CN105188710A - 包含缓冲的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物的组合物及其用于增强免疫应答的用途 - Google Patents

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Abstract

提供了包含氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物或其药学可接受的盐和缓冲液的组合物，其用作免疫调节剂。

Description

包含缓冲的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物的组合物及其用于增强免疫应答的用途
发明领域
本发明涉及包含氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物（AGP）的组合物，以及组合物在疫苗佐剂中或作为疫苗佐剂或者在预防或治疗性处理中的用途。还公开了使用组合物的方法。
关于联邦赞助研究的声明
本发明的方面依据NIH合约#HHSN272200900008C在美国政府支持下进行，美国政府在本发明中可以拥有一定权利。
发明背景
氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGP）是Toll样受体4（TLR4）的合成配体。AGP及其经由TLR4的免疫调节效应公开于专利公开例如WO2006/016997、WO2001/090129和/或美国专利号6,113,918中，并且已在文献中得到报道。另外的AGP衍生物公开于美国专利号7,129,219、美国专利号6,525,028和美国专利号6,911,434中。某些AGP充当TLR4的激动剂，而其他的识别为TLR4拮抗剂。AGP已知可用作疫苗佐剂和免疫调节剂，用于在免疫接种的动物中刺激细胞因子产生、活化巨噬细胞、促进先天性免疫应答和增强抗体产生。先前，作为佐剂和/或免疫调节剂的AGP原则上已以水包油乳剂的形式利用，通常使用灭菌的水和甘油（大约2%）。存在鉴定缓冲液的进行中的需要，所述缓冲液可以与这些AGP一起用于药物和/或佐剂组合物中。
发明概述
相应地，本发明提供了包含一种或多种AGP和缓冲液的药物组合物。在本文中公开的本发明的药物组合物可以导致下述利益中的一种或多种：相对于其他AGP水性制剂，在缓冲溶液中AGP的最大或增加或改善的稳定性和/或在缓冲溶液中AGP的最大或增加或改善的效力。
还提供的是在约pH7、或生理学正常的pH或药学可接受的pH下，具有改善的稳定性和/或效力的缓冲AGP组合物。
还提供的是用本发明的组合物治疗受试者（或患者例如人或其他哺乳动物）的方法。
依照本发明，提供了包含（i）氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯或其药学可接受的盐，和（ii）缓冲液的组合物。将缓冲溶液和AGP化合物组合，以形成具有作为免疫调节剂的实用性的组合物。
进一步提供了用于调节受试者（优选人）的免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用有效量的药物组合物。
还提供的是用于改善或基本上预防受试者（优选人）中的传染病、自身免疫性疾病、神经系统疾病或者过敏性或炎性状况的方法，其包括给所述受试者施用有效量的药物组合物。
附图简述
图1显示了来自实施例的CRX-601和CRX-601降解物的结构。
图2显示了在中性或接近生理学的pH下，用CRX-601配制的缓冲液的加速降解速率。
图3显示了对于每种缓冲液，在接近最佳pH下，用CRX-601配制的三种缓冲液的加速降解速率。
图4显示了来自实施例的CRX-527和CRX-527降解物的结构。
图5显示了分别使用在CRX-527和CRX-601中的磷酸盐和HEPES缓冲液的加速降解速率。
图6显示了在三种缓冲液中配制的CRX-601的长期稳定性。
图7到9显示了对于每种缓冲液，在接近最佳pH下，用CRX-601配制的三种缓冲液（HEPES、乙酸盐、柠檬酸盐）中的相对效力。
发明详述
氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物。AGP是Toll样受体4（TLR4）调节剂。Toll样受体4识别细菌LPS（脂多糖），并且当活化时，起始先天性免疫应答。AGP是细菌LPS的脂质A蛋白的单糖模拟物，并且已用在化合物的“酰基链”上的醚和酯键进行开发。用于制备这些化合物的过程是已知的，且例如公开于WO2006/016997、美国专利号7,288,640和6,113,918和WO01/90129中，所述专利在此整体引入作为参考。其他AGP和相关过程公开于美国专利号7,129,219、美国专利号6,525,028和美国专利号6,911,434中。在本发明的组合物中采用的在酰基链上具有醚键的AGP是已知的，且公开于在此整体引入作为参考的WO2006/016997中。特别有利的是在WO2006/016997中的段落[0019]直到[0021]处，根据式（III）阐述且描述的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物。
本发明中采用的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物具有如下在式1中所示的结构：
其中
m是0至6
n是0至4；
X是O或S，优选O；
Y是O或NH；
Z是O或H；
每个R1、R2、R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；
R4是H或Me；
R5独立地选自-H、-OH、-（Cl-C4）烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8和–CONR8R9，其中R8和R9各自独立地选自H和（Cl-C4）烷基；和
每个R6和R7独立地是H或PO3H2。
在式1中，正脂肪酰残基（即，仲酰氧基或烷氧基残基，例如R1O、R2O和R3O）与之附着的3’立体中心的构型是R或S，优选R（如通过Cahn-Ingold-Prelog顺序规则指定的）。R4和R5与之附着的糖苷配基立体中心的构型可以是R或S。所有立体异构体，对映体和非对映体两者，及其混合物视为落入本发明的范围内。
杂原子X和糖苷配基氮原子之间的碳原子数目由变量“n”确定，其可以是0至4的整数，优选0至2的整数。
正脂肪酸R1、R2和R3的链长可以为约6至约16个碳，优选约9至约14个碳。链长可以相同或不同。一些优选实施方案包括其中R1、R2和R3是6或10或12或14的链长。
式1涵盖L/D-丝氨酰、-苏氨酰、-半胱氨酰醚和酯脂质AGP，激动剂和拮抗剂两者及其同系物（n=1-4），以及各种羧酸生物电子等排体（即，R5是能够形成盐的酸性基团；磷酸酯可以在氨基葡萄糖单位的4或6位上，但优选在4位中）。
在采用式1的AGP化合物的本发明的一个优选实施方案中，n是0，R5是CO2H，R6是PO3H2，并且R7是H。这种优选AGP化合物如下作为式1a中的结构阐述：
其中X是O或S；Y是O或NH；Z是O或H；每个R1、R2、R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；并且R4是H或甲基。
在式1a中，正脂肪酰残基（即，仲酰氧基或烷氧基残基，例如R1O、R2O和R3O）与之附着的3’立体中心的构型是R或S，优选R（如通过Cahn-Ingold-Prelog顺序规则指定的）。R4和CO2H与之附着的糖苷配基立体中心的构型可以是R或S。所有立体异构体，对映体和非对映体两者，及其混合物视为落入本发明的范围内。
式1a涵盖L/D-丝氨酰、-苏氨酰、-半胱氨酰醚或酯脂质AGP，激动剂和拮抗剂两者。
在式1和式1a两者中，Z是通过双键附着的O，或各自通过单键附着的两个氢原子。即，当Z=Y=O时，化合物是酯连接的；当Z=O和Y=NH时，化合物是酰胺连接的；并且当Z=H/H和Y=O时，化合物是醚连接的。
尤其优选的式1的化合物被称为CRX-601和CRX-527。它们的结构如下阐述：
另外，另一个优选实施方案采用具有所示结构的CRX547。
另外其他的实施方案包括AGP例如CRX602或CRX526，对具有更短的仲酰基或烷基链的AGP提供增加的稳定性。
缓冲液。在本发明的一个实施方案中，包含AGP的组合物使用两性离子缓冲液进行缓冲。适当地，两性离子缓冲液是氨基链烷磺酸或合适的盐。氨基链烷磺酸缓冲液的例子包括但不限于HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS和PIPES。优选地，缓冲液是药学可接受的缓冲液，适合于在人中使用，例如用于商业注射产品中。最优选地，缓冲液是HEPES。
在本发明的合适实施方案中，AGP使用选自下述的缓冲液进行缓冲：
i）具有约7的pH的HEPES，
ii）具有约5的pH的柠檬酸盐（例如柠檬酸钠），和
iii）具有约5的pH的乙酸盐（例如乙酸铵）。
在本发明的一个优选实施方案中，AGPCRX-601、CRX-527和CRX-547使用具有约7的pH的HEPES进行缓冲。缓冲液可以与适当量的盐水或其他赋形剂一起使用，以实现所需等渗性。在一个优选实施方案中，使用0.9%盐水。
HEPES：CAS登记号：7365-45-9C8H18N2O4S
1-哌嗪乙磺酸，4-（2-羟乙基）-
HEPES是设计为在约6至约8（例如6.15-8.35）的生理学pH范围内缓冲的两性离子缓冲液，并且更具体而言更有用的约6.8至约8.2的范围，并且如在本发明中，约7至约8或7至8，且优选约7至小于8。HEPES通常为白色结晶粉末且具有下述结构的分子式C8H18N2O4S：
HEPES是众所周知和商购可得的。（参见例如Good等人，Biochemistry1966.）
当用作本发明的组合物中的缓冲液时，柠檬酸盐缓冲液（例如柠檬酸钠）和乙酸盐均具有约5的pH。在一个实施方案中，缓冲液的浓度为约10mM，但在一些实施方案中，可能需要增加的缓冲液浓度。柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液可以用于具有AGP的本发明的组合物中，所述AGP需要酸性或微酸性pH。乙酸盐缓冲液在其中不使用柠檬酸盐缓冲液的环境或组合物中良好工作，例如在明矾的存在下。柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液是商购可得的。
纳米颗粒混合物/溶液。当形成时，本发明的组合物可以是分散体或溶液。适当地，组合物是粒度≤200nm的纳米颗粒溶液。在一个合适的实施方案中，组合物是粒度≤200nm的纳米颗粒溶液，展示胶束或脂质体特征。在一个实施方案中，溶液或分散体适合于作为免疫调节剂的药学用途。溶液中的微粒大小部分地由对溶液或分散体中的组合物实施超声处理的时间长度决定。
治疗和施用方法。本发明提供了用于增强受试者的免疫应答的方法，其包括给受试者施用有效量的药物组合物。
本发明的组合物可以借助于经由全身或粘膜途径施用，用于保护或治疗哺乳动物。这些施用可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或通过粘膜施用于口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。本发明的组合物可以作为单一剂量或多重剂量施用。另外，本发明的组合物可以通过用于引发和加强的不同途径施用，例如IM引发剂量和IN用于加强剂量。
本发明的组合物可以单独或与合适的药学载体一起施用，并且可以用于制造固体或液体形式，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳剂。组合物可以配制成“疫苗”，并且在自由溶液中施用，或者与佐剂或赋形剂一起配制。疫苗制剂一般在VaccineDesign（"Thesubunitandadjuvantapproach"（编辑PowellM.F.&NewmanM.J.）（1995）PlenumPressNewYork）中描述。在脂质体内的封装由Fullerton，美国专利4,235,877描述。疫苗可以贮存于溶液中或冻干。
掺入本发明的组合物用于治疗受试者的有效治疗剂量取决于许多不同因素而改变，所述因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、施用的其他药剂、相对于其他医学并发症的患者身体状态、以及治疗是预防还是治疗性的。治疗剂量需要逐步增加以优化安全和功效。本文描述的受试者剂量通常范围为约0.1μg至50mg/施用，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及两者之间的任何其他时间量给予。更通常地，粘膜或局部剂量范围为约10μg至10mg/施用，并且任选为约100μg至1mg，具有间隔开数天或数周的2-4次施用。更通常地，免疫刺激剂剂量范围为1μg至10mg/施用，且最通常为10μg至1mg，伴随每天或每周一次施用。掺入本文描述的本发明用于肠胃外递送例如用于诱导先天性免疫应答或在专门的递送媒介物中的剂量通常范围为约0.1μg至10mg/施用，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及两者之间的任何其他时间量给予。更通常地，用于这些目的的肠胃外剂量范围为约10μg至5mg/施用，并且更通常为约100μg至1mg，具有间隔开数天或数周的2-4次施用。然而，在一些实施方案中，用于这些目的的肠胃外剂量可以以比上文描述的通常剂量高5至10,000倍的范围使用。
还提供了用于改善或基本上预防受试者中的传染病、自身免疫性疾病、神经系统疾病或者过敏性或炎性状况的方法，其包括给所述受试者施用有效量的药物组合物。在一些情况下，外源抗原可以连同药物组合物一起施用于受试者。在用于引发或增强免疫应答的组合物中，将本发明的组合物连同抗原例如蛋白质或多肽抗原或者表达蛋白质或多肽抗原的多核苷酸一起施用于温血动物，例如人或其他哺乳动物。施用以引发所需应答的抗原量可以容易地通过本领域技术人员确定，并且将随施用的抗原类型、施用途径和免疫接种时间表而改变。本发明的组合物还可以无需外源抗原进行施用，以引发经由非特异性抗性效应的立即保护。具有刺激非特异性抗性和/或引发佐剂效应的能力的组合物可以用于快速作用疫苗制剂中。
术语/定义。如本文讨论的，除非另有说明，术语“脂肪族”单独或作为另一个取代基的部分，意指直链或支链、或环烃原子团、或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可以包括二价和多价原子团，具有指定的碳原子数目（即C1-C10或C1-10意指一至十个碳）。饱和烃原子团的例子包括基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、（环己基）甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等等。不饱和的脂肪族基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和的脂肪族基团的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-（丁二烯基）、2,4-戊二烯基、3-（1,4-戊二烯基）、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、以及更高级的同系物和异构体。通常，脂肪族基团具有1至24个碳原子。“低级脂肪族”基团是一般具有八个或更少碳原子的短链脂肪族基团。
术语“酰基”指通过去除羟基而衍生自有机酸的基团。酰基的例子包括乙酰基、丙酰基、十二酰基、十四酰基、异丁酰基等等。相应地，如本文使用的，术语“酰基”意欲包括以其他方式定义为–C（O）-脂肪族的基团，其中脂肪族基团优选是饱和脂肪族基团。
术语“药学可接受的盐”意欲包括活性化合物的盐，其用相对无毒的酸或碱进行制备，取决于在本文描述的化合物上发现的特定取代基。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需碱纯接触或在合适的惰性溶剂中接触来获得。药学可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐、或类似的盐。在一个实施方案中，盐是乙醇胺盐，例如单乙醇胺（MEA）或三乙醇胺（TEA）。当在本发明的组合物中使用的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需酸纯接触或在合适的惰性溶剂中接触来获得。药学可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。还包括的是氨基酸的盐例如精氨酸盐等等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐等等（参见例如Berge，S.M.，等人，“PharmaceuticalSalts,”JournalofPharmaceuticalScience，66，1-19，1977）。在本发明的组合物中使用的某些特异性化合物含有碱性和酸性官能团两者，其允许化合物被转换成碱或酸加成盐。
如本文使用的，“药学可接受的载体”意指不干扰活性成分的免疫调节活性并且对它施用于的患者无毒的介质。
药学可接受的载体包括水包油或油包水乳剂、多重乳剂（例如水包油包水）、微乳剂、脂质体、微珠、微球体、微粒体等等。例如，载体可以是微球体或优选纳米球体，或可以是微粒或优选是纳米颗粒，具有在球体或颗粒的基质内或者吸附到球体或颗粒表面上的本发明的化合物。载体还可以是水溶液或胶束分散体，含有三乙胺、三乙醇胺或致使制剂性质碱性的其他试剂，或含有氢氧化铝、氢氧化钙、磷酸钙或酪氨酸吸附物的悬浮液。载体还可以包括所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。
在某些实施方案中，脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡等等用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞/生物内。特别地，本发明的组合物可以在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球体或纳米颗粒等等中封装而配制用于递送。
脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的配制和使用是本领域技术人员一般已知的（参见例如Lasic，TrendsBiotechnol1998Jul；16（7）:307-21；Takakura，NipponRinsho1998Mar；56（3）:691-5；Chandran等人，IndianJExpBiol.1997Aug；35（8）:801-9；Margalit，CritRevTherDrugCarrierSyst.1995；12（2-3）:233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专利5,795,587）。
脂质体已成功地对许多细胞类型使用，所述细胞类型通常难以通过其他操作转染，包括T细胞悬浮液、原代肝细胞培养物和PC12细胞（Renneisen等人，JBiolChem.1990Sep25；265（27）:16337-42；Muller等人，DNACellBiol.1990Apr；9（3）:221-9）。另外，脂质体不具有基于病毒的递送系统通常的DNA长度约束。脂质体已有效地用于将基因、各种药物、放射治疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应物等等引入各种培养的细胞系和动物内。此外，脂质体的使用看起来不与全身递送后的自身免疫应答或无法接受的毒性相关。
在某些实施方案中，由磷脂形成脂质体，所述磷脂在水介质中分散且自发形成多层同心双层囊泡（也称为多层囊泡（MLV）。
可替代地，在其他实施方案中，本发明提供了本发明的组合物的药学可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊一般可以以稳定和重现方式诱陷化合物（参见例如Quintanar-Guerrero等人，DrugDevIndPharm.1998Dec；24（12）:1113-28）。为了避免由于细胞内聚合物过负荷的副作用，此类超细颗粒（大小约0.1μm）可以使用能够在体内降解的聚合物进行设计。此类颗粒可以如例如由Couvreur等人，CritRevTherDrugCarrierSyst.1988；5（1）:1-20；zurMuhlen等人，EurJPharmBiopharm.1998Mar；45（2）:149-55；Zambaux等人JControlledRelease.1998Jan2；50（1-3）:31-40；和美国专利5,145,684描述的进行制备。
如本文使用的，术语“免疫调节剂”意指例如通过增强、降低、改变或以其他方式影响受试者的免疫应答，来改变受试者中的免疫应答的物质。
施用途径
可以肠胃外即腹膜内、皮下或肌内施用的本发明的组合物包括下述优选载体。用于皮下使用的合适载体的例子包括但不限于磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液、或在USP注射用水中的0.9%氯化钠、和在USP注射用水中的0.01-0.1%三乙醇胺。用于肌内注射的合适载体包括但不限于10%USP乙醇、40%丙二醇和平衡的可接受的等渗溶液例如5%右旋糖、或在USP注射用水中的0.9%氯化钠。用于静脉内使用的合适载体的例子包括但不限于10%USP乙醇、40%丙二醇和平衡USP注射用水、或在USP注射用水中的0.9%氯化钠。在一个实施方案中，载体包括10%USP乙醇和USP注射用水；对于另外一个实施方案，可接受的载体是在USP注射用水中的0.01-0.1%三乙醇胺。药学可接受的肠胃外溶剂是这样的，以便提供溶液或分散体，其可以通过5微米滤器或优选0.2微米滤器过滤，而不去除活性成分。
本发明的组合物的另一种施用途径是粘膜施用，特别是鼻内施用，或在一些情况下，通过吸入施用（肺施用）。肺药物递送可以通过几种不同方法来实现，包括液体喷雾器、基于气溶胶的计量吸入器（MDI）和干粉分散装置。在这类施用中使用的组合物通常为干粉或气溶胶。
除本发明的组合物之外，干粉还含有载体、吸收促进剂和任选的其他成分。载体是例如单、二或多糖，糖醇或另一种多元醇。合适的载体包括乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、拉克替醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇；和淀粉。乳糖是特别优选的，尤其是以其一水合物的形式。还包括的是吸收促进剂例如多肽、表面活性剂、烷基葡糖苷、脂肪酸的胺盐或磷脂。制剂的成分通常必须采取精细分开的形式，即它们的容量中位直径一般应为约30至约200微米，如通过激光衍射仪或库尔特计数器测量的。所需粒度可以使用本领域已知的方法产生，例如研磨、微粉化或直接沉淀。
鼻内施用途径提供了超过对于本发明的化合物的许多其他施用形式的众多优点。例如，鼻内施用的一个优点是方便。可注射系统需要皮下注射器的灭菌，并且在机构背景下，导致在医护人员中关于通过经由污染针的意外卡住接触疾病的危险的关注。在机构背景下还必须施加关于所使用的针和注射器的安全处置的严格要求。相比之下，鼻内施用就患者和主治医护人员而言需要很少的时间，并且对机构的负担比注射剂少得多。
鼻内施用的第二个重要优点是药物递送系统的患者接受。鼻内施用被感觉为非侵袭性的，不伴随疼痛，没有明显后效且在显示出症状的患者中产生迅速缓解的满足感。当患者是儿童时，这是特别有利的。另一个重要考虑是患者可能能够自施用鼻腔喷雾剂的处方剂量。
对于鼻内施用，本发明的组合物可以配制为液体或固体。此类制剂可以含有一种或多种另外的佐剂、用于增强活性成分通过跨越鼻粘膜渗透的吸收的试剂、以及（对于液体组合物）另外的水性缓冲液或其他药学可接受的载体。组合物可以进一步任选包括一种或多种多元醇和一种或多种防腐剂。合适的防腐剂包括例如庆大霉素、杆菌肽（0.005%）或甲酚。通过使用雾化器、喷洒器、喷雾器、滴管或保证溶液与鼻腔粘膜接触的其他装置，可以将组合物以喷雾剂的形式施用于鼻腔。装置可以是可以由患者使用的简单装置，例如简单的鼻喷雾器，或可以是用于组合物的更准确分配的更精细仪器，其可以用于医生的办公室或医疗机构中。
鼻粉末组合物可以通过下述进行制备：将本发明的组合物冻干或将组合物吸附到合适的鼻粉末（例如乳糖）上，并且需要时研磨至所需粒度。可替代地，可以制备组合物的溶液和环糊精赋形剂，随后为沉淀、过滤和粉碎。还能够通过冷冻干燥去除溶剂，随后为通过使用由药学文献已知的常规技术以所需粒度的粉末粉碎。最后一个步骤是例如通过筛分的粒度分级，以获得优选为直径30至200微米的颗粒。粉末可以使用鼻吹入器进行施用，或它们可以置于吸入或吹入装置的胶囊套中。将针穿透胶囊以在胶囊的顶部和底部上制备孔，并且送入空气以吹出粉末颗粒。粉末制剂还可以在惰性气体的喷射喷雾中施用或悬浮于液体有机流体中。
本发明的组合物以有效量或药学有效量施用于个体，以实现或增强个体的免疫应答。如本文使用的，“有效量”或“药学有效量”是显示超过且高于媒介物或阴性对照的应答的量。“佐剂有效量”是所讨论的化合物的量，当与抗原结合施用时，其显示超过且高于通过单独的抗原产生的那种的应答。待施用于患者的本发明的组合物的精确剂量取决于使用的特定化合物、施用途径、药物组合物和患者。
MM6效力测定
MonoMac6效力测定用于定量测量生物制品的两个不同批次之间的相对效力。测试和参考化合物的剂量范围与MonoMac6细胞（人单核细胞系）一起共温育，并且收获细胞上清液用于进一步测试。通过嵌套ELISA从细胞上清液中测量的趋化因子标记（MIP-1β）充当读出。构建原始光密度经过其内的效力分析模板，并且自动执行分析。基于测试和参考应答曲线之间的斜率和平行度，在限定度量内的设置标准确定成功的效力测定是否可以发生。如果这些标准被成功满足，则分析获得测试产品针对参考产品的相对效力值。
本发明通过下述非限制性实施例和测试实施例进行进一步描述，所述实施例仅给出用于举例说明性目的。本文引用的所有参考文献均整体引入作为参考。
实验
实施例1：配制以pH=7.0的HEPES。HEPES的分子量为238.3g/mol。因此，将6.044gHEPES称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为5.2。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到7.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=7.0的100mMHEPES缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mMHEPES缓冲液，将10mL100mMHEPES缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=7.0的10mMHEPES缓冲液也无菌过滤，以与得自GSKVaccinesHamilton，Montana的CRX-601一起使用。
实施例2（比较）：配制以pH=8.0的HEPES。HEPES的分子量为238.3g/mol。因此，将6.044gHEPES称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为5.2。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到8.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=8.0的100mMHEPES缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mMHEPES缓冲液，将10mL100mMHEPES缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=8.0的10mMHEPES缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例3：配制以pH=7.0的AGP和HEPES。通过称重3.99mgCRX-601并且加入1.877mL10mMHEPES，随后在水浴超声处理器中超声处理，CRX-601以2mg/mL靶浓度在以pH=7.0缓冲的10mMHEPES中进行配制。在25分钟后，溶液是目视澄清的，但超声处理继续，因为本文采用其他缓冲液的其他CRX-601制剂仍未达到相似的目视外观。实现这点是因为目的是对每种CRX-601缓冲制剂实施相同量的加工能量。
实施例4（比较）：配制以pH=8的AGP和HEPES。通过称重3.99mgCRX-601并且加入1.877mL10mMHEPES，随后在水浴超声处理器中超声处理，CRX-601以2mg/mL靶浓度在以pH=8.0缓冲的10mMHEPES中进行配制。在25分钟后，溶液是目视澄清的，但超声处理继续，因为本文采用其他缓冲液的其他CRX-601制剂仍未达到相似的目视外观。实现这点是因为目的是对每种CRX-601缓冲制剂实施相同量的加工能量。
配制非HEPES缓冲液。关于每种缓冲液的pH在关于分别缓冲液的缓冲能力内。关于每种缓冲液的制剂配方在下文描述。
实施例5：以pH=5.0的乙酸盐缓冲液。乙酸铵的分子量为77.08g/mol。因此，将1.927g乙酸铵称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为6.6。随后，逐滴加入乙酸，以达到5.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=5.0的100mM乙酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM乙酸盐缓冲液，将10mL100mM乙酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=5.0的10mM乙酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例6（比较）以pH=5.5的乙酸盐缓冲液。乙酸铵的分子量为77.08g/mol。因此，将1.927g乙酸铵称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为6.6。随后，逐滴加入乙酸，以达到5.5的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=5.5的100mM乙酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM乙酸盐缓冲液，将10mL100mM乙酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=5.5的10mM乙酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例7：以pH=5.0的柠檬酸盐缓冲液。柠檬酸三钠（脱水）的分子量为294.1g/mol，并且柠檬酸（一水合物）的分子量为210.14g/mol。因此，将3.670g柠檬酸三钠和2.627柠檬酸称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为4.1。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到5.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=5.0的100mM柠檬酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM柠檬酸盐缓冲液，将10mL100mM柠檬酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=5.0的10mM柠檬酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例8（比较）：以pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液。柠檬酸三钠（脱水）的分子量为294.1g/mol，并且柠檬酸（一水合物）的分子量为210.14g/mol。因此，将3.670g柠檬酸三钠和2.627g柠檬酸称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为4.1。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到6.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=6.0的100mM柠檬酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM柠檬酸盐缓冲液，将10mL100mM柠檬酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例9（比较）：以pH=6.1的柠檬酸盐缓冲液。柠檬酸三钠（脱水）的分子量为294.1g/mol，并且柠檬酸（一水合物）的分子量为210.14g/mol。因此，将3.670g柠檬酸三钠和2.627g柠檬酸称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为4.1。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到6.1的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=6.1的100mM柠檬酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM柠檬酸盐缓冲液，将10mL100mM柠檬酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=6.1的10mM柠檬酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例10（比较）：以pH=7.0的柠檬酸盐缓冲液。柠檬酸三钠（脱水）的分子量为294.1g/mol，并且柠檬酸（一水合物）的分子量为210.14g/mol。因此，将3.670g柠檬酸三钠和2.627g柠檬酸称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为4.1。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到7.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=7.0的100mM柠檬酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM柠檬酸盐缓冲液，将10mL100mM柠檬酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=7.0的10mM柠檬酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例11（比较）：以pH=7.0的TRIS缓冲液。TRIS的分子量为121.14g/mol。因此，将3.029gTRIS称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为10.5。随后，逐滴加入6NHCl，以达到7.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=7.0的100mMTRIS缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mMTRIS缓冲液，将10mL100mMTRIS缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=7.0的10mMTRIS缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例12（比较）：以pH=7.0的琥珀酸盐缓冲液。琥珀酸酐的分子量为100.07g/mol。因此，将2.502g琥珀酸酐称重，并且加入200mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为2.5。随后，逐滴加入5NNaOH，以达到7.0的最终pH。将溶液的体积补足至250mL，得到以pH=7.0的100mM琥珀酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来使用。为了制备10mM琥珀酸盐缓冲液，将10mL100mM琥珀酸盐缓冲液稀释到90mL无菌水（总体积=100mL）内。将所得到的以pH=7.0的10mM琥珀酸盐缓冲液也无菌过滤，以与CRX-601一起使用。
实施例13（比较）：以pH=7.0的磷酸盐缓冲液。磷酸钠（单碱式）的分子量为137.99g/mol，并且磷酸钠（二碱式）的分子量为141.96g/mol。因此，将0.059g磷酸钠（单碱式）和0.082g磷酸钠（二碱式）称重，并且加入80mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为7.0。将溶液的体积补足至100mL，得到以pH=7.0的10mM磷酸盐缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来与CRX-601一起使用。
实施例14（比较）：以pH=6.1的磷酸钠缓冲液。磷酸钠（二碱式）的分子量为141.96g/mol，并且氯化钠的分子量为58.5g/mol。因此，将7.098g磷酸钠（二碱式）和5.844g氯化钠称重，并且加入900mL无菌水，并且使用磁力搅拌器将混合物搅拌。溶液的pH测量为9.0。随后，逐滴加入6NHCl，以达到6.1的最终pH。将溶液的体积补足至1000mL，得到以pH=6.1的100mMNaCl和50mM磷酸钠（二碱式）缓冲液。将这种缓冲液无菌过滤用于未来与CRX-601一起使用。
实施例15
配制AGP和缓冲液。表1列出了在药学领域中视为有用的七种常见缓冲液。CRX-601以2mg/mL的靶浓度在表1中概括的缓冲液各自中进行配制。缓冲液配制为或接近其在表1中所示的报道的最佳pH下。
所有样品均在相同条件下进行加工，以定量由于特异性缓冲液而不是由于加工引起的CRX-601降解，除了乙酸盐缓冲液中的CRX-601花费很多时间加工之外。
表1
EE 缓冲液 组分 pH 浓度（mM） pKa（s） 对正文的参考
1 HEPES 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 7.0 10 3，7.6 实施例1
2 柠檬酸盐 柠檬酸钠（柠檬酸） 6.1 10 3.1，4.8，6.3 实施例9
3 磷酸盐 单碱式和二碱式磷酸钠 7.0 10 2.1，7.0，12.3 实施例13
4 琥珀酸盐 琥珀酸酐 7.0 10 4.2，5.6 实施例12
5 TRIS 氨基-2-羟甲基-甲烷（HCl） 7.1 10 8.3 实施例11
6 乙酸铵 乙酸铵（乙酸） 5.5 10 4.7，9.2 实施例6
7 磷酸盐 磷酸钠，NaCl 6.1 50 7.2 实施例14
缓冲溶液各自随后进行超声处理，以降低粒度以允许无菌过滤。表2显示了对于CRX-601缓冲制剂中的每一种，通过超声处理实现部分澄清的溶液（即，实现大约200nm的粒度）的加工时间。
表2
缓冲液 缓冲液的pH 至澄清溶液的目视外观（分钟）
1 HEPES 10 mM 7.00 25
2 柠檬酸钠10 mM 6.10 60
3 磷酸钠mM 7.15 15
4 琥珀酸钠10 mM 7.00 35
5 TRIS氯化物10 mM 7.10 60
6 乙酸铵10 mM 5.50 160
7 磷酸钠0.1 M　　在0.5 M盐水（LBH）中 6.10 80
降解使用加速稳定性测定，就在表中所示的浓度下的稳定性筛选表1的缓冲液1-7。缓冲液组合物在40℃下维持14天。通过测量就常见CRX-601降解物（图1中所示的结构）而言的组合物中的CRX-601百分比，来测定每种组合物中的CRX-601稳定性。图2中的曲线显示来自第一组缓冲液的数据，其用CRX-601进行筛选。与每个数据系列拟合的趋势线的斜率是CRX-601的降解速率的量度。有趣的是，发现在40℃下14天后，HEPES（pH=7.00）、乙酸盐（pH=5.50）和柠檬酸盐（pH=6.10）引起溶液中的最少CRX-601降解。磷酸钠（ph=7.15）、琥珀酸盐（pH=7.00）、TRIS（pH=7.10）和磷酸钠（pH=6.10）显示降低的稳定性，以及与HEPES（pH=7）相比较令人惊讶地降低的稳定性。在研究期间未观察到pH中的显著变化。关于所有制剂的粒度均保持稳定，除了显示降解的在脂质体水合缓冲液（LHB）和乙酸盐缓冲液中的CRX-601之外。
实施例16
稳定性/纯度。评估缓冲液，以鉴定pH对CRX-601的降解速率的作用；具体地，测试在以pH=5.0的乙酸盐，以pH7.0、8.0的HEPES，以及以5.0、6.0和7.0的柠檬酸盐中配制的CRX-601稳定性。为此，根据实施例1、2、5、7、8和10制备下述缓冲液：以pH7.0、8.0的HEPES，以5.0、6.0和7.0的柠檬酸盐，以及以pH=5.0的乙酸盐，并且在其中各自配制CRX-601，并且实施在40℃下14天的被迫降解。
通过就常见CRX-601降解物而言，测量组合物中的CRX-601百分比，来测定关于每种缓冲溶液的纯度。纯度数据在图3中标绘，并且指示以pH=7.0的HEPES导致最低限度降解，而在不同pH（pH=5）下，柠檬酸盐和乙酸盐均导致CRX-601的最低限度降解。
未观察到粒度中的显著变化，除了在以pH=5.0的柠檬酸盐缓冲液中的CRX-601之外，其显示粒度中的增加。对于本研究中的任何制剂，均未观察到pH中的显著变化。
实施例17
用另一种AGP测试缓冲液。另一种AGPCRX-527（得自GSKVaccines，Hamilton，Montana）在40℃下14天的加速稳定性研究中进行筛选，使用以pH=7.0的磷酸盐和HEPES缓冲液。通过测量就常见CRX-527降解物（图4中所示的结构）而言的组合物中的CRX-527百分比，来测定每种组合物中的CRX-527稳定性。同样地，如上所述，通过就常见CRX-601降解物而言，测量组合物中的CRX-601百分比，来测定关于缓冲溶液的纯度。图5中的曲线显示CRX-527连同CRX-601一起在两种缓冲液中的降解概况。与以相同pH（pH=7.0）的磷酸盐缓冲液相比较，HEPES为AGP提供了增强的稳定性。
实施例18
CRX-601长期稳定性/纯度。评估缓冲液，以鉴定pH对CRX-601的长期稳定性的作用；具体地，测试在以pH=5.0的乙酸盐、以pH7.0的HEPES和以5.0的柠檬酸盐中配制的CRX-601稳定性。为此，根据实施例1、5和7制备下述缓冲液：以pH7.0的HEPES、以5.0的柠檬酸盐和以pH=5.0的乙酸盐，并且在其中各自配制CRX-601，并且在2-8℃下贮存>1年。通过就常见CRX-601降解物而言，测量组合物中的CRX-601百分比，来测定关于每种缓冲溶液的纯度。纯度数据在图6中标绘，并且指示经过~1年的时期，在测试的缓冲液的任一种中不存在显著降解。因此，与乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液相比较，HEPES缓冲液为AGP化合物提供了在显著不同的pH值下的所需稳定性。
实施例19
CRX-601效力测试。MonoMac6细胞效力测定用于测量在以最佳pH的不同缓冲液中的CRX527的相对效力，以及在以最佳pH的不同缓冲液中的CRX601的相对效力。比较在HEPES中的CRX-527和CRX-527IN的效力的初始实验未显示效力中的显著差异。（数据未示出）然而，当针对CRX-601IN（2%含水甘油）参考制剂，在MM6细胞效力测定中筛选在以pH=7.0的HEPES、以pH=5.0的柠檬酸盐和以pH=5.0的乙酸盐中的CRX-601时，观察到效力中的明显差异。图7直到9中给出的效力结果显示：与CRX-601IN相比较，CRX-601乙酸盐和CRX-601柠檬酸盐具有小于50%效力。当通过台盼蓝染色时，在乙酸盐或柠檬酸盐缓冲制剂中未观察到显著的细胞死亡。相比之下，与CRX-601IN相比较，CRX-601HEPES具有CRX-601效力中的两倍增加。

Claims (49)

1.一种组合物，其包含（i）氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯或其药学可接受的盐，和（ii）足以提供药学可接受的pH范围的有效量的HEPES缓冲液。
2.权利要求1的组合物，其中所述缓冲液选自具有在药学可接受的pH范围内的pH的HEPES。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述缓冲液是具有约7至约8的pH的HEPES。
4.根据权利要求2的组合物，其具有约7.0的pH。
5.根据权利要求2的组合物，其具有pH=7.0。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯具有下述结构：
其中
m是0至6
n是0至4；
X是O或S；
Y是O或NH；
Z是O或H；
每个R1、R2、R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；
R4是H或甲基；
R5独立地选自-H、-OH、-（Cl-C4）烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8和–CONR8R9，其中R8和R9各自独立地选自H和（Cl-C4）烷基；和
每个R6和R7独立地是H或PO3H2。
7.权利要求6的组合物，其中n是包括0至2在内的整数。
8.权利要求6的组合物，其中R1、R2和R3各自独立地含有约7至约16个碳原子。
9.权利要求6的组合物，其中R1、R2和R3各自独立地含有约9至约14个碳原子。
10.权利要求6的组合物，其中n是0。
11.权利要求6的组合物，其中R5是CO2H。
12.权利要求6的组合物，其中R6是PO3H2。
13.权利要求6的组合物，其中R7是H。
14.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯具有下述结构：
其中X是O或S；Y是O或NH；Z是O或H；每个R1、R2和R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；，并且R4是H或甲基。
15.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯具有下述结构：
。
16.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯具有下述结构：
。
17.权利要求6的组合物，其中R6是磷酸基，并且抗衡离子选自单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。
18.权利要求17的组合物，其中所述抗衡离子是单乙醇胺。
19.权利要求14的组合物，其中所述抗衡离子是单乙醇胺。
20.权利要求1的组合物，其采取分散体的形式。
21.权利要求1的组合物，其采取溶液的形式。
22.权利要求20或21的组合物，其采取澄清溶液的形式。
23.权利要求22的组合物，其中所述混合物、溶液和澄清溶液是具有≤200mμ的粒度的纳米颗粒组合物。
24.权利要求23的组合物，其中所述溶液用作免疫调节剂。
25.权利要求1的组合物，其中如通过动态光散射（DLS）测量的，在40摄氏度下经过14天时期，所述组合物具有≤200纳米的无菌过滤的粒度。
26.权利要求1的组合物，其中如反相高效液相层析（RP-HPLC）测量的，在40摄氏度下14天后，所述组合物具有4.46%至5.93%的纯度百分比损失。
27.权利要求1的组合物，其中所述溶液用作免疫调节剂。
28.权利要求27的组合物，其中所述溶液用作疫苗佐剂。
29.根据权利要求28的组合物，其进一步包含抗原。
30.根据权利要求27的组合物，其适合于粘膜施用。
31.根据权利要求30的组合物，其适合于鼻内施用。
32.根据权利要求27的组合物，其在不存在外源抗原的情况下施用于受试者。
33.一种用于增强受试者的免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求1的药物组合物。
34.权利要求33的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
35.权利要求36的方法，其中所述哺乳动物是人。
36.权利要求35的方法，其进一步包括给所述受试者施用外源抗原。
37.权利要求36的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
38.权利要求37的方法，其中所述哺乳动物是人。
39.一种用于改善或基本上预防受试者中的传染病、自身免疫性疾病或过敏性状况的方法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求1的药物组合物。
40.权利要求39的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
41.权利要求40的方法，其中所述哺乳动物是人。
42.权利要求41的方法，其进一步包括给所述受试者施用外源抗原。
43.权利要求42的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
44.权利要求43的方法，其中所述哺乳动物是人。
45.权利要求1的方法，其中所述水是无菌的。
46.一种组合物，其包含（i）氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯或其药学可接受的盐，和（ii）足以提供药学可接受的pH的有效量的柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。
47.权利要求46的组合物，其中所述pH不大于6.5。
48.权利要求46的组合物，其中所述pH为约4.0至约6.0。
49.权利要求48的组合物，其中所述pH为约5.0。
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