WO2020032581A1 - 바이러스 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

바이러스 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질병을 치료 또는 예방하기 위한 바이러스를 유효 성분으로 포함하는, 바이러스 함유 약제학적 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법
본 발명은 질병을 치료 또는 예방하기 위한 바이러스를 유효 성분으로 포함하는, 바이러스 함유 약제학적 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.
인체 세포 속으로 치료를 위한 유전자를 효율적으로 전달하는 수단으로서 흔히 벡터가 이용되고 있다. 벡터는 바이러스 벡터와 비 바이러스 벡터로 구분된다.
바이러스 벡터는 인간 세포에서 발현이 잘 되고 침투력과 부착력이 양호한 장점으로 바이오의약품 제조업체들이 널리 사용하고 있으나 잠재적 안전성 위험을 안고 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스와 아데노바이러스가 대표적이며 이를 암이나 각종 난치성 질환의 치료에 효율적으로 응용하기 위하여 벡터를 변형하거나 주로 아데노바이러스를 근간으로 하여 키메라 바이러스를 개발하고 있다. 벡터의 변형은 바이러스 자체 단백질의 변형 또는 벡터에 면역조절 물질을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 그러나 바이러스 벡터는 정맥 투여시 간 축적에 의한 간 독성을 야기할 뿐만 아니라, 혈액 내에서 신속히 제거되어 종양 전달율이 낮아 주로 국소 투여로만 이용되고 있다.
반면, 비바이러스 벡터는, 바이러스성 벡터에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 비바이러스 벡터중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 핵산과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 핵산을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스 벡터보다는 덜하지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다.
현재 바이러스 및 비바이러스 성분의 장점들을 결합시킨 하이브리드 벡터가 개발되어 있다. 아데노바이러스의 CAR-의존성 및 면역원성의 제한을 극복하기 위하여 제시된 하나의 전략은 아데노바이러스의 표면을 CAR-매개의 엔도사이토시스의 필요성 없이 통과하는 폴리머로 개질시키는 것이다. 양이온성 폴리머 또는 지질로의 아데노바이러스 개질은 바이러스-매개의 유전자 전달을 강화시킨다. 그러나 이러한 전략들은, 주입된 폴리머/지질-개질된 바이러스가 급속도로 주변 비-타겟 조직들 내로 전파되기 때문에 타겟팅된 종양-특이적 바이러스-매개의 유전자 전달을 도출해내지 않는다. 또한 바이러스 약물의 경우 양이온성 비바이러스 벡터를 이용하여 체내 도입시킬 때 종양으로의 전달 효율이 현저히 감소하는 특징이 있다. 그 이유는 바이러스가 양이온성 고분자와의 비특이적 결합에 의해 원하는 조직으로 가지 못하기 때문이다. 따라서, 바이러스의 전달능 및 안정성 강화를 위한 제형 및 그 제조방법의 개발이 필요하다.
한편, 한국특허공개 제2003-0032897호는 다량의 난용성 약물을 가용화시키며, 수용액에서의 안정성이 우수한 혼합 고분자 나노입자 조성물을 제공하기 위하여, 친수성 블록과 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체 및, 카르복시산 말단기를 함유하는 폴리락트산 유도체를 포함하고, 체액 또는 수용액에서 고분자 나노입자를 형성할 수 있는 혼합 고분자 나노입자 조성물, 및 상기 혼합 고분자 나노입자 조성물로 이루어진 고분자 나노입자 내부에 난용성 약물이 포함된 약학적 조성물을 개시하고 있다.
본 발명자들은 바이러스, 예를 들어 암살상 바이러스로서 아데노바이러스의 전달 효율 증가를 위하여 예의 노력한 결과, 야생형의 아데노바이러스를 유기용매에 용해시킨 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염과 혼합하여 단일상 시스템(monophase system) 하에서 에멀젼화시켜 복합체를 형성함으로써 아데노바이러스를 고분자 나노입자 내에 봉입하는 경우, 아데노바이러스의 안정성, 안전성 및 목표한 생체 조직 내 발현 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 바이러스를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바이러스를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약제학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따른 조성물은, 나노입자 구조체를 포함하는 바이러스 전달용 조성물로, 유효성분으로서 바이러스; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 바이러스는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 양태에 따른 조성물의 제조 방법은 아래 단계들을 포함할 수 있다:
(a) 바이러스를 수성 용매에 용해시키는 단계;
(b) 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 각각 유기용매에 용해시키는 단계; 및
(c) 단계 (a) 및 (b)의 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계.
본 발명에 따른 조성물은 폴리락트산염과 양친성 블록 공중합체를 사용하여 바이러스를 체내에 주입할 때 외부로부터 격리시킴에 따라 바이러스의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 바이러스를 목표한 생체 조직 내에 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 상기 양친성 블록 공중합체는 생분해성 및 생체 적합성이 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 제조방법에 의해 제조된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 양태에 따른 고분자 나노입자 전달체의 간 조직 내 유전자 흡수 비율을 확인하기 위하여 발광 측정 이미징 시스템으로 루시퍼라아제 유전자의 발현을 측정한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 양태에 따른 고분자 나노입자 전달체의 목표한 생체 조직 내 발현 효율을 확인하기 위하여 루시퍼라아제 유전자의 발현으로 나타나는 발광을 Ex vivo 형태로 발광 측정 이미징 시스템으로 측정한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 양태에 따른 고분자 나노입자 전달체의 간 조직 내 독성 정도를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 양태에 따른 고분자 나노입자 전달체의 항암 효능을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
바이러스
본 발명의 바이러스 전달용 조성물에 사용되는 상기 바이러스는 질병의 치료용 또는 예방용 바이러스로서, 최종적으로 제조되는 조성물의 유효성분이다.
일 구체예에서, 상기 질병의 치료용 바이러스는 암살상 바이러스(oncolytic virus)일 수 있다. 암살상 바이러스의 예는 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 단순헤르페스바이러스(HSV) 및 수포성구내염바이러스(VSV)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 일 구체예에서, 암살상 바이러스는 아데노바이러스이다. 본 발명의 구체예에서 사용된 아데노바이러스는 루시퍼라아제를 포함하고, 이것은 이미징을 통해 확인할 수 있다.
상기 치료용 바이러스는 개체의 체내에 여러 종류의 치료 유전자를 발현할 수 있으며, 특정 분자량, 단백질, 생활성 또는 치료 분야에 제한되지 않는다. 상기 예방용 바이러스는 표적 질병에 대해 개체의 체내에 면역을 유발할 수 있다. 본 발명의 일례에 따른 질병 예방용 바이러스를 포함하는 조성물은 바이러스 자체에 의한 면역 유발을 감소시키고, 표적 세포를 지정 또는 확장 가능하며, 재투여시 바이러스에 대한 과면역 반응을 감소시켜 수 회 접종하여 유효한 효과를 얻을 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명의 일례에서, 바이러스는, 최종 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 바이러스의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
양친성 블록 공중합체
본 발명의 바이러스 전달용 조성물에 사용되는 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수상에서 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입으로, 고분자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다.
상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤인 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.
또한, 필요에 따라, 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염으로 형성된 고분자 나노입자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 나노입자 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 일 실시예에서, 소수성 B 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여, 상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 토코페롤, 콜레스테롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것일 수 있다.
상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 99.98 중량%이며, 구체적으로는 10 내지 99.8 중량%, 더 구체적으로는 20 내지 80 중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 1 중량% 미만이면 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 바이러스의 함량이 너무 적어지게 된다.
나아가, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 30 내지 80 중량%, 구체적으로는 40 내지 70 중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 30 중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 나노입자를 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 30 중량% 이상인 것이 좋은 한편, 80중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 80 중량% 이하인 것이 좋다.
폴리락트산염
본 발명의 바이러스 전달용 조성물에 사용되는 상기 폴리락트산염(예: PLANa)은 나노입자의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 나노입자를 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 바이러스와 결합하여 고분자 나노입자의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 나노입자에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 나노입자 내벽 성분으로 포함되는 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50,000달톤, 구체적으로 1,000 내지 10,000달톤인 것이 좋다. 분자량이 500달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 나노입자의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 분자량이 50,000달톤을 초과하면 고분자 나노입자의 입자가 커지는 문제가 있다.
상기 폴리락트산염은 양친성 블록 공중합체 100 중량부에 대하여 1 내지 500중량부, 구체적으로 20 내지 400중량부, 더 구체적으로 40 내지 300중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 함량이 양친성 블록 공중합체 100 중량부 대비 500 중량부를 초과하면 나노입자의 크기가 증가하여, 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1중량부 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.
일 구체예에서, 바이러스 1 중량부 대비 양친성 블록 공중합체를 1 내지 2,000 중량부, 폴리락트산염을 1 내지 1,000 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는 양친성 블록 공중합체를 5 내지 1,000 중량부, 보다 바람직하게는 10 내지 500 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리락트산염을 5 내지 500 중량부, 보다 바람직하게는 10 내지 250 중량부로 함유할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염의 말단 중 카르복실산-금속(예: 나트륨)의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 폴리락트산염은 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
[화학식 1]
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COOCH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.
[화학식 2]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다.
[화학식 3]
RO-PAD-COO-W-M'
상기 식 3에서, W-M'는
Figure PCTKR2019009893-appb-I000001
또는
Figure PCTKR2019009893-appb-I000002
이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다.
[화학식 4]
S-O-PAD-COO-Q
상기 식 4에서, S는
Figure PCTKR2019009893-appb-I000003
이고; L은 -NR1- 또는 -O-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1-10 알킬이고; Q는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000004
상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다.
[화학식 6]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
상기 폴리락트산염은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것인 바람직하다.
양이온성 화합물
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스 전달용 조성물은 양이온성 화합물을 더 포함할 수 있다.
즉, 본 발명에 있어서 상기 양친성 블록 공중합체 및 상기 폴리락트산염은, 바이러스가 내부에 봉입된 나노입자 구조체를 형성하는데, 일 구체예에 따르면, 이 나노입자 구조체가 양이온성 화합물을 더 포함할 수 있다.
상기 양이온성 화합물은 나노입자 구조체 내에서 음전하인 바이러스의 외피와 정전기적 결합으로 결합함으로써 바이러스를 나노입자 구조체 내에 안정화시키는데 기여할 수 있다. 상기 바이러스는 동시에 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 소수성 부분과 결합할 수 있다.
상기 양이온성 화합물은, 바이러스와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어, 양이온성 지질과 고분자 종류일 수 있다.
상기 양이온성 지질은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다.
보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 분자 당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 여러 개인 지질 종류일 수 있다. 구체적으로, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판 (DAP) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 다음의 화학식 A로 표현되는 것일 수 있다.
[화학식 A]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000005
상기 식에서,
n과 m 및 l은 각각 0 내지 12이되, 1 ≤ n + m + l ≤ 12이며, a와 b 및 c는 각각 1 내지 6이며, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로서, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소이다.
바람직하게는, n과 m 및 l은 독립적으로 0 내지 7이며, 1 ≤ n+m+l ≤ 7일 수 있다.
바람직하게는, a와 b 및 c는 2 내지 4일 수 있다.
바람직하게는, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl), 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 양이온성 지질의 구체적인 예는 1,6-dioleoyl triethylenetetramide(N,N'-((ethane-1,2-diylbis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))dioleamide), 1,8-dilinoleoyl tetraethylenepentamide ((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))bis(octadeca-9,12-dienamide)), 1,4-dimyristoleoyl diethylenetriamide ((9Z,9'Z)-N,N'-(azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(tetradec-9-enamide)), 1,10-distearoyl pentaethylenehexamide (N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)distearamide), 및 1,10-dioleoyl pentaethylenehexamide (N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)dioleamide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한편, 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 프로타민(protamine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 고분자 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은, 최종적으로 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 20 중량%로 사용될 수 있다. 상기 양이온성 화합물의 함량이 0.01 중량% 미만이면 바이러스를 봉입할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50 중량%을 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 양이온성 화합물의 사용되는 양은, 바이러스 1 X 1010 VP기준으로 0.1 내지 40 ㎍이며, 구체적으로는 0.5 내지 35 ㎍, 더 구체적으로는 1 내지 30 ㎍이고, 보다 더 구체적으로는 1 내지 25 ㎍, 가장 구체적으로는 6 내지 24 ㎍인 것이 좋다. 상기 양이온성 화합물의 양이 0.1 ㎍ 미만인 경우에는 양이온성 화합물이 바이러스를 충분히 봉입하지 못하기 때문에, 상기 양이 0.1 ㎍ 이상이어야 양이온성 화합물과 바이러스가 정전기적 결합에 의해 충분한 양의 바이러스를 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 양이 40 ㎍ 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 40 ㎍ 이하로 하는 것이 좋다.
2가 또는 3가 금속이온
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스 전달용 조성물은 2가 또는 3가 금속이온을 더 포함할 수 있다.
상기 2가 또는 3가의 금속이온은, 바람직하게는 칼슘(Ca2 +), 마그네슘(Mg2 +), 바륨(Ba2+), 크롬(Cr3 +), 철(Fe3 +), 망간(Mn2 +), 니켈(Ni2 +), 구리(Cu2 +), 아연(Zn2 +) 또는 알루미늄(Al3+) 등에서 선택될 수 있다.
상기 금속이온은 황산염, 염산염, 탄산염, 인산염 및 수산화물의 형태로 고분자 나노입자 조성물에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 염화아연(ZnCl2), 염화알루미늄(AlCl3), 염화철(FeCl3), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산마그네슘(MgCO3), 인산칼슘(Ca3(PO4)2), 인산마그네슘(Mg3(PO4)2), 인산알루미늄(AlPO4), 황산마그네슘(MgSO4), 수산화칼슘(Ca(OH)2),　수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화알루미늄(Al(OH)3), 수산화아연(Zn(OH)2) 또는 이들의 혼합물이 첨가될 수 있다.
상기 2가 또는 3가의 금속이온은 당량을 조절하여 고분자 나노입자 내부에 봉입되어 있는 약물의 방출 속도를 조절할 수 있다. 구체적으로, 2가 또는 3가의 금속이온이 폴리락트산염의 카르복시기의 당량에 대하여 고분자 나노입자 조성물에 1 당량 이하 포함되면, 폴리락트산염의 카르복시 말단기와 결합되는 수가 적어 약물의 방출 속도가 증가하게 되며, 1 당량 이상 포함되면, 폴리락트산염의 카르복시 말단기와 결합되는 수가 많아 약물의 방출 속도가 지연된다. 이에, 혈액 내 약물의 방출속도를 증가시키기 위해 적은 당량의 금속이온을 사용하며, 약물의 방출 속도를 지연시키기 위해서는 많은 당량의 금속이온을 사용할 수 있다.
또한, 2가 또는 3가 금속이온은 상기 폴리락트산염의 카르복시 말단기의 당량에 대하여 0.01∼10 당량, 0.1~5 당량, 0.2~2 당량으로 포함될 수 있다.
바이러스 전달용 조성물 제조 방법
본 발명의 다른 측면에 따르면, (a) 바이러스를 수성 용매에 용해시키는 단계; (b) 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 각각 유기용매에 용해시키는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계;를 포함하는 바이러스 전달용 조성물의 제조 방법이 제공된다.
상기 단계 (a)~(c)는 바이러스, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 복합체를 제조하기 위해, 바이러스를 수성 용매에, 그리고 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염를 각각 유기용매에 용해시켜, 이들을 혼합하여 단일상 시스템(monophase system)에서 에멀젼을 제조하는 단계이다.
상기 (a) 단계에서, 사용되는 수성 용매는 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있고, 바람직한 완충액은 인산완충액(Phosphate buffered saline)일 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 사용되는 유기 용매는 수혼화성 유기용매로서, 예를 들어 C1 내지 C5의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 등을 포함하나 이에 제한되지 않음), 아세톤, 에틸아세테이트 또는 이의 혼합물일 수 있다.
상기 단계 (b)에서는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 유기용매상에 녹이는데, 이때 사용되는 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 다이옥산, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 에탄올, 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 특별한 한정은 없으며, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 용해를 위해 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에서, 상기 단계 (b)는 양이온성 화합물을 상기 유기용매에 용해시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
단계 (c)에서는, 단계 (a)에서 얻어진 바이러스 수용액과 단계 (b)에서 얻어진 양친성 블록 공중합체 유기용액 및 폴리락트산염 유기용액, 및 임의로 양이온성 화합물 유기용액을 혼합하여 에멀젼을 형성한다. 상기 바이러스가 용해된 수용액과 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염, 및 임의로 양이온성 화합물이 각각 용해된 유기용액간의 혼합비율은 특별한 한정은 없으며, 예컨대 부피 기준으로 바이러스 수용액 대비 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염, 및 임의로 양이온성 화합물 유기용액의 비율(양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염, 및 임의로 양이온성 화합물 유기용액/ 바이러스 수용액)이 1 내지 30, 보다 구체적으로 2 내지 10 일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용액들은 당업계에 알려진 적절한 혼합 수단을 통해 혼합되는데, 이러한 방법의 예로서, 초음파 분쇄기 등을 들 수 있다.
또 다른 하나의 추가적인 양태로서, 본 발명에 따른 바이러스 전달용 조성물의 제조방법은, (d) 단계 (c)에서 얻어진 혼합물로부터 유기용매를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 단계 (d)에서는 단계 (c)에서 제조된 안정화된 나노입자를 포함하는 혼합물로부터 다양한 제거방법, 예를 들어 유기용매의 증발 등에 의해 유기용매를 제거하여 고분자 나노입자 수용액을 수득하게 된다. 또한, 삼투압막을 이용하여 투석시켜 유기용매를 희석 및 제거할 수 있다.
바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은, (e) 상기 단계 (d) 이후에, 2가 또는 3가 금속이온을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
나아가, 바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은 (f) 상기 단계 (e) 이후에, 동결건조 보조제를 가하여 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 추가적인 양태로서, 본 발명의 제조방법은, 상기 단계 (f)의 동결건조 전에, 단계 (e)에서 얻은 고분자 나노입자 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 등의 조성물들을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%, 더 구체적으로는 4 내지 20 중량% 이다.
본 발명의 일 양태에 따른 제조방법에 의하면, 바이러스와 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 단일상인 수상에서 에멀젼화시킨다. 단일상 시스템이란, 제조 공정상 하나의 용매 또는 혼합 가능한 용매를 사용함으로써 상의 분리를 포함하지 않는 시스템을 의미하는 것으로서, 단일상 시스템을 이용하면 소수성 결합에 의해 나노입자 형태의 복합체가 효과적으로 형성되고, 동결건조를 통해 수용액을 제거하는 과정에서 결합력이 증가하여, 최종적으로 제조되는 고분자 나노입자의 수득률이 매우 향상되게 된다. 나아가, 이러한 제조방법은 유기용매를 상대적으로 적게 사용하므로 환경친화적일 뿐 아니라, 재현성이 유지되고, 제조가 매우 편이하며, 바이러스 복합체 형성을 통해 소수성 약물 입자로 바꾸어 대량 생산이 용이하다는 특징을 갖는다. 또한, 유기용매를 상대적으로 적게 사용하므로 생체 내 적용 시 유기용매에 의한 독성 감소 효과도 기대할 수 있다
또한, 본 발명의 일 양태에 따라 제조된 조성물에서는 바이러스는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하기 때문에, 혈중 또는 체액 내에서의 안전성 및 안정성이 향상된다.
한편, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조될 수 있는 고분자 나노입자를 포함하는 바이러스 전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태의 제조방법에 따르면, 상기 바이러스와 폴리락트산염은 소수성 상호작용을 통해 서로 결합하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체가 양친성 블록 공중합체에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입된 고분자 나노입자 구조체가 제조된다. 이와 같이 본 발명의 일 양태에 따른 제조방법에 의해 제조된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 상기 조성물의 구성성분인 바이러스, 양친성 블록 공중합체 등에 관한 사항은 상기 기재된 바와 동일하다.
본 발명의 일 양태는 상기 고분자 나노입자가 수용액 상에서 더욱 향상된 안정성을 갖도록 하기 위하여, 2가 또는 3가 금속이온을 더 포함할 수 있다. 2가 또는 3가 금속이온은 고분자 나노입자 내에서 폴리락트산염의 카르복시 말단기와 결합한다. 상기 2가 또는 3가 금속이온은 고분자 나노입자 내의 폴리락트산 카르복시 말단기의 1가 금속 양이온과 치환 반응하여 금속이온 결합을 형성한다. 상기 형성된 금속이온 결합은 보다 강한 결합력으로 인해 더욱 안정한 고분자 나노입자를 형성시킨다.
바람직한 일 양태에서, 상기 조성물 중 나노입자의 입자 크기는, 10 내지 300 nm이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm인 것이 좋다. 또한, 상기 나노입자 입자의 표준 전하는 -40 내지 10 mV 이며, 더욱 구체적으로 -30 내지 0 mV인 것이 좋다. 상기 입자 크기 및 표준 전하는, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 바이러스의 흡수도 및 안정성 면에서 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체 나노입자 구조체에 봉입된 바이러스-폴리락트산염 함유 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제, 캡슐, 분체 제제, 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데, 바람직한 일 양태로서, 상기 조성물은 주사용 제제, 보다 바람직하게는 정맥 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우, 이를 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 바이러스를 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입하여 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예
[ 비교예 1] 아데노바이러스 벡터
서열번호 1의 루시퍼라아제 유전자를 발현하는 야생형의 아데노바이러스 1 X 1010 VP 을 PBS 10 ㎕에 녹여 제조하였다(이하 'Naked Ad'라 함). 비교예 1에서 얻어진 조성물은 아래의 표 1과 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000006
[ 비교예 2] 아데노바이러스 플라스미드 DNA(Ad pDNA )/1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG-PLA 토코페롤(2k- 1.7k )/ 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조
서열번호 1의 루시퍼라아제 유전자를 발현하는 35,000 염기 쌍을 갖는 플라스미드 DNA 1 ㎍을 증류수 4.35㎕에 녹인 용액, dioTETA 10.4 ㎍을 에탄올 10.4 ㎕에 녹인 용액, DOPE 10.4 ㎍을 에탄올 10.4 ㎕에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 20 ㎍을 에탄올 0.2 ㎕에 녹인 용액, PLA-Na 20 ㎍을 에탄올 2 ㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태(bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에탄올을 선택적으로 제거하여 Ad pDNA/dioTETA/DOPE/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k 함유 조성물을 제조하였다(이하 'Ad DNA/SENS'라 함). 제조된 조성물은 0.45 ㎛ hydrophilic filter로 여과시킨 후 4℃에 보관하였고 추후 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 1X가 되게 섞어 주었다. 비교예 2에서 얻어진 조성물은 아래의 표 2와 같다.
[표 2]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000007
[ 실시예 1] 아데노바이러스/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na(1.7k) 함유 조성물 제조
서열번호 1의 루시퍼라아제 유전자를 발현하는 야생형의 아데노바이러스 1 X 1010 VP 을 PBS 10 ㎕에 녹이고, mPEG-PLA (2k-1.7k) 40 ㎍을 에탄올 0.4 ㎕에 녹인 용액, PLA-Na_1.7k 100 ㎍을 에탄올 10 ㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태(bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에탄올을 선택적으로 제거하여 Ad/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k 함유 조성물을 제조하였다(이하 'Ad-vSENS'라 함). 제조된 조성물은 0.45 ㎛ hydrophilic filter로 여과시킨 후 4℃에 보관하였고 추후 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 1X가 되게 섞어 주었다. 실시예 1에서 얻어진 조성물은 아래의 표 3과 같다.
[표 3]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000008
[ 실시예 2] 아데노바이러스/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na(1.7k)/CaCl2 함유 조성물 제조
서열번호 1의 루시퍼라아제 유전자를 발현하는 야생형의 아데노바이러스 1 X 1010 VP 을 PBS 10 ㎕에 녹이고, mPEG-PLA (2k-1.7k) 40 ㎍을 에탄올 0.4 ㎕에 녹인 용액, PLA-Na_1.7k 100 ㎍을 에탄올 10 ㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태(bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에탄올을 선택적으로 제거하여 Ad/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLA-Na_1.7k 함유 조성물을 제조하였다. 이후, CaCl2 3.3 ㎍ 을 PBS 1.7 ㎕ 에 녹인 용액을 첨가해주었다(이하 'Ad-vSENS+CaCl2'라 함). 제조된 조성물은 0.45 ㎛ hydrophilic filter로 여과시킨 후 4℃에 보관하였고 추후 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 1X가 되게 섞어 주었다. 실시예 2에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4와 같다.
[표 4]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000009
[ 실시예 3] 아데노바이러스/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드(dio-TETA)/PLA-Na(1.7k)/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k) 함유 조성물 제조
서열번호 1의 루시퍼라아제 유전자를 발현하는 야생형의 아데노바이러스 1 X 1010 VP 을 PBS 100 ㎕에 녹이고, dio-TETA 20 ㎍을 2 ㎕에 녹인 용액, PLA-Na_1.7k 100 ㎍을 에탄올 2 ㎕에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 100 ㎍을 에탄올 2 ㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 먼저 바이러스가 포함된 100 ㎕ PBS와 최종적으로 섞어 Ad/dio-TETA/PLA-Na_1.7k/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다(이하 'Ad-vSENS_2'라 함). 실시예 3에서 얻어진 조성물은 아래의 표 5와 같다.
[표 5]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000010
[ 실험예 1] 제형에 따른 조성물의 크기 및 표면 전하 비교
제형에 따른 나노입자 형성 여부를 확인하기 위하여 크기, 표면 전하를 확인하였다. 동적 광산란 (DLS; dynamic light scattering) 방법을 이용하여 입자의 크기와 표면 전하를 측정하였다. 구체적으로, He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, MALVERN사의 Zetasizer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다. 제형에 따른 비교예 1 내지 2, 실시예 1 내지 3의 나노입자의 크기 및 표면 전하는 아래의 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000011
[ 실험예 2] 제형에 따른 간 조직 내 흡수 비율 비교
Luciferase 발현 유전자를 사용하여 in vivo 형태의 유전자 발현 level을 측정하였다. IVIS spectrum in vivo imaging system 방법을 이용하여 in vivo 형태로서 bioluminescence 값을 측정하였다. PerkinElmer사의 IVIS LUMINA III 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다. 제형에 따른 비교예 1, 실시예 1 내지 3의 liver uptake 값과 비율은 아래의 표 7 및 도 2에 나타내었다.
[표 7]
Figure PCTKR2019009893-appb-I000012
[ 실험예 3] 제형화에 따른 조직 내 발현 효율 비교
Luciferase 발현 유전자를 사용하여 ex vivo 형태의 유전자 발현 level을 측정하였다. IVIS spectrum in vivo imaging system 방법을 이용하여 ex vivo 형태로서 bioluminescence 값을 측정하였다. PerkinElmer사의 IVIS LUMINA III 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다. 제형화에 따른 비교예 1 내지 2, 실시예 1의 각 장기별 유전자 발현 분포 모습을 도 3에 나타내었다.
[ 실험예 4] 제형화에 따른 간 조직 내 독성 비교
모든 시험군은 정맥투여(i.v.)를 통해 단회 투여되었다. 간 조직 내 독성 비교 시험의 경우 투여 후 72시간 째 혈청을 추출하여 분석하였다. 제형화에 따른 비교예 1 및 실시예 3의 간 조직 내 독성 비교 값을 도 4에 나타내었다.
[ 실험예 5] 제형화에 따른 면역화 후 항암 효능 비교
모든 시험 물질은 정맥투여(i.v.)를 통해 투여되었다. 면역화에 따른 비교를 위하여 면역화 한 실험군과 면역화 하지 않은 대조군을 구분하여 실험을 진행하였다. 면역화 반응을 위하여 바이러스를 2주 간격으로 총 2회, 4주간 투여하였다. 비교예 1 및 실시예 3의 경우, 2일 간격으로 총 5회, 11 일간 투여하였다. 음성대조물질의 경우, 같은 용량 및 용법으로 투여하였다. 정맥투여의 경우, 동물을 보정기에 조심스럽게 넣은 후, 26 gauge needle이 장착된 주사기를 이용하여 미정맥으로 정맥 내 투여하였다. 제형화에 따른 비교예 1 및 실시예 3의 항암 효능을 나타내는 종양 크기 변화값을 아래의 도 5에 나타내었다.

Claims (15)

  1. 유효성분으로서 바이러스; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염;을 포함하며,
    상기 바이러스는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는, 바이러스 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 암살상 바이러스(oncolytic virus)인 것을 특징으로 하는, 바이러스 전달용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 단순헤르페스바이러스(HSV) 및 수포성구내염바이러스(VSV)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상인, 바이러스 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체이며, 상기 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 바이러스 전달용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤, 콜레스테롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된, 바이러스 전달용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리락트산염이 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 바이러스 전달용 조성물:
    [화학식 1]
    RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
    상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COOCH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이고;
    [화학식 2]
    RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
    상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이고;
    [화학식 3]
    RO-PAD-COO-W-M'
    상기 식 3에서, W-M'는
    Figure PCTKR2019009893-appb-I000013
    또는
    Figure PCTKR2019009893-appb-I000014
    이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이고;
    [화학식 4]
    S-O-PAD-COO-Q
    상기 식 4에서, S는
    Figure PCTKR2019009893-appb-I000015
    이고; L은 -NR1- 또는 -O-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1-10 알킬이고; Q는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019009893-appb-I000016
    또는
    Figure PCTKR2019009893-appb-I000017
    상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이고;
    [화학식 6]
    YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
    상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리락트산염이 화학식 1 또는 2의 화합물인, 바이러스 전달용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 양이온성 화합물을 더 포함하는, 바이러스 전달용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 2가 또는 3가 금속 이온을 추가로 포함하는, 바이러스 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 2가 또는 3가 금속 이온이 칼슘(Ca2 +), 마그네슘(Mg2+), 바륨(Ba2 +), 크롬(Cr3 +), 철(Fe3 +), 망간(Mn2 +), 니켈(Ni2 +), 구리(Cu2 +), 아연(Zn2+) 및 알루미늄(Al3 +)으로 구성된 그룹에서 선택되는 1종 이상인, 바이러스 전달용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 2가 또는 3가 금속이온이 황산염, 염산염, 탄산염, 인산염 또는 수산화물의 형태로 포함되는, 바이러스 전달용 조성물.
  12. (a) 바이러스를 수성 용매에 용해시키는 단계;
    (b) 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 각각 유기용매에 용해시키는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 (b)의 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계;를 포함하는,
    제1항에 따른 바이러스 전달용 조성물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (b)가 양이온성 화합물을 유기용매에 용해시키는 단계를 더 포함하는, 바이러스 전달용 조성물의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 단계 (c)에서 얻은 에멀젼으로부터 유기용매를 선택적으로 제거하는 단계 (d)를 추가로 포함하는, 바이러스 전달용 조성물의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (d) 이후에, 2가 또는 3가 금속 이온을 첨가하는 단계 (e)를 추가로 포함하는, 바이러스 전달용 조성물의 제조방법.
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