WO2024053862A1 - 약물 함유 나노입자 제조용 키트 및 약물전달용 나노입자 조성물 - Google Patents

약물 함유 나노입자 제조용 키트 및 약물전달용 나노입자 조성물 Download PDF

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WO2024053862A1
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acid
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anionic
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김고은
경규진
김소영
남정표
이소진
박종민
서원일
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주식회사 삼양홀딩스
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Definitions

  • the present invention relates to a kit for producing drug-containing nanoparticles and a nanoparticle composition for delivering a drug, and more specifically, to a kit comprising a cationic compound and an anionic polymer compound having at least one acid functional group. It relates to a kit for manufacturing drug-containing nanoparticles and a nanoparticle composition for drug delivery designed to increase the efficiency of drug delivery to cells using nanoparticles.
  • Non-viral carriers In treatment using anionic drugs, including nucleic acids, safe and efficient drug delivery technologies have been studied for a long time, and various carriers and delivery technologies have been developed. Delivery vehicles are largely divided into viral delivery vehicles using adenoviruses, retroviruses, etc., and non-viral delivery vehicles using cationic lipids and cationic polymers. In the case of viral carriers, it is known that they are exposed to risks such as non-specific immune reactions and that there are many problems in commercializing them due to the complicated production process. Therefore, recent research is progressing in the direction of improving the shortcomings by using non-viral carriers. Compared to viral carriers, non-viral carriers have the advantage of having fewer side effects in terms of in vivo safety and being less expensive to produce in terms of economic efficiency.
  • non-viral carriers used to deliver nucleic acid substances include a cationic lipid-nucleic acid complex (lipoplex) using cationic lipids and a polycationic polymer-nucleic acid complex (polyplex).
  • lipoplex cationic lipid-nucleic acid complex
  • polyplex polycationic polymer-nucleic acid complex
  • Nanoparticles containing drugs often lose their stability depending on the storage environment, so they are vulnerable to long-term storage and there is a risk that their quality may be damaged during transportation. In addition, it requires a complex manufacturing process to ensure sufficient stability, making it very difficult to manufacture. Therefore, there is a need to develop a drug delivery composition that is not significantly affected by the storage environment, is easy for end consumers to use, and can further increase the cell delivery efficiency of the drug.
  • the first aspect of the present invention is to provide a kit for producing drug-containing nanoparticles.
  • the drug can be easily incorporated into the nanoparticles by simply mixing the kit components, making it easy for end consumers to use.
  • drug-containing nanoparticles can be easily and quickly prepared immediately before use, allowing the drug to be effectively delivered into the body without being affected by the storage or transportation environment.
  • the drug can be delivered to the cells of the drug. Delivery efficiency can be further increased.
  • drug-containing nanoparticles formed by the kit according to the first aspect of the present invention can be specifically delivered to the spleen, thereby further increasing the applicability of anticancer vaccines.
  • a second aspect of the present invention is to provide a nanoparticle composition for drug delivery. Accordingly, drug-containing nanoparticles can be easily and quickly prepared immediately before use regardless of the type of drug (e.g., mRNA), thereby providing a drug delivery nanoparticle composition. Once this is determined, the drug can be easily incorporated into the nanoparticles simply by mixing it with the drug, making it simple to manufacture drug-containing nanoparticles and easy for end consumers to use.
  • drug e.g., mRNA
  • drug-containing nanoparticles formed by mixing the composition according to the second aspect of the present invention and the drug can be specifically delivered to the spleen, thereby further increasing the applicability of anticancer vaccines.
  • a first aspect of the present invention includes: a first chamber containing nanoparticles containing a cationic compound and an anionic polymer compound; and a second chamber containing a drug that is an active ingredient selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof, wherein the anionic polymer compound has at least one acid functional group.
  • a kit for preparing drug-containing nanoparticles is provided.
  • the drug-containing nanoparticle is for delivering the drug into cells.
  • the anionic polymer compound is an anionic amphiphilic block copolymer, an anionic hydrophilic polymer, an anionic hydrophobic polymer, or a combination thereof.
  • the anionic amphiphilic block copolymer includes a hydrophilic block and a hydrophobic block.
  • the anionic hydrophilic polymer includes only hydrophilic blocks.
  • the anionic hydrophobic polymer includes only hydrophobic blocks.
  • At least one selected from the group consisting of the first chamber and the second chamber further includes an additional solvent.
  • the solvent is an aqueous solvent, a water-miscible solvent, or a mixture thereof.
  • the second chamber further includes one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, saccharides, surfactants, chelating agents, or combinations thereof.
  • the kit for producing drug-containing nanoparticles includes a drug that is an active ingredient selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof; cationic compounds; The anionic polymer compound; menstruum; and one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, saccharides, surfactants, chelating agents, or combinations thereof.
  • the amount of the anionic polymer compound may be 0.01 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound may be used in the production of nanoparticles in the form of a solution that has been filtered one or more times.
  • the second aspect of the present invention is a drug delivery composition containing nanoparticles, wherein the nanoparticles include a cationic compound and an anionic polymer compound, and the nanoparticles do not contain a drug, wherein the anionic Provided is a nanoparticle composition for drug delivery, wherein the polymer compound has at least one acid functional group.
  • the drug delivery nanoparticle composition is for delivering drugs into cells.
  • the drug is selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof.
  • the anionic polymer compound is an anionic amphiphilic block copolymer, an anionic hydrophilic polymer, an anionic hydrophobic polymer, or a combination thereof.
  • the anionic amphiphilic block copolymer includes a hydrophilic block and a hydrophobic block.
  • the anionic hydrophilic polymer includes only hydrophilic blocks.
  • the anionic hydrophobic polymer includes only hydrophobic blocks.
  • the nanoparticle composition for drug delivery further includes an additional solvent.
  • the solvent is an aqueous solvent, a water-miscible solvent, or a mixture thereof.
  • the drug delivery nanoparticle composition further includes one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, saccharides, surfactants, chelating agents, or combinations thereof.
  • the nanoparticle composition for drug delivery includes a cationic compound; The anionic polymer compound; menstruum; and one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, saccharides, surfactants, chelating agents, or combinations thereof.
  • the amount of the anionic polymer compound may be 0.01 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound may be used in the production of nanoparticles in the form of a solution that has been filtered one or more times.
  • the kit for producing drug-containing nanoparticles according to the first aspect of the present invention contains the drug and nanoparticles separately in separate chambers, so it is not affected by the storage or transportation environment, and when used, the type of drug (e.g., mRNA) Even if the conditions change, the end user can quickly manufacture drug-containing nanoparticles by simply mixing the components of the chamber without going through complicated processes, for example, in a personalized vaccine at a hospital or in a pandemic situation. If only therapeutic mRNA is produced without optimizing the manufacturing process along with mRNA, it can be immediately administered to humans by simply mixing it with the nanoparticles proposed in the present invention.
  • the type of drug e.g., mRNA
  • the kit for producing drug-containing nanoparticles according to the present invention can further increase the cell delivery efficiency of the drug compared to the kit containing an amphiphilic polymer.
  • drug-containing nanoparticles formed by the kit for producing a nanoparticle composition of the present invention can be specifically delivered to the spleen, thereby further increasing the applicability of anticancer vaccines.
  • the nanoparticle composition for drug delivery according to the second aspect of the present invention is not affected by the storage or transportation environment, and when used, even if the type of drug (e.g., mRNA) changes, the end user can transfer the composition and drug without going through a complicated process.
  • Drug-containing nanoparticles can be manufactured quickly by simply mixing. For example, even in a personalized vaccine or pandemic situation in a hospital, there is no need to optimize the manufacturing process with mRNA, so only the completed mRNA is used. Once produced, it can be immediately administered to humans by simply mixing it with the composition of the present invention.
  • the nanoparticle composition for drug delivery according to the present invention can further increase the cell delivery efficiency of the drug compared to the nanoparticle composition containing an amphiphilic polymer.
  • drug-containing nanoparticles formed by mixing the composition of the present invention and a drug can be specifically delivered to the spleen, thereby further increasing the applicability of anticancer vaccines.
  • Figure 1 shows the agarose gel electrophoresis results of an experiment to confirm whether mRNA-containing nanoparticles were produced performed in Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 shows the agarose gel electrophoresis results of an experiment to confirm the production of mRNA-containing nanoparticles performed in Examples 2 to 5 and Comparative Examples 1 to 3 of the present invention.
  • Kit for preparing drug-containing nanoparticles [First aspect: Kit for preparing drug-containing nanoparticles]
  • a kit for producing drug-containing nanoparticles according to the first aspect of the present invention includes a first chamber containing nanoparticles containing a cationic compound and an anionic polymer compound; and a second chamber containing a drug that is an active ingredient selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof, wherein the anionic polymer compound has at least one acid functional group.
  • the kit of the present invention consists of two or more chambers, and the end user can easily produce drug-containing nanoparticles by simply mixing the contents of the chambers.
  • the term “simple mixing” can include all acts of “mixing” and means that no specific conditions are attached to the act of mixing.
  • the mixing may be accomplished by various methods such as dropping, stirring (vortexing), decanting, etc., but is not limited thereto.
  • at least 90%, at least 95%, or at least 99% of the theoretically formable amount of drug-containing nanoparticles is rapidly, for example, within 1 minute, within 30 seconds, Alternatively, it can be prepared in less than 15 seconds.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound form nanoparticles through electrostatic interaction, and the end user can form drug-containing nanoparticles by simply mixing the resulting nanoparticles with the drug.
  • the drug-containing nanoparticle prepared by the kit of the present invention may be in a form in which at least a portion of the drug is bound to the outside of the nanoparticle. This drug-containing nanoparticle structure improves the stability of the drug in the blood or body fluids.
  • nucleic acid may be, for example, DNA, RNA, siRNA, shRNA, miRNA, mRNA, aptamer, antisense oligonucleotide, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • polypeptide includes proteins active in the body, such as antibodies or fragments thereof, cytokines, hormones or analogs thereof, or polypeptide sequences of antigens, analogs or precursors thereof, and are recognized as antigens through a series of processes in the body. It can refer to a protein that can be
  • the “virus” may be an oncolytic virus, for example, one or more selected from the group consisting of adenovirus, vaccinia virus, herpes simplex virus (HSV), and vesicular stomatitis virus (VSV).
  • the oncolytic virus is an adenovirus.
  • the adenovirus used in embodiments of the present invention contains a luciferase gene, which can be confirmed through imaging.
  • the virus can express various types of therapeutic genes in the body of an individual, and is not limited to a specific molecular weight, protein, bioactivity, or therapeutic field.
  • Preventive viruses can induce immunity in an individual's body against a target disease.
  • Nanoparticles containing viruses for disease prevention reduce the triggering of immunity by the virus itself, can specify or expand target cells, and reduce hyperimmune responses to the virus upon re-administration, allowing effective effects to be obtained with multiple vaccinations. It has advantages.
  • the particle size of the nanoparticles can be defined as a Z-average value, such as 800 nm or less, 600 nm or less, 500 nm or less, 400 nm or less, 300 nm or less, 200 nm or less, or 180 nm or less. It may also be 10 nm or more, 50 nm or more, or 100 nm or more. In one embodiment, the particle size of the nanoparticles, defined as the Z-average value, may be, for example, 10 to 800 nm, 10 to 600 nm, 10 to 500 nm, or 10 to 400 nm.
  • the “Z-average” may mean the average of the hydrodynamic diameter of the particle distribution measured using dynamic light scattering (DSL).
  • the nanoparticles have a monodisperse particle distribution, and their polydispersity index may be, for example, 0.05 to 0.8, 0.1 to 0.7, or 0.2 to 0.6.
  • the surface potential of the nanoparticle may be, for example, -50 mV or more, -45 mV or more, -40 mV or more, or -35 mV or more, and may also be 40 mV or less, 30 mV or less, or 20 mV or less. , may be 10 mV or less or 0 mV or less.
  • the surface potential of the nanoparticle may be, for example, -50 to 40 mV, -45 to 30 mV, -40 to 20 mV, -40 to 10 mV, or -35 to 0 mV.
  • the surface potential may be measured in an environment close to a biological environment, for example, in 8 to 12 mM HEPES buffer (pH 7.0 to 7.5).
  • the drug when the particle size and surface potential of the nanoparticles are maintained at the above level, it is desirable in terms of stability of the nanoparticle structure, content of components, absorption in the body, and convenience of sterilization.
  • the drug when the drug is a nucleic acid, one or more ends of the nucleic acid may be modified with one or more selected from the group consisting of cholesterol, tocopherol, and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms.
  • the cholesterol, tocopherol, and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms include analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol, tocopherol, and fatty acids.
  • the drug may be, for example, 30 wt% or less, 20 wt% or less, 10 wt% or less, 5 wt% or less, or 1 wt% or less, based on the total weight of the drug-containing nanoparticles prepared by the kit of the present invention. and may be 0.001% by weight or more, 0.01% by weight or more, 0.05% by weight or more, 0.1% by weight or more, or 0.15% by weight or more. In one embodiment, the drug is, for example, 0.001 to 30% by weight, 0.01 to 20% by weight, 0.05 to 10% by weight, 0.1 to 5% by weight, or 0.15 to 0.15% by weight, based on the total weight of the drug-containing nanoparticles. It may be 1% by weight.
  • the drug-containing nanoparticles may include virus 1x10 6 to 1x10 14 VP (Virus particle), 1x10 7 to 1x10 13 VP, 1x10 8 to 1x10 12 VP, or 1x10 9 to 1x10 11 VP. You can.
  • the cationic compound may be a cationic lipid or a cationic polymer, and more specifically, may be a cationic lipid.
  • the cationic lipid is N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), N-( 1-(2,3-dioleoyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N,N-dimethyl-(2,3-dioleoyloxy)propylamine (DODMA), N ,N,N-Trimethyl-(2,3-dioleoyloxy)propylamine (DOTMA), 1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane (TAP), 1,2-diacyl-3-dimethyl Ammonium-propane (DAP), 3beta-[N-(N',N',N'-trimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol (TC-cholesterol), 3beta-
  • cationic lipids When using such cationic lipids, it is preferable to use a small amount of polycationic lipids with a high cation density within the molecule in order to reduce toxicity caused by cationic lipids, and more specifically, each molecule can exhibit cations in an aqueous solution. It is preferable to use a cationic lipid with one functional group.
  • the cationic lipid is 3beta-[N-(N',N',N'-trimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol (TC-cholesterol), 3beta[N-( N',N'- dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol (DC-cholesterol), 3beta[N-(N'-monomethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol (MC-cholesterol), 3beta[N-( Aminoethane) carbamoyl] cholesterol (AC-cholesterol), N-(1-(2,3-dioleoyloxy) propyl-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N,N-dimethyl-( It may be one or more selected from the group consisting of 2,3-dioleoyloxy)propylamine (DODMA), and N,N,N,
  • the cationic polymer is chitosan, glycol chitosan, protamine, polylysine, polyarginine, polyamidoamine (PAMAM), It may be selected from the group consisting of polyethylenimine, dextran, hyaluronic acid, albumin, high molecular weight polyethyleneimine (PEI), polyamine, and polyvinylamine (PVAm), and may be more specific. It may be one or more selected from the group consisting of polyethyleneimine (PEI), polyamine, and polyvinylamine (PVAm).
  • the cationic lipid may be a cationic lipid of Formula 1:
  • n and m are each independently 0 to 12, but 2 ⁇ n + m ⁇ 12,
  • a and b are each independently 1 to 6,
  • R 1 and R 2 are each independently selected from the group consisting of saturated and unsaturated hydrocarbon groups having 11 to 25 carbon atoms.
  • n and m are each independently 1 to 9, and 2 ⁇ n+m ⁇ 10.
  • a and b may each independently be 2 to 4.
  • R 1 and R 2 are each independently selected from lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, arachidyl, and beta. Behenyl, lignoceryl, cerotyl, myristoleyl, palmitoleyl, sapienyl, oleyl, linoleyl ( It may be selected from the group consisting of linoleyl), arachidonyl, eicosapentaenyl, erucyl, docosahexaenyl, and cerotyl.
  • the cationic lipid is 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (N,N'-((ethane-1,2-diylbis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl) )dioleamide; dioTETA), 1,8-dilinoleoyltetraethylenepentamide ((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((azanediylbis(ethane-2,1-diyl ))bis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))bis(octadeca-9,12-dienamide)), 1,4-dimyristoleoyldiethylenetriamide ((9Z,9'Z) -N,N'-(azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(tetradec-9
  • the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticles prepared by the kit of the present invention is, for example, 25 parts by weight or less, 20 parts by weight or less, 15 parts by weight or less, and 10 parts by weight or less, based on 1 part by weight of drug. Alternatively, it may be 5 parts by weight or less, and may also be 0.5 parts by weight or more, 1 part by weight or more, 1.5 parts by weight or more, 2 parts by weight or more, or 2.5 parts by weight or more. In one embodiment, the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticle is 0.5 to 25 parts by weight, 1 to 20 parts by weight, 1.5 to 15 parts by weight, 2 to 10 parts by weight, based on 1 part by weight of drug.
  • the content of the cationic compound is 1 ⁇ g or more, 5 ⁇ g or more, 10 ⁇ g or more, 15 ⁇ g or more, or 18 ⁇ g or more based on 1x10 10 VP of virus, and 150 ⁇ g or more. It may be ⁇ g or less, 100 ⁇ g or less, 50 ⁇ g or less, or 30 ⁇ g or less, for example, 1 ⁇ g to 150 ⁇ g, 5 ⁇ g to 100 ⁇ g, 10 ⁇ g to 50 ⁇ g, 15 ⁇ g to 30 ⁇ g.
  • the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticle is less than the above range, the drug may not be stably contained in the nanoparticle, and if it exceeds the above range, the size of the drug-containing nanoparticle becomes too large, reducing particle stability. There is a risk that the loss rate may increase during filter sterilization.
  • the cationic compound and the nucleic acid bind through electrostatic interaction.
  • the ratio of the charges of the nucleic acid (P) and the cationic compound (N) is 0.5 or more, 0.7 or more, or 0.9 or more. , or may be 1 or more, and may also be 100 or less, 50 or less, 20 or less, or 10 or less, for example, 0.5 to 100, 0.7 to 50, 0.9 to 20, or 1 to 10.
  • the ratio (N/P) is below the above range, a sufficient amount of nucleic acid may not be included in the drug-containing nanoparticles, whereas if the ratio (N/P) exceeds the above range, there is a risk of causing toxicity. There is.
  • the N/P value may be important in ensuring that the active ingredient is specifically expressed in the spleen.
  • the anionic polymer compound may be an anionic amphiphilic block copolymer, an anionic hydrophilic polymer, an anionic hydrophobic polymer, or a combination thereof.
  • the anionic amphiphilic block copolymer is a block copolymer comprising a hydrophilic block and a hydrophobic block (e.g., an A-B type block copolymer comprising a hydrophilic block (A) and a hydrophobic block (B)).
  • the hydrophilic block or the hydrophobic block has at least one acid functional group
  • the hydrophobic block may have at least one acid functional group.
  • these block copolymers form core-shell type polymer nanoparticles in which the hydrophobic block forms the core (inner wall) and the hydrophilic block forms the shell (outer wall).
  • the anionic hydrophilic polymer is a polymer comprising only a hydrophilic block, where the hydrophilic block has at least one acid functional group.
  • These hydrophilic polymers form shell-type polymer nanoparticles in which the acid functional group interacts electrostatically with the cationic lipid in an aqueous solution, and the hydrophilic block forms the shell (outer wall).
  • the anionic hydrophobic polymer is a polymer comprising only hydrophobic blocks, where the hydrophobic blocks have at least one acid functional group.
  • the acid functional group of this hydrophobic polymer interacts electrostatically with the cationic lipid to form a shell-type polymer nanoparticle in which the hydrophobic block forms the core (inner wall).
  • the hydrophilic block may be one or more selected from the group consisting of polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyoxazoline, polyacrylamide, and derivatives thereof.
  • the hydrophilic block is monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), monoacetoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol, polyethyloxazoline (PEOz), polymethyloxazoline (PMOz), and a copolymer of polyethylene and propylene glycol. And it may be one or more selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidone.
  • the number average molecular weight (g/mol) of the hydrophilic block may be 200 or more, 500 or more, 1,000 or more, or 1,500 or more, and may also be 50,000 or less, 20,000 or less, 10,000 or less, or 5,000 or less, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the body distribution of the polymer nanoparticle carrier can be controlled by chemically binding a functional group that can reach specific tissues or cells, a ligand, or a functional group that can promote intracellular delivery to the end of the hydrophilic block.
  • the efficiency with which the nanoparticle carrier is delivered into cells can be increased.
  • the functional group or ligand may be one or more selected from the group consisting of monosaccharides, polysaccharides, vitamins, peptides, proteins, and antibodies against cell surface receptors.
  • the functional group or ligand is anisamide, vitamin B9 (folic acid), vitamin B12, vitamin A, galactose, lactose, mannose, hyaluronic acid, RGD peptide, NGR peptide, transferrin, and antibodies to the transferrin receptor. It may be one or more types selected from the group consisting of etc.
  • the hydrophobic block is a biocompatible, biodegradable polymer, and in one embodiment, it may be one or more selected from the group consisting of polyester, polyanhydride, polyamino acid, polyorthoester, and polyphosphazine.
  • the hydrophobic block is polylactide (PLA), polyglycolide, polycaprolactone (PCL), polydioxan-2-one, copolymer of polylactide and glycolide, polylactide and polydihydride. It may be one or more selected from the group consisting of a copolymer of oxan-2-one, a copolymer of polylactide and polycaprolactone, and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the number average molecular weight (g/mol) of the hydrophobic block may be 200 or more, 500 or more, 700 or more, or 1,000 or more, and may also be 50,000 or less, 20,000 or less, 10,000 or less, or 6,000 or less, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the hydrophobic block may be modified by chemically bonding tocopherol, cholesterol, or a fatty acid having 10 to 24 carbon atoms to the hydroxy group at the end.
  • the hydrophilic block may not have an acid functional group or may have at least one acid functional group
  • the hydrophobic block may also not have an acid functional group or may have at least one acid functional group, provided that at least one of the hydrophilic block and the hydrophobic block Has at least one acid functional group.
  • the acid functional group may be derived from an acid selected from the group consisting of inorganic acids, sulfonic acids, carboxylic acids, and combinations thereof.
  • the inorganic acid may be selected from the group consisting of phosphoric acid, nitric acid, chromic acid, and combinations thereof
  • the sulfonic acid may be methanesulfonic acid, ethane sulfur, It may be selected from the group consisting of ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and combinations thereof
  • the carboxylic acid is acetic acid, citric acid, gluconic acid, and lactic acid ( It may be selected from the group consisting of lactic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, phthalic acid, and combinations thereof, but is not limited thereto. No.
  • the anionic amphiphilic block copolymer includes a hydrophilic block of monomethoxypolyethylene glycol (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol) and a hydrophobic block of polylactide (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol). /mol) or polycaprolactone (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol), and the hydrophobic block may have a carboxylic acid group derived from succinic acid.
  • the anionic hydrophilic polymer is monomethoxypolyethylene glycol (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol) or polymethyloxazoline (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol) or polyethyloxazoline. It is a polymer composed of hydrophilic blocks (number average molecular weight: 300 to 10,000 g/mol), and may have a carboxylic acid group derived from succinic acid.
  • the molar ratio of the anionic polymer compound to 1 mole of the cationic compound contained in the first chamber may be 0.01 or more, 0.015 or more, 0.02 or more, 0.025 or more, or 0.03 or more, and may be 1 or less, It may be 0.95 or less, 0.9 or less, 0.85 or less, 0.8 or less, or 0.75 or less. More specifically, the molar ratio of the anionic polymer compound to 1 mole of the cationic compound contained in the first chamber may be 0.01 to 1, or 0.02 to 0.9, or 0.03 to 0.8, but is not limited thereto.
  • the nanoparticles in the first chamber may further include fusible lipids.
  • the amount of fusible lipid contained in the nanoparticles in the first chamber is 0.01 to 50% by weight, more specifically, based on the total weight of the drug-containing nanoparticles prepared by the kit of the present invention. It may be 0.1 to 10% by weight.
  • the fusible lipid combines with a cationic compound through hydrophobic interaction to form a nanoparticle structure.
  • the fusion lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopherol.
  • the phospholipid may be one or more selected from the group consisting of phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), and phosphatidic acid.
  • the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), and phosphatidic acid may be combined with one or two C10-24 fatty acids.
  • the cholesterol and tocopherol include analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol and tocopherol, respectively.
  • the fusible lipids include dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and distearoyl phosphatidylethanolamine.
  • Ethanolamine disearoyl phosphatidylethanolamine
  • dioleoyl phosphatidylethanolamine DOPE
  • dipalmitoleoyl phosphoethanolamine 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)
  • DPPE dipalmitoleoyl alcohol
  • Dilinoleoyl phosphatidylethanolamine 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine, 1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine (1, 2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), dioleoyl phosphocholine (1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), dilauroyl phosphatidylcholine
  • the fusion lipid is dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), dipalmitoleoyl phosphocholine (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), diol 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) It may be one or more types selected from the group consisting of.
  • DOPE dioleoyl phosphatidylethanolamine
  • DPPC dipalmitoleoyl phosphocholine
  • DOPC diol 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DPPE 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the content of the anionic polymer compound among the components in the drug-containing nanoparticles prepared by the kit of the present invention is 0.01 part by weight or more, 0.03 part by weight, based on 1 part by weight of the cationic compound. It may be 0.05 parts by weight or more, 0.07 parts by weight or more, 0.1 parts by weight or more, 0.12 parts by weight or more, 0.15 parts by weight or more, 0.2 parts by weight or more, 0.3 parts by weight or more, 0.4 parts by weight or more, or 0.5 parts by weight or more.
  • the content of the anionic polymer compound may be adjusted depending on the drug within the above range.
  • the content of the anionic polymer compound when the drug is a virus, may be 3 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound, and in another embodiment, when the drug is a nucleic acid, the content of the anionic polymer compound may be 3 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound.
  • the content of the anionic polymer compound is 0.01 to 15 parts by weight, 0.05 to 15 parts by weight, 0.07 to 10 parts by weight, 0.1 to 5 parts by weight, 0.1 to 3 parts by weight, or 0.15 to 1 part by weight, based on 1 part by weight of the cationic compound. It may be by weight.
  • the first chamber and/or the second chamber may further include an aqueous solution, a water-miscible organic solvent, or a combination thereof.
  • the “aqueous solution” may be used in the same sense as an aqueous solution, and may mean, for example, water, sterilized purified water, buffer solution, injection solution, etc., and may also be a buffer solution further containing an organic acid.
  • the aqueous solution may be, for example, citric acid buffer, PBS buffer, etc., but is not limited thereto.
  • the “water-miscible organic solvent” may be C1 to C4 lower alcohol, acetone, acetonitrile, water mixtures thereof, or mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound may be used to prepare nanoparticles in the form of a solution that has been filtered one or more times. More specifically, the filtration may be performed using a hydrophilic filter.
  • Materials of the hydrophilic filter include, for example, nylon, mixed cellulose ester (MCE), polyethyl sulfone (PES), polyvinylidene difluoridem PVDF, and cellulose acetate (CA). ), polytetrafluoroethylene (PTFE), and mixtures thereof, but are not limited thereto.
  • MCE mixed cellulose ester
  • PES polyethyl sulfone
  • CA cellulose acetate
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the drug can be more successfully incorporated into the nanoparticles, and the stability of the drug-containing nanoparticles can be increased.
  • the second chamber may further include a stabilizer suitable for improving the stability of the drug.
  • the stabilizer may further include a pH adjuster, inorganic salt, saccharide, surfactant, chelating agent, etc., but is not limited thereto.
  • the “saccharide” may refer to monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols that are reducing sugars thereof, polymers of single or mixed multiple sugars, etc., and the polysaccharides may refer to trisaccharides or more.
  • the monosaccharides include, for example, mannose, glucose, arabinose, fructose, galactose, etc.;
  • the disaccharides include sucrose, trehalose, maltose, lactose, cellobiose, gentiobiose, isomaltose, melibose, etc.;
  • the sugar alcohols include mannitol, sorbitol, xylitol, erythritol, maltitol, etc.;
  • the polysaccharides include, but are not limited to, raffinose, dextran, starch, hydroxyethyl starch, cyclodextrin, cellulose, hetastarch, and oligosaccharides.
  • the “modulator” may be Tris, glycine, histidine, glutamate, succinate, phosphate, acetate, aspartate, or a combination thereof
  • the “surfactant” may be sodium lauryl sulfate, dioctyl sodium sulphate, Fosuccinate, dioctyl sodium sulfonate, chenodeoxycholic acid, N-lauroylsarcosine sodium salt, lithium dodecyl sulfate, 1-octanesulfonate sodium salt, sodium cholate hydrate, sodium deoxycholate, glycodeoxy Cholic acid sodium salt, benzalkonium chloride, Triton It may be a combination of these, but is not limited thereto.
  • the “chelating agent” may be citric acid, polyphenolic acid, EDTA, DTPA, EDDHA, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the “inorganic salt” refers to a salt of a monovalent or divalent metal, and may be NaCl, KCl, MgCl 2 , CaCl 2 , MgSO 4 , CaSO 4 , CaCO 3 , MgCO 3 , etc., but is not limited thereto.
  • the second chamber may contain 5 to 15 mM Tris, 5 to 15 mM histidine, 50 to 90 mM NaCl, 2 to 8% sucrose (w/v), 0.5 to 1.5 mM MgCl 2 , 0.005 to 0.05% (w/v) PS-80, 0.05 to 0.15 mM EDTA, and 0.1 to 1.0% ethanol (v/v), and the pH may be 7.0 to 8.0.
  • the second chamber when the drug is a nucleic acid, the second chamber contains a PBS buffer, e.g., pH 7.0 to pH 8.0, 2.0 to 3.5 mM KCl, 1.0 to 2.5mM KH 2 PO 4 , 125 to 145 mM NaCl, And it may further include a solution containing 7.5 to 9.5 mM Na 2 HPO 4 .
  • a PBS buffer e.g., pH 7.0 to pH 8.0, 2.0 to 3.5 mM KCl, 1.0 to 2.5mM KH 2 PO 4 , 125 to 145 mM NaCl.
  • the kit for producing drug-containing nanoparticles of the present invention includes a drug that is an active ingredient selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof; cationic compounds; Anionic polymer compounds; menstruum; and one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, sugars, surfactants, chelating agents, or combinations thereof, wherein the anionic polymer compound has at least one acid functional group.
  • the particle size of the drug-containing nanoparticles may be defined as a Z-average value, such as 800 nm or less, 600 nm or less, 500 nm or less, or 400 nm or less, and may also be 10 nm or more, 50 nm or less. It may be at least 1 nm, at least 100 nm, at least 150 nm, or at least 200 nm.
  • the particle size of the drug-containing nanoparticles, defined as the Z-average value is, for example, 100 to 800 nm, 100 to 600 nm, 100 to 500 nm, 100 to 400 nm, or 200 to 400 nm. It may be nm.
  • the “chamber” is suitable for containing nanoparticle materials or solvents containing them, and includes, but is not limited to, glass, plastic, paper, packs, etc.
  • the nanoparticle composition for drug delivery according to the second aspect of the present invention includes nanoparticles, wherein the nanoparticles include a cationic compound and an anionic polymer compound, and the nanoparticles do not include a drug.
  • Anionic polymer compounds have at least one acid functional group.
  • the particle size of the nanoparticles can be defined as a Z-average value, such as 800 nm or less, 600 nm or less, 500 nm or less, 400 nm or less, 300 nm or less, 200 nm or less, or 180 nm or less. It may also be 10 nm or more, 50 nm or more, or 100 nm or more. In one embodiment, the particle size of the nanoparticles, defined as the Z-average value, may be, for example, 10 to 800 nm, 10 to 600 nm, 10 to 500 nm, or 10 to 400 nm.
  • the “Z-average” may mean the average of the hydrodynamic diameter of the particle distribution measured using dynamic light scattering (DSL).
  • the nanoparticles have a monodisperse particle distribution, and their polydispersity index may be, for example, 0.05 to 0.8, 0.1 to 0.7, or 0.2 to 0.6.
  • the surface potential of the nanoparticle may be, for example, -50 mV or more, -45 mV or more, -40 mV or more, or -35 mV or more, and may also be 40 mV or less, 30 mV or less, or 20 mV or less. , may be 10 mV or less or 0 mV or less.
  • the surface potential of the nanoparticle may be, for example, -50 to 40 mV, -45 to 30 mV, -40 to 20 mV, -40 to 10 mV, or -35 to 0 mV.
  • the surface potential may be measured in an environment close to a biological environment, for example, in 8 to 12 mM HEPES buffer (pH 7.0 to 7.5).
  • the drug when the particle size and surface potential of the nanoparticles are maintained at the above level, it is desirable in terms of stability of the nanoparticle structure, content of components, absorption in the body, and convenience of sterilization.
  • the drug when the drug is a nucleic acid, one or more ends of the nucleic acid may be modified with one or more selected from the group consisting of cholesterol, tocopherol, and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms.
  • the cholesterol, tocopherol, and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms include analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol, tocopherol, and fatty acids.
  • the cationic compound may be a cationic lipid or a cationic polymer, and more specifically, may be a cationic lipid, and such cationic compound has been specifically described in the first aspect of the present invention. It's like a bar.
  • the anionic polymer compound may be an anionic amphiphilic block copolymer, an anionic hydrophilic polymer, an anionic hydrophobic polymer, or a combination thereof, and such anionic polymer compound is described above in the present invention. As specifically explained in aspect 1.
  • the acid functional group may be derived from an acid selected from the group consisting of inorganic acids, sulfonic acids, carboxylic acids, and combinations thereof, and these acids are as specifically described above in the first aspect of the present invention.
  • the content of the anionic polymer compound in the nanoparticles included in the drug delivery nanoparticle composition of the present invention is 0.01 part by weight or more, 0.03 part by weight or more, or 0.05 part by weight, based on 1 part by weight of the cationic compound. It may be at least 0.07 parts by weight, at least 0.1 parts by weight, at least 0.12 parts by weight, at least 0.15 parts by weight, at least 0.2 parts by weight, at least 0.3 parts by weight, at least 0.4 parts by weight, or at least 0.5 parts by weight, and also at least 15 parts by weight.
  • it may be 10 parts by weight or less, 9 parts by weight or less, 8 parts by weight or less, 7 parts by weight or less, 6 parts by weight or less, 5 parts by weight or less, 4 parts by weight or less, 3 parts by weight or less, or 1 part by weight or less.
  • the amount of the anionic polymer compound is 0.01 to 15 parts by weight, 0.05 to 15 parts by weight, 0.07 to 10 parts by weight, 0.1 to 5 parts by weight, 0.1 to 3 parts by weight, based on 1 part by weight of the cationic compound. Or it may be 0.15 to 1 part by weight.
  • the drug delivery nanoparticle composition of the present invention can be used to easily produce drug-containing nanoparticles simply by mixing it with a drug.
  • the term “simple mixing” can include all acts of “mixing” and means that no specific conditions are attached to the act of mixing. The mixing may be accomplished by various methods such as dropping, stirring (vortexing), decanting, etc., but is not limited thereto.
  • at least 90%, at least 95%, or at least 99% of the theoretically formable amount of drug-containing nanoparticles is rapidly formed, for example, within 1 minute. , can be prepared within 30 seconds, or within 15 seconds.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound form nanoparticles through electrostatic interaction, and the end user can form drug-containing nanoparticles by simply mixing the resulting nanoparticles with the drug. Therefore, according to one embodiment, drug-containing nanoparticles prepared by mixing the drug delivery nanoparticle composition of the present invention and a drug may have at least a portion of the drug bound to the outside of the nanoparticle. This drug-containing nanoparticle structure improves the stability of the drug in the blood or body fluids.
  • the drug may be selected from nucleic acids, polypeptides, viruses, or combinations thereof, and such drugs are as specifically described above in the first aspect of the present invention.
  • the drug is, for example, 30% by weight or less, 20% by weight or less, 10% by weight or less, 5% by weight, based on the total weight of the drug-containing nanoparticles prepared by mixing with the drug delivery nanoparticle composition of the present invention.
  • % or less or 1 weight% or less and may also be 0.001 weight% or more, 0.01 weight% or more, 0.05 weight% or more, 0.1 weight% or more, or 0.15 weight% or more.
  • the drug-containing nanoparticles may include virus 1x10 6 to 1x10 14 VP (Virus particle), 1x10 7 to 1x10 13 VP, 1x10 8 to 1x10 12 VP, or 1x10 9 to 1x10 11 VP. You can.
  • the content of the anionic polymer compound in the nanoparticles included in the drug delivery nanoparticle composition of the present invention may be adjusted depending on the drug.
  • the content of the anionic polymer compound when the drug is a virus, the content of the anionic polymer compound may be 3 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound, and in another embodiment, when the drug is a nucleic acid, the content of the anionic polymer compound may be 3 to 15 parts by weight based on 1 part by weight of the cationic compound.
  • the content of the anionic polymer compound is 0.01 to 15 parts by weight, 0.05 to 15 parts by weight, 0.07 to 10 parts by weight, 0.1 to 5 parts by weight, 0.1 to 3 parts by weight, or 0.15 to 1 part by weight, based on 1 part by weight of the cationic compound. It may be by weight.
  • the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticles prepared by mixing the drug delivery nanoparticle composition of the present invention and the drug is, for example, 25 parts by weight or less, based on 1 part by weight of the drug. It may be 20 parts by weight or less, 15 parts by weight or less, 10 parts by weight or less, or 5 parts by weight or less, and may also be 0.5 parts by weight or more, 1 part by weight or more, 1.5 parts by weight or more, 2 parts by weight or more, or 2.5 parts by weight or more.
  • the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticle is 0.5 to 25 parts by weight, 1 to 20 parts by weight, 1.5 to 15 parts by weight, 2 to 10 parts by weight, based on 1 part by weight of drug. Or it may be 2.5 to 5 parts by weight.
  • the drug is a virus, more specifically an adenovirus
  • the content of the cationic compound is 1 ⁇ g or more, 5 ⁇ g or more, 10 ⁇ g or more, 15 ⁇ g or more, or 18 ⁇ g or more based on 1x10 10 VP of virus, and 150 ⁇ g or more.
  • It may be ⁇ g or less, 100 ⁇ g or less, 50 ⁇ g or less, or 30 ⁇ g or less, for example, 1 ⁇ g to 150 ⁇ g, 5 ⁇ g to 100 ⁇ g, 10 ⁇ g to 50 ⁇ g, 15 ⁇ g to 30 ⁇ g. If the content of the cationic compound in the drug-containing nanoparticle is less than the above range, the drug may not be stably contained in the nanoparticle, and if it exceeds the above range, the size of the drug-containing nanoparticle becomes too large, reducing particle stability. There is a risk that the loss rate may increase during filter sterilization.
  • the cationic compound and the nucleic acid bind through electrostatic interaction.
  • the ratio of the charges of the nucleic acid (P) and the cationic compound (N) is 0.5 or more, 0.7 or more, or 0.9 or more. , or may be 1 or more, and may also be 100 or less, 50 or less, 20 or less, or 10 or less, for example, 0.5 to 100, 0.7 to 50, 0.9 to 20, or 1 to 10.
  • the ratio (N/P) is below the above range, a sufficient amount of nucleic acid may not be included in the drug-containing nanoparticles, whereas if the ratio (N/P) exceeds the above range, there is a risk of causing toxicity. There is.
  • the N/P value may be important in ensuring that the active ingredient is specifically expressed in the spleen.
  • the nanoparticles included in the drug delivery nanoparticle composition of the present invention may additionally contain fusible lipids to increase their intracellular delivery efficiency when mixed with drugs (e.g., mRNA).
  • drugs e.g., mRNA
  • these fusible lipids are as specifically described above in the first aspect of the present invention.
  • the amount of fusible lipid contained in the nanoparticle is 0.01 to 50% by weight, more specifically, based on the total weight of the drug-containing nanoparticle prepared by mixing with the drug (e.g., mRNA). may be 0.1 to 10% by weight.
  • the nanoparticle composition for drug delivery of the present invention may further include an aqueous solution, a water-miscible organic solvent, or a combination thereof, and the aqueous solution and the water-miscible organic solvent are described above in the first method of the present invention. As specifically explained in detail.
  • the cationic compound and the anionic polymer compound may be used to prepare nanoparticles in the form of a solution that has been filtered one or more times. More specifically, the filtration may be performed using a hydrophilic filter, and this hydrophilic filter has been specifically described above in the first aspect of the present invention.
  • the nanoparticle composition for drug delivery of the present invention may additionally contain a stabilizer suitable for improving the stability of the drug, and this stabilizer has been specifically described in the first aspect of the present invention. .
  • the nanoparticle composition for drug delivery of the present invention contains 5 to 15 mM Tris, 5 to 15 mM histidine, 50 to 90 mM NaCl, and 2 to 8% sucrose (w/v) , 0.5 to 1.5 mM MgCl 2 , 0.005 to 0.05% (w/v) PS-80, 0.05 to 0.15 mM EDTA, and 0.1 to 1.0% ethanol (v/v), and the pH is 7.0 to 8.0. It can be.
  • the nanoparticle composition for drug delivery of the present invention is a PBS buffer, for example, pH 7.0 to pH 8.0, 2.0 to 3.5 mM KCl, 1.0 to 2.5mM KH 2 PO 4 , 125 to 145mM NaCl, and 7.5 to 9.5mM Na 2 HPO 4 It may further include a solution containing.
  • the nanoparticle composition for drug delivery of the present invention includes a cationic compound; Anionic polymer compounds; menstruum; and one or more additives selected from pH adjusters, inorganic salts, sugars, surfactants, chelating agents, or combinations thereof, wherein the anionic polymer compound has at least one acid functional group.
  • the particle size of drug-containing nanoparticles prepared by mixing the drug delivery nanoparticle composition of the present invention with a drug can be defined as a Z-average value, for example, 800 nm or less, 600 nm or less, It may be 500 nm or less or 400 nm or less, and may also be 10 nm or more, 50 nm or more, 100 nm or more, 150 nm or more, or 200 nm or more.
  • the particle size of the drug-containing nanoparticles, defined as the Z-average value is, for example, 100 to 800 nm, 100 to 600 nm, 100 to 500 nm, 100 to 400 nm, or 200 to 400 nm. It may be nm.
  • nanoparticle composition for drug delivery 10 mL was prepared.
  • the prepared nanoparticle composition for drug delivery corresponds to the first chamber in the first aspect of the present invention.
  • the nanoparticle composition for drug delivery consists of 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dioTETA) as a cationic compound, monomethoxypolyethylene glycol (number average molecular weight: 2000 g/mol) as a hydrophilic block, and hydrophobic block.
  • dioTETA 1,6-dioleoyl triethylenetetramide
  • monomethoxypolyethylene glycol number average molecular weight: 2000 g/mol
  • hydrophobic block As a block copolymer containing polylactide (number average molecular weight: 1300 g/mol), the hydrophobic block was prepared using an anionic polymer compound (mPEG-PLA-COOH) having a carboxylic acid group derived from succinic acid.
  • dioTETA and mPEG-PLA-COOH were first mixed at a molar ratio of 1/0.03 (number of moles of dioTETA/moles of mPEG-PLA-COOH), and then mixed with RNase-free water.
  • RNase-free water As a freezing aid, sucrose was added to a concentration of 4% (40 mg/mL) in the final solution.
  • the components and contents of the prepared nanoparticle composition for drug delivery are shown in Table 1 below.
  • mRNA solution was prepared by diluting mTrp2 (murine tyrosine-related protein-2) mRNA with PBS. When producing mRNA-nanoparticles, 5 ⁇ g of mRNA was used.
  • the prepared mRNA solution corresponds to the second chamber in the first aspect of the present invention.
  • the prepared drug delivery nanoparticle composition and the mRNA solution are mixed to produce a final drug (Drug Product, DP) containing mRNA-containing nanoparticles.
  • DP drug Product
  • the components and contents of the final drug (DP) prepared are shown in Table 1 below.
  • agarose gel electrophoresis was performed to confirm whether the nanoparticles and mRNA were properly combined.
  • a volume equivalent to 400 ng of mRNA was taken and mixed with the loading dye. Afterwards, it was placed on a 1% agarose gel and electrophoresed at an appropriate voltage and time, and the image of the mRNA band was observed using a UV transilluminator device. At this time, Dyne Gel Safe Red Kit (Dyne Bio) was used as a nucleic acid color reagent.
  • the expression level of reporter protein was utilized using luciferase encoding mRNA.
  • the manufactured drug delivery formulation nanoparticle composition for drug delivery-mRNA formulation
  • Trp2 Turosine-related protein
  • the efficacy of the formulation was evaluated using the mouse-derived murine Trp2 antigen through IFN- ⁇ enzyme linked immunospot (ELISPOT).
  • Nanoparticle composition for drug delivery-mRNA The nanoparticle composition for drug delivery prepared in Example 1 was used in the formulation.
  • an LPX (lipoplex) formulation was used, and liposomes were prepared by mixing the cationic lipid DOTMA (1,2- -di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane) and the Hepler lipid DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) to produce liposome-mRNA. (lipoplex) formulation was prepared ( Nature , 2016, Vol. 534, pages 396-401).
  • Nanoparticle composition for drug delivery-mRNA formulation and control group LPX (i.v. control group) were administered systemically to mice, respectively. 7 days after administration, tissue was extracted and cells were extracted and analyzed to compare immune reactivity. The administered doses were 10, 20, and 20. Immunoreactivity according to the dose was observed at different doses of 40 ⁇ g.
  • a nanoparticle composition for drug delivery was prepared with the composition shown in Table 4 below.
  • the prepared nanoparticle composition for drug delivery corresponds to the first chamber in the first aspect of the present invention.
  • 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dioTETA) was dissolved in 20 mM sodium acetate buffer to prepare a dioTETA solution with a concentration of 5 mg/mL, and the anionic polymer compound was added to the concentration described in Table 4. It was prepared by dissolving in sterile distilled water. Each solution was filtered and sterilized using a 0.22 ⁇ m hydrophilic filter, and each solution was mixed to the ratio shown in Table 5 below. Afterwards, sterilized distilled water and sucrose as a freezing aid were added to a concentration of 4% (40 mg/mL) in the final solution to prepare a nanoparticle composition for drug delivery. The content and final concentration of the prepared nanoparticle composition for drug delivery are shown in Table 5 below.
  • mRNA solution was prepared by diluting 20 ⁇ g Luciferase mRNA (CleanCap®FireFly Luciferase mRNA, 5-methoxyuridine, TriLink, Catalog L-7202) with Phosphate buffer.
  • the prepared mRNA solution corresponds to the second chamber in the first aspect of the present invention.
  • the prepared drug delivery nanoparticle composition and the mRNA solution were mixed with a simple pipette to prepare a final drug product (DP) containing mRNA-containing nanoparticles.
  • the components and contents of the prepared final drug (DP) are shown in Table 5.
  • the nanoparticles of the comparative example include nanoparticles using only cationic compounds without adding polymers (Comparative Example 1) and nanoparticles using amphiphilic polymers (mPEG-PLA (2k-1.7k) without anionic carboxylic acid (Comparative Example) 2), and nanoparticles (Comparative Example 3) to which only hydrophobic polylactide (PLA1.7k) was added without a hydrophilic block were used.
  • agarose gel electrophoresis was performed to confirm whether the nanoparticles and mRNA were properly combined.
  • a volume equivalent to 500ng of mRNA was taken and mixed with the loading dye. Afterwards, it was placed on a 1% agarose gel and electrophoresed at an appropriate voltage and time, and the image of the mRNA band was observed using a UV transilluminator device. At this time, Dyne Gel Safe Red Kit (Dyne Bio) was used as a nucleic acid color reagent.

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Abstract

본 발명은 약물을 함유하는 나노입자를 제조하기 위한 키트 및 약물을 전달하기 위한 나노입자 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 양이온성 화합물과 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 음이온성 고분자 화합물을 포함하는 나노입자를 활용하여 약물의 세포 전달 효율을 증가시킬 수 있도록 설계된 약물-함유 나노입자 제조용 키트 및 약물전달용 나노입자 조성물에 관한 것이다.

Description

약물 함유 나노입자 제조용 키트 및 약물전달용 나노입자 조성물
본 발명은 약물을 함유하는 나노입자를 제조하기 위한 키트 및 약물을 전달하기 위한 나노입자 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 양이온성 화합물과 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 음이온성 고분자 화합물을 포함하는 나노입자를 활용하여 약물의 세포 전달 효율을 증가시킬 수 있도록 설계된 약물-함유 나노입자 제조용 키트 및 약물전달용 나노입자 조성물에 관한 것이다.
핵산을 비롯한 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다. 바이러스성 전달체의 경우 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
핵산 물질의 전달에 이용되는 비바이러스성 전달체로서 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 많은 연구가 진행되어 왔다(De Paula D, Bentley MV, Mahato RI, Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting, RNA 13 (2007) 431-56; Gary DJ, Puri N, Won YY, Polymer-based siRNA delivery: Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery, J Control release 121 (2007) 64-73).
약물을 포함한 나노입자는 보관 환경에 따라 쉽게 안정성을 잃게 되는 경우가 잦으므로, 장기 보관에 취약하고 운송 중에 품질이 손상될 우려가 있다. 또한, 충분한 안정성을 확보하기 위해 복잡한 제조 공정을 필요로 하여 제조하기에 매우 까다로운 특징을 갖는다. 따라서, 보관 환경에 크게 영향을 받지 않고, 최종 소비자가 사용하기에 용이하며, 나아가 약물의 세포 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있는 약물전달용 조성물의 개발이 요청되고 있다.
또한, 최근 들어 환자 맞춤형 백신(Personalized vaccine) 개발이 요구되고, 팬데믹(pandemic) 상황에서 최소한의 공정기간으로 약물이 함유된 나노입자를 환자에게 빠르게 공급되는 것이 중요하다. 그래서, 공정기간을 단축시키고, 더 나아가 약물의 종류와 상관없이 기성품으로 미리 제조된 나노입자를 제공하는 기술이 필요하다.
본 발명의 제1 측면은 약물-함유 나노입자 제조용 키트를 제공하는 것으로, 이에 따르면, 키트 구성성분들을 단순 혼합하는 것만으로 나노입자에 약물을 쉽게 함유시킬 수 있어 최종 소비자가 사용하기에 용이하다. 또한, 약물(예컨대, mRNA)의 종류와 무관하게 약물-함유 나노입자를 사용 직전에 쉽고 빠르게 준비할 수 있으므로 그 보관 또는 운송 환경에 따른 영향 없이 약물을 체내에 효과적으로 전달할 수 있으며, 나아가 약물의 세포 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 제1 측면에 따른 키트에 의하여 형성되는 약물-함유 나노입자는 비장에 특이적으로 전달될 수 있으며, 이로써 항암 백신의 활용가능성을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 측면은 약물전달용 나노입자 조성물을 제공하는 것으로, 이에 따르면, 약물(예컨대, mRNA)의 종류와 무관하게 약물-함유 나노입자를 사용 직전에 쉽고 빠르게 준비할 수 있어 약물이 결정되기만 하면 약물과 단순 혼합하는 것만으로 나노입자에 약물을 쉽게 함유시킬 수 있으므로 약물을 포함하는 나노입자의 제조가 간단하고 최종 소비자가 사용하기에 용이하다. 또한, 약물이, 예컨대, OVA, mTrp2, hTrp2 등 다른 염기서열을 가진 항원 mRNA 등으로 달라져도 안정하고 효능 있는 약물-함유 나노입자를 형성할 수 있어 기성품으로 개발된 나노입자에 다양한 약물의 적용이 가능하며, 또한, 보관 또는 운송 환경에 따른 영향이 적게 받아 약물의 변성 가능성을 최소화하여 환자에게 투여될 수 있고, 나아가 약물의 세포 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 제2 측면에 따른 조성물과 약물을 혼합하여 형성되는 약물-함유 나노입자는 비장에 특이적으로 전달될 수 있으며, 이로써 항암 백신의 활용가능성을 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 제1 측면은, 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하는 나노입자를 포함하는 제1 챔버; 및 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물을 포함하는 제2 챔버;를 포함하며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기(acid functional group)를 갖는 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트를 제공한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 약물-함유 나노입자는 상기 약물을 세포 내로 전달하기 위한 것이다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합이다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 양친성 블록 공중합체는 친수성 블록 및 소수성 블록을 포함한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 친수성 중합체는 친수성 블록만을 포함한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 소수성 중합체는 소수성 블록만을 포함한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 제1 챔버 및 제2 챔버로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상은 추가의 용매를 더 포함한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 용매는 수성 용매, 수혼화성 용매 또는 이의 혼합물이다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 제2 챔버는 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함한다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 약물-함유 나노입자 제조용 키트는, 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물; 양이온성 화합물; 상기 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어진 것일 수 있다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물의 양은 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부일 수 있다.
제1 측면의 일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 제2 측면은, 나노입자를 포함하는 약물전달용 조성물로서, 상기 나노입자가 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하고, 상기 나노입자는 약물을 포함하지 않으며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기(acid functional group)를 갖는 것인, 약물전달용 나노입자 조성물을 제공한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 약물전달용 나노입자 조성물은 약물을 세포 내로 전달하기 위한 것이다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 약물은 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합이다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 양친성 블록 공중합체는 친수성 블록 및 소수성 블록을 포함한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 친수성 중합체는 친수성 블록만을 포함한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 소수성 중합체는 소수성 블록만을 포함한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 약물전달용 나노입자 조성물은 추가의 용매를 더 포함한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 용매는 수성 용매, 수혼화성 용매 또는 이의 혼합물이다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 약물전달용 나노입자 조성물은 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함한다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 약물전달용 나노입자 조성물은, 양이온성 화합물; 상기 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어진 것일 수 있다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물의 양은 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부일 수 있다.
제2 측면의 일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물 및 상기 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 약물-함유 나노입자 제조용 키트는 약물과 나노입자를 별도의 챔버들 내에 분리시켜 포함하므로 보관 또는 운송 환경에 영향받지 않고, 이를 사용하면 약물(예컨대, mRNA)의 종류가 달라져도 최종 사용자가 복잡한 공정을 거치지 않고 챔버의 성분들을 단순 혼합하는 것 만으로 약물-함유 나노입자를 빠르게 제조할 수 있어, 예컨대, 병원에서 환자 맞춤형 백신(Personalized vaccine)이나 팬데믹(pandemic) 상황에서 mRNA와 함께 제조 공정 최적화 없이 치료용 mRNA만 생산되면 본 발명에서 제시한 나노입자와 단순 혼합으로 금방 사람에게 투여할 수 있다. 더 나아가 본 발명에 따른 약물-함유 나노입자 제조용 키트는, 양친성 고분자를 포함하는 키트에 비하여, 약물의 세포 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 나노입자 조성물 제조용 키트에 의하여 형성되는 약물-함유 나노입자는 비장에 특이적으로 전달될 수 있으며, 이로써 항암 백신의 활용가능성을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 측면에 따른 약물전달용 나노입자 조성물은 보관 또는 운송 환경에 영향받지 않고, 이를 사용하면 약물(예컨대, mRNA)의 종류가 달라져도 최종 사용자가 복잡한 공정을 거치지 않고 조성물과 약물을 단순 혼합하는 것 만으로 약물-함유 나노입자를 빠르게 제조할 수 있어, 예컨대, 병원에서 환자 맞춤형 백신(Personalized vaccine)이나 팬데믹(pandemic) 상황에서도 mRNA와 함께 제조 공정 최적화가 필요 없으므로 완성된 mRNA만 생산되면 본 발명의 조성물과 단순 혼합으로 금방 사람에게 투여할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자 조성물은, 양친성 고분자를 포함하는 나노입자 조성물에 비하여, 약물의 세포 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물과 약물을 혼합하여 형성되는 약물-함유 나노입자는 비장에 특이적으로 전달될 수 있으며, 이로써 항암 백신의 활용가능성을 더욱 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 수행된 mRNA-함유 나노입자 제조 여부 확인 실험의 아가로스 겔 전기영동 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2 내지 5 및 비교예 1 내지 3에서 수행된 mRNA-함유 나노입자 제조 여부 확인 실험의 아가로스 겔 전기영동 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[제1 측면: 약물-함유 나노입자 제조용 키트]
본 발명의 제1 측면에 따른 약물-함유 나노입자 제조용 키트는, 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하는 나노입자를 포함하는 제1 챔버; 및 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물을 포함하는 제2 챔버;를 포함하며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기(acid functional group)를 갖는다.
본 발명의 키트는, 두 개 이상의 챔버로 구성되어 있고, 최종 사용자는 상기 챔버들의 내용물들을 단순 혼합함으로써 약물-함유 나노입자를 쉽게 제조할 수 있다. 용어 “단순 혼합”은 “혼합”하는 행위를 모두 포함할 수 있고, 혼합하는 행위에 특정한 조건이 부여되지 않는 것을 의미한다. 상기 혼합은, 점적, 교반(vortexing), 디켄팅 등 다양한 방식에 의해 이루어질 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 키트 사용시, 이론적으로 형성 가능한 양의 90% 이상, 95 % 이상, 또는 99% 이상의 약물-함유 나노입자가 신속히, 예를 들어, 1분 이내, 30초 이내, 또는 15 초 이내에 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물과 상기 음이온성 고분자 화합물은 정전기적 상호작용을 통하여 나노입자를 형성하고, 최종 사용자는 생성된 나노입자와 약물을 단순 혼합하여 약물-함유 나노입자를 형성할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따르면, 본 발명의 키트에 의해 제조되는 약물-함유 나노입자는 약물의 적어도 일부분이 나노입자의 외부에 결합되어 있는 형태일 수 있다. 이러한 약물-함유 나노입자 구조는, 혈중 또는 체액 내에서 약물의 안정성을 향상시킨다.
상기 “핵산”은, 예를 들어, DNA, RNA, siRNA, shRNA, miRNA, mRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “폴리펩티드”는 항체 또는 이의 절편, 시토킨, 호르몬 또는 그 유사체와 같은 체내에 활성을 갖는 단백질, 또는 항원, 이의 유사체 또는 전구체의 폴리펩티드 서열을 포함하여, 체내에서 일련의 과정을 통해 항원으로 인식될 수 있는 단백질을 의미할 수 있다.
상기 “바이러스”는 암살상 바이러스(oncolytic virus)일 수 있고, 예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 단순헤르페스바이러스(HSV) 및 수포성구내염바이러스(VSV)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 암살상 바이러스는 아데노바이러스이다. 본 발명의 구체예에서 사용된 아데노바이러스는 루시퍼라아제 유전자를 포함하고, 이것은 이미징을 통해 확인할 수 있다.
상기 바이러스는 개체의 체내에 여러 종류의 치료 유전자를 발현할 수 있으며, 특정 분자량, 단백질, 생활성 또는 치료 분야에 제한되지 않는다. 예방용 바이러스는 표적 질병에 대해 개체의 체내에 면역을 유발할 수 있다. 질병 예방용 바이러스를 함유하는 나노입자는 바이러스 자체에 의한 면역 유발을 감소시키고, 표적 세포를 지정 또는 확장 가능하며, 재투여시 바이러스에 대한 과면역 반응을 감소시켜 수 회 접종하여 유효한 효과를 얻을 수 있는 장점을 갖는다.
일 예에서, 상기 나노입자의 입자 크기는 Z-평균 값으로 정의될 수 있고, 예컨대, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 200 nm 이하 또는 180 nm 이하일 수 있으며, 또한 10 nm 이상, 50 nm 이상, 또는 100 nm 이상일 수 있다. 일 구체예에서, Z-평균 값으로 정의된 상기 나노입자의 입자 크기는, 예를 들어, 10 내지 800 nm, 10 내지 600 nm, 10 내지 500 nm 또는 10 내지 400 nm일 수 있다.
상기 “Z-평균”은 동적빛산란(Dynamic light scattering, DSL)을 이용하여 측정한 입자 분포의 유체학적 지름(hydrodynamic diameter)의 평균을 의미할 수 있다. 상기 나노입자는 단순분산 입자 분포(monodisperse particle distribution)를 갖는 것으로서, 그 다분산도 지수(polydispersity index)는, 예컨대, 0.05 내지 0.8, 0.1 내지 0.7, 또는 0.2 내지 0.6일 수 있다.
또한, 일 예에서, 상기 나노입자의 표면 전위는, 예컨대, -50 mV 이상, -45 mV 이상, -40 mV 이상 또는 -35 mV 이상일 수 있고, 또한 40 mV 이하, 30 mV 이하, 20 mV 이하, 10 mV 이하 또는 0 mV 이하일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 나노입자의 표면 전위는, 예를 들어, -50 내지 40 mV, -45 내지 30 mV, -40 내지 20 mV, -40 내지 10 mV 또는 -35 내지 0 mV일 수 있다. 상기 표면 전위는 생물학적 환경에 가까운 환경에서 측정된 것일 수 있고, 예를 들어, 8 내지 12 mM HEPES 완충액(pH 7.0 내지 7.5)에서 측정될 수 있다.
나노입자의 입자 크기 및 표면 전위가 상기 수준을 유지할 경우, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 흡수도 및 멸균의 편의성 측면에서 바람직하다. 예를 들어, 상기 약물이 핵산인 경우, 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
상기 약물은, 본 발명의 키트에 의하여 제조되는 약물-함유 나노입자 전체 중량을 기준으로, 예컨대, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 10 중량% 이하, 5 중량% 이하 또는 1 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상 또는 0.15 중량% 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약물은, 약물-함유 나노입자 전체 중량을 기준으로, 예를 들어, 0.001 내지 30 중량%, 0.01 내지 20 중량%, 0.05 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량% 또는 0.15 내지 1 중량%일 수 있다. 약물의 함량이 약물-함유 나노입자 전체 중량을 기준으로 상기 범위보다 적으면 약물에 비하여 전달체로서 사용되는 나노입자의 양이 너무 많아서 오히려 전달체인 나노입자에 의한 부작용이 있을 수 있고, 상기 범위를 초과하면, 약물-함유 나노입자의 크기가 너무 커져 입자 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다. 상기 약물이 바이러스인 경우, 상기 약물-함유 나노입자는 바이러스 1x106 내지 1x1014VP(Virus particle), 1x107 내지 1x1013VP, 1x108 내지 1x1012VP, 또는 1x109 내지 1x1011VP를 포함할 수 있다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양이온성 화합물은 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 종류일 수 있으며, 보다 구체적으로는 양이온성 지질일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나인 양이온성 지질을 사용하는 것이 바람직하다.
이에 따라, 보다 바람직한 일 태양에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
한편, 일 구체예에서, 상기 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 프로타민(protamine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양이온성 지질은 하기 화학식 1의 양이온성 지질일 수 있다:
[화학식 1]
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상기 식에서,
n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이고,
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 6이며,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서, n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서, a 및 b는 각각 독립적으로 2 내지 4일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 라우릴(lauryl), 미리스틸(myristyl), 팔미틸(palmityl), 스테아릴(stearyl), 아라키딜(arachidyl), 베헨닐(behenyl), 리그노세릴(lignoceryl), 세로틸(cerotyl), 미리스트올레일(myristoleyl), 팔미트올레일(palmitoleyl), 사피에닐(sapienyl), 올레일(oleyl), 리놀레일(linoleyl), 아라키도닐(arachidonyl), 에이코사펜타에닐(eicosapentaenyl), 에루실(erucyl), 도코사헥사에닐(docosahexaenyl), 및 세로틸(cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 지질은 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라마이드(N,N'-((ethane-1,2-diylbis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))dioleamide; dioTETA), 1,8-디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))bis(octadeca-9,12-dienamide)), 1,4-디미리스톨레오일디에틸렌트리아마이드((9Z,9'Z)-N,N'-(azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(tetradec-9-enamide)), 1,10-디스테아로일펜타에틸렌헥사마이드(N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)distearamide) 및 1,10-디올레오일펜타에틸렌헥사마이드(N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)dioleamide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 키트에 의하여 제조되는 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량은, 약물 1 중량부를 기준으로, 예컨대, 25 중량부 이하, 20 중량부 이하, 15 중량부 이하, 10 중량부 이하 또는 5 중량부 이하일 수 있고, 또한 0.5 중량부 이상, 1 중량부 이상, 1.5 중량부 이상, 2 중량부 이상 또는 2.5 중량부 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량은, 약물 1 중량부를 기준으로, 0.5 내지 25 중량부, 1 내지 20 중량부, 1.5 내지 15 중량부, 2 내지 10 중량부, 또는 2.5 내지 5 중량부일 수 있다. 한편, 약물이 바이러스, 보다 구체적으로 아데노바이러스인 경우, 바이러스 1x1010VP를 기준으로 상기 양이온성 화합물의 함량은 1㎍ 이상, 5㎍ 이상, 10㎍ 이상, 15㎍ 이상 또는 18㎍ 이상이면서, 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 또는 30㎍ 이하로서, 예를 들어, 1 ㎍ 내지 150 ㎍, 5 ㎍ 내지 100 ㎍, 10 ㎍ 내지 50 ㎍, 15 ㎍ 내지 30 ㎍일 수 있다. 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량이 상기 범위 미만이면 약물이 나노입자 내에 안정하게 포함되지 못할 수 있고, 상기 범위를 초과하면 약물-함유 나노입자의 크기가 너무 커져 입자 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 약물이 핵산인 경우, 상기 양이온성 화합물과 핵산은 정전기적 상호작용을 통해 결합한다. 일 구체예에서, 상기 핵산(P)과 양이온성 화합물(N)의 전하량의 비율(N/P; 핵산의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.5 이상, 0.7 이상, 0.9 이상, 또는 1 이상일 수 있고, 또한 100 이하, 50 이하, 20 이하 또는 10 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 내지 100, 0.7 내지 50, 0.9 내지 20 또는 1 내지 10일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 상기 범위 미만인 경우에는 충분한 양의 핵산이 약물-함유 나노입자 내에 포함되지 못할 수 있는 반면, 상기 비율(N/P)이 상기 범위를 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있다. 또한, N/P 값은 유효성분이 비장에서 특이적으로 발현하는데 중요하게 작용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 양친성 블록 공중합체는, 친수성 블록 및 소수성 블록을 포함하는 블록 공중합체(예컨대, 친수성 블록(A) 및 소수성 블록(B)를 포함하는 A-B 형 블록 공중합체)이며, 여기서 상기 친수성 블록 또는 소수성 블록은 적어도 하나의 산 작용기를 가지며, 일 구체예에 따르면, 상기 소수성 블록이 적어도 하나의 산 작용기를 가질 수 있다. 이러한 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 친수성 중합체는, 친수성 블록만을 포함하는 중합체이며, 여기서 친수성 블록은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는다. 이러한 친수성 중합체는, 수용액 상에서 산 작용기가 양이온성 지질과 정전기적 상호작용을 하여 친수성 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 소수성 중합체는, 소수성 블록만을 포함하는 중합체이며, 여기서 소수성 블록은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는다. 이러한 소수성 중합체의 산 작용기가 양이온성 지질과 정전기적 상호작용을 하여 소수성 블록이 코어(내벽)를 형성하는 쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
일 구체예에서, 상기 친수성 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 친수성 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜(mPEG), 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸옥사졸린(PEOz), 폴리메틸옥사졸린(PMOz), 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 친수성 블록의 수평균분자량(g/mol)은 200 이상, 500 이상, 1,000 이상 또는 1,500 이상일 수 있고, 또한, 50,000 이하, 20,000 이하, 10,000 이하 또는 5,000 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 필요에 따라, 상기 친수성 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 고분자 나노입자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 나노입자 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 블록은 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일 구체예에서, 이는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 소수성 블록은 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 소수성 블록의 수평균분자량(g/mol)은 200 이상, 500 이상, 700 이상 또는 1,000 이상일 수 있고, 또한, 50,000 이하, 20,000 이하, 10,000 이하 또는 6,000 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 일 구체예에서, 상기 소수성 블록은, 그 말단의 히드록시기에 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 수식된 것일 수 있다.
상기 친수성 블록은 산 작용기를 갖지 않거나 적어도 하나의 산 작용기를 가질 수 있고, 상기 소수성 블록 또한 산 작용기를 갖지 않거나 적어도 하나의 산 작용기를 가질 수 있으나, 단, 상기 친수성 블록과 소수성 블록 중 적어도 하나는 적어도 하나의 산 작용기를 가진다.
일 구체예에서, 상기 산 작용기는 무기산, 설폰산, 카르복시산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산으로부터 유래된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 무기산은 인산(phosphoric acid), 질산(nitric acid), 크롬산(chromic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 설폰산은 메탄설폰산(methanesulfonic acid), 에탄설폰산(ethanesulfonic acid), 벤젠설폰산(benzenesulfonic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 카르복시산은 아세트산(acetic acid), 시트르산(citric acid), 글루콘산(gluconic acid), 락트산(lactic acid), 옥살산(oxalic acid), 타르타르산(tartaric acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 프탈산(phthalic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 일 태양에서, 상기 음이온성 양친성 블록 공중합체는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol)인 친수성 블록과 소수성 블록인 폴리락타이드(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol) 또는 폴리카프로락톤(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol)으로 구성된 A-B형 공중합체이며, 상기 소수성 블록이 숙신산으로부터 유래된 카르복시산기를 갖는 것일 수 있다.
바람직한 일 태양에서, 상기 음이온성 친수성 중합체는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol) 또는 폴리메틸옥사졸린(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol) 또는 폴리에틸옥사졸린(수평균분자량: 300 내지 10,000 g/mol)인 친수성 블록으로 구성된 중합체이며, 숙신산으로부터 유래된 카르복시산기를 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1 챔버 내에 포함되는 상기 양이온성 화합물 1몰에 대한 상기 음이온성 고분자 화합물의 몰 비는 0.01 이상, 0.015 이상, 0.02 이상, 0.025 이상 또는 0.03 이상일 수 있고, 또한 1 이하, 0.95 이하, 0.9 이하, 0.85 이하, 0.8 이하 또는 0.75 이하일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제1 챔버 내에 포함되는 상기 양이온성 화합물 1몰에 대한 상기 음이온성 고분자 화합물의 몰 비는 0.01 내지 1, 또는 0.02 내지 0.9, 또는 0.03 내지 0.8일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명의 키트에 의한 mRNA의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여, 상기 제1 챔버 내의 나노입자는 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1 챔버 내의 나노입자에 포함되는 융합성 지질의 양은, 본 발명의 키트에 의하여 제조되는 약물-함유 나노입자의 총중량을 기준으로, 0.01 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10 중량%일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 융합성 지질은 양이온성 화합물과의 소수성 상호작용으로 결합하여 나노입자 구조를 형성한다.
일 구체예에서, 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
보다 더 구체적으로, 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일 포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디팔미토올레오일 포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일 포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일 포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일 포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC) 및 디팔미토올레오일 포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 키트에 의하여 제조되는 약물-함유 나노입자 내의 구성 성분 중, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로, 0.01 중량부 이상, 0.03 중량부 이상, 0.05 중량부 이상, 0.07 중량부 이상, 0.1 중량부 이상, 0.12 중량부 이상, 0.15 중량부 이상, 0.2 중량부 이상, 0.3 중량부 이상, 0.4 중량부 이상 또는 0.5 중량부 이상일 수 있고, 또한 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 9 중량부 이하, 8 중량부 이하, 7 중량부 이하, 6 중량부 이하, 5 중량부 이하, 4 중량부 이하, 3 중량부 이하 또는 1 중량부 이하일 수 있다. 또한, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은 상기한 범위 내에서 약물에 따라 조절될 수도 있다. 예를 들어, 일 구체예에서 약물이 바이러스인 경우, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 3 내지 15 중량부일 수 있고, 다른 구체예에서 약물이 핵산인 경우, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부, 0.05 내지 15 중량부, 0.07 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부, 0.1 내지 3 중량부, 또는 0.15 내지 1 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1 챔버 및/또는 제2 챔버는 수성 용액, 수혼화성 유기용매 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 “수성 용액”은 수용액과 같은 의미로 사용될 수 있고, 예를 들어, 물, 멸균정제수, 완충액, 주사액 등을 의미할 수 있으며, 유기산을 더 포함한 완충액일 수도 있다. 상기 수성 용액은 예를 들어, 시트르산 완충액, PBS 완충액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “수혼화성 유기용매”는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 이의 수혼합물 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 여과는 친수성 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 친수성 필터의 재질로는 예를 들어, 나일론, 혼합형 셀룰로오스 에스테르(Mixed Cellulose Ester, MCE), 폴리에틸설폰(PES), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoridem PVDF), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate, CA), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 제한되지 않는다. 친수성 필터한 경우, 약물이 보다 성공적으로 나노입자 내에 포함될 수 있고, 약물-함유 나노입자의 안정성이 증가할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제2 챔버는 약물의 안정성을 향상시키는데 적절한 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 안정화제는, pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 등을 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 “당류”는 단당류, 이당류, 이들의 환원당인 당알코올, 단일 또는 혼합된 다수 당의 폴리머 등을 의미할 수 있고, 상기 다당류는 3당류 이상 당류를 의미할 수 있다. 상기 단당류는, 예를 들어, 만노스, 글루코스, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스 등이 있고; 상기 이당류로는, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 멜리보우스 등이 있고; 상기 당알코올은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 등이 있고; 상기 다당류로는, 라피노스, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, 셀룰로스, 헤타스타치, 올리고당이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “조절제”는 트리스(Tris), 글라이신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 아스파르테이트 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 “계면활성제”는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트, 디옥틸나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 벤즈알코늄 클로라이드, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “킬레이트제”는 구연산, 폴리페놀릭산, EDTA, DTPA, EDDHA 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “무기염”은 1가 또는 2가 금속의 염을 의미하는 것으로서, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, MgSO4, CaSO4, CaCO3, MgCO3 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 약물이 바이러스인 경우, 상기 제2 챔버는 5 내지 15 mM Tris, 5 내지 15 mM 히스티딘, 50 내지 90 mM NaCl, 2 내지 8% 수크로오스 (w/v), 0.5 내지 1.5 mM MgCl2, 0.005 내지 0.05% (w/v) PS-80, 0.05 내지 0.15 mM EDTA, 및 0.1 내지 1.0% 에탄올 (v/v)를 더 포함할 수 있고, pH는 7.0 내지 8.0일 수 있다. 다른 구체예에서, 약물이 핵산인 경우, 상기 제2 챔버는 PBS 완충액, 예를 들어, PH 7.0 내지 pH 8.0, 2.0 내지 3.5 mM KCl, 1.0 내지 2.5mM KH2PO4, 125 내지 145 mM NaCl, 및 7.5 내지 9.5 mM Na2HPO4를 포함하는 용액을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물-함유 나노입자 제조용 키트는, 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물; 양이온성 화합물; 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어질 수 있으며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 것이다.
일 예에서, 상기 약물-함유 나노입자의 입자 크기는 Z-평균 값으로 정의될 수 있고, 예컨대, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하 또는 400 nm 이하일 수 있으며, 또한 10 nm 이상, 50 nm 이상, 100 nm 이상, 150 nm 이상, 또는 200 nm 이상일 수 있다. 일 구체예에서, Z-평균 값으로 정의된 상기 약물-함유 나노입자의 입자 크기는, 예를 들어, 100 내지 800 nm, 100 내지 600 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm 또는 200 내지 400 nm일 수 있다.
상기 “챔버”는 나노입자의 재료 또는 이를 함유하는 용매를 담기에 적절한 것으로서, 유리, 플라스틱, 종이, 팩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
[제2 측면: 약물전달용 나노입자 조성물]
본 발명의 제2 측면에 따른 약물전달용 나노입자 조성물은 나노입자를 포함하며, 상기 나노입자가 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하고, 상기 나노입자는 약물을 포함하지 않으며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기(acid functional group)를 갖는다.
일 예에서, 상기 나노입자의 입자 크기는 Z-평균 값으로 정의될 수 있고, 예컨대, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 200 nm 이하 또는 180 nm 이하일 수 있으며, 또한 10 nm 이상, 50 nm 이상, 또는 100 nm 이상일 수 있다. 일 구체예에서, Z-평균 값으로 정의된 상기 나노입자의 입자 크기는, 예를 들어, 10 내지 800 nm, 10 내지 600 nm, 10 내지 500 nm 또는 10 내지 400 nm일 수 있다.
상기 “Z-평균”은 동적빛산란(Dynamic light scattering, DSL)을 이용하여 측정한 입자 분포의 유체학적 지름(hydrodynamic diameter)의 평균을 의미할 수 있다. 상기 나노입자는 단순분산 입자 분포(monodisperse particle distribution)를 갖는 것으로서, 그 다분산도 지수(polydispersity index)는, 예컨대, 0.05 내지 0.8, 0.1 내지 0.7, 또는 0.2 내지 0.6일 수 있다.
또한, 일 예에서, 상기 나노입자의 표면 전위는, 예컨대, -50 mV 이상, -45 mV 이상, -40 mV 이상 또는 -35 mV 이상일 수 있고, 또한 40 mV 이하, 30 mV 이하, 20 mV 이하, 10 mV 이하 또는 0 mV 이하일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 나노입자의 표면 전위는, 예를 들어, -50 내지 40 mV, -45 내지 30 mV, -40 내지 20 mV, -40 내지 10 mV 또는 -35 내지 0 mV일 수 있다. 상기 표면 전위는 생물학적 환경에 가까운 환경에서 측정된 것일 수 있고, 예를 들어, 8 내지 12 mM HEPES 완충액(pH 7.0 내지 7.5)에서 측정될 수 있다.
나노입자의 입자 크기 및 표면 전위가 상기 수준을 유지할 경우, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 흡수도 및 멸균의 편의성 측면에서 바람직하다. 예를 들어, 상기 약물이 핵산인 경우, 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물은 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 종류일 수 있고, 보다 구체적으로는 양이온성 지질일 수 있으며, 이러한 양이온성 화합물에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이러한 음이온성 고분자 화합물에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 산 작용기는 무기산, 설폰산, 카르복시산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산으로부터 유래된 것일 수 있으며, 이러한 산에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물에 포함되는 나노입자 내의 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로, 0.01 중량부 이상, 0.03 중량부 이상, 0.05 중량부 이상, 0.07 중량부 이상, 0.1 중량부 이상, 0.12 중량부 이상, 0.15 중량부 이상, 0.2 중량부 이상, 0.3 중량부 이상, 0.4 중량부 이상 또는 0.5 중량부 이상일 수 있고, 또한 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 9 중량부 이하, 8 중량부 이하, 7 중량부 이하, 6 중량부 이하, 5 중량부 이하, 4 중량부 이하, 3 중량부 이하 또는 1 중량부 이하일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 음이온성 고분자 화합물의 양은 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부, 0.05 내지 15 중량부, 0.07 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부, 0.1 내지 3 중량부, 또는 0.15 내지 1 중량부일 수 있다.
본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은 약물과 단순 혼합하는 것만으로 약물-함유 나노입자를 쉽게 제조할 수 있다. 용어 “단순 혼합”은 “혼합”하는 행위를 모두 포함할 수 있고, 혼합하는 행위에 특정한 조건이 부여되지 않는 것을 의미한다. 상기 혼합은, 점적, 교반(vortexing), 디켄팅 등 다양한 방식에 의해 이루어질 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물 사용시, 이론적으로 형성 가능한 양의 90% 이상, 95 % 이상, 또는 99% 이상의 약물-함유 나노입자가 신속히, 예를 들어, 1분 이내, 30초 이내, 또는 15 초 이내에 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 양이온성 화합물과 음이온성 고분자 화합물은 정전기적 상호작용을 통하여 나노입자를 형성하고, 최종 사용자는 생성된 나노입자와 약물을 단순 혼합하여 약물-함유 나노입자를 형성할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따르면, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물과 약물의 혼합에 의해 제조되는 약물-함유 나노입자는 약물의 적어도 일부분이 나노입자의 외부에 결합되어 있는 형태일 수 있다. 이러한 약물-함유 나노입자 구조는, 혈중 또는 체액 내에서 약물의 안정성을 향상시킨다.
일 구체예에서, 상기 약물은 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것일 수 있으며, 이러한 약물에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
상기 약물은, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물과의 혼합에 의해 제조되는 약물-함유 나노입자 전체 중량을 기준으로, 예컨대, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 10 중량% 이하, 5 중량% 이하 또는 1 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상 또는 0.15 중량% 이상일 수 있다. 약물의 함량이 약물-함유 나노입자 전체 중량을 기준으로 상기 범위보다 적으면 약물에 비하여 전달체로서 사용되는 나노입자의 양이 너무 많아서 오히려 전달체인 나노입자에 의한 부작용이 있을 수 있고, 상기 범위를 초과하면, 약물-함유 나노입자의 크기가 너무 커져 입자 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다. 상기 약물이 바이러스인 경우, 상기 약물-함유 나노입자는 바이러스 1x106 내지 1x1014VP(Virus particle), 1x107 내지 1x1013VP, 1x108 내지 1x1012VP, 또는 1x109 내지 1x1011VP를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물에 포함되는 나노입자 내의 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은 약물에 따라 조절될 수도 있다. 예를 들어, 일 구체예에서 약물이 바이러스인 경우, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 3 내지 15 중량부일 수 있고, 다른 구체예에서 약물이 핵산인 경우, 상기 음이온성 고분자 화합물의 함량은, 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부, 0.05 내지 15 중량부, 0.07 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부, 0.1 내지 3 중량부, 또는 0.15 내지 1 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물과 약물의 혼합에 의해 제조되는 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량은, 약물 1 중량부를 기준으로, 예컨대, 25 중량부 이하, 20 중량부 이하, 15 중량부 이하, 10 중량부 이하 또는 5 중량부 이하일 수 있고, 또한 0.5 중량부 이상, 1 중량부 이상, 1.5 중량부 이상, 2 중량부 이상 또는 2.5 중량부 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량은, 약물 1 중량부를 기준으로, 0.5 내지 25 중량부, 1 내지 20 중량부, 1.5 내지 15 중량부, 2 내지 10 중량부, 또는 2.5 내지 5 중량부일 수 있다. 한편, 약물이 바이러스, 보다 구체적으로 아데노바이러스인 경우, 바이러스 1x1010VP를 기준으로 상기 양이온성 화합물의 함량은 1㎍ 이상, 5㎍ 이상, 10㎍ 이상, 15㎍ 이상 또는 18㎍ 이상이면서, 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 또는 30㎍ 이하로서, 예를 들어, 1 ㎍ 내지 150 ㎍, 5 ㎍ 내지 100 ㎍, 10 ㎍ 내지 50 ㎍, 15 ㎍ 내지 30 ㎍일 수 있다. 약물-함유 나노입자 내의 상기 양이온성 화합물의 함량이 상기 범위 미만이면 약물이 나노입자 내에 안정하게 포함되지 못할 수 있고, 상기 범위를 초과하면 약물-함유 나노입자의 크기가 너무 커져 입자 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 약물이 핵산인 경우, 상기 양이온성 화합물과 핵산은 정전기적 상호작용을 통해 결합한다. 일 구체예에서, 상기 핵산(P)과 양이온성 화합물(N)의 전하량의 비율(N/P; 핵산의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.5 이상, 0.7 이상, 0.9 이상, 또는 1 이상일 수 있고, 또한 100 이하, 50 이하, 20 이하 또는 10 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 내지 100, 0.7 내지 50, 0.9 내지 20 또는 1 내지 10일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 상기 범위 미만인 경우에는 충분한 양의 핵산이 약물-함유 나노입자 내에 포함되지 못할 수 있는 반면, 상기 비율(N/P)이 상기 범위를 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있다. 또한, N/P 값은 유효성분이 비장에서 특이적으로 발현하는데 중요하게 작용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물에 포함되는 나노입자는, 약물(예컨대, mRNA)과 혼합시 그의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여, 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 융합성 지질에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 나노입자에 포함되는 융합성 지질의 양은, 약물(예컨대, mRNA)과의 혼합에 의하여 제조되는 약물-함유 나노입자의 총중량을 기준으로, 0.01 내지 50중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10중량%일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은 수성 용액, 수혼화성 유기용매 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 수성 용액 및 수혼화성 유기용매에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 여과는 친수성 필터를 사용하여 수행될 수 있으며, 이러한 친수성 필터에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은 약물의 안정성을 향상시키는데 적절한 안정화제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 안정화제에 대해서는 앞서 본 발명의 제1 측면에서 구체적으로 설명한 바와 같다.
예를 들어, 혼합될 약물이 바이러스인 경우, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은 5 내지 15 mM Tris, 5 내지 15 mM 히스티딘, 50 내지 90 mM NaCl, 2 내지 8% 수크로오스 (w/v), 0.5 내지 1.5 mM MgCl2, 0.005 내지 0.05% (w/v) PS-80, 0.05 내지 0.15 mM EDTA, 및 0.1 내지 1.0% 에탄올 (v/v)를 더 포함할 수 있고, pH는 7.0 내지 8.0일 수 있다. 다른 구체예에서, 혼합될 약물이 핵산인 경우, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은 PBS 완충액, 예를 들어, PH 7.0 내지 pH 8.0, 2.0 내지 3.5 mM KCl, 1.0 내지 2.5mM KH2PO4, 125 내지 145 mM NaCl, 및 7.5 내지 9.5 mM Na2HPO4를 포함하는 용액을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물은, 양이온성 화합물; 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어질 수 있으며, 여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 것이다.
일 예에서, 본 발명의 약물전달용 나노입자 조성물과 약물의 혼합에 의해 제조되는 약물-함유 나노입자의 입자 크기는 Z-평균 값으로 정의될 수 있고, 예컨대, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하 또는 400 nm 이하일 수 있으며, 또한 10 nm 이상, 50 nm 이상, 100 nm 이상, 150 nm 이상, 또는 200 nm 이상일 수 있다. 일 구체예에서, Z-평균 값으로 정의된 상기 약물-함유 나노입자의 입자 크기는, 예를 들어, 100 내지 800 nm, 100 내지 600 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm 또는 200 내지 400 nm일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1
(1) 약물전달용 나노입자 조성물의 제조
약물전달용 나노입자 조성물 10 mL를 제조하였다. 제조된 약물전달용 나노입자 조성물은 본 발명의 제1 측면에 있어서 제1 챔버에 해당하는 것이다.
약물전달용 나노입자 조성물은, 양이온성 화합물로서 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드(dioTETA)와, 친수성 블록으로서 모노메톡시폴리에틸렌클리콜(수평균분자량: 2000 g/mol)과 소수성 블록으로서 폴리락타이드(수평균분자량: 1300 g/mol)를 포함하는 블록 공중합체로서, 소수성 블록이 숙신산으로부터 유래된 카르복시산기를 갖는 음이온성 고분자 화합물(mPEG-PLA-COOH)를 사용하여 제조하였다.
구체적으로는, dioTETA와 mPEG-PLA-COOH를 1/0.03의 몰 비율(dioTETA 몰수/mPEG-PLA-COOH 몰수)로 먼저 혼합한 뒤, 여기에 RNA 분해효소가 없는 물(RNase-free water)와 동결 보조제로서 수크로스(sucrose)를 최종 용액 내 4 %(40 mg/mL) 농도가 되도록 넣어주었다. 제조된 약물전달용 나노입자 조성물의 성분 및 그 함량을 하기 표 1에 나타내었다.
(2) mRNA 용액의 제조
mTrp2(murine tyrosine-related protein-2) mRNA를 PBS로 희석하여 mRNA 용액을 준비하였다. mRNA-나노입자 제조 시 5 μg의 mRNA를 사용하였다. 제조된 mRNA 용액은 본 발명의 제1 측면에 있어서 제2 챔버에 해당하는 것이다.
(3) mRNA-함유 나노입자의 제조
상기 준비된 약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액(각각, 제1 측면에 있어서 제1 챔버 및 제2 챔버에 해당)을 혼합하여, mRNA-함유 나노입자를 포함하는 최종 약물(Drug Product, DP)를 제조하였다(N/P ratio=2.5). 제조된 최종 약물(DP)의 성분 및 그 함량을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000002
약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액의 혼합 후, 나노입자가 형성되었는지 확인하기 위해 입도 분석기(Dynamic light scattering, DLS)를 통해 입자 크기(Size), 입도 분포(PDI) 및 표면 전하(Zeta potential)를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 따르면, 단순 혼합 후에도 입자가 균일하게 형성되었음을 확인하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000003
(4) mRNA-함유 나노입자 제조 여부 확인 실험
약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액을 혼합했을 때, 나노입자와 mRNA가 정상적으로 결합되었는지 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. 나노입자 조성물과 mRNA 용액을 단순히 혼합한 뒤, mRNA 400 ng에 해당하는 부피를 취하여 loading dye와 혼합하였다. 이후 1% 아가로스 겔에 취하여 적정 전압과 시간으로 전기영동 후, UV transilluminator 장치를 통해 mRNA band의 이미지를 관찰하였다. 이때 핵산염색시약으로 Dyne Gel Safe Red Kit(Dyne Bio)를 사용하였다.
측정 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면, 실시예 1에서는 나노입자와 mRNA와의 높은 결합력으로 인해 노출된 mRNA band가 거의 나타나지 않았다.
(5) 제형의 면역 반응 유도 효과 확인 실험
제형 평가 screening시 luciferase encoding mRNA를 사용하여 reporter protein의 발현 정도를 활용하였다. 제조된 약물 전달 제형(약물전달용 나노입자 조성물-mRNA 제형)으로 실제로 약물이 비장(spleen)에 전달되어 면역 반응을 일으키는지를 평가하고, 흑색종(melanoma)에 중요한 인자인 Trp2(Tyrosine-related protein 2) 항원에 대한 면역 반응 효과를 확인해 보고자, 마우스 유래 murine Trp2 항원을 사용하여 제형의 효능을 IFN-γenzyme linked immunospot(ELISPOT)를 통하여 평가하였다.
약물전달용 나노입자 조성물-mRNA 제형에는 실시예 1에서 제조한 약물전달용 나노입자 조성물을 사용하였다. 대조군으로는 LPX(lipoplex) 제형을 사용하였으며, 양이온성 지질 DOTMA(1,2- -di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane)와 Hepler lipid DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)를 혼합한 liposome을 제조해 liposome-mRNA(lipoplex) 제형을 제조하였다 ( Nature , 2016, Vol.　534,　pages 396-401).
약물전달용 나노입자 조성물-mRNA 제형과 대조군인 LPX(i.v. 대조군)를 각각 마우스에 전신 투여하였고, 투여 7일 후 조직 적출 및 세포 추출한 후 분석하여 면역 반응성을 비교하였으며, 투여 dose를 10, 20, 40 μg으로 달리하여 투여량에 따른 면역 반응성을 관찰하였다.
결과를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에 따르면, 약물전달용 나노입자 조성물-mRNA 제형은 투여량에 따라 뚜렷한 경향성을 보였고, 모든 투여 용량에서 대조군보다 높은 면역 반응성을 나타내었음을 확인하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000004
실시예 2 내지 5 및 비교예 1 내지 3
(1) 약물 전달용 나노입자 조성물의 제조
하기 표 4의 조성으로 약물 전달용 나노입자 조성물을 제조하였다. 제조된 약물전달용 나노입자 조성물은 본 발명의 제1 측면에 있어서 제1 챔버에 해당하는 것이다.
구체적으로는, 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드(dioTETA)를 20 mM 아세트산나트륨 버퍼에 녹여 5 mg/mL 농도의 dioTETA 용액을 준비하고, 음이온성 고분자 화합물을 표 4에 기술된 농도로 멸균 증류수에 녹여 준비하였다. 각 용액을 0.22 μm 친수성 필터를 사용하여 여과 및 멸균하였고, 하기 표 5의 비율이 되도록 각 용액을 혼합하였다. 이후 멸균 증류수와 동결 보조제로서 수크로스(sucrose)를 최종 용액 내 4 %(40 mg/mL) 농도가 되도록 넣어 약물전달용 나노입자 조성물을 제조하였다. 제조된 약물전달용 나노입자 조성물의 함량 및 최종 농도를 하기 표 5에 나타내었다.
[표 4]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000005
[표 5]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000006
(2) mRNA 용액의 제조
20 μg Luciferase mRNA(CleanCap®FireFly Luciferase mRNA, 5-methoxyuridine, TriLink, Catalog L-7202)를 Phosphate buffer로 희석하여 mRNA 용액을 준비하였다. 제조된 mRNA 용액은 본 발명의 제1 측면에 있어서 제2 챔버에 해당하는 것이다.
(3) mRNA-함유 나노입자의 제조
상기 준비된 약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액을 단순 파이펫 혼합하여, mRNA-함유 나노입자를 포함하는 최종 약물(Drug Product, DP)를 제조하였다. 제조된 최종 약물(DP)의 성분 및 그 함량을 표 5에 나타내었다.
약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액의 혼합 후, 나노입자가 형성되었는지 확인하기 위해 입도 분석기(Dynamic light scattering, DLS)를 통해 입자 크기(Size), 입도 분포(PDI) 및 전하(Zeta potential)를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 표 6에 따르면, 단순 혼합 후에도 입자가 안정적으로 형성되었음을 확인하였다. 비교예의 나노입자로는 고분자를 첨가하지 않고 양이온성 화합물만 사용한 나노입자(비교예 1)와 음이온성 카르복시산이 없는 양친성 고분자(mPEG-PLA(2k-1.7k)를 첨가한 나노입자(비교예 2), 그리고 친수성 블록 없이 소수성 폴리락타이드(PLA1.7k)만을 첨가한 나노입자(비교예 3)를 사용하였다.
[표 6]
Figure PCTKR2023010824-appb-img-000007
(4) mRNA-함유 나노입자 제조 여부 확인 실험
약물전달용 나노입자 조성물과 mRNA 용액을 혼합했을 때, 나노입자와 mRNA가 정상적으로 결합되었는지 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. 약물 전달용 조성물과 mRNA 용액을 단순히 혼합한 뒤, mRNA 500ng에 해당하는 부피를 취하여 loading dye와 혼합하였다. 이후 1% 아가로스 겔에 취하여 적정 전압과 시간으로 전기영동 후, UV transilluminator 장치를 통해 mRNA band의 이미지를 관찰하였다. 이때 핵산염색시약으로 Dyne Gel Safe Red Kit(Dyne Bio)를 사용하였다.
측정 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 따르면, 실시예 2~5에서는 나노입자와 mRNA와의 높은 결합력으로 인해 노출된 mRNA band가 거의 나타나지 않았다. 반면, 비교예 1~3에서는 mRNA와의 상대적으로 낮은 결합력으로 인해 노출된 mRNA band가 관찰되었다.

Claims (20)

  1. 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하는 나노입자를 포함하는 제1 챔버; 및
    핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물을 포함하는 제2 챔버;를 포함하며,
    여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 것인,
    약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물-함유 나노입자는 상기 약물을 세포 내로 전달하기 위한 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 음이온성 양친성 블록 공중합체는 친수성 블록 및 소수성 블록을 포함하고,
    상기 음이온성 친수성 중합체는 친수성 블록만을 포함하며,
    상기 음이온성 소수성 중합체는 소수성 블록만을 포함하는,
    약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 친수성 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 소수성 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인,
    약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 친수성 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸옥사졸린, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 소수성 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인,
    약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 산 작용기는 무기산, 설폰산, 카르복시산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산으로부터 유래된 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 무기산은 인산, 질산, 크롬산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 설폰산은 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며,
    상기 카르복시산은 아세트산, 시트르산, 글루콘산, 락트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 프탈산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인,
    약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 챔버 및 제2 챔버로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상은 추가의 용매를 더 포함하는 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 용매는 수성 용매, 수혼화성 용매 또는 이의 혼합물인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2 챔버는 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  12. 제1항에 있어서, 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유효성분인 약물; 양이온성 화합물; 상기 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어진 것인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  13. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자 화합물의 양은 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부인, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  14. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용된, 약물-함유 나노입자 제조용 키트.
  15. 나노입자를 포함하는 약물전달용 조성물로서,
    상기 나노입자가 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물을 포함하고,
    상기 나노입자는 약물을 포함하지 않으며,
    여기서, 상기 음이온성 고분자 화합물은 적어도 하나의 산 작용기를 갖는 것인,
    약물전달용 나노입자 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 음이온성 고분자 화합물은, 음이온성 양친성 블록 공중합체, 음이온성 친수성 중합체, 음이온성 소수성 중합체, 또는 이들의 조합인, 약물전달용 나노입자 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 산 작용기는 무기산, 설폰산, 카르복시산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산으로부터 유래된 것인, 약물전달용 나노입자 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 양이온성 화합물; 상기 음이온성 고분자 화합물; 용매; 및 pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제;로 이루어진 것인, 약물전달용 나노입자 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 음이온성 고분자 화합물의 양은 상기 양이온성 화합물 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 15 중량부인, 약물전달용 나노입자 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 양이온성 화합물 및 음이온성 고분자 화합물은 1회 이상 여과된 용액의 형태로 나노입자의 제조에 사용된, 약물전달용 나노입자 조성물.
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