は少なくとも50％多く未分解であるように、ポリヌクレオチド分子が安定化されている。いくつかの局面において、URFプロセスは薄膜凍結（TFF）を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチド分子は二本鎖分子である。いくつかの局面において、ポリヌクレオチド分子は一本鎖分子または二本鎖分子と一本鎖分子の混合物である。いくつかの局面において、ポリヌクレオチド分子はsiRNA、shRNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、プラスミドDNAおよび/またはDNAオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約100μm、50μm、30μm、20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。さらなる局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約1～50μmまたは3～50μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は約1.0～g/cm3;2.0 1.4～1.9g/cm3;1.4～1.9g/cm3;または1.5～1.7g/cm3の密度を有する。いくつかの局面において、該粉末は約2.0～8.5m2/g;2.0～7.5m2/g;3.0～7.5m2/g;2.0～5.0m2/g;2.5～4.5m2/g;または3.0～4.0m2/gの表面積を有する。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。さらなる局面において、糖は二糖類である。いくつかの局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤は重量で該粉末の少なくとも約50％を構成する。さらなる局面において、第1の賦形剤は重量で該粉末の約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％から約99.5％までを構成する。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。
いくつかの局面において、乾燥粉末組成物はpH緩衝剤をさらに含む。いくつかの局面において、pH緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、酢酸ナトリウムまたはMg2＋保存（SM）バッファーを含む。いくつかの局面において、該乾燥粉末薬学的組成物は20％、15％または10％未満の水分含有量を有する。いくつかの局面において、該乾燥粉末薬学的組成物は約0.5％～10％、1％～10％、1.5％～8％または2％～5％の水分含有量を有する。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は少なくとも第2、第3および/または第4の賦形剤をさらに含む。さらなる局面において、第2、第3および/または第4の賦形剤はアミノ酸またはタンパク質を含む。なおさらなる局面において、第2、第3および/または第4の賦形剤はロイシンまたはグリシンを含む。いくつかの局面において、第2、第3および/または第4の賦形剤は高分子を含む。さらなる局面において、高分子はPEG、HPMC、PLGA、PVA、デキストラン、アルギン酸ナトリウムまたはPVPを含む。いくつかの局面において、該第2、第3および/または第4のものは糖または糖アルコールを含む。さらなる局面において、該粉末は2種、3種またはそれより多くの異なる糖または糖アルコールの混合物を含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物はタンパク質または界面活性剤をさらに含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物はカゼイン、ラクトフェリン、プルロニックF68、チロキサポールまたは重炭酸アンモニウムをさらに含む。いくつかの局面において、該賦形剤は該粉末の約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％から約99.9％まで、例えば該粉末の約20％w/w～約99.9％w/wを構成する。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はウイルスまたはウイルス様粒子（VLP）を含む。さらなる局面において、ウイルスはノンエンベロープウイルスである。なおさらなる局面において、ウイルスはアデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを含む。いくつかの局面において、ウイルスはバクテリオファージを含む。さらなる局面において、バクテリオファージは黄色ブドウ球菌（S.aureus）および/または緑膿菌（P.aeruginosa）に感染する。いくつかの局面において、バクテリオファージ粒子はファージPEV2またはT7ファージを含む。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約3～15μm、4～12μmまたは5～10μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、少なくとも約20％、25％、30％、35％、40％、45％～約50％、例えば約20％の粒子が1～5μmのサイズを有する。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。さらなる局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末はアミノ酸をさらに含む。さらなる局面において、アミノ酸はロイシンまたはグリシンを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物はスクロースとロイシンを含む。さらなる局面において、スクロースとロイシンは約50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10～約95:5、例えば約50:50～約95:5、約60:40、約70:30～約90:10;または約75:25～約80:20（スクロース:ロイシン）の比で存在する。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子は、脂質ナノ粒子（LNP）内に封入されたポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はmRNAを含む。さらなる局面において、mRNAは抗原をコードしている。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物はアジュバントをさらに含む。いくつかの局面において、アジュバントはアルミニウム塩、例えばミョウバンを含む。いくつかの局面において、LNPはイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む。いくつかの局面において、LNPはカチオン性脂質;DOPE;DPPC;DSPC;DMPE-PEG;DMG-PEG;DSPE-PEG;Dlin-MC3-DMA;リン脂質;PEG-脂質および/またはコレステロールを含む。いくつかの局面において、LNPは約25nm～1000nm、50nm～1000nm;50nm～600nmまたは80nm～200nmの平均粒子径を有する。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。さらなる局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％から約99％までのラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール、例えば約10％～約99％または約50％～約99.5％のラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は約80％～約99％または約90％～約99％のスクロースを含む。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はsiRNAを含む。いくつかの局面において、LNPはイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む。いくつかの局面において、LNPはレシチン、コレステロールおよび/またはポリエチレングリコール（2000）-ヒドラゾン-ステアリン酸を含む。いくつかの局面において、LNPはカチオン性脂質を含む。いくつかの局面において、LNPは約50nm、約75nm、約100nm、約125nm、約150nm、約175nm、約200nm、約225nm、約250nm、約275nm、約300nm、約325nm、約350nm、約375nm、約400nm、約425nm、約450nm、約475nmまたは約500nm、例えば約50nm～約500nm、約75nm～約250nm、約80nm～約200nm、約90nm～約175nmまたは約100nm～約150nmの平均粒子径を有する。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。さらなる局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約3～15μm、4～12μmまたは5～10μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は約2μm～7μm、3μm～7μm、3μm～5μmまたは3.5μm～4.5μmの空気動力学的質量中央径を有する。いくつかの局面において、該粉末は、約25％～60％、30％～50％または35％～40％の細粒分（FPF）値を有する。いくつかの局面において、該粉末は、次世代インパクター（NGI）のステージ4～7において少なくとも10％、15％または20％の沈着を有する。さらなる局面において、該粉末は、次世代インパクター（NGI）のステージ4～7において約10％～25％;15％～25％;10％～20％または15％～22％の沈着を有する。いくつかの局面において、siRNAはヌクレオチド30個未満の長さである。いくつかの局面において、siRNAはヒト遺伝子または病原体遺伝子を標的とする。いくつかの局面において、siRNAはTNF-αを標的とする。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子は、キトサンと複合体形成されたポリヌクレオチド分子を含む。さらなる局面において、キトサンはPEG化されている。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子は、キトサンと複合体形成されたDNAを含む。いくつかの局面において、溶液中の同じポリヌクレオチド分子と比べて該粉末中の該分子は少なくとも50％多く未分解であるように、該DNA分子が安定化されている。いくつかの局面において、該DNAはプラスミドDNAを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は、キトサンと複合体形成された、CRISPR/Cas9エレメントをコードしているDNAを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は、キトサンと複合体形成された、ガイドRNAをコードしているDNAを含む。いくつかの局面において、キトサン複合体は約100nm～2000nmの平均サイズを有する。いくつかの局面において、キトサン複合体は約100nm～1000nm;150nm～800nmまたは200nm～800nmの平均サイズを有する。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％から約90％までの糖または糖アルコール、例えば約5％～90％の糖または糖アルコールを含む。いくつかの局面において、乾燥粉末組成物は約10％～約90％、約10％～約70％または約10％～約50％のトレハロース、スクロース、および/またはマンニトールを含む。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約100μm、50μm、30μm、20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は乾式Rodos法による測定で約1～50μmまたは3～50μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、該粉末は約1.0～g/cm3～約2.0g/cm3、約1.4～約1.9g/cm3、約1.4～1.9g/cm3または約1.5～約1.7g/cm3の密度を有する。いくつかの局面において、該粉末は約2.0～8.5m2/g;2.0～7.5m2/g;3.0～7.5m2/g;2.0～5.0m2/g;2.5～4.5m2/g;または3.0～4.0m2/gの表面積を有する。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はゲノム材料を含む。いくつかの局面において、ゲノム材料は細菌、真核生物または古細菌のゲノム材料を含む。いくつかの局面において、該粉末はインタクトな細胞を含む。いくつかの局面において、該粉末は生細胞を含む。いくつかの局面において、該粉末はインタクトな細菌、真核生物または古細菌細胞を含む。いくつかの局面において、該粉末はインタクトな細菌細胞を含む。いくつかの局面において、該粉末は細菌生細胞を含む。いくつかの局面において、細菌細胞はグラム陰性菌を含む。いくつかの局面において、細菌細胞はグラム陽性菌を含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤はスクロースを含む。いくつかの局面において、該粉末は吸入による投与のために製剤化される。いくつかの局面において、該粉末は吸入器を用いた使用のために製剤化される。
他の態様において、本開示により、本開示の乾燥粉末組成物を含む吸入器を提供する。いくつかの局面において、該吸入器は固定用量配合剤吸入器、単回用量乾燥粉末吸入器、反復用量乾燥粉末吸入器、反復単位用量乾燥粉末吸入器、定量吸入器または加圧噴霧式定量吸入器である。いくつかの局面において、該吸入器はカプセルベースの吸入器である。いくつかの局面において、該吸入器は低抵抗吸入器である。いくつかの局面において、該吸入器は高抵抗吸入器である。いくつかの局面において、該吸入器は約10 L/分～約150 L/分の流速で使用される。いくつかの局面において、流速は約20 L/分～約100 L/分である。
また他の態様において、本開示により:（a）封入された生物学的に活性なポリヌクレオチド分子および第1の賦形剤を溶媒中で混合し、前駆体溶液を形成させる段階;（b）該前駆体溶液を表面上に、該溶媒の凍結を引き起こすのに適した温度で沈着させる段階;ならびに（c）該溶媒を除去して粉末薬学的組成物を得る段階を含む、乾燥粉末薬学的組成物の作製方法を提供する。いくつかの局面において、該方法は:（d）粒子径を縮小および/または粒子径を均一化するために該粉末薬学的組成物を脱凝集させる段階をさらに含む。
いくつかの局面において、前駆体溶液は水を含む。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は20％、15％または10％未満の水分含有量を有する。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は約0.5％～10％、1％～10％、1.5％～8％または2％～5％の水分含有量を有する。いくつかの局面において、工程（b）の温度は約-40℃～-180℃である。いくつかの局面において、工程（b）の温度は約-50℃～-150℃、-50℃～-125℃、-55℃～-100℃または-65℃～-75℃である。いくつかの局面において、前駆体溶液はpH緩衝剤を含む。いくつかの局面において、前駆体溶液は約6.0～8.0、6.5～8.0または7.0～7.8のpHを有する。いくつかの局面において、前駆体溶液は約0.1％～30％、0.1％～20％、0.5％～10％または0.5％～5％の第1の賦形剤を含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。いくつかの局面において、前駆体溶液は約0.1％～5％;0.1％～3％または0.5％～5％のトレハロース、スクロースおよび/またはマンニトールを含む。いくつかの局面において、前駆体溶液は約0.1％～50％の固形分を有する。いくつかの局面において、前駆体溶液は約0.1％～20％の固形分を有する。いくつかの局面において、前駆体溶液は少なくとも約0.25％の固形分を有する。いくつかの局面において、前駆体溶液は0.25％～10％;0.5％～10％;1％～5％または2％～5％の固形分を有する。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はウイルスまたはバクテリオファージを含む。いくつかの局面において、ウイルスはノンエンベロープウイルスである。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はバクテリオファージを含む。いくつかの局面において、前駆体溶液は約1×106～1×1012;1×106～1×1011;1×107～1×1010;または5×108～1×109プラーク形成単位/ml（PFU/mL）またはフォーカス形成単位/ml（ffu/ml）を含む。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は、前駆体溶液中での力価と比べて力価が（プラーク形成単位/ml（PFU/mL）またはフォーカス形成単位/ml（ffu/ml）で）3.5log未満減少したウイルスまたはバクテリオファージ粒子を有する。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は、前駆体溶液中での力価と比べて力価が（PFU/mLまたはFFU/mlで）3.0、2.5、2.0、1.5、1.0または0.5log未満減少したウイルスまたはバクテリオファージ粒子を有する。いくつかの局面において、工程（b）の温度は約-40℃～-150℃、-50℃～-125℃、-55℃～-100℃または-65℃～-75℃である。いくつかの局面において、工程（b）の温度は約-40℃～-100℃、-40℃～-90℃、-40℃～-80℃または-50℃～-75℃である。いくつかの局面において、前駆体溶液はロイシンを含む。いくつかの局面において、前駆体溶液はロイシンとスクロースを含む。いくつかの局面において、前駆体溶液はスクロースとロイシンを約50:50～95:5;60:40;70:30～90:10;または75:25～80:20（スクロース:ロイシン）の比で含む。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、粉末薬学的組成物は乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する。いくつかの局面において、少なくとも20％の粒子は1～5μmのサイズを有する。いくつかの局面において、少なくとも25％、30％、35％、40％、45％または50％の粒子は1～5μmのサイズを有する。いくつかの局面において、前駆体溶液はpH緩衝剤を含む。いくつかの局面において、pH緩衝剤はPBSまたはSMバッファーである。いくつかの局面において、pH緩衝剤はSMバッファーであり、前駆体溶液はトレハロースとロイシンを含む。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子は、脂質ナノ粒子（LNP）内に封入されたポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はmRNAを含む。いくつかの局面において、LNPはイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む。いくつかの局面において、LNPは約25nm～1000nm、50nm～1000nm;50nm～600nmまたは80nm～200nmの平均粒子径を有する。いくつかの局面において、前駆体溶液は約10％～30％または15％～25％のラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はsiRNAを含む。いくつかの局面において、siRNAはヌクレオチド30個未満の長さである。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子は、キトサンと複合体形成されたポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの局面において、キトサンはPEG化されている。いくつかの局面において、LNPは、キトサンと複合体形成されたDNA分子を含む。
いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はゲノム材料を含む。いくつかの局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチド分子はインタクトな細胞内に含まれている。いくつかの局面において、インタクトな細胞は生細胞を含む。いくつかの局面において、インタクトな細胞はインタクトな細菌細胞、真核生物細胞または古細菌細胞を含む。いくつかの局面において、インタクトな細胞はインタクトな細菌細胞を含む。いくつかの局面において、インタクトな細胞は細菌生細胞を含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤は糖または糖アルコールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤はラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む。いくつかの局面において、第1の賦形剤はスクロースを含む。いくつかの局面において、材料を沈着させる表面は回転式である。いくつかの局面において、溶媒は減圧下で除去される。いくつかの局面において、溶媒は凍結乾燥によって除去される。いくつかの局面において、凍結乾燥は約-20℃～約-100℃の凍結乾燥温度で行なわれる。いくつかの局面において、凍結乾燥温度は約-40℃である。いくつかの局面において、減圧は400mTor;350mTorr;300mTorrまたは250mTorr未満である。いくつかの局面において、減圧は約100mTorrである。いくつかの局面において、該方法はGMPの方法である。
他の態様において、本開示により、本開示の方法に従って調製される薬学的組成物を提供する。
さらに他の態様において、本開示により、本開示の組成物または本開示の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、肺疾患、肺損傷または肺感染症の処置方法を提供する。いくつかの局面において、肺疾患は間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、嚢胞性線維症（CF）、肺線維症または原発性線毛運動不全症（PCD）である。いくつかの局面において、肺感染症は細菌性肺感染症である。いくつかの局面において、バクテリオファージを含む（the comprises）。いくつかの局面において、該組成物はLNPを含む。いくつかの局面において、該組成物はsiRNAを含む。
また他の態様において、本開示により、対象の免疫応答の賦活化方法を提供し、該方法は、本開示の組成物または本開示の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階を含み、該生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が抗原をコードしている。いくつかの局面において、該組成物はLNPとmRNAを含む。
他の態様において、本開示により、本開示の組成物または本開示の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、対象の疾患を処置する方法を提供する。いくつかの局面において、疾患は遺伝性疾患である。いくつかの局面において、疾患は肺疾患である。いくつかの局面において、疾患は感染症である。
さらに他の態様において、本開示により:（i）本開示の組成物または本開示の方法によって作製される組成物を薬学的に許容されるビヒクル中で再構成する段階;および（ii）再構成された該組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、対象の疾患を処置する方法を提供する。
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例に本発明の特定の態様を示しているが、当業者にはこの詳細な説明から本発明の趣旨および範囲の範囲内で種々の変更および修正が明らかとなるため、実例として示しているにすぎないことは理解されよう。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の局面の実例をさらに示すために含めている。本開示は、この図面の1つまたは複数を本明細書に提示した具体的な態様の詳細な説明と併せて参照することによってよりよく理解され得よう。
異なる賦形剤マトリックスでの薄膜凍結乾燥後のT7の力価低下量を示す。注:Y軸の2つのセグメントは同じスケールにしなかった。 異なるTFFDファージ製剤の幾何学的粒子径分布を示す。 固形分が異なる種々の賦形剤マトリックスでの薄膜凍結乾燥後のT7の力価低下量を示す。注:Y軸の2つのセグメントは同じスケールにしなかった。 異なる固形分を有するTFFD処理ファージ製剤の幾何学的粒子径分布を示す。 異なる温度での薄膜凍結乾燥後のT7の力価低下量を示す。 異なる温度で処理されたTFFDファージ製剤の幾何学的粒子径分布を示す。 異なる初期ファージ濃度を有する製剤中の薄膜凍結乾燥後のT7の力価低下量を示す。注:5E10、5E09、5E08、5E07および5E06は、それぞれ5×1010 PFU/mL、5×109 PFU/mL、5×108 PFU/mL、5×107 PFU/mLおよび5×106 PFU/mLの代わりの表示である。 異なるファージ濃度で処理されたTFFDファージ製剤の幾何学的粒子径分布を示す。注:5E10、5E09、5E08、5E07および5E06は、それぞれ5×1010 PFU/mL、5×109 PFU/mL、5×108 PFU/mL、5×107 PFU/mLおよび5×106 PFU/mLの代わりの表示である。 異なるバッファー系における薄膜凍結乾燥後のT7の力価低下量を示す。 バッファーなし、PBSバッファーまたはSMバッファーで処理されたTFFDファージ製剤の幾何学的粒子径分布を示す。 薄膜凍結乾燥の各工程でのT7ファージの力価低下量を示す。 TFFDファージ粉末のX線回折パターンを示す。 走査型電子顕微鏡法による粉末の形態構造の画像を示す。 透過型イレクション（election）顕微鏡法によるファージの形態構造の画像を示す。 TFFDファージ粉末の熱重量分析曲線を示す。 TGAによって測定されたTFFDファージ粉末中の水分含有量を示す。 GFP発現パーセント（左軸）および蛍光強度（右軸）によって測定した、異なるN/P比のLNP製剤のHEK-293細胞内への細胞内取込みを示す。 図18A～18DはLNP製剤の特性評価を示す。（図18A）サイズ、（図18B）ゼータ電位、（図18C）封入効率、および（図18D）pKa。脂質ナノ粒子の安定性を、1日目目および調製および4℃で保存から14日後のサイズおよびゼータ電位を測定することによって評価した。（平均±SD、n＝3）。 図19A～19Cは、（a）サイズ、（b）ゼータ電位、および（c）封入効率の観点からの霧化前および霧化後のLNP製剤の安定性を示す。霧化された製剤のサイズ（＊＊＊p＝0.0004）および封入効率（＊＊＊＊p＜0.0001）は霧化前の製剤と有意に異なっていた。 図20Aおよび20Bは、LNP調製後16日間にわたるHEK-293細胞内への細胞内取込みの効率を示す。（図20A）GFP発現パーセント、および（図20B）蛍光強度。 図21A～21Dは、HEK-293細胞およびNuLi-1細胞内への霧化前および霧化後のLNP製剤のGFP発現パーセント（図21Aおよび21C）ならびに蛍光強度（図21Bおよび21D）の観点からのインビトロ細胞内取込みを示す。 図22Aおよび22Bは、ルシフェラーゼmRNAを有するF2、F8、F11、F17製剤の有効性および生体内分布を示す。（図22A）15μgの全mRNAの気管内送達後6時間目の全光束で測定時の霧化前および霧化後の4つのリード製剤の肺内における有効性（図22B）IVISイメージングによって測定した肺、心臓、肝臓および腎臓内におけるルシフェラーゼ発現の代表的な画像。 図23A～23Dは、粒子径とPEG-脂質との間の相関を示す。（図23A）霧化前の粒子径に対するPEG-脂質のモル比の効果。（図23B）霧化前の粒子径に対するPEG-脂質の型の効果。（図23C）霧化後の粒子径に対するPEG-脂質のモル比の効果。（図23D）霧化後の粒子径に対するPEG-脂質の型の効果。 図24A～24Dは、ゼータ電位とPEG-脂質との間の相関を示す。（図24A）霧化前のゼータ電位に対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。（図24B）霧化前のゼータ電位に対するPEG-脂質の型の有意な効果。（図24C）霧化後のゼータ電位に対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。（図24D）霧化後のゼータ電位に対するPEG-脂質の型の有意な効果。 図25A～25Dは、封入効率とコレステロールのモル比およびリン脂質の型との相関を示す。（図25A）霧化前における封入効率とコレステロールのモル比との間の有意な相関（p＜0.05）。（図25B）霧化前において封入効率に対するリン脂質の型の有意な効果なし（p＞0.05）。（図25C）霧化後において封入効率とコレステロールのモル比間に有意な相関なし。（図25D）霧化後における封入効率に対するリン脂質の型の有意な効果。＊＊p＜0.01。 図26A～26Fは、細胞内取込み（GFP発現パーセントおよび蛍光強度）とPEG-脂質のモル比またはリン脂質の型との間の相関分析を示す。（図26A）霧化前におけるGFP発現パーセントに対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。（図26B）霧化前におけるGFP発現パーセントに対するリン脂質の型の有意な効果。（図26C）霧化前におけるGFP発現パーセントに対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。（図26D）霧化後におけるGFP発現パーセントに対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。（図26E）霧化後においてGFP発現パーセントに対するリン脂質の型の有意な効果なし。（図26F）霧化後における蛍光強度に対するPEG-脂質のモル比の有意な効果。 図27A～27Hは、GFP発現パーセントおよび蛍光強度の観点からの細胞内取込みのオルトゴナル傾向を示し、ここで、点線で非有意性を表し、実線で有意性を表した。（図27A～27D）:霧化前における細胞内取込みと製剤特性との間の相関。（図27E～27H）: 霧化後における細胞内取込みと製剤特性との間の相関。 図28A～28CはLNP製剤の特性評価を示す。（図28A）サイズ、（図28B）ゼータ電位および（図28C）封入効率。 図29A～29Dは、HEK-293細胞およびNuLi-1細胞内へのLNP製剤のGFP発現パーセント（図29Aおよび29B）および蛍光強度（図29Cおよび29D）の観点からのインビトロ細胞内取込みを示す。 図30A～30Fは、42通りの乾燥粉末製剤の肉眼での外観を示す。（図30A）マンニトールを含む製剤、（図30B）マンニトールとロイシンを含む製剤、（図30C）スクロースを含む製剤、（図30D）スクロースとロイシンを含む製剤、（図30E）トレハロースを含む製剤、（図30F）トレハロースとロイシンを含む製剤。 図31A～31Fは、再構成した乾燥粉末製剤のサイズ、PDIおよびゼータ電位を示す。（図31A）ロイシンとともに/なしでマンニトールを含む再構成TFF製剤のサイズおよびPDI、（図31B）ロイシンとともに/なしでスクロースを含む再構成製剤のサイズおよびPDI、（図31C）ロイシンとともに/なしでトレハロースを含む再構成TFF製剤のサイズおよびPDI、（図31D）ロイシンとともに/なしでマンニトールを含む再構成TFF製剤のゼータ電位、（図31E）ロイシンとともに/なしでスクロースを含む再構成TFF製剤のゼータ電位、（図31E）ロイシンとともに/なしでトレハロースを含む再構成TFF製剤のゼータ電位。 再構成製剤のトランスフェクション効率を示す。 ナノ複合体の構造を示す。 6つの精製乾燥粉末製剤の走査型電子顕微鏡法による画像を示す。 図35A～35Cは、6つの精製乾燥粉末製剤ならびにそのままのマンニトール、スクロースおよびトレハロースのX線回折パターンを示す。 精製TFF製剤の空気動力学的粒子径分布プロフィールを示す。 LNPのZ-平均サイズを示す。 HEK-293細胞におけるLNP-mRNA乾燥粉末製剤のトランスフェクション効率を示す。 図39Aおよび39Bは、SLNの乾燥粉末の代表的なSEM顕微鏡写真を示す。図39A:噴霧乾燥SLN;図39B:TFFDによって調製されたSLN。上の画像は3Kの倍率（スケールバー:10μm）で、下の画像は10.5Kの倍率（スケールバー:2μm）で取得した。 賦形剤としてマンニトールを有する噴霧乾燥SLN対薄膜凍結乾燥（TFFD）SLNの沈着パターンを示す。データは平均±SDである（n＝3）。 図41Aおよび41Bは、薄膜凍結乾燥siRNA-SLNの代表的なSEM画像を示す（図41A）。（図41B）次世代インパクターの異なるステージにおけるsiRNA-SLNの沈着パターン。データは平均±SDである（n＝3）。 TFFDに供される前（すなわち、懸濁液）および後（すなわち、粉末）におけるTNF-α-siRNA-SLNによるJ774A.1細胞からのTNF-α放出の下方調節を示す。リポフェクタミンと複合体形成したTNF-α-siRNAを対照として使用した。データ 稀な 平均±SD（n＝4）。a、bおよびdと表示した群はcと表示した群と異なっている（p＜0.05）。 疑似粘液中へのsiRNA-SLNの透過を示す。データは平均±SDである（n＝3）。 TNF-α放出の下方調節におけるTFN-α siRNAの機能の評価を示す。 TopFluor-コレステロール標識固形脂質ナノ粒子乾燥粉末の次世代インパクター測定（Next Gen impaction）データを示す。NGIの各ステージで回収されナノ粒子の割合をプロットする。MOCはマイクロオリフィス捕集部であり、IPは導入ポートである。エラーバーは2つの試行の標準偏差である。 図46Aおよび46Bは、酸感受性TNF-α siRNA-SLNの物理的特性評価を示す。（図46A）SLNのTEM画像。（図46B）酸感受性TNF-α siRNA-SLNからの蛍光標識siRNAのインビトロ放出。 SLN乾燥粉末の物理的外観を示す。 噴霧乾燥SLN粉末（左）および凍結乾燥SLN粉末（右）のSEM画像を示す。 噴霧乾燥SLNおよび凍結乾燥SLNのNGI沈着プロフィールを示す。NGIデータを3つの独立した試行で収集し、90％を超える回収率を有した。 凍結乾燥（左）および噴霧乾燥（右）を用いた乾燥前および乾燥後でのSLNサイズ分布の比較を示す。 棚式凍結乾燥細菌粉末および薄膜凍結乾燥細菌粉末の形態構造の比較を示す。左:凍結保護剤としてスクロース（10％w/v）を有する棚式凍結乾燥細菌粉末;右:凍結保護剤としてマンニトール（250μLの5％w/w）を有するTFFD細菌粉末。 Plastiape（登録商標）RS00高抵抗DPIを60 L/分の流速で用いてNGIに適用した後の種々のステージでの薄膜凍結乾燥プラスミド粉末の沈着プロフィールを示す。データは平均±S.D.である（n＝3）。 図53A～53Cは、薄膜凍結乾燥pCMV-β粉末（製剤P3）の代表的なSEM画像を示す。 TFF製剤化の前後におけるプラスミドのゲル電気泳動解析を示す。レーン1:pCMV-ベータ、製剤7;レーン2:pCMV-ベータ、製剤7、Hind IIIとEcoR1;レーン3:pCMV-ベータ、製剤7、EcoR I;レーン4:GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder（ThermoFisher）;レーン5:pCMV-ベータ、TFFD後の製剤7;レーン6:pCMV-ベータ、TFFD後の製剤7、Hind IIIとEcoR I;レーン7:pCMV-ベータ、TFFD後の製剤7、EcoR I;レーン8:pCMV-ベータ、Hind IIIとEcoR I;およびレーン9:pCMV-ベータ、EcoR I。pCMV-ベータ、レーン1および5には500ngのプラスミド、他は約420ngを負荷。消化時間:2時間、EcoR I:7.3 kbpおよびHind IIIとEcoR I:4.6＋2.7。 薄膜凍結乾燥（製剤5）および再構成に供した後のmRNA-LNPの代表的なTEM画像を示す。
例示的態様の説明
I. 本発明の態様
本明細書において、URFプロセスによって作製され得る、生物学的に活性なポリヌクレオチドの乾燥粉末製剤を提供する。URFの使用により、該組成物は、該ポリヌクレオチドが過度な分解から保護され、諸成分が製剤化後も実質的な生物学的活性を保持しているように安定化され得ることが示された。いくつかの場合において、製剤には少なくとも第1の賦形剤、例えば糖が含められ、なおさらなる安定化がもたらされる。したがって、諸態様の乾燥粉末は多種多様なポリヌクレオチド含有組成物を構成し得る。さらに、諸態様の粉末は、治療用薬剤を例えば肺に直接投与するために使用され得ることが実証された。したがって、本発明の諸局面において、使用されているこれまでの組成物および方法と比べて有意な利点を示す新たな薬学的製剤、製剤化方法および投与モダリティを提供する。
いくつかの場合において、本態様の粉末はウイルス、例えばバクテリオファージを含む。本明細書に詳述されているようにして粉末へと処理されたウイルスは実質的なウイルス力価を保持できることが示された。したがって、本明細書において提供される方法および組成物は、ウイルスを、例えば保存および/または輸送のために安定化させるために使用され得る。同様に、ウイルス含有粉末は、それを必要とする患者に直接投与（投与前に再構成）してもよい。例えば、ウイルスは弱毒化ウイルスまたはウイルス様粒子、および免疫応答を賦活化するためのワクチンとして使用される組成物であり得る。さらなる局面において、ウイルスはバクテリオファージであり得、細菌感染、例えば肺感染症を処置するために使用され得る。なおさらなる局面において、ウイルスは疾患の処置における使用のための遺伝子治療用ベクターであり得る。
いくつかの場合において、諸態様の粉末は一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAを含み得る。かかるポリヌクレオチドは、ナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子内に封入され得るか、あるいはナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子との複合体の状態であり得る。例えば、いくつかの場合において、ポリヌクレオチド、例えばmRNAまたはsiRNAは、LNPとの複合体の状態で提供される。例えば、mRNA-LNP複合体は、治療活性なタンパク質（例えば、遺伝子置換療法用）または抗原（例えば、ワクチン接種用）をコードし得る。好ましい局面において、諸態様の乾燥粉末状態で提供されるLNPは複数の脂質型、例えばカチオン性脂質、リン脂質および/またはPEG化脂質で形成されている。さらなる局面において、RNA-LNP粉末は少なくとも第1の賦形剤、例えば糖またはアミノ酸をさらに含む。いくつかの局面において、乾燥粉末は対象に、疾患を処置するため、または免疫応答を賦活化するために直接投与され得る（例えば、肺内分散により）。
なおさらなる局面において、siRNAを含むLNPを有する粉末が提供される。かかる組成物により、例えば肺への該粉末の分散などによる送達にも理想的な、安定化された製剤がもたらされることが実証された。したがって、siRNAを用いて広範な疾患を処置することができよう。例えば、過剰に活性な、または異常な免疫応答の場合、siRNAにより、炎症性免疫応答を刺激する遺伝子、例えばTNF-アルファを標的とすることができよう。さらなる局面では、siRNAは、疾患の処置のためにがん遺伝子または病原体の遺伝子を標的とすることができよう。
さらなる局面において、キトサンナノ粒子との複合体の状態の粉末で提供されるポリヌクレオチド、例えばDNA。いくつかの局面において、キトサンナノ粒子はPEG化によってさらに修飾される。かかるDNA分子は例えばプラスミドまたはDNA発現ベクターであり得る。いくつかの場合において、DNAはCRISPRシステムをコードし、対象において標的遺伝子置換をもたらし得る。したがって、システムは、例えば遺伝性疾患、例えば嚢胞性線維症の処置に理想的である。いくつかの局面において、疾患を処置するために、DNA複合体含有粉末は対象に直接投与され得る（例えば、肺内分散により）。
なおさらなる局面において、諸態様の乾燥粉末組成物はインタクトな細胞を含む。例えば、該粉末は真核生物細胞または細菌細胞を含み得る。特に、生細胞がURF粉末に製剤化され得ること、およびかかる粉末は高レベルの細胞生存性を保持していることが本明細書において実証された。したがって、乾燥粉末は、インタクトな細胞または生細胞、例えば細菌細胞の、安定化、保存および/または輸送のために使用され得る。かかる組成物は広範な潜在的用途を有する。例えば、弱毒化または不活化された細菌は、免疫応答を賦活化するために製剤化して使用することができよう。あるいはまた、有益な細菌系を、プロバイオティクス組成物を得るために製剤化することができよう。さらに、細胞含有乾燥粉末は、細胞を患者に経口製剤および/またはエアロゾル製剤として直接送達するための手段としての役割を果たし得る。いくつかの局面において、細菌含有乾燥粉末は農業、例えば安定化された生物防除剤における適用を有し得る。したがって、いくつかの場合において、細菌含有粉末はエアロゾル化され、例えば作物の畑に適用され得る。
II. 超急速凍結（URF）製剤
特定の局面において、本開示により、URFプロセス、例えば薄膜凍結プロセスを用いて調製され得る薬学的組成物を提供する。かかる方法は、米国特許出願公開第2010/0221343号およびWatts,et al.,2013に記載されており、これらはともに参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの場合において、該方法では、最大10,000 K/秒の、例えば少なくとも1,000、2,000、5,000または8,000 K/秒の超急速凍結速度が使用される。いくつかの態様において、このような方法は、薬学的組成物の成分を溶媒中に溶解させて前駆体溶液を形成することを伴う。溶媒は水または有機溶媒のいずれかであり得る。しかしながら、好ましい局面では、前駆体溶液は、少なくとも第1の賦形剤および生物学的に活性なポリヌクレオチド分子を含む水溶液である。いくつかの態様において、前駆体溶液は10％w/v未満の治療用薬剤および賦形剤を含み得る。前駆体溶液は0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％もしくは10％w/v未満またはその間の導出可能な任意の範囲を含み得る。
この前駆体溶液は、該前駆体溶液の凍結を引き起こす温度である表面上に沈着され得る。いくつかの態様において、この温度は大気圧で該溶液の氷点より下であり得る。他の態様では、該表面に減圧が適用され、大気圧での氷点より下の温度で該溶液の凍結が引き起こされ得る。また、該表面は、回転式または移動式コンベア型システム上での移動式であり、したがって前駆体溶液が該表面上に一様に分布することが可能であってもよい。あるいはまた、前駆体溶液は表面に、一様な表面が得られるような様式で適用され得る。
前駆体溶液が表面に適用された後、溶媒が除去されて薬学的組成物が得られ得る。任意の適切な溶媒除去方法、例えば減圧下でのエバポレーションまたは昇温または凍結乾燥が適用され得る。いくつかの態様において、凍結乾燥は減圧および/または降下温度を含み得る。かかる降下温度は25℃～約-200℃、20℃～約-175℃、約20℃～約-150℃、0℃～約-125℃、-20℃～約-100℃、-75℃～約-175℃または-100℃～約-160℃であり得る。該温度は約-20℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃～約-200℃またはその間の導出可能な任意の範囲である。さらに、溶媒は、500mTorr、450mTorr、400mTorr、375mTorr、350mTorr、325mTorr、300mTorr、275mTorr、250mTorr、225mTorr、200mTorr、175mTorr、150mTorr、125mTorr、100mTorr、75mTorr、50mTorrまたは25mTorr未満の減圧で除去され得る。
このような方法を用いて調製される組成物は、該組成物がデバイスを経由して処理される場合、容易に剪断を受けてより小さい粒子になるというような脆い性質を示し得る。このような組成物は、高い表面積を有するとともに、改善された組成物流動性を示す。かかる流動性は、例えばCarr指数または他の同様の測定値によって測定され得る。特に、Carrの指数は、粉末のかさ密度を該粉末のタップ密度と比較することによって測定され得る。かかる化合物は好都合なCarr指数を示し得、該組成物が、粉末組成物をさらに処理するための二次デバイスを経由して処理される場合、より小さい粒子が得られるようにより良好に剪断を受ける粒子をもたらし得る。
III. 諸態様の組成物の諸成分
A. 生物学的に活性なポリヌクレオチドを含む組成物
諸態様の方法および組成物は生物学的に活性なポリヌクレオチドに関する。いくつかの場合において、このようなものは一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAを含み得る。かかるポリヌクレオチドはナノ粒子内に封入され得るか、あるいはナノ粒子との複合体の状態であり得る。例えば、いくつかの場合において、ポリヌクレオチド、例えばmRNAまたはsiRNAはLNPとの複合体の状態で提供される。さらなる局面において、キトサンナノ粒子との複合体の状態で提供されるポリヌクレオチド、例えばDNA。なおさらなる局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチドは、ウイルス、例えばバクテリオファージまたはウイルス様粒子内に提供される。またさらなる局面において、生物学的に活性なポリヌクレオチドは、インタクトな細胞、例えば細菌の生細胞内に提供される。
いくつかの局面において、諸態様の核酸分子は治療用ポリペプチドをコードしている。例えば、治療用タンパク質は、特定の疾患状態において非機能性であるか、あるいは破壊されているタンパク質、例えば酵素（例えば、嚢胞性線維症におけるCFTR）であり得る。
さらなる局面において、諸態様のポリヌクレオチドは、抗原、例えば病原体由来の抗原またはがん細胞関連抗原をコードしている。例えば、がん関連抗原はCD19、CD20、ROR1、CD22、がん胎児性抗原、アルファフェトプロティン、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、メラノーマ関連抗原、変異型p53、変異型ras、HER2/Neu、葉酸結合タンパク質、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、メソテリン、GD3、HERV-K、IL-11Rアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、CSPG4、ERBB2、EGFRvIIIまたはVEGFR2であり得る。いくつかの特定の局面において、抗原はGP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2またはERBB3である。
本開示において有用な抗原としては、限定するわけではないが、アレナウイルス科のもの（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、アルテリウイルス科のもの（例えば、ウマ動脈炎ウイルス）、アストロウイルス科のもの（ヒトアストロウイルス1）、ビルナウイルス科のもの（例えば、伝染性膵臓壊死症ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、ブニヤウイルス科のもの（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス群）、カリシウイルス科のもの（例えば、カリシウイルス）、コロナウイルス科のもの（例えば、ヒトコロナウイルス299EおよびOC43）、デルタウイルス（例えば、肝炎デルタウイルス）、フィロウイルス科のもの（例えば、マールブルグウイルス、エボラウイルス）、フラビウイルス科のもの（例えば、黄熱ウイルス群、C型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科のもの（例えば、B型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科のもの（例えば、エプスタインバールウイルス、シンプレックスウイルス属、バリセロウイルス属、サイトメガロウイルス属、ロゼオロウイルス属、リンフォクリプトウイルス属、ラディノウイルス属）、オルトミクソウイルス科のもの（例えば、インフルエンザウイルスA型、B型およびC型）、パルボウイルス科のもの（例えば、パピローマウイルス属）、パラミクソウイルス科のもの（例えば、パラミクソウイルス属、例えばヒトパラインフルエンザウイルス1型、モルビリウイルス属、例えば麻疹ウイルス、ルブラウイルス属、例えばムンプスウイルス、ニューモウイルス（Pneumovirus）、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス）、ピコルナウイルス科のもの（例えば、ライノウイルス属、例えばヒトライノウイルス1A、ヘパトウイルス属 例えばヒトA型肝炎ウイルス、ヒトポリオウイルス、カルジオウイルス属、例えば脳心筋炎ウイルス、アフトウイルス属、例えば口蹄疫ウイルスO、コクサッキーウイルス）、ポキシイリダエ（Poxyiridae）（例えば、オルソポックスウイルス属、例えば天然痘ウイルスもしくはサル痘ウイルス）、レオウイルス科のもの（例えば、ロタウイルス属、例えばA～F群ロタウイルス）、レトロウイルス科のもの（霊長類レンチウイルス群、例えばヒト免疫不全ウイルス1型および2型）、ラブドウイルス科のもの（例えば、狂犬病ウイルス）、トガウイルス科のもの（例えば、ルビウイルス属、例えば風疹ウイルス）、ヒトT細胞白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、HIV-1およびHIV-2、西ナイル、H1N1、SARS、1918年のインフルエンザ、ダニ媒介性脳炎群ウイルス（Absettarov、Hanzalova、Hypr）、ロシア春夏脳炎ウイルス、コンゴ・クリミア出血熱ウイルス、フニンウイルス、Kumlingeウイルス、マールブルグウイルス、マチュポウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ラッサウイルス、オムスク出血熱ウイルス、FIV、SIV、単純ヘルペス1型および2型、帯状疱疹、ヒトパルボウイルス（B19）、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス（すべての型および血清型）、コルティウイルス属、レオウイルス-すべての型ならびに/またはルビウイルス属（風疹）などのウイルスに由来するものが挙げられ得る。
本開示において有用な抗原としては、細菌、例えば限定するわけではないが、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、ナイセリア・ゴノロサエ（Neisseria gonorrhosae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎球菌、ヘモフィリス・インフルエンザ（Hemophilis influenzae）B型、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病の病原スピロヘータ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、ランゲルトリパノソーマ（Trypanosoma rangeli）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ローデシアトリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiensei）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japanicum）、牛バベシア（Babesia bovis）、エルメリア・テネラ（Elmeria tenella）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、タイレリア・パルバ（Theileria parva）、胞状条虫（Taenia hydatigena）、ヒツジ条虫（Taenia ovis）、無鉤条虫（Taenia saginata）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、メソセストイド・コルティ（Mesocestoides corti）、マイコプラズマ・アルスリティディス（Mycoplasma arthritidis）、M.ハイオライニス（hyorhinis）、M.オラーレ（orale）、M.アルギニニ（arginini）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Acholeplasma laidlawii）、M.サリバリウム（salivarium）、M.ニューモニエ（pneumoniae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティジス（Blastomyces dermatitidis）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、バルトネラ属、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ菌-すべての血清型、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）-クロストリジウム血清型由来の任意のもの、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、クレブシエラ属-すべての血清型、レジオネラ菌-すべての血清型、リステリア菌、マイコバクテリウム属-すべての血清型、マイコプラズマ属-ヒトおよび動物の血清型、リケッチア属-すべての血清型、赤痢菌-すべての血清型、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、連鎖球菌-S.ニューモニエ（S.pneumoniae）、S.ピオゲネス（S.pyogenes）、コレラ菌（Vibrio cholera）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）ならびに/またはペスト菌（Yersinia pestis）に由来するものが挙げられ得る。
本開示において有用な抗原としては、寄生虫、例えば限定するわけではないが、アンシロストーマ属のヒトの鉤虫、リーシュマニア属-すべての系統、ミクロスポリジウム属、ネカトール属のヒトの鉤虫、オンコセルカ糸状虫、プラスモジウム属-すべてのヒト系統およびサル種、トキソプラズマ-すべての系統、トリパノソーマ属-すべての血清型ならびに/またはバンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）の糸状虫に由来するものが挙げられ得る。
（1）DNA分子
特定の局面において、諸態様による送達のための核酸はDNA分子である。例えば、DNA分子は発現ベクターであり得る。用語「発現ベクター」は、転写されることが可能なRNAをコードしている核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を示す。いくつかの場合において、RNA分子は次いでタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合において、このような配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの産生時には翻訳されない。発現ベクターにはさまざまな「制御配列」が含められ得、該制御配列は、特定の宿主細胞内での機能的に連結されたコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列を示す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターには他の機能を果たす核酸配列が含められ得る。いくつかの局面において、DNA発現ベクターには治療用ポリペプチドまたは抗原ポリペプチドがコードされ得る。さらなる局面において、DNA発現ベクターにはCRISPRシステムのエレメントがコードされる。
CRISPRシステム
クラスター化された等間隔にスペーサーが入った短い回文型のリピート配列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（CRISPR）およびCRISPR関連（Cas）タンパク質は、態様に応じて標的遺伝子の破壊および/または置換のために使用され得る。一般に、「CRISPRシステム」は集合的に、CRISPR関連（「Cas」）遺伝子の発現に関与しているか、または該遺伝子の活性を導く転写物および他のエレメント、例えば、Cas遺伝子をコードしている配列、tracr（トランス活性化型CRISPR）配列（例えば、tracrRNAもしくは活性な部分tracrRNA）、tracrメイト配列（内在性CRISPRシステムの状況では「ダイレクトリピート」およびtracrRNAにプロセッシングされた部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性CRISPRシステムの状況では「スペーサー」とも称する）ならびに/またはCRISPR座位に由来する他の配列および転写物を示す。
CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、DNAに配列特異的に結合する非コードRNA分子（ガイド）RNAと、ヌクレアーゼ機能性（例えば、2つのヌクレアーゼドメイン）を有するCasタンパク質（例えば、Cas9）を含み得る。CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントは、例えば、内在性CRISPRシステムを含む特定の生物体、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスに由来するI型、II型またはIII型のCRISPRシステムに由来し得る。
いくつかの局面において、CasヌクレアーゼとgRNA（例えば、標的配列に特異的なcrRNAと固定されたtracrRNAとの融合体）は細胞内に導入される。一般に、gRNAの5'末端の標的部位は、Casヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に、相補的な塩基対合を用いて標的指向させる。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列、例えば典型的にはNGGまたはNAGのすぐ5'側のその場所に基づいて選択され得る。この点において、gRNAは、ガイドRNAの最初の20、19、18、17、16、15、14、14、12、11または10個のヌクレオチドを標的DNA配列に対応するように修飾することによって、所望の配列を標的とする。一般に、CRISPRシステムは、標的配列の部位でのCRISPR複合体の形成を促進させるエレメントを特徴とする。典型的には、「標的配列」は一般的に、ガイド配列がそれに対し相補性を有するように設計される配列を示し、このとき、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションによってCRISPR複合体の形成が促進される。完全な相補性は必ずしも必要とされないが、ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進させるのに充分な相補性があるものとする。
CRISPRシステムは標的部位に二本鎖切断（DSB）を誘導し得、その後、本明細書において論考するような破壊を起こす。他の態様では、「ニッカーゼ」とみなされるCas9バリアントを使用し、標的部位の一本鎖にニックを入れる。例えば特異性を改善するためにニッカーゼペアが使用され得、各ニッカーゼは、ニックが同時に導入されたら5'オーバーハングが導入されるような配列を標的とする異なるgRNAのペアによって導かれる。他の態様では、触媒的に不活性なCas9を異種エフェクタードメイン、例えば転写抑制因子または転写活性化因子と融合させ、遺伝子発現に影響を及ぼす。
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の核内または細胞質内、例えば細胞の細胞小器官内に位置し得る。一般的に、標的配列を含む標的座位内での組換えに使用され得る配列または鋳型は、「編集用（editing）鋳型」または「編集用ポリヌクレオチド」または「編集用配列」と称される。いくつかの局面において、外来性鋳型ポリヌクレオチドは編集用鋳型と称され得る。いくつかの局面において、組換えは相同組換えである。
典型的には、内在性CRISPRシステムの状況では、CRISPR複合体（標的配列とハイブリダイズされ、1つまたは複数のCasタンパク質と複合体形成されたガイド配列を含む）の形成により、標的配列内または標的配列付近（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50塩基対以内もしくはそれより多くの塩基対以内）の一方または両方の鎖の切断がもたらされる。また、野生型tracr配列の全部または一部（例えば、野生型tracr配列の約20、26、32、45、48、54、63、67、85個もしくはそれより多くのヌクレオチドあるいは約20個超、26、32、45、48、54、63、67、85個もしくはそれより多くのヌクレオチド）を含み得るか、あるいは野生型tracr配列の全部または一部（例えば、野生型tracr配列の約20、26、32、45、48、54、63、67、85個もしくはそれより多くのヌクレオチドあるいは約20個超、26、32、45、48、54、63、67、85個もしくはそれより多くのヌクレオチド）からなり得るtracr配列も、例えば、ガイド配列に機能的に連結されたtracr配列の少なくとも一部分に沿ったtracrメイト配列の全部または一部とのハイブリダイゼーションによってCRISPR複合体の一部を形成し得る。tracr配列は、ハイブリダイズしてCRISPR複合体の形成に関与するのに充分なtracrメイト配列との相補性、例えば、最適にアラインメントしたときtracrメイト配列の長さに沿って少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％の配列相補性を有する。
CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントの発現を駆動する1つまたは複数のベクターが細胞内に、CRISPRシステムの該エレメントの発現によって1つまたは複数の標的部位でCRISPR複合体の形成が導かれるように導入され得る。また、諸成分は細胞にタンパク質および/またはRNAとして送達され得る。例えば、Cas酵素、tracrメイト配列に連結させたガイド配列、およびtracr配列を各々、別々のベクターの別々の調節エレメントに機能的に連結させることができよう。あるいはまた、同じか、または異なる調節エレメントから発現されるエレメントのうちの2つまたはそれより多くを単一のベクター内で合わせてもよく、1つまたは複数の追加のベクターによって、第1のベクター内に含まれていないCRISPRシステムの任意の成分がもたらされ得る。ベクターは、1つまたは複数の挿入部位、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称する）を含み得る。いくつかの態様において、1つまたは複数の挿入部位は、1つまたは複数のベクターの1つまたは複数の配列エレメントの上流および/または下流に位置する。複数種の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を用いてCRISPR活性を細胞内の対応する複数種の異なる標的配列に標的指向させ得る。
ベクターは、CRISPR酵素、例えばCasタンパク質をコードしている酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含み得る。Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても公知）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、そのホモログまたはその修飾型が挙げられる。このような酵素は公知であり;例えば、S.ピオゲネスのCas9タンパク質のアミノ酸配列はSwissProtデータベースのアクセッション番号Q99ZW2で知得され得る。
CRISPR酵素はCas9（例えば、S.ピオゲネスまたはS.ニューモニエ由来）であり得る。CRISPR酵素は、例えば標的配列内および/または標的配列の相補配列内の標的配列の場所の一方または両方の鎖の切断を導き得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断能力が欠如するように変異しているCRISPR酵素をコードし得る。例えば、S.ピオゲネス由来のCas9のRuvC I触媒ドメイン内のアスパラギン酸のアラニン置換（D10A）により、Cas9は、両鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、1つまたは複数のガイド配列、例えばDNA標的のそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とする2つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組合せによって両鎖にニックが入り、NHEJまたはHDRの誘導に使用されることが可能になる。
いくつかの態様において、CRISPR酵素をコードしている酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核生物細胞内での発現のためにコドン最適化される。真核生物細胞は、特定の生物体、例えば哺乳動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類のもの、あるいは特定の生物体、例えば哺乳動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類に由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、関心対象の宿主細胞内での発現の向上のために核酸配列を修飾するプロセスであって、天然状態の配列の少なくとも1つのコドンを、天然状態のアミノ酸配列を維持したまま、該宿主細胞の遺伝子内でより高頻度に、または最も高頻度に使用されているコドンで置き換えることにより核酸配列を修飾するプロセスを示す。さまざまな種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物体間でのコドン使用頻度の違い）は、多くの場合、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関し、さらにこれは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーRNA（tRNA）分子の利用可能性に依存していると考えられる。細胞内で選択されるtRNAの優位性は一般的に、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、所与の生物体内での最適な遺伝子発現のためにコドン最適化に基づいて個別調整され得る。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズするのに充分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有し、CRISPR複合体の標的配列との配列特異的結合を導く任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の度合いは、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％またはそれ以上あるいは約50％超、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％またはそれ以上である。
最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムの使用により求められ得、その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づいたアルゴリズム（例えば、Burrows Wheeler Aligner）、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies,ELAND（Illumina,San Diego,Calif.）、SOAP（soap.genomics.org.cnにおいて入手可能）およびMaq（maq.sourceforge.netにおいて入手可能）が挙げられる。
CRISPR酵素は、1つまたは複数の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であってもよい。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および任意で、任意の2つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。CRISPR酵素と融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定するわけではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性および核酸結合活性のうちの1つまたは複数を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（His）タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン（HA）タグ、Mycタグ、VSV-Gタグおよびチオレドキシン（Trx）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定するわけではないが、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）ベータガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、HcRed、DsRed、シアン色蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）および自家蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（BFP）が挙げられる。CRISPR酵素は、DNA分子に結合するか、または他の細胞性分子に結合するタンパク質またはタンパク質断片、例えば限定するわけではないが、マルトース結合タンパク質（MBP）、S-タグ、Lex A DNA結合ドメイン（DBD）融合体、GAL4A DNA結合ドメイン融合体および単純ヘルペスウイルス（HSV）BP16タンパク質融合体をコードしている遺伝子配列と融合され得る。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられるUS 20110059502に記載されている。
（2）阻害性核酸分子
低分子阻害性核酸（siNA、例えばsiRNA）は当技術分野において周知である。例えば、siRNAおよび二本鎖RNAは米国特許第6,506,559号および同第6,573,099号ならびに米国特許出願公開第2003/0051263号、同第2003/0055020号、同第2004/0265839号、同第2002/0168707号、同第2003/0159161号および同第2004/0064842号に報告されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
siNA内において、核酸の成分は全体にわたって同じ型または均一である必要はない（例えば、siNAは、ヌクレオチドと核酸アナログまたはヌクレオチドアナログとを含み得る）。典型的には、siNAは二本鎖構造を形成しており;該二本鎖構造は、部分的または完全に相補的な2つの別々の核酸から生じるものであってもよい。本発明の特定の態様において、siNAは、単一の核酸（ポリヌクレオチド）または核酸アナログのみを含み、自身と相補的になること（例えば、ヘアピンループを形成すること）によって二本鎖構造を形成し得る。siNAの二本鎖構造は、間のすべての範囲を含む16、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個またはそれより多くの隣接核酸塩基を含み得る。siNAは、相補的な核酸（これは同じ核酸の別の部分であっても別個の相補的な核酸であってもよい）とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する17～35個の隣接核酸塩基、より好ましくは18～30個の隣接核酸塩基、より好ましくは19～25個の核酸塩基、より好ましくは20～23個の隣接核酸塩基もしくは20～22個の隣接核酸塩基または21個の隣接核酸塩基を含み得る。
本発明の方法を実施するのに有用な本発明の態様の剤としては、限定するわけではないがsiRNAが挙げられる。典型的には、本明細書において代わりに低分子干渉RNA（siRNA）と称する場合もある二本鎖RNA（dsRNA）の導入により、RNA干渉またはRNAiと称される現象である強力で特異的な遺伝子サイレンシングが誘導される。この現象は線虫C.エレガンス（C.elegans）において広く記録されている（Fire et al.,1998）が、トリパノソーマ（trypanosome）からヒトにわたる範囲の他の生物体でも広く知られている。論考される生物体に応じて、RNA干渉は「コサプレッション」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「センスサプレッション」および「クエリング」とも称されている。RNAiは、特定の遺伝子の活性をするための手段を提供するため、魅力的なバイオテクノロジーツールである。
RNAiの設計において、siRNAの性質、サイレンシング効果の持続性および送達系の選択など、考慮する必要がある要素がいくつか存在する。RNAi効果をもたらすため、生物体に導入されるsiRNAは典型的にはエキソン内配列を含む。さらに、RNAiプロセスは相同性依存的であり、そのため、配列は、遺伝子特異性は最大限となる一方、相同的だが遺伝子特異的でない配列間の交差干渉の可能性は最小限となるように注意深く選択されなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAの配列と阻害される遺伝子間において80％超、85％、90％、95％、98％またはさらには100％の同一性を示す。標的遺伝子との同一性が約80％未満である配列は実質的にあまり効果的でない。したがって、siRNAと阻害される遺伝子との間の相同性が大きいほど、無関連遺伝子の発現は影響を受けにくい。
また、siRNAのサイズは重要な考慮事項の1つである。いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約19～25個のヌクレオチドを含み、遺伝子発現を調節することができるsiRNA分子に関する。本発明との関連において、siRNAは好ましくは500、200、100、50または25ヌクレオチド未満の長さである。より好ましくは、siRNAは約19ヌクレオチド～約25ヌクレオチドの長さである。
標的遺伝子は一般的に、ポリペプチドをコードしている領域を含むポリヌクレオチド、あるいは複製、転写もしくは翻訳またはポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、あるいはポリペプチドをコードしている領域とこれに機能的に連結された、発現を調節する領域との両方を含むポリヌクレオチドを意味する。標的遺伝子は染色体内（ゲノム内）であっても染色体外であってもよい。これは細胞に内在性であってもよく、外来遺伝子（導入遺伝子）であってもよい。外来遺伝子は宿主ゲノム内に組み込まれ得るか、または染色体外の遺伝子構築物上、例えばプラスミドもしくはコスミド上に存在し得る。また、標的遺伝子は、生物体または細胞に感染することができる病原体、例えばウイルス、細菌、真菌または原生動物に由来するものであってもよい。標的遺伝子は、インターフェロン応答を誘起しないウイルス遺伝子およびプロウイルス遺伝子、例えばレトロウイルス遺伝子であってもよい。標的遺伝子はタンパク質コード遺伝子または非タンパク質コード遺伝子、例えばリボソームRNA、スプライセオソームRNA、tRNAなどをコードする遺伝子であり得る。
細胞内で発現されている任意の遺伝子を標的とし得る。好ましくは、標的遺伝子は、疾患に重要な細胞活動の進展に関与しているか、または該進展と関連しているもの、あるいは研究目的として非常に重要なものである。したがって、一例として、以下のもの:発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、ウィングドヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカインおよびその受容体、増殖因子または分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体）、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene 26（CACNA2D2）、PL6、Beta＊（BLU）、Luca-1（HYAL1）、Luca-2（HYAL2）、123F2（RASSF1）、101F6、Gene 21（NPRL2）またはSEM A3ポリペプチドをコードしている遺伝子）、プロアポトティック遺伝子（例えば、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIKおよびBID）、サイトカイン（例えば、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGFおよびmda7）、がん遺伝子（例えば、ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3およびYES）ならびに酵素（例えば、ACPデサチュラーゼおよびヒクロキシラーゼ（hycroxylase）、ADP-グルコースピロホリラーゼ（pyrophorylase）、ATPase、アルコールデヒクロゲナーゼ（dehycrogenase）、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インバターゼ、イソメルサーゼ（isomersase）、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ヌクレアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanase）、レコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）が、標的遺伝子発現を調節するため、または減衰させるために本発明の方法において使用され得る、考えられ得る標的遺伝子の類型である。
siRNAは市販の供給元もしくは天然供給源から入手してもよく、または当業者に周知のいくつかの手法のいずれかを用いて合成してもよい。例えば、あらかじめ設計されたsiRNAの市販の供給元の一例はAmbion（登録商標）,Austin,Tex.である。別の例はQiagen（登録商標）（Valencia,Calif.）である。本発明の組成物および方法に適用することができる阻害性核酸は、任意の情報源により関心対象のタンパク質の検証済み下方調節因子であることがわかっている任意の核酸配列であり得る。
一局面において、TNF-αをコードしている核酸の少なくとも10個だが30個以下の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であり、かつTNF-αタンパク質の発現を低減させる少なくとも1つの鎖を有する、少なくとも19ヌクレオチドの単離されたsiRNA分子。
また、siRNAは1個または複数のヌクレオチドの改変を含んでいてもよい。かかる改変としては、例えば、19～25ヌクレオチドのRNAの1つもしくは複数の末端または内部（のRNAの1個または複数のヌクレオチド）への非ヌクレオチド物質の付加が挙げられ得る。特定の局面において、RNA分子は3'-ヒドロキシル基を含む。また、本発明のRNA分子内のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾主鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは当技術分野において公知の他の修飾主鎖を含むものであってもよく、非天然のヌクレオシド間結合を含むものであってもよい。siRNAの追加の修飾（例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および逆位デオキシ脱塩基（deoxyabasic）残基の組み込み）は米国特許出願公開第2004/0019001号および米国特許第6,673,611号（これらの各々は参照によりその全体が組み入れられる）において知得され得る。集合的に、上記のかかる改変された核酸またはRNAはすべて、修飾siRNAと称する。
（3）メッセンジャーRNA（mRNA）分子
さらなる局面において、諸態様のポリヌクレオチドはmRNA分子である。例えば、mRNAには治療用ポリペプチドまたは抗原がコードされ得る。いくつかの局面において、mRNA分子は5'キャップ;5'UTR;3'UTR;および/またはポリ-Aテールを含む。mRNA分子は、標的細胞内で関心対象のポリペプチドを発現させる、より直接的な方法を提供し得る。しかしながら、かかる分子は典型的には非常に不安定であり、急速に分解される。しかしながら、いくつかの局面では、mRNAを実質的に安定化させるために諸態様によるLNPおよび/またはURF処理が使用され得る。好ましい局面において、LNP内に封入されているか、あるいはLNPとの複合体の状態のmRNAが提供される。
（4）インタクトな細胞
いくつかの局面において、諸態様の組成物はインタクトな細胞および/または生細胞を含む。例えば、該細胞は真核生物細胞、古細菌細胞および/または細菌細胞であり得る。例えば、該細胞はヒト細胞（例えば、ヒトiPS細胞）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）または植物細胞を含み得る。いくつかの局面において、該細胞は細菌細胞を含む。細菌はグラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。例えば、該細胞は、農作物に対して保護的である細菌あるいは虫害の防除を補助するタンパク質を発現する細菌を含み得る。さらなる局面において、細菌は、ヒト対象に有益である細菌、例えば健常腸内細菌であり得る。いくつかの局面において、細胞は改変操作された細胞、例えば改変操作された細菌である。
なおさらなる局面において、諸態様の細菌組成物はプロバイオティクス組成物であり得る。例えば、かかるプロバイオティクス組成物は、バクテロイデス門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門、ウェルコミクロビウム門およびアクチノバクテリア門由来の1種または複数種の細菌を含み得る。いくつかの局面において、アクチノバクテリア綱、バクテロイデス綱、バシラス綱、クロストリジウム綱、エリュシペロトリクス綱、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱、モリクテス綱およびウェルコミクロビウム綱のうちの1種または複数種を含む。
なおさらなる局面において、細菌細胞は弱毒化または不活化された細菌細胞（例えば、ワクチンにおける使用のための）であり得る。例えば、弱毒化または不活化された細菌はストレプトコッカス・アガラクティエ、レジオネラ・ニューモフィリア、ストレプトコッカス・ピオゲネス、大腸菌、ナイセリア・ゴノロサエ、髄膜炎菌、肺炎球菌、ヘモフィリス・インフルエンザB型、梅毒トレポネーマ、ライム病の病原スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ブルセラ・アボルタス、ヒト型結核菌、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルーストリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、牛バベシア、エルメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、ヒツジ条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイド・コルティ、マイコプラズマ・アルスリティディス、M.ハイオライニス、M.オラーレ、M.アルギニニ、アコレプラズマ・レイドロウイ、M.サリバリウム、M.ニューモニエ、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティティジス、アスペルギルス・フミガーツス、ペニシリウム・マルネッフェイ、炭疽菌、バルトネラ属、百日咳菌、ブルセラ菌-すべての血清型、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエ、ボツリヌス菌-クロストリジウム血清型由来の任意のもの、インフルエンザ菌、ピロリ菌、クレブシエラ属-すべての血清型、レジオネラ菌-すべての血清型、リステリア菌、マイコバクテリウム属-すべての血清型、マイコプラズマ属-ヒトおよび動物の血清型、リケッチア属-すべての血清型、赤痢菌-すべての血清型、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌-S.ニューモニエ、S.ピオゲネス、コレラ菌、エルシニア・エンテロコリチカならびに/またはペスト菌であり得る。
（5）ウイルス
なおさらなる局面において、諸態様の組成物はウイルス、ウイルスベクターおよび/またはVLPを含む。例えば、ウイルスは、哺乳動物細胞または細菌細胞に感染するウイルス（バクテリオファージ）であり得る。好ましい局面において、ウイルスは、ヒト対象にとって病原性である細菌に感染するバクテリオファージを含む。さらにより好ましい局面において、バクテリオファージは、肺感染症を引き起こす細菌に感染する。
なおさらなる局面において、ウイルスは弱毒化または不活化されたウイルス（例えば、ワクチンにおける使用のための）であり得る。例えば、弱毒化または不活化されたウイルスは、アレナウイルス科のもの（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、アルテリウイルス科のもの（例えば、ウマ動脈炎ウイルス）、アストロウイルス科のもの（ヒトアストロウイルス1）、ビルナウイルス科のもの（例えば、伝染性膵臓壊死症ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、ブニヤウイルス科のもの（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス群）、カリシウイルス科のもの（例えば、カリシウイルス）、コロナウイルス科のもの（例えば、ヒトコロナウイルス299EおよびOC43）、デルタウイルス（例えば、肝炎デルタウイルス）、フィロウイルス科のもの（例えば、マールブルグウイルス、エボラウイルス）、フラビウイルス科のもの（例えば、黄熱ウイルス群、C型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科のもの（例えば、B型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科のもの（例えば、エプスタインバールウイルス、シンプレックスウイルス属、バリセロウイルス属、サイトメガロウイルス属、ロゼオロウイルス属、リンフォクリプトウイルス属、ラディノウイルス属）、オルトミクソウイルス科のもの（例えば、インフルエンザウイルスA型、B型およびC型）、パルボウイルス科のもの（例えば、パピローマウイルス属）、パラミクソウイルス科のもの（例えば、パラミクソウイルス属、例えばヒトパラインフルエンザウイルス1型、モルビリウイルス属、例えば麻疹ウイルス、ルブラウイルス属、例えばムンプスウイルス、ニューモウイルス、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス）、ピコルナウイルス科のもの（例えば、ライノウイルス属、例えばヒトライノウイルス1A、ヘパトウイルス属 例えばヒトA型肝炎ウイルス、ヒトポリオウイルス、カルジオウイルス属、例えば脳心筋炎ウイルス、アフトウイルス属、例えば口蹄疫ウイルスO、コクサッキーウイルス）、ポキシイリダエ（例えば、オルソポックスウイルス属、例えば天然痘ウイルスもしくはサル痘ウイルス）、レオウイルス科のもの（例えば、ロタウイルス属、例えばA～F群ロタウイルス）、レトロウイルス科のもの（霊長類レンチウイルス群、例えばヒト免疫不全ウイルス1型および2型）、ラブドウイルス科のもの（例えば、狂犬病ウイルス）、トガウイルス科のもの（例えば、ルビウイルス属、例えば風疹ウイルス）、ヒトT細胞白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、HIV-1およびHIV-2、西ナイル、H1N1、SARS、1918年のインフルエンザ、ダニ媒介性脳炎群ウイルス（Absettarov、Hanzalova、Hypr）、ロシア春夏脳炎ウイルス、コンゴ・クリミア出血熱ウイルス、フニンウイルス、クムリンゲ（Kumlinge）ウイルス、マールブルグウイルス、マチュポウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ラッサウイルス、オムスク出血熱ウイルス、FIV、SIV、単純ヘルペス1型および2型、帯状疱疹、ヒトパルボウイルス（B19）、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス（すべての型および血清型）、コルティウイルス属、レオウイルス-すべての型ならびに/またはルビウイルス属（風疹）であり得る。
またさらなる局面において、ウイルスはウイルスベクター、例えば改変操作されたウイルスベクターであり得る。かかるウイルスベクターとしては、限定するわけではないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
B. ナノ粒子およびナノ粒子複合体
本明細書において使用する場合、用語「ナノ粒子」は1～1,000nmの範囲の寸法を有する任意の物質を示す。いくつかの態様において、ナノ粒子は50～500nmの範囲の寸法を有する。本発明の態様において使用されるナノ粒子としては、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、高分子ベースのナノ粒子、シリコンベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンおよびナノチューブなどのナノスケールの物質が挙げられる（Ferrari,2005）。ポリペプチドまたは核酸のナノ粒子とのコンジュゲーションにより、標的送達、制御放出、細胞内取込みおよび細胞内輸送の向上ならびに治療用ペプチドのインビトロおよびインビボでの分子イメージングへの応用の潜在的可能性を有する構造がもたらされる（West,2004;Stayton et al.,2000;Ballou et al.,2004;Frangioni,2003;Dubertret et al.,2002;Michalet et al.,2005;Dwarakanath et al.,2004）。
（1）キトサンナノ粒子
いくつかの局面において、諸態様に従う使用のためのナノ粒子は一成分としてキトサンを含む。一般的に、キトサンは、（1→4）結合型の2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコース（GlcNAc、A単位）と2-アミノ-2-デオキシ-β-D-グルコース（GlcN;D単位）で構成される一群のカチオン性の二元ヘテロ多糖類である（Varum et al.,1991）。キトサンは、脱アセチル化アミノ基（-NH3 ＋）に起因する正電荷を有する。キトサン、キトサン誘導体またはキトサンの塩（例えば、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩もしくは酢酸塩）が使用され得、用語「キトサン」の意味に包含される。本明細書において使用する場合、用語「キトサン誘導体」は、エステル、エーテル、またはアシル基および/もしくはアルキル基とキトサンのNH2基ではなく-OH基との結合によって形成される他の誘導体を包含することを意図する。例はキトサンのO-アルキルエーテルおよびキトサンのO-アシルエステルである。修飾キトサン、特にポリエチレングリコールとコンジュゲートされたものもまた、「キトサン誘導体」とみなす。多くのキトサンならびにその塩および誘導体は市販されている（例えば、SigmaAldrich,Milwaukee,WI）。好ましい局面において、諸態様のキトサンナノ粒子はPEG化される。
また、キチンを濃アルカリ（50％w/v）中で数時間、煮沸処理するなどの、キトサンならびにその誘導体および塩の調製方法も公知である。これにより、70％～75％のN-アセチル基が除去されてキトサンが得られる。すべてのN-アセチル基が除去されているキトサンの非限定的な一例を以下に示す。
Figure 2023522103000001
キトサンは、当業者に公知の任意の供給源から得られ得る。例えば、キトサンは市販の供給元から得られ得る。キトサンを、自然界で2番目に豊富な生体高分子であるキチンから得てもよい。キトサンは、キチンのN-脱アセチル化によって調製される。多種多様な分子量（例えば、10～1000 kDa）のキトサンが市販されており、通常、70％～90％の範囲の脱アセチル化度を有する。
使用されるキトサン（またはキトサンの誘導体もしくは塩）は好ましくは、4,000ダルトンまたはそれより大きい、好ましくは25,000～2,000,000ダルトンの範囲、最も好ましくは約50,000～300,000ダルトンの分子量を有する。いろいろな分子量のキトサンはキトサナーゼを用いた高分子量キトサンの酵素分解によって、または亜硝酸の添加によって調製され得る。どちらの手順も当業者に周知であり、種々の刊行物に記載されている（Li et al.,1995;Allan and Peyron,1995;Domard and Cartier,1989）。キトサンは水溶性であり、40％超、好ましくは50％～98％、より好ましくは70％～90％の度合いまでの脱アセチル化によってキチンから作製され得る。
キトサンを作製するいくつかの方法、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,806,474号および米国特許出願公開第2005/0042735号に教示されている方法は微生物バイオマスからの回収を伴う。米国特許第4,282,351号に教示されている別の方法には、どのようにしてキトサン-ベータ-グルカン複合体を作出するかのみが教示されている。
本明細書において使用されるキトサン、キトサン誘導体または塩は水溶性である。キトサングルタミン酸系は水溶性である。「水溶性」とは、キトサン、キトサン誘導体または塩が、室温および大気圧で少なくとも10mg/mlの量で水に溶解することを意味する。本明細書において使用されるキトサン、キトサン誘導体または塩は正電荷を有する。
キトサンおよびキトサン誘導体に関する追加の情報は、米国特許出願公開第2007/0167400号、同第2007/0116767号、同第2007/0311468号、同第2006/0277632号、同第2006/0189573号、同第2006/0094666号、同第2005/0245482号、同第2005/0226938号、同第2004/0247632号および同第2003/0129730号において知得され得、これらの各々は参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
好ましい局面において、諸態様のキトサンナノ粒子は、核酸、例えばDNAとの複合体の状態で提供される。
（2）脂質ナノ粒子（LNP）
脂質ベースのナノ粒子としては、リポソーム、脂質調製物および脂質ベースの小胞（例えば、DOTAP:コレステロール小胞）が挙げられる。脂質ベースのナノ粒子は正荷電、負荷電または中性であり得る。特定の態様において、脂質ベースのナノ粒子は荷電が中性である（例えば、DOPCリポソーム）。
「リポソーム」は、封入型の脂質二重層または凝集体の作製によって形成されるさまざまな単層および多層の脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重層膜を有する小胞構造と、一般的に水性組成物を含む内部媒体とを有することを特徴とし得る。本明細書において提供されるリポソームとしては、単層リポソーム、多層リポソームおよび多胞リポソームが挙げられる。本明細書において提供されるリポソームは正荷電、負荷電または荷電が中性であり得る。特定の態様において、リポソームは電荷中性である。
多層リポソームは、水性媒体によって隔離された複数の脂質層を有する。これは、リン脂質を構成する脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は、閉構造の形成の前に自己組織化し、水と溶解溶質を脂質二重層間に封じ込める（Ghosh and Bachhawat,1991）。また、親油性分子または親油性領域を有する分子も脂質二重層内に溶解し得るか、あるいは脂質二重層と会合し得る。
特定の局面において、ポリペプチドまたは核酸は、例えば、リポソームの水性内部に封入される、リポソームの脂質二重層内に散在する、リポソームとポリペプチド/核酸の両方と会合している連結分子を介してリポソームに結合される、リポソーム内に封じ込められる、リポソームと複合体形成される、などであり得る。
本発明の態様で有用であり得る追加のリポソームとしては、例えば、すべて参照によりその全体がいかなる意味においても本明細書に組み入れられるWO02/100435A1、米国特許第5,962,016号、米国特許出願公開第2004/0208921号、WO03/015757A1、WO04029213A2、米国特許第5,030,453号および米国特許第6,680,068号に記載のようなカチオン性リポソームが挙げられる。また、リポソームを作製するプロセスはWO04/002453A1に記載されている。中性脂質がカチオン性リポソーム内に組み込まれ得る（例えば、Farhood et al.,1995）。特定の態様において使用され得る種々の中性リポソームは米国特許第5,855,911号に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。このような方法は、それぞれの水性物質封じ込め能力およびそれぞれの水性空間対脂質比が異なる。
リポソームのサイズは合成方法に応じてさまざまである。本発明の態様におけるリポソームはさまざまなサイズであり得る。特定の態様において、リポソームは小型、例えば外径が約100nm未満、約90nm、約80nm、約70nm、約60nmまたは約50nm未満である。例えば、一般に、核酸の組み込み前、本発明の態様に従う使用のためのDOTAP:コレステロールリポソームは約50～500nmのサイズを含む。また、かかるリポソーム製剤は粒子電荷（ゼータ電位）および/または光学密度（OD）によっても規定され得る。例えば、DOTAP:コレステロールリポソーム製剤は典型的には、核酸の組み込み前、0.45未満のOD400を含む。同様に、溶液状態のかかる粒子の総電荷は約50～80mVのゼータ電位によって規定され得る。
かかるリポソームの調製には、本明細書に記載の、または当業者にはわかるであろう任意のプロトコルが使用され得る。リポソームの調製の追加の非限定的な例は、米国特許第4,728,578号、同第4,728,575号、同第4,737,323号、同第4,533,254号、同第4,162,282号、同第4,310,505号および同第4,921,706号;国際特許出願PCT/US85/01161および同PCT/US89/05040;英国特許出願公開第2193095A号;Mayer et al.,1986;Hope et al.,1985;Mayhew et al.1987;Mayhew et al.,1984;Cheng et al.,1987;およびLiposome Technology,1984に記載されており、各々、参照により本明細書に組み入れられる）。
特定の態様において、脂質ベースのナノ粒子は中性リポソーム（例えば、DOPCリポソーム）である。「中性リポソーム」または「無電荷リポソーム」は、本明細書において使用する場合、本質的に中性の正味電荷（実質的に無電荷）をもたらす1種または複数種の脂質成分を有するリポソームと定義する。「本質的に中性」または「本質的に無電荷」とは、所与の集団（例えば、リポソーム集団）内において、別の成分の反対の電荷によって無効になっていない電荷を含む脂質成分が、あったとしてもわずかである（すなわち、無効になっていない電荷を含む成分が10％より少ない、より好ましくは5％より少ない、最も好ましくは1％より少ない）ことを意味する。特定の態様において、中性リポソームは、大部分が生理学的条件下で（すなわち、約pH7で）それ自体、中性である脂質および/またはリン脂質を含み得る。
本発明の態様のリポソームおよび/または脂質ベースのナノ粒子はリン脂質を含み得る。特定の態様では、1種類のリン脂質がリポソームの生成に使用され得る（例えば、中性リン脂質、例えばDOPCが中性リポソームの作製に使用され得る）。他の態様では、1種類より多くのリン脂質がリポソームを生成させるために使用され得る。
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる;ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下で（すなわち、約pH7で）無電荷であるため、このような化合物は中性リポソームの作製に特に有用であり得る。特定の態様では、リン脂質DOPCを用いて無電荷リポソームが作製される。特定の態様では、リン脂質でない脂質（例えば、コレステロール）が使用され得る。
リン脂質としてはグリセロリン脂質および特定のスフィンゴ脂質が挙げられる。リン脂質としては、限定するわけではないが、ジオレオイルホスファチジリ（phosphatidyly）コリン（「DOPC」）、卵のホスファチジルコリン（「EPC」）、ジラウリロイル（dilauryloyl）ホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール（「DLPG」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「DSPG」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「DSSP」）、ジステアロイルホファチジル（phophatidyl）エタノールアミン（「DSPE」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「DMPA」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「DPPA」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、脳内ホスファチジルセリン（「BPS」）、脳内スフィンゴミエリン（「BSP」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「DPSP」）、ジミリスチル（dimyristyl）ホスファチジルコリン（「DMPC」）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DAPC」）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DBPC」）、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DEPC」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「DOPE」）、パルミトイルオエオイル（oeoyl）ホスファチジルコリン（「POPC」）、パルミトイルオエオイルホスファチジルエタノールアミン（「POPE」）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。
リン脂質は天然供給源由来であってもまたは合成供給源由来であってもよい。しかしながら、天然供給源由来のリン脂質、例えば卵または大豆のホスファチジルコリン、脳内ホスファチジン酸、脳内または植物のホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピンおよび植物または細菌のホスファチジルエタノールアミンは、特定の態様では、得られるリポソームの不安定性および漏出性がもたらされ得るため、主要ホスファチド（すなわち、全ホスファチド組成物の50％またはそれ以上を構成する）として使用されない。
C. 賦形剤
いくつかの局面において、本開示は、薬学的組成物中に製剤化される1種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの態様において、本明細書において使用される賦形剤は水溶性の賦形剤である。このような水溶性の賦形剤としては糖類、例えば二糖類が挙げられる。いくつかの場合において、賦形剤はスクロース、トレハロースまたはラクトース、三糖類、例えばフルクトース、スクロース、グルコース、グラカトース（glacatose）もしくはラフィノース、多糖類、例えばデンプンもしくはセルロースまたは糖アルコール、例えばキシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールを含む。いくつかの態様において、このような賦形剤は室温で固形である。糖アルコールのいくつかの非限定的な例としては、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリトール（maltotritol）、マルトテトライトールまたはポリグリシトールが挙げられる。いくつかの局面において、本発明の薬学的組成物には疎水性またはワックス状の賦形剤、例えばワックスおよび油類がさらに除外され得る。疎水性の賦形剤のいくつかの非限定的な例としては、水素添加油および部分水素添加油、ヤシ油、ダイズ油、ヒマシ油、カルナウバワックス、蜜蝋、ヤシ蝋、白蝋、カスターワックスまたはラノリンが挙げられる。さらに、本開示は、1種もしくは複数種のアミノ酸またはそのアミドもしくはエステル誘導体をさらに含み得る。いくつかの態様において、使用されるアミノ酸は、20種の標準的なアミノ酸のうちの1つ、例えばグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり得る。このようなアミノ酸はD体配向もしくはL体配向であり得、またはアミノ酸はα-、β-、γ-もしくはδ-アミノ酸であり得る。他の態様では、一般的な非標準的なアミノ酸のうちの1つ、例えばカルニチン、GABA、カルボキシグルタミン酸、レボチロキシン、ヒドロキシプロリン、セレオン（seleon）メチオニン、ベータアラニン、オルニチン、シトルリン、デヒドロアラニン、δ-アミノレブリン酸または2-アミノイソ酪酸が使用され得る。
いくつかの局面において、粉末組成物を作製するための前駆体溶液中の賦形剤の量は約0.5％～約20％w/w、約1％～約10％w/w、約2％～約8％w/wまたは約2％～約5％w/wである。前駆体溶液中の賦形剤の量は約0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％から約10％w/wまで、またはその間の導出可能な任意の範囲を含む。一態様において、諸態様の乾燥粉末中の賦形剤の量は薬学的組成物の総重量の約10％～99.5％w/w、例えば約50％～99％、75％～99％または80％～98％である。
III. 定義
語「1つの（a）」または「1つの（an）」の使用は、特許請求の範囲および/または本明細書において用語「含む（comprising）」とともに使用する場合「1」を意味し得るが、これは、「1または複数（one or more）」、「少なくとも1（at least one）」および「1または1より多く（one or more than one）」という意味と一致する場合もあり得る。本明細書において使用する場合、「別の」は少なくとも2つ目またはそれより多くを意味し得る。
本明細書において使用する場合、用語「薬物」、「医薬品」、「治療用薬剤」および「治療活性薬剤」は、ヒトまたは動物において治療効果または薬理学的効果をもたらし、かつ疾患、障害または他の病態を処置するために使用される化合物を表すために互換的に使用される。いくつかの態様において、このような化合物は生き物への投与について規制当局に承認申請（undergo）され、承認を受けている。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、択一のみを示す、または択一選択肢が相互に排他的であると明白に示していない限り、「および/または」を意味するために使用している。本明細書において使用する場合、「別の」は少なくとも2つ目またはそれより多くを意味し得る。
本明細書および1つまたは複数の請求項において使用する場合、語「含む（comprising）」（ならびに「含む（comprising）」の任意の形態、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」、「有する（having）」（ならびに「有する（having）」の任意の形態、例えば「有する（have）」および「有する（has）」）、「含む（including）」（ならびに「含む（including）」の任意の形態、例えば「含む（includes）」および「含む（include）」または「含む（containing）」（ならびに「含む（containing）」の任意の形態、例えば「含む（contains）」および「含む（contain）」は包括的またはオープンエンドであり、記載されていない追加の要素または方法工程を排除しない。
本明細書において使用する場合、用語「有意な」（ならびに有意な任意の形態、例えば「有意に」）は、2つの値間の統計学的な差を示唆することを意味するのではなく、パラメータの差の重要性または範囲を示唆することを意味しているにすぎない。
本願の全体を通して、用語「約」は、値が、該値を求めるために使用されるデバイス、方法の誤差の固有変動性または試験対象間もしくは実験的研究間に存在する変動性を含むことを示すために使用している。別の定義が適用可能でない限り、用語「約」は、表示された値の±10％を示す。
本明細書において使用する場合、指定された成分に関する用語「実質的に無含有状態の」または「実質的にフリー」は本明細書において、該指定された成分はいずれも目的をもって組成物に製剤化されない、および/または混入物としてしか、あるいは微量でしか存在しないことを意味するために使用している。すべての含有物、副生成物および他の物質は総量で、該組成物中に2％未満の量で存在する。用語「実質的により無含有状態の」または「実質的によりフリー」は、該組成物に含まれている該特定の成分が1％未満であることを表すために使用している。用語「本質的に無含有状態の」または「本質的にフリー」とは、含まれている該特定の成分が0.5％未満である。
本明細書において使用する場合、用語「ナノ粒子」は、その慣用的な通常の定義を有し、粒子内の個々の分子としてではなく全体として単位で挙動する個々の粒子群を示す。ナノ粒子は、約1～約10,000nmのサイズを有し得、1nm～100nmのサイズを有する超微細ナノ粒子、100nm～2,500nmのサイズを有する微粒子および2,500nm～10,000nmのサイズを有する粗粒子を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載のナノ凝集体は、複数のナノ粒子群の組成物を構成し得、約10nm～約100μmのサイズを有し得る。
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるとはいえ、具体的な実施例に示した数値は可能な限り厳密に報告している。しかしながら、数値はいずれも、それぞれの試験測定値およびパラメータにみられる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を内在的に含んでいる。
IV. 実施例
本開示のよりよい理解を容易にするために、以下に具体的な態様の実施例を示す。当業者には、以下の実施例に開示した手法は、本発明者が開示の実施において充分に機能することを見出した手法を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが認識されよう。しかしながら、当業者には、本開示に鑑みて、開示された具体的な態様において開示の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更を行なうことができ、それでもなお同様または類似の結果が得られ得ることが認識されるはずである。以下の実施例は、何ら本開示の範囲全体が限定または規定されるように読まれるべきでない。
実施例1-薄膜凍結技術を用いた吸入可能バクテリオファージ固形製剤
A. 材料および方法
1. 材料
D-（＋）-トレハロース二水和物、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、スクロースおよび溶原性ブロス（LB）培地、LBアガーはThermo Fisher Scientific（Waltham,MA,US）から購入し;ロイシンおよびマンニトールはSpectrum（New Brunswick,NJ,US）から購入し;T7バクテリオファージおよびその宿主細菌BL21株はMillipore Sigma（Burlington,MA,US）から購入し;リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、Trizma（登録商標）塩基、Tris-HClはSigma-Aldrich（St.Louis,MO,US）から購入した。
2. 方法
T7増幅およびファージ再構成。T7ファージを製造業者のプロトコルに従って増幅した。簡単には、ファージをBL21液状培養物（0.2～0.3のOD600）に感染多重度（MOI）0.001～0.01で添加し、1～3時間、37℃、250 RPMで溶解が観察されるまで増幅した。細菌ライセートを回収し、5M NaCl/LBを用いて清澄化し、10,000rpmでSorvall XFR Centrifuge（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,US）にて4℃で30分間スピンダウンした。ファージを含む上清みを回収し、ファージ試料を50％PEG 8000溶液とともに4℃で一晩インキュベートすることによってファージをさらに沈殿させた。沈殿したら、ファージを、14,000rpmでスピンダウンすることによってペレット化し、PBSまたはSMバッファーのいずれかに再懸濁させ、1.5mL容マイクロ遠心チューブ内に回収した。ファージをさらに精製するため、再懸濁させたファージで、50％PEG 8000溶液を用いて氷上で少なくとも30分間、沈殿させることにより第2のPEG沈殿工程を行なった。次いで、このライセート-PEG混合物を14,000rpmで30分間、遠心分離し、得られたファージペレットを50～100μLのPBSまたはSMバッファーのいずれかに再懸濁させた。増幅されたファージを標準的な二重層プラークアッセイによって定量し、4℃で保存した。
ファージの生存性試験。溶液および粉末試料中の生存能力のあるファージの量を、力価測定すること（すなわち、活性計測（activity counting）アッセイ）によって調べた。TFFD処理ファージ粉末を滅菌水中で再構成して10mg/mlの終濃度にした。凍結工程での生存性試験では、凍結された薄膜を回収し、室温で解凍した後、力価測定した。ファージの溶解性生物活性（lytic bioactivity）を、標準的な二重層プラークアッセイを行なうことによってアッセイした。簡単には、試験用ファージ溶液を10倍段階希釈列で、LB培地を用いて調製した。10マイクロリットルの各希釈液を200μLのBL21菌液（OD600＝1.0）および1mLの溶かしたLBトップアガーに添加した。短時間ボルテックスした後、混合物を、5mLの固化された寒天下部を有する事前に加温した6ウェルプレート上にプレーティングした。プレートを37℃でおよそ3～4時間、プラークが計数および定量のために視認可能になるまでインキュベートした。最初の製剤溶液の力価を各試料の力価で割り算することにより、力価低下量を計算した。
製剤の調製。3種類の二糖類（ラクトース、スクロースおよびトレハロース）、1種類の糖アルコール（マンニトール）ならびに1種類のアミノ酸（ロイシン）を含む、固形ファージ製剤の研究に一般的に使用されるいくつかの賦形剤を選択した。これらの賦形剤を、単独または別のものとの組合せのいずれかで製剤中に組み込み、二元賦形剤マトリックスを形成した。組合せは90:10～50:50の比での糖とマンニトールまたは糖とロイシンであった。製剤溶液は、2.5mg/mL～100mg/mLの溶液濃度に相当する0.25％～10％の範囲の固形分で調製した。固形分は、TFFD前の溶液製剤中のすべての成分の容量に対する重量の濃度を示す。初期力価のファージストック液は1011 PFU/mL～1012 PFU/mLの増殖状態であり、特に記載のない限り、これを100～1000倍希釈で製剤に添加して5×108～109 PFUl/mLの最終力価にした。溶液はPBS（pH7.4）、SMバッファー（pH7.4～7.5）または水で調製した。SMバッファー（ゼラチンなし）は、Cold Spring Harbor Protocolに示された配合に従って調製した。
TFFDによるファージ粉末の製造。水性ファージ溶液を標準的な5mLまたは10mL容シリンジに通した。液滴を、液体窒素への浸漬によって事前に冷却した完全（absolute）平底ステンレス鋼容器の上部10 cmの高さから落下させた。ステンレス鋼による熱伝導率の結果、容器の底の表面の得られた平衡表面温度は溶液の氷点より下になり、-100℃より冷たいほどの低温まで下げることができた。この実験では、作業温度を、液体窒素中での容器の高さを調整することによって制御した。温度は、特に記載のない限り-65～-75℃以内に制御した。実験前および実験中、容器の底の表面温度は、ワイヤで底面上に取り付けた熱電対で確認した。ステンレス鋼容器の底の表面に触れたら、液滴は薄膜に変形し、即座に凍結された。凍結された薄膜を表面からステンレス鋼ブレードによって手作業で剥がした。次いで、凍結された薄膜が入った容器に液体窒素を充填した。膜と液体窒素を20mL容凍結乾燥用バイアル内に注入し、次いで、これを2枚重ねのキムワイプで被覆し、真空乾燥中、粒子がバイアルから出て行かないようにした。最後に、バイアルを直接、-80℃のフリーザーに移して過剰の液体窒素を蒸発させ、凍結乾燥機内に入れるまで保持した。
Virtis Advantage Lyophilizer（The Virtis Company,Inc.,Gardiner,NY）を使用し、凍結されたスラリーを乾燥させた。一次乾燥を-40℃で2000分間、100mTorrにて、二次乾燥を25℃で1250分間、100mTorrにて行なった。この2つの乾燥工程間に、-40℃から＋25℃までの棚板温度の12時間の線形ランプ制御を100mTorrで使用した。サイクルを行なった後、容器にしっかりキャップし、次いで、凍結乾燥機から取り出した直後に真空チャンバ内に保存した。
幾何学的粒子径の測定。TFFD処理ファージ粉末のGPSDを、RODOS分散機を備えたSympatec HELOSレーザー回折装置（Sympatec GmbH,Germany）を用いて解析した。3バールでの粉末分散後、10ms毎に測定値を得た。5％～25％の光学密度である測定値を、次いで平均し、粒子径分布を求めた。体積基準の粒子径を、それぞれ10、50および90パーセンタイル（例えば、Dv10/50/90）ならびに1～5μmのサイズ範囲に含まれる粒子のパーセンテージで報告した。スパンは以下の式:スパン＝（Dv90-Dv10）/Dv50を用いて計算した。
走査型電子顕微鏡（SEM）による画像。TFFD処理ファージ粉末の形態構造を、Zeiss Supra 40VP SEM（Carl Zeiss Microscopy GmbH,Jena,Germany）で解析した。試料をアルミニウムSEMスタブ上に、カーボン導電性テープを用いてマウントし、Cressingtonスパッターコーター208 HR（Cressington Scientific Instruments Ltd.,Watford,UK）を用いて15nmの白金/パラジウム（Pt/Pd）でコーティングした。
X線回折（XRD）パターン。TFFD処理ファージ粉末の結晶化度を、X線回折計（MiniFlex 600,Rigaku Co.,Japan）を用いて周囲条件下で検出した。粉末をガラススライド上に広げ、15mAおよび40 kVのCu Kα線に曝露した。散乱強度を検出器により5から50°までの範囲の2θで、それぞれ0.025°のステップサイズおよび2°/分の速度で収集した。
熱重量分析（TGA）。熱重量分析を、Mettler Thermogravimetric Analyzer（Mettler Toledo,Columbus,OH,US）を用いて実施した。1～3mgのサイズの試料を70μl容アルミナパン内にロードし、パンに、通気孔を有する蓋で緩くキャップした。試料を35℃から400℃まで10℃/分の速度で加熱した。この系に窒素を50 L/分の流速でパージした。初期質量と比べた質量変化パーセンテージを計算し、温度に対してプロットした。120℃における重量減少パーセントを使用し、粉末中の水分含有量を求めた。
透過型電子顕微鏡（TEM）による画像。選択された試料粉末を、滅菌水を用いて再構成し、1010 PFU/mLの濃度にした。5μL容量の試験溶液をカーボンコート銅グリッド（CFT300-CU,Electron Microscopy Science,Hatfield,PA,USA）の表面上に静かに滴下し、液体残渣を濾紙によって毛管作用により吸い取った。次いでグリッドを、ファージの可視化を改善するために5μlの2％酢酸ウラニルネガティブ染色液（pH＝4.3）で染色した。ファージを、AMT Advantage HR 1k×1kデジタルカメラ（Advanced Microscopy Techniques,MA,US）を備えたFEI Tecnai TEM（FEI Tecnai,OR,US）を用いて80 kVでイメージングした。
賦形剤スクリーニング
この試験では、ラクトース、トレハロースおよびスクロースの3種類の糖をマンニトールまたはロイシンとともに/なしで、異なる比で製剤化した。この試験の製剤は-70±5℃で処理し、固形分を1％（w/v）にした。
図1の力価低下量の結果は、概して、スクロース含有製剤はラクトースおよびトレハロースより良好にファージの溶解活性を保持したことを示す。また、糖単独ではファージを充分に保護することができず、ファージの安定性に対して有害な効果を有する。ほとんどのマンニトール含有製剤で完全な力価低下が起こった。マンニトールがファージにとって決定因子であることは明白であった。マンニトールのファージに対するマイナスの影響は凍結乾燥M13ファージ研究で以前に報告され、この場合、力価低下量はマンニトール-トレハロース二元系におけるマンニトール比の増大に伴って増加することが観察された。すべての製剤のうち、スクロース:ロイシンが80:20のものは、力価低下量が1.47（log,PFU）であり、ファージの生存性を保持するのに最良の製剤であることがわかった。
GPSDのパターンに対する賦形剤の効果は有意であった（図2）。賦形剤マトリックス中のロイシン比の増大に伴い、粒子径および1～5μm粒子のパーセンタイルはそれぞれ、低減および増大することがはっきり実証された。興味深いことに、この傾向はラクトース群およびトレハロース群で、スクロース群より明白であった。驚くべきことに、マンニトールを添加するとラクトース-マンニトール試料の粒子径が大きくなった。スクロース:ロイシンが80:20のDv50は6.94±0.38μmであった。
固形分スクリーニング。製剤中における固形分レベルが種々である複数の賦形剤マトリックスを製剤化した。この試験の製剤は-70±5℃で処理した。力価低下量に対する固形分の影響はパターンを有しないが、製剤中の固形分が多いと力価低下量は上昇するという傾向が若干観察された（図3）。ほとんどの賦形剤マトリックスで、固形分が0.25％である場合、凍結乾燥後に粉末が崩壊したことは言及するに値する。したがって、固形分は製剤中において0.5％超でなければならない。
図4は、製剤中の固形分の増大に伴う粒子径分布の変化を示す。一般に、粒子径と固形分は負の相関を有する、すなわち、固形分が少ないほどより小さい粒子径となる。しかしながら、試験した製剤群、例えばラクトース群では、固形分が10％ではなく0.5％の場合に粒子径が最大となるという例外がみられた。
プロセス温度スクリーニング。製剤中における固形分レベルが種々である複数の賦形剤マトリックスを製剤化した。この試験の製剤は-70±5℃で処理し、固形分を1％（w/v）にした。スクロース:ロイシンが70:30および80:3の賦形剤マトリックスがファージ活性の保持に最も有効であることがわかったため、これらをファージ粉末の力価および粒子径に対する凍結温度の効果を探索するためのモデル製剤として使用した。方法のセクションに記載のように、ステンレス鋼容器の表面の温度は、容器と接触する液体窒素の液面を調整することによって変化させた。温度は-40±5℃、-70±5℃、-100±5℃および-120±5℃に制御した。
図5に示す力価低下量の変化によって示されるように、冷たさはファージの生存性にマイナスの影響を有し、温度が低いほど力価低下量が大きくなることを意味する。だが、最高力価と最低力価の差が0.5未満（log,PFU）であったため、温度の効果は限定的である。また、この傾向および影響度は製剤が異なると異なり得る。
粉末の粒子径分布に対する処理温度の効果は不規則であった（図6参照）。これは、形成される温度が異なるとディスク（薄膜）の寸法（サイズおよび厚さ）も異なったという事実が原因かもしれない。温度を下げると、ディスクはより厚く、より円形になる。温度を-125℃より低くした場合、滴下した液体は液滴形状を形成し、ステンレス表面周囲に飛び散ることが観察された。また、プロセス温度を-40℃より高くした場合、ディスクは表面上に強固に付着した。このような観察結果は、ステンレス鋼の表面温度が特定の温度より低い場合、気体の層が形成されるライデンフロスト効果によってもたらされたという仮説をたてる。気体の層の影響の度合いは、容器の表面と製剤液滴の温度差に大きく依存する。その結果は、ディスクの寸法が他の要素、例えば製剤の組成と交絡する場合、製剤マトリックスが異なると表面張力も異なるため、より複雑になった。
製剤の初期力価。製剤中のファージの初期力価の影響を、PBS中に保存した5×1011 PFU/mL（5E11とも表示する）の初期力価のファージストック液を希釈することによって検討した。固形分は0.5％（w/v）であり、賦形剤はスクロース:ロイシンが80:20の製剤であった。TFFDを-70±5℃で実施した。
図7に示されるように、5×1010 PFU/mL、5×108 PFU/mLおよび5×107 PFU/mL（5E10、5E8および5E7とも表示する）での力価低下量は同様のレベルで、およそ1.50～1.55（log,PFU）であったが、その他の初期力価レベルは、それぞれ2.02（5×109 PFU/mLの製剤で）および2.07（5×106 PFU/mLの製剤で）低下した。
粒子径は製剤中のファージの量によって有意に影響された。ファージ粉末のDv50は、初期力価を5E10 PFU/mLから5E07 PFU/mLに下げた場合、増大した。5E10 PFU/mLと5E09 PFU/mL間での粒子径の劇的な変化は、おそらく、ストック液由来の残留塩分子の存在のためであった。ストック液は、プロセス中の製剤の結晶化挙動に充分に影響力を有し得る5E10 PFU/mLの製剤では10倍のみに希釈した。Dv50は2.61±0.07μmに減少し、1～5μm粒子のパーセンタイルは67.2±2.42％に改善されたことが見出されたことは有望である（図8）。
異なる二元賦形剤マトリックスに対するバッファー系の影響。バッファー系中の塩分子は、粒子径および場合によってはファージの生存性に影響を及ぼす可能性があるという先の知見に基づいて、この影響を検討するための試験を実施した。どちらもファージを保存するために常套的に使用されることから、PBSおよびSMバッファー（ゼラチンなし）を選択した。製剤の固形分を0.5％（w/v）にし、TFFを-70±5℃で実施した。
図9に、バッファー系の存在がファージ力価に対して有意な保持効果を有することがはっきり実証されている。さらに、影響のレベルは、試験した2つのバッファー系間で異なっていた。一般的に、SMバッファー試料の方がPBSバッファー試料よりファージの生存性の低下が少なかった。賦形剤マトリックスのうち、トレハロース:ロイシンが90:10のものは、最大の力価低下量（バッファーなし試料、4.97±0.14logの力価低下量）および最小の力価低下量（SMバッファー試料、0.19±0.21logの力価低下量）の両方を有する。
PBS含有粉末のDv50は一般的に、各賦形剤マトリックス群においてバッファーなしおよびSMバッファーの対応物のものより小さかった。対照的に、SMバッファー試料の測定結果は有意に高かった（図10）。これはおそらく、SM粉末が、周囲雰囲気に特定の時間量、曝露されると非常に粘着性になったという事実のためである。同様の現象が、いくつかのバッファーなし試料でも観察されたが、PBS試料では全く起こらなかった。この粘着性は、粉末の高い吸湿性により生じたのかもしれない。試験時の現地湿度は75％であった（weather.comによるデータ）。
図9および図10の結果に基づいて、2つの製剤群、トレハロース:ロイシンが90:10のものおよびスクロース:ロイシンが75:25のものを、さらなる試験で検討するために選択した。ファージの生存性は良好に保持されたが、スクロース:ロイシンが90:10のものおよびラクトース:ロイシンが90:10/75:25のものは、この2つの群でのSMバッファー試料の粒子径が、粘着性の結果、高すぎるか、または測定不能のいずれかであったため選択しなかった。
異なるプロセス工程での力価低下。TFFDは、ファージの生存性を損なう可能性がある2つの工程:凍結および乾燥を伴う。各工程での活性低下の程度を知るため、それぞれ凍結後および乾燥後の力価を調べた。図11に示されるように、バッファー系を組み込むことにより、賦形剤の組成に関係なく凍結工程および乾燥工程の両方で力価低下が低減された。ファージは、凍結工程でのPBSバッファー系中で最も多く残存した。ほとんどの力価低下はPBSバッファー試料およびバッファーなし試料の乾燥工程で起こった。対照的に、その他の賦形剤がトレハロース:ロイシンが90:10である場合、SMバッファー試料の乾燥工程では力価低下がみられなかった。
バッファー系は、その凍結プロセス中でのpH安定化能のため、固形製品に常套的に含められる。しかしながら、これは、この場合、ファージが一般的にpHに対して非感受性であり、pHシフトが急速凍結プロセスでは限定的であり得るため、保護機構ではないかもしれない。したがって、保護は、ファージカプシドタンパク質と塩分子との間の分子レベルでの相互作用の結果なのかもしれない。乾燥工程でのバッファー系の保護効果は間接的であり得る。塩分子の存在によって凍結薄膜内の結晶形状が変化し、これによって最終的に異なる乾燥挙動に至った。
幾何学的粒子径分布。幾何学的粒子径は、レーザー回折法を用いて測定した（表1のデータ）。粒子は一般的に、スクロース:ロイシンが75:25の群の方がトレハロース:ロイシンが90:10の群より小さかった。これは、スクロース:ロイシンが75:25の製剤系の方が、ロイシンが15％多いことに起因し得る。バッファー系の添加によって一般的にファージ粉末の粒子径は小さくなった。どちらのPBS含有試料も3μmより小さいDv50を有し、50％超の粒子が1～5μmのサイズ範囲に分類された。しかしながら、この粉末のスパンは、高いDv90のため8より大きかった。対照的に、SM試料でのスパンはすべての試料のうちで最も小さかった。粒子径はトレハロース:ロイシンが90:10のSMバッファー製剤で大きかった。これは、90％のトレハロースによる粉末中への水分吸収の結果かもしれない。
（表１）薄膜凍結乾燥ファージ粉末の幾何学的粒子径分布
Figure 2023522103000002
結晶化度。TFFDファージ粉末の物理的状態を、XRDを用いて評価した（図12）。NaClの特性ピークは、すべてのバッファー含有製剤において、27.8°、32°および45.5°の2θに観察された。NaCl特性ピークに加えて、SMバッファー試料もまた、いくつかの比較的小さいピークを、10.9°、15.7°および21.8°～23.7°、26°、27.5°、39.3°～43°の2θに有する。これらは、バッファー中のその他の成分であるTrisおよびMgSO4による寄与の可能性がある。ロイシンの特性ピークである7°、19.2°および24.6°の2θにおけるピークは、ロイシンが15％多い結果、スクロース:ロイシンが75:25の試料の方が、トレハロース:ロイシンが90:10の試料と比べてよりはっきりしていた。スクロースおよびトレハロースの特性ピークは観察されず、これらがTFFDプロセス後、非晶質になったことを示した。2つのバッファーなし粉末は、ブロードな「ハロー」ピークによって示されるように、非晶質であることが示された。
粉末の形態構造。TFFDファージ粉末の表面の形態構造を、SEMを用いて解析した（図13）。粉末は一般的に高度に多孔質であり、ナノ構造の凝集体の網状組織がすべての試料で観察された。PBS含有試料のサイズ分布は、GPSD測定値における高いスパンによって示されるように、均一性が低かった。SM試料粉末は、その他の群と最も異なっているようであった。その粒子は分枝様構造を示し、細く見える。低倍率の図では、粒子は長い突起を有するようであり、互いに連結していた。SM粉末の表面は網状組織様構造ではなく、より滑らかであり、表面上に小さい「隆起」を有していた。粉末の多孔度は潜在的に該粉末の流動性を改善することができ、該粉末は、肺への分散および衝突時に容易にナノ凝集体に分解される傾向になる。
ファージの形態構造。T7ファージの形態構造は既に充分に特性評価されている。基本的に、このファージは、ロングテールファイバーが結合している比較的短いテールを有する20面体（20個の面）のタンパク質カプシドで構成されている（図14の絵に示されるとおり。
水分含有量および熱分析。TGAを使用してTFFDファージ粉末の熱安定性プロフィールを図示し（図15）、粉末の水分含有量を求めた（図16）。水分含有量は、120℃における重量減少量を確認することにより求めた。現在使用されている方法（10℃/分の速度で35℃から400℃までのランプ制御）の信頼度を、同じ試料を、等温加熱法（10℃/分の速度で35℃から120℃までのランプ制御の後、120℃で10分間保持）で試験することによって確認した。どちらの方法の結果でも有意差は示されなかった（データ非表示）。水分含有量は一般的に、おそらく結晶性塩の存在の結果、バッファー含有試料の方が少なかった。PBS試料に含まれる水分は最小限であり、スクロース:ロイシンが75:25である一例のSM試料で湿分が高かった。
結論。生物活性な吸入可能ファージ粉末を作製するためのTFFD技術の使用の実現可能性が実証された。最適な製剤化により、TFFDによって微粉化粒子を最小限の力価低下で成功裡に得ることができることが証明された。バッファー系の組み込みによってファージ安定性の保持ならびに粒子径のより望ましい範囲への低減が補助されることが実証された。
TFFDは、SD、SFDおよびASFDにおけるノズルの振動によるファージに対する応力が排除されることを考えると、現在開発されている粒子エンジニアリング法の望ましい代替法であり、SDプロセスにおける熱応力が回避された。したがって、薄膜凍結技術を用いたバクテリオファージの吸入可能乾燥粉末の開発は価値のあるストラテジーである。
実施例2-mRNAのエアロゾル化経肺送達のための実験設計による脂質ナノ粒子の開発
A. 材料および方法
1. 材料
DLin-MC3-DMAはBiofine International Inc.,Vancouver,BCから購入した。1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000（DMG-PEG-2000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［アミノ（ポリエチレングリコール）2000（DSPE-PEG 2000）および（デルタ 9 シス）/1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）はAvanti Polar Lipids,AL,USAから購入した。N-（メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル）-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエイタノールアミン（ehtanolamine）（DMPE-PEG 2000）は日油株式会社,東京,日本から購入した。コレステロールはSigma Aldrich,MOから購入した。エタノール（分子生物学用グレード）はDecon Laboratories,Inc.,PAから購入した。CleanCap（登録商標）蛍光強化型緑色蛍光タンパク質（EGFP）mRNAおよびCleanCap（登録商標）ホタルルシフェラーゼ（FLuc）mRNAはTriLink,San Diego,CA,USAから購入した。Slide-A-Lyzer（商標）ガンマ線照射済み透析カセット（10kDa）、Quanit-iT（商標）RiboGreen（登録商標）RNA試薬およびキット（Invitrogen）ならびにOpti-MEM（商標）低血清培地（Gibco）はThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USAから購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（100×）はCorning,Manassas,VA,USAから購入した。Balb/cマウスはCharles River Laboratories,Inc,Wilmington,MA,USAから購入した。
2. 方法
LNP製剤の調製。EGFP mRNAまたはFLuc mRNAを含む脂質ナノ粒子を、水相（100mMの酢酸ナトリウム クエン酸バッファー,pH3.0中に希釈したmRNA）と、エタノールおよび各製剤（表2）に従う脂質を含む有機相とを、マイクロ流体ミキサー（Precision Nanosystems,Canada;Leung et al.,2015）を用いて合わせることにより調製した。調製後、LNP製剤を1×PBS（pH7.4）中に2時間、10K MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific,MA）にて透析した。
サイズおよびゼータ電位の測定。LNP製剤のサイズおよびゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments MA）を使用することによって特性評価した。各製剤は、サイズ測定では0.1×PBSバッファー中に10倍希釈し、ゼータ電位の測定では0.1×PBS中に40倍希釈した。動的光散乱を希釈試料に対して25℃で173°を用いて行ない、報告したz-平均直径は3つの測定値の平均である。
mRNA封入効率。mRNA封入効率を、ローレンジQuanti-iT RiboGreen RNA試薬アッセイ（Thermo Fisher Scientific,MA）によって評価した。各LNP試料をTEバッファー中に0.2ng/μLのmRNA濃度まで希釈した。各LNP希釈標準溶液のアリコートを、96ウェルプレート内で、TEバッファー中1:1（未封入mRNAの測定）または4％のTriton-X100を含むTEバッファー中1:1（全mRNA-LNP内に封入されたmRNAと未封入の遊離mRNAの両方の測定）にさらに希釈した。試料は二連で調製し、100μLの2000倍希釈Quanti-iT（商標）RiboGreen RNA試薬を各試料に添加し、蛍光強度をプレートリーダーにより、それぞれ480nmおよび520nmの励起波長および発光波長で測定した（Infinite M200,Tecan,Switzerland）。
TNSアッセイ。2.5～11の範囲のpH（pH 2.5、pH3、pH3.5、pH4、pH4.6、pH5、pH5.5、pH5.8、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11）を有する一連のバッファーを、10mM HEPES、10mM MES、10mM酢酸アンモニウム、130mM NaClからなるバッファー溶液のpHを1N HClで調整することによって調製した。また、90μLの各バッファー溶液を96ウェルプレートに添加した。2μLのTNSストック液（DMSO中300μM）を、この96ウェルプレート内の異なるpHのバッファー溶液に添加した。次いで、3μLのLNP溶液（mRNAを用いて調製）を上記の混合物に添加した。蛍光強度を325nmの励起波長および435nmの発光波長で測定した。蛍光強度をpH値に対してプロットし、3パラメータロジスティック方程式（GraphPad Prism v.6,GraphPad Software）を用いてフィットさせた。最大蛍光の半分に達するpH値をLNP製剤のpKaとみなした。
LNP製剤のエアロゾル化。振動型メッシュ式ネブライザは剪断感受性製剤、例えばリポソームおよびニオソームをエアロゾル化するために使用することができ、したがってエアジェット式および超音波式ネブライザの良好な代替品となることが示されている（Wagner et al.,2006;Elhissi et al.,2013）。LNP製剤を、振動型メッシュ式ネブライザであるAerogen Solo（Aerogen Ltd,Galway Ireland）に添加し、続いてエアロゾルを、事前に冷却したチューブ内での凝縮によって捕集した。
細胞培養。HEK-293細胞を、10％FBSおよび1％のペニシリン ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて培養した。NuLi-1細胞（ATCC CRL-4013）を、60μg/mLのヒト胎盤のIV型コラーゲン（Sigma Aldrich,MO）の溶液でプレコートされたフラスコ内で培養し、LonzaのSingleQuot添加因子（BEGM Bullet Kit,照会CC-3170）および50μg/mL G-418が補給された気管支上皮細胞増殖用培地（BEGM）中で増殖させた。細胞株はすべて、単層培養物として37℃および5％CO2で維持した。
インビトロ細胞内取込み。細胞を96ウェルプレート内に12,500個の細胞/ウェルの細胞密度で播種し、37℃および5％CO2で24時間増殖させた。次いで、10ngのEGFP mRNA/μLの濃度の10μLのLNPを、0.2mLの細胞培養培地中の細胞に24時間添加した。その後、細胞培養培地を除去し、細胞を1×PBSで洗浄した。細胞を剥離するため、100μLの0.25％トリプシン-EDTA溶液を各ウェルに添加し、37℃で8～10分間インキュベートした。次に、100μLの1％FBS含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞を125×gで5～10分間スピンし、上清みを廃棄した。細胞を0.25μLのヨウ化プロピジウム（PI）（1mg/mL）を有する50μLの1×PBSの溶液中に再懸濁させた。GFP発現細胞パーセント（すなわち、トランスフェクション効率）および蛍光強度をフローサイトメトリーによって解析した。
インビボトランスフェクション。動物プロトコルはすべて、テキサス大学オースティン校の動物実験委員会によって承認された。Balb/cマウス（雌、6～8週齢）を2％イソフルランの連続フロー下で麻酔し、PBS中1.5μgのFLuc mRNA/μLを含むおよそ50μLのLNPを気管内投与した。6時間後、マウスにD-ルシフェリン溶液（30mg/ml）を150mgルシフェリン/kg体重に達するまで腹腔内（i.p.）注射した。15分間後、マウスを致死させ、肺を注意深く収集し、In Vivo Imaging System（IVIS）により、生体発光設定および60秒の露光時間を用いてイメージングした。発光の定量（放射輝度［p/秒/cm2/sr］で）を、Living Image 4.3ソフトウェア（PerkinElmer）を用いて行なった。
統計解析。統計解析はJMP 13を用いて行なった。データの値は平均±標準偏差（SD）として表示する。必要な場合は、一元配置分散分析（一元配置ANOVA）またはスチューデントのt検定を行なった。＊p値≦0.05、＊＊p値≦0.01、＊＊＊p値≦0.001および＊＊＊＊p値≦0.0001を統計学的に有意とみなした。
B. 結果および考察
1. 結果
LNP製剤の有効性に対するN/P比の効果。細胞内取込みに対するN/P比の効果を検討するため、EGFP mRNAを封入している6つのLNP製剤を、N/P比を6～200で変化させることによって調製した。LNP製剤は、DLin-MC3-DMA、ホスファチジルコリン（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、DSPC）、コレステロールおよびPEG-脂質（ポリエチレングリコール-ジミリストール（myristol）グリセロール、PEG-DMG）がそれぞれ50:10:38.5:1.5の単一のモル比で構成した（Jayaraman et al.,2012に既報のとおり）。異なるN/P比（N/P＝6、15、30、50、100および200）は、mRNA（10ng/μl）に添加する脂質組成物の相対量を変えることによって得た。LNPを調製し、各製剤の細胞内取込みをHEK-293細胞において、フローサイトメトリーにより評価した。図17に示されるように、N/P比＝15を有するLNP製剤で、最も高いGFP発現パーセントと最も高い平均蛍光強度の両方が示された。細胞内取込みは、N/P比が15から200に増大するにつれて減少した。以下の実験でN/P比＝15を維持し、この特定の製剤を後続の実験では「参照製剤」として使用する。
DOE:制約を伴う混合実験設計。LNPは一般的に4種類の脂質成分:イオン化脂質、リン脂質、PEG-脂質およびコレステロールからなる。脂質の型および量の違いはLNP製剤のトランスフェクション有効性に影響を及ぼし得る（Kauffman et al.,2015）。各LNP製剤の有効性に対する製剤組成の効果を検討するためのいくつかの試験では、一度に1因子のみ変更する（one-factor-at-a-time）設計が使用されている（Belliveau et al.,2012;Akinc et al.,2009）。しかしながら、このアプローチでは組成物パラメータ間の二次相互作用の可能性が考慮されておらず、これにより、LNP製剤の最適化にはあまり望ましくないものとなっている。あるいはまた、一部実施要因計画が、mRNA送達のためのLNP製剤の効力を最大限にするために使用されている（Kauffman et al.,2015）。この方法では二次効果が検討されるが、すべての変数を設計に含めることができるわけではないという事実が大きな制限となっている。LNP製剤の効力に対する変数の効果を体系的に検討するため、本試験では制約を伴う混合設計を使用した（表2）。JMPソフトウェアを使用し、試験用の18種類のLNP製剤の設計を作製した（表3）。
（表２）実験設計スペースの限界値
Figure 2023522103000003
（表３）LNP製剤の組成
Figure 2023522103000004
mRNA-LNPの特性評価。制約を伴う混合設計に基づいて、N/P比＝15を有する18種類の製剤を、NanoAssemblr（登録商標）ベンチトップシステムを用いて調製した。LNPのサイズおよびゼータ電位をDLSによって評価した。図18Aに示されるように、霧化前のLNP製剤の粒子径は35.7±1.1nm（F14）から120.9±3.4nm（F8）までさまざまであり、一方、ゼータ電位は-12.2±5.5mV（F3）～18.8±1.2mV（F13）の範囲であった（図18B）。さらに、LNP製剤のサイズおよびゼータ電位は、すべての製剤のサイズおよび表面電荷が少なくとも2週間安定なままであることが示された4℃で14日間の保存後、有意な変化は示されなかった（図18Aおよび18B）。製剤の封入効率をRiboGreenアッセイによって評価した。49％の封入効率を示したF12以外、ほとんどの製剤が80％超の高い封入効率を有した（図18C）。LNPのpKaは、エンドソームからの脱出に極めて重要であり得、遺伝子治療のインビボ有効性の相関因子として関与していることが以前に報告されている（Jayaraman et al.,2012）。したがって、EGFP mRNAが負荷されたLNPのpKa製剤を、TNSアッセイを用いて測定し、pKaは5.74（F15）～6.11（F14）の範囲であった（図18D）。
LNP製剤を臨床使用のために変換するためには、これは、有意な不安定性を伴うことなく経肺送達のためにエアロゾル化できなければならない。その目的のため、LNP製剤に対する霧化の効果を検討し、霧化後も高いインビトロ細胞内取込みを保持している製剤を特定した。LNP製剤をAerogen Soloネブライザによってエアロゾル化し、霧化された各製剤の効力をヒト胎児腎HEK-293細胞株およびヒト気管支上皮細胞NuLi-1細胞株において評価した。霧化後、LNP製剤のサイズは100.9nm（F12）～1480.7nm（F7）の範囲であり、霧化前のLNP製剤と比べて有意な増大が示されたが、ゼータ電位は、すべての製剤で有意な変化は示されなかった（図19A～19C）。霧化するとF8が最も小さいサイズ変化を有し、霧化後、F7が最も大きいサイズ変化を示したことは注記に値する。霧化後、LNP製剤の封入効率は有意に低下し、これは、霧化プロセス時にmRNAがLNPから漏出する可能性があることを示した。霧化されたLNP製剤の封入効率は15.5％（F12）～79.9％（F17）の範囲であった。
HEK-293細胞およびNuLi-1細胞内へのLNP製剤の細胞内取込み。霧化前および霧化後のLNP mRNA製剤の細胞内取込みを、フローサイトメトリーを用いて、HEK-293細胞およびNuLi-1細胞株におけるGFP発現パーセントおよび蛍光強度を測定することによって評価した。0日目（すなわち、製剤の調製と同日のインキュベーション）、各mRNA封入製剤の細胞内取込みをHEK-293細胞において測定し、参照製剤（DLin-MC3-DMA:DSPC:コレステロール:PEG-DMG＝50:10:38.5:1.5、N/P＝15）より高度のトランスフェクションを示す製剤を特定した。F5、F12およびF13以外、ほとんどの製剤が50％超のGFP発現を示すことがわかった。注目すべきことに、ほとんどの製剤は比較的高いGFP発現パーセントを有していたが、蛍光強度に置き換えた細胞内取込みは製剤間で異なっていた。18種類の製剤のうちの8種類（F2、F3、F4、F6、F8、F11、F15およびF17）は、0日目にHEK-293細胞において6708 a.u.の平均蛍光強度を示した参照製剤と比べて有意に高い蛍光強度を示した。これらの8種類の製剤のGFP発現パーセントは95％を超えるという高いものであり、参照製剤と比べた場合、有意差は示されなかった。次に、LNPの安定性（すなわち、未成熟mRNAの漏出がない）を、0、5、12および16日間の冷蔵保存後の細胞内取込みを定量することによって試験した。図20Aに示されるように、8種類の製剤（F2、F3、F6、F8、F10、F11、F15およびF17）は、4℃で16日間の保存後、GFP発現パーセントの観点から安定なままであった。対照的に、すべての製剤の蛍光強度は、4℃で5日間の保存後、有意に低下した（図20B）。具体的には、F2、F3、F6、F8、F11、F15およびF17で、16日間の保存後、参照製剤より有意に高い18,000 a.u.超の蛍光強度が示された。
霧化されると、すべてのLNP製剤が、HEK-293細胞およびNuLi-1細胞の両方において、霧化前のLNP製剤と比べて有意な蛍光強度の低下を示した。この知見は、エアロゾル化プロセスによってmRNAのインビトロトランスフェクションがマイナスの影響を受けたことを示す。F2、F3、F8、F11およびF17は、GFP発現パーセントの観点から霧化後、霧化前のLNPと比べて有意な変化を示さないことがわかった（図21Aおよび21C）。すべてのLNP製剤で蛍光強度の有意な低下が観察されたにもかかわらず、前述の5つの製剤は、霧化しても比較的高い蛍光強度（3000 a.u.超）が維持された（図21Bおよび21D）。NuLi-1細胞において、F2、F8、F11およびF17は、霧化するとGFP発現パーセントおよび蛍光強度の低下を示したが、これらの4つの製剤は依然として、他の製剤と比べて比較的高いGFP発現（50％超）および蛍光強度（1000 a.u.超）を示した。要約すると、16日間の保存および霧化後に比較的高い細胞内取込みを有する4つの製剤（F2、F8、F11およびF17）を特定した。
マウスへのLNP製剤の気管内送達。インビトロ細胞内取込みに基づいて、4つのリード製剤（F2、F8、F11およびF18）をインビボでのさらなる試験用に選択した。具体的には、ホタルルシフェラーゼ（Luc）mRNAをこれらのLNP製剤内に負荷し、Aerogen Soloネブライザによって霧化した。捕集された霧化分散体を、マウスの肺への気管内注入投与を用いて霧化前対照と比較し、インビボトランスフェクションおよび生体内分布を検討した。投与から6時間後、ルシフェラーゼ活性は、この4つのリード製剤で、霧化プロセスに関係なく他の器官と比べて肺内で主に検出された（図22）。興味深いことに、霧化前のLNP製剤または霧化されたLNP製剤のいずれかを投与されたマウス間で発光強度に統計学的有意差はみとめられず、これにより、候補製剤は霧化後もその機能を保持していることが示された。
2. 考察
本研究は、mRNAのエアロゾル型送達に適したLNP製剤を見出すためのDOEアプローチを強調する。DOEを使用し、種々の脂質組成の18種類の製剤を調製し、物理化学的特性および細胞内取込みの観点から特性評価した。霧化前および霧化後で比較的高い細胞内取込みを有する4つのリード製剤を特定し、マウスに気管内送達し、このとき、これらの製剤は、霧化前および霧化後においてインビボで肺へのmRNA送達能を示した。製剤の詳しい統計解析により、ナノ粒子の安定性および細胞内送達に影響する特定のパラメータの同定が補助された。
LNP製剤の組成は自身の霧化前および霧化後の物理化学的特性（サイズ、ゼータ電位および封入効率）に影響した。霧化前の分散体は、使用されるPEG-脂質のモル比に依存性である粒子径を有することがわかった。このような霧化前の製剤において、使用されるPEG-脂質の型は粒子径に有意な様式で影響しないようであった。対照的に、霧化された分散体は、製剤に使用されるPEG-脂質の型によって有意に影響された。このような観察結果を以下に論考する。
LNPのサイズと各LNP成分との間の相関性を探索するため、霧化前および霧化後のLNPのサイズを各成分に対してプロットし、オルトゴナル傾向を解析した。その他の製剤パラメータに関係なく、霧化前のLNP製剤のPEG-脂質のモル組成の増大に伴うサイズ縮小の統計学的に有意な（p＜0.05）傾向が観察された（図23A）。サイズは、製剤の他の成分とは、モル量の観点で有意に相関しなかった。PEG化されたリポソームは慣用的なリポソームと比べて有意なサイズの縮小を示し、DSPE-PEGの総量の増加によってリポソームサイズの縮小がもたらされたという同様の知見が報告されている（Kontogiannopoulos et al.,2014;Sriwongsitanont and Ueno,2004）。この知見に対する考えられ得る説明は、PEG-脂質の濃度の増大に伴って頭部基周囲の広範な水和により脂質二重層の表面の側方反発力が増大するという事実のためである可能性がある（Akinc et al.,2009）。高い側方反発力を低減させるためには、粒子径が縮小しなければならず、続いて、これによりグラフティング（grafting）表面の曲率が大きくなる（Sriwongsitanont et al.,2004）。対照的に、本明細書において示されるように、霧化後の製剤では、PEG-脂質のモル量の増大に伴って粒子径の統計学的に有意な増大が観察された（図23C）。これは、おそらく、PEG-脂質のモル比ではなく製剤に使用されるPEG-脂質の型のためである。PEG-脂質の型によって再配列した図23Cのデータ（図23D）から、DSPE-PEGを有する製剤は、その他の2つの型のPEG-脂質を有する製剤と比べて大きなサイズを示し、これにより、PEG-脂質の型は霧化後のLNPのサイズに有意に影響することが示された（図23D）。このような結果により、DSPE-PEGを用いて作製された製剤は、エアロゾル化プロセス後に自身のサイズを維持する能力が不充分であることが示された。
また、霧化前および霧化後の両方の製剤のゼータ電位もまた、主として、選択されるPEG-脂質の型によって駆動された。その他の製剤パラメータに関係なく、霧化前のLNP製剤または霧化されたLNP製剤のいずれかのPEG-脂質のモル比の増大に伴うLNPゼータ電位の増大の統計学的に有意な傾向が観察された（図24Aおよび24C）。しかしながら、この有意な傾向は主として、使用されるPEG-脂質の型と関係しており、このとき、DSPE-PEGを有する製剤は、エアロゾル化プロセスに関係なく高いゼータ電位を示したことは注記に値する（図24Bおよび24D）。
封入効率に関して、ほとんどすべての製剤で高い封入効率が得られた。コレステロールのモル比の漸増により、霧化前のLNPの封入効率の統計学的に有意な増大がもたらされることがわかった（図25A）。これにより、構造的コレステロールはエアロゾル化前のLNP製剤の封入効率に重要な役割を果たすが、使用されるリン脂質の型は霧化前に有意な効果を示さないことが示された（図25B）。Li et al.により、コレステロールのモル比が高い脂質様ナノ粒子は高いmRNA封入効率を有したことが報告されている（Li et al.,2015）。しかしながら、霧化後は、コレステロールのモル量ではなくリン脂質の型が、封入効率に有意に影響する唯一の要因となった（図25Cおよび25D）。DOPEを有するLNP製剤は、DSPCまたはDPPCのいずれかを有するLNP製剤と比べて有意に高い封入効率を示した（図25D）。この知見により、DOPEを含めることにより、LNPがエアロゾル化プロセス中にmRNAの漏出を抑制する能力を有意に向上させることができることが示された。
PEG-脂質のモル比は霧化前および霧化後のLNPの細胞内取込みにマイナスに影響した。mRNA負荷LNPの製剤は、例えばトランスフェクション効率およびナノ粒子安定性といったいくつかの性能の測定値のバランスがとれていなければならない。この試験で開発した製剤には、PEG-脂質を使用し、ナノ粒子の分散に対する物理的安定性を付与した。しかしながら、PEG化はトランスフェクション効率に有意に影響を及ぼし得ることが示されている（Otsuka et al.,2003;Mishra et al.,2004;Osman et al.,2018）。ここで、PEG-脂質のモル比は、霧化前および霧化後の両方のLNPの細胞内取込みに有意に、かつマイナスに影響した。
具体的には、PEG-脂質のモル比の増大は、HEK-293細胞（図26Aおよび26C）ならびにNuLi-1細胞（データ非表示）において、霧化前のLNPの細胞内取込みにマイナスに影響した。その他の製剤パラメータに関係なく、PEG-脂質のモル分率の増大に伴うGFP発現パーセントおよび蛍光強度の低下の統計学的に有意な傾向が観察された;この知見は以前の報告（Otsuka et al.,2003;Mishra et al.,2004）と整合した。また、リン脂質の型はGFP発現パーセントに有意に影響した。DSPCを有するLNP製剤は、DOPEまたはDPPCのいずれかを有するLNP製剤と比べて有意に低いGFP発現パーセントを示すことが観察され（図26B）、以前の報告（Kauffman et al.,2015）と整合する観察結果であった。霧化されると、PEG-脂質のモル比の増大により、HEK-293（図26Dおよび26F）ならびにNuLi-1細胞（データ非表示）において同じ傾向の観察がもたらされたが、GFP発現パーセントに対するリン脂質の型の有意な効果はみとめられなかった（図26E）。
霧化前および霧化後における物理化学的特性と細胞内取込みとの間の相関性。物理化学的特性とLNP製剤の効力との間の相関性を探索するため、サイズ、ゼータ電位、封入効率およびpKaをHEK-293細胞における細胞内取込みおよび蛍光強度に対してプロットした。粒子径が大きいとGFP発現パーセントおよび蛍光強度が高いという有意な傾向が観察されたため（図27A）、大きな粒子径を有するLNP製剤ほど、霧化前において高いGFP発現パーセントおよび蛍光強度を示す（図27Aおよび27C）ことがわかった。さらに、霧化前の製剤は、ゼータ電位が高いほど、低い蛍光強度を示した（図27D）。霧化後、pKaは、pKaが小さいほど高いGFP発現パーセントがもたらされるという、GFP発現パーセントに影響を及ぼす重要なパラメータのようであった（図27F）が、他のパラメータは、細胞内取込みに対して有意な効果を示さなかった。
結論。エアロゾル遺伝子送達のためのLNPの製剤のインビトロ性能は脂質組成によって有意に影響される。製剤送達のためのDOEアプローチを使用し、霧化前および霧化後において比較的高い細胞内取込みを有する4つのリード製剤を特定し、続いてインビボで試験した。これらの製剤は、マウスに気管内送達すると、霧化前および霧化後の両方においてインビボで肺へのmRNAの送達能を示した。製剤の詳しい統計解析により、ナノ粒子の安定性および細胞内送達に影響する特定のパラメータの同定が補助された。DSPE-PEGは、霧化後、DMG-PEGおよびDMPE-PEGを有する製剤と比べて有意に高い凝集体レベルがみられたため、LNPナノ粒子の安定性のマイナス要因であった。また、PEG-脂質のモル比およびDSPCリン脂質はLNPの細胞内取込みに有意に、かつマイナスに影響することがわかった。このアプローチにより、mRNAの有効なエアロゾル型送達を容易にするために最適な特性を有するLNP製剤を、より迅速かつ容易に特定することができる。本研究は、肺疾患の処置に向けたmRNAの送達に焦点を当てたが、DOEストラテジーは、異なる適応症のための核酸医薬の送達向上を促進させるLNPの組成および特性を見出すために広く適用することができよう。
C. さらなる比較例
1. 材料
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン（DODAP）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［アミノ（ポリエチレングリコール）2000（DSPE-PEG 2000）および（デルタ9シス）/1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）はAvanti Polar Lipids,AL,USAから購入した。N-（メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル）-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエイタノールアミン（DMPE-PEG 2000）は日油株式会社,東京,日本から購入した。コレステロールはSigma Aldrich,MOから購入した。エタノール（分子生物学用グレード）はDecon Laboratories,Inc.,PAから購入した。EGFP受容体を伴うEdit-R Cas9 Nuclease mRNA（照会CAS11860）はHorizon Discovery Dharmacon Inc.,Chicago,IL,USAから購入した。Slide-A-Lyzer（商標）ガンマ線照射済み透析カセット（10kDa）、Quanit-iT（商標）RiboGreen（登録商標）RNA試薬およびキット（Invitrogen）ならびにOpti-MEM（商標）低血清培地（Gibco）はThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USAから購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（100×）はCorning,Manassas,VA,USAから購入した。
2. 方法
LNP製剤の調製。Edit-R Cas9 Nuclease mRNAを含む脂質ナノ粒子を、水相（50mMの酢酸ナトリウムクエン酸バッファー,pH4.0中に希釈したmRNA）と、エタノールおよび各製剤（表1）に従う脂質を含む有機相とを、マイクロ流体ミキサー（Precision Nanosystems,Canada;Leung et al.,2015）を用いて合わせることにより調製した。流量比は3:1（水相:有機相）にし、窒素対リン（N/P）比は6にした。調製後、LNP製剤を1×PBS（pH7.4）中に2時間、10K MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific,MA）にて透析した。
サイズおよびゼータ電位の測定。LNP製剤のサイズおよびゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments MA）を使用することによって特性評価した。各製剤は、サイズ測定では0.1×PBSバッファー中に10倍希釈し、ゼータ電位の測定では0.1×PBS中に40倍希釈した。希釈試料に対して動的光散乱を25℃で173°を用いて行ない、報告したz-平均直径は3つの測定値の平均である。
mRNA封入効率。mRNA封入効率を、ローレンジQuanti-iT RiboGreen RNA試薬アッセイ（Thermo Fisher Scientific,MA）によって評価した。各LNP試料をTEバッファー中に0.2ng/μLのmRNA濃度まで希釈した。各LNP希釈標準溶液のアリコートを、96ウェルプレート内で、TEバッファー中1:1（未封入mRNAの測定）または4％のTriton-X100を含むTEバッファー中1:1（全mRNA-LNP内に封入されたmRNAと未封入の遊離mRNAの両方の測定）にさらに希釈した。試料は二連で調製し、100μlの2000倍希釈Quanti-iT（商標）RiboGreen RNA試薬を各試料に添加し、蛍光強度をプレートリーダーにより、それぞれ480nmおよび520nmの励起波長および発光波長で測定した（Infinite M200,Tecan,Switzerland）。
細胞培養。HEK-293細胞を、10％FBSおよび1％のペニシリンストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて培養した。NuLi-1細胞（ATCC CRL-4013）を、60μg/mLのヒト胎盤のIV型コラーゲン（Sigma Aldrich,MO）の溶液でプレコートされたフラスコ内で培養し、LonzaのSingleQuot添加因子（BEGM Bullet Kit,照会CC-3170）および50μg/mL G-418が補給された気管支上皮細胞増殖用培地（BEGM）中で増殖させた。細胞株はすべて、単層培養物として37℃および5％CO2で維持した。
インビトロ細胞内取込み。細胞を96ウェルプレート内に12,500個の細胞/ウェルの細胞密度で播種し、37℃および5％CO2で24時間増殖させた。次いで、10ngのEGFP mRNA/μLの濃度の10μLのLNPを、0.2mLの細胞培養培地中の細胞に24時間添加した。その後、細胞培養培地を除去し、細胞を1×PBSで洗浄した。細胞を剥離するため、100μLの0.25％トリプシン-EDTA溶液を各ウェルに添加し、37℃で8～10分間インキュベートした。次に、100μLの1％FBS含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞を125×gで5～10分間スピンし、上清みを廃棄した。細胞を0.25μLのヨウ化プロピジウム（PI）（1mg/mL）を有する50μLの1×PBSの溶液中に再懸濁させた。GFP発現細胞パーセント（すなわち、トランスフェクション効率）および蛍光強度をフローサイトメトリーによって解析した。
3. 結果
制約を伴う混合設計に基づいて、N/P比＝6を有する20種の製剤を、NanoAssemblr（登録商標）ベンチトップシステムを用いて調製した（表4）。
（表４）LNP製剤の組成
Figure 2023522103000005
mRNA-LNPの特性評価。LNPのサイズおよびゼータ電位を動的光散乱（DLS）（Zetasizer Nano,Malvern Instruments,MA）によって評価した。サイズおよびゼータ電位の測定は0.1×PBS中、25℃および173°の散乱角で行なった。図28Aに示されるように、1日目のLNP製剤の粒子径は83.3±14.7nm（F8）から416.30±41.1nm（F17）までさまざまであったが、ゼータ電位は-43.95±4.75mV（F3）～11.7±1.4mV（F20）の範囲であった（図28B）。しかしながら、LNP製剤のサイズおよびゼータ電位は、4℃で7日間の保存後に変化が示され、いくつかの製剤で、粒子径は増大し、ゼータ電位は変化した（図28Aおよび28B）。製剤の封入効率をRiboGreenアッセイにより、製造業者のプロトコル（Thermo Fisher Scientific,MA）に従って評価した。半数の製剤は80％超の高い封入効率を有しており（F3、F4、F9、F10、F11、F13、F15、F17、F18およびF20）、F16では70.28％の封入効率が示された。しかしながら、その他の製剤では50％またはそれより低い封入効率が示された（図28C）。
HEK-293細胞およびNuLi-1細胞内へのLNP製剤の細胞内取込み。24時間後のLNP mRNA製剤の細胞内取込みを、フローサイトメトリーを用いて、HEK-293細胞およびNuLi-1細胞株におけるGFP発現パーセントおよび蛍光強度を測定することによって評価した。すべての製剤で、示されるGFP発現は2％未満であることがわかった（図29Aおよび29B）。注目すべきことに、ほとんどの製剤は比較的低いGFP発現パーセントを有していたが、蛍光強度に置き換えた細胞内取込みは製剤間で異なっていた。F3は、HEK-293細胞においてF2、F14およびF17と比べて有意に高い蛍光強度を示した（図29C、p＜0.05）が、NuLi-1細胞において試験した場合、蛍光強度に有意差は示されなかった（図29D）。
実施例3-PEG化キトサン/CRISPR-Cas9および薄膜凍結による経肺送達のための脂質ナノ粒子-mRNA粉末の開発
A. 材料および方法
1. 材料
ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルMW 5000 kDa、マンニトール、スクロース、トレハロースおよびロイシンはSigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）から購入した。低分子量キトサンMW 15 kDaはPolysciences Inc.,USA.から入手した。ヌクレアーゼフリー水、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Opti-MEMおよびジエチルエーテルはThermo Fisher Scientific Inc.（Waltham,MA,USA）から入手した。pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）はFeng Zhang氏から提供された（Addgeneプラスミド番号48138;http://n2t.net/addgene:48138;RRID:Addgene＿48138;Ran et al.,2013）。
2. 方法
TFFによる吸入用乾燥粉末の調製。異なる濃度（10～0.1％w/v）のマンニトール、スクロースまたはトレハロースおよび0.3％のロイシンを、既報の方法（Zhang et al.,2018）によって調製したPEG化キトサン/DNAナノ複合体内で混合した。フルオレセインナトリウム塩（0.02％）を、インビトロでの空気動力学的性能評価のために製剤に添加した。およそ15μLの液体を、液体窒素によって冷却した回転式極低温冷却（-70℃）ステンレス鋼ドラムの上部10 cmの高さから滴下した。凍結された試料を、液体窒素を充填したステンレス鋼容器内に捕集し、-80℃のフリーザー内に移して余分な液体窒素を除去した。VirTis Advantage Lyophilizer（VirTis Company Inc.,Gardiner,NY）を用いて水分を除去した。試料を一次乾燥のために-40℃で40時間維持し、650分間かけて温度を25℃までゆっくり上げ、次いで、25℃でさらに6時間維持し、二次乾燥のために乾燥させた。乾燥プロセス中、圧力を300mTorrに維持した。また、4つの脂質ナノ粒子乾燥粉末製剤を、マンニトール、スクロースおよびトレハロースを20％（w/v）の濃度で用いて製剤化した。
サイズおよびゼータ電位の測定。乾燥粉末製剤を滅菌ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。再構成製剤の流体力学的直径およびゼータ電位を三連で、Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments,UK）により25℃で測定した。簡単には、測定前に、20μLのナノ複合体を80μLのpH5.5の酢酸ナトリウムバッファーに添加し、充分に混合した。
幾何学的粒子径分布の測定。精製乾燥粉末製剤の幾何学的粒子径分布をHELOSレーザー回折装置（Sympatec GmbH,Germany）により、RODOS分散機を3バールで用いて評価した。粉末分散後、10ms毎に測定値を得た。5～25％の範囲の光学密度での測定値を平均し、幾何学的粒子径分布を求めた。
走査型電子顕微鏡法（SEM）。6つの精製乾燥粉末製剤の表面の形態構造をSEM（Zeiss Supra 40 VP SEM、Carl Zeiss Microscopy GmbH,Jena,Germany）によって評価した。乾燥粉末試料をアルミニウムSEMスタブ上にマウントし、カーボンテープでカバーし、12nmの白金/パラジウム（Pt/Pd）をCressingtonスパッターコーター208HR（Cressington Scientific Instruments Ltd.,Watford,U.K.）によってスパッターコーティングした後、画像収集した。
粉末X線回折。CSP7の結晶化度を、X線回折計（MiniFlex 600,Rigaku Co.,Japan）により、周囲条件下で確認した。粉末をガラススライド上に置き、散乱強度を5～40°の2θ（0.025°のステップサイズ、2°/分、15mAおよび40 kVのCu Kα線）で収集した。結晶化度を解析し、Jade 9ソフトウェア（KS Analytical Systems,Aubrey,TX）によって計算した。
次世代インパクター（NGI）による空気動力学的粒子径分布。インビトロ空気動力学的性能を次世代インパクター（NGI、MSP Corporation,MN,USA）によって検出した。乾燥粉末を、Capsugel Inc.（Morristown,NJ,US）から提供されたサイズ3のヒプロメロース（HPMC）カプセル内に負荷した。乾燥粉末製剤をMonodose RS01高抵抗DPI（Plastiape,Osnago,Italy）またはSpiriva HandiHalerによりエアロゾル化した。エアロゾルは、4秒間で4 Lの吸入容量が得られる60 L/分の気流速度で作製した。圧力はHigh Capacity Pump（型番HCP5,Copley Scientific,Nottingham,UK）によって発生させ、Critical Flow Controller（型番TPK 2000,Copley Scientific,Nottingham,UK）によって制御した。各作業の前に、NGIプレートを1％のグリセロール含有エタノールでコーティングし、風乾させた。各乾燥粉末試料は三連で作業した。エアロゾル化後、カプセル、デバイス、導入ポート（IP）およびステージ1～MOCに沈着した乾燥粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4中に溶解させ、Tecan Infinite1 200 PROマルチモードマイクロプレートリーダー（Tecan Systems,Inc.,San Jose,CA,USA）によって測定した。幾何標準偏差（GSD）、空気動力学的質量中央径（MMAD）および細粒分％（FPF％）を計算し、解析した。FPF％は、放出量または定量で5.0μm未満または3.0μmの乾燥粉末の質量分率と定義した。
真密度。真密度はMultipycnometer（Quantachrome Instruments,Boynton Beach,FL）により、読み値の0.03％以内まで正確なヘリウムを置換ガスとして用いて測定した。
ブルナウアー・エメット・テラー（BET）比表面積（SSA）分析。乾燥粉末のSSAをMonosorb迅速表面積分析装置 型番MS-21（Quantachrome Instruments,Boynton Beach,FL）により、BET一点法によって解析した。試料を、窒素ガスを用いて20 psiで37℃にて一晩ガス抜きし、表面不純物を除去した。窒素/ヘリウム（30:70 v/v）混合物を吸着ガスとして使用した。
トランスフェクション効率。DNAプラスミド（pSpCas9（BB）-2A-GFP）およびLNP-mRNAのトランスフェクション効率をHEK293細胞において評価した。簡単には、5×103のHEK293細胞を96ウェルプレートの各ウェル内の100μLのDMEM培地中に播種し、完全な付着が可能となるように24時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、Opti-MEM低血清培地を細胞に添加した。10μLの再構成製剤を、異なるpH6.5を有する培地中で培養された細胞に添加した。24時間のインキュベーション後、トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって評価した。
LNP製剤の調製。蛍光強化型緑色蛍光タンパク質（EGFP）mRNAを含む脂質ナノ粒子を、水相（100mMの酢酸ナトリウムクエン酸バッファー,pH3.0中に希釈したmRNA）と、エタノールおよび各製剤（表5）に従う脂質を含む有機相とを、マイクロ流体ミキサー（Precision Nanosystems,Canada;Leung et al.,2015）を用いて合わせることにより調製した。調製後、LNP製剤を1×PBS（pH7.4）中に2時間、10K MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific,MA）にて透析した。
（表５）LNP製剤の組成
Figure 2023522103000006
統計解析。統計解析はJMP 13を用いて行なった。実験はすべて、三連で行なった。データの値は平均±標準偏差（SD）として表示する。必要な場合は、スチューデントのt検定または一元配置分散分析（ANOVA）を行なった。＊p値＜0.05を統計学的に有意とみなした。
3. 結果
実験設計および乾燥粉末製剤の外観。3種類の凍結保護剤（マンニトール、スクロースおよびトレハロース）および1種類の分散向上剤（ロイシン）を使用し、乾燥粉末ナノ複合体をTFFによって調製した。各凍結保護剤の最適な濃度をスクリーニングするため、7つの異なる濃度（10％、5％、3％、1％、0.5％、0.25％および0.1％;w/v）の各凍結保護剤ならびにPEG化キトサン/DNAナノ複合体（50ng/μlのDNA）を含む製剤を、0.3％のロイシンあり、またはなしで調製した（表6）。この実験設計に基づいて、42種類の製剤をTFFによって調製し、各DPI製剤の外観を図30に示した。製剤はすべて概して、薄膜乾燥粉末のフレークの外観を有した（図30）。凍結保護剤の量が少ない製剤では、フレークは視認可能により小さく、および/またはより脆かった。また、ロイシンを含む製剤は、ロイシンなしの製剤と比べて外観が視認可能に異なっており、薄膜は膜構造を維持していた。具体的には、Man DPI製剤では、ロイシンにより、低マンニトール濃度であっても、該製剤が元の円板様構造を維持することが可能であった（F11～F14対F4～F7参照）。
（表６）PEG化キトサン乾燥粉末製剤の実験設計（DP:乾燥粉末、Man:マンニトール、Suc:スクロース、Treh:トレハロース、Leu:ロイシン）
Figure 2023522103000007
再構成後のナノ複合体のサイズおよびゼータ電位。サイズおよびゼータ電位をゼータサイザーによって測定して処理および再構成後のサイズ変化を評価し、製造時のナノ複合体の物理的安定性を評価した。図31A～31Cに示されるように、再構成製剤はどれも、TFF処理なしのナノ複合体（184.1±6.6nm）と比べて統計学的に有意な粒子径増大を有した。再構成Man-DP製剤のサイズは235.0±39.2nm（F1）～621.2±58.3nm（F7）の範囲であり、一方、再構成Man-Leu DP製剤のサイズは223.4±30.2nm（F8）～345.7±20.1nm（F14）の範囲であった。Suc DP製剤では、粒子径は200.4±9.2nm（F15）～536.0±198.8nm（F21）の範囲であり、一方、Suc-Leu DPの粒子径は206.8±11.1nm（F22）～326.4±21.6nm（F28）の範囲であった。Treh DP製剤では、最も小さい粒子径がF29で観察され、最大粒子径が示された製剤はF35である。ロイシンの添加あり（Treh-Leu DP）では、粒子径は202.9±4.5nm（F36）～376.3±47.6nm（F42）の範囲であった。要するに、凍結保護剤濃度の減少に伴ってナノ複合体のサイズが増大する傾向が観察された。対照的に、DP製剤のゼータ電位の点では明白な傾向は観察されなかった。
再構成後のナノ複合体のトランスフェクション効率。ナノ複合体のトランスフェクション効率に対する凍結保護剤の型および濃度の効果を試験した。図32に、未処理のナノ複合体に対して正規化した、再構成製剤のトランスフェクション効率のデータを示した。凍結保護剤は、高濃度および低濃度のいずれも、TFF/凍結乾燥工程または再構成工程でナノ複合体の効力を保護することができないことがわかった。最も高いトランスフェクション効率は、Man DP、Suc DP、Treh DP、Man-Leu DP、Suc-Leu DPおよびTreh-Leu DPについて、それぞれ1％のマンニトール、3％のスクロース、0.5％のトレハロース、3％のマンニトール＋0.3％のロイシン、1％のスクロース＋ロイシンおよび3％のトレハロース＋0.3％のロイシンを含む製剤で観察された。対照的に、いずれの賦形剤も有しないナノ複合体では、TFFおよび凍結乾燥プロセス後、トランスフェクション効率性はほとんど示されなかった。
このようなスクリーニングアッセイに基づくと、凍結保護剤の濃度が高いと、再構成後のナノ複合体の凝集が少なくなる（すなわち、粒子径の変化が少なくなる）ことがわかったが、最も高いトランスフェクション効率は、0.5～3％の範囲の凍結保護剤濃度を含む製剤でみられた。したがって、3％の凍結保護剤を含む6つの製剤（F3、F10、F17、F24、F31およびF38）を、さらなる検討のためのリード製剤として選択した（図33）。
リード乾燥粉末製剤の特性評価。SEM画像（図34）により、6つの乾燥粉末製剤はすべて、異なる程度の凝集を示し、中でも、F3およびF10は、滑らかな固体の外観を示すその他の4つの製剤と比べて、高い多孔度を示すことが明らかになった。このような観察結果を粉末の粒子径と組み合わせた。6つのリード乾燥粉末製剤の幾何学的粒子径分布をHELOSレーザー回折によりRODOS粉末分散を用いて特性評価した。表7に示されるように、F3およびF10の幾何学的粒子径の中央値（D50）はその他の製剤より有意に小さかったようであった。D50が大きい製剤F17、F24、F31、F38の外観および低い多孔度を考えると、これらはおそらく、呼吸できる粉末ではない。これを、上記の空気動力学的粒子サイズ分類によって確認した。X線回折図により、未処理のそのままのマンニトールは2θが10.54°および14.69°の特性回折ピークを有するβ形態を示すが、TFF乾燥粉末製剤（F3およびF10）は、9.69°の2θに特性回折ピークが観察され、10°～16°に回折ピークが観察されないことからδ形態を示すことが明らかになった（図35A）。図6bおよび6cに示されるように、F17、F24、F31およびF38は、未処理のスクロース（図35B）およびトレハロース（図35C）と比べて明白な結晶のピークが観察されないため非晶質のようであった。
（表７）精製乾燥粉末製剤の平均幾何学的粒子径分布
Figure 2023522103000008
RS01 Monodose DPIにおける精製乾燥粉末製剤の空気動力学的性能。NGIを使用し、低抵抗RS01 Monodose DPI（流速60L/分）によってエアロゾル化される精製乾燥粉末製剤の空気動力学的性能を評価した。図36に示されるように、F3およびF10は、ステージ2（4.46ミクロンの空気動力学的カットオフ）以降も他の製剤と比べて沈着が多く、これによりF3およびF10の空気動力学的粒子径分布がよりよいことが示された。この沈着プロフィールに基づいて、MMAD、FPF％およびEF％を計算し、表8に要約した。F3およびF10では、それぞれ4.8μmおよび4.6μmのMMADが示され、これにより、5μmより大きいMMADを有する他の製剤と比べて肺内への乾燥粉末粒子の沈着がより良好である可能性が示された。さらに、EF％がF3（74.2％）およびF7（71.5％）では他の製剤よりも小さいにもかかわらず、F3およびF10では、それぞれ44.5％～44.2％という他の製剤より比較的高いFPF％（＜5μm）が示された。このような結果に基づいて、F3およびF10を吸入に適した製剤であると認定し、さらに試験した。
（表８）60 L/分のRS01における精製TFF乾燥粉末製剤の空気動力学的性能
Figure 2023522103000009
F3およびF10の空気動力学的性能に対する吸入器の型および流速の効果。F3およびF10の空気動力学的性能をさらに評価するため、2つの型の高抵抗吸入器を使用して乾燥粉末製剤を2つの異なる流速でエアロゾル化した（表9）。ロイシンを含むF10は、吸入器の型または流速に関係なくF3と比べて小さいMMADおよび高いFPF％を示すようであった。また、HandiHalerまたはRS01 DPIのいずれでも、どちらの製剤も、60L/分の流速では45 L/分の流速と比べて有意に高いEF％およびFPF％ならびに小さいMMADを有し、これにより、これらのデバイスにおいてF3およびF10の流速依存性空気動力学的性能が示された。さらに、同じ流速では、HandiHaler DPIは、F3またはF10のいずれでも、RS01 Monodose DPIと比べてEF％は高くなっているがMMADは大きく、これにより、両方の製剤の空気動力学的性能は吸入器の型にも依存性であることが示された。
（表９）異なる吸入器および異なる流速でのF3およびF10の空気動力学的性能（サイズが測定範囲外であったものをN/Aと表示した）
Figure 2023522103000010
F3およびF10の含水量、真密度および比表面積をTGA、マルチピクノメーターおよびモノソーブ（迅速表面積分析装置BET）によって評価した。表10に示されるように、ロイシンを含むF10は、F3と比べて少ない含水量および低い真密度を有していた。対照的に、F10の比表面積はF3より有意に大きかった。
（表１０）F3およびF10の真密度および比表面積
Figure 2023522103000011
TFF脂質ナノ粒子-mRNA（LNP）乾燥粉末製剤のサイズ。イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、ポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質）およびEGFPコードmRNAからなる4つのLNP製剤をTFFにより、異なる賦形剤を20％（w/w）の濃度で用いて、乾燥粉末に製剤化した:マンニトール、スクロースおよびトレハロースを使用した。TFFおよび凍結乾燥後、乾燥粉末製剤を蒸留水中で再構成し、LNPの粒子径をDLSによって測定した。図37に示されるように、再構成後のTFF製剤はすべて、未処理のLNPと比べて有意な粒子径増大を示したが、各製剤に対して、異なる凍結保護剤で異なる凍結保護効果が示された。LNP-1およびLNP-4では、スクロースが、再構成後のサイズ変化が最も小さいため、マンニトールおよびトレハロースよりサイズに対する良好な保護効果を示し、一方、LNP-2およびLNP-3では、マンニトールがスクロースおよびトレハロースよりサイズに対する良好な保護効果を示した。
TFF脂質ナノ粒子（mRNA負荷済み）乾燥粉末製剤の細胞内取込み。再構成後の乾燥粉末LNP製剤のトランスフェクション効率をHEK293細胞において評価した。図38に示されるように、20％のスクロースを有する製剤では、未処理のLNP製剤と比べてトランスフェクション効率に有意差は示されなかったが、他の凍結保護剤では未処理のLNP製剤と比べてトランスフェクション効率の有意な低下が示された。
実施例4-経肺送達の潜在的可能性のための薄膜凍結乾燥siRNA封入固形脂質ナノ粒子
A. 材料および方法
1. 材料
ポリエチレングリコール2000-ヒドラゾン-C18（PHC）を既報の方法に従って合成し、NMRによって特性評価した（Zhu et al.,2013）。精製レシチンはAlfa Aesar（Tewksbury,MA）から入手した。Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）のマンニトール（USP）、リポ多糖（LPS）、コレステロール、ブタ胃由来Type IIIムチン、Amicon Ultra遠心式フィルターユニットUltra-15（MWCO 100 kDa）。リポフェクタミンRNAiMAXトランスフェクション試薬、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、ストレプトマイシン/ペニシリン、FluoSpheres（商標）アミン修飾ポリスチレンマイクロスフェアおよびHEPESバッファーはInvitrogen（Carlsbad,CA）のものであった。TopFluor（登録商標）コレステロールおよび1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）はAvanti Polar Lipids（Alabaster、Alabama,USA）のものであった。配列（
Figure 2023522103000012
、アンチセンス:
Figure 2023522103000013
）のTNF-α siRNAはIntegrated DNA Technologies（Coralville,Iowa,USA）から購入し、TNF-α ELISAキットはBioLegend（San Diego,CA）のものであった。
2. 方法
ナノ粒子懸濁液の調製。SLNを、以前に確立された溶媒蒸発法に従い、軽微な修正を伴って調製した（Aldayel et al.,2018）。簡単には、レシチン（3.2mg）、コレステロール（1.6mg）、PHC（2mg）および8μLのTopFluorコレステロール溶液（0.25％w/v in THF）を0.5mLのTHF中に溶解させ、0.2μmのPTFEシリンジフィルターに通して濾過した。混合物を撹拌下で5mLの水に滴下した。得られたナノ粒子懸濁液を一晩撹拌してTHFを蒸発させ、次いで3.2μmのPTFEシリンジフィルターを用いて濾過し、次いで乾燥手順まで4℃で保存した。
siRNAが組み込まれたSLNを調製するため、100μlの20μM siRNA含有水を400μLの水で希釈し、次いで680μLの2.56％（v/v）DOTAP含有クロロホルムに添加し、30分間、激しく撹拌した後、1.3mLのメタノールを添加し、1時間撹拌した。siRNA/DOTAP複合体を、クロロホルムを用いて混合物から相分離によって抽出した。レシチン（3.2mg）、コレステロール（1.6mg）およびPHC（2mg）を0.5mLのクロロホルム中に溶解させ、siRNA/DOTAP複合体と混合した。混合物を窒素ガス下で乾燥させ、次いで500μLのTHF中に再溶解させた後、5mLの水に滴下した。SLNを蛍光標識するため、TopFluorコレステロール溶液（クロロホルム中0.25％w/v）をレシチン混合物に添加した後、siRNA/DOTAP複合体と混合した。得られたSLNのサイズ、多分散指数（PDI）およびゼータ電位を、動的光散乱（DLS）によりMalvern Zeta Sizer Nano ZS（Westborough,MA）を用いて測定した。
薄膜凍結乾燥による乾燥粉末の調製。薄膜凍結乾燥SLN粉末を調製するため、マンニトールをナノ粒子懸濁液中に溶解させ（SLN siRNAなしのSLNでは40.8mg/mLおよびsiRNA封入SLNでは48mg/mL）、次いで懸濁液を、回転式の事前に冷却した中空ステンレス鋼円筒型ドラムに既報のとおりに滴下することによって凍結させた（Zhang et al.,2012;Engstrom et al.,2008;Thakkar et al.,2017）。凍結乾燥サイクルは-40℃の棚板温度で20時間、20時間で25℃までのランプ制御、次いで25℃でさらに20時間保持であり、圧力はVirTis AdVantage Bench Top Lyophilizer（Gardiner,NY,USA）を用いて100mPaより下にした。SLNに対するマンニトールの比を凍結・解凍実験によって求めた。簡単には、1mLのSLN含有懸濁液を異なる量のマンニトールと混合し、-80℃で2時間凍結させ、次いで室温で解凍した後、粒子径およびPDIを測定した。
噴霧乾燥による乾燥粉末の調製。噴霧乾燥ナノ粒子粉末を、マンニトールをナノ粒子懸濁液中に4.08mg/mLで溶解させることによって調製し、次いでこれを、直径0.5mmの二液ノズルを有するBuechi B-290ミニスプレードライヤー（Flawil,Switzerland）を用いて乾燥させた。エアロゾル化ガスフローを29 L/分にし（窒素）、アスピレーターを100 psiに設定し、供給口温度を90℃にし、排出口温度を65℃にし、懸濁液の供給速度を3mL/分にした。粉末を解析まで暗所で真空デシケータ内に保存した。粉末をさらなる解析まで暗所で真空デシケータ内に保存した。
粉末の特性評価。噴霧乾燥粉末およびTFFD粉末の形態構造は、Zeiss Supra 40V走査型電子顕微鏡（SEM）（Zeiss SMT AG,Oberkochen,Germany）を用いて、テキサス大学オースティン校（Austin,TX）のMicroscopy and Imaging Facilityで検査した。試料を導電性テープにタッピングし、次いで15nm Au/Ptを、Cressington 208スパッターコーター（Cressington Scientific Instruments,Watford,UK）を用いてコーティングした後、SEMにロードした。乾燥粉末の表面積を、Quantachrome Nova 2000ブルナウアー・エメット・テラー（BET）表面積分析装置（Quantachrome Corporation,Boynton Beach,FL）を用いて測定した。
インビトロエアロゾル化特性。粉末のインビトロエアロゾル性能を、Copley Scientific（Colwick,Nottingham,UK）の次世代インパクター（NGI）およびCITDASソフトウェアを用いて評価した。およそ10mgの乾燥粉末をサイズ3のヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）カプセル（Capsugel,Morristown,NJ）内に充填し、Plastiape（Milano,Italy）のRS01高抵抗吸入器内に入れた。細粒分（FPF）は空気動力学的直径＜5ミクロンと定義した。NPの蛍光強度を、BioTek Synergy HTマイクロプレートリーダー（ex＝485、em＝528）（Winooski,VT）を用いて測定し、以下の式:沈着％＝100×（各NGIステージでの再懸濁させた粉末の蛍光強度/再懸濁媒体の容量）/（再懸濁させた標準粉末の蛍光強度/再懸濁媒体の容量）を用いることによって、SLNの定量を行なった。純水中での蛍光シグナルが比較的弱いため、エタノールの水溶液（50％、v/v）を再懸濁媒体として選択した。
刺激された粘液中におけるナノ粒子の拡散。SLNおよびポリスチレンビーズの拡散を疑似粘液において比較し、以前に開発されたアッセイ（Leal et al.,2018）を用いて測定した。ムチンを20mM HEPESバッファー中に溶解させて2％（w/v）溶液を作製し、穏やかに30分間アジテーションし、次いで100μLの疑似粘液を、3.0μm孔径を有するポリエステル膜Corning（登録商標）Transwellインサート（Corning,NY）の上部区画に移したのに対して、底部区画には600μLの20mM HEPESバッファーを入れ、Transwellを室温で放置した。孔径は、実験の時間経過中、粒子は膜を通り抜けて移動できるがムチンゲルは保持されることが確実になるように選択した（Norris and Sinko,1997）。次に、10μlの再構成SLNまたはポリスチレンビーズ（対照として）を上部区画に穏やかに添加した。底部のHEPESバッファーは、5時間の間1時間毎に収集して新鮮HEPESバッファーと交換した。ムチンゲルなしのウェルを対照として使用した。収集された溶出液中の粒子の量を、蛍光強度から、6点直線検量線に基づいて求めた。
ELISA。TNF-α SLN粉末（100mg）を5mLの無血清培地中に再懸濁させ、次いで3.2μm PTFEフィルターを用いて濾過した。J774A.1マクロファージ細胞（American Type Culture Collection,Manassas,VA）を96ウェルプレート内に播種した（7000個の細胞/ウェル）。一晩のインキュベーション後、培地を150μL/ウェルの懸濁液と交換した。4時間後、20％FBSを有する150μLの培地を添加し、細胞をさらに44時間インキュベートした。次いで培地を、300ng/mLのLPSを含む300μL/ウェルの培地と交換し、4時間インキュベートした後、TNF-α濃度をBioLegend ELISAキットによって測定した。
統計解析。拡散およびELISAのデータはPrism（GraphPad Software,San Diego,CA）を用いて処理した。
B. 結果および考察
TFFDは、高速凍結の後、凍結乾燥するプロセスである。TFFDによって調製される乾燥粉末は多孔質であり、大きな表面積を有する。この方法は、低分子（Zhang et al.,2012;Overhoff et al.,2008;Overhoff et al.,2007）、タンパク質（Engstrom et al.,2008）、および不溶性アルミニウム塩のアジュバントを伴うワクチン（Thakkar et al.,2017;Li et al.,2015）に成功裡に適用されている。また、該粉末は、その綿毛様構造および脆さにより経肺薬物送達のための優れたエアロゾル特性がもたらされている。低分子の経肺送達（Patlolla et al.,2010;Nemati et al.,2019;Patil-Gadhe et al.,2016）および核酸ベースの剤の経肺送達（Hyde et al.,2014;Deshpande et al.,2002）が実現可能であることは、脂質ベースの粒子を担体として用いて証明されている。噴霧乾燥（Nemati et al.,2019）および凍結乾燥（Lball et al.,2017）はどちらも、SLNの乾燥粉末製剤を調製するために使用されている。しかしながら、噴霧乾燥によって調製されたエタンブトール負荷SLN乾燥粉末の空気動力学的特性は、その大きな粒子径のため、肺深部への送達には好都合でないことが報告された（Nemati et al.,2019）。1μm～5μmのサイズを有する粒子のみが肺深部に沈着できるため、100～200nmの範囲の直径を有するSLNは小さすぎて、吸入後に吐出される（Rahimpour and Hamishehkar,2012）。したがって、SLNには、担体としての役目を果たす1種または複数種の賦形剤および乾燥粉末形成のための1種または複数種の凍結保護剤が必要とされる。この試験では、経肺送達のためのSLNに対するTFFDの適用の実現可能性を試験した。SLNを、溶媒蒸発法により既報のとおりに調製した（Aldayel et al.,2018）。これは、レシチン、コレステロールおよびPHCを用いて、カチオン性脂質と複合体形成されたsiRNAあり、またはなしで調製した。得られたSLNはおよそ100～150nmの直径であり（DLSによって測定）、比較的一様に分布しており、球形であった。次いで、siRNAなしのSLNをTFFDまたは噴霧乾燥に供し、生成した粉末を比較した。次いで、TNF-α siRNAが封入されたSLNをTFFDに供した。TNF-α siRNA-SLNの乾燥粉末を特性評価し、そのエアロゾル特性を測定するとともに、TFFDおよび再構成に供された後のTNF-α siRNA-SLNの機能ならびにTNF-α siRNA-SLNが模擬肺粘液を透過する能力も測定した。
SLNを凍結させるための賦形剤のスクリーニング。SLNをTFFDに供する前に、潜在的凍結保護剤を、凍結中でのSLNの保護能についてスクリーニングした。良好なエアロゾル性能特性（D'Addio et al.,2013）および凍結保護能（Wang et al.,2018）のため、マンニトールを粉末増量剤かつ凍結保護剤として選択した。必要とされるマンニトールに対するSLN比を調べるため、凍結・解凍実験を行なった。表11の結果により、最良の凍結保護は、粒子対マンニトールの重量比が1対30で得られることが示され、次いでこれをさらなる試験に使用した。
（表１１）種々の量のマンニトールの存在下でのSLNの凍結・解凍。データは平均±SDである（n＝3）。
Figure 2023522103000014
SLNの薄膜凍結乾燥粉末の調製および特性評価。SLNの乾燥粉末を、マンニトール溶液中に懸濁させたSLNを事前に冷却した金属表面に滴下することによって調製し、棚式凍結乾燥機内で凍結乾燥させた。また、対照として、同じ組成を有するSLNの噴霧乾燥粉末も調製した。SLNのTFFD粉末および噴霧乾燥（SD）粉末をまず、再構成後の粒子径、PDIおよびゼータ電位を測定することによって特性評価した。表12に示されるように、SD粉末およびTFFD粉末から再構成したSLNのサイズは乾燥前のSLNと比べて増大した。SLNのPDIは、TFFDおよび再構成に供された後も変化しなかったが、SDおよび再構成に供された後では増大した。粒子径増大の原因となる機構は不明であるが、凍結応力（Chung et al.,2012）ならびに乾燥工程中の応力および粒子と賦形剤との間の相互作用が粒子径増大に寄与したのかもしれない（Niu and Panyam,2017）。次いで粉末を、その形態構造および比表面積を検査することによって特性評価した。図39に示されるように、TFFD粉末では多孔質組織が示されたが、SD粉末ではビーズ様微細構造が示された。TFFD粉末の比表面積はSD粉末よりおよそ20倍大きく（表12）、これは以前の文献（Engstrom et al.,2008）と整合した。
（表１２）噴霧乾燥またはTFFDおよび再構成に供される前と後におけるSLNの物性。データは平均±SDである（n＝3）。
Figure 2023522103000015
インビトロエアロゾル化性能。NGIを用いてSD粉末およびTFFD粉末のエアロゾル性能を調べ、比較した（図40）。おそらくTFFD粉末の多孔質形態構造および大きな表面積のため、TFFD粉末ではSD粉末製剤より高いFPF（表13）および良好な肺深部領域内への沈着が示された（図40、ステージ4～7参照）。したがって、試験した組成では、TFFDによって調製されたSLN乾燥粉末はSLNの経肺送達に対して、噴霧乾燥によって調製されたものより良好であると結論づけた。
（表１３）噴霧乾燥またはTFFDによって調製されたSLNの乾燥粉末の細粒分（FPF）％、空気動力学的質量中央径（MMAD）および幾何学的標準偏差（GSD）の値（データは平均±SDである,n≧3）
Figure 2023522103000016
siRNA封入SLNの薄膜凍結乾燥粉末の調製および特性評価。siRNA封入SLNを調製するため、siRNAを生体適合性カチオン性脂質であるDOTAPとN対P比が12対1で混合し、次いで他の成分と混合した後、既報のとおりに溶媒蒸発を行なった。得られたsiRNA-SLNはsiRNAなしのSLNと比べてわずかに大きい粒子径を有していた（表14）。懸濁状態のsiRNA-SLNをマンニトールと1:30,w/wの比で混合し、TFFDに供した。図41Aに示した粉末は綿毛様であり、多孔質組織を有した。siRNA-SLNのサイズは、TFFDおよび再構成に供された後、わずかに増大した。図41Bに、TFFDによって調製されたsiRNA-SLN粉末のエアロゾル性能の特徴を示した。この場合も、siRNA-SLN粉末は、肺深部に相当するステージにおいて高いFPF％（表15）および多くの沈着を有していた（図41B）。肺の肺胞への送達のための主な要因は空気動力学的粒子径である。薄膜凍結乾燥siRNA-SLN粉末では、既報の方法（Nemati et al.,2019;Ohashi et al.,2009）より小さいMMAD、高いFPF％および肺胞に相当するNGIステージまで多くの沈着が示され、TFFDは、エアロゾル送達のためのsiRNA-SLNの乾燥粉末の作製に理想的であることが示唆された。
（表１４）TFFDおよび再構成に供される前と後のTNF-a siRNA-SLNの物性の比較。データは平均±SDである（n＝3）。
Figure 2023522103000017
（表１５）TFFDによって調製されたsiRNA-SLNの乾燥粉末の細粒分（FPF）％、空気動力学的質量中央径（MMAD）および幾何学的標準偏差（GSD）の値（データは±平均SDである,n≧3）
Figure 2023522103000018
TFFDおよび再構成に供された後のsiRNA-SLNのsiRNAの機能の検証。siRNA-SLNがTFFDおよび再構成に供された後のsiRNAの機能を検証するため、TNF-α siRNA-SLNを使用し、LPSで活性化されたJ774A.1マウスマクロファージによるTNF-αの発現をsiRNA-SLNが抑制する能力を測定した。図42に示されるように、TFFDおよび再構成に供された後のTNF-α siRNA-SLNは、細胞からのTNF-α放出の下方調節においてTFFD前と同程度に有効であり、TFFDは、siRNAの機能性を損なうことなくsiRNA-SLNを液体の懸濁液から乾燥粉末に変形させるために成功裡に適用され得ることが実証された。
疑似粘液中へのsiRNA-SLNの拡散。肺に送達されたsiRNA-SLNが生細胞に到達するためには粘液層を透過する必要がある。siRNA-SLNが肺への送達後、粘液層を透過できるかどうかを評価するため、疑似粘液あり、またはなしTranswellパーミアブルサポートからなる系を用いて粘液透過アッセイを行なった（Norris and Sinko,1997;Desai et al.,1991）。懸濁状態のSLNを粘液上に、粘液を乱すことなくウェルの中央に穏やかに添加し、Transwellの反対側の粒子濃度を異なる時間点で定量した。市販の蛍光標識ポリスチレンビーズ（サイズ、279±4nm;PDI、0.10±0.02;ゼータ電位、＋36.0±0.4mV）を対照として使用した。図43に、疑似粘液層あり、またはなしでの膜中に拡散された粒子のパーセンテージを示す。疑似粘液なしでは、SLNおよびポリスチレンビーズはどちらも膜中に急速に拡散され、1時間以内に横ばいに達した。siRNA-SLNの粘液層全体への拡散は明らかに遅かった（図43）が、SLNの約25％が5時間以内に疑似粘液層中に拡散され、siRNA-SLNは、エアロゾル化された後も肺内で薄膜凍結乾燥粉末として肺内の粘液を透過できることが明白に示された。
本試験では、治療用薬剤、例えばTNF-α siRNAの肺への経肺送達が潜在的に可能な良好なエアロゾル特性を有するSLNの乾燥粉末製剤の作製が実現可能であることが実証された。最初に、SLNの乾燥粉末を噴霧乾燥およびTFFDによって調製し、その物性およびエアロゾル特性を比較した。TFFDによって調製された粉末は綿毛様で脆く、噴霧乾燥粉末より良好なエアロゾル特性が示された。TNF-α siRNA封入SLNのTFFD粉末は、培養状態のマクロファージによるTNF-α放出を下方調節する能力において機能性のままであることがさらに示された。おそらくナノ粒子の表面PEG化（Huckaby and Lai,2018）のため、疑似粘液を透過する能力が実証されたことにより、siRNA-SLNのTFFD粉末は、カギとなる炎症促進性サイトカイン、例えばTNF-αに特異的なsiRNAを用いて肺疾患、例えば喘息および他の慢性炎症性疾患を処置するための肺へのsiRNAの経肺送達のために使用することが潜在的に可能であり得ることが期待される。もちろん、siRNAはTNF-a siRNAでなくてもよく、実際、他の核酸ベースの剤、例えばmRNA、shRNA、プラスミドDNA、ミニサークルDNA、DNAオリゴもまた、本試験で使用したSLNと同様のSLNまたは脂質ナノ粒子に製剤化され得ることが期待される。また、ナノ粒子は脂質ベースである必要はなく;高分子ベースのナノ粒子または無機ナノ粒子で作製されたナノ粒子もまた、エアロゾル化のためのTFFDを用いて液体の懸濁液から乾燥粉末に転換され得る。さらに、ナノ粒子は、核酸ベースの剤を保護するため、および標的細胞によるその取込みを改善するための担体として一般的に使用される。核酸ベースの剤が安定であるように特別に改変操作されれば、および/またはナノ粒子の補助を伴わずに標的細胞に取り込まれることができれば、これを、TFFDを用いて良好なエアロゾル特性を有する乾燥粉末に直接転換することができる。さらに、ナノ粒子内に封入される治療用薬剤および/または診断用薬剤は核酸ベースでなくてもよいことは明白である。低分子、タンパク質、ならびに細菌およびウイルスでさえ、ナノ粒子に担持させ得る。最後に、任意の潜在的治療用薬剤および診断用薬剤もまた、ナノ粒子と混合された後、TFFDに供され得る。
コロイド状懸濁液の凍結乾燥は以前に詳細に報告されており、増量剤によって引き起こされるコロイド状ナノ粒子のサイズ増大は安定なコロイド系において普遍的であることが示された（Lintingre et al.,2016）。これは、siRNAが封入された、または封入されていないSLNの流体力学的直径が、TFFDに供された後に増大する説明となり得る。賦形剤に対するSLNの比は、SLNの粒子径および多分散指数（PDI）への影響に大きな役割を果たす。コロイド状懸濁液の凍結乾燥は多工程プロセスであり、かかるプロセスを説明するのはかなり難しい。凍結工程において、凍結によって引き起こされる粒子の凝集は主に、粒子を高い凍結応力を伴う狭い面積に押しやる氷の結晶化に起因する。乾燥工程では、該1種または複数種の賦形剤が水の代用としての機能を果たし、粒子表面との水素結合を確立することによって粒子を安定化させる（Abdelwahed et al.,2006）。TFFD技術は2つの局面において特殊である:第1に、冷却速度が1～10 K/分程度である棚式凍結と比べて冷却速度が500～1000 K/s17の範囲である。このより高速な冷却によって氷結晶が小さくなる。第2に、TFFDプロセスでは1ミリメートルより薄い厚さを有する薄膜がもたらされ、薄膜内のフリースペースは、水が昇華過程で移動するチャネルを提供する。滴下および凍結のプロセス時の液滴と空気との間の気体-液体間界面張力によってナノ粒子の凝集が引き起こされるのかどうかは不明であるが、気体-液体間界面張力は噴霧凍結時より低い。最後に、TFFDおよび再構成に供された後のSLNの流体力学的サイズのわずかな増大は、粒子径が200nmより小さいままであり、SLN内のsiRNAの機能性は損なわれなかったため、経肺送達に対して生物学的に有意にはなり得ない。必要であれば、粒子径の変化を最小限にするための、賦形剤ならびに凍結および凍結乾燥手順の修正にかかわる将来的な取り組みが適用され得る。
したがって、本試験は、肺疾患を処置するための経肺送達が潜在的に可能な良好なエアロゾル特性を有する、siRNAが封入された、またはsiRNAなしの、固形脂質ナノ粒子の乾燥粉末を調製するために、薄膜凍結乾燥を適用することができることを示す。
C. 経肺送達の潜在的可能性のためのTNF-α siRNA固形脂質ナノ粒子のエアロゾル性能
1. 方法
カチオン性脂質と複合体形成されたTNF-a siRNAを、レシチン、コレステロールおよびポリエチレングリコール（2000）-ヒドラゾン-ステアリン酸（C18）誘導体を用いて調製された固形脂質ナノ粒子内にナノ沈殿によって封入することにより、siRNA固形脂質ナノ粒子を操作した。ナノ粒子をTopFluorコレステロールで蛍光標識した。siRNA固形脂質ナノ粒子の乾燥粉末製剤を調製するため、マンニトールをナノ粒子懸濁液に添加し、次いで懸濁液を凍結乾燥させた。乾燥粉末のエアロゾル性能を、次世代インパクター（NGI）を用いて検査した。
エアロゾル性能を評価するための次世代インパクター（NGI）実験では、ナノ粒子を、全コレステロールの1.25％w/wのTopFluorコレステロール（Bodipy labelled）で蛍光標識した。噴霧乾燥試験では、カチオン性脂質およびsiRNAを製剤に添加しなかった。TEM画像を撮影し、マクロファージ取込み試験を行なった。Buchi B290噴霧乾燥機を使用し、マンニトールを賦形剤として用いて乾燥粉末製剤を調製した。凍結乾燥では、凍結保護剤および理想的な賦形剤濃度の予備スクリーニングを行なった。SLNのエアロゾル性能をNGIによって測定した。
2. 結果および結論
TNF-a siRNA固形脂質ナノ粒子は球形であった。その粒子径および多分散指数は118±7nmおよび0.16±0.01であった。細胞培養物において、TNF-a siRNA固形脂質ナノ粒子は、リポ多糖で処理されたJ774A.1マウスマクロファージによるTNF-αの発現を有意に下方調節した（図44）。NGIデータにより、ナノ粒子の乾燥粉末は、細粒分（FPF）が78.5％の良好なエアロゾル性能を有することが実証された（図45）。TNF-a siRNA固形脂質ナノ粒子は球形であった。その粒子径および多分散指数は118±7nmおよび0.16±0.01であった（図46）。
SLNの乾燥粉末製剤。図47に示すSLNの乾燥粉末製剤の物理的外観。ともにブルナウアー・エメット・テラー（BET）によって測定した噴霧乾燥SLN粉末の比表面積は0.92±0.11m2/gであったが、凍結乾燥粉末は19.34±2.5m2/gであった。
SEM画像により、凍結乾燥粉末の方が噴霧乾燥粉末より多孔質であることが示された（図48）。NGI実験により、凍結乾燥粉末製剤の方が噴霧乾燥製剤と比べてエアロゾル性能が良好であることが示された（図49）。粒子径およびPDIは、どちらの乾燥方法後もわずかに増大した（表16）。
（表１６）各乾燥方法の前後での粒子径およびPDI
Figure 2023522103000019
図50に示した乾燥前後でのサイズ分布の比較。乾燥工程前にナノ粒子を懸濁させるための異なるバッファーおよび/または凍結保護剤を用いた賦形剤のスクリーニングもまた行なったが、有効な条件は得られなかった。
したがって、本試験は、TNF-a siRNA固形脂質ナノ粒子製剤により、マウスモデルにおいて培養状態のマクロファージによるTNF-α産生を成功裡に阻害でき、慢性炎症が緩和されたことを示す。ナノ粒子の乾燥粉末は経肺送達のための良好なエアロゾル性能を示した。
実施例5-細菌の薄膜凍結および薄膜凍結乾燥
A. 結果
1. 細菌の薄膜凍結
単一コロニーの大腸菌DH5α（Invitrogen,Carlsbad,CA）を3mLのルリア-ベルターニブロス（LB）培地（Invitrogen）中に播種して培養を開始し、次いで100mLのLB培地に移し、振盪下、33℃で一晩インキュベートした。細菌を2000 rcfで15分間の遠心分離によって収集し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4、10mM）で1回洗浄した。遠心分離後、細菌を、10％（w/v）スクロースを有する溶液再懸濁させて元の容量にした。薄膜凍結のため、250μLの細菌懸濁液（0.7～5×108コロニー形成単位（CFU）/ml）を、シリンジに取り付けられた21ゲージの針を用いて、ドライアイスで事前に冷却した20mL容ガラスバイアルの底に滴下した。次いで、凍結された細菌薄膜を有するガラスバイアルにキャップし、室温で放置して解凍するか、またはさらなる試験まで-80℃で保存した。棚式凍結を対照として使用した。簡単には、250μLの細菌懸濁液を20mL容ガラスバイアル内に分注し、次いで-20℃で2時間凍結させた。凍結・解凍の前または後の懸濁液中の生菌数を、LB培地での段階希釈後、LB寒天培地プレートを用いる標準的なプレートアッセイを使用した測定した。表17に、細菌を薄膜凍結または棚式凍結に供した後の回収された生菌のパーセントおよびlog CFU減少を示す。全体的に、棚式凍結に供された後より薄膜凍結に供された後の方が多くの細菌が生存したままであった。
（表１７）棚式凍結または薄膜凍結に供された後の細菌生存性の比較
Figure 2023522103000020
2. 細菌の薄膜凍結乾燥
細菌乾燥粉末を調製するため、10％スクロース（w/v）中に懸濁させた細菌を標準的な凍結乾燥サイクルに供した（すなわち、試料をVirtis Advantage凍結乾燥機（Warminster,PA）で乾燥させ;圧力を＜10mbarにし;棚板温度を24時間、-40℃にし、24時間で25℃までランプ制御し、次いで25℃で24時間保持した、すなわち表18の方法A）。次いで乾燥粉末を、LB培地を用いて再構成し、懸濁液中の生菌数を、滅菌PBS（pH7.4、10mM）での段階希釈後にプレートアッセイによって測定した。驚くべきことに、生菌はわずか0.09％であり、対数減少値は3より大きかった（表19）。したがって、薄膜凍結乾燥および再構成に供された後の細菌の生存性に対する凍結乾燥サイクルならびに該1種または複数種の賦形剤の組成の効果を試験した（表18および19）。最終的に、組成および凍結乾燥方法は30％近くの細菌を保持することがわかった（すなわち、対数減少値は0.54）（表19）。図51は、薄膜凍結乾燥を用いて調製される細菌乾燥粉末は棚式凍結乾燥によって調製されるものと異なることを示す。
（表１８）薄膜凍結された細菌薄膜から水分を除去するために使用した凍結乾燥条件
Figure 2023522103000021
（表１９）異なる賦形剤および凍結乾燥方法を用いた大腸菌（E.coli）の薄膜凍結乾燥（TFF、薄膜凍結;フラッシュ凍結、250μLの細菌懸濁液が入った20mL容ガラスバイアルを液体窒素中で1分未満凍結）
Figure 2023522103000022
3. 凍結・解凍
表20は、凍結・解凍実験の結果を示す。細胞を4000 RPMで30分間、遠心分離し、次いで10％w/vスクロース溶液中に再懸濁させた。非凍結群の実験では、100μLの懸濁液に段階希釈を直接、行なった。棚式凍結実験では、500μLの懸濁液を-20℃の冷蔵庫内に30分間入れ、次いで室温まで昇温させた。TFF実験では、250μLの懸濁液を、ドライアイス-エタノール浴中で事前に冷却した20mL容ガラスバイアルに滴下し、次いでそのまま室温まで昇温させた。
（表２０）凍結・解凍実験の結果
Figure 2023522103000023
薄膜凍結乾燥された細菌乾燥粉末の調製以外に、本明細書に開示の方法は、他の生物体、例えば真菌、酵母、古細菌、ウイルス、花粉などの乾燥粉末製剤を調製するためにも適用され得ることも想定される。生物体は、生きているもの、弱毒化されたもの、または不活化されたものであり得る。
B. TFF細菌調製物のさらなる最適化
別個の試験において、細菌に対してステンレス鋼ドラム上での薄膜凍結の使用を行ない、凍結された薄膜から水分を、Virtis Advantage Pro凍結乾燥機（Warminster,PA）を用いて昇華させた。簡単には、アンピシリン耐性のpUC19ベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA）を有する単一コロニーの大腸菌DH5αを5mLのミラールリア-ベルターニブロス（LB）培地（Invitrogen）中に播種して一晩の培養を開始し、次いで100mLのLB培地に移し、振盪下37℃で、OD600が0.4に達するまでインキュベートした。細菌を4300 rcfで5分間の遠心分離により周囲温度で収集した。遠心分離後、細菌を凍結保護剤カクテルに元の培養容量の10％で再懸濁させた。薄膜凍結のため、1000μLの細菌懸濁液（0.1～2×109コロニー形成単位（CFU）/ml）を、シリンジに取り付けられた21ゲージの針を用いて、-40℃まで事前に冷却した回転式のステンレスドラムに滴下した。凍結された膜を5mL容アンバーガラスバイアルに回収し、表21に示すサイクルを用いる凍結乾燥まで-80℃で保存した。TFFDプロセスに供する前または後の懸濁液中の生菌数を、LB培地を用い、LB寒天培地プレートに塗り広げる標準的な段階希釈法を用いて測定した。
（表２１）Virtis Advantage Pro 85凍結乾燥機を用いた細菌の凍結乾燥サイクル
Figure 2023522103000024
表22に、いろいろな配合の凍結保護剤カクテル、細菌を薄膜凍結乾燥に供した後のCFU数およびlog CFU減少値を示す。少数の製剤では、棚式凍結に供した後より細菌を薄膜凍結に供した後の方が、生存性の低下を1log以内に最小限にできる。
（表２２）凍結保護剤カクテルおよびTFFD後の細菌生存性
Figure 2023522103000025
実施例6-プラスミドDNAの薄膜凍結および薄膜凍結乾燥
A. 材料および方法
i. 材料
β-ガラクトシダーゼ遺伝子コードプラスミドDNA pCMV-βはAmerican Type Culture Collection（ATCC,Manassas,VA）のものであった。これは、哺乳動物の細胞内で大腸菌ベータ-ガラクトシダーゼ（β-Gal）を異なるウイルスプロモーターの制御下で発現することができるpUC19プラスミドをベースに構築されていた（MacGregor et al.,1989）。大腸菌DH5αコンピテント細胞およびLBブロスはInvitrogen（Carlsbad,CA）のものであった。1,4-ジオキサンおよびtert-ブタノール、Tris-EDTA（TE）バッファーならびにアンピシリンはFisher Scientific（Fair Lawn,NJ）のものであった。アガロースはAmresco（Atlanta,GA）のものであった。ポリソルベート20、ラクトース一水和物および無水メタノールはSigma-Aldrich（St.Louis,MO）のものであった。Quant-iT（商標）PicoGreen（商標）dsDNAアッセイキットはThermo Scientific（Waltham,MA）のものであった。サイズ3号ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルはQuali-V-Iカプセル（Qualicaps US、Whitsett,NC）のものであった。
ii. プラスミドの調製
pCMV-βプラスミドで大腸菌DH5αを選択的増殖条件下で形質転換し、次いで増幅させ、QIAGEN Midiprep Kit（Valencia,CA）を用いて精製した。大規模プラスミド調製をQIAGEN Plasmid Maxiキットによって行なった。プラスミドを、アガロースゲルおよびThermo Scientific（Waltham,MA）のNanodrop 2000分光光度計を用いて評価した。
iii. 薄膜凍結を用いたプラスミドDNA乾燥粉末の調製
吸入用乾燥粉末の最良の製剤についてスクリーニングするため、pCMV-βならびに賦形剤（すなわち、マンニトールおよびロイシン）を水、Tris-EDTA（TE）バッファー、1,4-ジオキサン/水（10/90、v/v）またはTert-ブタノール/水（40/60、v/v）のいずれかに、表23に示したとおりの種々の固形分およびプラスミド負荷で溶解させた。製剤を2～8℃の冷蔵庫内に一時的に保存した後、薄膜凍結プロセスに適用した。
（表２３）プラスミド組成物およびTFFパラメータの一覧
Figure 2023522103000026
TFFプロセスおよび凍結乾燥を既報のとおりに行なった（Li et al.,2015;Sahakijpijarn et al.,2020a;Moon et al.,2019;Sahakijpijarn et al.,2020b）。簡単には、0.25mLの試料を21ゲージシリンジから回転式極低温冷却ステンレス鋼表面（-80±10℃）上に滴下した。凍結薄膜を形成させるため、ドラムの極低温冷却スチール表面が回転する速度を、液滴の重なりが回避される5～7rpmに制御した。凍結された薄膜を、スチールブレードを用いて剥がし、ガラスバイアル内の液体窒素中に回収した。ガラスバイアルに、半分開口状態でラバーストッパーを用いてキャップし、一時的な保存のため-80℃のフリーザー（Thermo Fisher Scientific）内に移し、次いで、ストッパーリキャップ機能を有するVirTis Advantageベンチトップ型トレイ式凍結乾燥機（The VirTis Company,Inc.Gardiner,NY）に移した。凍結乾燥を60時間にわたって100mTorr以下の圧力で行ない、その間、棚板温度を-40℃から25℃まで徐々にランプ制御した。凍結乾燥サイクルを表24に示す。
（表２４）薄膜凍結されたプラスミドを凍結乾燥させるために使用した凍結乾燥サイクル
Figure 2023522103000027
iv. インビトロエアロゾル性能の評価
薄膜凍結乾燥されたプラスミド粉末試料のエアロゾル性能特性を既報のとおりに測定した（Li et al.,2015;Sahakijpijarn et al.,2020a;Moon et al.,2019;Sahakijpijarn et al.,2020b）。簡単には、High-Capacity Pump（型番HCP5,Copley Scientific,Nottingham,UK）およびCritical Flow Controller（型番TPK 2000,Copley Scientific,Nottingham,UK）に接続された次世代薬剤インパクター（NGI）（MSP Corp,Shoreview,MN）をエアロゾル性能の評価のために採用した。放出される粒子がNGI回収プレート中に飛び散るのを回避するため、プレートを1.5％w/vのポリソルベート20含有メタノールでプレコートし、風乾させた後に解析した。プラスミドDNA粉末（2～3mg）をサイズ3号カプセル内に負荷し、カプセルを、米国薬局方（USP）導入ポート（Copley Scientific,Nottingham,UK）を取り付けた高抵抗Plastiape（登録商標）RS00吸入器（Plastiape S.p.A,Osnago,Italy）内に装填した。各動作あたり粉末をNGIに60 L/分の流速で4秒間分散させると、デバイスにおいて4 kPaの圧力降下がもたらされた。次いで、カプセル、吸入器、アダプター、導入ポート、ステージ1～7およびマイクロオリフィス捕集部（MOC）から、沈着した粉末を、水で希釈することによって回収し、沈着したプラスミドDNAの量を、PicoGreen（商標）dsDNAアッセイキットを製造業者の指示書に従って用いて定量した。
Copley Inhaler Testing Data Analysis Software（CITDAS）バージョン3.10（Copley Scientific,Nottingham,UK）を使用し、空気動力学的質量中央径（MMAD）、幾何学的標準偏差（GSD）および細粒分（FPF）を計算した。回収量のFPFは、回収されたプラスミドの総量のうちのパーセンテージとしての5μm未満の空気動力学的直径を有するプラスミドの全回収量として計算した。送達量のFPFは、アダプター、導入ポート、ステージ1～7およびMOCに沈着していたプラスミドの総量のうちのパーセンテージとしての5μm未満の空気動力学的直径を有するプラスミドの全回収量として計算した。
v. 走査型電子顕微鏡法（SEM）
粉末の形態構造を、Zeiss Supra 40C走査型電子顕微鏡（SEM）（Carl Zeiss,Heidenheim an der Brenz,Germany）を用いて、テキサス大学オースティン校のInstitute for Cell and Molecular Biology Microscopy and Imaging Facilityで検査した。少量の原料粉末（例えば、薄膜凍結乾燥粉末のフレーク）を試料スタブ上に両面カーボンテープを用いて沈着させた。スパッターを用いて試料を15mmの60/40のPd/Ptでコートした後、画像を収集した。
vi. アガロースゲル電気泳動
プラスミドpCMV-βを製剤P7（表23）に製剤化し、薄膜凍結乾燥させた。次いで乾燥粉末を再構成し、次いで、EcoR IまたはHind IIIおよびEcoR Iを用いて2時間消化し、電気泳動のためにアガロースゲル（0.8％）に適用した。対照には、薄膜凍結乾燥なしでpCVM-β単独または製剤P7中のpCMV-βを含め、どちらも消化し、電気泳動に適用した。
B. 結果
7:3のw/w比のマンニトールおよびロイシンを、プラスミドDNAを薄膜凍結乾燥させるための賦形剤として選択した。データにより、マンニトールおよびロイシン7:3w/w、1％w/vの固形分で調製されたプラセボ粉末は優れたエアロゾル性能特性を有していることが示され、MMAD値は0.99±0.25μm、GSDは2.39±0.09、回収量のFPFは84.7±9.0％、送達量のFPFは91.1±5.5％および放出量（ED）は92.7±3.9％であった。
i. インビトロエアロゾル性能
薄膜凍結乾燥されたプラスミドDNA乾燥粉末のエアロゾル性能特性を図52および表25に示す。より少ない固形分で調製された乾燥粉末の方が良好なエアロゾル性能を示したことは明白である。例えば、1.0、0.5および0.25％w/vの固形分で調製されたプラスミド製剤（P1、P4およびP3）のFPF＜5μm（回収量の）は、それぞれ32.92±2.52％、34.55±2.34％および55.13±2.36％であり、これらの粉末のMMAD値は、それぞれ、1.58±0.07μm、1.77±0.22μmおよび1.44±0.16μmであった（表25）。エアロゾル性能に対するプラスミド負荷（全賦形剤に対するプラスミド）の効果に関して、プラスミド負荷が少ない方が良好なエアロゾル性能が示された。例えば、10.0、5.0および2.5％w/wのプラスミドで調製されたプラスミド製剤（それぞれP5、P3およびP6）のFPF＜5μm（回収量の）は、それぞれ36.13±2.53％、55.13±2.36％および64.70±3.53％であり、これらの粉末のMMAD値は、それぞれ1.69±0.30μm、1.44±0.16μmおよび1.27±0.40μmであった（表25）。しかしながら、肺深部内への送達量のうちの実際量（送達量のFPFに薬物負荷を乗算）を考慮し、製剤P3（5％のプラスミドDNA負荷、0.25％固形分）を最良の製剤とみなした。
また、エアロゾル性能に対する共溶媒およびTEバッファーの効果も検討した。溶媒にTEバッファー、1,4-ジオキサンまたはTert-ブタノールを含めることはFPF＜5μm（回収量の）の改善の補助にならなかった（図52、表25）。しかしながら、P7中のTEバッファーはプラスミドDNAをDNaseから保護することが意図されていたことは注目される。TEバッファー中のEDTAは、二価カチオン、例えばMg2＋のキレート剤であり、これは酵素によって必要とされる（Nurakami et al.,2013）。溶媒にTEバッファーを含めることで、得られる乾燥粉末のエアロゾル性能がわずかに低下するようであった（図52および表25のP3対P7）。将来的には、TFFD中またはTFFD後のプラスミドの安定性に改善が必要とされれば、TEバッファーまたはETDAを単独で粉末に含めるのがよいかもしれない。
（表２５）薄膜凍結乾燥pCMV-βプラスミド粉末のエアロゾル性能特性。データは平均±S.D.である（n＝3）（MMAD,空気動力学的質量中央径;GSD,幾何学的標準偏差;FPF,細粒分）。
Figure 2023522103000028
ii. 薄膜凍結乾燥されたプラスミドDNA粉末の形態構造
TFFDによって調製されたプラスミド粉末（製剤P3）の形態構造を、SEMを用いて検査した（図53）。乾燥粉末製剤P3にはナノ構造凝集体が含まれており（図53Aおよび53B）、高度に多孔質のマトリックス構造を有し（図53C）、これは、図52および表25に示されるような良好なエアロゾル性能特性の説明となる。
iii. TFFDに供された後のプラスミドDNAの完全性
製剤7は5％のプラスミドDNA負荷を有し、TEを含み、全体的に良好なエアロゾル性能特性を有する。この製剤を、TFFDおよび再構成に供された後のプラスミドDNAの完全性を試験するために選択した。プラスミドpCMV-βを製剤7に製剤化し、薄膜凍結乾燥させた。次いでこれを再構成し、EcoR IまたはHind IIIおよびEcoR Iを用いて2時間消化し、電気泳動のためにアガロースゲルに適用した。対照には、薄膜凍結乾燥なしでpCVM-β単独または製剤7中のpCMV-βを含め、消化し、電気泳動に適用した。図54に示されるように、pCMV-βをTFFDに供することは、プラスミドの完全性に何ら有意な変化を引き起こさなかった。
総合すると、薄膜凍結乾燥は、純粋なプラスミドDNAを、その化学的完全性を保持したまま、エアロゾル化可能な乾燥粉末に変換するために適用することができると結論づけられる。
実施例6-mRNA-LNPの薄膜凍結および薄膜凍結乾燥
A. TFF-mRNA/LNP乾燥粉末の調製
製剤1:シンチレーションバイアルに、3.5mLのポロキサマー188（1.0mg/mL）を添加した後、10.0mLの緊急使用許可を受けたmRNA COVID-19ワクチン（希釈済み、2.567mg LNP/mL）を添加した。混合物を穏やかに振盪し、極低温冷却（-180℃）ステンレス鋼ドラム上に滴下した。凍結された試料を、液体窒素が充填されたステンレス鋼容器内に捕集した。試料をガラス製凍結乾燥用バイアル内に移し、凍結乾燥機に入れるまで-80℃のフリーザー内で保存した。溶媒を凍結乾燥機で、100mTorr以下で-40℃にて20時間の保持、100mTorrにて20時間で25℃までのランプ制御および100mTorrにて25℃で5時間の保持の処理によって除去した。乾燥窒素ガスを再充填し、バイアルの蓋を閉栓システムによって閉めた後、凍結乾燥機の扉を開いた。保存のため、バイアルをアルミニウムキャップで密封した。
製剤2:シンチレーションバイアルに、10.5mLのスクロース（20.0mg/mL）および4.2mLのポロキサマー188（1.0mg/mL）を添加した後、3.0mLのmRNA COVID-19ワクチン（希釈済み、2.567mg LNP/mL）を添加した。混合物を穏やかに振盪し、極低温冷却（-180℃）ステンレス鋼ドラム上に滴下した。凍結された試料を、液体窒素が充填されたステンレス鋼容器内に捕集した。試料をガラス製凍結乾燥用バイアル内に移し、凍結乾燥機に入れるまで-80℃のフリーザー内で保存した。溶媒を凍結乾燥機で、100mTorr以下で-40℃にて20時間の保持、100mTorrにて20時間で25℃までのランプ制御および100mTorrにて25℃で5時間の保持の処理によって除去した。乾燥窒素ガスを再充填し、バイアルの蓋を閉栓システムによって閉めた後、凍結乾燥機の扉を開いた。保存のため、バイアルをアルミニウムキャップで密封した。
製剤3:シンチレーションバイアルに、8.0mLのトレハロース（20.0mg/mL）および4.6mLのポロキサマー188（1.0mg/mL）を添加した後、2.0mLのmRNA COVID-19ワクチン（希釈済み、および透析して賦形剤を除去済み、2.127mg LNP/mL）を添加した。混合物を穏やかに振盪し、極低温冷却（-180℃）ステンレス鋼ドラム上に滴下した。凍結された試料を、液体窒素が充填されたステンレス鋼容器内に捕集した。試料をガラス製凍結乾燥用バイアル内に移し、凍結乾燥機に入れるまで-80℃のフリーザー内で保存した。溶媒を凍結乾燥機で、100mTorr以下で-40℃にて20時間の保持、100mTorrにて20時間で25℃までのランプ制御および100mTorrにて25℃で5時間の保持の処理によって除去した。乾燥窒素ガスを再充填し、バイアルの蓋を閉栓システムによって閉めた後、凍結乾燥機の扉を開いた。保存のため、バイアルをアルミニウムキャップで密封した。
製剤4:シンチレーションバイアルに、8.0mLのスクロース（20.0mg/mL）および4.6mLのポロキサマー188（1.0mg/mL）を添加した後、2.0mLのmRNA COVID-19ワクチン（希釈済み、および透析して賦形剤を除去済み、2.127mg LNP/mL）を添加した。混合物を穏やかに振盪し、極低温冷却（-180℃）ステンレス鋼ドラム上に滴下した。凍結された試料を、液体窒素が充填されたステンレス鋼容器内に捕集した。試料をガラス製凍結乾燥用バイアル内に移し、凍結乾燥機に入れるまで-80℃のフリーザー内で保存した。溶媒を凍結乾燥機で、100mTorr以下で-40℃にて20時間の保持、100mTorrにて20時間で25℃までのランプ制御および100mTorrにて25℃で5時間の保持の処理によって除去した。乾燥窒素ガスを再充填し、バイアルの蓋を閉栓システムによって閉めた後、凍結乾燥機の扉を開いた。保存のため、バイアルをアルミニウムキャップで密封した。
製剤5:200μL容の遠心チューブに、40μLのスクロース（20.0mg/mL）および13μLのポロキサマー188（1.0mg/mL）を添加した後、10μLのmRNA COVID-19ワクチン（希釈済み、および透析して賦形剤を除去済み、2.16mg LNP/mL）を添加した。混合物を穏やかに振盪し、極低温冷却（-180℃）ステンレス鋼ドラム上に滴下した。凍結された試料を、液体窒素が充填されたステンレス鋼容器内に捕集した。試料をガラス製凍結乾燥用バイアル内に移し、凍結乾燥機に入れるまで-80℃のフリーザー内で保存した。溶媒を凍結乾燥機で、100mTorr以下で-40℃にて20時間の保持、100mTorrにて20時間で25℃までのランプ制御および100mTorrにて25℃で5時間の保持の処理によって除去した。乾燥窒素ガスを再充填し、バイアルの蓋を閉栓システムによって閉めた後、凍結乾燥機の扉を開いた。保存のため、バイアルをアルミニウムキャップで密封した。
棚式凍結乾燥:上記のようにして希釈したばかりのmRNA-LNP製剤1、2および元のmRNA COVIDワクチンでは、慣用的な棚式凍結乾燥を用いた乾燥粉末も調製した。mRNA-LNPの懸濁液（0.6mL）を2mL容の凍結乾燥バイアル内に入れ、このバイアルをAdvantage EL棚式凍結乾燥機内に入れた。棚板温度を室温から-50℃まで1℃/分の速度で下げ、50℃で1時間維持した後、乾燥させた。乾燥サイクルは、薄膜凍結試料から水分を昇華させるために使用したものと同じにした。
B. 透析
承認済みのmRNA COVIDワクチンを少なくとも1,000倍容量のピロ炭酸ジエチル（DEPC）処理水に対して4℃で24時間透析した。次いでLNPの濃度を、透析後の容量変化に基づいて調整した。
例えば、1.200mLの承認済みのmRNA COVIDワクチンを透析チューブ（Spectrum,Stamford,CT）内に入れ、次いで、この透析チューブを、外部ビーカー内の1,500mLのDEPC処理水中に、100rpmの穏やかな撹拌速度下、4℃で24時間入れた。透析液（DEPC処理水）は8時間毎に交換した。最後に、1.398mLの試料を透析チューブから回収した。TFF用の製剤調製のためのLNPの濃度を、容量変化に基づいて計算した。
C. TFF-mRNA/LNP乾燥粉末の特性評価
i. 粒子径分布（PSD）
少量のTFF粉末を使い捨てUVキュベット内に入れ、濾過水（Evoqua,Warrendale,PA）を用いて再構成した。粒子径分布を、Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical Ltd,Malvern,UK）を用いて、分散剤屈折率は1.33および物質屈折率は1.45で測定した。以下の表1に、薄膜凍結乾燥（TFFD）に供される前、TFFDおよび再構成に供された後、ならびに乾燥粉末を冷蔵庫内（約4℃）または温度（約25℃）で3週間保存した後のmRNA-LNPの粒子径（Z-平均）を示す。
（表２６）乾燥粉末の粒子径分布。データは平均±SDである（n＝3）。
Figure 2023522103000029
＊26.67部のLNPは1部のmRNAを含む（w/w）。
＊＊粉末は再構成媒体中に完全には分散せず、大きな粒子が分散媒の表面上に浮いていた。
ii. mRNA封入効率の定量
mRNA/LNP COVIDワクチン製剤中のmRNA負荷を、Quanti-iT RiboGreenアッセイキット（Invitrogen,Carlsbad,CA）を用いて既報のとおりに定量した（Blakney et al.,2019;Yang et al.,2020）。粉末試料を、TFFプロセス前の液体製剤と同じ濃度まで再構成した。すべての試料を、全mRNAを検出するための15分間のインキュベーションのために、0.5％（v/v）Triton X-100（Sigma Aldrich,St.Louis,MO）を含む1×TEバッファー（RNaseフリー）中で2倍、20倍、200倍および2000倍に希釈した。遊離mRNAの検出では、すべての試料を1×TEバッファー（RNaseフリー）中で2倍、20倍、200倍および2000倍に希釈した。Triton X-100処理試料および未処理試料はすべて、RiboGreen試薬とともに黒色96ウェルプレート（Costar,Corning,NY）内でインキュベートした。蛍光強度をBioTek Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダーによって記録した（Winooski,VT、Ex＝485nm、Em＝528nm、ゲイン＝35）。蛍光強度値を、全mRNAおよびLNP外のmRNAについてそれぞれ作成した標準曲線に基づいてmRNA濃度に変換した。封入効率を、以下の式:
Figure 2023522103000030
に従って計算した。
（表２）封入効率
Figure 2023522103000031
iii. 透過型電子顕微鏡（TEM）解析
LNP製剤の形態構造を、FEI Tecnai透過型電子顕微鏡検査を用いて試験した。薄膜凍結乾燥mRNA/LNP粉末を水中で再構成し、精製水で希釈して0.1～0.3mg/mLのLNP濃度を得た。5μLのLNP分散液を200メッシュのカーボンフィルム銅グリッド（Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA）上に添加した。1分後、濾紙を用いてグリッドの端から液体を穏やかに除去した。5μLの1％リンタングステン酸をこのグリッド上に滴下し、試料をネガティブ染色した。1分後、濾紙を用いてグリッドの端から染料を除去した。試料を風乾させた後、画像を収集した。図55参照。
本明細書において開示し、請求項に記載した組成物および方法はすべて、過度の実験を行なうことなく本開示に鑑みて作製および実行することができる。本開示の組成物および方法を好ましい態様に関して報告したが、当業者には、本開示の思想、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法に対して、および本明細書に記載の方法の工程または工程の順序においてバリエーションが適用され得ることが明らかであろう。より詳しくは、化学的にも生理学的にも関連している特定の剤は本明細書に記載の剤の代わりに使用され得るが、同じまたは同様の結果が得られるであろうことが明らかであろう。当業者に明らかな同様のかかる代用例および変形例はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の趣旨、範囲および思想に含まれているとみなす。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示したものに対して補足的な例示的手順の詳細または他の詳細をもたらす程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 2023522103000032
Figure 2023522103000033

Claims (189)

  1. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子および少なくとも第1の賦形剤を含み、超急速凍結プロセス（URF）によって作製された乾燥粉末であって、該ポリヌクレオチド分子が実質的な生物学的活性を保持している、および/または該URFプロセスによって安定化されている、乾燥粉末。
  2. 前記ポリヌクレオチド分子が、URFプロセス前の溶解状態の等量の該ポリヌクレオチド分子と比べて少なくとも約0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％または50％の生物学的活性を保持している、請求項1記載の乾燥粉末。
  3. 溶液中の同じポリヌクレオチド分子と比べて粉末中のポリヌクレオチド分子は少なくとも50％多く未分解であるように、前記ポリヌクレオチド分子が安定化されている、請求項1または請求項2のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  4. URFプロセスが薄膜凍結（TFF）を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  5. ポリヌクレオチド分子が二本鎖分子である、請求項1～4のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  6. ポリヌクレオチド分子が、一本鎖分子、または二本鎖と一本鎖との混合物である、請求項1～4のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  7. ポリヌクレオチド分子がsiRNA、shRNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、プラスミドDNAおよび/またはDNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項1～6のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  8. 乾式Rodos法による測定で約100μm、50μm、30μm、20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～7のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  9. 乾式Rodos法による測定で約1～50μmまたは3～50μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～8のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  10. 約1.0～g/cm3; 2.0 1.4～1.9g/cm3; 1.4～1.9g/cm3; または1.5～1.7g/cm3の密度を有する、請求項1～9のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  11. 約2.0～8.5m2/g; 2.0～7.5m2/g; 3.0～7.5m2/g; 2.0～5.0m2/g; 2.5～4.5m2/g; または3.0～4.0m2/gの表面積を有する、請求項1～10のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  12. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項1～11のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  13. 糖が二糖類である、請求項12記載の乾燥粉末。
  14. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項1～12のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  15. 第1の賦形剤が、重量で粉末の少なくとも約50％を構成する、請求項1～14のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  16. 第1の賦形剤が、重量で粉末の約50％～99.5％; 60％～99％; 70％～99％; 80％～99％; 90％～99％; または95％～99.5％を構成する、請求項1～15のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  17. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項1～15のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  18. pH緩衝剤をさらに含む、請求項1～17のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  19. pH緩衝剤がリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、酢酸ナトリウムまたはMg2＋保存（SM）バッファーを含む、請求項18記載の乾燥粉末。
  20. 20％、15％または10％未満の水分含有量を有する、請求項1～19のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  21. 約0.5％～10％、1％～10％、1.5％～8％または2％～5％の水分含有量を有する、請求項1～20のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  22. 少なくとも第2、第3および/または第4の賦形剤をさらに含む、請求項1～21のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  23. 第2、第3および/または第4の賦形剤がアミノ酸またはタンパク質を含む、請求項22記載の乾燥粉末。
  24. 第2、第3および/または第4の賦形剤がロイシンまたはグリシンを含む、請求項23記載の乾燥粉末。
  25. 第2、第3および/または第4の賦形剤が高分子を含む、請求項22記載の乾燥粉末。
  26. 高分子がPEG、HPMC、PLGA、PVA、デキストラン、アルギン酸ナトリウムまたはPVPを含む、請求項25記載の乾燥粉末。
  27. 前記第2、第3および/または第4のものが糖または糖アルコールを含む、請求項22記載の乾燥粉末。
  28. 2種、3種またはそれより多くの異なる糖または糖アルコールの混合物を含む、請求項27記載の乾燥粉末。
  29. タンパク質または界面活性剤をさらに含む、請求項1～28のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  30. カゼイン、ラクトフェリン、プルロニックF68、チロキサポールまたは重炭酸アンモニウムをさらに含む、請求項1～29のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  31. 第2、第3および/または第4の賦形剤が粉末の約20％w/w～約99.9％w/wを構成する、請求項22～30のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  32. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がウイルスまたはウイルス様粒子（VLP）を含む、請求項1のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  33. ウイルスがノンエンベロープウイルスである、請求項32記載の乾燥粉末。
  34. ウイルスがアデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを含む、請求項32または請求項33記載の乾燥粉末。
  35. ウイルスがバクテリオファージを含む、請求項32記載の乾燥粉末。
  36. バクテリオファージが黄色ブドウ球菌（S.aureus）および/または緑膿菌（P.aeruginosa）に感染する、請求項35記載の乾燥粉末。
  37. バクテリオファージ粒子がファージPEV2またはT7ファージを含む、請求項35記載の乾燥粉末。
  38. 乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項32～37のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  39. 乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項32～37のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  40. 乾式Rodos法による測定で約3～15μm、4～12μmまたは5～10μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項32～39のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  41. 少なくとも約20％の粒子が1～5μmのサイズを有する、請求項32～40のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  42. 少なくとも約25％、30％、35％、40％、45％または50％の粒子が1～5μmのサイズを有する、請求項32～41のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  43. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項32～42のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  44. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項32～43のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  45. 乾燥粉末がアミノ酸をさらに含む、請求項32～44のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  46. アミノ酸がロイシンまたはグリシンを含む、請求項45記載の乾燥粉末。
  47. スクロースおよびロイシンを含む、請求項1～46のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  48. スクロースおよびロイシンを約50:50～95:5; 60:40; 70:30～90:10; または75:25～80:20（スクロース:ロイシン）の比で含む、請求項47記載の乾燥粉末。
  49. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が、脂質ナノ粒子（LNP）内に封入されたポリヌクレオチド分子を含む、請求項1～31のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  50. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がmRNAを含む、請求項1～49のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  51. mRNAが抗原をコードしている、請求項50記載の乾燥粉末。
  52. アジュバントをさらに含む、請求項1～51のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  53. アジュバントがミョウバンを含む、請求項52記載の乾燥粉末。
  54. LNPがイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  55. LNPがカチオン性脂質; DOPE; DPPC; DSPC; DMPE-PEG; DMG-PEG; DSPE-PEG; Dlin-MC3-DMA; リン脂質; PEG-脂質および/またはコレステロールを含む、請求項49～54のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  56. LNPが約25nm～1000nm、50nm～1000nm、50nm～600nmまたは80nm～200nmの平均粒子径を有する、請求項49～55のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  57. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項1～50のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  58. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項1～57のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  59. 約10％～99％または50％～99.5％のラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項57記載の乾燥粉末。
  60. 約80％～99％または約90％～99％のスクロースを含む、請求項1～59のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  61. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がsiRNAを含む、請求項1～60のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  62. LNPがイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む、請求項49～61のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  63. LNPがレシチン、コレステロールおよび/またはポリエチレングリコール（2000）-ヒドラゾン-ステアリン酸を含む、請求項49～62のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  64. LNPがカチオン性脂質を含む、請求項49～63のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  65. LNPが約50nm～500nm、75nm～250nm、80nm～200nm、90nm～175nmまたは100nm～150nmの平均粒子径を有する、請求項49～64のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  66. 乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項49～65のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  67. 乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～66のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  68. 乾式Rodos法による測定で約3～15μm、4～12μmまたは5～10μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～67のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  69. 約2μm～7μm、3μm～7μm、3μm～5μmまたは3.5μm～4.5μmの空気動力学的質量中央径を有する、請求項49～68のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  70. 約25％～60％、30％～50％または35％～40％の細粒分（FPF）値を有する、請求項1～69のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  71. 次世代インパクター（NGI）のステージ4～7において少なくとも10％、15％または20％の沈着を有する、請求項1～70のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  72. 次世代インパクター（NGI）のステージ4～7において約10％～25％; 15％～25％; 10％～20％または15％～22％の沈着を有する、請求項1～71のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  73. siRNAがヌクレオチド30個未満の長さである、請求項61～72のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  74. siRNAがヒト遺伝子または病原体遺伝子を標的とする、請求項61～73のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  75. siRNAがTNF-αを標的とする、請求項61～74のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  76. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が、キトサンと複合体形成されたポリヌクレオチド分子を含む、請求項1～75のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  77. キトサンがPEG化されている、請求項76記載の乾燥粉末。
  78. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が、キトサンと複合体形成されたDNAを含む、請求項1～77のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  79. 溶液中の同じポリヌクレオチド分子と比べて粉末中のポリヌクレオチド分子は少なくとも50％多く未分解であるように、前記DNA分子が安定化されている、請求項78記載の乾燥粉末。
  80. 前記DNAがプラスミドDNAを含む、請求項78記載の乾燥粉末。
  81. キトサンと複合体形成された、CRISPR/Cas9エレメントをコードしているDNA
    を含む、請求項1～80のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  82. キトサンと複合体形成された、ガイドRNAをコードしているDNA
    を含む、請求項1～81のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  83. キトサン複合体が約100nm～2000nmの平均サイズを有する、請求項76～82のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  84. キトサン複合体が約100nm～1000nm、150nm～800nmまたは200nm～800nmの平均サイズを有する、請求項76～83のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  85. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項76～84のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  86. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項1～85のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  87. 約5％～90％の糖または糖アルコールを含む、請求項85記載の乾燥粉末。
  88. 約10％～90％、10％～70％または10％～50％のトレハロース、スクロースおよび/またはマンニトールを含む、請求項76～87のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  89. 乾式Rodos法による測定で約100μm、50μm、30μm、20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～88のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  90. 乾式Rodos法による測定で約1～50μmまたは3～50μmの幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項1～89のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  91. 約1.0～g/cm3; 2.0 1.4～1.9g/cm3; 1.4～1.9g/cm3; または1.5～1.7g/cm3の密度を有する、請求項1～90のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  92. 約2.0～8.5m2/g; 2.0～7.5m2/g; 3.0～7.5m2/g; 2.0～5.0m2/g; 2.5～4.5m2/g; または3.0～4.0m2/gの表面積を有する、請求項1～91のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  93. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がゲノム材料を含む、請求項1～92のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  94. ゲノム材料が細菌、真核生物または古細菌のゲノム材料を含む、請求項93記載の乾燥粉末。
  95. インタクトな細胞を含む、請求項1～94のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  96. 生細胞を含む、請求項1～95のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  97. インタクトな細菌細胞、真核生物細胞または古細菌細胞を含む、請求項1～96のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  98. インタクトな細菌細胞を含む、請求項1～97のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  99. 細菌生細胞を含む、請求項1～98のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  100. 細菌細胞がグラム陰性菌を含む、請求項97～99のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  101. 細菌細胞がグラム陽性菌を含む、請求項97～99のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  102. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項1～101のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  103. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項1～102のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  104. 第1の賦形剤がスクロースを含む、請求項100記載の乾燥粉末。
  105. 吸入による投与のために製剤化される、請求項1～104のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  106. 吸入器を用いた使用のために製剤化される、請求項1～104のいずれか一項記載の乾燥粉末。
  107. 請求項1～106のいずれか一項記載の粉末を含む、吸入器。
  108. 固定用量配合剤吸入器、単回用量乾燥粉末吸入器、反復用量乾燥粉末吸入器、反復単位用量乾燥粉末吸入器、定量吸入器または加圧噴霧式定量吸入器である、請求項107記載の吸入器。
  109. カプセルベースの吸入器である、請求項107記載の吸入器。
  110. 低抵抗吸入器である、請求項107記載の吸入器。
  111. 高抵抗吸入器である、請求項107記載の吸入器。
  112. 約10 L/分～約150 L/分の流速で使用される、請求項107記載の吸入器。
  113. 流速が約20 L/分～約100 L/分である、請求項112記載の吸入器。
  114. （a）前駆体溶液を形成させるために、封入された生物学的に活性なポリヌクレオチド分子と第1の賦形剤とを溶媒中で混合する段階;
    （b）該溶媒の凍結を引き起こすのに適した温度で、該前駆体溶液を表面上に沈着させる段階;および
    （c）粉末薬学的組成物を得るために、該溶媒を除去する段階
    を含む、粉末薬学的組成物の作製方法。
  115. （d）粒子径を縮小するおよび/または粒子径を均一化するために粉末薬学的組成物を脱凝集させる段階
    をさらに含む、請求項114記載の方法。
  116. 前駆体溶液が水を含む、請求項114または請求項115のいずれか一項記載の方法。
  117. 粉末薬学的組成物が20％、15％または10％未満の水分含有量を有する、請求項114～116のいずれか一項記載の方法。
  118. 粉末薬学的組成物が約0.5％～10％、1％～10％、1.5％～8％または2％～5％の水分含有量を有する、請求項114～117のいずれか一項記載の方法。
  119. 工程（b）の温度が約-40℃～-180℃である、請求項114～118のいずれか一項記載の方法。
  120. 工程（b）の温度が約-50℃～-150℃、-50℃～-125℃、-55℃～-100℃または-65℃～-75℃である、請求項114～119のいずれか一項記載の方法。
  121. 前駆体溶液がpH緩衝剤を含む、請求項114～120のいずれか一項記載の方法。
  122. 前駆体溶液が約6.0～8.0、6.5～8.0または7.0～7.8のpHを有する、請求項114～121のいずれか一項記載の方法。
  123. 前駆体溶液が約0.1％～30％、0.1％～20％、0.5％～10％または0.5％～5％の第1の賦形剤を含む、請求項114～122のいずれか一項記載の方法。
  124. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項114～123のいずれか一項記載の方法。
  125. 前駆体溶液が約0.1％～5％; 0.1％～3％または0.5％～5％のトレハロース、スクロースおよび/またはマンニトールを含む、請求項114～124のいずれか一項記載の方法。
  126. 前駆体溶液が約0.1％～50％の固形分を有する、請求項114～125のいずれか一項記載の方法。
  127. 前駆体溶液が約0.1％～20％の固形分を有する、請求項114～126のいずれか一項記載の方法。
  128. 前駆体溶液が少なくとも約0.25％の固形分を有する、請求項114～127のいずれか一項記載の方法。
  129. 前駆体溶液が0.25％～10％; 0.5％～10％; 1％～5％または2％～5％の固形分を有する、請求項114～128のいずれか一項記載の方法。
  130. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がウイルスまたはバクテリオファージを含む、請求項114～129のいずれか一項記載の方法。
  131. ウイルスがノンエンベロープウイルスである、請求項130記載の方法。
  132. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がバクテリオファージを含む、請求項130記載の方法。
  133. 前駆体溶液が約1×106～1×1012; 1×106～1×1011; 1×107～1×1010; または5×108～1×109プラーク形成単位/ml（PFU/mL）またはフォーカス形成単位/ml（ffu/ml）を含む、請求項1～132のいずれか一項記載の方法。
  134. 粉末薬学的組成物が、前駆体溶液中での力価と比べて力価が（プラーク形成単位/ml（PFU/mL）またはフォーカス形成単位/ml（ffu/ml）で）3.5log未満減少したウイルスまたはバクテリオファージ粒子を有する、請求項1～133のいずれか一項記載の方法。
  135. 粉末薬学的組成物が、前駆体溶液中での力価と比べて力価が（PFU/mLまたはffu/mlで）3.0、2.5、2.0、1.5、1.0または0.5log未満減少したウイルスまたはバクテリオファージ粒子を有する、請求項114～134のいずれか一項記載の方法。
  136. 工程（b）の温度が約-40℃～-150℃、-50℃～-125℃、-55℃～-100℃または-65℃～-75℃である、請求項114～135のいずれか一項記載の方法。
  137. 工程（b）の温度が約-40℃～-100℃、-40℃～-90℃、-40℃～-80℃または-50℃～-75℃である、請求項114～136のいずれか一項記載の方法。
  138. 前駆体溶液がロイシンを含む、請求項114～137のいずれか一項記載の方法。
  139. 前駆体溶液がロイシンおよびスクロースを含む、請求項114～138のいずれか一項記載の方法。
  140. 前駆体溶液がスクロースおよびロイシンを約50:50～95:5; 60:40; 70:30～90:10; または75:25～80:20（スクロース:ロイシン）の比で含む、請求項114～139のいずれか一項記載の方法。
  141. 粉末薬学的組成物が乾式Rodos法による測定で15μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項114～140のいずれか一項記載の方法。
  142. 粉末薬学的組成物が乾式Rodos法による測定で約20μm、15μmまたは12μm未満の幾何学的粒子径分布Dv50を有する、請求項114～141のいずれか一項記載の方法。
  143. 少なくとも20％の粒子が1～5μmのサイズを有する、請求項114～142のいずれか一項記載の方法。
  144. 少なくとも25％、30％、35％、40％、45％または50％の粒子が1～5μmのサイズを有する、請求項114～143のいずれか一項記載の方法。
  145. 前駆体溶液がpH緩衝剤を含む、請求項114～144のいずれか一項記載の方法。
  146. pH緩衝剤がPBSまたはSMバッファーである、請求項145記載の方法。
  147. pH緩衝剤がSMバッファーであり、前駆体溶液がトレハロースおよびロイシンを含む、請求項145または請求項146のいずれか一項記載の方法。
  148. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が、脂質ナノ粒子（LNP）内に封入されたポリヌクレオチド分子を含む、請求項114～147のいずれか一項記載の方法。
  149. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がmRNAを含む、請求項114～148のいずれか一項記載の方法。
  150. LNPがイオン化脂質、リン脂質、コレステロール、レシチンおよび/またはポリ（エチレン）グリコール（PEG）-脂質を含む、請求項148記載の方法。
  151. LNPが約25nm～1000nm、50nm～1000nm、50nm～600nmまたは80nm～200nmの平均粒子径を有する、請求項148～150のいずれか一項記載の方法。
  152. 前駆体溶液が約10％～30％または15％～25％のラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項114～151のいずれか一項記載の方法。
  153. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がsiRNAを含む、請求項114～148のいずれか一項記載の方法。
  154. siRNAがヌクレオチド30個未満の長さである、請求項153記載の方法。
  155. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が、キトサンと複合体形成されたポリヌクレオチド分子を含む、請求項114～154のいずれか一項記載の方法。
  156. キトサンがPEG化されている、請求項155記載の方法。
  157. キトサンと複合体形成されたDNA分子を含む、請求項114～156のいずれか一項記載の方法。
  158. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がゲノム材料を含む、請求項114～157のいずれか一項記載の方法。
  159. 生物学的に活性なポリヌクレオチド分子がインタクトな細胞内に含まれている、請求項114～158のいずれか一項記載の方法。
  160. インタクトな細胞が生細胞を含む、請求項159記載の方法。
  161. インタクトな細胞が、インタクトな細菌細胞、真核生物細胞または古細菌細胞を含む、請求項159記載の方法。
  162. インタクトな細胞が、インタクトな細菌細胞を含む、請求項159記載の方法。
  163. インタクトな細胞が細菌生細胞を含む、請求項159記載の方法。
  164. 第1の賦形剤が糖または糖アルコールを含む、請求項114～163のいずれか一項記載の方法。
  165. 第1の賦形剤がラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む、請求項114～164のいずれか一項記載の方法。
  166. 第1の賦形剤がスクロースを含む、請求項114～165のいずれか一項記載の方法。
  167. 前記表面が回転式である、請求項114～166のいずれか一項記載の方法。
  168. 溶媒が減圧下で除去される、請求項114～167のいずれか一項記載の方法。
  169. 溶媒が凍結乾燥によって除去される、請求項114～168のいずれか一項記載の方法。
  170. 凍結乾燥が約-20℃～約-100℃の凍結乾燥温度で行なわれる、請求項114～169のいずれか一項記載の方法。
  171. 凍結乾燥温度が約-40℃である、請求項170記載の方法。
  172. 減圧が400mTor; 350mTorr; 300mTorrまたは250mTorr未満である、請求項168～171のいずれか一項記載の方法。
  173. 減圧が約100mTorrである、請求項168～172のいずれか一項記載の方法。
  174. GMPの方法である、請求項114～173のいずれか一項記載の方法。
  175. 請求項114～174のいずれか一項記載の方法に従って調製される、薬学的組成物。
  176. 請求項1～113のいずれか一項記載の組成物または請求項114～174のいずれか一項記載の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階
    を含む、肺疾患、肺損傷または肺感染症の処置方法。
  177. 肺疾患が間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、嚢胞性線維症（CF）、肺線維症または原発性線毛運動不全症（PCD）である、請求項176記載の方法。
  178. 肺感染症が細菌性肺感染症である、請求項176記載の方法。
  179. 前記組成物がバクテリオファージを含む、請求項176～178のいずれか一項記載の方法。
  180. 前記組成物がLNPを含む、請求項176～176のいずれか一項記載の方法。
  181. 前記組成物がsiRNAを含む、請求項176～180のいずれか一項記載の方法。
  182. 前記組成物がmRNAを含む、請求項176～180のいずれか一項記載の方法。
  183. 請求項1～113のいずれか一項記載の組成物または請求項114～174のいずれか一項記載の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階
    を含む、対象の免疫応答の賦活化方法であって、
    前記生物学的に活性なポリヌクレオチド分子が抗原をコードしている、方法。
  184. 前記組成物がLNPおよびmRNAを含む、請求項183記載の方法。
  185. 請求項1～113のいずれか一項記載の組成物または請求項114～174のいずれか一項記載の方法によって作製される組成物の有効量を対象に投与する段階
    を含む、対象の疾患を処置する方法。
  186. 疾患が遺伝性疾患である、請求項185記載の方法。
  187. 疾患が肺疾患である、請求項185記載の方法。
  188. 疾患が感染症である、請求項185記載の方法。
  189. （i）請求項1～113のいずれか一項記載の組成物または請求項114～174のいずれか一項記載の方法によって作製される組成物を、薬学的に許容されるビヒクル中で再構成する段階;および
    （ii）再構成された該組成物の有効量を対象に投与する段階
    を含む、対象の疾患を処置する方法。
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