CN115996707A - 生物活性干粉组合物及其制造和使用方法 - Google Patents

生物活性干粉组合物及其制造和使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了包含生物活性多核苷酸分子的干粉组合物以及用于制造此类干粉的方法。在一些方面，实施方案的干粉包含与纳米颗粒复合的可表达或调节(例如，siRNA)多核苷酸分子。还提供了包含活病毒和细菌的干粉。

Description

生物活性干粉组合物及其制造和使用方法
本申请要求于2020年4月20日提交的美国临时申请号63/012,792的优先权利益，所述美国临时申请的全部内容在此通过引用并入。
背景技术
1.技术领域
本公开内容一般涉及药物制剂、生物制品及其制造领域。更具体地，它涉及包括病毒、细菌和多核苷酸分子的干粉组合物，以及例如通过薄膜冷冻制备粉末组合物的方法。
2.相关技术的描述
最近的药物开发已用于新的治疗部分，例如包括生物活性多核苷酸的组合物。例如，正在研究用于递送治疗性蛋白质和抗原的mRNA。同样地，正在探索用于基因替代的CRISPR技术，并且正在开发用于敲减不期望的基因活性的小干扰RNA(siRNA)。另外，整个细胞(例如细菌细胞)和病毒组合物提供了潜在的新治疗和疫苗接种部分。然而，在所有这些情况下，都需要新的制剂和配制方法，其允许组合物得到稳定并维持生物活性。同样地，需要新的制剂和方法，以提供将疗法递送给有需要的患者的有效方式。
发明内容
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含生物活性多核苷酸分子和至少第一赋形剂的干粉组合物，所述干粉已通过超快速冷冻工艺(URF)进行生产，其中所述多核苷酸分子保留了显著的生物活性和/或已通过URF工艺得到稳定。在一些方面，与URF工艺之前溶液中的等量多核苷酸分子相比，多核苷酸分子保留至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的生物活性。在一些方面，多核苷酸分子已这样得到稳定，使得粉末中至少50％以上的分子相对于溶液中的相同多核苷酸分子是未降解的。在一些方面，URF工艺包含薄膜冷冻(TFF)。在一些方面，多核苷酸分子是双链分子。在一些方面，多核苷酸分子是单链分子或双链分子和单链分子的混合物。在一些方面，多核苷酸分子包含siRNA、shRNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、质粒DNA和/或DNA寡核苷酸。
在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约100μm、50μm、30μm、20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。在进一步的方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，约1至50μm或3至50μu的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有约1.0至g/cm3；2.01.4至1.9g/cm3；1.4至1.9g/cm3；或1.5至1.7g/cm3的密度。在一些方面，粉末具有约2.0至8.5m2/g；2.0至7.5m2/g；3.0至7.5m2/g；2.0至5.0m2/g；2.5至4.5m2/g；或3.0至4.0m2/g的表面积。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在进一步的方面，糖是二糖。在一些方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，第一赋形剂构成按重量计至少约50％的粉末。在进一步的方面，第一赋形剂构成按重量计约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％至约99.5％的粉末。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。
在一些方面，干粉组合物进一步包含pH缓冲剂。在一些方面，pH缓冲剂包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙酸钠或Mg2+贮存(SM)缓冲液。在一些方面，药物干粉组合物具有小于20％、15％或10％的含水量。在一些方面，药物干粉组合物具有约0.5％至10％、1％至10％、1.5％至8％或2％至5％的含水量。在一些方面，干粉组合物进一步包含至少第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂。在进一步的方面，第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含氨基酸或蛋白质。在另外进一步的方面，第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含亮氨酸或甘氨酸。在一些方面，第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含聚合物。在进一步的方面，聚合物包含PEG、HPMC、PLGA、PVA、葡聚糖、海藻酸钠或PVP。在一些方面，第二、第三和/或第四赋形剂包含糖或糖醇。在进一步的方面，粉末包含两种、三种或更多种不同糖或糖醇的混合物。在一些方面，干粉组合物进一步包含蛋白质或表面活性剂。在一些方面，干粉组合物进一步包含酪蛋白、乳铁蛋白、普兰尼克F68、泰洛沙泊或碳酸氢铵。在一些方面，赋形剂构成约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％至约99.9％的粉末，例如约20％w/w至约99.9％w/w的粉末。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含病毒或病毒样颗粒(VLP)。在进一步的方面，病毒是无包膜病毒。在另外进一步的方面，病毒包含腺伴随病毒、腺病毒、腺伴随病毒载体或腺病毒载体。在一些方面，病毒包含细菌噬菌体。在进一步的方面，细菌噬菌体感染金黄色葡萄球菌(S.aureus)和/或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。在一些方面，细菌噬菌体颗粒包含噬菌体PEV2或T7噬菌体。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，约3至15μm、4至12μm或5至10μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％至约50％的颗粒具有1-5μm的大小，例如约20％。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在进一步的方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，干粉进一步包含氮基酸。在进一步的方面，氨基酸包含亮氨酸或甘氮酸。在一些方面，干粉组合物包含蔗糖和亮氨酸。在进一步的方面，蔗糖和亮氨酸以约50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10至约95∶5，例如约50∶50至约95∶5、约60∶40、约70∶30至约90∶10；或约75∶25至约80∶20(蔗糖∶亮氨酸)的比率存在。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含封装在脂质纳米颗粒(LNP)中的多核苷酸分子。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含mRNA。在进一步的方面，mRNA编码抗原。在一些方面，干粉组合物进一步包含佐剂。在一些方面，佐剂包含铝盐，例如明矾。在一些方面，LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。在一些方面，LNP包含阳离子脂质；DOPE；DPPC；DSPC；DMPE-PEG；DMG-PEG；DSPE-PEG；Dlin-MC3-DMA；磷脂；PEG-脂质和/或胆固醇。在一些方面，LNP具有约25nm至1000nm、50nm至1000nm；50nm至600nm、或80nm至200nm的平均粒度。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在进一步的方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，干粉组合物包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％至约99％的乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，例如约10％至约99％或约50％至约99.5％的乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，干粉组合物包含约80％至约99％或约90％至约99％的蔗糖。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含siRNA。在一些方面，LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。在一些方面，LNP包含卵磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇(2000)-腙-硬脂酸。在一些方面，LNP包含阳离子脂质。在一些方面，LNP具有以下的平均粒度：约50nm、约75nm、约100nm、约125nm、约150nm、约175nm、约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm或约500nm，例如约50nm至约500nm、约75nm至约250nm、约80nm至约200nm、约90nm至约175nm、或约100nm至约150nm。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。在进一步的方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，约3至15μmm、4至12μm或5至10μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有约2μm至7μm、3μm至7μm、3μm至5μm或3.5μm至4.5μm的质量中值空气动力学直径。在一些方面，粉末具有约25％至60％、30％至50％或35％至40％的细颗粒分数(FPF)值。在一些方面，粉末在新一代撞击器(NextGeneration Impactor)(NGI)的阶段4-7中具有至少10％、15％或20％的沉积。在进一步的方面，粉末在新一代撞击器(NGI)的阶段4-7中具有约10％至25％；15％至25％；10％至20％或15％至22％的沉积。在一些方面，siRNA的长度小于30个核苷酸。在一些方面，siRNA靶向人基因或病原体基因。在一些方面，siRNA靶向TNF-α。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的多核苷酸分子。在进一步的方面，壳聚糖是聚乙二醇化的。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的DNA。在一些方面，DNA分子已这样得到稳定，使得粉末中至少50％以上的分子相对于溶液中的相同多核苷酸分子是未降解的。在一些方面，DNA包含质粒DNA。在一些方面，干粉组合物包含与壳聚糖复合的编码CRISPR/Cas9元件的DNA。在一些方面，干粉组合物包含与壳聚糖复合的编码引导RNA的DNA。在一些方面，壳聚糖复合物具有约100nm至2000nm的平均大小。在一些方面，壳聚糖复合物具有约100nm至1000nm；150nm至800nm或200nm至800nm的平均大小。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在一些方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，干粉组合物包含约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％至约90％的糖或糖醇，例如如约5％至90％的糖或糖醇。在一些方面，干粉组合物包含约10％至约90％、约10％至约70％、或约10％至约50％的海藻糖、蔗糖和/或甘露糖醇。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约100μm、50μm、30μm、20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有通过干Rodos法测量的，约1至50μm或3至50μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末具有约1.0至g/cm3至约2.0g/cm3、约1.4至约1.9g/cm3、约1.4至1.9g/cm3、或约1.5至约1.7g/cm3的密度。在一些方面，粉末具有约2.0至8.5m2/g；2.0至7.5m2/g；3.0至7.5m2/g；2.0至5.0m2/g；2.5至4.5m2/g；或3.0至4.0m2/g的表面积。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含基因组材料。在一些方面，基因组材料包含细菌、真核或古细菌基因组材料。在一些方面，粉末包含完整细胞。在一些方面，粉末包含活细胞。在一些方面，粉末包含完整的细菌、真核或古细菌细胞。在一些方面，粉末包含完整的细菌细胞。在一些方面，粉末包含活细菌细胞。在一些方面，细菌细胞包含革兰氏阴性细菌。在一些方面，细菌细胞包含革兰氏阳性细菌。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在一些方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，第一赋形剂包含蔗糖。在一些方面，粉末被配制用于经由吸入施用。在一些方面，粉末被配制用于与吸入器一起使用。
在其它实施方案中，本公开内容提供了包含本公开内容的干粉组合物的吸入器。在一些方面，吸入器是固定剂量组合吸入器、单剂量干粉吸入器、多剂量干粉吸入器、多单位剂量干粉吸入器、定量吸入器或加压定量吸入器。在一些方面，吸入器是基于胶囊的吸入器。在一些方面，吸入器是低阻力吸入器。在一些方面，吸入器是高阻力吸入器。在一些方面，吸入器以约10L/分钟至约150L/分钟的流速使用。在一些方面，流速为约20L/分钟至约100L/分钟。
在再其它实施方案中，本公开内容提供了生产干粉药物组合物的方法，其包括：(a)将封装的生物活性多核苷酸分子和第一赋形剂在溶剂中混合，以形成前体溶液；(b)在适合于促使溶剂冷冻的温度下，将前体溶液沉积到表面上；并且(c)去除溶剂，以获得粉末药物组合物。在一些方面，该方法进一步包括：(d)分解粉末药物组合物，以减少粒度和/或使粒度均匀。
在一些方面，前体溶液包含水。在一些方面，粉末药物组合物具有小于20％、15％或10％的含水量。在一些方面，粉末药物组合物具有约0.5％至10％、1％至10％、1.5％至8％或2％至5％的含水量。在一些方面，步骤(b)中的温度为约-40℃至-180℃。在一些方面，步骤(b)中的温度为约-50℃至-150℃、-50℃至-125℃、-55℃至-100℃或-65℃至-75℃。在一些方面，前体溶液包含pH缓冲剂。在一些方面，前体溶液具有约6.0至8.0、6.5至8.0或7.0至7.8的pH。在一些方面，前体溶液包含约0.1％至30％、0.1％至20％、0.5％至10％或0.5％至5％的第一赋形剂。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在一些方面，前体溶液包含约0.1％至5％；0.1％至3％或0.5％至5％的海藻糖、蔗糖和/或甘露糖醇。在一些方面，前体溶液具有约0.1％至50％的固体含量。在一些方面，前体溶液具有约0.1％至20％的固体含量。在一些方面，前体溶液具有至少约0.25％的固体含量。在一些方面，前体溶液具有0.25％至10％：0.5％至10％；1％至5％或2％至5％的固体含量。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含病毒或细菌噬菌体。在一些方面，病毒是无包膜病毒。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含细菌噬菌体。在一些方面，前体溶液包含约1x106至1x1012：1x106至1x1011：1x107至1x1010；或5x108至1x109噬斑形成单位/ml(PFU/mL)或病灶形成单位/ml(ffu/ml)。在一些方面，与前体溶液中的滴度相比，粉末药物组合物具有损失小于3.5对数滴度(以噬斑形成单位/ml(PFU/mL)或病灶形成单位/ml(ffu/ml)计)的病毒或细菌噬菌体颗粒。在一些方面，与前体溶液中的滴度相比，粉末药物组合物具有损失小于3.0、2.5、2.0、1.5、1.0或0.5对数滴度(以PFU/mL或FFU/ml计)的病毒或细菌噬菌体颗粒。在一些方面，步骤(b)中的温度为约-40℃至-150℃、-50℃至-125℃、-55℃至-100℃或-65℃至-75℃。在一些方面，步骤(b)中的温度为约-40℃至-100℃、-40℃至-90℃、-40℃至-80℃或-50℃至-75℃。在一些方面，前体溶液包含亮氨酸。在一些方面，前体溶液包含亮氨酸和蔗糖。在一些方面，前体溶液包含比率为约50∶50至95∶5；60∶40；70∶30至90∶10；或75∶25至80∶20(蔗糖∶亮氨酸)的蔗糖和亮氨酸。在一些方面，粉末药物组合物具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。在一些方面，粉末药物组合物具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12℃n的几何粒度分布Dv50。在一些方面，至少20％的颗粒具有1-5μm的大小。在一些方面，至少25％、30％、35％、40％、45％或50％的颗粒具有1-5μm的大小。在一些方面，前体溶液包含pH缓冲剂。在一些方面，pH缓冲剂是PBS或SM缓冲剂。在一些方面，pH缓冲剂是SM缓冲剂，并且前体溶液包含海藻糖和亮氨酸。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含封装在脂质纳米颗粒(LNP)中的多核苷酸分子。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含mRNA。在一些方面，LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。在一些方面，LNP具有约25nm至1000nm、50nm至1000nm；50nm至600nm、或80nm至200nm的平均粒度。在一些方面，前体溶液包含约10％至30％或15％至25％的乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含siRNA。在一些方面，siRNA的长度小于30个核苷酸。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的多核苷酸分子。在一些方面，壳聚糖是聚乙二醇化的。在一些方面，LNP包含与壳聚糖复合的DNA分子。
在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含基因组材料。在一些方面，生物活性多核苷酸分子包含在完整细胞中。在一些方面，完整细胞包含活细胞。在一些方面，完整细胞包含完整的细菌、真核或古细菌细胞。在一些方面，完整细胞包含完整的细菌细胞。在一些方面，完整细胞包含活细菌细胞。在一些方面，第一赋形剂包含糖或糖醇。在一些方面，第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。在一些方面，第一赋形剂包含蔗糖。在一些方面，材料沉积在其上的表面是旋转的。在一些方面，在减压下去除溶剂。在一些方面，经由冻干去除溶剂。在一些方面，冻干在约-20℃至约-100℃的冻干温度下进行。在一些方面，冻干温度为约-40℃。在一些方面，减压是小于400mTor；350mTorr；300mTorr或250mTorr。在一些方面，减压是约100mTorr。在一些方面，方法是GMP方法。
在其它实施方案中，本公开内容提供了根据本公开内容的方法制备的药物组合物。
在另外其它的实施方案中，本公开内容提供了治疗肺疾病、肺损伤或肺部感染的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开内容的组合物或通过本公开内容的方法产生的组合物。在一些方面，肺疾病是间质性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、囊性纤维化(CF)、肺纤维化或原发性纤毛运动障碍(PCD)。在一些方面，肺部感染是细菌性肺部感染。在一些方面，包含细菌噬菌体。在一些方面，组合物包含LNP。在一些方面，组合物包含siRNA。
在再其它实施方案中，本公开内容提供了刺激受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开内容的组合物或通过本公开内容的方法产生的组合物，其中所述生物活性多核苷酸分子编码抗原。在一些方面，组合物包含LNP和mRNA。
在其它实施方案中，本公开内容提供了治疗受试者中的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开内容的组合物或通过本公开内容的方法产生的组合物。在一些方面，疾病是遗传疾病。在一些方面，疾病是肺疾病。在一些方面，疾病是感染。
在另外其它实施方案中，本公开内容提供了治疗受试者中的疾病的方法，其包括：(i)在药学上可接受的媒介物中，重构本公开内容的组合物或通过本公开内容的方法产生的组合物；并且(ii)将有效量的重构组合物施用于受试者。
本发明的其它目的、特征和优点根据下述详细描述将变得显而易见。然而，应该理解，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的某些实施方案，但仅作为说明给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
下述附图构成本说明书的部分，并且被包括以进一步证实本公开内容的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本公开内容。
图1显示了在用不同赋形剂基质的薄膜冷冻干燥后T7的滴度损失。注意：Y轴的两段不在同一刻度上。
图2显示了不同TFFD噬菌体制剂的几何粒度分布。
图3显示了在用以不同固体含量的各种赋形剂基质的薄膜冷冻干燥后T7的滴度损失。注意：Y轴的两段不在同一刻度上。
图4显示了TFFD处理的具有不同固体含量的噬菌体制剂的几何粒度分布。
图5显示了在不同温度下的薄膜冷冻干燥后T7的滴度损失。
图6显示了在不同温度下处理的TFFD噬菌体制剂的几何粒度分布。
图7显示了在薄膜冷冻干燥后，具有不同初始噬菌体浓度的制剂中T7的滴度损失。注意：5E10、5E09、5E08、5E07和5E06分别是5x1010PFU/mL、5x109PFU/mL、5x108PFU/mL、5x107PFU/mL和5x106PFU/mL的替代表达。
图8显示了用不同噬菌体浓度处理的TFFD噬菌体制剂的几何粒度分布。注意：5E10、5E09、5E08、5E07和5E06分别是5x1010PFU/mL、5x109PFU/mL、5x108PFU/mL、5x107PFU/mL和5x106PFU/mL的替代表达。
图9显示了在不同缓冲系统中的薄膜冷冻干燥后T7的滴度损失。
图10显示了用无缓冲液、PBS缓冲液或SM缓冲液处理的TFFD噬菌体制剂的几何粒度分布。
图11显示了在薄膜冷冻干燥的每个步骤中T7噬菌体的滴度损失。
图12显示了TFFD噬菌体粉末的X射线衍射图。
图13显示了通过扫描电子显微镜检查的粉末形态图像。
图14显示了通过透射电子显微镜检查的噬菌体形态图像。
图15显示TFFD噬菌体粉末的热重分析曲线。
图16显示了通过TGA确定的TFFD噬菌体粉末中的含水量。
图17显示了通过百分比GFP表达(左轴)和荧光强度(右轴)测量的，在HEK-293细胞中以不同N/P比的LNP制剂的细胞内摄取。
图18A-18D显示了LNP制剂的表征。(图18A)大小、(图18B)ζ电位、(图18C)封装效率和(图18D)pKa。通过在第1天以及在从制备和4℃下贮存14天后测量大小和ζ电位，来评估脂质纳米颗粒的稳定性。(平均值±SD，n＝3)。
图19A-19C显示了按照(a)大小、(b)ζ电位和(c)封装效率，在雾化前和雾化后LNP制剂的稳定性。雾化制剂的大小(***p＝0.0004)和封装效率(****p＜0.0001)与雾化前制剂显著不同。
图20A和20B显示了在LNP制备后的16天内，HEK-293细胞中的细胞内摄取效率。(图20A)百分比GFP表达，和(图20B)荧光强度。
图21A-21D显示了在HEK-293和NuLi-1细胞中，在雾化前和雾化后，按照LNP制剂的百分比GFP表达(图21A和21C)和荧光强度(图21B和21D)的体个细胞内摄取。
图22A和22B显示了具有萤光素酶mRNA的F2、F8、F11、F17制剂的功效和生物分布。(图22A)在15μg总mRNA的气管内递送后6小时，如以总发光通量测量的，在肺中在雾化前和雾化后四种先导制剂的功效。(图22B)通过IVIS成像测量的，在肺、心脏、肝和肾中的萤光素酶表达的代表性图像。
图23A-23D显示了粒度和PEG-脂质之间的相关性。(图23A)PEG-脂质摩尔比对雾化前的粒度的作用。(图23B)PEG-脂质类型对雾化前的粒度的作用。(图23C)PEG-脂质摩尔比对雾化后的粒度的作用。(图23D)PEG-脂质类型对雾化后的粒度的作用。
图24A-24D显示了ζ电位和PEG-脂质之间的相关性。(图24A)PEG-脂质摩尔比对雾化前的ξ电位的显著作用。(图24B)PEG-脂质类型对雾化前的ζ电位的显著作用。(图24C)PEG-脂质摩尔比对雾化后的ζ电位的显著作用。(图24D)PEG-脂质类型对雾化后的ζ电位的显著作用。
图25A-25D显示了封装效率与胆固醇摩尔比和磷脂类型的相关性。(图25A)在雾化前的封装效率和胆固醇摩尔比之间的显著相关性(p＜0.05)。(图25B)磷脂类型对雾化前的封装效率没有显著作用(p＞0.05)。(图25C)在雾化后的封装效率和胆固醇摩尔比之间没有显著相关性。(图25D)磷脂类型对雾化后的封装效率的显著作用。**p＜0.01。
图26A-26F显示了细胞内摄取(百分比GFP表达和荧光强度)与PEG-脂质摩尔比或磷脂类型之间的相关性分析。(图26A)PEG-脂质摩尔比对雾化前的百分比GFP表达的显著作用。(图26B)磷脂类型对雾化前的百分比GFP表达的显著作用。(图26C)PEG-脂质摩尔比对雾化前的百分比GFP表达的显著作用。(图26D)PEG-脂质摩尔比对雾化后的百分比GFP表达的显著作用。(图26E)磷脂类型对雾化后的百分比GFP表达没有显著作用。(图26F)PEG-脂质摩尔比对雾化后的荧光强度的显著作用。
图27A-27H显示了按照百分比GFP表达和荧光强度的细胞内摄取的正交趋势，其中虚线表示不显著，并且实线表示显著。(图27A-27D)：在雾化前的细胞内摄取和制剂性质之间的相关性。(图27E-27H)：在雾化后的细胞内摄取和制剂性质之间的相关性。
图28A-28C显示了LNP制剂的表征。(图28A)大小、(图28B)ξ电位和(图28C)封装效率。
图29A-29D显示了在HEK-293和NuLi-1细胞中，按照LNP制剂的百分比GFP表达(图29A和29B)和荧光强度(图29C和29D)的体外细胞内摄取。
图30A-30F显示了42种干粉制剂的肉眼外观。(图30A)含有甘露糖醇的制剂，(图30B)含有甘露糖醇和亮氨酸的制剂，(图30C)含有蔗糖的制剂，(图30D)含有蔗糖和亮氨酸的制剂，(图30E)含有海藻糖的制剂，(图30F)含有海藻糖和亮氨酸的制剂。
图31A-31F显示了重构的干粉制剂的大小、PDI和ζ电位。(图31A)含有甘露糖醇连同/不连同亮氨酸的重构TFF制剂的大小和PDI，(图31B)含有蔗糖连同/不连同亮氨酸的重构制剂的大小和PDI，(图31C)含有海藻糖连同/不连同亮氨酸的重构TFF制剂的大小和PDI，(图31D)含有甘露糖醇连同/不连同亮氨酸的重构TFF制剂的ξ电位，(图31E)含有蔗糖连同/不连同亮氨酸的重构TFF制剂的ξ电位，(图31E)含有海藻糖连同/不连同亮氨酸的重构TFF制剂的ξ电位。
图32显示了重构制剂的转染效率。
图33显示了纳米复合物的结构。
图34显示了六种精制干粉制剂的扫描电子显微镜检查图像。
图35A-35C显示了六种精制干粉制剂以及粗甘露糖醇、蔗糖和海藻糖的X射线衍射图。
图36显示了精制TFF制剂的空气动力学粒度分布概况。
图37显示了LNP的z平均大小。
图38显示了LNP-mRNA干粉制剂在HEK-293细胞中的转染效率。
图39A和39B显示了SLN的干粉的代表性SEM显微照片。图39A：喷雾干燥的SLN；图39B：通过TFFD制备的SLN。顶部图像以3K放大率(比例尺：10μm)获得，并且底部图像以10.5K放大率(比例尺：2μm)获得。
图40显示了具有甘露糖醇作为赋形剂的喷雾干燥的相对于薄膜冷冻干燥的(TFFD)SLN的沉积模式。数据是平均值±SD(n＝3)。
图41A和41B显示了薄膜冷冻干燥的siRNA-SLN的代表性SEM图像(图41A)。(图41B)在新一代撞击器的不同阶段中siRNA-SLN的沉积模式。数据是平均值±SD(n＝3)。
图42显示了在TNF-α-siRNA-SLN经受TFFD之前(即悬浮液)和之后(即粉末)，通过其来自J774A.1细胞的TNF-α释放的下调。与Lipofectamine复合的TNF-α-siRNA用作对照。数据为平均值±SD(n＝4)。用a、b和d标记的组不同于c中标记的组(p＜0.05)。
图43显示了siRNA-SLN通过模拟粘液的渗透。数据为平均值±SD(n＝3)。
图44显示了TFN-αsiRNA在下调TNF-α释放方面的功能评估。
图45显示了关于TopFluor-胆固醇标记的固体脂质纳米颗粒干粉的新一代撞击数据。绘制了从NGI的每个阶段中回收的纳米颗粒的分数。MOC是微孔收集器，并且IP是感应端口。误差条是两次试验的标准差。
图46A和46B显示了酸敏感性TNF-αsiRNA-SLN的物理表征。(图46A)SLN的TEM图像。(图46B)来自酸敏感性TNF-αt siRNA-SLN的荧光标记的siRNA的体外释放。
图47显示了SLN干粉的物理外观。
图48显示了喷雾干燥的(左)和冷冻干燥的(右)SLN粉末的SEM图像。
图49显示了关于喷雾干燥的SLN和冷冻干燥的SLN的NGI沉积概况。NGI数据在三个独立试验中收集，并且具有超过90％的回收率。
图50显示了使用冷冻干燥(左)和喷雾干燥(右)，在干燥前和干燥后的SLN大小分布的比较。
图51显示了搁板式冷冻干燥的细菌粉末和薄膜冷冻干燥的细菌粉末的形态比较。左：具有蔗糖(10％w/v)作为冷冻保护剂的搁板式冷冻干燥的细菌粉末；右：具有甘露糖醇(250μL的5％w/w)作为冷冻保护剂的TFFD细菌粉末。
图52显示了在使用
Figure BDA0004033979400000171
RS00高阻力DPI以60L/分钟的流速应用于NGI后，在各个阶段薄膜中冷冻干燥的质粒粉末的沉积概况。数据是平均值±S.D.(n＝3)
图53A-53C显示了薄膜冷冻干燥的pCMV-β粉末(制剂P3)的代表性SEM图像。
图54显示了在TFF配制前和配制后质粒的凝胶电泳分析。泳道1：pCMV-β，制剂7；泳道2：pCMV-β，制剂7，Hind III和EcoR1；泳道3：pCMV-β，制剂7，EcoR I；泳道4：GeneRuler1kb Plus DNA Ladder(ThermoFisher)；泳道5：pCMV-β，在TFFD后的制剂7；泳道6：pCMV-β，在TFFD、Hind III和EcoR I后的制剂7；泳道7：pCMV-β，在TFFD、EcoR I后的制剂7；泳道8：pCMV-β、Hind III和EcoR I；以及泳道9：pCMV-β，EcoR I。pCMV-β，泳道1和5，装载500ng质粒，其它，～420ng。消化时间：2小时，EcoR I：7.3kbp，以及Hind III和EcoR I：4.6加上2.7。
图55显示了在mRNA-LNP经受薄膜冷冻干燥(制剂5)和重构后，它的代表性TEM图像。
具体实施方式
I.呈现的实施方案
本文提供的是可以通过URF工艺制备的生物活性多核苷酸的干粉制剂。显示了通过使用URF，组合物可以得到稳定，使得保护多核苷酸免于过度降解，并且组分在配制后保留显著的生物活性。在一些情况下，制剂包括至少第一赋形剂，例如糖，以提供再进一步的稳定。因此，实施方案的干粉可以包含广泛多样的含有多核苷酸的组合物。此外，已证实了实施方案的粉末可以用于例如将治疗剂直接施用于肺。因此，本发明的各方面提供了新的药物制剂、配制方法和施用模式，其证实了超过先前已使用的组合物和方法的显著优点。
在一些情况下，实施方案的粉末包含病毒，例如细菌噬菌体。已显示了如本文详述的处理成粉末的病毒能够保留大量的病毒滴度。因此，本文提供的方法和组合物可以用于稳定病毒，例如用于贮存和/或转运。同样地，可以将含有病毒的粉末直接施用于有此需要的患者(或在施用前进行重构)。例如，病毒可以是减毒病毒或病毒样颗粒，并且组合物用作疫苗以刺激免疫应答。在进一步的方面，病毒可以是细菌噬菌体，并且用于治疗细菌感染例如肺部感染。在另外进一步的方面，病毒可以是用于疾病治疗中的基因治疗载体。
在一些情况下，实施方案的粉末可以包含单链或双链RNA或DNA。此类多核苷酸可以封装在纳米颗粒中或与纳米颗粒复合，所述纳米颗粒例如脂质纳米颗粒。例如，在一些情况下，多核苷酸，例如mRNA或siRNA，与LNP复合提供。例如，mRNA-LNP复合物可以编码治疗活性蛋白(例如，用于基因替代疗法)或抗原(例如，用于疫苗接种)。在优选的方面，实施方案的干粉中提供的LNP由多重脂质类型例如阳离子脂质、磷脂和/或聚乙二醇化脂质形成。在进一步的方面，RNA-LNP粉末进一步包含至少第一赋形剂，例如糖或氨基酸。在一些方面，干粉可以直接施用(例如，通过在肺中分散)于受试者，以治疗疾病或刺激免疫应答。
在另外进一步的方面，提供了具有包含siRNA的LNP的粉末。已证实了此类组合物提供了稳定的制剂，其对于例如通过将粉末分散到肺中的递送也是理想的。因此，siRNA可以用于治疗广泛范围的疾病。例如，在过度活跃或异常免疫应答的情况下，siRNA可以靶向刺激炎症性免疫应答的基因，例如TNF-α。在进一步的方面，siRNA可以靶向癌基因或病原体的基因用于疾病治疗。
在进一步的方面，多核苷酸，例如DNA，以与壳聚糖纳米颗粒复合的粉末提供。在一些方面，壳聚糖纳米颗粒通过聚乙二醇化进行进一步修饰。此类DNA分子可以是例如质粒或DNA表达载体。在一些情况下，DNA可以编码CRISPR系统，以在受试者中提供靶向基因替换。因此，例如，系统对于遗传疾病例如囊性纤维化的治疗是理想的。在一些方面，可以将含有DNA复合物的粉末直接施用(例如，通过在肺中分散)于受试者，以治疗疾病。
在另外进一步的方面，实施方案的干粉组合物包含完整细胞。例如，粉末可以包含真核细胞或细菌细胞。特别地，本文已证实了活细胞可以配制成URF粉末，并且此类粉末保留高水平的细胞活力。因此，干粉可以用于稳定、贮存和/或转运完整细胞或活细胞，例如细菌细胞。此类组合物具有广泛范围的潜在用途。例如，可以配制减毒或灭活的细菌并用于刺激免疫应答。可替代地，可以配制有益细菌以提供益生菌组合物。此外，含有细胞的干粉可以充当用于将细胞作为经口和/或气溶胶制剂直接递送给患者的手段。在一些方面，含有细菌的干粉可以具有在农业中的应用，例如稳定的生物防治剂。因此，在一些情况下，可以将含有细菌的粉末气溶胶化并且施加于例如作物的田地。
II.超快速冷冻(URF)制剂
在某些方面，本公开内容提供了可以使用URF工艺例如薄膜冷冻工艺制备的药物组合物。此类方法在美国专利申请号2010/0221343和Watts等人，2013中进行了描述，所述两个参考文献均通过引用并入本文。在一些情况下，该方法采用高达10,000K/秒，例如至少1,000、2,000、5,000或8,000K/秒的超快速冷冻速率。在一些实施方案中，这些方法涉及将药物组合物的组分溶解到溶剂内，以形成前体溶液。溶剂可以是水或有机溶剂。然而，在优选的方面，前体溶液是包括至少第一赋形剂和生物活性多核苷酸分子的水溶液。在一些实施方案中，前体溶液可以含有小于10％w/v的治疗剂和赋形剂。前体溶液可以含有小于0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％w/v，或其中可推导的任何范围。
这种前体溶液可以沉积在处于导致前体溶液冷冻的温度下的表面上。在一些实施方案中，该温度可以低于溶液在环境压力下的冰点。在其它实施方案中，可以向表面施加减压，导致溶液在低于环境压力的冰点的温度下冷冻。表面还可以在移动的传送器型系统上旋转或移动，因此允许前体溶液均匀地分布在表面上。可替代地，前体溶液可以以这样的方式施加到表面，以生成平坦表面。
在前体溶液已施加到表面后，可以去除溶剂以获得药物组合物。可以应用任何适当的去除溶剂的方法，包括在减压或升温下蒸发或冻干。在一些实施方案中，冻干可以包括减压和/或降温。此类降温可以是25℃至约-200℃、20℃至约-175℃、约20℃至约-150℃、0℃至约-125℃、-20℃至约-100℃、-75℃至约-175℃、或-100℃至约-160℃。温度为约-20℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃至约-200℃，或其中可推导的任何范围。另外，溶剂可以在小于500mTorr、450mTorr、400mTorr、375mTorr、350mTorr、325mTorr、300mTorr、275mTorr、250mTorr、225mTorr、200mTorr、175mTorr、150mTorr、125mTorr、100mTorr、75mTorr、50mTorr或25mTorr的减压下去除。
使用这些方法制备的此类组合物可能显示出易碎的性质，使得组合物在通过装置处理时容易剪切成更小的颗粒。这些组合物具有高表面积并且显示出改善的组合物流动性。此类流动性可以例如通过卡尔指数或其它类似测量进行测量。特别地，可以通过比较粉末的堆积密度与粉末的振实密度来测量卡尔指数。此类化合物可以显示出有利的卡尔指数，并且当组合物通过二次装置进行处理以进一步处理粉末组合物时，可以导致颗粒被更好地剪切以给出更小的颗粒。
III.实施方案的组合物的组分
A.包括生物活性多核苷酸的组合物
实施方案的方法和组合物涉及生物活性多核苷酸。在一些情况下，这些可以包括单链或双链RNA或DNA。此类多核苷酸可以封装在纳米颗粒中或与纳米颗粒复合。例如，在一些情况下，多核苷酸，例如mRNA或siRNA，与LNP复合提供。在进一步的方面，多核苷酸，例如DNA，与壳聚糖纳米颗粒复合提供。在另外进一步的方面，生物活性多核苷酸在病毒如细菌噬菌体或病毒样颗粒中提供。在再进一步的方面，生物活性多核苷酸在完整细胞例如活细菌细胞中提供。
在一些方面，实施方案的核酸分子编码治疗性多肽。例如，治疗性蛋白质可以是蛋白质，例如在特定疾病状态中无功能或被破坏的酶(例如囊性纤维化中的CFTR)。
在进一步的方面，实施方案的多核苷酸编码抗原，例如来自病原体的抗原或癌细胞相关抗原。例如，癌症相关抗原可以是CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸盐结合蛋白、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在一些具体方面，抗原是GP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB3。
可用于本公开内容中的抗原可以包括衍生自病毒的那些抗原，所述病毒包括但不限于来自以下的那些病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉炎病毒属(Arterivirus)(例如，马动脉炎病毒)、星状病毒科(Astroviridae)(人星状病毒1型)、双RNA病毒科(Birnaviridae)(例如，传染性胰腺坏死病毒、传染性法氏囊病病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，加利福尼亚脑炎病毒组)、杯状病毒科(Caliciviridae)(例如，杯状病毒)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，人冠状病毒299E和OC43)、δ病毒属(Deltavirus)(例如，丁型肝炎病毒)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，马尔堡病毒、埃博拉病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，黄热病病毒组、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，EB病毒、单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)、水痘病毒属(Varicellovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、玫瑰疱疹病毒属(Roseolovirus)、淋巴潜隐病毒属(Lymphocryptovirus)、蛛猴病毒属(Rhadinovirus))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒属(Influenzavirus))、乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如，乳头状瘤病毒属(Papillomavirus))、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副粘病毒属(Paramyxovirus)如人副流感病毒1型、麻疹病毒属(Morbillivirus)如麻疹病毒、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)如腮腺炎病毒、肺病毒属(Pneumovirus)如人呼吸道合胞病毒)、小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，鼻病毒属(Rhinovirus)如人鼻病毒1A型、肝病毒属(Hepatovirus)如人甲型肝炎病毒、人脊髓灰质炎病毒、心病毒属(Cardiovirus)如脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)如口蹄疫病毒O、柯萨奇病毒)、痘病毒科(Poxyiridae)(例如，正痘病毒属(Orthopoxvirus)如天花病毒或猴痘病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒属(Rotavirus)如A-F组轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(灵长类慢病毒组如人免疫缺陷病毒1和2型)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒属(Rubivirus)如风疹病毒)、人T细胞白血病病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革热病毒、HIV-1和HIV-2、西尼罗河、H1N1、SARS、1918年流感、蜱传脑炎病毒复合体(Absettarov、Hanzalova、Hypr)、俄罗斯春夏脑炎病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、胡宁病毒、坎姆林格病毒(Kumlinge Virrus)、马尔堡病毒、马秋波病毒(Machupo Virrus)、贾萨努尔森林热病毒、拉沙病毒、鄂木斯克出血热病毒、FIV、SIV、单纯疱疹1和2型、带状疱疹、人细小病毒(B19)、呼吸道合胞病毒、痘病毒(所有类型和血清型)、科罗拉多蜱传热病毒属(Coltivirus)、呼肠孤病毒属(Reoviruses)-所有类型、和/或风疹病毒属(风疹)。
可用于本公开内容中的抗原可以包括衍生自细菌的那些抗原，所述细菌包括但不限于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhosae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、B型流感嗜血杆菌(Hemophilis influenzae B)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、兰氏锥虫(Trypanosomarangeli)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、罗氏锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japanicum)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美耳球虫(Elmeriatenella)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、小泰勒虫(Theileria parva)、泡状带绦虫(Taeniahydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛带绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)、肺炎支原体(M.pneumoniae)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、巴尔通体属(Bartonella)、百日咳杆菌(Bordete1la pertussis)、布鲁氏菌属(Brucella)-所有血清型、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、内毒杆菌(Clostridium botulinum)-来自梭菌血清型的任何东西、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)-所有血清型、军团菌属(Legionella)-所有血清型、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)-所有血清型、支原体属(Mycoplasma)-人和动物血清型、立克次体属(Rickettsia)-所有血清型、志贺氏菌属(Shigella)-所有血清型、金黄色葡萄球菌、链球菌属(Streptococcus)-肺炎链球菌(S.pneumoniae)、化脓性链球菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和/或鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。
可用于本公开内容中的抗原可以包括衍生自寄生虫的那些抗原，所述寄生虫包括但不限于钩虫属(Ancylostoma)人钩虫、利什曼原虫属(Leishmania)-所有菌株、微孢子虫属(Microsporidium)、板口线虫属(Necator)人钩虫、盘尾丝虫属(Onchocerca)丝虫、疟原虫属(Plasmodium)-所有人菌株和猿物种、弓形虫属(Toxoplasma)-所有菌株、锥虫属(Trypanosoma)-所有血清型、和/或班氏吴策线虫(Wuchereria)丝虫。
(1)DNA分子
在某些方面，根据实施方案用于递送的核酸是DNA分子。例如，DNA分子可以是表达载体。术语“表达载体”指任何类型的遗传构建体，其包含编码能够被转录的RNA的核酸。在一些情况下，然后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况下，例如，在反义分子或核酶的生产中，这些序列并不翻译。表达载体可以含有各种“控制序列”，其指对于可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中的转录和可能的翻译所必要的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可能含有发挥其它功能的核酸序列。在一些方面，DNA表达载体可以编码治疗性多肽或抗原多肽。在进一步的方面，DNA表达载体编码CRISPR系统的元件。
CRISPR系统
成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白可以根据实施方案用于靶向基因破坏和/或替换。一般而言，“CRISPR系统”共同地指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配对序列(mate sequence)(在内源性CRISPR系统的背景下，包括“同向重复”和tracrRNA处理的部分同向重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统的背景下，也被称为“间隔区”)、和/或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括与DNA序列特异性结合的非编码RNA分子(引导)RNA，以及具有核酸酶功能性(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一种或多种元件可以衍生自I型、II型或III型CRISPR系统，例如衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物，例如化脓性链球菌。
在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对于靶序列特异性的crRNA和固定的tracrRNA的融合物)引入细胞内。一般而言，使用互补碱基配对，在gRNA的5′端处的靶位点将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。靶位点可以基于其紧邻前间隔序列邻近基序(PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5′定位进行选择。在这方面，gRNA通过修饰引导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸，以对应于靶DNA序列，来靶向所需的序列。一般而言，CRISPR系统的特征在于促进CRISPR复合物在靶序列的位点处形成的元件。通常，“靶序列”一般指引导序列设计为针对其具有互补性的序列，其中靶序列和引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补性，条件是存在足够的互补性，以促使杂交并促进CRISPR复合物的形成。
CRISPR系统可以诱导在靶位点处的双链断裂(DSB)，随后为如本文讨论的破坏。在其它实施方案中，Cas9变体，被视为“切口酶”，用于在靶位点处切割单链。例如，可以使用配对的切口酶，以改善特异性，所述切口酶各自由靶向序列的一对不同gRNA指导，使得在同时引入切口后，引入5′突出端。在其它实施方案中，催化失活的Cas9融合到异源效应结构域，例如转录阻遏物或激活物，以影响基因表达。
靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以定位于细胞的核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。一般地，可以用于重组到包含靶序列的靶基因座内的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可以被称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。
通常，在内源性CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并且与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致在靶序列中或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条链或两条链的切割。可以包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如，野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)或者由其组成的tracr序列，例如通过沿着tracr序列的至少一部分与tracr配对序列的全部或一部分杂交，也可以形成CRISPR复合物的部分，所述tracr配对序列与引导序列可操作地连接。当最佳比对时，tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性，以杂交并且参与CRISPR复合物的形成，例如沿着tracr配对序列的长度至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。
可以将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞内，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或多个靶位点处的CRISPR复合物形成。组分也可以作为蛋白质和/或RNA递送至细胞。例如，Cas酶、与tracr配对序列连接的引导序列和tracr序列可以各自可操作地连接到不同载体上的分开的调控元件。可替代地，从相同或不同的调控元件表达的元件中的两种或更多种可以组合到单一载体中，其中一种或多种另外的载体提供并不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也被称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点定位于一种或多种载体的一种或多种序列元件的上游和/或下游。当使用多重不同的引导序列时，可以使用单一表达构建体，以将CRISPR活性靶向细胞内的多重不同的对应靶序列。
载体可以包含可操作地连接到酶编码序列的调控元件，所述酶编码序列编码CRISPR酶，例如Cas蛋白。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Cst4、其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓性链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中在登录号Q99ZW2下找到。
CRISPR酶可以是Cas9(例如，来自化脓性链球菌或肺炎链球菌)。CRISPR酶可以指导在靶序列的定位处，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补体内的一条链或两条链的切割。载体可以编码关于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。例如，来自化脓性链球菌的Cas9的RuvCI催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A)，将Cas9从切割两条链的核酸酶转换为切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与引导序列例如两种引导序列组合使用，所述引导序列分别靶向DNA靶的有义链和反义链。这种组合允许两条链均被切开并且用于诱导NHEJ或HDR。
在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化，用于在特定细胞例如真核细胞中的表达。真核细胞可以是特定生物的那些细胞或衍生自特定生物，所述特定生物例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、犬或非人灵长类动物。一般而言，密码子优化指通过以下修饰核酸序列用于在感兴趣的宿主细胞中的增强表达的过程：用该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子，同时维持天然氨基酸序列。各种物种显示出对于特定氨基酸的某些密码子的特定偏倚。密码子偏倚(在生物之间的密码子使用中的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关联，所述信使RNA(mRNA)的翻译效率依次又被认为尤其依赖于待翻译密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中的所选tRNA的优势一般是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。相应地，基因可以基于密码子优化进行定制用于在给定生物中的最佳基因表达。
一般而言，引导序列是这样的任何多核苷酸序列，其与靶多核苷酸序列具有足够互补性，以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。
最佳比对可以使用用于比对序列的任何合适算法进行确定，所述算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies，ELAND(Illumina，San Diego，Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn处获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net处获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白质序列，以及任选地在任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签、报告基因序列和具有下述活性中的一种或多种的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氮酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自体荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以融合到编码蛋白质或蛋白质片段的基因序列，所述蛋白质结合DNA分子或结合其它细胞分子，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4A DNA结合结构域融合物和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的部分的另外结构域在US 20110059502中进行描述，所述专利通过引用并入本文。
(2)抑制性核酸分子
小抑制性核酸(siNA，例如siRNA)是本领域众所周知的。例如，siRNA和双链RNA已在美国专利号6,506,559和6,573,099，以及美国专利申请2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中进行描述，所述专利全部通过引用以其整体并入本文。
在siNA内，核酸的组分无需具有相同类型或自始至终同质(例如，siNA可以包含核苷酸和核酸或核苷酸类似物)。通常，siNA形成双链结构；双链结构可以起因于部分或完全互补的两种分开的核酸。在本发明的某些实施方案中，siNA可以仅包含单一核酸(多核苷酸)或核酸类似物，并且通过与自身互补(例如，形成发夹环)而形成双链结构。siNA的双链结构可以包含16、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个邻接核碱基，包括其中的所有范围。siNA可以包含17至35个邻接核碱基，更优选18至30个邻接核碱基，更优选19至25个核碱基，更优选20至23个邻接核碱基、或20至22个邻接核碱基、或21个邻接核碱基酸，其与互补核酸(其可以是相同核酸的另一部分或分开的互补核酸)杂交，以形成双链结构。
可用于实践本发明方法的本文实施方案的试剂包括但不限于siRNA。通常，可以在本文中可替代地被称为小干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)的引入，诱导有力和特异性的基因沉默，称为RNA干扰或RNAi的现象。这种现象已在线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)中得到广泛记录(Fire等人，1998)，但在范围从锥虫到人的其它生物中也是普遍的。取决于所讨论的生物，RNA干扰已被称为“共抑制”、“转录后基因沉默”、“有义抑制”和“压制”。RNAi是有吸引力的生物技术工具，因为它提供了用于敲除特定基因的活性的手段。
在设计RNAi时，存在需要考虑的几个因素，例如siRNA的性质、沉默效应的持久性和递送系统的选择。为了产生RNAi效应，引入生物内的siRNA通常含有外显子序列。此外，RNAi过程是同源依赖的，因此必须仔细选择序列以便使基因特异性达到最大，同时使同源序列但不是基因特异性序列之间的交叉干扰的可能性降到最低。优选地，siRNA显示出在siRNA的序列和待抑制基因之间大于80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％的同一性。与靶基因小于约80％等同的序列基本上不太有效。因此，siRNA和待抑制基因之间的同源性越大，不相关基因的表达受到影响的可能性就越小。
另外，siRNA的大小是重要的考虑因素。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少约19-25个核苷酸并且能够调节基因表达的siRNA分子。在本发明的上下文中，siRNA的长度优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。更优选地，siRNA的长度为约19个核苷酸至约25个核苷酸。
靶基因一般意指包含编码多肽的区域，或者调控复制、转录或翻译或对多肽的表达重要的其它过程的多核苷酸区域的多核苷酸，或者包含编码多肽的区域以及与其可操作地连接的调控表达的区域两者的多核苷酸。靶向基因可以是染色体的(基因组的)或染色体外的。它可能对于细胞是内源的，或者它可能是外源基因(转基因)。外源基因可以整合到宿主基因组内，或者它可以存在于染色体外的遗传构建体例如质粒或粘粒上。靶向基因也可以衍生自病原体，例如病毒、细菌、真菌或原生动物，其能够感染生物或细胞。靶基因可以是并不引发干扰素应答的病毒和前病毒基因，例如逆转录病毒基因。靶基因可以是蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因，例如编码核糖体RNA、剪接体RNA、tRNA等的基因。
待在细胞中表达的任何基因都可以被靶向。优选地，靶基因是涉及细胞活性的进辰或与细胞活性的进辰相关的基因，所述细胞活性对疾病是重要的或作为研究对象是特别感兴趣的。因此，举例来说，下述是可以用于本发明的方法中以调节或减弱靶基因表达的可能靶基因类别：发育基因(例如，粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、有翼螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子及其受体、生长或分化因子及其受体、神经递质及其受体)、肿瘤抑制基因(例如APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zacl、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、基因26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、基因21(NPRL2)或编码SEM A3多肽的基因)、促凋亡基因(例如CD95、半胱天冬酶-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK和BID)、细胞因子(例例GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF和mda7)、癌基因(例如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)、以及酶(例如ACP去饱和酶和羟化酶(hycroxylases)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、溶菌酶、核酸酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支链淀粉酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶)。
siRNA可以从商业来源、天然来源获得，或者可以使用本领域普通技术人员众所周知的多种技术中的任一种来合成。例如，预先设计的siRNA的商业来源是
Figure BDA0004033979400000341
Austin，Tex。另一个是
Figure BDA0004033979400000342
(Valencia，Calif.)。可以在本发明的组合物和方法中应用的抑制性核酸可以是已被任何来源发现为感兴趣蛋白质的验证下调剂的任何核酸序列。
在一个方面，分离的siRNA分子具有至少19个核苷酸，具有与编码TNF-α的核酸的至少10个但不多于30个连续核苷酸基本上互补的至少一条链，并且减少TNF-α蛋白的表达。
siRNA还可以包含一个或多个核苷酸的改变。此类改变可以包括例如向19至25核苷酸RNA的端部或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。在某些方面，RNA分子含有3′-羟基。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可以含有修饰的主链，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它修饰的主链，或者可以含有非天然核苷间键合。siRNA的另外修饰(例如，2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或多个硫代磷酸酯核苷间键合和反向脱氧无碱基残基掺入)可以在美国申请公开2004/0019001和美国专利号6,673,611(所述专利各自通过引用以其整体并入)中找到。上述所有此类改变的核酸或RNA统称为修饰的siRNA。
(3)信使RNA(mRNA)分子
在进一步的方面，实施方案的多核苷酸是mRNA分子。例如，mRNA可以编码治疗性多肽或抗原。在一些方面，mRNA分子包含5′帽；5’UTR；3’UTR；和/或多聚A尾。mRNA分子可以提供在靶细胞中表达感兴趣多肽的更直接方法。然而，此类分子通常是高度不稳定且快速降解的。然而，在一些方面，根据实施方案的LNP和/或URF处理可以用于基本上稳定mRNA。在优选的方面，提供了封装在LNP中或与LNP复合的mRNA。
(4)完整细胞
在一些方面，实施方案的组合物包含完整细胞和/或活细胞。例如，细胞可以是真核细胞、古细菌细胞和/或细菌细胞。例如，细胞可以包含人细胞(例如人iPS细胞)、真菌细胞(例如酵母细胞)或植物细胞。在一些方面，细胞包含细菌细胞。细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。例如，细胞可以包含对作物植物是保护性或表达帮助控制昆虫损害的蛋白质的细菌。在进一步的方面，细菌可以是有益于人受试者的细菌，例如健康的肠道细菌。在一些方面，细胞是工程化的细胞，例如工程化的细菌。
在另外进一步的方面，实施方案的细菌组合物可以是益生菌组合物。例如，此类益生菌组合物可以包含来自拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌纲(Verucomicrobiae)和放线菌门(Actinobacteria)的一种或多种细菌。在一些方面，包含放线菌门、拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌属(Bacilli)、梭菌属(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichi)、α变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β变形杆菌纲(Betaproteobacteria)、γ变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)、柔膜菌纲(Mollicutes)和疣微菌纲中的一种或多种。
在另外进一步的方面，细菌细胞可以是减毒或灭活的细菌细胞(例如，用于疫苗中)。例如，减毒或灭活的细菌可以是无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎球菌、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、兰氏锥虫、克氏锥虫、罗氏锥虫、布氏锥虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝斯虫、柔嫩艾美耳球虫、旋盘尾丝虫、热带利什曼原虫、旋毛形线虫、小泰勒虫、泡状带绦虫、羊绦虫、牛带绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫、关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、唾液支原体、肺炎支原体、白色念珠菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、烟曲霉、马尔尼菲青霉菌、炭疽杆菌、巴尔通体属、百日咳杆菌、布鲁氏菌属-所有血清型、沙眼衣原体、肺炎衣原体、内毒杆菌-来自梭菌血清型的任何东西、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、克雷伯氏菌属-所有血清型、军团菌属-所有血清型、李斯特菌属、分枝杆菌属-所有血清型、支原体属-人和动物血清型、立克次体属-所有血清型、志贺氏菌属-所有血清型、金黄色葡萄球菌、链球菌属-肺炎链球菌、化脓性链球菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌和/或鼠疫耶尔森菌。
(5)病毒
在另外进一步的方面，实施方案的组合物包含病毒、病毒载体和/或VLP。例如，病毒可以是感染哺乳动物细胞或细菌细胞(细菌噬菌体)的病毒。在优选的方面，病毒包含感染细菌的细菌噬菌体，所述细菌对人受试者是致病性的。在另外更优选的方面，细菌噬菌体感染引起肺部感染的细菌。
在另外进一步的方面、病毒可以是减毒或灭活病毒(例如，用于疫苗中)。例如，减毒或灭活病毒可以来自沙粒病毒科(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉炎病毒属(例如，马动脉炎病毒)、星状病毒科(人星状病毒1型)、双RNA病毒科(例如，传染性胰腺坏死病毒、传染性法氏囊病病毒)、布尼亚病毒科(例如，加利福尼亚脑炎病毒组)、杯状病毒科(例如，杯状病毒)、冠状病毒科(例如，人冠状病毒299E和OC43)、δ病毒属(例如，丁型肝炎病毒)、丝状病毒科(例如，马尔堡病毒、埃博拉病毒)、黄病毒科(例如，黄热病病毒组、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如，EB病毒、单纯疱疹病毒属、水痘病毒属、巨细胞病毒属、玫瑰疱疹病毒属、淋巴潜隐病毒属、蛛猴病毒属)、正粘病毒科(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒属)、乳多空病毒科(例如，乳头状瘤病毒属)、副粘病毒科(例如，副粘病毒属如人副流感病毒1型、麻疹病毒属如麻疹病毒、腮腺炎病毒属如腮腺炎病毒、肺病毒属如人呼吸道合胞病毒)、小RNA病毒科(例如，鼻病毒属如人鼻病毒1A型、肝病毒属如人甲型肝炎病毒、人脊髓灰质炎病毒、心病毒属如脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒属如口蹄疫病毒O、柯萨奇病毒)、痘病毒科(例如，正痘病毒属如天花病毒或猴痘病毒)、呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒属如A-F组轮状病毒)、逆转录病毒科(灵长类慢病毒组如人免疫缺陷病毒1和2型)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)、披膜病毒科(例如，风疹病毒属如风疹病毒)、人T细胞白血病病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革热病毒、HIV-1和HIV-2、西尼罗河、H1N1、SARS、1918年流感、蜱传脑炎病毒复合体(Absettarov、Hanzalova、Hypr)、俄罗斯春夏脑炎病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、胡宁病毒、坎姆林格病毒、马尔堡病毒、马秋波病毒、贾萨努尔森林热病毒、拉沙病毒、鄂木斯克出血热病毒、FIV、SIV、单纯疱疹1和2型、带状疱疹、人细小病毒(B19)、呼吸道合胞病毒、痘病毒(所有类型和血清型)、科罗拉多蜱传热病毒属、呼肠孤病毒属-所有类型、和/或风疹病毒属(风疹)。
在再进一步的方面，病毒可以是病毒载体，例如改造的病毒载体。此类病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体。
B.纳米颗粒和纳米颗粒复合物
如本文使用的，术语“纳米颗粒”指尺寸在1-1,000nm范围内的任何材料。在一些实施方案中，纳米颗粒具有在50-500nm范围内的尺寸。在本文实施方案中使用的纳米颗粒包括此类纳米级材料如基于脂质的纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、纳米壳、半导体纳米晶体、量子点、基于聚合物的纳米颗粒、基于硅的纳米颗粒、基于二氧化硅的纳米颗粒、基于金属的纳米颗粒、富勒烯和纳米管(Ferrari，2005)。多肽或核酸与纳米颗粒的缀合提供了这样的结构，其具有用于靶向递送、控制释放、增强细胞摄取和细胞内运输、以及治疗性肽的体外和体内分子成像的潜在应用(West，2004；Stayton等人，2000；Ballou等人，2004；Frangioni，2003；Dubertret等人，2002；Michalet等人，2005；Dwarakanath等人，2004。
(1)壳聚糖纳米颗粒
在一些方面，用于根据实施方案使用的纳米颗粒包括壳聚糖作为组分。一般地，壳聚糖是由(1→4)-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A-单元)和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcN；D-单位)构成的阳离子、二元杂多糖家族(Varum等人，1991)。壳聚糖具有源自脱乙酰氨基(-NH3 +)的正电荷。可以使用壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐(例如，硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐或乙酸盐)，并且包括在术语“壳聚糖”的含义内。如本文使用的，术语“壳聚糖衍生物”预期包括通过酰基和/或烷基与壳聚糖的-OH基团而不是NH2基团的键合形成的酯、醚或其它衍生物。实例是壳聚糖的O-烷基醚和壳聚糖的O-酰基酯。修饰的壳聚糖，特别是与聚乙二醇缀合的那些壳聚糖，也被视为“壳聚糖衍生物”。许多壳聚糖及其盐和衍生物是商购可得的(例如，SigmaAldrich，Milwaukee，WI)。在优选的方面，实施方案的壳聚糖纳米颗粒是聚乙二醇化的。
制备壳聚糖及其衍生物和盐的方法也是已知的，例如使壳多糖在浓碱(50％w/v)中煮沸几小时。这产生了其中70％-75％的N-乙酰基已被去除的壳聚糖。其中所有N-乙酰基都已被去除的壳聚糖的非限制性实例显示于下文：
Figure BDA0004033979400000401
壳聚糖的实例
壳聚糖可以从本领域普通技术人员已知的任何来源获得。例如，壳聚糖可以从商业来源获得。壳聚糖可以从壳多糖获得，所述壳多糖是自然界中第二丰富的生物聚合物。壳聚糖通过壳多糖的N-脱乙酰化进行制备。壳聚糖以广泛多样的分子量(例如，10-1000kDa)商购可得，并且通常具有范围在70％-90％之间的脱乙酰化程度。
所使用的壳聚糖(或壳聚糖衍生物或盐)优选具有4,000道尔顿或更高的分子量，优选在25,000至2,000,000道尔顿的范围内，且最优选为约50,000至300,000道尔顿。不同分子量的壳聚糖可以通过使用壳聚糖酶来酶促降解高分子量壳聚糖或通过添加亚硝酸进行制备。两种程序对于本领域技术人员均是众所周知的，并且在各种出版物(Li等人，1995；Allan和Peyron，1995；Domard和Cartier，1989)中进行描述。壳聚糖是水溶性的，并且可以通过脱乙酰化至大于40％，优选50％至98％，且更优选70％至90％的程度，由壳多糖进行生产。
生产壳聚糖的一些方法涉及从微生物生物质中回收，例如通过美国专利号4,806,474和美国专利申请号2005/0042735教导的方法，所述专利通过引用并入本文。由美国专利号4,282,351教导的另一种方法，仅教导了如何产生壳聚糖-β-葡聚糖复合物。
用于本发明中的壳聚糖、壳聚糖衍生物或盐是水溶性的。壳聚糖谷氨酸盐是水溶性的。“水溶性”意指壳聚糖、壳聚糖衍生物或盐在室温和大气压下以至少10mg/ml的量溶解于水中。本发明中使用的壳聚糖、壳聚糖衍生物或盐具有正电荷。
关于壳聚糖和壳聚糖衍生物的另外信息可以在美国专利申请公开号2007/0167400、2007/0116767、2007/0311468、2006/0277632、2006/01 89573、2006/0094666、2005/0245482、2005/0226938、2004/0247632和2003/0129730中找到，所述专利各自通过引用的方式特别地并入本文。
在优选的方面，实施方案的壳聚糖纳米颗粒与核酸例如DNA复合提供。
(2)脂质纳米颗粒(LNP)
基于脂质的纳米颗粒包括脂质体、脂质制剂和基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。基于脂质的纳米颗粒可以是带正电的、带负电的或中性的。在某些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是带中性电荷的(例如，DOPC脂质体)。
“脂质体”是包括通过生成封闭的脂质双层或聚集物而形成的各种单层和多层脂质囊泡(vehicles)的通用术语。脂质体可以表征为具有囊泡结构，其具有一般包含磷脂的双层膜以及一般包含水性组合物的内部介质。本文提供的脂质体包括单层脂质体、多层脂质体和多囊脂质体。本文提供的脂质体可以是带正电的、带负电的或带中性电荷的。在某些实施方案中，脂质体是电荷中性的。
多层脂质体具有由水性介质分开的多重脂质层。当包含磷脂的脂质悬浮于过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。亲脂分子或具有亲脂区域的分子也可以溶解于脂质双层中或与脂质双层结合。
在特定方面，多肽或核酸可以例如被封装在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由连接分子附着至脂质体，所述连接分子与脂质体和多肽/核酸两者结合，截留在脂质体中，与脂质体复合等等。
可以用于本文实施方案的另外脂质体包括阳离子脂质体，例如，如WO02/100435A1、美国专利5,962,016、美国申请2004/0208921、WO03/015757A1、WO04029213A2、美国专利5,030,453和美国专利6,680,068中所述，所述所有专利都在此通过引用以其整体并入而不放弃。制备脂质体的方法也在WO04/002453A1中进行描述。中性脂质可以掺入阳离子脂质体内(例如，Farhood等人，1995)。可以在某些实施方案中使用的各种中性脂质体公开于美国专利5,855,911中，所述专利通过引用并入本文。这些方法的不同之处在于其分别截留水性材料的能力以及其分别的水性空间/脂质比。
脂质体的大小取决于合成方法而变。本文实施方案中的脂质体可以是各种大小。在某些实施方案中，脂质体很小，例如外径小于约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm或小于约50nm。例如，一般而言，在掺入核酸之前，用于根据本文实施方案使用的DOTAP：胆固醇脂质体包含约50至500nm的大小。此类脂质体制剂也可以通过颗粒电荷(ζ电位)和/或光密度(OD)进行定义。例如，DOTAP：胆固醇脂质体制剂通常在核酸掺入之前包含小于0.45的OD400。同样地，溶液中此类粒子的总体电荷可以通过约50-80mV的ζ电位进行定义。
在制备此类脂质体时，可以使用本文所述或如本领域普通技术人员已知的任何方案。制备脂质体的另外非限制性实例在以下中进行描述：美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；英国专利申请GB 2193095 A；Mayer等人，1986；Hope等人，1985；Mayhew等人1987；Mayhew等人，1984；Cheng等人，1987；以及Liposome Technology，1984，所述参考文献各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是中性脂质体(例如，DOPC脂质体)。如本文使用的，“中性脂质体”或“不带电的脂质体”定义为具有一种或多种脂质组分的脂质体，所述脂质组分产生基本中性的净电荷(基本上不带电)。“基本中性”或“基本不带电”意指在给定群体(例如，脂质体群体)内的少数(如果有的话)脂质组分包括未被另一种组分的相反电荷抵消的电荷(即，小于10％的组分包括未抵消的电荷，更优选小于5％，且最优选小于1％)。在某些实施方案中，中性脂质体可以主要包括在生理条件下(即，在约pH 7下)本身是中性的脂质和/或磷脂。
本文实施方案的脂质体和/或基于脂质的纳米颗粒可以包含磷脂。在某些实施方案中，单一种类的磷脂可以用于产生脂质体(例如，中性磷脂如DOPC可以用于生成中性脂质体)。在其它实施方案中，多于一种的磷脂可以用于产生脂质体。
磷脂包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺；因为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱在生理条件下(即，在约pH 7下)是不带电的，所以这些化合物可能特别可用于生成中性脂质体。在某些实施方案中，磷脂DOPC用于生产不带电的脂质体。在某些实施方案中，可以使用并非磷脂的脂质(例如胆固醇)
磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)、卵磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-内豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰-2-内豆蔻酰磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二月桂酰磷脂酰甘油(“DLPG”)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕榈酰磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰鞘磷脂(“DSSP”)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)、二肉豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)、二棕榈酰磷脂酸(“DPPA”)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二棕榈酰酰磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、脑磷脂酰丝氨酸(“BPS”)、脑鞘磷脂(“BSP”)、二棕榈酰鞘磷脂(“DPSP”)、二内豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1，2-二花生酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1，2-二二十烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DEPC”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(“POPC”)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和二亚油酰磷脂酰胆碱。
磷脂可以来自天然或合成来源。然而，在某些实施方案中，来自天然来源的磷脂，例如卵或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心脏心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺并不用作主要磷脂(即，构成50％或更多的总磷脂组合物)，因为这可能导致所得到的脂质体的不稳定性和泄漏。
C.赋形剂
在一些方面，本公开内容包含配制成药物组合物的一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，本文使用的赋形剂是水溶性赋形剂。这些水溶性赋形剂包括糖类，例如二糖。在一些情况下，赋形剂包含蔗糖、海藻糖或乳糖，三糖如果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖(glacatose)或棉子糖，多糖如淀粉或纤维素，或者糖醇如木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。在一些实施方案中，这些赋形剂在室温下是固体。糖醇的一些非限制性实例包括赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇(volemitol)、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇或聚葡糖醇(polyglycitol)。在一些方面，本文的药物组合物可以进一步排除疏水性或蜡状赋形剂，例如蜡和油。疏水性赋形剂的一些非限制性实例包括氢化油和部分氢化油、棕榈油、大豆油、蓖麻油、巴西棕榈蜡、蜂蜡、棕榈蜡、白蜡、蓖麻蜡或羊毛脂。另外，本公开内容可以进一步包含一种或多种氨基酸或其酰胺或酯衍生物。在一些实施方案中，使用的氨基酸可以是20种经典氨基酸之一，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氮酸。这些氨基酸可以是D或L取向，或者氨基酸可以是α-、β-、γ-或δ-氨基酸。在其它实施方案中，可以使用常见的非经典氨基酸之一，例如肉毒碱、GABA、羧基谷氨酸、左甲状腺素、羟脯氨酸、硒代甲硫氨酸、β丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、脱氢丙氨酸、δ-氨基乙酰丙酸或2-氨基异丁酸。
在一些方面，用于制备粉末组合物的前体溶液中的赋形剂的量为约0.5％至约20％w/w、约1％至约10％w/w、约2％至约8％w/w、或约2％至约5％w/w。前体溶液中的赋形剂的量包含约0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％至约10％w/w，或其中可推导的任何范围。在一个实施方案中，实施方案的干粉中的赋形剂的量为药物组合物总重量的约10％至99.5％w/w，例如约50％至99％、75％至99％或80％至98％。
III.定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”的使用可能意指“一个/种”，但它也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。如本文使用的，“另一个/种”可以意指至少第二个/种或更多个/种。
如本文使用的，术语“药物”、“药剂”、“治疗剂”和“治疗活性剂”可互换使用，以表示在人或动物中激发治疗或药理效应，并且用于治疗疾病、病症或其它状况的化合物。在一些实施方案中，这些化合物已经历并获得了用于对活生物施用的监管批准。
在权利要求中的术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指示仅指替代方案或替代方案是相互排斥的。如本文使用的，“另一个/种”可以意指至少第二个/种或更多个/种。
如本说明书和权利要求中使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含(comprising)，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有(having)，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，例如“包括(includes)”和包括(include)”)、或“含有(containing)”(以及任何形式的含有(containing)，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含在内的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的元件或方法步骤。
如本说明书中使用的，术语“显著”(以及任何形式的显著，例如“显著地”)并不意味着暗示两个值之间的统计差异，而是仅暗示参数差异的重要性或范围。
本申请自始至终，术语“约”用于指示值包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法、或研究受试者或实验研究中存在的变化。除非另一个定义是适用的，否则术语“约”指所指示值的±10％。
如本文使用的，就指定组分而言的术语“基本上不含(substantiallyfree of)”或“基本上不含(substantially free)”，在本文中用于意指指定组分无一已有意地配制入组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。所有污染物、副产物和其它材料的总量以小于2％的量存在于该组合物中。术语“基本上更不含(more substantially free of)”或“基本上更不含(more substantially free)”用于表示组合物含有小于1％的特定组分。术语“基本不含(essentially free of)”或“基本不含(essentially free)”含有小于0.5％的特定组分。
如本文使用的，术语“纳米颗粒”具有其习惯和普通的定义，并且指表现为整体单元而不是颗粒内的个别分子的离散颗粒。纳米颗粒可以具有约1至约10,000nm的大小，其中超细纳米颗粒具有1nm至100nm的大小，细颗粒具有100nm至2,500nm的大小，且粗颗粒具有2,500nm至10,000nm的大小。在一些实施方案中，本文所述的纳米聚集物可以包含多重纳米颗粒的组合物，并且具有约10nm至约100μm的大小。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中阐述的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值都固有地含有一定误差，其必然地起因于在其分别的测试测量和参数中发现的标准差。
IV.实施例
为了促进本公开内容的更好理解，给出了具体实施方案的下述实施例。本领域技术人员应当了解，下述实施例中公开的技术代表了由发明人发现在本公开内容的实践中发挥良好功能的技术，并且因此可以被视为构成用于其实践的优选模式。然而，按照本公开内容，本领域的技术人员应该了解，可以在所公开的具体实施方案中制备许多变化，并且仍获得相同或相似的结果，而不脱离本公开内容的精神和范围。绝不应将下述实施例解读为限制或限定本公开内容的整个范围。
实施例1-使用薄膜冷冻技术的可吸入细菌噬菌体固体制剂
A.材料和方法
1.材料
D-(+)-海藻糖、二水合物、氯化钠、硫酸镁、蔗糖和溶菌肉汤(Lysogeny broth)(LB)培养基、LB琼脂购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，US)；亮氨酸和甘露糖醇购自Spectrum(New Brunswick，NJ，US)；T7细菌噬菌体及其宿主BL21细菌菌株购自Millipore Sigma(Burlington，MA，US)；磷酸盐盐水缓冲液(PBS)、
Figure BDA0004033979400000481
碱、Tris-HCl购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，US)。
2.方法
T7扩增和噬菌体重构。根据制造商的方案扩增T7噬菌体。简言之，将噬菌体以感染复数(MOI)0.001-0.01加入BL21液体培养物(OD600为0.2-0.3)中，并且在37℃、250RPM下扩增1-3小时，直到观察到裂解。收集细菌裂解物，用5M NaCl/LB澄清，并且在4℃下在SorvallXFR离心机(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，US)中以10,000rpm向下旋转30分钟。收集含有噬菌体的上清液，并且通过使噬菌体样品与50％PEG 8000溶液一起在4℃下温育过夜，使噬菌体进一步沉淀。一旦沉淀，噬菌体就通过以14,000rpm向下旋转形成团块，并且重悬浮于PBS或SM缓冲液中，并且收集到1.5mL微量离心管中。为了进一步纯化噬菌体，通过用50％PEG 8000溶液在冰上沉淀至少30分钟，用重悬浮的噬菌体执行第二个PEG沉淀步骤。然后将该溶解物(lysate)-PEG混合物以14,000rpm离心30分钟，并且将所得到的噬菌体团块重悬浮于50-100μL的PBS或SM缓冲液中。扩增的噬菌体通过标准双层菌斑测定进行定量，并且贮存于4℃下。
噬菌体活力测试。通过滴定(即活性计数测定)确定溶液和粉末样品中的活噬菌体的量。TFFD处理的噬菌体粉末在无菌水中重构至10mg/ml的最终浓度。在用于冷冻步骤的活力测试中，在滴定之前收集冷冻的薄膜并在室温下解冻。通过执行标准的双层菌斑测定来测定噬菌体的溶解生物活性。简言之，使用LB培养基以10倍连续稀释制备测试噬菌体溶液。将10微升的每种稀释物加入200μL BL21细菌(OD600＝1.0)和1mL融化的LB顶部琼脂中。在短暂涡旋后，将混合物铺平板到预热的6孔板上，所述板具有5mL固化的琼脂底部。使板在37℃下温育大约3-4小时，直到用于计数和定量的菌斑是可见的。通过将初始制剂溶液的滴度除以每个样品的滴度来计算滴度损失。
制剂制备。选择了常用于固体噬菌体制剂研究中的几种赋形剂，包括三种二糖(乳糖、蔗糖和海藻糖)、一种糖醇(甘露糖醇)和一种氨基酸(亮氨酸)。这些赋形剂单独或与另一种组合掺入制剂中，以形成二元赋形剂基质。组合是比率为90∶10至50∶50的糖和甘露糖醇或糖和亮氨酸。制剂溶液以0.25％至10％的固体含量范围进行制备，所述固体含量范围对应于2.5mg/mL至100mg/mL的溶液浓度。固体含量指TFFD前的溶液制剂中的所有组分的重量/体积浓度。除非另有说明，否则噬菌体原液的初始滴度为1011PFU/mL至1012PFU/mL的量级，并且它们以100至1000倍稀释度加入制剂中，以实现5x108至109PFUl/mL的最终滴度。溶液在PBS(pH 7.4)、SM缓冲液(pH 7.4-7.5)或水中进行制备。根据由Cold Spring HarborProtocol提供的配方来制备SM缓冲液(不含明胶)。
通过TFFD制造噬菌体粉末。使噬菌体水溶液通过标准的5mL或10mL注射器。液滴从绝对平底的不锈钢容器上方10cm的高度落下，所述容器通过将其浸入液氮中进行预冷。由于通过钢的导热性，所得到的容器底部表面的平衡表面温度低于溶液的冰点，并且可以下降到低至-100℃以下。在该实验中，通过调整容器在液氮中的高度来控制工作温度。除非另有说明，否则温度控制在-65至-75℃内。在运行之前和运行期间，容器底部的表面温度用热电偶进行验证，所述热电偶用电线安装到底部表面上。在接触不锈钢容器底部的表面后，液滴变形成薄膜并立即冷冻。冷冻薄膜通过不锈钢刀从表面手动取下。然后用液氮填充具有冷冻薄膜的容器。将薄膜和液氮倒入20mL冻干小瓶内，然后用双层Kim-wipe覆盖所述冻干小瓶，以防止颗粒在真空干燥期间离开小瓶。最后，将小瓶直接转移到-80℃冰箱以蒸发过量的液氮，并且保持直至置于冻干器内。
Virtis Advantage Lyophilizer(The Virtis Company，Inc.，Gardiner，NY)用于干燥冷冻浆料。初次干燥在100mTorr下在-40℃下进行2000分钟，并且二次干燥在100mTorr下在25℃下进行1250分钟。在这两个干燥步骤之间，在100mTorr下使用从-40℃到+25℃的搁板温度的12小时线性斜坡。在循环完成后，将容器盖紧，然后在从冻干器中取出后立即贮存于真空腔室中。
几何粒度测量。使用配备有RODOS分散的Sympatec HELOS激光衍射仪(SympatecGmbH，德国)，来分析TFFD处理的噬菌体粉末的GPSD。在3巴下的粉末分散之后，每10ms获取测量。然后对在5％至25％之间的光密度的测量取平均值，以确定粒度分布。按体积计的粒度分别以10、50和90百分位数(例如Dv10/50/90)，以及落入1-5μm大小范围内的颗粒百分比报告。径距(Span)用下式进行计算：径距＝(Dv90-Dv10)/Dv50。
通过扫描电子显微镜(SEM)的图像。用Zeiss Supra 40VP SEM(Carl ZeissMicroscopy GmbH，Jena，德国)分析TFFD处理的噬菌体粉末的形态。使用碳导电胶带将样品固定到铝SEM样品座(stubs)上，并且使用Cressington溅射镀膜仪208HR(CressingtonScientific Instruments Ltd.，Watford，UK)，用15nm的铂/钯(Pt/Pd)进行涂布。
X射线衍射(XRD)图。在环境条件下，使用X射线衍射仪(MiniFlex600，RigakuCo.，日本)，来检测TFFD处理的噬菌体粉末的结晶度。将粉末散布在载玻片上，并且暴露于以15mA和40kV的Cu Kα辐射。散射强度通过检测器分别以0.025°的步长和2°/分钟的速度对于范围为5至50°的2θ进行收集。
热重分析(TGA)。使用Mettler Thermogravimetric Analyzer(Mettler Toledo，Columbus，OH，US)进行热重分析。将大小为1-3mg的样品装载到70μl氧化铝盘中，并且用具有排气孔的盖松散地盖住盘。样品以10℃/分钟的速率从35℃加热到400℃。系统通过氮以50L/分钟的流速进行吹扫。计算质量相对于初始质量的变化百分比并且针对温度进行标绘。在120℃下的重量损失百分比用于确定粉末中的含水量。
通过透射电子显微镜(TEM)的图像。所选择的样品粉末用无菌水重构至1010PFU/mL的浓度。将体积为5μL的测试溶液轻轻滴到碳涂布的铜网格(CFT300-CU，ElectronMicroscopy Science，Hatfield，PA，USA)的表面上，并且液体残留物通过滤纸伴随毛细作用进行吸收。然后用5μl的2％乙酸双氧铀负染色溶液(pH＝4.3)对网格进行染色，以改善噬菌体的可视化。使用配备有AMT Advantage HR 1kx1k数码相机(Advanced MicroscopyTechniques，MA，US)的以80kV的FEI Tecnai TEM(FEI Tecnai，OR，US)，对噬菌体进行成像。
赋形剂筛选。
在本研究中，三种糖，乳糖、海藻糖和蔗糖，连同/不连同甘露糖醇或亮氨酸以不同的比率进行配制。本研究中的制剂在-70±5℃下进行处理，并且固体含量为1％(w/v)。
图1中的滴度损失结果显示了，一般而言，含有蔗糖的制剂比乳糖和海藻糖更好地保存噬菌体裂解活性。另外，单独的糖不能充分保护噬菌体并且对噬菌体稳定性具有不利作用。大多数含有甘露糖醇的制剂都经历了完全滴度损失。显而易见的是，甘露糖醇对噬菌体有害。先前用冻干的M13噬菌体研究报告了甘露糖醇对噬菌体的负面影响，在所述研究中，观察到滴度损失随着甘露糖醇-海藻糖二元系统中的甘露糖醇比率增加而增加。在所有制剂中，发现具有1.47(log，PFU)的滴度损失的蔗糖：亮氨酸80∶20是保存噬菌体活力的最佳制剂。
赋形剂对GPSD模式的作用是显著的(图2)。清楚地证实了，随着赋形剂基质中的亮氨酸比率增加，1-5μm颗粒的粒度和百分位数分别是降低和增加的。有趣的是，这种趋势在乳糖和海藻糖组中比蔗糖组中更为明显。令人惊讶的是，甘露糖醇的添加扩大了乳糖-甘露糖醇样品的粒度。蔗糖：亮氨酸80：20的Dv50为6.94±0.38μm。
固体含量筛选。多重赋形剂基质以各种水平的固体含量在制剂中进行配制。本研究中的制剂在-70±5℃下进行处理。固体含量对滴度损失的影响没有规律，尽管观察到滴度损失随着制剂中更多的固体含量升高的弱趋势(图3)。值得注意的是，在大多数赋形剂基质中，当固体含量为0.25％时，粉末在冻干后坍塌。因此，制剂中的固体含量必须大于0.5％。
图4显示了随着制剂中的固体含量增加的粒度分布变化。一般而言，粒度和固体含量具有负相关，即较低的固体含量生成较小的粒度。然而，在测试的制剂组中发现了例外情况，例如，在乳糖组中，最大粒度是当固体含量为0.5％而不是10％时。
工艺温度筛选。多重赋形剂基质以各种水平的固体含量在制剂中进行配制。本研究中的制剂在-70±5℃下进行处理，并且固体含量为1％(w/v)。由于发现赋形剂基质蔗糖∶亮氨酸70∶30和80∶3在保存噬菌体活性方面是最有效的，因此将它们用作模型制剂以探索冷冻温度对噬菌体粉末的滴度和粒度的作用。如方法节段中所述的，通过调整与容器接触的液氮水平来改变不锈钢容器的表面温度。温度控制为-40±5℃、-70±5℃、-100±5℃和-120±5℃。
如图5中所示的滴度损失变化指示的，寒冷对噬菌体活力具有负面影响，这意味着温度越低，滴度损失越大。然而，温度的效应是有限的，因为最高滴度和最低滴度之间的差异小于0.5(log，PFU)。另外，影响的趋势和程度在不同的制剂中可能不同。
处理温度对粉末粒度分布的作用是不规则的(参见图6)。这可能由以下事实引起：在不同温度下形成的圆盘(薄膜)的尺寸(大小和厚度)是不同的。随着温度的降低，圆盘变得更厚且更圆。观察到当温度变得低于-125℃时，滴落的液体形成液滴形状并在不锈钢表面周围反弹。另外，当工艺温度升至高于-40℃时，圆盘紧紧地附着到表面上。假设这些观察由莱顿弗罗斯特效应(Leidenfrost effect)引起，其中当不锈钢的表面温度低于一定程度时，形成气层。气层的影响程度高度依赖于容器表面和制剂液滴之间的温差。当圆盘的尺寸与其它因素例如制剂中的组成相混淆时，结果变得更加复杂，因为表面张力随着不同的制剂基质而变。
制剂中的初始滴度。通过稀释以5x1011PFU/mL(也表示为5E11)的初始滴度贮存于PBS中的噬菌体原液，调查了制剂中的噬菌体的初始滴度的影响。固体含量为0.5％(w/v)，并且赋形剂为蔗糖∶亮氨酸80∶20制剂。TFFD在-70±5℃下进行。
如图7显示的，5x1010PFU/mL、5x108PFU/mL和5x107PFU/mL(也表示为5E10、5E8和5E7)的滴度损失处于相似水平，大约为1.50-1.55(log，PFU)，而其它初始滴度水平分别损失2.02(在5x109PFU/mL制剂中)和2.07(在5x106PFU/mL制制中)。
粒度受制剂中的噬菌体量的显著影响。当初始滴度从5E10 PFU/mL减少到5E07PFU/mL时，噬菌体粉末的Dv50增加。粒度在5E10 PFU/mL至5E09 PFU/mL之间的剧烈变化很可能是由于来自储备溶液的残留盐分子的存在。原液在5E10 PFU/mL制剂中仅稀释10倍，其对工艺过程中制剂的结晶行为具有足够的影响。令人鼓舞地发现Dv50减少到2.61±0.07μm，并且1-5μm颗粒的百分位数改善到67.2±2.42％(图8)
缓冲系统对不同二元赋形剂基质的影响。基于缓冲系统中的盐分子可以影响粒度和潜在地噬菌体活力的先前发现，进行了一项研究来调查这种影响。已选择了PBS和SM缓冲液(不含明胶)，因为它们均照常规用于贮存噬菌体。制剂的固体含量为0.5％(w/v)，并且TFF在-70±5℃下进行。
图9中清楚地证实了，缓冲系统的存在对噬菌体滴度具有显著的保存作用。此外，影响水平在两个测试缓冲系统之间是不同的。一般地，SM缓冲液样品损失比PBS缓冲液样品更少的噬菌体活力。在赋形剂基质中，海藻糖∶亮氨酸90∶10既具有最高的滴度损失(无缓冲液样品，4.97±0.14对数滴度损失)，又具有最低的滴度损失(SM缓冲液样品，0.19±0.21对数滴度损失)。
在每个赋形剂基质组内，含有PBS的粉末的Dv50一般小于其无缓冲液和SM缓冲液配对物。相比之下，SM缓冲液样品的测量结果明显更高(图10)。这很可能是由于SM粉末在暴露于环境大气一定时间量时会变得非常粘稠的事实。在一些无缓冲液样品中观察到类似现象，但对于PBS样品从未发生。粘性可能已起因于粉末的高吸湿性。在测试时的当地湿度为75％(数据来自weather.com)。
基于图9和10中的结果，选择两个制剂组在进一步研究中进行调查：海藻糖∶亮氨酸90∶10和蔗糖∶亮氨酸75∶25。即使良好地保存了噬菌体活力，也没有选择蔗糖∶亮氨酸90∶10和乳糖∶亮氨酸90∶10/75∶25，因为这两组中的SM缓冲液样品的粒度或者太高，或者由于粘性而无法测量。
不同工艺步骤中的滴度损失。TFFD涉及可以损害噬菌体活力的两个步骤：冷冻和干燥。为了了解每个步骤中的活性损失程度，分别在冷冻和干燥后检查滴度。如图11中所示，无论赋形剂组成如何，掺入缓冲系统都减少了在冷冻和干燥步骤两者中的滴度损失。在冷冻步骤期间，噬菌体在PBS缓冲系统中存活最多。大多数滴度损失在PBS以及没有缓冲液的样品的干燥步骤中发生。相比之下，当其它赋形剂为海藻糖：亮氨酸90：10时，在SM缓冲液样品的干燥步骤中并未发现滴度损失。
由于其在冷冻过程期间稳定pH的能力，缓冲系统照常规包括在固体产物中。然而，这可能不是在这种情况下的保护机制，因为噬菌体一般对pH不敏感，并且pH转变在快速冷冻过程中可能是有限的。因此，保护可能是噬菌体衣壳蛋白和盐分子之间的分子水平相互作用的结果。缓冲系统在干燥步骤中的保护效应可以是间接的：盐分子的存在改变了冷冻薄膜中的晶体形状，其最终导致不同的干燥行为。
几何粒度分布。使用激光衍射法测量几何粒度(表1中的数据)。颗粒在蔗糖∶亮氨酸75∶25组中一般小于在海藻糖∶亮氨酸90∶10组中。这可以归于蔗糖∶亮氨酸75∶25制剂系统中多15％的亮氨酸。缓冲系统的添加一般降低噬菌体粉末的粒度。两种含有PBS的样品均具有小于3μm的Dv50，并且超过50％的颗粒落入1-5μm大小范围内。然而，由于高Dv90，这些粉末的径距大于8。相比之下，SM样品中的径距是所有样品中最小的。粒度在海藻糖∶亮氨酸90∶10SM缓冲剂制剂中较大。这可能是具有90％海藻糖的粉末中的吸水性的结果。
表1.薄膜冷冻干燥的噬菌体粉末的几何粒度分布
Figure BDA0004033979400000571
结晶度。使用XRD评估TFFD噬菌体粉末的物理状态(图12)。跨越所有含有缓冲液的制剂，在27.8°、32°和45.5°的2θ下观察到NaCl的特征峰。除NaCl特征峰之外，SM缓冲液样品也具有在10.9°、15.7°和21.8°至23.7°、26°、27.5°、39.3°至43°的2θ下的一些相对较短的峰。这些可以通过缓冲液中的其它组分Tris和MgSO4促成。由于与海藻糖：亮氨酸90：10样品相比多15％的亮氨酸，因此亮氨酸的特征峰(在7°、19.2°和24.6°的2θ下的峰)在蔗糖∶亮氨酸75∶25样品中更为明显。没有观察到蔗糖和海藻糖的特征峰，指示了它们在TFFD工艺后变成无定形的。如通过宽‘光晕’峰所指示的，两种无缓冲剂粉末显示为无定形的。
粉末的形态。使用SEM分析TFFD噬菌体粉末的表面形态(图13)。粉末一般是高度多孔的，并且在所有样品中都观察到纳米结构聚集物的网络。如通过GPSD测量中的高径距所指示的，含有PBS的样品中的大小分布不太均匀。SM样品粉末似乎与其它组最不同。颗粒显示出树枝状结构且看起来更薄。在较低量级的视图中，颗粒看起来具有长的挤压并且彼此连接。SM粉末的表面更光滑，具有在表面上的小‘凸起’，而不是网状结构。粉末的孔隙率可以潜在地改善粉末的流动性，并且它们在分散和对肺的撞击过程中趋于容易地分解为纳米聚集物。
噬菌体的形态。T7噬菌体的形态已经得到充分表征。基本上，噬菌体由具有相对短尾的二十面体(二十个面)蛋白质衣壳构成，在所述短尾上附着长尾纤维(如图14中的卡通图(carton)所示的)。
含水量和热分析。TGA用于绘制TFFD噬菌体粉末的热稳定性概况(图1 5)，并且确定粉末中的含水量(图16)。通过鉴定在120℃下的重量损失来确定含水量。通过用等温加热方法(以10℃/分钟的速率从35℃升至120℃，随后为在120℃下保持10分钟)测试相同的样品，来确认当前使用的方法(以10℃/分钟的速率从35℃升至400℃)的可靠性。来自两种方法的结果并未显示显著差异(数据未显示)。含水量在含有缓冲液的样品中一般较低，很可能是由于盐结晶的存在。PBS样品含有最少的水，并且水分在其中蔗糖∶亮氨酸为75∶25的一个SM样品中很高。
结论。已证实了使用TFFD技术生产生物活性的可吸入噬菌体粉末的可行性。证明了使用优化制剂，TFFD可以成功地实现微粉化颗粒，伴随最低限度的滴度损失。证实了缓冲系统的掺入帮助保存噬菌体稳定性以及将粒度减小到更期望的范围。
TFFD是目前开发的颗粒改造方法的期望替代方案，鉴于它消除了来自SD、SFD和ASFD中的喷嘴振动对噬菌体的应力，并且避免了SD工艺中的热应力。因此，使用薄膜冷冻技术开发细菌噬菌体可吸入干粉是值得考虑的策略。
实施例2-通过用于mRNA的气溶胶化肺部递送的实验设计来开发脂质纳米颗粒
A.材料和方法
1.材料
DLin-MC3-DMA购自Biofine International Inc.，Vancouver，BC。1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG-2000)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000(DSPE-PEG 2000)和(δ9顺式)/1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)购自Avanti Polar Lipids，AL，USA。N-(甲基聚氧乙烯氧羰基)-1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEG 2000)购自NOF Corporation，Tokyo，JP。胆固醇购自Sigma Aldrich，MO。乙醇(分子级)购自Decon Laboratories，Inc.，PA。
Figure BDA0004033979400000591
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA和
Figure BDA0004033979400000592
萤火虫萤光素酶(FLuc)mRNA购自TriLink，SanDiego，CA，USA。Slide-A-LyzerTM伽马照射透析盒(10kDa)、Quanit-iTTM
Figure BDA0004033979400000593
RNA试剂和试剂盒(Invitrogen)和Opti-MEMTM减血清培养基(Gibco)购自ThermoFisherScientific Inc.，Waltham，MA，USA。达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素(100X)购自Corning，Manassas，VA，USA。Balb/c小鼠购自Charles RiverLaboratories，Inc，Wilmington，MA，USA。
2.方法
LNP制剂的制备。使用微流体混合器(Precision Nanosystems，Canada；Leung等人，2015)，根据每种制剂(表2)，通过将水相(在100mM乙酸钠柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0中稀释的mRNA)以及含有乙醇和脂质的有机相混合，来制备含有EGFP mRNA或FLuc mRNA的脂质纳米颗粒。在制备后，将LNP制剂在10K MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific，MA)中透析到1X PBS(pH 7.4)内2小时。
大小和ζ电位的测量。通过使用Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments MA)来表征LNP制剂的大小和ξ电位。每种制剂在0.1X PBS缓冲液中进行10倍稀释用于大小测量，并且在0.1X PBS中进行40倍稀释用于ξ电位测量。在25℃伴随173°下对稀释样品执行动态光散射，并且所报告的z平均直径是三次测量的平均值。
mRNA封装效率。通过低范围Quanti-iT RiboGreen RNA试剂测定(Thermo FisherScientific，MA)来评估mRNA封装效率。每个LNP样品在TE缓冲液内稀释降至0.2ng/μL的mRNA浓度。每种LNP工作溶液的等分试样进一步在96孔板中的TE缓冲液中进行1∶1稀释(测量未封装的mRNA)，或者在具有4％Triton-X100的TE缓冲液中进行1∶1稀释(测量总mRNA-在LNP内封装的和未封装的游离RNA两者)。样品一式两份进行制备，并且将100μL 2000倍稀释的Quanti-iTTM RiboGreen RNA试剂加入每个样品中，通过板阅读器分别在480和520nm的激发波长和发射波长下测量荧光强度(Infinite M200，Tecan，瑞士)。
TNS测定。pH范围为2.5至11(pH 2.5、pH 3、pH 3.5、pH 4、pH 4.6、pH 5、pH 5.5、pH5.8、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11)的一系列缓冲液通过调整缓冲溶液的pH进行制备，所述缓冲溶液由10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl连同1N HCl组成。另外，将90μL的每种缓冲溶液加入96孔板中。将2μLTNS储备溶液(300μM的DMSO溶液)加入96孔板中的具有不同pH的缓冲溶液中。然后将3μLLNP溶液(用mRNA制备)加入上述混合物中。在325nm的激发波长和435nm的发射波长下测量荧光强度。荧光强度针对pH值进行标绘，并且使用三参数逻辑方程(GraphPad Prism v.6，GraphPad Software)进行拟合。在其下达到最大荧光一半的pH值被视为LNP制剂的pKa。
LNP制剂的气溶胶化。已显示了，振动网孔雾化器可以用于使剪切敏感的制剂，例如脂质体和类脂质体(niosome)气溶胶化，并且因此是空气喷射和超声雾化器的良好替代品(Wagner等人，2006：Elhissi等人，2013)。将LNP制剂加入Aerogen Solo(Aerogen Ltd，Galway Ireland)中，其为振动网孔雾化器，并且随后通过在预冷管中冷凝收集气溶胶。
细胞培养。HEK-293细胞用含有10％FBS和1％青霉素链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基进行培养。NuLi-1细胞(ATCC CRL-4013)在预涂布有60μg/mL人胎盘IV型胶原(Sigma A1drich，MO)溶液的烧瓶中进行培养，并且在补充有来自Lonza的SingleQuot添加剂(BEGM Bullet Kit，参考CC-3170)和50μg/mL G-418的支气管上皮生长培养基(BEGM)中生长。所有细胞系都在37℃和5％CO2下作为单层培养物得到维持。
体外细胞内摄取。将细胞以12,500个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中，并且在37℃和5％CO2下生长24小时。然后将10μL以10ng EGFP mRNA/μL浓度的LNP加入0.2mL细胞培养基中的细胞中24小时。之后，去除细胞培养基，并且用1X PBS洗涤细胞。为了使细胞解离，向每个孔中加入100μL 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下温育8-10分钟。接下来，加入100μL在达尔贝科磷酸盐缓冲盐水中的1％FBS，细胞以125x g旋转5至10分钟，并且弃去上清液。将细胞重悬浮于具有0.25μL碘化丙啶(PI)(1mg/mL)溶液的50μL 1X PBS中。通过流式细胞术分析细胞百分比GFP表达(即转染效率)和荧光强度。
体内转染。所有动物方案都由在Austin的University of Texas的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。Balb/c小鼠(雌性，6-8周)在连续流动的2％异氟醚下麻醉，并且气管内施用大约50μL含有1.5μgFLucmRNA/μL的LNP的PBS溶液。在6小时后，小鼠用D-萤光素溶液(30mg/ml)进行腹膜内(i.p.)注射，以达到150mg萤光素/kg体重。在15分钟后，将小鼠处死，并且小心地收集肺并通过体内成像系统(IVIS)成像，使用生物发光设置和60秒的发光暴露时间。用Living Image 4.3软件(PerkinElmer)执行发光的定量(以辐射度[p/秒/cm2/sr]计)。
统计分析。使用JMP 13执行统计分析。数据值表示为平均值±标准差(SD)。需要时，执行单因素方差分析(单因素ANOVA)或斯氏t检验。*p值≤0.05，**p值≤0.01，***p值≤0.001和****p值≤0.0001被视为统计学显著的。
B.结果与讨论
1.结果
N/P比对LNP制剂功效的作用。为了调查N/P比对细胞内摄取的作用，通过在6和200之间改变N/P比，制备了封装EGFP mRNA的六种LNP制剂。LNP制剂分别由单摩尔比为50∶10∶38.5∶1.5的DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和PEG-脂质(聚乙二醇_二肉豆蔻酰甘油，PEG-DMG)构成(如Jayaraman等人，2012中先前描述的)。不同的N/P比(N/P＝6、15、30、50、100和200)通过改变加入mRNA中的脂质组合物的相对量(10ng/μl)来实现。制备LNP，并且通过流式细胞术在HEK-293细胞中评估每种制剂的细胞内摄取。如图17中所示，具有N/P比＝15的LNP制剂证实了最高百分比GFP表达和平均荧光强度两者。随着N/P比从15增加到200，细胞内摄取降低。维持N/P比＝15用于下述实验，并且该特定制剂随后在实验中用作“参考制剂”。
DOE；具有约束的混合实验设计。LNP一般由四种脂质组分组成：可电离脂质、磷脂、PEG-脂质和胆固醇。脂质的不同类型和量可能影响LNP制剂的转染功效(Kauffman等人，2015)。一次一因子(One-factor-at-a-time)的设计方法已用于几项研究中，以调查制剂组成对每种LNP制剂的功效的作用(Belliveau等人，2012；Akinc等人，2009)。然而，这种方法没有考虑到组合物参数之间潜在的二阶相互作用，这使得它对于LNP制剂的优化较不期望。可替代地，部分因子设计已用于使LNP制剂用于mRNA递送的效力达到最大(Kauffman等人，2015)。尽管这种方法调查了二阶效应，但并非所有变量都可以包括在设计中的事实是主要局限性。为了系统地调查变量对LNP制剂的效力的作用，本研究中采用了具有约束的混合设计(表2)。使用JMP软件，生成了18种LNP制剂的设计用于测试(表3)。
表2.实验设计空间的局限性。
Figure BDA0004033979400000641
表3.LNP制剂的组成。
Figure BDA0004033979400000642
Figure BDA0004033979400000651
mRNA-LNP的表征。基于具有约束的混合设计，使用
Figure BDA0004033979400000661
台式系统制备了具有N/P比＝15的18种制剂。通过DLS评估LNP的大小和ζ电位。如图18A中所示，在雾化前LNP制剂的粒度从35.7±1.1nm(F14)到120.9±3.4nm(F8)不等，而ζ电位范围为-12.2±5.5mV(F3)至18.8±1.2mV(F13)(图18B)。此外，LNP制剂的大小和ζ电位在4℃下贮存14天后并未显示显著变化，其指示了所有制剂的大小和表面电荷保持稳定至少2周(图18A和18B)。通过RiboGreen测定来评估制剂的封装效率。大多数制剂具有大于80％的高封装效率，除了显示49％的封装效率的F12之外(图18C)。先前已报告了，LNP的pKa对于内体逃逸可能是关键的，并且已牵涉为基因治疗的体内功效的相关因素(Jayaraman等人，2012)。因此，使用TNS测定测量装载有EGFP mRNA的LNP制剂的pKa，并且pKa范围为5.74(F15)至6.11(F14)(图18D)。
为了将LNP制剂转化用于临床使用，它们必须能够被气溶胶化以用于肺部递送而无显著的不稳定性。为此，调查了雾化对LNP制剂的作用，并且鉴定了在雾化之后在体外保持高细胞内摄取的制剂。LNP制剂通过Aerogen Solo雾化器进行气溶胶化，并且在人胚肾HEK-293和人支气管上皮NuLi-1细胞系中评估每种雾化制剂的效力。在雾化后，LNP制剂的大小范围为100.9nm(F12)至1480.7nm(F7)，并且显示了与雾化前的LNP制剂相比的显著增加，而ζ电位在所有制剂中均未显示显著变化(图19A-19C)。值得注意的是，F8具有在雾化后最小的大小变化，并且F7显示了在雾化后最大的大小变化。LNP制剂的封装效率在雾化后显著降低，其指示了mRNA在雾化过程后很可能从LNP中泄漏。雾化LNP制剂的封装效率范围为15.5％(F12)至79.9％(F17)。
LNP制剂在HEK-293和NuLi-1细胞中的细胞内摄取。通过测量HEK-293和NuLi-1细胞系中的百分比GFP表达和荧光强度，使用流式细胞术来评价雾化前和雾化后LNP mRNA制剂的细胞内摄取。在第0天时(即与制剂制备的同一天温育)，在HEK-293细胞中测量每种mRNA封装制剂的细胞内摄取，以鉴定显示出比参考制剂更高的转染的制剂(DLin-MC3-DMA∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG＝50∶10∶38.5∶1.5，N/P＝15)。发现大多数制剂显示了超过50％的GFP表达，除了F5、F12和F13之外。值得注意的是，尽管大多数制剂具有相对较高的百分比GFP表达，但按照荧光强度的细胞内摄取在制剂中不同。与在第0天时在HEK-293细胞中显示了6708a.u.的平均荧光强度的参考制剂相比，18种制剂中的8种(F2、F3、F4、F6、F8、F11、F15和F17)显示了显著更高的荧光强度。这八种制剂的百分比GFP表达高达95％以上，并且当与参考制剂相比时，并未显示显著差异。接下来，通过在冷冻贮存0、5、12和16天后定量其细胞内摄取，来测试LNP的稳定性(即过早的mRNA泄漏的缺乏)。如图20A中所示，八种制剂(F2、F3、F6、F8、F10、F11、F15和F17)在4℃下贮存16天后在百分比GFP表达方面保持稳定。相比之下，所有制剂的荧光强度在4℃下贮存5天后显著降低(图20B)。具体地，F2、F3、F6、F8、F11、F15和F17显示了超过18,000a.u的荧光强度，其在贮存16天后显著高于参考制剂。
在雾化后，在HEK-293细胞和NuLi-1细胞两者中，所有LNP制剂均显示了与雾化前的LNP制剂相比显著降低的荧光强度。这一发现指示了，气溶胶化过程负面影响体外的mRNA转染。发现与雾化前的LNP相比，F2、F3、F8、F11和F17并未显示在雾化后的百分比GFP表达方面的显著变化(图21A和21C)。尽管在所有LNP制剂中观察到荧光强度的显著降低，但上述五种制剂在雾化后保留了相对高的荧光强度(超过3000a.u.)(图21B和21D)。在NuLi-1细胞中，尽管F2、F8、F11和F17显示了在雾化后的百分比GFP表达和荧光强度降低，但这四种制剂仍证实了与其它制剂相比相对较高的GFP表达(超过50％)和荧光强度(超过1000a.u.)。总之，鉴定了在贮存16天和雾化后具有相对较高的细胞内摄取的四种制剂(F2、F8、F11和F17)。
将LNP制剂气管内递送至小扁。基于体外细胞内摄取，选择了四种先导制剂(F2、F8、F11和F18)用于进一步的体内研究。具体地，将萤火虫萤光素酶(Luc)mRNA装载到这些LNP制剂内，并且通过Aerogen Solo雾化器进行雾化。将收集的雾化分散体与使用气管内滴注施用至小鼠肺的雾化前对照进行比较，以调查体内转染和生物分布。在施用后6小时后，对于四种先导制剂，与其它器官相比，萤光素酶活性占优势地在肺中检测到，与雾化过程无关(图22)。有趣的是，在用雾化前或雾化LNP制剂给药的小鼠之间的发光强度方面不存在统计学显著的差异，其指示了候选制剂在雾化后保留了其功能。
2.讨论
这项工作突出强调了一种DOE方法，以发现适合于mRNA的气溶胶化递送的LNP制剂。使用DOE，制备了各种脂质组成的18种制剂，并且在物理化学性质和细胞内摄取方面进行表征。鉴定了在雾化前和雾化后具有相对较高的细胞内摄取的四种先导制剂，并且将其气管内递送至小鼠，在其中它们显示了在雾化前和雾化后在体内将mRNA递送到肺的能力。制剂的广泛的统计分析帮助鉴定影响纳米颗粒的稳定性和细胞内递送的某些参数。
LNP制剂的组成影响其在雾化前和雾化后的物理化学性质(大小、ζ电位和封装效率)。发现雾化前分散体具有取决于所使用的PEG-脂质的摩尔比的粒度。在这些雾化前的制剂中，似乎所使用的PEG-脂质类型并不以显著方式影响粒度。相比之下，雾化分散体受到制剂中使用的PEG-脂质类型的显著影响。这些观察在下文进行讨论。
为了探索LNP大小和每种LNP组分之间的相关性，将雾化前和雾化后的LNP大小针对每种组分进行标绘，并且分析正交趋势。对于雾化前的LNP制剂，随着摩尔PEG-脂质组成的增加，观察到统计学显著(p＜0.05)的大小降低趋势，不依赖于其它制剂参数(图23A)。就摩尔量而言，大小与制剂的其它组分并未显著相关联。类似发现已得到报告，其中与常规脂质体相比，聚乙二醇化脂质体显示了在大小方面的显著降低，并且DSPE-PEG的总量增加导致脂质体大小的降低(Kontogiannopoulos等人，2014；Sriwongsitanont and Ueno，2004)。关于这一发现的潜在解释可以是由于以下事实：随着PEG-脂质的浓度增加，通过头基周围的广泛水合作用增加了脂质双层表面的横向排斥(Akinc等人，2009)。为了减少高横向排斥，粒度必须降低，其随后增加接枝表面的曲率(Sriwongsitanont等人，2004)。相比之下，如此处在雾化后的制剂中所示的，随着PEG-脂质的摩尔量增加，观察到统计学显著的粒度增加(图23C)。这很可能是由于制剂中使用的PEG-脂质类型而不是PEG-脂质摩尔比。根据图23C中按PEG-脂质类型重排的数据(图23D)，与具有其它两种类型的PEG-脂质的制剂相比，具有DSPE-PEG的制剂显示了更大的大小，其指示了PEG-脂质的类型显著影响雾化后的LNP大小(图23D)。这些结果指示了，用DSPE-PEG制备的制剂在气溶胶化过程后具有维持其大小的弱能力。
在雾化前和雾化后，制剂的ζ电位也主要由所选的PEG-脂质类型驱动。对于雾化前或雾化的LNP制剂，随着PEG-脂质的摩尔比增加，观察到统计学显著的LNPζ电位增加趋势，不依赖于其它制剂参数(图24A和24C)。然而，值得注意的是，这个显著趋势主要与所使用的PEG-脂质类型有关，其中无论气溶胶化过程如何，具有DSPE-PEG的制剂都显示了更高的ζ电位(图24B和24D)。
关于封装效率，几乎所有制剂都实现了高封装效率。发现增加的胆固醇摩尔比导致关于雾化前LNP的封装效率的统计学显著增加(图25A)。这指示了结构胆固醇在气溶胶化前的LNP制剂的封装效率方面起重要作用，而使用的磷脂类型在雾化之前并未证实显著效应(图25B)。Li等人已报告了，具有较高胆固醇摩尔比的脂质样纳米颗粒具有较高的mRNA封装效率(Li等人，2015)。然而，在雾化后，磷脂的类型，而不是胆固醇的摩尔量，成为显著影响封装效率的唯一因素(图25C和25D)。与具有DSPC或DPPC的LNP制剂相比，具有DOPE的LNP制剂显示了显著更高的封装效率(图25D)。这一发现指示了，DOPE的包括可以显著增强在气溶胶化过程期间LNP防止mRNA泄漏的能力。
PEG-脂质摩尔比负面影响在雾化前和雾化后LNP的细胞内摄取。装载mRNA的LNP的制剂必须平衡几个性能指标，例如转染效率和纳米颗粒稳定性。在本研究中开发的制剂中，PEG-脂质用于对纳米颗粒分散体赋予物理稳定性。然而，已显示了聚乙二醇化可以显著影响转染效率(Otsuka等人，2003；Mishra等人，2004；Osman等人，2018)。在此处，PEG-脂质摩尔比显著且负面影响在雾化前和雾化后LNP的细胞内摄取。
具体地，增加PEG-脂质摩尔比负面影响雾化前的LNP在HEK-293细胞(图26A和26C)和NuLi-1细胞(数据未显示)中的细胞内摄取。随着PEG-脂质的摩尔分数增加，观察到统计学显著的百分比GFP表达和荧光强度降低趋势，不依赖于其它制剂参数；这一发现与先前的报告一致(Otsuka等人，2003；Mishra等人，2004)。另外，磷脂的类型显著影响百分比GFP表达。观察到与具有DOPE或DPPC的LNP制剂相比，具有DSPC的LNP制剂显示了显著更低的百分比GFP表达(图26B)，与先前的报告一致的观察(Kauffman等人，2015)。在雾化后，增加PEG-脂质的摩尔比导致在HEK-293(图26D和26F)和NuLi-1细胞(数据未显示)中观察到的相同趋势，但不存在磷脂类型对百分比GFP表达的显著作用(图26E)。
在雾化前和雾化后的物理化学性质与细胞内摄取之间的相关性。为了探索LNP制剂的物理化学性质和效力之间的相关性，将大小、ζ电位、封装效率和pKa针对HEK-293细胞中的细胞内摄取和荧光强度进行绘制。发现具有较大粒度的LNP制剂显示了在雾化前更高的百分比GFP表达和荧光强度(图27A和27C)，因为随着粒度的增加，观察到百分比GFP表达和荧光强度增加的显著趋势(图27A)。此外，具有较高ζ电位的雾化前制剂显示了较低的荧光强度(图27D)。在雾化后，pKa似乎是影响百分比GFP表达的重要参数，由此较低的pKa导致较高的百分比GFP表达(图27F)，而其它参数并未显示对细胞内摄取的显著作用。
结论。用于气溶胶基因递送的LNP制剂的体外表现受到脂质组成的显著影响。使用DOE方法用于制剂发现，鉴定了在雾化前和雾化后具有相对较高的细胞内摄取的四种先导制剂，并且随后在体内进行测试。当气管内递送至小鼠时，这些制剂显示了在雾化前和雾化后在体内将mRNA递送至肺的能力。制剂的广泛统计分析帮助鉴定影响纳米颗粒的稳定性和细胞内递送的某些参数。DSPE-PEG是关于LNP纳米颗粒的稳定性的负面因素，因为与具有DMG-PEG和DMPE-PEG的制剂相比，在雾化后出现了显著更高的聚集物水平。还发现PEG-脂质摩尔比和DSPC磷脂显著且负面影响LNP的细胞内摄取。根据这种方法，可以更快速且更容易地鉴定这样的LNP制剂，其具有促进mRNA的有效气溶胶化递送的最佳性质。虽然这项工作集中于针对肺部疾病治疗的mRNA递送，但DOE策略可以广泛应用于发现LNP组合物及其性质，其促进用于不同适应症的核酸治疗剂的增强递送。
C.进一步的比较实施例
1.材料
1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000(DSPE-PEG 2000)和(δ9顺式)/1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)购自Avanti Polar Lipids，AL，USA。N-(甲基聚氧乙烯氧羰基)-1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEG2000)购自NOFCorporation，Tokyo，JP。胆固醇购自Sigma Aldrich，MO。乙醇(分子级)购自DeconLaboratories，Inc.，PA。具有EGFP报告基因(EGFP reporter)的Edit-R Cas9核酸酶RNA(参考CAS11860)购自Horizon Discovery Dharmacon Inc.，Chicago，IL，USA。Slide-A-LyzerTM伽马照射透析盒(10kDa)、Quanit-iTTM
Figure BDA0004033979400000721
RNA试剂和试剂盒(Invitrogen)和Opti-MEMTM减血清培养基(Gibco)购自ThermoFisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA。达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素(100X)购自Corning，Manassas，VA，USA。
2.方法
LNP制剂的制备。使用微流体混合器(Precision Nanosystems，Canada；Leung等人，2015)，根据每种制剂(表1)，通过将水相(在50mM乙酸钠柠檬酸盐缓冲液，pH 4.0中稀释的mRNA)以及含有乙醇和脂质的有机相混合，来制备含有Edit-R Cas9核酸酶mRNA的脂质纳米颗粒。流量比为3：1(水：有机)，并且氮/磷(N/P)比为6。在制备后，将LNP制剂在1 0K MWCOSlide-A-Lyzer透析盒(Thermo Fisher Scientific，MA)中透析到1X PBS(pH 7.4)内2小时。
大小和ζ电位的测量。通过使用Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments MA)来表征LNP制剂的大小和ζ电位。每种制剂在0.1X PBS缓冲液中进行10倍稀释用于大小测量，并且在0.1X PBS中进行40倍稀释用于ζ电位测量。在25℃伴随173°下对稀释样品执行动态光散射，并且所报告的z平均直径是三次测量的平均值。
mRNA封装效率。通过低范围Quanti-iT RiboGreen RNA试剂测定(Thermo FisherScientific，MA)来评估mRNA封装效率。每个LNP样品在TE缓冲液内稀释降至0.2ng/μL的mRNA浓度。每种LNP工作溶液的等分试样进一步在96孔板中的TE缓冲液中进行1∶1稀释(测量未封装的mRNA)，或者在具有4％Triton-X100的TE缓冲液中进行1∶1稀释(测量总mRNA-在LNP内封装的和未封装的游离RNA两者)。样品一式两份进行制备，并且将100μl 2000倍稀释的Quanti-iTTMRiboGreen RNA试剂加入每个样品中，通过板阅读器分别在480和520nm的激发波长和发射波长下测量荧光强度(Infinite M200，Tecan，瑞士)。
细胞培养。HEK-293细胞用含有10％FBS和1％青霉素链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基进行培养。NuLi-1细胞(ATCC CRL-4013)在预涂布有60μg/mL人胎盘IV型胶原(Sigma Aldrich，MO)溶液的烧瓶中进行培养，并且在补充有来自Lonza的SingleQuot添加剂(BEGM Bullet Kit，参考CC-3170)和50μg/mL G-41 8的支气管上皮生长培养基(BEGM)中生长。所有细胞系都在37℃和5％CO2下作为单层培养物得到维持。
体外细胞内摄取。将细胞以12,500个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中，并且在37℃和5％CO2下生长24小时。然后将10μL以10ng EGFP mRNA/μL浓度的LNP加入0.2mL细胞培养基中的细胞中24小时。之后，去除细胞培养基，并且用1X PBS洗涤细胞。为了使细胞解离，向每个孔中加入100μL 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下温育8-10分钟。接下来，加入100μL在达尔贝科磷酸盐缓冲盐水中的1％FBS，细胞以125xg旋转5至10分钟，并且弃去上清液。将细胞重悬浮于具有0.25μL碘化丙啶(PI)(1mg/mL)溶液的50μL 1X PBS中。通过流式细胞术分析细胞百分比GFP表达(即转染效率)和荧光强度。
3.结果
基于具有约束的混合设计，使用
Figure BDA0004033979400000742
台式系统制备具有N/P比＝6的20种制剂(表4)。
表4.LNP制剂的组成。
Figure BDA0004033979400000741
Figure BDA0004033979400000751
Figure BDA0004033979400000761
mRNA-LNP的表征。通过动态光散射(DLS)(Zetasizer Nano，MalvernInstruments，MA)，来评估LNP的大小和ζ电位。在25℃和173°的散射角下，在0.1X PBS中执行大小和ζ电位测量。如图28A中所示，在第1天时LNP制剂的粒度从83.3±14.7nm(F8)到416.30±41.1nm(F17)不等，而ζ电位范围为-43.95±4.75mV(F3)至11.7±1.4mV(F20)(图28B)。然而，LNP制剂的大小和ζ电位显示了在4℃下贮存7天后的变化，伴随对于一些制剂的粒度增加和ζ电位变化(图28A和28B)。根据制造商方案(Thermo Fisher Scientific，MA)，通过RiboGreen测定来评估制剂的封装效率。一半的制剂具有大于80％的高封装效率(F3、F4、F9、F10、F11、F13、F15、F17、F18和F20)，并且F16证实了70.28％的封装效率。然而，其它制剂证实了等于或低于50％的封装效率(图28C)。
LNP制剂在HEK-293和NuLi-1细胞中的细胞内摄取。通过测量HEK-293和NuLi-1细胞系中的百分比GFP表达和荧光强度，使用流式细胞术来评价24小时后LNP mRNA制剂的细胞内摄取。发现所有制剂都显示了小于2％的GFP表达(图29A和29B)。值得注意的是，尽管大多数制剂具有相对较低的百分比GFP表达，但按照荧光强度的细胞内摄取在制剂中不同。与F2、F14和F17相比，F3在HEK-293细胞中显示了显著更高的荧光强度(图29C，p＜0.05)，但当在NuLi-1细胞中测试时，并未显示在荧光强度方面的显著差异(图29D)。
实施例3-经由薄膜冷冻用于肺部递送的聚乙二醇化壳聚糖/CRISPR-Cas9和脂质纳米颗粒mRNA粉末的开发
A.材料和方法
1.材料
聚(乙二醇)单甲醚MW 5000kDa、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖和亮氨酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。低分子量壳聚糖MW 15kDa得自Polysciences Inc.，USA。无核酸酶水、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、Opti-MEM和二乙醚得自Thermo FisherScientific Inc.(Waltham，MA，USA)。pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)是来自Feng Zhang(Addgene质粒#48138；http：//n2t.net/addgene：48138；RRID：Addgene_48138；Ran等人，2013)的赠予。
2.方法
用于通过TFF吸入的干粉的制备。将不同浓度(10％-0.1％，w/v)的甘露糖醇、蔗糖或海藻糖和0.3％亮氨酸在聚乙二醇化壳聚糖/DNA纳米复合物中混合，所述聚乙二醇化壳聚糖/DNA纳米复合物通过先前报告的方法(Zhang等人，2018)进行制备。将萤光素钠盐(0.02％)加入制剂中用于体外空气动力学表现评估。将大约15μL的液体从10cm的高度滴落到通过液氮冷却的旋转低温冷却的(-70℃)不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中，并且转移到-80℃的冰箱内以去除过量的液氮。VirTis AdvantageLyophilizer(VirTis Company Inc.，Gardiner，NY)用于去除水。将样品在-40℃下保持40小时用于初次干燥，并且在650分钟内将温度缓慢增加至25℃，然后在25℃下再保持6小时用于二次干燥。压力在干燥过程期间保持在300mTorr下。还用浓度为20％(w/v)的甘露糖醇、蔗糖和海藻糖配制四种脂质纳米颗粒干粉制剂。
大小和ζ电位的测量。干粉制剂在无菌无核酸酶水中进行重构。在25℃下，通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments，UK)，一式三份地测量重构制剂的流体动力学直径和ζ电位。简言之，将20μL纳米复合物加入80μL以pH 5.5的乙酸钠缓冲液中，并且在测量前充分混合。
几何粒度分布的测量。通过在3巴下使用RODOS分散的HELOS激光衍射仪(SympatecGmbH，德国)，来评估精制干粉制剂的几何粒度分布。在粉末分散之后，每10ms获取测量。对光密度范围为5％至25％的测量取平均值，以确定几何粒度分布。
扫描电子显微镜检查(SEM)。通过SEM(Zeiss Supra 40VP SEM，Carl ZeissMicroscopy GmbH，Jena，德国)，来评价6种精制干粉制剂的表面形态。将干粉样品固定到由碳带覆盖的铝SEM样品座上，并且在图像捕获前，通过Cressington溅射镀膜仪208HR(Cressington Scientific Instruments Ltd.，Watford，U.K.)，用12nm的铂/钯(Pt/Pd)进行溅射涂布。
X射线粉末衍射。在环境条件下，通过X射线衍射仪(MiniFlex600，RigakuCo.，日本)，来鉴定CSP7的结晶度。将粉末置于载玻片上，并且从5到40°2θ收集散射强度(步长为0.025°，2°/分钟，在15mA和40kV下的Cu Kα辐射)。通过Jade 9软件(KS AnalyticalSystems，Aubrey，TX)分析且计算结晶度。
递过新一代撞击器(NGI)的空气动力学粒度分布。通过新一代撞击器(nextgeneration impactor)(NGI，MSP Corporation，MN，USA)检测了体外空气动力学表现。将干粉装载到3号羟丙甲纤维素(HPMC)胶囊内，所述胶囊是来自Capsugel Inc.(Morristown，NJ，US)的赠予。干粉制剂通过Monodose RS01高阻力DPI(Plastiape，Osnago，意大利)或Spiriva HandiHaler进行气溶胶化。气溶胶以60L/分钟的空气流速在4秒内产生，以实现4L的吸入体积。压力由高容量泵(型号HCP5，Copley Scientific，Nottingham，UK)生成，并且由临界流量控制器(型号TPK2000，Copley Scientific，Nottingham，UK)控制。NGI板用1％甘油的乙醇溶液进行涂布，并且在每次运行前风干。每个干粉样品一式三份运行。在气溶胶化后，将在胶囊、装置、感应端口(IP)和阶段1-MOC中沉积的干粉溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中，并且通过Tecan Infinite1200PRO多模式微板阅读器(Tecan Systems，Inc.，San Jose，CA，USA)进行测量。计算且分析几何标准差(GSD)、质量中值空气动力学直径(MMAD)和细颗粒分数％(FPF％)。FPF％定义为小于5.0μm或3.0μm的干粉与发射剂量或计量剂量的质量分数。
真密度。真密度通过Multipycnometer(Quantachrome Instruments，BoyntonBeach，FL)，用氦作为置换气体进行测量，其准确到读数值的0.03％内。
Brunauer-Emmett-Teller(BET)比表面积(SSA)分析。干粉的S SA通过Monosorb快速表面积分析仪型号MS-21(Quantachrome Instruments，Boynton Beach，FL)，通过单点BET方法进行分析。样品在37℃下用以20psi的氮气脱气过夜，以去除表面杂质。氮/氦(30：70v/v)的混合物用作吸附气体。
转染效率。在HEK293细胞中评估DNA质粒(pSpCas9(BB)-2A-GFP)和LNP-mRNA的转染效率。简言之，将5×103个HEK293细胞接种到96孔板的每个孔中的100μL DMEM培养基中，并且温育24小时以使其完全粘附。在温育后，去除培养基，并且向细胞中加入Opti-MEM减血清培养基。将10μL重构制剂加入在具有不同pH 6.5的培养基中培养的细胞中。在温育24小时后，通过流式细胞术评估转染效率。
LNP制剂的制备。使用微流体混合器(Precision Nanosystems，Canada；Leung等人，2015)，根据每种制剂(表5)，通过将水相(在100mM乙酸钠柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0中稀释的mRNA)以及含有乙醇和脂质的有机相混合，来制备含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA的脂质纳米颗粒。在制备后，将LNP制剂在10K MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(ThermoFisher Scientific，MA)中透析到1X PBS(pH 7.4)内2小时。
表5.LNP制剂的组成。
Figure BDA0004033979400000811
统计分析。使用JMP 13执行统计分析。所有实验都一式三份地执行。数据值表示为平均值±标准差(SD)。需要时，执行斯氏t检验(Student′s t-test)或单因素方差分析(ANOVA)。*p值＜0.05被视为统计学显著的。
3.结果
干粉制剂的实验设计和外观。三种冷冻保护剂(甘露糖醇、蔗糖和海藻糖)和一种分散增强剂(亮氨酸)用于通过TFF制备干粉纳米复合物。含有七种不同浓度(10％、5％、3％、1％、0.5％、0.25％和0.1％；w/v)的每种冷冻保护剂和聚乙二醇化壳聚糖/DNA纳米复合物(50ng/μl DNA)的制剂连同或不连同0.3％的亮氨酸进行制备，以便筛选每种冷冻保护剂的最佳浓度(表6)。基于该实验设计，通过TFF制备了42种制剂，并且每种DPI制剂的外观显示于图30中。所有制剂一般具有薄膜干粉薄片的外观(图30)。对于具有较低冷冻保护剂量的制剂，薄片明显更小和/或更脆。相对于不含亮氨酸的制剂，含有亮氨酸的制剂在外观上也明显不同，并且薄膜维持了薄膜结构。具体地，对于Man DPI制剂，亮氨酸允许制剂即使在低甘露糖醇浓度下也维持原始盘状结构(参见F11-F14相对于F4-F7)。
表6.关于聚乙二醇化壳聚糖干粉制剂的实验设计。(DP：干粉，Man：甘露糖醇，Suc：蔗糖，Treh：海藻糖，Leu：亮氨酸)。
Figure BDA0004033979400000821
在重的后纳米复合物的大小和ζ电位。通过zetasizer测量大小和ζ电位，以评价在处理和重构后的大小变化，以评估在制造过程中纳米复合物的物理稳定性。如图31A-31C中所示，与没有TFF处理的纳米复合物相比，每一种重构制剂具有统计学显著的粒度增加(184.1±6.6nm)。重构的Man-DP制剂的大小范围为235.0±39.2nm(F1)至621.2±58.3nm(F7)，而重构的Man-Leu DP制剂的大小范围为223.4±30.2nm(F8)至345.7±20.1nm(F14)。对于Suc DP制剂，粒度范围为200.4±9.2nm(F15)至536.0±198.8nm(F21)，而Suc-Leu DP的粒度范围为206.8±11.1nm(F22)至326.4±21.6nm(F28)。对于Treh DP制剂，在F29中观察到最小粒度，并且显示最大粒度的制剂是F35。伴随亮氮酸的添加(Treh-Leu DP)，粒度范围为202.9±4.5nm(F36)至376.3±47.6nm(F42)。总之，随着冷冻保护剂的浓度降低，观察到纳米复合物大小增加的趋势。相比之下，就DP制剂的ζ电位而言，没有观察到明显的趋势。
在重构后纳米复合物的转染效率。测试了冷冻保护剂的类型和浓度对纳米复合物的转染效率的作用。图32显示了针对未处理的纳米复合物标准化的重构制剂数据的转染效率。发现高浓度或低浓度的冷冻保护剂都不能保护纳米复合物的效力免受TFF/冻干或重构步骤的影响。对于Man DP、Suc DP、Treh DP、Man-Leu DP、Suc-Leu DP和Treh-Leu DP，分别在含有1％甘露糖醇、3％蔗糖、0.5％海藻糖、3％甘露糖醇+0.3％亮氨酸、1％蔗糖+亮氨酸、以及3％海藻糖+0.3％亮氨酸的制剂中观察到最高的转染效率。相比之下，不含任何赋形剂的纳米复合物在TFF和冻干工艺后显示了很小的转染效率。
基于这些筛选测定，发现较高浓度的冷冻保护剂导致重构后纳米复合物的较少聚集(即较小的粒度变化)，然而，用含有范围为0.5-3％的冷冻保护剂浓度的制剂发现了最高的转染效率。因此，选择含有3％冷冻保护剂的六种制剂(F3、F10、F17、F24、F31和F38)作为用于进一步调查的先导制剂(图33)。
先导干粉制剂的表征。SEM图像(图34)揭示了，所有六种干粉制剂都显示出不同程度的聚集，在其中，与在外观中显示出光滑固体的其它四种制剂相比，F3和F10证实更大的孔隙率。这些观察与粉末的粒度相组合。六种先导干粉制剂的几何粒度分布通过使用RODOS粉末分散的HELOS激光衍射进行表征。如表7中所示，似乎F3和F10的几何粒度中值(D50)明显小于其它制剂。鉴于制剂F17、F24、F31、F38的外观和较低的孔隙率及其较大的D50，它们很可能不是可吸入的粉末。这通过上述空气动力学粒度分析得到确认。X射线衍射图揭示了，未处理的粗甘露糖醇显示出具有在10.54°和14.69°的2θ下的特征衍射峰的β型，而TFF干粉制剂(F3和F10)证实了在9.69°的20下作为特征衍射峰的δ型，并且没有观察到从10°到16°的衍射峰(图35A)。如图6b和6c中所示，与未处理的蔗糖(图35B)和海藻糖(图35C)相比，F17、F24、F31和F38似乎是无定形的，因为没有观察到明显的结晶峰。
表7.精制干粉制剂的平均几何粒度分布。
Figure BDA0004033979400000841
RS01单剂量DPI中的精制干粉制剂的空气动力学表现。NGI用于评估精制干粉制剂的空气动力学表现，所述精制干粉制剂通过低阻力RS01单剂量DPI(流速60L/分钟)进行气溶胶化。如图36中所示，与其它制剂相比，F3和F10致使低于阶段2(4.46微米的空气动力学截止)的更高沉积，其指示了F3和F10的空气动力学粒度分布更好。基于沉积概况，MMAD、FPF％和EF％被计算并概括于表8中。F3和F10分别证实了4.8μm和4.6μm的MMAD，其指示了与具有大于5μm的MMAD的其它制剂相比，用于在肺中的干粉颗粒沉积的更好潜力。此外，尽管F3(74.2％)和F7(71.5％)的EF％低于其它制剂，但F3和F10证实了比其它制剂相对更高的FPF％(＜5μm)，分别为44.5％和44.2％。基于这些结果，F3和F10被鉴定为适合于吸入的制剂，并且进行进一步测试。
表8.在RS01中的精制TFF干粉制剂以60L/分钟的空气动力学表现。
Figure BDA0004033979400000851
吸入器类型和流速对F3和F10的空气动力学表现的作用。为了选一步评估F3和F10的空气动力学表现，两种类型的高阻力吸入器用于以两种不同的流速使干粉制剂气溶胶化(表9)。看起来无论吸入器类型或流速如何，与F3相比，含有亮氨酸的F10都显示了更低的MMAD和更高的FPF％。另外，对于HandiHaler或RS01 DPI，与45L/分钟的流速相比，两种制剂在60L/分钟的流速下均具有显著更高的EF％和FPF％、以及更低的MMAD，其指示了这些装置中F3和F10的流速依赖性的空气动力学表现。此外，与RS01单剂量DPI相比，在相同流速下，对于F3或F10，HandiHaler DPI致使更高的EF％，但更大的MMAD，其指示了两种制剂的空气动力学表现也是吸入器类型依赖性的。
表9.F3和F10在不同吸入器和不同流速下的空气动力学表现。(N/A指示大小超出测量范围)。
Figure BDA0004033979400000861
F3和F10的水分含量、真密度和比表面积通过TGA、复式比重计(multipycnometer)和monosorb(快速表面积分析仪BET)进行评估。如表10中所示，与F3相比，含有亮氨酸的F10具有更低的水分含量和更低的真密度。相比之下，F10的比表面积明显高于F3。
表10.F3和F10的真密度和比表面积。
Figure BDA0004033979400000862
TFF脂质纳米颗粒-mRNA(LNP)干粉制剂的大小。由可电离脂质、磷脂、胆固醇、聚(乙二醇)(PEG)-脂质和编码EGFP的mRNA组成的四种LNP制剂，通过TFF用浓度为20％(w/w)的不同赋形剂配制成干粉：采用了甘露糖醇、蔗糖和海藻糖。在TFF和冻干后，将干粉制剂在蒸馏水中重构，并且通过DLS测量LNP粒度。如图37中所示，尽管与未处理的LNP相比，重构后的所有TFF制剂都显示了粒度的显著增加，但不同的冷冻保护剂显示了对每种制剂不同的冷冻保护作用。对于LNP-1和LNP-4，由于重构后的大小变化最小，与甘露糖醇和海藻糖相比，蔗糖显示了对大小的更好保护作用，而对于LNP-2和LNP-3，与蔗糖和海藻糖相比，甘露糖醇显示了对大小的更好保护作用。
TFF脂质纳米颗粒(装载mRNA的)干粉制剂的细胞内摄取。在HEK293细胞中评估在重构后的干粉LNP制剂的转染效率。如图38中所示，与未处理的LNP制剂相比，含有20％蔗糖的制剂并未显示在转染效率方面的显著差异，而与未处理的LNP制剂相比，其它冷冻保护剂显示了转染效率的显著降低。
实施例4-用于潜在肺部递送的薄膜冷冻干燥的封装siRNA的固体脂质纳米颗粒
A.材料和方法
1.材料
聚乙二醇2000-腙-C18(PHC)遵循先前公开的方法合成，并且通过NMR进行表征(Zhu等人，2013)。精制卵磷脂得自Alfa Aesar(Tewksbury，MA)。甘露糖醇(USP)、脂多糖(LPS)、胆固醇、III型粘蛋白、来自猪胃的Amicon Ultra离心过滤单元Ultra-15(MWCO100kDa)来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。Lipofectamine RNAiMAX转染试剂、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、链霉素/青霉素、FluoSpheresTM胺修饰的聚苯乙烯微球体和HEPES缓冲液来自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
Figure BDA0004033979400000871
胆固醇和1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)来自Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)。TNF-αsiRNA购自Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa，USA)，具有序列(5′-GUCUCAGCCUCUUCUCAUUCCUGCT-3′(SEQ ID NO：1)，反义：5′-AGCAGGAAUGAGAAGAGGCUGAGACAU-3′(SEQ ID NO：2))。TNF-αELISA试剂盒来自BioLegend(San Diego，CA)。
2.方法
纳米颗粒悬浮液的制备。SLN遵循先前建立的溶剂蒸发方法进行制备，伴随轻微修改(Aldayel等人，2018)。简言之，将卵磷脂(3.2mg)、胆固醇(1.6mg)、PHC(2mg)和8μLTopFluor胆固醇溶液(0.25％w/v的THF溶液)溶解于0.5mL THF中，并且通过0.2μm PTFE注射器式过滤器进行过滤。伴随搅拌，将混合物逐滴加入5mL水中。将所得的纳米颗粒悬浮液搅拌过夜以蒸发THF，然后用3.2μm PTFE注射式过滤器进行过滤，然后在干燥程序前贮存于4℃下。
为了制备掺入siRNA的SLN，将100μl 20μM siRNA的水溶液用400μL水稀释，然后加入680μL 2.56％(v/v)DOTAP的氯仿溶液中，并且剧烈搅拌30分钟，随后为1.3mL甲醇的添加，搅拌1小时。通过相分离，用氯仿从混合物中提取siRNA/DOTAP复合物。将卵磷脂(3.2mg)、胆固醇(1.6mg)和PHC(2mg)溶解于0.5mL氯仿中，并且与siRNA/DOTAP复合物混合。使混合物在氮气下干燥，然后重新溶解于500μL THF中，然后逐滴加入5mL水中。为了对SLN进行荧光标记，在与siRNA/DOTAP复合物混合之前，将TopFluor胆固醇溶液(0.25％w/v的氯仿溶液)加入卵磷脂混合物中。使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough，MA)，通过动态光散射(DLS)测量所得的SLN的大小、多分散性指数(PDI)和ζ电位。
通过薄膜冷冻干燥的干粉制备。为了制备薄膜冷冻干燥的SLN粉末，将甘露糖醇溶解于纳米颗粒悬浮液中(对于SLN无siRNA的SLN为40.8mg/mL，且对于封装siRNA的SLN为48mg/mL)，然后如先前所述的(Zhang等人，2012；Engstrom等人，2008；Thakkar等人，2017)，通过将悬浮液滴落到旋转、预冷的空心不锈钢圆柱形滚筒进行冷冻。使用VirTisAdVantage台式冻干器(Gardiner，NY，USA)，冻干循环为-40℃搁板温度20小时，在20小时内升温至25℃，然后在25℃下再保持20小时，伴随低于100mpa的压力。通过冻融实验确定甘露糖醇/SLN比。简言之，将1 mL悬浮液中的SLN与不同量的甘露糖醇混合并在-80℃下冷冻2小时，然后在室温下解冻，然后测量粒度和PDI。
通过喷雾干燥的干粉制备。喷雾干燥的纳米颗粒粉末通过将甘露糖醇以4.08mg/mL溶解到纳米颗粒悬浮液内进行制备，所述纳米颗粒悬浮液然后使用具有
Figure BDA0004033979400000891
双流体喷嘴的Büüchi B-290小型喷雾干燥器(Flawil，瑞士)进行干燥。气溶胶化气体的流动为29L/分钟(氮)，吸气器设定为100psi，入口温度为90℃，且出口温度为65℃，且悬浮液进料速率为3mL/分钟。粉末在黑暗中贮存于真空干燥器中，直到分析。粉末在黑暗中贮存于真空干燥器中，直到进一步分析。
粉末表征。在Austin(Austin，TX)的University of Texas的显微镜成像中心(Microscopy and Imaging Facility)，使用Zeiss Supra 40V扫描电子显微镜(SEM)(Zeiss SMT AG，Oberkochen，德国)，检查喷雾干燥粉末和TFFD粉末的形态。将样品轻拍到导电胶带上，然后用Cressington 208溅射镀膜仪(Cressington ScientificInstruments，Watford，UK)，用15nmAu/Pt进行涂布，然后装载到SEM。用Quantachrome Nova2000Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积分析仪(Quantachrome Corporation，BoyntonBeach，FL)测量干燥粉末的表面积。
体外气溶胶化性质。用来自Copley Scientific(Colwick，Nottingham，UK)的新一代撞击器(NGI)和CITDAS软件评估粉末的体外气溶胶表现。将大约10mg干粉填充到3号羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊(Capsugel，Morristown，NJ)内，并且置于来自Plastiape(Milano，意大利)的RS01高阻力吸入器内。细颗粒分数(FPF)定义为空气动力学直径＜5微米。SLN的定量通过使用BioTek Synergy HT微板阅读器(ex＝485，em＝528)(Winooski，VT)测量NP的荧光强度来实现，使用下式：％沉积＝100X(在每个NGI阶段上的重悬浮粉末的荧光强度/重悬浮介质的体积)/(重悬浮粉末标准的荧光强度/重悬浮介质的体积)。选择乙醇的水溶液(50％，v/v)作为重悬浮介质，因为荧光信号在纯水中相对较弱。
模拟粘液中的纳米颗粒扩散。使用先前开发的测定(Leal等人，2018)，测量了SLN和聚苯乙烯珠在模拟粘液中的扩散。将粘蛋白溶解于20mM HEPES缓冲液中，以制备2％(w/v)溶液并且轻轻搅动30分钟，然后将100μL模拟粘液转移到具有3.0μm孔径的聚酯膜
Figure BDA0004033979400000901
Transwell插入物(Corning，NY)中的顶部区室，针对底部区室中的600μL 20mMHEPES缓冲液，并且将Transwells置于室温下。选择孔径以确保在实验的时间过程期间颗粒可以移动通过膜，同时保留粘蛋白凝胶(Norris和Sinko，1997)。接下来，将10μl重构的SLN或聚苯乙烯珠(作为对照)轻轻加入顶部区室中。每小时收集底部HEPES缓冲液，并且用新鲜的HEPES缓冲液替换，共5小时。不含粘蛋白凝胶的孔用作对照。收集的洗脱物中的颗粒量基于6点线性校准曲线由荧光强度进行确定。
ELISA。将TNF-αSLN粉末(100mg)重悬浮于5mL无血清培养基中，然后用3.2μm PTFE过滤器进行过滤。将J774A.1巨噬细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Manassas，VA)接种到96孔板(7000个细胞/孔)中。在过夜温育后，将培养基替换为150μL/孔的悬浮液。在4小时后，加入150μL具有20％FBS的培养基，并且使细胞再温育四十四(44)小时。然后用300μL/孔的含有以300ng/mL的LPS的培养基替换该培养基，并温育4小时，然后通过BioLegend ELISA试剂盒测量TNF-α浓度。
统计分析。用Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)处理扩散和ELISA数据。
B.结果与讨论
TFFD是一种快速冷冻工艺，随后为冻干。通过TFFD制备的干粉是多孔的，具有高表面积。该方法已成功地应用于小分子(Zhang等人，2012：Overhoff等人，2008；Overhoff等人，2007)、蛋白质(Engstrom等人，2008)、以及用不溶性铝盐佐剂化的疫苗(Thakkar等人，2017：Li等人，2015)。另外，粉末的蓬松性和脆性给予其用于肺部药物递送的极佳气溶胶性质。基于小分子(Patlolla等人，2010；Nemati等人，2019；Patil-Gadhe等人，2016)和核酸的试剂(Hyde等人，2014；Deshpande等人，2002)的肺部递送已证明使用基于脂质的颗粒作为载体是可行的。喷雾干燥(Nemati等人，2019)和冷冻干燥(Lball等人，2017)均已用于制备SLN的干粉制剂。然而，报告了由于其大粒度，通过喷雾干燥制备的装载乙胺丁醇的SLN干粉的空气动力学性质不利于肺深处递送(Nemati等人，2019)。由于仅具有1μm至5μm大小的颗粒可以沉积到肺深处，直径在100-200nm范围内的SLN太小，并且将在吸入后被呼出(Rahimpour和Hamishehkar，2012)。因此，SLN需要赋形剂来充当载体和细胞保护剂用于干粉形成。在本研究中，测试了将TFFD应用于SLN用于肺部递送的可行性。SLN通过如先前所述的溶剂蒸发方法(Aldayel等人，2018)进行制备。它们用卵磷脂、胆固醇和PHC进行制备，连同或不连同与阳离子脂质复合的siRNA。所得SLN的直径为大约100-150nm(通过DLS测量的)，相对均匀分布且是球形的。然后使不含siRNA的SLN经受TFFD或喷雾干燥，并且比较了所生成的粉末。然后使由TNF-αsiRNA封装的SLN经受TFFD。对TNF-αsiRNA-SLN的干粉进行表征，测量其气溶胶性质，以及TNF-αsiRNA-SLN在经受TFFD和重构后的功能和TNF-αsiRNA-SLN渗透通过模拟肺粘液的能力。
筛选赋形剂以冷冻SLN。在使SLN经受TFFD之前，筛选了潜在的冷冻保护剂在冷冻期间保护SLN的能力。由于其良好的气溶胶表现性质(D’Addio等人，2013)和冷冻保护能力(Wang等人，2018)，选择甘露糖醇作为粉末填充剂和冷冻保护剂。为了确定所需的SLN/甘露糖醇比，执行了冻融实验。表11中的结果显示了，用1/30的颗粒/甘露糖醇重量比实现了最佳的冷冻保护，所述重量比然后用于进一步研究。
表11.SLN在各种量的甘露糖醇的存在下的冻融。数据为平均值±SD(n＝3)。
Figure BDA0004033979400000921
SLN的薄膜冷冻干燥粉末的制备和表征。SLN的干粉通过将悬浮于甘露糖醇溶液中的SLN滴落到预冷的金属表面，并且在搁板式冷冻干燥器中冻干进行制备。作为对照，还用相同的组合物制备了SLN的喷雾干燥粉末。首先通过测量重构后的粒度、PDI和ζ电位来表征SLN的TFFD粉末和喷雾干燥(SD)粉末。如表12中所示，与干燥前的SLN相比，由SD和TFFD粉末重构的SLN的大小是增加的。SLN的PDI在它们经受TFFD和重构后并未改变，尽管它在经受SD和重构后是增加的。粒度增加的潜在机制尚不清楚，但冷冻应力(Chung等人，2012)以及在干燥步骤期间的应力和颗粒赋形剂相互作用可能已促成粒度增加(Niu和Panyam，2017)。粉末然后通过检查其形态和比表面积进行表征。如图39中所示，TFFD粉末证实了多孔质地，而SD粉末显示了珠状显微结构。TFFD粉末的比表面积是SD粉末的大约20倍(表12)，这与先前的文献一致(Engstrom等人，2008)。
表12.SLN在它们经受喷雾干燥或TFFD和重构之前和之后的物理性质。数据是平均值±SD(n＝3)。
Figure BDA0004033979400000931
体外气溶胶化表现。SD粉末和TFFD粉末的气溶胶表现使用NGI进行确定且比较(图40)。TFFD粉末证实了比SD粉末制剂更高的FPF(表13)和肺深处区域中的更好沉积(图40，参见阶段4-7)，其很可能是由于TFFD粉末的多孔形态和高表面积。因此得出结论，在所测试的组成下，对于SLN的肺部递送，通过TFFD制备的SLN干粉优于通过喷雾干燥制备的SLN干粉。
表13.通过喷雾干燥或TFFD制备的SLN干粉的细颗粒分数(FPF)％、质量中值空气动力学直径(MMAD)和几何标准差(GSD)值(数据为平均值±SD，n≥3)
Figure BDA0004033979400000941
封装siRNA的SLN的薄膜冷冻干燥粉末的制备和表征。为了制备封装siRNA的SLN，将siRNA与生物相容性阳离子脂质DOTAP以12/1的N/P比混合，然后与其它成分混合，随后为如先前所述的溶剂蒸发。与不含siRNA的SLN相比，所得的siRNA-SLN具有略微更大的粒度(表14)。将悬浮液中的siRNA-SLN与甘露糖醇以1∶30w/w的比率混合，并且经受TFFD。如图41A中所示的粉末是蓬松的，具有多孔质地。siRNA-SLN的大小在它们经历TFFD和重构后略微增加。图41B显示了通过TFFD制备的siRNA-SLN粉末的气溶胶表现特性。再次，siRNA-SLN粉末具有高FPF％(表15)和代表肺深处的阶段中的高沉积(图41B)。用于递送到肺泡的主要因素是空气动力学粒度。与先前公开的方法(Nemati等人，2019；Ohashi等人，2009)相比，薄膜冷冻干燥的siRNA-SLN粉末证实更小的MMAD、更高的FPF％和更高的沉积到对应于肺泡的NGI阶段，提示了TFFD对于生成用于气溶胶递送的siRNA-SLN干粉是理想的。
表14.TNF-a siRNA-SLN在它们经受TFFD和重构之前和之后的物理性质比较。数据是平均值±SD(n＝3)。
Figure BDA0004033979400000951
表15.通过TFFD制备的siRNA-SLN干粉的细颗粒分数(FPF)％、质量中值空气动力学直径(MMAD)和几何标准差(GSD)值(数据为±均值SD，n≥3)。
Figure BDA0004033979400000952
在siRNA-SLN经受TFFD和重构后，在其中的siRNA的功能验证。为了验证在siRNA-SLN经受TFFD和重构后siRNA的功能，使用TNF-αsiRNA-SLN，并且测量siRNA-SLN抑制通过用LPS刺激的J774A.1小鼠巨噬细胞表达TNF-α的能力。如图42中所示，在经受TFFD和重构后的TNF-αsiRNA-SLN在下调来自细胞的TNF-α释放方面与TFFD之前一样有效，证实了TFFD可以成功地应用于将siRNA-SLN从液体悬浮液转化为干粉，而不损害siRNA的功能性。
siRNA-SLN跨模拟粘液的扩散。为了递送至肺的siRNA-SLN具有对活细胞的接近，它们需要渗透穿过粘液层。为了评估siRNA-SLN在递送到肺后是否可以渗透穿过粘液层，使用由具有或不具有模拟粘液的Transwell可渗透支持物组成的系统执行粘液渗透测定(Norris和Sinko，1997；Desai等人，1991)。将悬浮液中的SLN轻轻加入孔中心的粘液上，而不干扰粘液，并且在不同的时间点定量在Transwell的另一侧中的颗粒浓度。商购可得的荧光标记的聚苯乙烯珠(大小，279±4nm：PDI，0.10±0.02；ζ电位，+36.0±0.4mV)用作对照。图43中显示的是扩散通过具有或不具有模拟粘液层的膜的颗粒百分比。如果没有模拟粘液，则SLN和聚苯乙烯珠两者均快速扩散穿过膜并且在一小时内达到平台期。siRNA-SLN跨越粘液层的扩散明显较慢(图43)，但约25％的SLN在5小时内扩散穿过模拟粘液层，清楚地指示了在siRNA-SLN作为薄膜冷冻干燥的粉末气溶胶化到肺内之后，它们可以渗透肺中的粘液。
在本研究中，证实了生产具有良好气溶胶性质的SLN干粉制剂用于将治疗剂如TNF-αsiRNA潜在的肺递送到肺内是可行的。最初，通过喷雾干燥和TFFD制备SLN的干粉，并且比较它们的物理和气溶胶性质。通过TFFD制备的粉末是蓬松而脆的，证实比喷雾干燥粉末更好的气溶胶性质。进一步显示了，封装TNF-αsiRNA的SLN的TFFD粉末在其下调通过培养中的巨噬细胞的TNF-α释放的能力方面保持功能。伴随它们证实的穿透模拟粘液的能力，很可能是由于纳米颗粒的表面聚乙二醇化(Huckaby和Lai，2018)，预计使用对关键促炎细胞因子如TNF-α特异性的siRNA，siRNA-SLN的TFFD粉末可以潜在地用于将siRNA肺部递送到肺，以治疗肺部疾病如哮喘和其它慢性炎症性疾病。当然，siRNA不必是TNF-a siRNA，并且事实上，预计其它基于核酸的试剂如mRNA、shRNA、质粒DNA、微环DNA、DNA寡核苷酸，也可以配制成与本研究中使用的SLN类似的SLN或脂质纳米颗粒。另外，纳米颗粒无需是基于脂质的；基于聚合物或由无机纳米颗粒制备的纳米颗粒也可以使用TFFD用于气溶胶化从液体悬浮液转换为干粉。此外，纳米颗粒通常用作载体，以保护基于核酸的试剂并改善其通过靶细胞的摄取。如果基于核酸的试剂专门改造为稳定的和/或可以无需纳米颗粒的帮助而被靶细胞吸收，则它们可以使用TFFD直接转换成具有良好气溶胶性质的干粉。此外，显而易见的是，封装到纳米颗粒内的治疗剂和/或诊断剂不必是基于核酸的。小分子、蛋白质以及甚至细菌和病毒可能由纳米颗粒携带。最后，任何潜在的治疗剂和诊断剂也可以在纳米颗粒经受TFFD之前与其混合。
之前已详细描述了胶体悬浮液的冷冻干燥，并且显示了由填充剂引起的胶体纳米大小的增加在稳定的胶体系统中是普遍的(Lintingre等人，2016)。这可以解释在SLN经受TFFD后它们的流体动力学直径的增加，无论是否用siRNA封装。SLN/赋形剂的比率在影响SLN的粒度和多分散性指数(PDI)方面起着重要作用。胶体悬浮液的冷冻干燥是多步骤的过程，并且很难描述此类过程。在冷冻步骤中，通过冷冻引起的颗粒聚集主要归于冰结晶，其将颗粒推向具有高冷冻应力的小区域。在干燥步骤中，赋形剂充当水的替代物，通过与颗粒表面建立氢键来稳定颗粒(Abdelwahed等人，2006)。TFFD技术在两个方面是独特的：首先，与其中冷却速率在1到10K/分钟的量级上的搁板式冷冻相比较，冷却速率在500-1000K/s17范围内。更快的冷却导致更小的冰晶。其次，TFFD工艺产生厚度低于1毫米的薄膜，并且薄膜中的自由空间对于水在升华过程中的行进提供了通道。目前尚不知道在滴落和冷冻过程期间液滴与空气之间的气液界面张力是否导致纳米颗粒上的聚集，但气液界面张力低于喷雾冷冻期间。最后，SLN在它们经受TFFD和重构后的流体动力学大小的轻微增加对于肺部递送可能没有生物学意义，因为粒度保持小于200nm，并且SLN中siRNA的功能性并未受到损害。需要时，可以应用涉及修饰赋形剂以及冷冻和冻干程序的未来努力，以使粒度变化降到最低。
因此，研究显示了，薄膜冷冻干燥可以应用于制备固体脂质纳米颗粒的干粉，其封装有siRNA或不含siRNA，具有用于潜在的肺部递送的良好气溶胶性质，以治疗肺疾病。
C.用于潜在的肺部递送的TNF-αsiRNA固体脂质纳米颗粒的气溶胶表现
1.方法
siRNA-固体脂质纳米颗粒通过将与阳离子脂质复合的TNF-a siRNA封装到固体脂质纳米颗粒内进行改造，所述固体脂质纳米颗粒由卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇(2000)-腙-硬脂酸(C18)衍生物通过纳米沉淀进行制备。纳米颗粒用TopFluor胆固醇进行荧光标记。为了制备siRNA-固体脂质纳米颗粒的干粉制剂，将甘露糖醇加入纳米颗粒悬浮液中，然后将悬浮液冷冻干燥。使用新一代撞击器(NGI)检查干粉的气溶胶表现。
对于评估气溶胶表现的新一代撞击器(NGI)实验，纳米颗粒用以总胆固醇的1.25％w/w的TopFluor胆固醇(Bodipy标记的)进行荧光标记。对于喷雾干燥研究，阳离子脂质和siRNA并未加入制剂中。获取TEM图像并且执行巨噬细胞摄取研究。Buchi B290喷雾干燥器用于制备干粉制剂，使用甘露糖醇作为赋形剂。对于冷冻干燥，对于冷冻保护剂和理想的赋形剂浓度执行初步筛选。SLN的气溶胶表现通过NGI进行确定。
2.结果与结论
TNF-a siRNA固体脂质纳米颗粒是球形的。它们的粒度和多分散性指数为118±7nm和0.16±0.01。在细胞培养中，TNF-a siRNA固体脂质纳米颗粒显著下调了通过用脂多糖处理的J774A.1小鼠巨噬细胞的TNF-α表达(图44)。NGI数据证实了纳米颗粒的干粉具有良好的气溶胶表现，具有78.5％的细颗粒分数(FPF)(图45)。TNF-a siRNA固体脂质纳米颗粒是球形的。它们的粒度和多分散性指数为118±7nm和0.16±0.01。(图46)。
SLN的干粉制剂。图47中所示的SLN干粉制剂的物理外观。喷雾干燥的SLN粉末的比表面积为0.92±0.11m2/g，而冷冻干燥粉末的比表面积为19.34±2.5m2/g，两者均通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)进行确定。
SEM图像显示了冷冻干燥的粉末比喷雾干燥的粉末更多孔(图48)。NGI实验指示了冷冻干燥的粉末制剂超过喷雾干燥制剂的更佳气溶胶表现(图49)。粒度和PDI在两种干燥方法后均略微增加(表16)。
表16.在每种干燥方法之前和之后的粒度和PDI。
Figure BDA0004033979400000991
在干燥前和干燥后的粒度分布比较显示于图50中。还执行了在干燥步骤前使用不同缓冲液和/或冷冻保护剂来悬浮纳米颗粒的赋形剂筛选，但并未获得有效条件。
因此，研究显示了，TNF-a siRNA固体脂质纳米颗粒制剂能够成功地抑制通过培养中的巨噬细胞的TNF-a产生，并且减轻小鼠模型中的慢性炎症。纳米颗粒的干粉显示了用于肺部递送的良好气溶胶表现。
实施例5-细菌的薄膜冷冻和薄膜冷冻干燥
A.结果
1.细菌的薄膜冷冻
将大肠杆菌DH5α(Invitrogen，Carlsbad，CA)的单个菌落接种到3mL LoriaBertani肉汤(LB)培养基(Invitrogen)起始培养物内，然后转移到100mL LB培养基中，并且在33℃下伴随振荡温育过夜。细菌通过以2000rcf离心15分钟进行收获，并且用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4，10mM)洗涤一次。在离心后，将细菌重悬浮到具有10％(w/v)蔗糖的溶液中至原始体积。对于薄膜冷冻，使用附接到注射器的21号针头，将250μL细菌悬浮液(0.7-5x108个菌落形成单位(CFU)/ml)逐滴加入20mL玻璃小瓶的底部，所述玻璃小瓶用干冰进行预冷。然后将具有细菌的冷冻薄膜的玻璃小瓶盖上盖子，并且置于室温下至解冻或贮存于-80℃下直至进一步测试。搁板式冷冻用作对照。简言之，将250μL细菌悬浮液分配到20mL玻璃小瓶中，然后在-20℃下冷冻2小时。在用LB培养基连续稀释之后，使用具有LB琼脂平板的标准平板测定，来确定在冻融前或冻融后悬浮液中的活细菌数目。表17中显示的是在细菌经受薄膜冷冻或搁板式冷冻后回收的活细菌百分比和对数CFU减少。总体而言，与搁板式冷冻相比，更多的细菌在它们经受薄膜冷冻后保持活的。
表17.在它们经受搁板式冷冻或薄膜冷冻后的细菌活力比较。
Figure BDA0004033979400001001
2.细菌的薄膜冷冻干燥
为了制备细菌干粉，使悬浮于10％蔗糖(w/v)中的细菌经受标准冻干循环(即，样品用Virtis Advantage冷冻干燥器(Warminster，PA)进行干燥；压力＜10mbar；搁板温度为-40℃共24小时，在24小时内升温至25℃，然后在25℃下保持24小时，或表18中的方法A)。然后用LB培养基重构干粉，并且在用无菌PBS(pH 7.4，10mM)连续稀释后，通过平板测定来确定悬浮液中的活细菌数目。令人惊讶的是，仅0.09％的细菌是活的，多于3的对数减少(表19)。因此，研究了冻干循环以及赋形剂的组成对细菌在它们经受薄膜冷冻干燥和重构后的活力的作用(表18和19)。最终，发现了一种组合物和冻干方法，其保存接近30％的细菌(即，0.54的对数减少)(表19)。图51显示了用薄膜冷冻干燥制备的细菌干粉不同于通过搁板式冷冻干燥制备的细菌干粉。
表18.用于从薄膜冷冻的细菌薄膜中去除水的冻干条件。
Figure BDA0004033979400001011
表19.大肠杆菌使用不同的赋形剂和冻干方法的薄膜冷冻干燥(TFF，薄膜冷冻；闪冻，在液氮中冷冻不到1分钟的具有250μL细菌悬浮液的20mL玻璃小瓶)。
Figure BDA0004033979400001021
3.冷冻和融解
表20显示了冷冻和融解实验的结果。将细胞以4000RPM离心30分钟，然后重悬浮于10％w/v蔗糖溶液中。对于解冻组实验，100μL悬浮液直接经历连续稀释。对于搁板式冷冻实验，将500μL悬浮液置于-20℃冰箱中30分钟，然后升温至RT。对于TFF实验，将250μL悬浮液滴落到在干冰-乙醇浴中预冷的20mL玻璃小瓶，然后直接升温至RT。
表20.冷冻和融解实验的结果。
Figure BDA0004033979400001022
除了制备薄膜冷冻干燥的细菌干粉之外，还考虑了本文公开的方法也可以应用于制备其它生物如真菌、酵母、古细菌、病毒、花粉等的干粉制剂。生物可以是活的、减毒的或灭活的。
B.TFF细菌制剂的进一步优化
在分开的研究中，使用在不锈钢滚筒上的薄膜冷冻处理细菌，并且使用VirtisAdvantage Pro冻干器(Warminster，PA)，使水从冷冻薄膜中升华。简言之，将具有氨苄青霉素抗性的pUC19载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的大肠杆菌DH5α的单个菌落接种到5mLMiller Loria Bertani肉汤(LB)培养基(Invitrogen)起始培养物内过夜，然后转移到100mL LB培养基中，并且在37℃下伴随振荡温育，直到OD600达到0.4。通过在环境温度下以4300rcf离心5分钟来收获细菌。在离心后，将细菌以原始培养体积的10％重悬浮到冷冻保护剂混合物(cocktails)中。对于薄膜冷冻，使用附接到注射器的21号针头，将1000μL细菌悬浮液(0.1-2×109个菌落形成单位(CFU)/ml)逐滴加入预冷至-40℃的旋转不锈钢滚筒中。将冷冻薄膜收集到5mL琥珀色玻璃小瓶中，贮存于-80℃下，直至使用表21中所示的循环的冻干。使用具有LB培养基并且铺展到LB琼脂平板上的标准连续稀释方法，来确定在经受TFFD工艺之前或之后悬浮液中的活细菌数目。
表21.使用Virtis Advantage Pro 85冻干器，用于细菌的冻干循环。
Figure BDA0004033979400001031
Figure BDA0004033979400001041
表22中显示的是冷冻保护剂混合物的不同制剂、在细菌经受薄膜冷冻干燥后的CFU计数和对数CFU减少。与搁板式冷冻相比，在细菌经受薄膜冷冻后，少数制剂可以使活力损失降到最低，在一个对数内。
表22.冷冻保护剂混合物以及在TFFD后的细菌活力
Figure BDA0004033979400001042
Figure BDA0004033979400001051
实施例6-质粒DNA的薄膜冷冻和薄膜冷冻干燥
A.材料和方法
i.材料
编码β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA pCMV-β来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，它基于pUC19质粒进行构建，所述pUC19质粒在哺乳动物细胞中的不同病毒启动子的控制下，能够表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-Gal)(MacGregor等人，1989)。大肠杆菌DH5α感受态细胞和LB内汤来自Invitrogen(Carlsbad，CA)。1，4-二噁烷和叔丁醇、Tris-EDTA(TE)缓冲液和氨苄青霉素来自Fisher Scientific(FairLawn，NJ)。琼脂糖来自Amresco(Atlanta，GA)。聚山梨醇酯20、乳糖一水合物和无水甲醇来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。Quant-iTTMPicoGreenTM dsDNA测定试剂盒来自Thermo Scientific(Waltham，MA)。#3号羟丙基甲基纤维素胶囊来自Quali-V-I胶囊(Qualicaps US，Whitsett，NC)。
ii.质粒制备
在选择性生长条件下，将pCMV-β质粒转化到大肠杆菌DH5α内，然后使用QIAGENMidiprep试剂盒(Valencia，CA)进行扩增且纯化。通过QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒执行大规模质粒制备。使用琼脂糖凝胶和来自Thermo Scientific(Waltham，MA)的Nanodrop 2000分光光度计来评估质粒。
iii.使用薄膜冷冻制备质粒DNA干粉
为了筛选用于吸入的干粉的最佳制剂，pCMV-β和赋形剂(即，甘露糖醇和亮氨酸)以如表23中所示的各种固体含量和质粒载量溶解于水、Tris-EDTA(TE)缓冲液、1，4-二噁烷/水(10/90，v/v)或叔丁醇/水(40/60，v/v)中。在应用于薄膜冷冻工艺之前，制剂暂时贮存于2-8℃下的冰箱中。
表23.质粒组合物和TFF参数列表。
Figure BDA0004033979400001061
Figure BDA0004033979400001071
TFF工艺和冻干如先前所述的完成(Li等人，2015；Sahakijpijarn等人，2020a；Moon等人，2019；Sahakijpijarn等人，2020b)。简言之，将0.25mL样品通过21号注射器逐滴滴落到旋转的低温冷却的不锈钢表面(-80±10℃)上。为了形成冷冻薄膜，将滚筒的低温冷却的钢表面在其下旋转的速度控制在5-7rpm下，以避免液滴重叠。使用钢刀片取下冷冻的薄膜，并且将其收集在玻璃小瓶中的液氮中。玻璃小瓶用半开的橡胶塞盖上，并且转移到-80℃冰箱(Thermo Fisher Scientific)内用于临时贮存，然后转移到具有塞子重新盖上功能的VirTis Advantage台式托盘冻干器(The VirTis Company，Inc.Gardiner，NY)。冻干在不多于100mTorr的压力下执行60小时以上，同时搁板温度从-40℃逐渐升温到25℃。冻干循环显示于表24中。
表24.用于冻干薄膜冷冻质粒的冻干循环。
Figure BDA0004033979400001081
iv.体外气溶胶表现评估
薄膜冷冻干燥的质粒粉末样品的气溶胶表现性质如先前所述的进行确定(Li等人，2015；Sahakijpijarn等人，2020a；Moon等人，2019；Sahakijpijarn等人，2020b)。简言之，采用连接到高容量泵(型号HCP5，Copley Scientific，Nottingham，UK)和临界流量控制器(型号TPK 2000，Copley Scientific，Nottingham，UK)的新一代药物撞击器(NGI)(MSPCorp，Shoreview，MN)，以评价气溶胶表现。为了避免发射的颗粒在NGI收集板上反弹，板用1.5％，w/v，聚山梨醇酯20的甲醇溶液进行预涂布，并且在分析前在空气中干燥。将质粒DNA粉末(2-3mg)装载到#3号胶囊内，并且将胶囊装载到与美国药典(USP)感应端口(CopleyScientific，Nottingham，UK)附接的高阻力
Figure BDA0004033979400001082
RS00吸入器(Plastiape S.p.A，Osnago，意大利)内。每次启动，粉末以60L/分钟的流速分散到NGI共4秒，提供了在装置上4kPa的压力降。然后，通过用水稀释收集来自胶囊、吸入器、适配器、感应端口、阶段1-7和微孔收集器(MOC)的沉积粉末，并且遵循制造商的说明书，使用PicoGreenTM dsDNA测定试剂盒来定量沉积的质粒DNA量。
Copley吸入器测试数据分析软件(Copley Inhaler Testing Data AnalysisSoftware)(CITDAS)版本3.10(Copley Scientific，Nottingham，UK)用于计算质量中值空气动力学直径(MMAD)、几何标准差(GSD)和细颗粒分数(FPF)。回收剂量的FPF计算为作为收集的质粒总量的百分比，收集的空气动力学直径低于5μm的质粒总量。递送剂量的FPF计算为作为在适配器、感应端口、阶段1-7和MOC上沉积的质粒总量的百分比，收集的空气动力学直径低于5μm的质粒总量。
v.扫描电子显微镜检查(SEM)
在Austin的The University of Texas的细胞和分子生物学研究所显微镜成像中心(Institute for Cell and Molecular Biology Microscopy and Imaging Facility)，使用Zeiss Supra 40C扫描电子显微镜(SEM)(Carl Zeiss，Heidenheim an der Brenz，德国)，检查粉末的形态。使用双面粘性碳带，将少量散装粉末(例如，薄膜冷冻干燥粉末的薄片)沉积到样本样品座上。在捕获图像之前，使用溅射器用15mm的60/40Pd/Pt涂布样品。
vi.琼脂糖凝胶电泳
将质粒pCMV-β配制成制剂P7(表23)并且进行薄膜冷冻干燥。然后将干粉重构，然后用EcoR I或Hind III和EcoR I消化2小时，并且应用到琼脂糖凝胶(0.8％)用于电泳。对照包括单独的pCVM-β或没有薄膜冷冻干燥的制剂P7中的pCMV-β，两者均进行消化并应用于电泳。
B.结果
选择比率为7∶3w/w的甘露糖醇和亮氨酸作为用于薄膜冷冻干燥质粒DNA的赋形剂。数据显示了，用甘露糖醇和亮氨酸7∶3w/w，以1％w/v的固体含量制备的安慰剂粉末，具有极佳的气溶胶表现性质，具有0.99±0.25μm的MMAD值，2.39±0.09的GSD，84.7±9.0％的回收FPF，91.1±5.5％的递送FPF，以及92.7±3.9％的发射剂量(ED)。
i.体外气溶胶表现
薄膜冷冻干燥的质粒DNA干粉的气溶胶表现性质显示于图52和表25中。明确的是，用较低固体含量制备的干粉显示了更好的气溶胶表现。例如，用1.0、0.5和0.25％w/v的固体含量制备的质粒制剂(P1、P4和P3)的(回收剂量的)FPF＜5μm分别为32.92±2.52％、34.55±2.34％和55.13±2.36％，并且这些粉末的MMAD值分别为1.58±0.07μm、1.77±0.22μm和1.44±0.16μm(表25)。关于质粒载量(质粒相对于总赋形剂)对气溶胶表现的作用，更低的质粒载量显示了更好的气溶胶表现。例如，用10.0、5.0和2.5％w/w的质粒制备的质粒制剂(分别为P5、P3和P6)的(回收剂量的)FPF＜5μm分别为36.13±2.53％、55.13±2.36％和64.70±3.53％，并且这些粉末的MMAD值分别为1.69±0.30μm、1.44±0.16μm和1.27±0.40μm(表25)。然而，考虑到进入肺深处内的递送剂量的实际量(FPF递送的剂量乘以药物载量)，制剂P3(5％质粒DNA载量，0.25％固体含量)被视为最佳制剂。
还调查了共溶剂和TE缓冲液对气溶胶表现的作用。在溶剂中包括TE缓冲液、1，4-二噁烷或叔丁醇并未帮助改善(回收剂量)的FPF＜5μm(图52，表25)。然而，值得注意的是，P7中的TE缓冲液预期保护质粒DNA免受DNA酶的影响。TE缓冲液中的EDTA是酶所需的二价阳离子例如Mg2+的整合剂(Nurakami等，2013)。看起来在溶剂中包括TE缓冲液略微减少了所得的干粉的气溶胶表现(P3相对于P7，在图52和表25中)。将来，如果在TFFD期间或TFFD之后质粒的稳定性需要改善，则粉末中可以包括单独的TE缓冲液或ETDA。
表25.薄膜冷冻干燥的pCMV-β质粒粉末的气溶胶表现性质。数据是平均值±S.D.(n＝3)(MMAD，质量中值空气动力学直径；GSD，几何标准差：FPF，细颗粒分数)。
Figure BDA0004033979400001111
Figure BDA0004033979400001121
ii.薄膜冷冻干燥的质粒DNA粉末的形态
使用SEM(图53)检查通过TFFD制备的质粒粉末(制剂P3)的形态。干粉制剂P3含有纳米结构聚集物(图53A和53B)，具有高度多孔的基质结构(图53C)，其解释了如图52和表25中所示的良好的气溶胶表现性质。
iii.在经受TFFD后质粒DNA的完整性
制剂7具有5％的质粒DNA载量，含有TE，并且具有整体良好的气溶胶表现性质。选择该制剂以测试质粒DNA在它经受TFFD和重构后的完整性。将质粒pCMV-β配制为制剂7并且进行薄膜冷冻干燥。它然后进行重构，用EcoR I或Hind III和EcoR I消化2小时，并且应用到琼脂糖凝胶用于电泳。对照包括单独的pCVM-β或没有薄膜冷冻干燥的制剂7中的pCMV-β，其进行消化并应用于电泳。如图54中所示，使pCMV-β经受TFFD并不导致质粒完整性中的任何显著变化。
总的来说，得出结论薄膜冷冻干燥可以应用于将纯质粒DNA转化成可气溶胶化的干粉，同时保存其化学完整性。
实施例6-mRNA-LNP的薄膜冷冻和薄膜冷冻干燥
A.TFF-mRNA/LNP干粉的制备
制剂1：向闪烁小瓶中加入3.5mL泊洛沙姆188(1.0mg/mL)，随后加入10.0mL已获得紧急使用授权的mRNA COVID-19疫苗(稀释的，2.567mg LNP/mL)。使混合物轻轻振荡并且逐滴滴落到低温冷却(-180℃)的不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中。将样品转移到玻璃冻干小瓶中，并且贮存于-80℃冰箱中，直到置于冻干器中。通过在或低于100mTorr下在-40℃下保持20小时，在100mTorr下升温至25℃共20小时，并且在100mTorr下在25℃下保持5小时的处理，通过冻干器去除溶剂。将干燥的氮气回填，并且在打开冻干器门之前，通过加塞系统关闭小瓶的盖子。小瓶用铝盖进行密封用于保存。
制剂2：向闪烁小瓶中加入10.5mL蔗糖(20.0mg/mL)和4.2mL泊洛沙姆188(1.0mg/mL)，随后加入3.0mL的mRNA COVID-19疫苗(稀释的，2.567mg LNP/mL)。使混合物轻轻振荡并且逐滴滴落到低温冷却(-180℃)的不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中。将样品转移到玻璃冻干小瓶中，并且贮存于-80℃冰箱中，直到置于冻干器中。通过在或低于100mTorr下在-40℃下保持20小时，在100mTorr下升温至25℃共20小时，并且在100mTorr下在25℃下保持5小时的处理，通过冻干器去除溶剂。将干燥的氮气回填，并且在打开冻干器门之前，通过加塞系统关闭小瓶的盖子。小瓶用铝盖进行密封用于保存。
制剂3：向闪烁小瓶中加入8.0mL海藻糖(20.0mg/mL)和4.6mL泊洛沙姆188(1.0mg/mL)，随后加入2.0mL的mRNA COVID-19疫苗(稀释且透析以去除赋形剂，2.127mg LNP/mL)。使混合物轻轻振荡并且逐滴滴落到低温冷却(-180℃)的不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中。将样品转移到玻璃冻干小瓶中，并且贮存于-80℃冰箱中，直到置于冻干器中。通过在或低于100mTorr下在-40℃下保持20小时，在100mTorr下升温至25℃共20小时，并且在100mTorr下在25℃下保持5小时的处理，通过冻干器去除溶剂。将干燥的氮气回填，并且在打开冻干器门之前，通过加塞系统关闭小瓶的盖子。小瓶用铝盖进行密封用于保存。
制剂4：向闪烁小瓶中加入8.0mL蔗糖(20.0mg/mL)和4.6mL泊洛沙姆188(1.0mg/mL)，随后加入2.0mL的mRNA COVID-19疫苗(稀释且透析以去除赋形剂，2.127mg LNP/mL)。使混合物轻轻振荡并且逐滴滴落到低温冷却(-180℃)的不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中。将样品转移到玻璃冻干小瓶中，并且贮存于-80℃冰箱中，直到置于冻干器中。通过在或低于100mTorr下在-40℃下保持20小时，在100mTorr下升温至25℃共20小时，并且在100mTorr下在25℃下保持5小时的处理，通过冻干器去除溶剂。将干燥的氮气回填，并且在打开冻干器门之前，通过加塞系统关闭小瓶的盖子。小瓶用铝盖进行密封用于保存。
制剂5：向200μL离心管中加入40μL蔗糖(20.0mg/mL)和13μL泊洛沙姆188(1.0mg/mL)，随后加入10μL的mRNA COVID-19疫苗(稀释且透析以去除赋形剂，2.16mg LNP/mL)。使混合物轻轻振荡并且逐滴滴落到低温冷却(-180℃)的不锈钢滚筒上。将冷冻样品收集到充满液氮的不锈钢容器中。将样品转移到玻璃冻干小瓶中，并且贮存于-80℃冰箱中，直到置于冻干器中。通过在或低于100mTorr下在-40℃下保持20小时，在100mTorr下升温至25℃共20小时，并且在100mTorr下在25℃下保持5小时的处理，通过冻干器去除溶剂。将干燥的氮气回填，并且在打开冻干器门之前，通过加塞系统关闭小瓶的盖子。小瓶用铝盖进行密封用于保存。
搁板式冷冻干燥：对于如上文提到的稀释后的mRNA-LNP制剂1、2和原始mRNACOVID疫苗，还用常规搁板式冷冻干燥制备干粉。将悬浮液(0.6mL)中的mRNA-LNP置于2mL冻干小瓶内，并且将小瓶置于Advantage EL搁板式冷冻干燥器中。搁板温度以1℃/分钟的速率从室温冷却到-50℃，并且在干燥前在50℃下维持1小时。干燥循环与用于从薄膜冷冻样品中升华水的循环相同。
B.透析
批准的mRNA COVID疫苗在4℃下针对至少1,000倍体积的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水透析24小时。然后基于透析后的体积变化调整LNP的浓度。
例如，将1.200mL批准的mRNA COVID疫苗置于透析管(Spectrum，Stamford，CT)内，然后在4℃下，将透析管置于外部烧杯中的1,500mL DEPC处理的水中，伴随100rpm的轻轻搅拌速度共24小时。透析溶液(DEPC处理的水)每8小时进行更换。最后，从透析管中回收了1.398mL样品。基于关于TFF的制剂制备的体积变化计算LNP的浓度。
C.TFF-mRNA/LNP干粉的表征
i.粒度分布(PSD)
将少量TFF粉末置于一次性使用的UV比色皿中，并且用过滤水(Evoqua，Warrendale，PA)进行重构。使用分散剂折射率为1.33且材料折射率为1.45的ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical Ltd，Malvern，UK)测量粒度分布。下表1中显示的是mRNA-LNP在它们经受薄膜冷冻干燥(TFFD)之前，在它们经受TFFD和重构之后，以及干粉在冰箱(～4℃)或温度(～25℃)下贮存三周之后的粒度(Z-平均值)。
表26：干粉的粒度分布。数据是平均值±SD(n＝3)。
Figure BDA0004033979400001161
Figure BDA0004033979400001171
*26.67份LNP包括1份mRNA(w/w)
**粉末在重构介质中并未完全分散，具有漂浮在分散介质的表面上的大颗粒。
ii.mRNA封装效率的定量
如先前所述的(Blakney等人，2019；Yang等人，2020)，使用Quanti-iT RiboGreen测定试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，对mRNA/LNP COVID疫苗制剂中的mRNA载量进行定量。将粉末样品重构为与TFF工艺前的液体制剂相同的浓度。所有样品在含有0.5％(v/v)Triton X-100(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的1×TE缓冲液(无RNA酶)中稀释2、20、200和2000倍，用于温育15分钟以检测总mRNA。为了检测游离mRNA，所有样品在1×TE缓冲液(无RNA酶)中稀释2、20、200和2000倍。所有Triton X-100处理和未处理的样品在黑色96孔板(Costar，Corning，NY)中，与RiboGreen试剂一起进行温育。荧光强度通过BioTek SynergyHT多模式微板阅读器(Winooski，VT，Ex＝485nm，Em＝528nm，增益＝35)进行记录。基于对于总mRNA和LNP外的mRNA构建的标准曲线，将荧光强度值分别转换为mRNA浓度。根据下式计算封装效率：
封装效率(EE，％)＝总mRNA-游离mRNA/总mRNA×100％
表2：封装效率
Figure BDA0004033979400001181
iii.透射电子显微镜(TEM)分析
使用FEI Tecnai透射电子显微镜检查来研究LNP制剂的形态。薄膜冷冻干燥的mRNA/LNP粉末在水中进行重构，并且用净化水稀释以获得0.1-0.3mg/mL的LNP浓度。将5μLLNP分散体加入200网目的碳膜、铜网格(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)上。在一分钟后，使用滤纸以从网格的边缘轻轻去除液体。将5μL的1％磷钨酸滴落到网格上，对样品进行负染色。在一分钟后，使用滤纸以从网格的边缘去除污渍。在捕获图像之前将样品风干。参见图55。
***
按照本公开内容，可以无需过度实验而制备且执行本文公开且请求保护的所有组合物和方法。尽管本公开内容的组合物和方法已按照优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序实施变化，而不脱离本公开内容的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，同时将实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改被视为在如通过所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
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就其提供补充本文阐述内容的示例性程序或其它细节的程度，下述参考文献特别地通过引用并入本文。
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序列表
<110> 德克萨斯大学系统董事会
<120> 生物活性干粉组合物及其制造和使用方法
<130> UTFB.P1238WO
<140> Unknown
<141> 2021-04-20
<150> US 63/012,792
<151> 2020-04-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
gucucagccu cuucucauuc cugct 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
agcaggaaug agaagaggcu gagacau 27

Claims (189)

1.一种包含生物活性多核苷酸分子和至少第一赋形剂的干粉，所述干粉已通过超快速冷冻工艺(URF)进行生产，其中所述多核苷酸分子保留了显著的生物活性和/或已通过URF工艺得到稳定。
2.权利要求1的干粉，其中与URF工艺之前溶液中的等量多核苷酸分子相比，所述多核苷酸分子保留至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的生物活性。
3.权利要求1或2的干粉，其中所述多核苷酸分子已这样得到稳定，使得粉末中至少50％以上的分子相对于溶液中的相同多核苷酸分子是未降解的。
4.根据权利要求1-3中任一项的干粉，其中所述URF工艺包含薄膜冷冻(TFF)。
5.根据权利要求1-4中任一项的干粉，其中所述多核苷酸分子是双链分子。
6.根据权利要求1-4中任一项的干粉，其中所述多核苷酸分子是单链分子或双链和单链的混合物。
7.根据权利要求1-6中任一项的干粉，其中所述多核苷酸分子包含siRNA、shRNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、质粒DNA和/或DNA寡核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约100μm、50μm、30μm、20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。
9.根据权利要求1-8中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，约1至50μm或3至50μm的几何粒度分布Dv50。
10.根据权利要求1-9中任一项的干粉，其中所述粉末具有约1.0至g/cm3；2.0 1.4至1.9g/cm3；1.4至1.9g/cm3；或1.5至1.7g/cm3的密度。
11.根据权利要求1-10中任一项的干粉，其中所述粉末具有约2.0至8.5m2/g；2.0至7.5m2/g；3.0至7.5m2/g；2.0至5.0m2/g；2.5至4.5m2/g；或3.0至4.0m2/g的表面积。
12.根据权利要求1-11中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
13.权利要求12的干粉，其中所述糖是二糖。
14.根据权利要求1-12中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
15.根据权利要求1-14中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂构成按重量计至少约50％的粉末。
16.根据权利要求1-15中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂构成按重量计约50％-99.5％；60％-99％；70％-99％；80％-99％；90％-99％或95％-99.5％的粉末。
17.根据权利要求1-15中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
18.根据权利要求1-17中任一项的干粉，其进一步包含pH缓冲剂。
19.权利要求18的干粉，其中所述pH缓冲剂包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙酸钠或Mg2+贮存(SM)缓冲液。
20.根据权利要求1-19中任一项的干粉，其中所述干粉具有小于20％、15％或10％的含水量。
21.根据权利要求1-20中任一项的干粉，其中所述干粉具有约0.5％至10％、1％至10％、1.5％至8％或2％至5％的含水量。
22.根据权利要求1-21中任一项的干粉，其进一步包含至少第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂。
23.权利要求22的干粉，其中所述第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含氨基酸或蛋白质。
24.权利要求23的干粉，其中所述第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含亮氨酸或甘氨酸。
25.权利要求22的干粉，其中所述第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂包含聚合物。
26.权利要求25的干粉，其中所述聚合物包含PEG、HPMC、PLGA、PVA、葡聚糖、海藻酸钠或PVP。
27.权利要求22的干粉，其中所述第二、第三和/或第四包含糖或糖醇。
28.权利要求27的干粉，其中所述粉末包含两种、三种或更多种不同糖或糖醇的混合物。
29.根据权利要求1-28中任一项的干粉，其进一步包含蛋白质或表面活性剂。
30.根据权利要求1-29中任一项的干粉，其进一步包含酪蛋白、乳铁蛋白、普兰尼克F68、泰洛沙泊或碳酸氢铵。
31.根据权利要求22-30中任一项的干粉，其中所述第二赋形剂、第三赋形剂和/或第四赋形剂构成约20％w/w至约99.9％w/w的粉末。
32.根据权利要求1的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含病毒或病毒样颗粒(VLP)。
33.权利要求32的干粉，其中所述病毒是无包膜病毒。
34.权利要求32或33的干粉，其中所述病毒包含腺伴随病毒、腺病毒、腺伴随病毒载体或腺病毒载体。
35.权利要求32的干粉，其中所述病毒包含细菌噬菌体。
36.权利要求35的干粉，其中所述细菌噬菌体感染金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌。
37.权利要求35的干粉，其中所述细菌噬菌体颗粒包含噬菌体PEV2或T7噬菌体。
38.根据权利要求32-37中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。
39.根据权利要求32-37中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。
40.根据权利要求32-39中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，约3至15μm、4至12μm或5至10μm的几何粒度分布Dv50。
41.根据权利要求32-40中任一项的干粉，其中至少约20％的颗粒具有1-5μm的大小。
42.根据权利要求32-41中任一项的干粉，其中至少约25％、30％、35％、40％、45％或50％的颗粒具有1-5μm的大小。
43.根据权利要求32-42中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
44.根据权利要求32-43中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
45.根据权利要求32-44中任一项的干粉，其中所述干粉进一步包含氨基酸。
46.权利要求45的干粉，其中所述氨基酸包含亮氨酸或甘氨酸。
47.根据权利要求1-46中任一项的干粉，其包含蔗糖和亮氨酸。
48.权利要求47的干粉，其包含比率为约50:50至95:5；60:40；70:30至90:10或75:25至80:20(蔗糖：亮氨酸)的蔗糖和亮氨酸。
49.根据权利要求1-31中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含封装在脂质纳米颗粒(LNP)中的多核苷酸分子。
50.根据权利要求1-49中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含mRNA。
51.权利要求50的干粉，其中所述mRNA编码抗原。
52.根据权利要求1-51中任一项的干粉，其进一步包含佐剂。
53.权利要求52的干粉，其中所述佐剂包含明矾。
54.根据权利要求49-53中任一项的干粉，其中所述LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。
55.根据权利要求49-54中任一项的干粉，其中所述LNP包含阳离子脂质；DOPE；DPPC；DSPC；DMPE-PEG；DMG-PEG；DSPE-PEG；Dlin-MC3-DMA；磷脂；PEG-脂质和/或胆固醇。
56.根据权利要求49-55中任一项的干粉，其中所述LNP具有约25nm至1000nm、50nm至1000nm；50nm至600nm、或80nm至200nm的平均粒度。
57.根据权利要求1-50中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
58.根据权利要求1-57中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
59.权利要求57的干粉，其包含约10％至99％或50％至99.5％的乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
60.根据权利要求1-59中任一项的干粉，其包含约80％至99％或约90％至99％的蔗糖。
61.根据权利要求1-60中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含siRNA。
62.根据权利要求49-61中任一项的干粉，其中所述LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。
63.根据权利要求49-62中任一项的干粉，其中所述LNP包含卵磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇(2000)-腙-硬脂酸。
64.根据权利要求49-63中任一项的干粉，其中所述LNP包含阳离子脂质。
65.根据权利要求49-64中任一项的干粉，其中所述LNP具有约50nm至500nm、75nm至250nm、80nm至200nm、90nm至175nm或100nm至150nm的平均粒度。
66.根据权利要求49-65中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。
67.根据权利要求1-66中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。
68.根据权利要求1-67中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，约3至15μm、4至12μm或5至10μm的几何粒度分布Dv50。
69.根据权利要求49-68中任一项的干粉，其中所述粉末具有约2μm至7μm、3μm至7μm、3μm至5μm或3.5μm至4.5μm的质量中值空气动力学直径。
70.根据权利要求1-69中任一项的干粉，其中所述粉末具有约25％至60％、30％至50％或35％至40％的细颗粒分数(FPF)值。
71.根据权利要求1-70中任一项的干粉，其中所述粉末在新一代撞击器(NGI)的阶段4-7中具有至少10％、15％或20％的沉积。
72.根据权利要求1-71中任一项的干粉，其中所述粉末在新一代撞击器(NGI)的阶段4-7中具有约10％至25％；15％至25％；10％至20％或15％至22％的沉积。
73.根据权利要求61-72中任一项的干粉，其中所述siRNA的长度小于30个核苷酸。
74.根据权利要求61-73中任一项的干粉，其中所述siRNA靶向人基因或病原体基因。
75.根据权利要求61-74中任一项的干粉，其中所述siRNA靶向TNF-α。
76.根据权利要求1-75中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的多核苷酸分子。
77.权利要求76的干粉，其中所述壳聚糖是聚乙二醇化的。
78.根据权利要求1-77中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的DNA。
79.权利要求78的干粉，其中所述DNA分子已这样得到稳定，使得粉末中至少50％以上的分子相对于溶液中的相同多核苷酸分子是未降解的。
80.权利要求78的干粉，其中所述DNA包含质粒DNA。
81.根据权利要求1-80中任一项的干粉，其包含与壳聚糖复合的编码CRISPR/Cas9元件的DNA。
82.根据权利要求1-81中任一项的干粉，其包含与壳聚糖复合的编码引导RNA的DNA。
83.根据权利要求76-82中任一项的干粉，其中所述壳聚糖复合物具有约100nm至2000nm的平均大小。
84.根据权利要求76-83中任一项的干粉，其中所述壳聚糖复合物具有约100nm至1000nm；150nm至800nm或200nm至800nm的平均大小。
85.根据权利要求76-84中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
86.根据权利要求1-85中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
87.权利要求85的干粉，其包含约5％至90％的糖或糖醇。
88.根据权利要求76-87中任一项的干粉，其包含约10％至90％；10％至70％或10％至50％的海藻糖、蔗糖和/或甘露糖醇。
89.根据权利要求1-88中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，小于约100μm、50μm、30μm、20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。
90.根据权利要求1-89中任一项的干粉，其中所述粉末具有通过干Rodos法测量的，约1至50μm或3至50μm的几何粒度分布Dv50。
91.根据权利要求1-90中任一项的干粉，其中所述粉末具有约1.0至g/cm3；2.0 1.4至1.9g/cm3；1.4至1.9g/cm3；或1.5至1.7g/cm3的密度。
92.根据权利要求1-91中任一项的干粉，其中所述粉末具有约2.0至8.5m2/g；2.0至7.5m2/g；3.0至7.5m2/g；2.0至5.0m2/g；2.5至4.5m2/g；或3.0至4.0m2/g的表面积。
93.根据权利要求1-92中任一项的干粉，其中所述生物活性多核苷酸分子包含基因组材料。
94.权利要求93的干粉，其中所述基因组材料包含细菌、真核或古细菌基因组材料。
95.根据权利要求1-94中任一项的干粉，其中所述粉末包含完整细胞。
96.根据权利要求1-95中任一项的干粉，其中所述粉末包含活细胞。
97.根据权利要求1-96中任一项的干粉，其中所述粉末包含完整的细菌、真核或古细菌细胞。
98.根据权利要求1-97中任一项的干粉，其中所述粉末包含完整的细菌细胞。
99.根据权利要求1-98中任一项的干粉，其中所述粉末包含活细菌细胞。
100.根据权利要求97-99中任一项的干粉，其中所述细菌细胞包含革兰氏阴性细菌。
101.根据权利要求97-99中任一项的干粉，其中所述细菌细胞包含革兰氏阳性细菌。
102.根据权利要求1-101中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
103.根据权利要求1-102中任一项的干粉，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
104.权利要求100的干粉，其中所述第一赋形剂包含蔗糖。
105.权利要求1-104中任一项的干粉，其中所述粉末被配制用于经由吸入施用。
106.权利要求1-104中任一项的干粉，其中所述粉末被配制用于与吸入器一起使用。
107.一种吸入器，其包含权利要求1-106中任一项的粉末。
108.权利要求107的吸入器，其中所述吸入器是固定剂量组合吸入器、单剂量干粉吸入器、多剂量干粉吸入器、多单位剂量干粉吸入器、定量吸入器或加压定量吸入器。
109.权利要求107的吸入器，其中所述吸入器是基于胶囊的吸入器。
110.权利要求107的吸入器，其中所述吸入器是低阻力吸入器。
111.权利要求107的吸入器，其中所述吸入器是高阻力吸入器。
112.权利要求107的吸入器，其中所述吸入器以约10L/分钟至约150L/分钟的流速使用。
113.权利要求112的吸入器，其中所述流速为约20L/分钟至约100L/分钟。
114.一种生产粉末药物组合物的方法，其包括：
(a)将封装的生物活性多核苷酸分子和第一赋形剂在溶剂中混合，以形成前体溶液；
(b)在适合于促使溶剂冷冻的温度下，将前体溶液沉积到表面上；和
(c)去除溶剂，以获得粉末药物组合物。
115.权利要求114的方法，其进一步包括：
(d)分解所述粉末药物组合物，以减少粒度和/或使粒度均匀。
116.权利要求114或115的方法，其中所述前体溶液包含水。
117.根据权利要求114-116中任一项的方法，其中所述粉末药物组合物具有小于20％、15％或10％的含水量。
118.根据权利要求114-117中任一项的方法，其中所述粉末药物组合物具有约0.5％至10％、1％至10％、1.5％至8％或2％至5％的含水量。
119.根据权利要求114-118中任一项的方法，其中步骤(b)中的温度为约-40℃至-180℃。
120.根据权利要求114-119中任一项的方法，其中步骤(b)中的温度为约-50℃至-150℃、-50℃至-125℃、-55℃至-100℃或-65℃至-75℃。
121.根据权利要求114-120中任一项的方法，其中所述前体溶液包含pH缓冲剂。
122.根据权利要求114-121中任一项的方法，其中所述前体溶液具有约6.0至8.0、6.5至8.0或7.0至7.8的pH。
123.根据权利要求114-122中任一项的方法，其中所述前体溶液包含约0.1％至30％、0.1％至20％、0.5％至10％或0.5％至5％的第一赋形剂。
124.根据权利要求114-123中任一项的方法，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
125.根据权利要求114-124中任一项的方法，其中所述前体溶液包含约0.1％至5％；0.1％至3％或0.5％至5％的海藻糖、蔗糖和/或甘露糖醇。
126.根据权利要求114-125中任一项的方法，其中所述前体溶液具有约0.1％至50％的固体含量。
127.根据权利要求114-126中任一项的方法，其中所述前体溶液具有约0.1％至20％的固体含量。
128.根据权利要求114-127中任一项的方法，其中所述前体溶液具有至少约0.25％的固体含量。
129.根据权利要求114-128中任一项的方法，其中所述前体溶液具有0.25％至10％；0.5％至10％；1％至5％或2％至5％的固体含量。
130.根据权利要求114-129中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含病毒或细菌噬菌体。
131.权利要求130的方法，其中所述病毒是无包膜病毒。
132.权利要求130的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含细菌噬菌体。
133.根据权利要求1-132中任一项的方法，其中所述前体溶液包含约1x106至1x1012；1x106至1x1011；1x107至1x1010；或5x108至1x109噬斑形成单位/ml(PFU/mL)或病灶形成单位/ml(ffu/ml)。
134.根据权利要求1-133中任一项的方法，其中与前体溶液中的滴度相比，所述粉末药物组合物具有损失小于3.5对数滴度(以噬斑形成单位/ml(PFU/mL)或病灶形成单位/ml(ffu/ml)计)的病毒或细菌噬菌体颗粒。
135.根据权利要求114-134中任一项的方法，其中与前体溶液中的滴度相比，所述粉末药物组合物具有损失小于3.0、2.5、2.0、1.5、1.0或0.5对数滴度(以PFU/mL或ffu/ml计)的病毒或细菌噬菌体颗粒。
136.根据权利要求114-135中任一项的方法，其中步骤(b)中的温度为约-40℃至-150℃、-50℃至-125℃、-55℃至-100℃或-65℃至-75℃。
137.根据权利要求114-136中任一项的方法，其中步骤(b)中的温度为约-40℃至-100℃、-40℃至-90℃、-40℃至-80℃或-50℃至-75℃。
138.根据权利要求114-137中任一项的方法，其中所述前体溶液包含亮氨酸。
139.根据权利要求114-138中任一项的方法，其中所述前体溶液包含亮氨酸和蔗糖。
140.根据权利要求114-139中任一项的方法，其中所述前体溶液包含比率为约50:50至95:5；60:40；70:30至90:10；或75:25至80:20(蔗糖：亮氨酸)的蔗糖和亮氨酸。
141.根据权利要求114-140中任一项的方法，其中所述粉末药物组合物具有通过干Rodos法测量的，小于15μm的几何粒度分布Dv50。
142.根据权利要求114-141中任一项的方法，其中所述粉末药物组合物具有通过干Rodos法测量的，小于约20μm、15μm或12μm的几何粒度分布Dv50。
143.根据权利要求114-142中任一项的方法，其中至少20％的颗粒具有1-5μm的大小。
144.根据权利要求114-143中任一项的方法，其中至少25％、30％、35％、40％、45％或50％的颗粒具有1-5μm的大小。
145.根据权利要求114-144中任一项的方法，其中所述前体溶液包含pH缓冲剂。
146.权利要求145的方法，其中所述pH缓冲剂是PBS或SM缓冲剂。
147.权利要求145或146的方法，其中所述pH缓冲剂是SM缓冲剂，并且所述前体溶液包含海藻糖和亮氨酸。
148.根据权利要求114-147中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含封装在脂质纳米颗粒(LNP)中的多核苷酸分子。
149.根据权利要求114-148中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含mRNA。
150.权利要求148的方法，其中所述LNP包含可电离脂质、磷脂、胆固醇、卵磷脂和/或聚(乙二醇)(PEG)脂质。
151.根据权利要求148-150中任一项的方法，其中所述LNP具有约25nm至1000nm、50nm至1000nm；50nm至600nm、或80nm至200nm的平均粒度。
152.根据权利要求114-151中任一项的方法，其中所述前体溶液包含约10％至30％或15％至25％的乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
153.根据权利要求114-148中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含siRNA。
154.权利要求153的方法，其中所述siRNA的长度小于30个核苷酸。
155.根据权利要求114-154中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含与壳聚糖复合的多核苷酸分子。
156.权利要求155的方法，其中所述壳聚糖是聚乙二醇化的。
157.根据权利要求114-156中任一项的方法，其包含与壳聚糖复合的DNA分子。
158.根据权利要求114-157中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含基因组材料。
159.根据权利要求114-158中任一项的方法，其中所述生物活性多核苷酸分子包含在完整细胞中。
160.权利要求159的方法，其中所述完整细胞包含活细胞。
161.权利要求159的方法，其中所述完整细胞包含完整的细菌、真核或古细菌细胞。
162.权利要求159的方法，其中所述完整细胞包含完整的细菌细胞。
163.权利要求159的方法，其中所述完整细胞包含活细菌细胞。
164.根据权利要求114-163中任一项的方法，其中所述第一赋形剂包含糖或糖醇。
165.根据权利要求114-164中任一项的方法，其中所述第一赋形剂包含乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
166.根据权利要求114-165中任一项的方法，其中所述第一赋形剂包含蔗糖。
167.根据权利要求114-166中任一项的方法，其中所述表面是旋转的。
168.根据权利要求114-167中任一项的方法，其中在减压下去除所述溶剂。
169.根据权利要求114-168中任一项的方法，其中经由冻干去除所述溶剂。
170.根据权利要求114-169中任一项的方法，其中所述冻干在约-20℃至约-100℃的冻干温度下进行。
171.权利要求170的方法，其中所述冻干温度为约-40℃。
172.根据权利要求168-171中任一项的方法，其中所述减压是小于400mTor；350mTorr；300mTorr或250mTorr。
173.根据权利要求168-172中任一项的方法，其中所述减压是约100mTorr。
174.权利要求114-173中任一项的方法，其中所述方法是GMP方法。
175.一种药物组合物，其根据权利要求114-174中任一项的方法进行制备。
176.一种治疗肺疾病、肺损伤或肺部感染的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1-113中任一项的组合物或通过权利要求114-174中任一项的方法产生的组合物。
177.权利要求176的方法，其中所述肺疾病是间质性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、囊性纤维化(CF)、肺纤维化或原发性纤毛运动障碍(PCD)。
178.权利要求176的方法，其中所述肺部感染是细菌性肺部感染。
179.根据权利要求176-178中任一项的方法，其中所述组合物包含细菌噬菌体。
180.根据权利要求176-176中任一项的方法，其中所述组合物包含LNP。
181.根据权利要求176-180中任一项的方法，其中所述组合物包含siRNA。
182.根据权利要求176-180中任一项的方法，其中所述组合物包含mRNA。
183.一种刺激受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1-113中任一项的组合物或通过权利要求114-174中任一项的方法产生的组合物，其中所述生物活性多核苷酸分子编码抗原。
184.权利要求183的方法，其中所述组合物包含LNP和mRNA。
185.一种治疗受试者中的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1-113中任一项的组合物或通过权利要求114-174中任一项的方法产生的组合物。
186.权利要求185的方法，其中所述疾病是遗传疾病。
187.权利要求185的方法，其中所述疾病是肺疾病。
188.权利要求185的方法，其中所述疾病是感染。
189.一种治疗受试者中的疾病的方法，其包括：
(i)在药学上可接受的媒介物中，重构权利要求1-113中任一项的组合物或通过权利要求114-174中任一项的方法产生的组合物；和
(ii)将有效量的重构组合物施用于受试者。
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