CN112566627A - 用于递送病毒的高分子纳米粒子组合物及其制造方法 - Google Patents

用于递送病毒的高分子纳米粒子组合物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包括用于治疗或预防疾病的病毒，作为有效成分的含病毒药物组合物及其制造方法。

Description

用于递送病毒的高分子纳米粒子组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种包含用于治疗或预防疾病的病毒作为有效成分的含病毒药物组合物及其制造方法。
背景技术
作为将用于治疗的基因有效地递送至人体细胞中的手段，通常使用载体。载体被区分为病毒载体和非病毒载体。
病毒载体因其在人细胞中表达较好且渗透力和粘附力良好的优点而被生物药品生产商广泛使用，但存在潜在的安全风险。病毒载体中具有代表性的是逆转录病毒和腺病毒，为了有效地将其应用于治疗癌症或各种难治性疾病，人们正在对载体进行变形或主要以腺病毒为基础来开发嵌合病毒。载体的变形可以包括病毒自身蛋白质的变形或将免疫调节物质引入载体中。然而，就病毒载体而言，不仅在静脉内给药时由于肝脏蓄积而引起肝毒性，而且从血液中被迅速去除而导致肿瘤递送率低，因而主要仅利用于局部给药。
相反，非病毒载体虽然在效率方面不如病毒性载体，但其具有在体内安全性的方面副作用较少，在经济性方面生产价格低廉的优点。非病毒载体中最具代表性的是利用阳离子脂质的阳离子脂质和核酸的复合体(lipoplex)以及聚阳离子高分子和核酸的复合体(polyplex)。人们在这种阳离子脂质或聚阳离子高分子通过与核酸的静电相互作用形成复合体而使核酸稳定并增加细胞内递送的方面进行了多样的研究。然而，结果表明，当为了得到充分的效果而使用必要的量时，虽然与病毒载体相比较轻，但还是引起严重的毒性，因而不适合用作医药品。
目前，已开发有结合病毒和非病毒成分的优点的混合载体。为了克服腺病毒对CAR依赖性和免疫原性的限制而提出的一策略是利用无需CAR介导的内吞作用即可通过腺病毒的表面的聚合物进行改性。利用阳离子聚合物或脂质的腺病毒的改性强化病毒介导的基因递送。但是，就这些策略而言，由于所注入的聚合物/脂质改性的病毒会快速传播到周边非目标组织内，因而不会导出针对性的肿瘤特异性病毒介导的基因递送。此外，在病毒药物的情况下，具有在利用阳离子非病毒载体引入体内时向肿瘤的递送效率显著下降的特征。其原因是，由于与阳离子高分子的非特异性结合，病毒无法达到期望的组织。因此，需要开发一种用于强化病毒的递送能力和稳定性的制剂及其制造方法。
另一方面，为了提供可溶解大量的难溶性药物且水溶液中的稳定性优秀的混合高分子纳米粒子组合物，韩国专利公开第2003-0032897号公开了：混合高分子纳米粒子组合物，其包含由亲水性嵌段和疏水性嵌段构成的两亲性嵌段共聚物以及含有羧酸端基的聚乳酸衍生物且能够在体液或水溶液中形成高分子纳米粒子；以及在由所述混合高分子纳米粒子组合物而成的高分子纳米粒子内部包含难溶性药物的药物组合物。
发明内容
技术问题
为提高例如作为溶瘤病毒的腺病毒的递送效率，经不懈努力，本发明者们确认到当通过将野生型腺病毒与溶解于有机溶剂的两亲性嵌段共聚物以及聚乳酸盐混合并在单相系统(monophase system)下乳化以形成复合体来将腺病毒封入高分子纳米粒子内时，可以增加腺病毒的稳定性、安全性及在目标生物组织内的表达效率，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种能够有效地将病毒递送至到体内的药物组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种能够有效地将病毒递送至体内的药物组合物的制造方法。
解决课题方法
根据本发明的一实施方式的组合物是一种包含纳米粒子结构体的用于递送病毒的组合物，其特征在于，包含：作为有效成分的病毒、两亲性嵌段共聚物、以及聚乳酸盐，所述病毒被封入在由所述两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的纳米粒子结构体的内部。
此外，根据本发明的一实施方式的组合物的制造方法可以包括以下步骤：
将病毒溶解于水性溶剂中的步骤(a)；
将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐分别溶解于有机溶剂中的步骤(b)；以及
将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合而形成乳液的步骤(c)。
发明的效果
本发明的组合物在使用聚乳酸盐和两亲性嵌段共聚物将病毒注入体内时使其与外部隔离，由此可以提高病毒在血液中或体液内的稳定性。此外，本发明的组合物能够有效地将病毒递送至目标生物组织内。此外，所述两亲性嵌段共聚物具有优秀的生物降解性和生物相容性。
附图说明
图1是示出通过根据本发明的一实施方式的制造方法制造的高分子纳米粒子递送体的大致的结构的图。
图2是利用发光测量成像系统测量荧光素酶基因的表达，以确认根据本发明的一实施方式的高分子纳米粒子递送体在肝组织内的基因吸收比率的照片。
图3是利用发光测量成像系统以体外(Ex vivo)形态测量通过荧光素酶基因的表达产生的发光，以确认根据本发明的一实施方式的高分子纳米粒子递送体在目标生物组织内的表达效率的照片。
图4是比较根据本发明的一实施方式的高分子纳米粒子递送体在肝组织内的毒性程度的图表。
图5是比较根据本发明的一实施方式的高分子纳米粒子递送体的抗癌功效的图表。
具体实施方式
下面对本发明进行更详细的说明。
病毒
在本发明的用于递送病毒的组合物中使用的所述病毒是用于治疗或预防疾病的病毒，是最终制造的组合物的有效成分。
在一具体例中，所述用于治疗疾病的病毒可以是溶瘤病毒(oncolytic virus)。溶瘤病毒的例子是选自由腺病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒(HSV)及水疱性口炎病毒(VSV)组成的组中的一种以上。在一具体例中，溶瘤病毒是腺病毒。在本发明的具体例中使用的腺病毒包含荧光素酶，这可以通过成像来确认。
所述用于治疗的病毒可以在个体的体内表达多种治疗基因，不限于特定分子量、蛋白质、生物活性或治疗领域。所述用于预防的病毒可以针对靶标疾病在个体的体内诱发免疫。本发明的一示例的包含用于预防疾病的病毒的组合物减少病毒自身引起的免疫诱发，能够指定或扩增靶细胞，并且再给药时减少对病毒的超免疫反应，从而具有可以通过多次接种来获得有效的效果的优点。
在本发明的一示例中，优选病毒以最终制造的组合物的总重量为基准包含0.001至10重量％，具体地0.01至5重量％。若所述病毒的含量小于0.001重量％，则由于相对于药物使用的递送体的量过多，因而可能会有递送体所导致的副作用；若超过10重量％，则由于纳米粒子的大小变得太大，因而可能会存在纳米粒子的稳定性降低且过滤器灭菌时的损失率增大的忧虑。
两亲性嵌段共聚物
在本发明的用于递送病毒的组合物中使用的所述两亲性嵌段共聚物可以是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型嵌段共聚物。所述A-B型嵌段共聚物是在水相中由疏水性B嵌段形成核(内壁)，并由亲水性A嵌段形成壳(外壁)的核-壳型，其可以调节高分子递送体的体内的分布或提高所述递送体向细胞内递送的效率。
所述亲水性A嵌段可以是选自由聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺及其衍生物组成的组中的一种以上。更具体地，亲水性A嵌段可以是选自由单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯与丙二醇的共聚物、以及聚乙烯吡咯烷酮组成的组中的一种以上。在一实施例中，所述亲水性A嵌段的数均分子量可以为200至50,000道尔顿，更具体地为1,000至20,000道尔顿，还更具体地为1,000至5,000道尔顿。
此外，根据需要，可以将能够到达特定组织或细胞的官能团、配体或能够细胞内递送的官能团化学结合于亲水性A嵌段的末端，以调节由两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的高分子纳米粒子递送体的体内分布或提高向细胞内递送所述纳米粒子递送体的效率。所述官能团或配体可以是选自由单糖类、多糖类、维生素、肽、蛋白质以及针对细胞表面受体的抗体组成的组中的一种以上。更具体地，所述官能团或配体可以是选自由茴香酰胺(anisamide)、维生素B9(叶酸)、维生素B12、维生素A、半乳糖、乳糖、甘露糖、透明质酸、RGD肽、NGR肽、转铁蛋白、针对转铁蛋白受体的抗体组成的组中的一种以上。
所述疏水性B嵌段是生物相容性的生物降解性高分子，在一实施例中，其可以是选自由聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯以及聚膦嗪(polyphosphazine)组成的组中的一种以上。更具体地，所述疏水性B嵌段可以是选自由聚丙交酯(polylactide)、聚乙交酯、聚己内酯、聚二
Figure BDA0002938441310000051
烷-2-酮、聚丙交酯与乙交酯的共聚物、聚丙交酯与聚二
Figure BDA0002938441310000052
烷-2-酮的共聚物、聚丙交酯与聚己内酯的共聚物以及聚乙交酯与聚己内酯的共聚物组成的组中的一种以上。在另一实施例中，所述疏水性B嵌段的数均分子量可以为50至50,000道尔顿，更具体地为200至20,000道尔顿，还更具体地为1,000至5,000道尔顿。此外，在一实施例中，为了通过增加疏水性B嵌段的疏水性来提高纳米粒子的稳定性，所述疏水性B嵌段的末端羟基可以被选自由生育酚、胆固醇以及碳原子数10至24个的脂肪酸组成的组中的一种以上修饰。
优选所述包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物的含量以组合物的总干重为基准为1至99.98重量％，具体地为10至99.8重量％，更具体地为20至80重量％。若所述两亲性嵌段共聚物的含量小于1重量％，则由于纳米粒子的大小变得太大，因而存在纳米粒子的稳定性降低，并且过滤器灭菌时的损失率增大的忧虑；若含量超过99.98重量％，则陷入的病毒的含量会变得太少。
进一步地，在所述两亲性嵌段共聚物中，就亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的组成比而言，以共聚物重量为基准，亲水性嵌段(A)可以在30至80重量％，具体地在40至70重量％的范围内。若亲水性嵌段(A)的比率小于30重量％，则由于对于高分子的水的溶解度低而难以形成纳米粒子，因而为了使共聚物具有足以形成纳米粒子的相对于水的溶解度，优选亲水性嵌段(A)的比率为30重量％以上；另一方面，若超过80重量％，则由于亲水性过高而高分子纳米粒子的稳定性降低，从而难以用作复合体的增溶组合物，考虑纳米粒子的稳定性，优选亲水性嵌段(A)的比率为80重量％以下。
聚乳酸盐
用于本发明的递送病毒的组合物中使用的所述聚乳酸盐(例如，PLANa)分布于纳米粒子的核(内壁)以强化核的疏水性来稳定纳米粒子的同时，起到在体内有效避免网状内皮系统(RES)的作用。即，聚乳酸盐的羧酸阴离子比聚乳酸更有效地与病毒结合而减少高分子纳米粒子的表面电势，从而与不包括聚乳酸盐的高分子纳米粒子相比减少表面电势的正电荷，因而较少地被网状内皮系统捕获，因此，具有向目标部位(例如，癌细胞，炎症细胞等)的递送效率优秀的优点。
以与所述两亲性嵌段共聚物独立的成分作为纳米粒子内壁成分所包含的聚乳酸盐的数均分子量优选为500至50,000道尔顿，具体地为1,000至10,000道尔顿。若分子量小于500道尔顿，则疏水性太低而难以存在于纳米粒子的核(内壁)；若分子量超过50,000道尔顿，则存在高分子纳米粒子的粒子会变大的问题。
相对于两亲性嵌段共聚物100重量份，所述聚乳酸盐可以使用1至500重量份，具体地20至400重量份，更具体地40至300重量份。若聚乳酸盐的含量相对于两亲性嵌段共聚物100重量份超过500重量份，则纳米粒子的大小增大而难以进行使用灭菌膜的过滤；若小于1重量份，则无法充分地获得期望的效果。
在一具体例中，相对于病毒1重量份，可以含有1至2,000重量份的两亲性嵌段共聚物，并且含有1至1,000重量份的聚乳酸盐。优选地，两亲性嵌段共聚物的含量可以为5至1,000重量份，更优选为10至500重量份。优选地，聚乳酸盐的含量可以为5至500重量份，更优选为10至250重量份。
在一具体例中，所述聚乳酸盐的末端中羧酸-金属(例如，钠)的相对侧的末端可以被选自由羟基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、癸酰氧基、棕榈酰氧基及碳原子数1至2个的烷氧基组成的组中的一者取代。
作为优选的一实施方式，本发明的聚乳酸盐可以是选自由以下化学式1至6的化合物组成的组中的一个以上。
[化学式1]
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
在上述式1中，A为-COO-CHZ-；B为-COO-CHY-，-COOCH2CH2CH2CH2CH2-或-COO-CH2CH2OCH2-；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；Z和Y各自为氢原子、甲基或苯基；M为Na、K或Li；n为1至30的整数；m为0至20的整数。
[化学式2]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
在上述式2中，X为甲基；Y'为氢原子或苯基；p为0至25的整数，q为0至25的整数，其中，p+q为5至25的整数；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M为Na、K或Li；Z为氢原子、甲基或苯基。
[化学式3]
RO-PAD-COO-W-M'
在上述式3中，W-M'为
Figure BDA0002938441310000071
；PAD选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物以及D,L-乳酸与1,4-二
Figure BDA0002938441310000073
烷-2-酮的共聚物组成的组；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M独立地为Na、K或Li。
[化学式4]
S-O-PAD-COO-Q
在上述式4中，S为
Figure BDA0002938441310000072
；L为-NR1-或-O-，其中，R1为氢原子或C1-10烷基；Q为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3或-CH2C6H5；a为0至4的整数；b为1至10的整数；M为Na、K或Li；PAD是选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物以及D,L-乳酸与1,4-二
Figure BDA0002938441310000074
烷-2-酮的共聚物组成的组中的一种以上。
[化学式5]
Figure BDA0002938441310000081
在上述式5中，R'为-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，其中，PAD选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物、D,L-乳酸与1,4-二
Figure BDA0002938441310000082
烷-2-酮的共聚物组成的组，M为Na、K或Li；a为1至4的整数。
[化学式6]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
在上述式6中，X和X'独立地为氢，碳原子数1～10的烷基或碳原子数6～20的芳基；Y和Z独立地为Na、K或Li；m和n独立地为0至95的整数，且5<m+n<100；a和b独立地为1至6的整数；R为-(CH2)k-、碳原子数2～10的二价烯基(divalent alkenyl)、碳原子数6～20的二价芳基(divalent aryl)或它们的组合，其中，k为0至10的整数。
优选所述聚乳酸盐为化学式1或化学式2的化合物。
阳离子化合物
在一具体例中，本发明的用于递送病毒的组合物还可以包含阳离子化合物。
即，在本发明中，所述两亲性嵌段共聚物和所述聚乳酸盐形成在内部封入有病毒的纳米粒子结构体，根据一具体例，该纳米粒子结构体还可以包含阳离子化合物。
所述阳离子化合物在纳米粒子结构体内与带负电荷的病毒的外皮通过静电结合来结合，从而可以有助于使病毒在纳米粒子结构体内稳定化。所述病毒可以同时与两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐的疏水性部分结合。
所述阳离子化合物可以包括能够与病毒通过静电相互作用形成复合体的所有形态的化合物，例如，可以是阳离子脂质和高分子种类。
所述阳离子脂质例如可以是选自由N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N,N-二甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、N,N,N-三甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DOTMA)、1,2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(TAP)、1,2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷(DAP)、3β-[N-(N',N',N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(TC-胆固醇)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、3β-[N-(N'-单甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(MC-胆固醇)、3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(AC-胆固醇)、胆固醇基氧基丙烷-1-胺(COPA)、N-(N'-氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(AC-生育酚)及N-(N'-甲基氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(MC-生育酚)组成的组中的一种或两种以上的组合，但不限于此。当使用这样的阳离子脂质时，优选使用少量的分子内的阳离子密度高的聚阳离子脂质，以减少由阳离子脂质引起的毒性，更具体地，每分子中能够在水溶液相中显示阳离子的官能团的数量可以为一个。
在更优选的一实施方式中，所述阳离子脂质可以是选自由3β-[N-(N'，N'，N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(TC-胆固醇)、3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、3β[N-(N'-单甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(MC-胆固醇)、3β[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(AC-胆固醇)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N,N-二甲基-(2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)及N,N,N-三甲基-(2,3-二油氧基丙基)丙胺(DOTMA)组成的组中的一种以上。
此外，所述阳离子脂质可以是每分子中具有多个能够在水溶液上显示阳离子的官能团的脂质种类。具体地，可以是选自由N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(TAP)、1,2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷(DAP)组成的组中的一个以上。
此外，所述阳离子脂质可以由下面的化学式A表示。
[化学式A]
Figure BDA0002938441310000091
在上式中，
n、m和l分别为0至12，且l≤n+m+l≤12，a、b和c各自为1至6，且R1、R2和R3各自独立地为氢或碳原子数11至25个的饱和及不饱和烃，R1、R2和R3中的至少一个为碳原子数11至25个的饱和及不饱和烃。
优选地，n、m和l可以独立地为0至7，且l≤n+m+l≤7。
优选地，a、b和c可以为2至4。
优选地，R1、R2和R3可以各自独立地选自由月桂基(lauryl)、肉豆蔻基(myristyl)、棕榈基(palmityl)、硬脂基(stearyl)、二十烷基(arachidyl)、山嵛基(behenyl)、二十四烷基(lignoceryl)、二十六烷基(cerotyl)、十四碳烯基(myristoleyl)、棕榈油酰基(palmitoleyl)、十六碳烯酰基(sapienyl)、油基(oleyl)、亚油基(linoleyl)、花生四烯基(arachidonyl)、二十碳五烯基(eicosapentaenyl)、瓢儿菜基(erucyl)、二十二碳六烯基(docosahexaenyl)及二十六烷基(cerotyl)组成的组。
所述阳离子脂质的具体例可以是选自由1,6-二油基三亚乙基四酰胺(N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氮亚烷基))双(乙烷-2,1-二基))二油酰胺)、1，8-二亚油酰基四亚乙基五酰胺((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((氮亚烷基双(乙烷-2,1-二基))双(氮亚烷基))双(乙烷-2,1-二基))双(十八碳-9,12-二烯酰胺))、1,4-二肉豆蔻油酰基二亚乙基三酰胺((9Z,9'Z)-N,N'-(氮亚烷基双(乙烷-2,1-二基))双(十四碳-9-烯酰胺))、1,10-二硬脂酰基五亚乙基己酰胺(N,N'-(3,6,9,12-四氮杂十四烷-1,14-二基)二硬脂酰胺)及1,10-二油酰基五亚乙基己酰胺(N,N'-(3,6,9,12-四氮杂十四烷-1,14-二基)二油酰胺)组成的组中的一个以上。
另一方面，阳离子高分子的特征在于，选自由壳聚糖(chitosan)、乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)、鱼精蛋白(protamine)、聚赖氨酸(polylysine)、聚精氨酸(polyarginine)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine)、右旋糖酐(dextran)、透明质酸(hyaluronic acid)、白蛋白(albumin)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚胺和聚乙烯胺(PVAm)组成的组，优选地，可以是选组由聚乙烯亚胺(PEI)、聚胺和聚乙烯胺(PVA)组成的组中的一种以上。
以最终制造的组合物的总重量为基准，在本发明中使用的阳离子化合物的用量可以为0.01至50重量％，具体地为0.1至20重量％。若所述阳离子化合物的含量小于0.01重量％，则是不足以封入病毒的量；若超过50重量％，则纳米粒子的大小变得太大，从而存在纳米粒子的稳定性降低且过滤器灭菌时的损失率加大的忧虑。
作为一具体的实施方式，以病毒1X1010VP为基准，优选所述阳离子化合物的使用量为0.1至40μg，具体地为0.5至35μg，更具体地为1至30μg，更进一步具体地为1至25μg，最具体地为6至24μg。当所述阳离子化合物的量小于0.1μg时，阳离子化合物无法充分封入病毒，因而所述量为0.1μg以上才使得阳离子化合物和病毒通过静电结合来形成包含充分的量的病毒的复合体而有利。相反，当该量超过40μg时，存在引起毒性的忧虑，因而优选为40μg以下。
二价或三价金属离子
在一具体例中，本发明的用于递送病毒的组合物还可以包含二价或三价金属离子。
优选地，所述二价或三价金属离子可以选自钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、钡(Ba2+)、铬(Cr3 +)、铁(Fe3+)、锰(Mn2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、锌(Zn2+)或铝(Al3+)等。
所述金属离子可以以硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、磷酸盐及氢氧化物的形态被添加至高分子纳米粒子组合物，优选地，可以添加氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化锌(ZnCl2)、氯化铝(AlCl3)、氯化铁(FeCl3)、碳酸钙(CaCO3)、碳酸镁(MgCO3)、磷酸钙(Ca3(PO4)2)、磷酸镁(Mg3(PO4)2)、磷酸铝(AlPO4)、硫酸镁(MgSO4)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化镁(Mg(OH)2)、氢氧化铝(Al(OH)3)、氢氧化锌(Zn(OH)2)或它们的混合物。
通过调节所述二价或三价金属离子的当量，可以调节封入在高分子纳米粒子内部的药物的释放速度。具体地，若相对于聚乳酸盐的羧基的当量在高分子纳米粒子组合物中包含1当量以下的二价或三价金属离子，则与聚乳酸盐的羧基端基结合的数量少，因而药物的释放速度会增加；若包含1当量以上的二价或三价金属离子，则与聚乳酸盐的羧基端基结合的数量多，因而会延迟药物的释放速度。因此，为了增加血液内的药物的释放速度，可以使用较少当量的金属离子，而为了延迟药物的释放速度，可以使用较多当量的金属离子。
此外，相对于所述聚乳酸盐的羧基端基的当量，可以包含0.01～10当量、0.1～5当量、0.2～2当量的二价或三价金属离子。
用于递送病毒的组合物的制造方法
根据本发明的另一方面，提供一种用于递送病毒的组合物的制造方法，包括：将病毒溶解于水性溶剂中的步骤(a)；将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐分别溶解于有机溶剂中的步骤(b)；以及将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合以形成乳液的步骤(c)。
上述步骤(a)～(c)是为了制造病毒、两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐的复合体而将病毒溶解于水性溶剂中，并且将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐分别溶解于有机溶剂，将它们混合而在单相系统(monophase system)中制造乳液的步骤。
在上述步骤(a)中，所使用的水性溶剂可以是蒸馏水、注射用水或缓冲液，优选的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)。
在上述步骤(b)中，所使用的有机溶剂是与水混溶的有机溶剂，例如可以是C1至C5的低级醇(包括甲醇、乙醇、丙醇等，但不限于此)、丙酮、乙酸乙酯或其混合物。
所述步骤(b)中，将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐溶解于有机溶剂中，此时所使用的有机溶剂可以是选自由丙酮、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、二
Figure BDA0002938441310000121
烷、二甲基亚砜、乙腈、乙酸乙酯及乙酸组成的组中的一种以上。优选地，可以是选自由乙醇、乙酸乙酯及乙酸组成的组中的一种以上。对所述有机溶剂的使用量没有特殊限制，为了两亲性嵌段共聚物及聚乳酸盐的溶解，可以适当地调节并使用。
在本发明的一示例中，所述步骤(b)还可以包括将阳离子化合物溶解于所述有机溶剂的步骤。
在步骤(c)中，将在步骤(a)中获得的病毒水溶液和在步骤(b)中获得的两亲性嵌段共聚物有机溶液及聚乳酸盐有机溶液、以及任选的阳离子化合物有机溶液混合来形成乳液。对所述病毒所溶解的水溶液和两亲性嵌段共聚物及聚乳酸盐、以及任选的阳离子化合物所分别溶解的有机溶液间的混合比率没有特殊限制，例如，以体积为基准，相对于病毒水溶液，两亲性嵌段共聚物及聚乳酸盐、以及任选的阳离子化合物有机溶液的比率(两亲性嵌段共聚物及聚乳酸盐、以及任选的阳离子化合物有机溶液/病毒水溶液)可以为1至30，更具体地为2至10，但不限于此。所述溶液通过本领域中已知的适当的混合手段来混合，作为这种方法的示例，可以列举超声波粉碎机等。
作为又一追加性的实施方式，本发明的用于递送病毒的组合物的制造方法还可以包括从在步骤(c)中获得的混合物中去除有机溶剂的步骤(d)。
优选地，在上述步骤(d)中，通过多样的去除方法，例如有机溶剂的蒸发等，从在步骤(c)中制造的包含稳定化的纳米粒子的混合物中去除有机溶剂，以获得高分子纳米粒子水溶液。此外，可以利用渗透膜透析来稀释和去除有机溶剂。
作为一优选的实施方式，本发明的制造方法还可以包括：在上述步骤(d)之后添加二价或三价金属离子的步骤(e)。
进一步地，作为一优选的实施方式，本发明的制造方法还可以包括：在上述步骤(e)之后添加冻干助剂来进行冻干的步骤(f)。
作为又一追加性的实施方式，本发明的制造方法可以在上述步骤(f)的冻干之前进一步包括：利用灭菌过滤器对在步骤(e)中获得的高分子纳米粒子水溶液进行灭菌的步骤。
在本发明中使用的冻干助剂是为了使冻干的组合物维持蛋糕形态，或者，在将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐等组合物冻干后进行重构(reconstitution)的过程中帮助短时间内均匀溶解而添加的，具体地，冻干助剂可以是选自由乳糖、甘露醇、山梨醇及蔗糖组成的组中的一种以上。以冻干组合物的总干重为基准，所述冻干助剂的含量为1至90重量％，更具体地为4至20重量％。
通过根据本发明的一实施方式的制造方法，将病毒、两亲性嵌段共聚物及聚乳酸盐在单相系统的水相中乳液。单相系统是指在制造工艺中通过使用一种溶剂或可混合的溶剂从而不包括相分离的系统，若利用单相系统，则通过疏水性结合有效地形成纳米粒子形态的复合体，并且在通过冻干来除去水溶液的过程中使结合力增加，从而显著提高最终制造的高分子纳米粒子的收率。进一步地，由于这种方法使用相对较少的有机溶剂，因而具有不但利于环保，而且维持重现性且制造起来非常便利，并且通过形成病毒复合体来转变为疏水性药物粒子而有利于大量生产的特征。此外，由于相对较少地使用有机溶剂，因而还可以期待在体内应用时减少由有机溶剂引起的毒性的效果。
此外，在根据本发明的一实施方式制造的组合物中，由于病毒维持被封入由所述两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的纳米粒子结构体内的状态，因而提高在血液或体液内的安全性和稳定性。
另一方面，作为又一实施方式，本发明涉及一种包含能够通过所述制造方法制造的高分子纳米粒子的用于递送病毒的组合物。根据本发明的一实施方式的制造方法，所述病毒和聚乳酸盐通过疏水性相互作用相互结合来形成复合体，并制造该复合体被封入由两亲性嵌段共聚物形成的纳米粒子结构内部的高分子纳米粒子结构体。图1示出如此通过根据本发明的一实施方式的制造方法制造的高分子纳米粒子递送体的大致的结构。关于作为所述组合物的构成成分的病毒、两亲性嵌段共聚物等的事项，与上述相同。
本发明的一实施方式中，为了使所述高分子纳米粒子在水溶液相中具有进一步提高了的稳定性，还可以包含二价或三价金属离子。二价或三价金属离子在高分子纳米粒子内与聚乳酸盐的羧基端基结合。所述二价或三价金属离子与高分子纳米粒子内的聚乳酸羧基端基的一价金属阳离子发生置换反应来形成金属离子结合。所形成的所述金属离子结合因更强的结合力而形成更稳定的高分子纳米粒子。
在一优选的实施方式中，优选所述组合物中纳米粒子的粒子的大小为10至300nm，更具体地为10至150nm。此外，优选所述纳米粒子粒子的标准电荷为-40至10mV，更具体地为-30至0mV。从纳米粒子结构的稳定性及构成成分的含量和病毒在体内的吸收度和稳定性方面考虑，所述粒子的大小及标准电荷是最优选的。
本发明的含有封入两亲性嵌段共聚物纳米粒子结构体的病毒-聚乳酸盐组合物可以通过血管、肌肉、皮下、经口、骨头、经皮或局部组织等给药路径给药，并且可以制成多样的经口或非经口给药制剂以适合于这种给药路径。作为所述经口给药制剂，可以例示片剂、胶囊剂、粉体制剂、液体制剂等；作为非经口给药制剂，可以例示滴眼剂、注射剂等多样的制剂，作为优选的一实施方式，所述组合物可以是注射用制剂，更优选地为静脉注射用制剂。例如，当冻干本发明的组合物时，可以将其用注射用蒸馏水、0.9％生理盐水和5％右旋糖水溶液等重构来制成注射用制剂。
本发明的一实施方式提供一种预防或治疗个体的疾病的方法，所述方法包括：将病毒封入由两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的纳米粒子结构体内部并将其给药于需要其的个体的步骤。
下面依据以下实施例对本发明进行更详细的说明，但这些仅用于说明本发明，本发明的范围不以任何方式限于这些实施例。
实施例
[比较例1]腺病毒载体
通过将表达SEQ ID NO：1的荧光素酶基因的野生型腺病毒1X1010VP溶解于PBS 10μl来制造(下称“裸露Ad(Naked Ad)”)。在比较例1中获得的组合物如下表1所示。
[表1]
组合物 Ad mPEG-PLA PLA-Na
比较例1 裸露Ad 1X10<sup>10</sup>VP - -
[比较例2]含有腺病毒质粒DNA(AdpDNA)/1,6-二油酰三亚乙基四酰胺(dio-TETA)/mPEG-PLA生育酚(2k-1.7k)/二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的组合物的制造
依次混合将具有表达序列号1的荧光素酶基因的35,000个碱基对的质粒DNA 1μg溶解于蒸馏水4.35μl而成的溶液、将dioTETA 10.4μg溶解于乙醇10.4μl而成的溶液、将DOPE 10.4μg溶解于乙醇10.4μl而成的溶液、将mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)20μg溶解于乙醇0.2μl而成的溶液、将PLA-Na 20μg溶解于乙醇2μl而成的溶液后，在超声粉碎状态(浴式)下再混合10分钟。将制造的复合乳状液放入单口圆底烧瓶并在蒸馏浓缩装置(rotaryevaporator，旋转蒸发仪)中减压蒸馏以选择性除去乙醇，由此制造含有Ad pDNA/dioTETA/DOPE/mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k的组合物(下称“Ad DNA/SENS”)。利用0.45μm亲水性过滤器(hydrophilic filter)过滤所制造的组合物后，在4℃下保管，在进行随后的实验时混合10X PBS，使其在最终体积中达到1X。在比较例2中获得的组合物如下表2所示。
[表2]
组合物 Ad DNA dio-TETA DOPE mPEG-PLA-tocopherol PLA-Na
比较例2 Ad pDNA/SENS 1μg 10.4μg 10.4μg 20μg 20μg
[实施例1]含有腺病毒/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na(1.7k)的组合物的制造
将表达序列号1的荧光素酶基因的野生型腺病毒1X1010VP溶解于PBS 10μl，并依次混合将mPEG-PLA(2k-1.7k)40μg溶解于乙醇0.4μl而成的溶液、将PLA-Na_1.7k 100μg溶解于乙醇10μl而成的溶液后，在超声粉碎状态(浴式)下再混合10分钟。将制造的复合乳状液放入单口圆底烧瓶并在蒸馏浓缩装置(rotary evaporator，旋转蒸发仪)中减压蒸馏以选择性除去乙醇，从而制造含有Ad/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k的组合物(下称“Ad-vSENS”)。利用0.45μm亲水性过滤器过滤所制造的组合物后，在4℃下保管，在进行随后的实验时混合10X PBS，使其在最终体积中达到1X。在实施例1中获得的组合物如下表3所示。
[表3]
组合物 Ad mPEG-PLA PLA-Na
实施例1 Ad-vSENS 1X10<sup>10</sup>VP 40μg 100μg
[实施例2]含有腺病毒/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na(1.7k)/CaCl2的组合物的制造
将表达序列号1的荧光素酶基因的野生型腺病毒1X1010VP溶解于PBS 10μl，并依次混合将mPEG-PLA(2k-1.7k)40μg溶解于乙醇0.4μl而成的溶液、将PLA-Na_1.7k 100μg溶解于乙醇10μl而成的溶液后，在超声粉碎状态(浴式)再混合10分钟。将制造的复合乳状液放入单口圆底烧瓶并在蒸馏浓缩装置(rotary evaporator，旋转蒸发仪)中减压蒸馏以选择性除去乙醇，从而制造含有Ad/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k的组合物。之后，添加将CaCl2 3.3μg溶解于PBS 1.7μl而成的溶液(下称“Ad-vSENS+CaCl2”)。利用0.45μm亲水性过滤器过滤所制造的组合物后，在4℃下保管，在进行随后的实验时混合10X PBS，使其在最终体积中达到1X。在实施例2中获得的组合物如下表4所示。
[表4]
组合物 Ad mPEG-PLA PLA-Na CaCl<sub>2</sub>
实施例2 Ad-vSENS+CaCl<sub>2</sub> 1X10<sup>10</sup>VP 40μg 100μg 3.3μg
[实施例3]含有腺病毒/1,6-二油酰三亚乙基四酰胺(dio-TETA)/PLA-Na(1.7k)/mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)的组合物的制造
将表达序列号1的荧光素酶基因的野生型腺病毒1X1010VP溶解于PBS 100μl，并依次混合将dio-TETA 20μg溶解于2μl而成的溶液、将PLA-Na_1.7k100μg溶解于乙醇2μl而成的溶液、将mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)100μg溶解于乙醇2μl而成的溶液后，最终与先包含病毒的100μlPBS混合来制造含有Ad/dio-TETA/PLA-Na_1.7k/mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)的组合物(下称“Ad-vSENS_2'”)。在实施例3中获得的组合物如下表5所示。
[表5]
组合物 Ad dio-TETA PLA-Na(1.7k) mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)
实施例3 Ad-vSENS_2 1X10<sup>10</sup>VP 20μg 100μg 50μg
[实验例1]基于配方的组合物的大小和表面电荷的比较
为了确认是否形成基于配方的纳米粒子形成，确认大小和表面电荷。利用动态光散射(DLS；dynamic light scattering)方法测量了粒子的大小和表面电荷。具体地，将He-Ne激光用作光源，并按照手册操作了MALVERN公司的Zetasizer Nano ZS90设备。下表6示出基于配方的比较例1至2、实施例1至3的纳米粒子的大小和表面电荷。
[表6]
组合物的种类 粒子大小(以强度为基准) 表面电荷
比较例1 裸露Ad 119.8nm -16.8mV
比较例2 Ad pDNA/SENS 152.3nm -10.7mV
实施例1 Ad-vSENS 129.7nm -29.5mV
实施例2 Ad-vSENS+CaCl<sub>2</sub> 125.3nm -28.2mV
实施例3 Ad-vSENS_2 191.8nm -2.81mV
[实验例2]基于配方的肝组织内吸收比率的比较
使用荧光素酶(Luciferase)表达基因测量了体内(in vivo)形态的基因表达水平(level)。利用IVIS光谱体内成像系统(spectrum in vivo imaging system)方法以体内形态测量了生物发光(bioluminescence)值。按照手册操作了PerkinElmer公司的IVISLUMINA III设备。下面的表7和图2示出基于配方的比较例1、实施例1至3的肝摄取(liveruptake)值和比率。
[表7]
组成物名称 肝 肝摄取比率(相对于裸露Ad)
比较例1 Naked Ad 5.7X10<sup>10</sup> 1
实施例1 Ad-vSENS 2.9X10<sup>8</sup> 0.005
实施例2 Ad-vSENS(+CaCl<sub>2</sub>) 2.6X10<sup>7</sup> 0.0005
实施例3 Ad-vSENS_2 4.3X10<sup>6</sup> 0.000075
[实验例3]基于配方化的组织内表达效率的比较
使用荧光素酶表达基因测量了体外形态的基因表达水平。利用IVIS光谱体内成像系统(spectrum in vivo imaging system)方法以体外形态测量了生物发光值。按照手册操作了PerkinElmer公司的IVIS LUMINA III设备。图3示出基于配方化的比较例1至2、实施例1的各器官的基因表达分布的样貌。
[实验例4]基于配方化的各组织内毒性的比较
对所有试验组通过静脉给药(i.v.)给药一次。当进行肝组织内毒性比较试验时，在给药72小时后提取血清并进行分析。图4示出基于配方化的比较例1和实施例3的肝组织内毒性的比较值。
[实验例5]基于配方化的免疫化后的抗癌功效的比较
所有试验物质均通过静脉给药(i.v.)来给药。为了进行基于免疫化的比较，区分经免疫化的实验组和未经免疫化的对照组来进行了实验。为了免疫化反应，将病毒以两个星期的间隔共给药两次，为期四个星期。在比较例1和实施例3的情况下，以2天的间隔共给药5次，为期11天。对于阴性对照物质，以等同用量和用法给药。在静脉给药的情况下，将动物小心地置于保持固定器后，利用安装有26号针头(gauge needle)的注射器对尾静脉进行静脉内给药。下面的图5示出基于配方化的比较例1和实施例3的表示抗癌功效的肿瘤大小变化值。
Figure IDA0002938441370000011
Figure IDA0002938441370000021

Claims (15)

1.一种用于递送病毒的组合物，其特征在于，包含：作为有效成分的病毒、两亲性嵌段共聚物、以及聚乳酸盐，
所述病毒被封入在由所述两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的纳米粒子结构体的内部。
2.根据权利要求1所述的用于递送病毒的组合物，其特征在于，所述病毒是溶瘤病毒。
3.根据权利要求2所述的用于递送病毒的组合物，所述溶瘤病毒是选自由腺病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒HSV以及水疱性口炎病毒VSV组成的组中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的用于递送病毒的组合物，所述两亲性嵌段共聚物是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型嵌段共聚物，所述亲水性A嵌段是选自由单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯与丙二醇的共聚物以及聚乙烯吡咯烷酮组成的组中的一种以上，所述疏水性B嵌段是选自由聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯以及聚膦嗪组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的用于递送病毒的组合物，所述疏水性B嵌段的末端羟基被选自由生育酚、胆固醇以及碳原子数10至24个的脂肪酸组成的组中的一种以上修饰。
6.根据权利要求1所述的用于递送病毒的组合物，所述聚乳酸盐是选自由以下化学式1至6的化合物组成的组中的一种以上：
[化学式1]
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
在所述式1中，A为-COO-CHZ-；B为-COO-CHY-，-COOCH2CH2CH2CH2CH2-或-COO-CH2CH2OCH2-；R为氢原子、或者乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；Z和Y各自为氢原子、或者甲基或苯基；M为Na、K或Li；n为1至30的整数；m为0至20的整数；
[化学式2]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
在所述式2中，X为甲基；Y'为氢原子或苯基；p为0至25的整数，q为0至25的整数，其中，p+q为5至25的整数；R为氢原子、或者乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M为Na、K或Li；Z为氢原子、甲基或苯基；
[化学式3]
RO-PAD-COO-W-M'
在所述式3中，W-M'为
Figure FDA0002938441300000021
PAD选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物以及D,L-乳酸与1,4-二
Figure FDA0002938441300000024
烷-2-酮的共聚物组成的组；R为氢原子、或者乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M独立地为Na、K或Li；
[化学式4]
S-O-PAD-COO-Q
在所述式4中，S为
Figure FDA0002938441300000022
L为-NR1-或-O-，其中，R1为氢原子或碳原子数1～10的烷基；Q为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3或-CH2C6H5；a为0至4的整数；b为1至10的整数；M为Na、K或Li；PAD是选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物以及D,L-乳酸与1,4-二
Figure FDA0002938441300000025
烷-2-酮的共聚物组成的组中的一种以上；
[化学式5]
Figure FDA0002938441300000023
在上述式5中，R'为-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，其中，PAD选自由D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸与乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸与己内酯的共聚物、D,L-乳酸与1,4-二
Figure FDA0002938441300000031
烷-2-酮的共聚物组成的组，M为Na、K或Li；a为1至4的整数；
[化学式6]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
在所述式6中，X和X'独立地为氢、碳原子数1～10的烷基或碳原子数6～20的芳基；Y和Z独立地为Na、K或Li；m和n独立地为0至95的整数，其中，5<m+n<100；a和b独立地为1至6的整数；R为-(CH2)k-、碳原子数2～10的二价烯基、碳原子数6～20的二价芳基或它们的组合，其中，k为0至10的整数。
7.根据权利要求6所述的用于递送病毒的组合物，所述聚乳酸盐为化学式1或化学式2的化合物。
8.根据权利要求1所述的用于递送病毒的组合物，其还包含阳离子化合物。
9.根据权利要求1所述的用于递送病毒的组合物，其进一步包含二价或三价金属离子。
10.根据权利要求9所述的用于递送病毒的组合物，所述二价或三价金属离子为选自由钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、钡(Ba2+)、铬(Cr3+)、铁(Fe3+)、锰(Mn2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、锌(Zn2+)和铝(Al3+)组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求9所述的用于递送病毒的组合物，以硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、磷酸盐或氢氧化物的形态包含所述二价或三价金属离子。
12.一种权利要求1所述的用于递送病毒的组合物的制造方法，其包括：
将病毒溶解于水性溶剂中的步骤(a)；
将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐分别溶解于有机溶剂中的步骤(b)；以及
将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合而形成乳液的步骤(c)。
13.根据权利要求12所述的用于递送病毒的组合物的制造方法，步骤(b)还包括：将阳离子化合物溶解于有机溶剂中的步骤。
14.根据权利要求12所述的用于递送病毒的组合物的制造方法，其进一步包括：从在步骤(c)中获得的乳液中选择性地去除有机溶剂的步骤(d)。
15.根据权利要求14所述的用于递送病毒的组合物的制造方法，其进一步包括：在步骤(d)之后添加二价或三价金属离子的步骤(e)。
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