WO2019093802A2 - 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 조성물 및 방법 - Google Patents

음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 조성물 및 방법 Download PDF

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lipid
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김상훈
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Definitions

  • the present invention relates to a freeze-dried composition and method for anionic drug delivery lipid nanoparticles (LNP), and more particularly to a freeze-dried composition for freeze-drying lipid nanoparticles (LNP) for anionic drug delivery, lyoprotectant composition and a freeze-drying method using the same.
  • LNP anionic drug delivery lipid nanoparticles
  • Medicines are usually made into a finished product as a desiccant.
  • conventional drying methods such as vacuum drying, spray drying and freeze drying may be used.
  • the freeze-drying method is a method in which a preparation containing water is prepared, rapidly frozen to a temperature of -80 ⁇ or lower, and then dried at a temperature of 0 ⁇ or lower.
  • a protective agent is used during such freeze-drying.
  • additives refers to a substance that is added to increase the usability of stability, safety, and quality when formulating a drug, and the quality of the drug is controlled by using the additive when the drug is formulated. Safety must also be established.
  • Sugar alcohols such as mannitol, sucrose, sucrose, and trehalose, sugars and the like are widely used as protective agents for the freeze-drying of lipid nanoparticles. According to the presently reported results, the above additives are added at various concentrations (0.1% to 20% / W), but the stabilization effect is insufficient.
  • an anionic drug of the nucleic acid type may exhibit structural changes during freezing or lyophilization and may cause structural changes of the nonviral carrier.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to solve the problems of the prior art as described above and it is an object of the present invention to provide a method for reconstituting a lyophilized product of lipid nanoparticles for anionic drug delivery, , The same degree of dispersion as before the freeze-drying, and homogeneity and stability can be maintained.
  • Another object of the present invention is to provide a method for freeze-drying lipid nanoparticles for anionic drug delivery using the above-described protective composition.
  • One aspect of the present invention relates to a lyophilized protective composition for anionic drug delivery lipid nanoparticles comprising albumin.
  • the composition may further comprise a sugar alcohol or sugar.
  • the sugar alcohol or sugar may be one or more selected from the group consisting of mannitol, sorbitol, lactose, sucrose and trehalose.
  • the albumin may be serum albumin, such as bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the weight ratio of sugar alcohol or sugar: albumin may be 0.01 to 10: 1, especially 0.05 to 5: 1.
  • the anionic drug may be a nucleic acid.
  • the lipid nanoparticles comprise an anionic drug, a cationic lipid, and an amphiphilic block copolymer, wherein the anionic drug forms a complex by electrostatic interaction with a cationic lipid, Or may be encapsulated within the nanoparticle structure of the block copolymer.
  • the lipid nanoparticle comprises a plasmid DNA, a nucleotide sequence, or a peptide comprising a RGD peptide sequence, a cationic lipid, and an amphiphilic block copolymer, wherein the plasmid DNA binds to the peptide to bind to the cationic lipid And the complex may be encapsulated within the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for freeze-drying lipid nanoparticles for anionic drug delivery, which comprises lyophilizing the lipid nanoparticle solution for anionic drug delivery by adding the protective composition to an aqueous solution.
  • the protective composition so that the weight ratio of anionic drug: albumin is 1: 30 to 500.
  • Another aspect of the present invention relates to a lyophilizate of lipid nanoparticles for anionic drug delivery comprising lipid nanoparticles for anionic drug delivery and the protective composition.
  • the weight ratio of the anionic drug: albumin is preferably 1: 30-500.
  • the present inventors have tested the effects of various protective agents during freeze-drying in order to maintain stability, safety and homogeneity of anionic drug delivery lipid nanoparticles.
  • the agent to which the present invention is applied is an anionic drug, for example, a nucleic acid, particularly a lipid nanoparticle used for delivering siRNA, mRNA, miRNA, pDNA, more particularly pDNA.
  • a nucleic acid particularly a lipid nanoparticle used for delivering siRNA, mRNA, miRNA, pDNA, more particularly pDNA.
  • lipid nanoparticle refers to a carrier that includes one or more lipids, such as cationic lipids, non-cationic lipids, PEG-modified lipids, and the like.
  • the lipid nanoparticles may be cationic lipid nanoparticles.
  • Korean Patent Publication No. 2010-0076905 discloses an anionic drug as an active ingredient; Cationic lipids; And an amphiphilic block copolymer, wherein the anionic drug forms a complex with the cationic lipid, and the complex is encapsulated in the micellar structure of the amphiphilic block copolymer ≪ / RTI > Korean Patent Application No.
  • 10-2017-0115341 discloses a plasmid DNA as an active ingredient; A peptide comprising a Nuclear Localization Signal (NLS) sequence or an RGD peptide sequence, a cationic compound (a cationic lipid or a cationic polymer); And an amphiphilic block copolymer, wherein the plasmid DNA binds with the peptide to form a complex by electrostatic interaction with the cationic compound, and the complex is encapsulated within the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing plasmid DNA. These compositions can be formulated into the subject application of the present invention, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the anionic drug is contained in an amount of 0.001 to 10% by weight, specifically 0.01 to 5% by weight, based on the weight of the entire composition to be finally prepared. If the content of the anionic drug is less than 0.001% by weight, the amount of the carrier to be used is too large as compared with the drug, and the side effects may be caused by the carrier. If the content exceeds 10% by weight, the size of the nanoparticles becomes too large, And the loss rate may increase when the filter is sterilized.
  • Cationic lipids include, but are not limited to, N, N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride (DODAC), N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide ), N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N, N-dimethyl- (2,3-dioloyuooxy) propylamine (DODMA), N, N, N-trimethyl- (2,3-diolooyloxy) propylamine (DOTMA), 1,2-diacyl- (TC-cholesterol), 3 beta - [N- (N (N, N ', N'-trimethylaminoethanecarbamoyl) (N-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DC-cholesterol), 3-beta- [N- (N'-monomethylaminoethane) carbamoyl] (Aminoethan) carbamoyl]
  • the cationic lipids are composed of 3 beta - [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethan) carbamoyl] cholesterol (TC- 3-beta [N- (N'-monomethylaminoethan) carbamoyl] cholesterol (MC-cholesterol), 3beta [N- (aminoethanecarbamoyl)] cholesterol (AC- Cholesterol), N- (1- (2,3-dioloyioxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N, N- Amine (DODMA), and N, N, N-trimethyl- (2,3-diolooyloxy) propylamine (DOTMA).
  • the cationic lipid may be a lipid species having a plurality of functional groups capable of exhibiting a cation on an aqueous solution per molecule.
  • a lipid species having a plurality of functional groups capable of exhibiting a cation on an aqueous solution per molecule.
  • DODAC N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride
  • DDAB N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide
  • TAP 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane
  • the cationic lipid may be a cationic lipid in which an amine functional group of 1 to 12 oligoalkyleneamines is bonded with a saturated or unsaturated hydrocarbon having 11 to 25 carbon atoms, and the cationic lipid may be represented by the following chemical formula 1 . ≪ / RTI >
  • n and m and l are each from 0 to 12, 1? n + m + 1? 12, a, b and c are each 1 to 6, and R 1 , R 2 and R 3 are each independently hydrogen or a At least one of R 1 , R 2 and R 3 is a saturated or unsaturated hydrocarbon having from 11 to 25 carbon atoms.
  • a, b and c may be from 2 to 4.
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently selected from the group consisting of lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, arachidyl, behenyl, lignoceryl, cerotyl, myristoleyl, palmitoleyl, sapienyl, oleyl, linoleyl, , Arachidonyl, eicosapentaenyl, erucyl, docosahexaenyl, and cerotyl.
  • cationic lipids include monooleoyl triethylene tetramide, diolauryl triethylene tetramide, trioleoyl triethylene tetramide, tetraoleoyl triethylene tetramide monolinoleoyl tetraethylene pentaamide, Tetraethylene tetraethylene pentaerythritol, trimethylolpropane trimellitate, trimethylolpropane trimellitate, trimethylolpropane trimellitate, trimethylol propane trimellitate, trimethylol propane trimellitate, trimethylol propyl trimellitate, trimethylol propyl trimellitate, trimethylol propyl trimellitate, trimethylol propyl trimellitate, trimethylol propyl trimellitate, Amides, monooleoyl pentaethylene hexamides, dioloyl pentaethylene hexamides, trioleoyl pentaethylene hex
  • the amphiphilic block copolymer may be an A-B type block copolymer comprising a hydrophilic A block and a hydrophobic B block.
  • the AB type block copolymer may be prepared by controlling the distribution of a core-shell type polymeric transporter in which a hydrophobic B block forms a core (inner wall) and a hydrophilic A block forms a shell (outer wall) It is possible to increase the efficiency of delivery to the outside.
  • the functional group or ligand may be at least one selected from the group consisting of monosaccharides, polysaccharides, vitamins, peptides, proteins, and antibodies against cell surface receptors.
  • the functional group or ligand is an antibody to anisamide, vitamin B9 (folic acid), vitamin B12, vitamin A, galactose, lactose, mannose, hyaluronic acid, RGD peptide, NGR peptide, transferrin, And the like.
  • the hydrophobic B block is a biocompatible biodegradable polymer.
  • the hydrophobic B block may be at least one selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines. More specifically, the hydrophobic B block may be a copolymer of polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polydioxan-2-one, polylactide and glycolide, polylactide and polydioxan-2- , A copolymer of polylactide and polycaprolactone, and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the hydrophobic B block may have a number average molecular weight of 50 to 50,000 daltons, more specifically 200 to 20,000 daltons, more particularly 1,000 to 5,000 daltons. Further, to increase the hydrophobicity of the hydrophobic block to improve the stability of the nanoparticles, tocopherol, cholesterol, or a fatty acid having 10 to 24 carbon atoms can be chemically bonded to the hydroxyl group at the hydrophobic block end.
  • the content of the amphiphilic block copolymer comprising the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is 40 to 99.98% by weight, specifically 85 to 99.8% by weight, more specifically, Preferably 90 to 99.8% by weight. If the content of the amphiphilic block copolymer is less than 40% by weight, the size of the nanoparticles may become too large, which may result in deterioration of the stability of the nanoparticles and loss of the filter during sterilization. If the content exceeds 99.98% by weight, The content of the anionic drug becomes too small.
  • the proportion of the hydrophilic block (A) to the hydrophobic block (B) is preferably 40 to 70% by weight, more preferably 50 to 70% by weight, based on the weight of the copolymer, 60% by weight. If the proportion of the hydrophilic block (A) is less than 40% by weight, the solubility of the polymer in water is low and it is difficult to form nanoparticles.
  • A) is preferably 40% by weight or more, and when it is more than 70% by weight, the stability of the polymer nanoparticles is lowered due to the excessively high hydrophilicity, which makes it difficult to use the composition as a solubilization composition for anionic drug / cationic compound complex. It is preferable that the proportion of the hydrophilic block (A) is 70% by weight or less.
  • the cationic lipid nanoparticles may further comprise a fusogenic lipid.
  • the fusogenic lipid is combined with an anionic drug, especially a complex of a nucleic acid (e.g., plasmid DNA) and a cationic lipid, by hydrophobic interaction to form a complex of nucleic acid, cationic lipid and fusogenic lipid,
  • the complex comprising the lipid is encapsulated within the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the fusogenic lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopherol.
  • the phospholipid may be at least one selected from the group consisting of phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), and phosphatidic acid.
  • the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidic acid may be in a form combined with one or two C10-24 fatty acids.
  • the cholesterol and tocopherol include analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol and tocopherol.
  • the fusogenic lipid is selected from the group consisting of dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, distearoyl phosphatidylethanolamine distearoyl phosphatidylethanolamine, dioleoyl phosphatidylethanolamine, dilinoleoyl phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine, 1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine, dilauroyl phosphatidylcholine, dimyristoyl phosphatidylcholine, di Dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearate, Distearoyl phosphatidylcholine, dioleoyl phosphatidylcholine, dilinoleoyl
  • the fusogenic lipid is selected from the group consisting of dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine May be at least one selected from the group consisting of
  • DOPE dioleoyl phosphatidylethanolamine
  • DPPC 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPC 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the freeze-dried protective composition for lipid nanoparticles for anionic drug delivery according to the present invention includes albumin.
  • the composition further comprises a sugar alcohol or sugar.
  • the sugar alcohol or sugar may be one or more of those conventionally used as lyophilized protective agents, and may be one or more selected from the group consisting of, for example, mannitol, sorbitol, lactose, sucrose and trehalose, But are not limited thereto.
  • the albumin may be a plant or animal albumin, for example, but not limited to, serum albumin, for example, bovine serum albumin, human serum albumin, particularly bovine serum albumin.
  • the weight ratio of sugar alcohol or sugar: albumin may be 0.01 to 10: 1, preferably 0.05 to 5: 1. This is because the reconstitution of the lyophilizate in the above range is easy and the dispersity and homogeneity of the preparation can be maintained.
  • the present invention provides a method for freeze-drying lipid nanoparticles for anionic drug delivery, which comprises lyophilizing the lipid nanoparticle solution for anionic drug delivery by adding the protective composition to an aqueous solution.
  • the protective composition may be added such that the weight ratio of anionic drug: albumin is 1: 30 to 500, preferably 1: 50 to 300, more preferably 1: 70 to 200, 1: 80 to 150, most preferably 1: 90 to 120, especially 1: 100. This is because the reconstitution of the lyophilizate in the above range is easy and the dispersity and homogeneity of the preparation can be maintained.
  • the present invention relates to a lipid nanoparticle for anionic drug delivery and a lyophilizate of lipid nanoparticles for anionic drug delivery comprising the above protective composition.
  • the weight ratio of the anionic drug: albumin is preferably 1: 30 to 500, more preferably 1:50 to 300, more preferably 1:70 to 200, even more preferably 1: 150, most preferably from 1: 90 to 120, especially 1: 100. This is because the reconstitution of the lyophilizate in the above range is easy and the dispersity and homogeneity of the preparation can be maintained.
  • the present invention it is possible to easily reconstitute a lyophilizate of an anionic drug-transporting lipid nanoparticle at an atmospheric pressure by using a diluting liquid for injection, etc., and to maintain the same degree of dispersion and homogeneity and stability as those before lyophilization .
  • a solution obtained by dissolving 1 ⁇ g of plasmid DNA (hereinafter referred to as "pDNA”) in 2 ⁇ l of distilled water and 3.15 ⁇ g of dioTETA in 1.05 ⁇ l of distilled water or 4 mM sodium acetate buffer (pH 4.2) as an acidic solvent was dissolved in 50 ⁇ l of distilled water , 2.9 ⁇ g of DOPE in 0.29 ⁇ l of ethyl acetate, and a solution of 50 ⁇ g of mPEG-PLA-tocopherol in 0.5 ⁇ l of ethyl acetate. The mixture was further stirred for 10 minutes in an ultrasonic wave-type bath.
  • the resulting complex emulsion was placed in a 1-necked round flask and distilled under reduced pressure on a rotary evaporator to selectively remove ethyl acetate to obtain a composition containing pDNA / dioTETA / mPEG-PLA-tocopherol (2k-1.7k) / DOPE .
  • the prepared composition was filtered with a 0.45 ⁇ m hydrophilic filter and stored at 4 ° C. Then, 10% PBS (10 ⁇ ) was added at the time of cell test.
  • composition containing pDNA / dioTETA / mPEG-PLA-tocopherol (2k-1.7k) / DOPE was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 and then freeze-dried in a cryogenic freezer. The freeze-drying conditions are shown in Table 1 below. The lyophilized material was reconstituted with 30 ⁇ l of 0.9% physiological saline. The compositions obtained in Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 2 below.
  • Example 1-3 pDNA / 1,6- Diol leoyl Triethylenetetramide ( dio - TETA ) / mPEG-PLA tocopherol (2k- 1.7k ) / Diol rail phosphatidyl - Comparison of Albumin Addition after Preparation of Ethanolamine (DOPE) Containing Composition
  • compositions obtained in Examples 1 to 3 are shown in Table 4 below.
  • compositions obtained in Examples 4 to 19 are shown in Table 5 below.
  • Example 20-35 pDNA / 1,6- Diol leoyl Triethylenetetramide ( dio - TETA ) / mPEG-PLA tocopherol (2k- 1.7k ) / Diol rail phosphatidyl -Ethanolamine (DOPE) -containing composition, the freeze-dried protective agent (sucrose / mannitol / Abattoir / Trehalose ) And 0.1 mg of BSA
  • compositions obtained in Examples 20 to 35 are shown in Table 6 below.
  • the size of the nanoparticles was measured using a dynamic light scattering (DLS) method. Specifically, a He-Ne laser was used as the light source and the Zetasizer Nano ZS90 instrument from MALVERN was operated according to the manual. Comparative Examples 1 and 2 The size of the composition nanoparticles is shown in Table 7 below.
  • DLS dynamic light scattering
  • the polydisperse index (PdI) is an index of aggregation in the particles, a larger value indicates that the system is a polydisperse system. The closer the polydisperse index is, the more monodispersed system. And smaller. Pk1 and Pk2 are due to decomposition, and the closer Pk1 is to 100%, the better. As can be seen from Table 7, the degree of dispersion of the particles was increased and the homogeneity and stability were decreased by the freeze-drying process.
  • composition nanoparticles obtained in Comparative Examples 3 to 18 are shown in Table 8 below.
  • composition nanoparticles obtained in Examples 1 to 3 are shown in Table 9 below.
  • composition nanoparticles obtained in Examples 4 to 19 are shown in Table 10 below.
  • composition nanoparticles obtained in Examples 20 to 35 are shown in Table 11 below.
  • the same freeze-dried protecting agent can be obtained by the BSA blending method to secure the same dispersion, homogeneity and stability as those before freeze-drying.

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Abstract

음이온성 약물 전달용 지질 나노입자(lipid nanoparticles, LNP)의 동결건조 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 조성물 및 방법
본 발명은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자(lipid nanoparticles, LNP)의 동결건조 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 핵산 등의 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조를 위한 보호제(lyoprotectant) 조성물 및 이를 이용한 동결건조 방법에 관한 것이다.
의약품은 건조제제로 완제품화되는 것이 보통이다. 이를 위하여 감압건조, 분무건조, 동결건조 등의 통상적인 건조 방법을 이용할 수 있다. 이 중 동결건조 방법은 통상 물을 포함하는 제제를 제조하여 -80 ℃ 이하 온도로 급속 냉동시킨 후 0 ℃ 이하의 온도에서 건조하는 방법이다. 이와 같은 동결건조 시 보호제를 사용하는 경우가 많다.
'의약품 첨가제 가이드라인(2015년 12월)'에 따르면, 의약품 제제는 일반적으로 첨가제를 가하여 제제의 안정성, 안전성 또는 균질성을 유지하면서 품질과 경제성을 높이고자 한다. 즉 첨가제는 의약품을 제제화할 때 안정성, 안전성 및 품질 등의 유용성을 높이기 위하여 추가 사용하는 물질을 말하며, 제제화할 때 이들 첨가제를 사용하여 의약품의 품질을 조절하며 일반적으로 다량 사용하는 경우가 많으므로 특별히 안전성도 확립되어야 한다.
음이온성 약물, 특히 핵산은 유전자 치료에 있어서, 그 효능이 검증 되었다. 이에 따라 안전하고 효율적인 약물 전달기술이 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 최근에는 지질 나노입자(lipid nanoparticles, LNP) 등을 이용하는 비바이러스성 전달체가 활발히 개발되는 중이다. 이러한 비바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 그러나, 음이온성 약물의 생체 내, 생체 외로의 전달 효율, 치료 효과 검증 등에 대해서는 연구가 많이 이루어졌지만, 장기 안정성 등의 입증을 위한 동결건조 보호제에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다. 최근에 mRNA의 백신으로서의 역할이 증대되면서 지질 나노입자들의 활용도가 증가되고 있지만, 동결건조에 대한 연구는 부족한 상황이다. 지질 나노입자의 동결건조 시 보호제로서 만니톨, 소비톨, 수크로스, 트레할로스와 같은 당 알코올류, 당류 등이 많이 사용되고 있으며, 현재 발표된 결과에 따르면 위의 첨가제를 여러 농도(0.1%~20% W/W)로 사용하고 있지만 안정화 효과는 부족한 상황이다. 특히 핵산 종류의 음이온성 약물은 동결 혹은 동결건조 시 구조적인 변화를 나타낼 수 있고, 비바이러스성 전달체의 구조 변화를 야기할 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물을 대기압 상태에서 주사용 희석액 등으로 재건할 때 용이하게 재건할 수 있고, 동결건조 전과 동일한 분산도, 및 균질성 및 안정성을 유지할 수 있도록 하는, 동결건조 보호제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 보호제 조성물을 이용하여 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자를 동결건조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 보호제 조성물을 포함하는 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 동결건조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 알부민을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물에 관한 것이다.
구체예에서, 상기 조성물은 당 알코올 또는 당을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
구체예에서, 당 알코올 또는 당은 만니톨, 소비톨, 락토스, 수크로스 및 트레할로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.
구체예에서, 알부민은 혈청 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)일 수 있다.
구체예에서, 당 알코올 또는 당:알부민의 중량비가 0.01~10:1, 특히 0.05~5:1일 수 있다.
구체예에서, 음이온성 약물은 핵산일 수 있다.
구체예에서, 지질 나노입자는 음이온성 약물, 양이온성 지질, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물이 양이온성 지질과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것일 수 있다. 특히, 지질 나노입자는 플라스미드 DNA, 핵 배치 신호 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드, 양이온성 지질, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 지질과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 수용액에 상기 보호제 조성물을 가하여 동결건조를 수행하는 단계를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자를 동결건조하는 방법에 관한 것이다.
구체예에서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500이 되도록 보호제 조성물을 가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 및 상기 보호제 조성물을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물에 관한 것이다.
구체예에서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 안정성, 안전성 및 균질성을 유지하기 위하여 동결건조 시 각종 보호제에 의한 영향을 시험하였다.
본 발명의 적용대상이 되는 제제는 음이온성 약물, 예를 들어 핵산, 특히, siRNA, mRNA, miRNA, pDNA, 보다 특히 pDNA를 전달하기 위해 사용되는 지질 나노입자이다. "지질　나노입자"는 하나 이상의　지질, 예를 들어, 양이온성　지질, 비-양이온성　지질, PEG-변형　지질 등을 포함하는 전달체를 가리킨다.
구체예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질 나노입자일 수 있다.
예를 들어, 한국특허 공개번호 제2010-0076905호는 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물을 제공하고 있다. 또한, 한국특허 출원번호 제10-2017-0115341호는 유효성분으로서 플라스미드 DNA; 핵 배치 신호(NLS; Nuclear Localization Signal) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드, 양이온성 화합물(양이온성 지질 또는 양이온성 고분자); 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 함유 약제학적 조성물을 제공하고 있다. 이들 조성물은 본 발명의 적용대상 제제로 할 수 있는 바, 상기 한국특허의 내용은 그 전체로 본 명세서에 참조로서 인용된다.
음이온성 약물은 최종 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
양이온성 지질은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 분자 당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 여러 개인 지질 종류일 수 있다. 구체적으로, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판 (DAP) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 1 내지 12 개의 올리고알킬렌아민 (oligoalkyleneamine)의 아민 작용기에 탄소수 11 내지 25 개의 포화 또는 불포화 탄화수소를 결합시킨 양이온성 지질일 수도 있으며, 상기 양이온성 지질은 다음의 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000001
상기 식에서,
n과 m 및 l은 각각 0 내지 12이되, 1 ≤ n + m + l ≤ 12이며, a와 b 및 c는 각각 1 내지 6이며, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로서, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소이다.
바람직하게는, n과 m 및 l은 독립적으로 0 내지 7이며, 1 ≤ n+m+l ≤ 7일 수 있다.
바람직하게는, a와 b 및 c는 2 내지 4일 수 있다.
바람직하게는, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl), 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 양이온성 지질의 구체적인 예는 모노올레오일트리에틸렌테트라마이드, 디올레오일트리에틸렌테트라마이드, 트리올레오일트리에틸렌테트라마이드, 테트라올레오일트리에틸렌테트라마이드 모노리놀레오일테트라에틸렌 펜타마이드, 디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 트리리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드, 테트라리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 펜타 리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 모노미리스톨레오일디에틸렌트리 아마이드, 디미리스톨레오일디에틸렌트리아마이드, 모노올레오일펜타에틸렌 헥사마이드, 디올레오일펜타에틸렌헥사마이드, 트리올레오일펜타에틸렌 헥사마이드, 테트라올레오일펜타에틸렌헥사마이드, 펜타올레오일펜타에틸렌 헥사마이드 및 헥사올레오일펜타에틸렌헥사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
구체예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩티드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩티드, NGR 펩티드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 40 내지 99.98 중량%이며, 구체적으로는 85 내지 99.8중량%, 더 구체적으로는 90 내지 99.8 중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량% 미만이면 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 음이온성 약물의 함량이 너무 적어지게 된다.
나아가, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70 중량%, 구체적으로는 50 내지 60 중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 나노입자를 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 음이온성 약물/양이온성 화합물 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70 중량% 이하인 것이 좋다.
구체예에서, 양이온성 지질 나노입자는 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 융합성 지질은 음이온성 약물, 특히 핵산(예: 플라스미드 DNA)과 양이온성 지질의 복합체에 혼합시, 소수성 상호작용으로 결합하여 핵산, 양이온성 지질 및 융합성 지질의 복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 일실시예에서, 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
구체적으로는 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디팔미토올레오일포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물은 알부민을 포함한다.
구체예에서, 상기 조성물은 당 알코올 또는 당을 추가로 포함한다.
구체예에서, 당 알코올 또는 당은 동결건조 보호제로 통상적으로 사용되는 것들 중 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어 만니톨, 소비톨, 락토스, 수크로스 및 트레할로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구체예에서, 알부민은 식물 또는 동물 알부민일 수 있으며, 예를 들어 혈청 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 특히 소 혈청 알부민일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구체예에서, 당 알코올 또는 당:알부민의 중량비는 0.01~10:1, 바람직하게는 0.05~5:1일 수 있다. 상기 범위에서 동결건조물의 재건 시 재건이 용이하고 제제의 분산도 및 균질성이 유지될 수 있기 때문이다.
본 발명은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 수용액에 상기 보호제 조성물을 가하여 동결건조를 수행하는 단계를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자를 동결건조하는 방법을 제공한다.
구체예에서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500이 되도록 보호제 조성물을 가할 수 있으며, 바람직하게는 1:50~300, 보다 바람직하게는 1:70~200, 보다 더 바람직하게는 1:80~150, 가장 바람직하게는 1:90~120, 특히 1:100이 되도록 가할 수 있다. 상기 범위에서 동결건조물의 재건 시 재건이 용이하고 제제의 분산도 및 균질성이 유지될 수 있기 때문이다.
본 발명은 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 및 상기 보호제 조성물을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물에 관한 것이다.
구체예에서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500인 것이 바람직하며, 바람직하게는 1:50~300, 보다 바람직하게는 1:70~200, 보다 더 바람직하게는 1:80~150, 가장 바람직하게는 1:90~120, 특히 1:100일 수 있다. 상기 범위에서 동결건조물의 재건 시 재건이 용이하고 제제의 분산도 및 균질성이 유지될 수 있기 때문이다.
본 발명에 따르면, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물을 대기압 상태에서 주사용 희석액 등으로 재건할 때 용이하게 재건할 수 있고, 동결건조 전과 동일한 분산도, 및 균질성 및 안정성을 유지할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 기재하나, 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하는 것은 아니다.
[ 비교예 1-2] 플라스미드 DNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA) / mPEG- PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 동결건조에 따른 비교
플라스미드 DNA (이하 'pDNA'라 함) 1 ㎍을 증류수 2 ㎕에 녹인 용액, dioTETA 3.15 ㎍을 증류수 혹은 산성 용매인 4 mM 소듐아세테이트 완충용액 (pH 4.2) 1.05 ㎕에 녹인 용액을 증류수 50 ㎕에 녹이고, DOPE 2.9 ㎍을 에틸아세테이트 0.29 ㎕에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 50 ㎍을 에틸아세테이트 0.5 ㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태(bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 pDNA/ dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/ DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 0.45 ㎛ hydrophilic filter로 여과시킨 후 4℃에 보관하였고 추후 세포 실험 진행 시 10% PBS (10x)를 섞어 주었다.
비교예 1과 동일한 방법으로 pDNA/ dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/ DOPE 함유 조성물 제조 후 초저온냉동고에서 동결건조를 실시 하였다. 동결건조 조건은 아래의 표 1과 같다. 동결 건조된 것은 0.9% 생리식염수 30 ㎕를 이용하여 재건하였다. 비교예 1 및 2에서 얻어진 조성물은 아래의 표 2와 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000002
[표 2]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000003
[ 비교예 3-18] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 ( 수크로스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 첨가에 따른 비교
위와 동일한 방법으로 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 종류 및 함량을 달리하여 초저온냉동고에서 동결건조를 실시 하였다. 동결 건조된 것은 0.9% 생리식염수 30 ㎕를 이용하여 재건하였다. 비교예 3 내지 18에서 얻어진 조성물은 아래의 표 3과 같다.
[표 3]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000004
[ 실시예 1-3] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 알부민 첨가에 따른 비교
위와 동일한 방법으로 조성물 제조 후 Bovine serum albumin (이하 'BSA'라 함) 함량을 달리하여 초저온냉동고에서 동결건조를 실시 하였다. 동결 건조된 것은 0.9% 생리식염수 30 ㎕를 이용하여 재건하였다. 실시예 1 내지 3에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4와 같다.
[표 4]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000005
[ 실시예 4-19] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 ( 수크로스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 및 BSA 0.03 mg 첨가에 따른 비교
위와 동일한 방법으로 조성물을 제조하여 BSA 함량을 고정한 후 기존 동결건조 보호제 함량을 달리하여 초저온냉동고에서 동결건조를 실시 하였다. 동결 건조된 것은 0.9% 생리식염수 30 ㎕를 이용하여 재건하였다. 실시예 4 내지 19에서 얻어진 조성물은 아래의 표 5와 같다.
[표 5]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000006
[ 실시예 20-35] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 (수크로오스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 및 BSA 0.1 mg 첨가에 따른 비교
위와 동일한 방법으로 조성물을 제조하여 BSA 함량을 고정한 후 기존 동결건조 보호제 함량을 달리하여 초저온냉동고에서 동결건조를 실시 하였다. 동결 건조된 것은 0.9% 생리식염수 30 ㎕를 이용하여 재건하였다. 실시예 20 내지 35에서 얻어진 조성물은 아래의 표 6과 같다.
[표 6]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000007
[ 실험예 1] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 동결건조에 따른 비교
비교예 1 및 2에서 얻어진 조성물의 나노 입자 형성 여부를 확인하기 위하여 Intensity 기준 나노입자의 크기 (d.nm)를 확인하였다.
동적 광산란 (DLS; dynamic light scattering) 방법을 이용하여 나노입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, MALVERN사의 Zetasizer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다. 비교예 1 내지 2 조성물 나노입자의 크기는 아래의 표 7과 같다.
[표 7]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000008
PdI(Polydisperse index)는 입자에서 응집의 지표이므로, 이 값이 클수록 다중분산 시스템임을 나타내고 0에 가까울수록 단일분산 시스템임을 나타내는 것이며, 다중분산 시스템이 단일분산 시스템에 비해 응집 경향이 강하므로 PdI는 0.5 미만이어야 하고 작을수록 바람직하다. Pk1 및 Pk2는 분해로 인한 것으로, Pk1이 100%에 가까울수록 바람직하다. 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 동결건조 과정으로 입자의 분산도가 증가하고 균질성과 안정성이 저하되는 것으로 나타났다.
[ 실험예 2] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 ( 수크로스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 첨가에 따른 비교
비교예 3 내지 18에서 얻어진 조성물 나노입자의 크기는 아래의 표 8과 같다.
[표 8]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000009
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 기존 동결건조 보호제 사용으로는 동결건조로 인한 문제점을 해결할 수 없는 것으로 나타났다.
[ 실험예 3] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 알부민 첨가에 따른 비교
실시예 1 내지 3에서 얻어진 조성물 나노입자의 크기는 아래의 표 9와 같다.
[표 9]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000010
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, BSA 단독 사용 시 동결건조로 인한 분산도 증가, 균질성 및 안정성 저하 문제를 어느 정도 해결할 수 있는 것으로 나타났다.
[ 실험예 4] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 ( 수크로스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 및 BSA 첨가에 따른 비교
실시예 4 내지 19에서 얻어진 조성물 나노입자의 크기는 아래의 표 10과 같다.
[표 10]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000011
표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 기존 동결건조 보호제에 BSA 배합 사용 시 동결건조로 인한 분산도 증가, 균질성 및 안정성 저하 문제를 해결할 수 있는 것으로 나타났다.
[ 실험예 5] pDNA / 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA ) / mPEG-PLA 토코페롤 (2k- 1.7k ) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유 조성물 제조 후 기존 동결건조 보호제 ( 수크로스 / 만니톨 / 소비톨 / 트레할로스 ) 및 BSA 첨가에 따른 비교
실시예 20 내지 35에서 얻어진 조성물 나노입자의 크기는 아래의 표 11과 같다.
[표 11]
Figure PCTKR2018013586-appb-I000012
따라서, 기존 동결건조 보호제에 BSA 배합에 의해 동결건조 전과 동일한 분산도와 균질성 및 안정성을 확보할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 알부민을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 당 알코올 또는 당을 추가로 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 당 알코올 또는 당은 만니톨, 소비톨, 락토스, 수크로스 및 트레할로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 알부민은 혈청 알부민인 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 알부민은 소 혈청 알부민인 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 당 알코올 또는 당:알부민의 중량비가 0.01~10:1인 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 당 알코올 또는 당:알부민의 중량비가 0.05~5:1인 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 음이온성 약물이 핵산인 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 음이온성 약물, 양이온성 지질, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물이 양이온성 지질과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 플라스미드 DNA, 핵 배치 신호 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드, 양이온성 화합물, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 화합물과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조 보호제 조성물.
  11. 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 수용액에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 보호제 조성물을 가하여 동결건조를 수행하는 단계를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자를 동결건조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500이 되도록 보호제 조성물을 가하는 것인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자를 동결건조하는 방법.
  13. 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 보호제 조성물을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물.
  14. 제13항에 있어서, 음이온성 약물:알부민의 중량비가 1:30~500인, 음이온성 약물 전달용 지질 나노입자의 동결건조물.
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