KR101202553B1 - 신규 당지질 보조제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당지질, 약산, 알콜, 비-이온성 계면활성제 및 완충제를 포함하는 안정한 보조제 희석 스톡 용액 및 최종 보조제 용액을 제조하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

신규 당지질 보조제 조성물{NOVEL GLYCOLIPID ADJUVANT COMPOSITIONS}
본 발명은 당지질 보조제의 신규 조성물, 이의 사용방법 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 조성물은 응집없이 긴 기간동안 안정하다. 이들은 특히 백신을 포함한 다양한 약제의 전달에 유용하다.
백신은 일반적으로 사람 및 수의학적 동물이 세균, 바이러스 및 기생충에 의해 야기된 감염성 질병에 걸리는 것을 방지하기 위해 사용된다. 백신에 사용된 항원은 임의의 다양한 약제일 수 있지만 일반적으로 박멸된 병원성 미생물, 살아있지만 변형되거나 쇠약해진 병원성 미생물, 단백질, 재조합 단백질 또는 그의 분획으로 구성된다. 항원의 공급원이 무엇이든지 간에, 항원에 대한 숙주 면역 반응을 향상시키기 위해 보조제를 첨가할 필요가 종종 있다.
보조제는 다음 두가지 목표를 달성하기 위해 사용된다: 주사 부위로부터 항원을 서서히 방출하고 면역 시스템을 자극한다.
문헌에 보고된 첫번째 보조제는 프로인트 완전 보조제(Freund's Complete Adjuvant; FCA)이었다. FCA는 유중수적형 에멀젼 및 마이코박테륨 추출물을 함유 한다. 마이코박테륨 추출물은 조질의 형태로 면역자극성 분자를 제공한다. 유중수적형 에멀젼은 항원이 서서히 방출되는 데포(depot) 효과를 만들어내는 작용을 한다. 불행하게도, FCA는 내성이 열등하고 조절되지 않은 염증을 유발할 수 있다. 80년 전 FCA의 발견 이래로, 보조제의 원하지 않는 부작용을 감소시키기 위해 노력하여 왔다.
보조제 성질을 갖는 새로운 부류의 화합물을 포함하는 당지질 유사체가 현재 공지되어 있다. 미국 특허 제 4,855,283 호(이후 '283)에는 N-글라이코실아마이드, N-글라이코실우레아, N-글라이코실카바메이트, 구체적으로 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트(Bay R1005로 공지됨; O Lockoff, Angrew. Chem. Int. Ed. Engl.(1991) 30:1611-1620)를 포함하는 당지질 유사체의 합성이 개시되어 있다. '283 특허에 개시된 화합물은 보조제로서 사용하기에 특히 적절하다.
당지질 보조제 제형은 제작하기에 용이해야 하고 장시간 보관할 때 지질 성분의 응집을 나타내지 않으면서 안정적일 필요가 있다. 당지질 아마이드 또는 글라이코실아마이드의 비-아세테이트 형태는 매우 불용성이고 일반적으로 실온 또는 더욱 낮은 온도에서 저장할 때 용액으로부터 응집된다.
본원에 제공된 글라이코실아마이드를 포함하는 용액 및 보조제는 응집을 거의 나타내지 않고 매우 안정하다. 이들은 제조하기가 용이하고 공업적 규모로 제조될 수 있다. 액체 당지질 보조제 제형은 희석제로서 사용되어 동결건조된 항원 제제를 재수화시키기 위한 희석제로서 사용될 수 있다. 이들 제형의 안정성을 실시간으로 가속 안정성 시험 프로토콜을 통해 시험하기 위한 방법 또한 제공된다.
본 발명은 글라이코실아마이드 스톡 용액 및 당지질 보조제 용액을 만들거나 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 글라이코실아마이드 스톡 용액은 하기 화학식 I의 당지질을 알콜중에 용해시키고 적절한 양의 약산 + "비-이온성" 계면활성제와 결합함으로써 제조된다. 약산은, 당지질에 비해 몰과량으로 당지질 알콜 용액에 첨가한다. 한가지 실시태양에서, 당지질은 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-굴루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아마이드 하이드로아세테이트이다. 한가지 실시태양에서, 알콜은 에탄올이다. 한가지 실시태양에서, 약산은 아세트산이다. 한가지 실시태양에서, 비-이온성 계면활성제는 다양한 소비탄(스판(Span)®) 또는 폴리옥시에틸렌소비탄(트윈(Tween)®), 특히 모노라우레이트 소비탄(스판 20®) 및 모노라우레이트 폴리옥시에틸렌소비탄(트윈 20®)이다. 당지질 보조제 용액은 적절한 양의 글라이코실아마이드 스톡 용액을 "적절한 완충제"에 도입하여 제조한다. 본원에 개시된 최종 안정한 당지질 보조제 용액의 pH는 약 6 내지 약 8이어야 한다. 약 6 내지 약 7의 최종 pH가 바람직하다. 약 6.3 내지 약 6.4의 최종 pH가 기술된다. 당지질 보조제의 높은 염 농도, 즉 30 mM NaCl 이상은 피해야 한다.
이러한 두가지 용액은 하기에 더욱 상세히 예시되어 있다:
글라이코실아마이드 스톡 용액은
a) 약산으로부터 유도된 염 형태의 하기 화학식 I의 당지질;
b) HO-C1 -3 알킬인 알콜;
c) 1) 당지질 함량에 비해 몰 과량으로 존재하고, 2) 표준 표 또는 값을 사용할 때 약 1.0 내지 약 9.5의 pKa 값을 갖는 임의의 산인 약산; 및
d) 그 자신이 용해되어 있는 물질의 표면장력을 감소시키고 소수성의 한 성분과 친수성의 또 다른 성분을 갖는 물질인 비-이온성 계면활성제
을 포함하는 조성물이다:
Figure 112008053182348-pct00001
상기 식에서,
R1은 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 알킬 라디칼이고;
X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
R2는 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 또는 불포화 알킬 라디칼이고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2 -, -PO4 2 - 또는 -COC1 - 10알킬이고;
R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파기닐, L-아스파틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-아이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이들의 D-이성질체이다.
당지질 보조제 용액은 a) 글라이코실아마이드 스톡 용액; 및 b) 수의학 또는 의학용에 적합하고 수용액 중에서 약 6.0 내지 약 8.0의 비교적 일정한 pH를 유지할 수 있는 적절한 완충제를 포함하는 조성물이다.
달리 명시하지 않은 한, 본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 용어의 의미는 하기와 같다.
"알콜"이란 용어는 일반식 HO-C1 -3 알킬의 화합물을 말한다. 이는 메탄올, 에탄올, 또는 n-프로판올 또는 아이소-프로판올과 같이 임의의 형태의 프로판올일 수 있다. 에탄올이 바람직하다.
"알킬"이란 용어는 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소 잔기를 말한다.
"당지질"이란 용어는 하기 화학식 I의 화합물을 말한다. 이들 화합물은 1989년 8월 8일자로 허여된 미국 특허 제 6,290,971 호 및 미국 특허 제 4,855,283 호에 개시된다. 미국 특허 제 6,290,971 호 및 미국 특허 제 4,855,283 호 모두는 본원에서 그 전문을 참조로서 인용한다. 특히 여기에 개시된 당지질은 아세테이트 형태일 때 상표명 Bay R1005® 및 화학명 "N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트"를 갖는다. 이러한 화합물의 아 마이드 형태는 상표명 Bay 15-1583® 및 화학명 "N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드"를 갖는다.
화학식 I의 당지질은 하기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
화학식 I
Figure 112008053182348-pct00002
상기 식에서,
R1은 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 알킬 라디칼이고;
X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
R2는 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 또는 불포화 알킬 라디칼이고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2 -, -PO4 2 - 또는 -COC1 -10 알킬이고;
R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파기닐, L-아스파틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-아이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이들의 D-이성질체이다.
또 다른 구체적인 실시태양은 R1이 수소, 또는 포화 C12 -18 알킬이고; R2가 수 소, 또는 포화 C7 -11 알킬이고; X가 -CH2이고; R4 및 R5가 독립적으로 수소이고; R6이 L-류실로부터 선택되는, 화학식 I의 당지질이다.
화학식 I에 대한 변수들은 별개이고 독립적이며 변수들의 모든 조합이 본원에 개시되고 청구된다.
또 다른 실시태양에서, 당지질은 하기 화학식 IIa의 화합물이다:
Figure 112008053182348-pct00003
또 다른 실시태양에서, 당지질은 하기 화학식 IIb의 화합물이다:
Figure 112008053182348-pct00004
또 다른 실시태양에서, 당지질은 하기 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure 112008053182348-pct00005
화학식 III의 화합물은 아마이드 형태 또는 아세테이트 형태로 존재할 수 있다. 이러한 화합물의 아마이드 형태는 상표명이 Bay 15-1583®이다. 아세테이트 형태는 상표명이 Bay R1005®이다.
화학식 I의 당지질은 미국 특허 제 4,855,283 호로부터 공지된 하기 절차를 사용하여 제조할 수 있다.
화학식 I로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물은 치환 2-아미노-2-데옥시헥소오스에 기초한 것이다. 이러한 당은 항상 C-1, 즉 아노머 탄소(anomeric carbon) 원자를 통해 하기 화학식 Ia의 아실아마이도, 카브아마이도 또는 알콕시카보닐아마이도 기에 N-글라이코사이드 결합된다:
Figure 112008053182348-pct00006
상기 식에서,
R1, R2 및 X는 전술한 의미를 갖는다.
화학식 I의 본 발명에 따른 화합물에서 아미노 당의 2-아미노기는 α-아미노산 또는 α-아미노산 유도체에 아마이드적으로 결합된다.
아미노산은 글라이신, 사코신, 히푸르산, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 오르니틴, 시트룰린, 아르기닌, 아스파트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린, 트립토판 및 히스티딘과 같은 중성 L-아미노산이다. 아미노 당에 치환체로서 작용하는 D-아미노산, 예를 들면 D-알라닌, 또는 아미노 카복실산, 예를 들면 알파-아미노부티르산, α-아미노발레르산, α-아미노카프로산 또는 α-아미노헵탄산이 D- 및 L-형태 모두 또한 개시되어 있다.
화학식 I에 따른 화합물의 제조방법이 또한 제공된다. 이 방법은 아미노기 상에서 보호된 하기 화학식 IV의 2-아미노-2-데옥시글라이코피라노오즈 유도체로부터 출발하는 것을 포함한다:
Figure 112008053182348-pct00007
상기 식에서,
R10은 아미노기의 보호를 위한 보호기이고, 이는 펩타이드의 합성으로부터 공지되어 있고 적절하게는 선택적으로 제거될 수 있다.
적절한 보호기의 예는 아실기, 예를 들면 트라이플루오로아세틸 또는 트라이클로로아세틸, o-나이트로페닐설페닐, 2,4-다이나이트로페닐설페닐 또는 선택적으로 치환된 저급 알콕시카보닐기, 예를 들면 메톡시카보닐, t-부틸옥시카보닐, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐 또는 2,2,2-트라이클로로에틸옥시카보닐기이다. 적절한 N-보호된 아미노-헥소오스 유도체가 공지된다. 예를 들면, 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 문헌을 참조한다: 문헌[M.Bergmann and L.Zervas, Ber. 64, 975(1931)]; 문헌[D.Horton, J.Org.Chem.29, 1776(1964)]; 문헌[P.H.Gross and R.W.Jeanloz, J.Org.Chem.32, 2759(1967)]; 문헌[M.L.Wolfrom and H.B.Bhat, J.Org.Chem.32,1821(1967)]; 문헌[general: J.F.W.McOmie(Editor). Prot. Groups. Org. Chem., Plenum Press(1973)]; 문헌[Geiger in "The Peptides" Vol. 3, p 1-99, (1981) Academic Press]. 화학식 I에 따른 화합물의 제조를 위한 바람직한 아미노 보호기는 BOC 기(t-부틸옥시카보닐) 또는 Z 기(벤질옥시카보닐)이다.
화학식 IV 보호된 아미노 당 유도체를 제 1 반응 단계에서 하기 화학식 V의 아민과 반응시켜 하기 화학식 VI의 글라이코실아민을 수득한다:
H2N-R1
Figure 112008053182348-pct00008
상기 식에서,
R1은 전술한 의미를 갖는다.
이러한 유형의 글라코실아민 제제는 원칙적으로 공지되어 있고(ELLIS, Advances in Carbohydrate Chemistry 10, 95(1955)) 구체적으로 문헌[DE-OS(독일 공개 명세서) 제3,213,650호]에 개시되어 있다.
제 2 반응 단계에서, 화학식 VI의 글라이코실아민을 카복실 할라이드 또는 카복실산 무수물과 같은 하기 화학식 VII의 적절한 카복실산 유도체와 반응시킨다:
R11-CO-CH2-R4
상기 식에서,
R2는 전술한 의미를 갖고, R11은 예를 들면 염소와 같은 할로겐을 나타내거나, 또는 R2에 대한 전술한 의미를 갖는 -O-CO-R2, 또는 -O-CO-O 저급 알킬을 나타낸다. 이러한 방식으로, 하기 화학식 VIII의 글라이코실아마이드가 수득된다:
Figure 112008053182348-pct00009
상기 식에서,
R1 및 R2는 전술한 의미를 갖고,
R10은 R6과 동일하고,
X는 -CH2-를 나타낸다.
이러한 유형의 N-아실화를 위한 조건은 문헌[DE-OS(독일 공개 명세서) 제3,213,650호]에 기재되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 화학식 VI의 글라이코실아민은 유기 보조 염기의 존재하에 문헌으로부터 공지된 방법을 이용하여 1 내지 2 당량의 화학식 VII의 카보닐 클로라이드와 반응시키거나, 또는 화학식 R2-CH2-CO2H의 적절한 카복실산 및 에틸 클로로포르메이트 또는 아이소부틸 클로로포르메이트로부터 수득된 1 내지 2 당량의 혼합된 무수물과 반응시켜 X가 -CH2-인 화학식 VIII의 글라이코실아마이드를 수득한다.
이는 0 내지 50℃에서 유기 또는 수성-유기 용매중 적절하게는 유기 또는 무기 염기의 존재하에 수행된다. 적절한 희석제는 알콜, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올 또는 에터, 예를 들면 다이에틸 에터, 테트라하이드로푸란 또는 1,4-다이옥세인, 또는 할로겐화 탄화수소, 예를 들면 다이클로로메탄, 트라이클로로메탄 또는 1,2-다이클로로에탄 또는 N,N-다이메틸포름아마이드이다.
제 1 단계에서 수득된 화학식 VI의 글라이코실아민이 하기 화학식 IX의 할로게노포름산 에스터와 반응할 때, X가 산소인 화학식 VIII의 글라이코실카바메이트가 수득된다:
R12-CO-O-R2
상기 식에서,
R12는 예를 들면 염소 또는 브롬과 같은 할로겐이고,
R2는 전술한 의미를 갖는다.
한가지 실시태양에서, 화학식 VIII의 글라이코실아민을 1 내지 2 당량의 화학식 IX의 클로로카본산 에스터와 반응시켜 글라이코실카바메이트를 수득한다. 이는 바람직하게는 0 내지 50℃의 온도에서, 바람직하게는 실온에서 유기 또는 수성-유기 용매중 수행한다. 적절한 용매는 전술한 바와 같은 알콜, 에터, 할로겐화 탄화수소 또는 다이메틸포름아마이드이다.
제 1 단계에서 수득된 화학식 VI의 글라이코실아민 1 내지 2 당량의 하기 화학식 X의 유기 아이소사이아네이트와 반응할 때, X가 -NH-인 화학식 VIII의 글라이 코실우레아가 수득된다:
R2-NCO
상기 식에서,
R2는 전술한 의미를 갖는다.
전술한 반응과 같이 이러한 아실화 반응은 바람직하게는 유기 용매 중에서 -20 내지 60℃, 바람직하게는 0 내지 25℃의 반응 온도에서 수행된다. 적절한 용매는 상기한 알콜, 에터, 할로겐화 탄화수소 또는 다이메틸포름아마이드이다.
이러한 방식으로 수득된, X가 -CH2-인 화학식 VIII의 글라이코실아마이드, X가 -O-인 화학식 VIII의 글라이코실카바메이트 또는 X가 -NH-인 화학식 VIII의 글라이코실우레아는 그 자체로 공지된 방법에 의해 결정성 또는 비결정성 고형물 형태로 단리되고, 필요하다면 재결정화, 크로마토그래피, 추출 등과 같은 표준 절차에 의해 정제된다.
많은 경우, 화학식 VIII의 글라이코실아마이드, 글라이코실카바메이트 및 글라이코실우레아의 유도체를 유도하는 화학적 유도체화를 전술한 정제 단계와 동시에 또는 그 대신 수행하는 것 또한 유리한데, 이렇게 하면 양호한 결정화 특성을 갖는다. 이러한 유형의 화학적 유도체화는 본 발명에 따른 글라이코실아마이드, 글라이코실카바메이트 및 글라이코실우레아의 경우 예를 들면 당 잔기의 하이드록실기 상에서의 에스터화 반응이다. 적절한 에스터기의 예는 아세틸, 벤조일 또는 p-나이트로벤조일기이다.
글라이코실아마이드, 글라이코실우레아 또는 글라이코실카바메이트의 트라이-O-아실 유도체를 제조하기 위해, 화학식 VIII의 상응하는 트라이올을 무기 또는 유기 보조 염기의 존재하에 아실화제와 반응시킨다. 적절한 아실화제는 산 클로라이드, 예를 들면 아세틸 클로라이드, 벤조일 클로라이드 또는 p-나이트로벤질 클로라이드 또는 산 무수물, 예를 들면 아세트산 무수물이다. 이는 결과적으로 하기 화학식 XI의 에스터를 형성한다:
Figure 112008053182348-pct00010
상기 식에서,
R1, R2, R10 및 X는 전술한 의미를 갖고,
R13은 아세틸, 벤조일 또는 p-나이트로벤조일을 나타낸다.
O-아실화 반응은 바람직하게는 불활성 유기 용매 중에서 수행된다. 사용될 수 있는 용매는 할로겐화 탄화수소, 예를 들면 다이클로로메탄, 트라이클로로메탄 또는 1,2-다이클로로에탄, 에터, 예를 들면 테트라하이드로푸란, 또는 1,4-다이옥세인, 에스터, 예를 들면 에틸 아세테이트 및 아마이드, 예를 들면 다이메틸포름아마이드이다.
유기 염기 단독, 예를 들면 트라이에틸아민 또는 피리딘이 적절한 용매로서 언급될 수 있다. 사용될 수 있는 염기는 O-아실화를 위한 유기 화학중에 사용되는 모든 염기이다. 바람직하게는, 트라이에틸아민, 피리딘 또는 피리딘/4-다이메틸아미노피리딘 혼합물이 사용된다. 화학식 XI의 트라이에스터가 유기 용매로부터 용이하게 결정화될 수 있다. 결정화를 위해 특히 바람직한 것은 극성 용매, 예를 들면 단쇄 알콜 즉 메탄올, 에탄올, n-프로판올 또는 아이소프로판올이다. 화학식 XI의 트라이에스터의 결정화를 위해 적절한 다른 용매는 유기 용매와 극성 무기 또는 유기 용매의 혼합물, 예를 들면 테트라하이드로푸란-메탄올, 테트라하이드로푸란-물, 에탄올-물 및 아이소프로판올-물이다. 일회 또는 적절하게는 복수회 재결정화에 의해 정제된 화학식 XI의 트라이에스터는 3개의 O-아세틸 기의 가수분해 또는 에스터교환반응에 의해 화학식 VIII의 트라이올로 복귀된다. 많은 유형의 에스터 분할이 유기 화학 분야에 공지되어 있다. 언급된 화학식 XI의 트라이에스터로부터 화학식 VIII의 트라이올을 제조하기 위해, 메탄올 및 촉매량의 소듐 메탄올레이트의 존재하에 아실 기의 에스터교환반응이 이루어질 수 있고, 이는 유기 화학에서 ZEMPLEN 가수분해로 알려져 있다.
본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 제조에 있어서 제 3 반응 단계는 화학식 VIII의 화합물에서 당의 2-아미노기의 보호기의 선택적 분할을 포함한다. 이러한 반응에서, 화학식 VIII의 화합물에서 당의 1-아마이도 또는 1-카브아마이도 또는 1-(알콕시카보닐아마이도) 기가 동시에 제거되는 일이 없도록 특별한 주의가 이루어져야 한다.
아미노헥세인의 C-2 상에서 바람직하게 사용된 벤질옥시카보닐 기는, 가수소분해 조건하에 1-아마이도, 1-카브아마이도 또는 1-알콕시카보닐아마이도기를 보유하면서 정량적으로 그리고 선택적으로 분할될 수 있다. 이러한 가수소분해는 하기 화학식 XII의 구조를 갖는 당의 자유 2-아미노기를 갖는 글라이코실아마이드, 글라이코실우레아 또는 글라이코실카바메이트를 제공한다:
Figure 112008053182348-pct00011
상기 식에서,
R1, R2 및 X는 전술한 의미를 갖는다.
가수소분해에 적합한 촉매의 예는 활성 목탄 상에 흡착된 백금 또는 팔라듐과 같은 귀금속이다. 팔라듐/목탄(5% 또는 10%)이 바람직하게 사용된다. 가수소분해는 대기압 또는 승압하에 적절한 압력 용기중에 수행될 수 있다. 불활성 용매가 수소화를 위해 적절하고, 예를 들면 알콜(메탄올, 에탄올, 또는 프로판올), 에터(예를 들면 테트라하이드로푸란 또는 1,4-다이옥세인), 또는 카복실산(예: 아세트산), 또는 이들의 혼합물이 있다. 적절하게는, 용매는 물, 또는 염화수소산 또는 황상과 같은 희석산과 혼합된다. 물론, 이러한 산이 첨가될 때, 화학식 XII에 따른 2-아미노-2-데옥시-글라이코실아마이드, 2-아미노-2-데옥시-글라이코실카바메 이트 및 2-아미노-2-데옥시-글라이코실우레아가 이들 산의 암모늄 염으로서 수득된다. 화학식 VIII의 화합물에 있어서 마찬가지로 바람직하게 사용되는 t-부틸옥시카보닐 보호기가 염화수소산 또는 황산과 같은 무기산을 사용하여 문헌으로부터 공지된 방법에 의해 분할될 수 있다. 이러한 경우에도, 화학식 XII의 2-아미노-2-데옥시-글라이코실아마이드, 2-아미노-2-데옥시-글라이코실카바메이트 및 2-아미노-2-데옥시-글라이코실우레아가 분할을 위해 사용된 산의 암모늄 염으로서 선택적으로 수득된다.
본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 합성을 위한 제 4 반응 단계는 화학식 XII에 따른 아미노글라이코실아마이드, 아마이드, -카바메이트 또는 -우레아, 또는 이들의 염의 적절한 아미노산 유도체와의 연결기를 포함한다. 적절한 아미노산 유도체는 하기 화학식 XIII의 N-보호된 아미노산이다:
Figure 112008053182348-pct00012
상기 식에서,
R7은 전술한 의미를 갖고,
R8은 수소 또는 메틸이고,
R14는 펩타이드 합성에 통상적으로 사용된 보호기를 나타내고 펩타이드 결합을 보유하면서 선택적으로 다시 제거될 수 있다.
바람직하게 사용되는 화학식 XIII의 아미노기를 위한 보호기는 전술한 바와 같고, 벤질옥시카보닐 또는 t-부틸옥시카보닐기가 특히 바람직하다. 화학식 XII의 2-아미노-2-데옥시-글라이코실아마이드, -카바메이트 또는 -우레아와 화학식 XIII의 아미노산 유도체의 연결기는 하기 문헌의 통상적인 펩타이드 합성 방법에 의해 수행될 수 있다: 문헌[E. Wunsch 등: Synthese von Peptiden(Synthesis of peptides) in: Methoden der Org.Chemie(Methods of org.chemistry)(Houben-Weyl)(E.Muller, Editor), Vol XV/I and XV/2, 4th Edition, published by Thieme, Stuttgart(1974)].
통상적인 방법의 예는 수분제거제, 예를 들면 다이사이클로헥실카보다이이마이드 또는 다이아이소프로필카보다이이마이드의 존재하에 화학식 XII의 화합물중 아미노기와 화학식 XIII의 아미노산 유도체의 축합이다.
화학식 XII의 화합물과 화학식 XIII의 화합물의 축합은 또한 카복실기가 활성화될 때 수행될 수 있다. 가능한 활성화된 카복실기는 예를 들면 산 무수물, 바람직하게는 혼합된 산 무수물, 예를 들면 산의 아세테이트, 또는 산의 아마이드, 예를 들면 이미다졸라이드, 또는 활성화된 에스터이다. 활성화된 에스터의 예는 사이아노메틸 에스터, 펜타클로로페닐 에스터 및 N-하이드록시프탈이마이드 에스터이다. 또한, 활성화된 에스터는 카보다이이마이드와 같은 수분-제거제의 존재하에 화학식 XIII의 산 및 N-하이드록시숙신이마이드 또는 1-하이드록시벤조티아졸로부터 수득될 수 있다. 아미노산의 유도체가 공지되어 있고 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 화학식 XII의 아미노 화합물과 선택적으로 활성화된 화학식 XIII의 카복 실 화합물의 축합은 화학식 XIV의 펜타이도당지질을 제공한다:
Figure 112008053182348-pct00013
상기 식에서,
R1, R2, R7, R8, R14 및 X는 전술한 의미를 갖는다.
화학식 I에 따른 화합물의 제조를 위한 최종 공정 단계에서, 화학식 XIV의 화합물에서의 보호기 R14가 제거된다. 이러한 단계에서, 화학식 XIV의 화합물에 존재하는 다른 아마이드, 우레탄 또는 우레아기가 분할되지 않도록 주의를 기울여야 한다. 화학식 XIV의 화합물, N-카보벤즈옥시 기 및 N-t-부틸옥시카보닐 기의 화합물에서 바람직하게 사용되는 보호기 R14는 아마이드, 우레탄 또는 우레아기를 유지하면서 제거될 수 있다. 카보벤즈옥시 기는 예를 들면 목탄 상의 팔라듐과 같은 귀금속의 존재하에 가수소분해에 의해 에탄올, 메탄올, 빙초산 또는 테트라하이드로푸란과 같은 적절한 용매중에 선택적으로 제거될 수 있다. 용매는 순수한 용매로서 사용하거나 서로 결합하거나 물과 결합할 수 있다. 반응을 대기압 또는 승압하에 수행할 수 있다. 화학식 XIV의 화합물에서 t-부틸옥시카보닐 기 R14를 가산분해 방법에 의해 제거할 수 있다. 적절한 조건의 예는 실온에서 예를 들면, 빙초 산, 다이에틸 에터, 다이옥세인 또는 에틸 아세테이트와 같은 적절한 용매중 염화수소의 사용이다. t-부틸 카바메이트의 분할에 대한 이러한 유형의 방법이 원칙적으로 공지되어 있다. 이러한 방식으로 수득된 화학식 I의 펩타이도글라이코실아마이드, 펩타이도글라이코실카바메이트 및 펩타이도글라이코실우레아가 당해 공지된 방법에 의해 결정성 또는 비결정성 고형물 형태로 단리되고, 필요하다면 재결정화, 크로마토그래피, 추출 등과 같은 표준방법에 의해 정제된다.
화학식 I의 본 발명에 따른 화합물이 또한 마찬가지로 양호한 결과를 갖는 제 2 합성 경로에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제 2 합성 경로는 합성 단위체 아미노 당 아미노산, 아민 R1-NH2 및 카복실산 R2-CH2-CO2-H 또는 카복산 유도체 R2-O-CO-할로겐 또는 R2-NCO(여기서, R1 및 R2는 전술한 의미를 갖는다)의 연결기의 서열이 상이하다는 점에서 전술한 제 1 경로와 상이하다. 제 2 경로에서, 하기 화학식 XV의 적절한 2-N-(아미노아실)아미노당이 출발 성분으로서 사용된다:
Figure 112008053182348-pct00014
상기 식에서,
R7 및 R8의 전술한 의미를 갖고,
R14는 펩타이드 화학에 공지된 아미노 보호기, 바람직하게는 벤질옥시카보닐 또는 t-부틸옥시카보닐 기이다.
이어서, 수득된 화학식 XV의 화합물을 화학식 III의 아미노 화합물과 축합하여 하기 화학식 XVI의 글라이코실아민을 수득한다:
Figure 112008053182348-pct00015
상기 식에서,
R1, R7, R8 및 R14는 화학식 I에서의 의미를 갖고 R6의 정의를 갖는다.
화학식 VI의 화합물의 제조를 위해 전술한 모든 방법을 화학식 XVI의 화합물의 제조를 위해 사용할 수 있다. 이어서, 화학식 XVI의 화합물을 화학식 VII의 상기 카복실산 유도체 또는 화학식 IX의 할로게노포름산 에스터와 반응시키거나 화학식 X의 유기 아이소사이아네이트와 반응시켜 X가 -CH2-인 화학식 XIV의 2-(아미노아실)-아미노글라이코실아마이드, 또는 X가 -0-인 화학식 XIV의 2-(아미노아실)-아미노글라이코실카바메이트, 또는 X가 -NH-인 화학식 XIV의 2-(아미노아실)-아미노글라이코실우레아를 수득한다. 이 아실화 반응은 일반적으로 글라이코실아민과 카복 실산 또는 카본산 유도체와의 반응에 대해 전술한 방법에 의해 수행될 수 있다.
이러한 방식으로 수득된 화학식 XIV의 중간체를 전술한 물리적 정제 방법에 의해 정제할 수 있다. 그러나, 화학식 XIV의 화합물을 전술한 O-아실화 방법에 의해 화학식 하기 XVII의 트라이-O-아세테이트 또는 트라이-O-벤조에이트로 전환하는 것이 바람직하다:
Figure 112008053182348-pct00016
상기 식에서,
치환기는 화학식 I의 치환기 정의와 동일하다.
이들 화합물은 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 용매로부터 용이하게 결정화됨으로써 정제된다. 화학식 XVII의 정제된 결정성 유도체를 전술한 에스터 가수분해 방법에 의해 당 화학 분야에서 특히 광범위하게 사용되는 화학식 XIV의 트라이올로 전환시킨다. 화학식 XIV의 화합물에서 아미노산의 보호기의 최종 제거는 이미 화학식 I의 화합물의 제조에 대해 전술하였다. 본 발명은 또한 화학식 I의 화합물의 염에 관한 것이다. 이들은 일차적으로 약학에서 통상적으로 사용될 수 있는 무독성 염, 예를 들면 클로라이드, 아세테이트 및 락테이트, 또는 화학식 I의 화합물의 불활성 염이다.
"약산"이란 용어는 표준 표 또는 값을 사용할 때 약 1.0 내지 약 9.5의 pKa(Ka의 -log) 값을 갖는 임의의 산을 의미한다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 약산의 하기 예가 명칭, 화학식 및 대략적인 pKa와 함께 기재된다: 아세트산, H(C2H3O2)(pKa 4.76); 아스코르브산(1), H2(C6H6O6)(pKa 4.10); 아세틸살리실산, H8(C9O4)(pK 3.5); 부탄산 H(C4H7O2)(pKa 4.83); 카본산, H2CO3(pKa 4.83, 형태 1); 크롬산, HCrO4 -(pKa 6.49, 형태 2); 시트르산, H3(C6H5O7)(pKa 3.14, 형태 1); 시트르산, (H2C6H5O7)-(pKa 4.77, 형태 2); 시트르산, (HC6H5O7)2-(pKa 6.39, 형태 3); 포름산, H(CHO2)(pKa 3.75); 푸마르산, H4(C4O4)(pKa 3.03); 헵탄산, H(C7H13O2)(pKa 4.89); 헥산산, H(C6H11O2)(pKa 4.84); 하이드로플루오르산, HF(pKa 3.20); 아이소시트레이트, H8(C6O7)(pKa 3.29); 락트산, H(C3H5O3)(pKa 3.08); 말레산, H4(C4O4)(pKa 1.83); 니코틴산, H5(C6NO2)(pKa 3.39); 옥살산, H2(C2O4)(pKa 1.23, 형태 1); 옥살산, (HC2O4)-(pKa 4.19, 형태 2); 펜탄산, H(C5H9O2)(pKa 4.84); 인산, H3PO4(pKa 2.16, 형태 1); 프로판산, H(C3H5O2)(pKa 4.86); 피루브산, H4(C3O3)(pKa 2.39); 숙신산 H6(C4O4)(pKa 4.19) 및 트라이클로로아세트산, H(C2Cl3O2)(pKa 0.70). 이들 산의 임의의 조합물 또한 예시된다.
아세트산이 바람직하다. 아세틸살리실산, 시트르산, 포름산, 푸마르산, 하 이드로플루오르산, 아이소시트레이트, 말레산, 니코틴산, 인산, 피루브산, 숙신산 및 트라이클로로아세트산은 개별적으로, 조합하여 및 집합적으로 포괄하는 보다 통상적인 약산이다.
"비-이온성 계면활성제"란 용어는 그 자산이 용해되어 있는 물질의 표면장력을 감소시키는 물질인 계면활성제를 의미하고, 비-이온성은 전기적으로 하전되지 않은 극성기를 갖는 것을 의미한다. 양친매성 계면활성제란 용어는 계면활성제 분자의 일부가 소수성을 나타내고 일부는 친수성을 나타내는 계면활성제를 의미한다. 적절한 계면활성제는 비-이온성 및 양친매성을 나타내고 수의학 또는 의학적 용도로 허용가능하다. 특정 비-이온성 계면활성제가 의학적 또는 수의학적 용도로 허용가능한지 여부는 당해 기술분야의 숙련인에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 많은 적절한 비-이온성 계면활성제가 존재하고 수많은 예가 후술되어 있다.
잘 공지되어 있는 두 가지 유형의 비-이온성 계면활성제가 본원에 포함된다. 이들은 스판® 상표명하에 통상적으로 판매된 소비탄으로 공지되고, 트윈® 상표명하에 통상적으로 판매된 폴리옥시에틸렌 소비탄으로 공지되며, 본원에서 구체적으로 포함된 것은 다음과 같다:
소비탄 모노라우레이트(스판 20®), 소비탄 모노팔미테이트(스판 40®), 소비탄 모노스테아레이트(스판 60®), 소비탄 트라이스테아레이트(스판 65®), 소비탄 모 노올레에이트(스판 80®), 소비탄 트라이올레에이트(스판 85®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트(트윈 20®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노팔미테이트(트윈 40®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노스테아레이트(트윈 60®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이트(트윈 80) 및 폴리옥시에틸렌소비탄 트라이올레에이트(트윈 85). 이 설명은 상기 상표명 성분들 또는 이들의 등가의 성분들을 이들 계면활성제에 대한 공급 카탈로그에 열거된 바와 같이 포함하기 위한 것이다. 계면활성제는 개별적으로 또는 임의의 조합물로서 사용될 수 있다.
소비탄 모노라우레이트(스판 20®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트(트윈 20®), 소비탄 모노올레에이트(스판 80®), 소비탄 트라이올레에이트(스판 85®), 폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이트(트윈 80) 및 폴리옥시에틸렌소비탄 트라이올레에이트(트윈 85)가 특히 기재된다.
"적절한 완충제"란 용어는 수의학 또는 의학 용도에 적합하고 수용액 중에서 약 6 내지 약 8의 비교적 일정한 pH를 유지할 수 있는 완충제를 의미한다. 포스페이트 완충제는 본원에 개시된 한가지 실시태양이다. 포스페이트 완충제는 소듐 포스페이트 및/또는 포타슘 포스페이트의 일염기성 염 및 이염기성 염을 상이한 비율로 혼합함으로써 광범위한 범위 내의 특정 pH에서 제조할 수 있다. 다양한 소듐 및 포타슘 완충제의 제조 및 그 용도가 당해 기술분야의 숙련인들에게 잘 공지되어 있다.
완충제의 다른 예는 다음과 같다:
2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES로도 공지됨);
3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS로도 공지됨);
n-[트리스(하이드록시메틸)]-2-아미노에탄설폰산(TES로도 공지됨);
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES로도 공지됨);
[트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신(TRIS로도 공지됨).
부분 I. 용액의 제조
본원에 개시된 신규 제형은 1) 글라이코실아마이드 스톡 용액 및 2) 당지질 보조제 용액이다.
1) 글라이코실아마이드 스톡 용액은 당지질을 알콜에 용해하고 적절한 양의 약산을 혼합함으로써 제조된다. 약산은 당지질 알콜 용액에 당지질에 비해 과량의 몰로 첨가된다. 비-이온성 계면활성제를 당지질 알콜 산 혼합물에 첨가하여 글라이코실아마이드 스톡 용액을 제조한다. 예시된 당지질은 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-굴루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아마이드 아세테이트이다. 예시된 알콜은 에탄올이다. 예시된 약산은 아세트산이다. 비-이온성 계면활성제는 전술한 바와 같다.
글라이코실아마이드 스톡 용액의 제조
약산을 당지질을 함유하는 알콜성 용액에 첨가한다. 약산을 당지질 함량에 비해 과량의 몰로 첨가한다. 약산 성분은 당지질, 즉 당지질의 몰당량의 1.25 내지 5배의 양으로 첨가되어야 한다. 특정 실시태양에서, 하기 상대적 산의 양이 추천된다. 약산은 당지질의 몰의 2.0배, 2.5배, 2.7배, 3.0배, 및 5.0배이어야만 하고, 가장 바람직하게는 2.7배이어야만 한다.
비-이온성 계면활성제를 약산을 첨가하기 전 또는 후에 상기 알콜 당지질 혼합물에 첨가하여 최종 글라이코실아마이드 스톡 용액을 생성한다.
약산의 존재하에, 글라이코실아마이드는, 당지질의 아세테이트 형태로 전환된다. 화학식 I의 당지질은 단순히 수성 완충 용액 내로 직접 도입할 때 완전한 가용성을 나타내지 않는다. 화학식 I의 당지질을 수성 완충 용액에 용해함으로써 수득한 용액은 일반적으로 유백색 혼합물이다. 초기 연구원들은 유백색 용액을 고주파 분해함으로써 균일한 혼합물 용액을 제조하고자 하였다. 그러나, 고주파 분해는 용액이 저장되는 동안에 균질성을 유지할 것이라는 보장을 하지 못한다. 이들 화합물을 부유시키는 화학적 방법은 적절한 pH에서 거의 광학적으로 투명하고 완전한 가용성을 나타내는 수성 완충 당지질 용액을 생성하였다. 약산이 당지질에 비해 과량으로 첨가될 때, 모든 당지질이 가용성 형태로 전환되고, 이들의 불용성 형태로 복귀되는 것이 확실히 방지될 수 있다.
약산은 당지질을 약학적으로 허용가능한 염으로 전환시킨다. 바람직한 염은 무-독성 염이고, 약제학적 및 생물학적 제제에 통상적으로 사용된다. 예를 들면, 화학식 I의 화합물의 클로라이드, 아세테이트, 락테이트 및 불활성 염이 본원에 개시된 약산으로서 수득된다.
당지질을 용해하기 위해 사용된 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올의 임의의 이성질체 형태, 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 생성된 당지질 알콜 용액은 광학적으로 투명하다. 당지질의 아세테이트의 형태를 비-아세테이트 형태로 복귀시킬 수 있는 임의의 화학적 반응이 수성 용액 중에서의 당지질의 응집을 유발할 것이다. 당지질의 응집이 발생하면, 당지질 분자는 용액으로부터 얇은 플레이크로서 생성되어 용기의 바닥에 가라앉는다. 당지질 및 알콜의 글라이코실아마이드 스톡 용액중 약산의 초기 농도는 당지질의 임의의 응집이 발생할 것인지 여부를 결정한다. 약산은 응집을 피하기 위해 당지질에 비해 과량의 몰로 존재해야 한다.
2) 당지질 보조제 용액을 적절한 양의 글라이코실아마이드 스톡 용액을 "적절한 완충제" 내로 도입함으로써 제조한다. 본원에 개시된 안정한 최종 당지질 보조제 용액의 pH는 약 6 내지 약 8이어야 한다. 약 6 내지 약 7의 최종 pH가 바람직하다. 약 6.3 내지 약 6.4의 최종 pH가 기재된다.
글라이코실아마이드 스톡 용액은 과량의 산을 함유하므로 보조제로서 사용되기 위해서는 완충되어야 한다. 예를 들면, 포스페이트 완충제는 소듐 포스페이트 또는 포타슘 포스페이트의 일염기성 염과 이염기성 염을 상이한 비율로 혼합함으로써 넓은 범위 내의 특정 pH에서 제조할 수 있다. 포스페이트 완충제가 사용되면, 약 20 mM에서 제조될 수 있고, 이는 약 7.8의 pH를 갖는다. 글라이코실아마이드 스톡 용액이 완충제에 첨가되면, 완충제의 pH가 강하된다. pH 7.8에서 포스페이트 완충 용액은 약 6.4의 pH를 갖는 최종 당지질 보조제 용액을 생성한다. 최종 pH 조절이 이루어질 수 있지만 일반적으로 필요하지는 않다.
약산 및 당지질을 함유하는 글라이코실아마이드 스톡 용액은 매우 낮은 pH를 갖는다. pH를 허용가능한 수준까지 올리는 것이 필요할 수 있다. 강염기는, 강염기의 첨가가 당지질의 염 형태를 비-염 형태로 복귀시켜, 결과적으로 수성 환경에서 비-염 형태의 침전(응집)을 만들 수 있기 때문에 이러한 목적에서 회피된다. 그러나, 강염기가 바람직한 경우, 단지 소량이 사용되어야 한다. 예를 들면, 100mM NaOH 이하가 사용되는 것이 권장되며, 4.0mM 이하가 최적이다.
완충 용액은 선택적으로 어느 정도의 NaCl을 포함할 수 있지만 요구되지는 않는다. NaCl 농도는 약 1 내지 약 50 mM이다. 더 낮은 양의 NaCl이 더 많은 양보다 바람직하다. 예를 들면 NaCl를 전혀 갖지 않거나 15mM NaCl을 갖는다. 100mM NaCl은 응집이 발생하기 때문에 적절하지 않다. 15 mM 이하의 NaCl 농도에서는 어떠한 응집도 예상되지 않는다. 30 mM 이하의 NaCl 농도로 어떠한 응집도 예상되지 않는다. 50 mM 이하의 NaCl 농도로 어떠한 응집도 예상되지 않는다.
부분 II . 당지질 보조제 용액의 특성화
저장 기간 동안 당지질 보조제 용액의 안정성은 단순히 육안으로 관찰하거나 또는 적절한 분석 기기를 사용하여 모니터링될 수 있다. 당지질 분자는 수용액 상태일 때 미셀(micell)을 형성하고 레이저 자동회절계로 정확하게 미셀의 크기를 측정할 수 있다. 이러한 측정은 당지질 분자의 응집이 존재하는지 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
실시간 안정성 측정에 대한 선택적인 접근법은 가속 안정성 시험을 수행하는 것이다. 가속 안정성 시험으로, 보조제 용액은 약 7일 동안 약 37℃에서 도입되고 일정한 진탕하에 약 2일 동안 약 4℃에서 배양된다. 약 7일 동안 약 37℃에서의 배양은 약 1년 동안 약 4℃에서의 저장을 나타낸다. 약 2일 동안 일정한 진탕하에 약 4℃에서의 배양은 당지질 보조제 용액이 수송되는 동안 직면할 수 있는 스트레스 조건을 나타낸다.
당지질 보조제 용액이 세포질과의 등장성을 나타내는 지를 결정하기 위해, 삼투성을 측정할 수 있다. 상이한 농도의 염화나트륨을 첨가할 수 있고 생성된 용액의 삼투성은 삼투압계를 사용하여 측정하였다. 삼투성을 증가시키는 것 이외에, 염화나트륨의 농도를 증가시키는 것 또한 용액을 더욱 탁하게 만드는 경향이 있다. 탁도는 더 큰 입자로 미셀을 응집시킴으로써 유발될 수 있는 것으로 생각된다. 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하기 어렵거나 불가능한 용액은 일반적으로 공업적 용도로 허용되지 않는데, 왜냐하면 최종 여과가 공업적 규모로 제조된 보조제 용액의 멸균성을 확실히 하기 위해 종종 사용되기 때문이다. 전자현미경 분석을 이용하여 너무 많은 염의 결과로서 미셀의 응집이 있는 지를 확인할 수 있다.
부가적인 비-당지질 보조제가 전술한 것과 함께 당지질 보조제 용액에 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 부가적인 면역자극성 분자가 당지질 보조제 용액에 첨가된다. 면역자극성 분자는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고, 이들은 사포닌, 퀼 A(Quil A), 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA) 및 카보폴(Carbopol)을 포함한다.
퀼 A는 남미산 나무 퀼라하 사포나리아(Quillaja saponaria)의 나무 껍질로부터의 정제된 추출물이다. 퀼 A는 체액성 반응 및 세포-매개된 반응 모두를 유도한다. 콜레스테롤이 적절한 비율로 첨가될 때 덜 바람직한 부작용을 제거하기 때 문에 퀼 A는 종종 콜레스테롤과 함께 사용된다. 콜레스테롤은 퀼 A와 불용성 착체를 형성하는데, 이때 콜레스테롤은 퀼 A와 결합할 때 나선형 구조를 형성함으로써 면역 반응을 자극하는 도움을 주는 분자의 당 단위체를 노출시킨다.
다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드 DDA는 18개의 탄소 알킬 쇄를 갖는 양이온성 계면활성제이다. 이는 양친매성 4급 아민이다. DDA와 항원의 직접적인 상호작용이 최적 면역 반응을 수득하는 데 필요한데, DDA가 오일/물 계면에서 항원의 직접 결합을 통해 항원의 담체로서 기능하기 때문이다. 이는 체액성 면역 반응 및 세포-매개 면역 반응 모두를 자극한다.
카보폴은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 또 다른 유용한 면역자극성 분자이다. 이는 폴리알케닐 에터와 가교결합된 아크릴산 단독중합체이다.
부분 III . 당지질 보조제 용액의 사용
약학적으로 허용가능한 염 형태의 당지질 보조제 용액은 항원과 혼합될 수 있다. 손쉬운 항원은 미생물 병원균 단백질, 당단백질, 지방 단백질, 펩타이드, 당펩타이드, 지방 펩타이드, 유독소, 탄화수소, 및 종양 특이적 항원을 포함한다. 항원은 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 미생물 병원균으로부터 항원은 질병 유발 박테리아, 바이러스, 및 기생충을 포함한다. 두개 이상의 항원의 혼합물이 사용될 수 있다. 항원은 박멸되거나, 자연적으로 쇠약해지거나, 변형된 채 살아있거나, 단백질 추출물, 재조합적으로 생성된 단백질, 화학적으로 합성된 펩타이드 또는 면역반응을 자극하는 다른 것일 수 있다. 펩타이드 항원은 유리 펩타이드로서 존재하거나 당지질에 공액되거나 다른 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프에 공액된 상태로 존재할 수 있다.
안정한 당지질 보조제 용액은 보조적 성질을 갖는 것으로 알려진 부가적인 보조제 또는 성분과 조합될 수 있다. 당지질 보조제 용액과 조합될 수 있는 부가적인 보조제는 중합체, 조질 또는 부분적으로 정제된 형태로 자연적으로 발생하는 터페노이드 화합물, 양친매성 4급 아민, 세균성 세포벽 물질의 유도체 및 세균성 세포벽 또는 DNA 성분의 합성 유사체의 유도체를 포함한다. 당지질 보조제 용액은 항생물질 또는 상이한 항원과 같은 하나 이상의 시약과 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 세균성 또는 바이러스 항원은 박멸되거나 변형된 채 살아 있다. 박멸된 바이러스 항원은 바이러스를 조직 배지 중에서 생장시키고 바이러스를 화학적 처리를 통해 불활성화시킴으로써 제조한다. 몇가지 바이러스는 부화란 내에서 생장할 수 있다. 박멸된 바이러스 항원을 당지질 보조제 용액을 함유하는 용액에 첨가하고 생성된 용액을 사용하여 동물을 백신화하여 바이러스 감염에 대해 보호할 수 있다.
본 발명의 한가지 실시태양에서, 당지질 보조제 용액을 변형된 채 살아 있는 바이러스 항원에 대한 희석제로서 사용할 수 있다. 바이러스 병원체는 이들을 조직 배지 중에서 몇 세대 동안 계대배양하거나 바이러스 게놈을 특이적으로 조작함으로써 약독화시킬 수 있다. 이러한 약독화된 바이러스 균주는 조직 배지 중에서 매우 높은 역가까지 생장할 수 있고 백신 항원으로서 사용될 수 있다. 약독화된 바이러스 균주는 변형된 살아있는 바이러스 항원으로서 언급된다. 이들 균주는 독성을 덜 나타내지만, 백신 내에서 항원으로서 사용될 때 여전히 높은 면역원성을 나타내면서 독성 균주에 의한 감염으로부터 보호를 제공한다. 당지질 보조제 용액 이 변형된 살아 있는 바이러스 항원에 대해 희석제로서 사용되는 경우, 당지질 보조제 용액을 시험하여 관심 대상인 특정 바이러스에 대해 어떠한 살바이러스성 효과도 갖지 않는다는 것을 확인해야 한다.
변형된 살아 있는 바이러스 항원에 대한 당지질 보조제 용액의 살바이러스성은 시험관내 실험에서 측정될 수 있다. 동결건조된 바이러스 항원은 당지질 보조제 용액 또는 물로 재수화된다. 생성된 바이러스 용액을 허용성(permissive) 세포로 이루어진 단일층 상에 평판배양한다. 바이러스 항원의 역가는 단일층 상에 형성된 플라크의 수를 계수함으로서 측정한다. 물과 당지질 보조제 용액으로 재수화된 샘플 사이에 수득된 바이러스 역가에서의 차이를 이용하여, 임의의 살아 있는 바이러스상에 대한 당지질 보조제 용액의 살바이러스성 효과가 있다면 그 효과가 어느 정도인지를 측정할 수 있다.
변형된 살아 있는 바이러스 항원을 동결건조하고 공업적 백신 제제중 동결건조 케이크로서 공급하였다. 일반적으로 변형된 살아 있는 바이러스 항원의 이들 동결건조된 케이크를 묽은 용액으로 재수화하고 비경구용 백신의 제조를 위해 사용한다. 희석제의 예는 포스페이트 완충 식염수를 함유하는 수용액을 포함한다. 희석제 용액이 공지된 면역자극 분자를 함유하는 경우, 변형된 살아 있는 바이러스 항원을 사용한 백신 제조의 효율이 향상될 수 있다. 본 발명의 한가지 실시태양에서, 당지질 보조제 용액을 희석 용액으로서 사용된다.
실시예 1
동등한 농도의 Bay 15-5831® 및 아세트산을 갖는 불용성 글라이코실아마이드 조성물의 제조
공업적 용도에 적절하지 않은 조성
시약 양(200 mL)
에탄올(100%) 176.1mL
트윈 20 4.0mL
빙초산 1.5mL
Bay 15-5831® 18.4gm
Bay 15-5831®은 바이엘 캄파니(Bayer Company) 명의하에 등록되어 있고, 이는 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-굴루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아마이드에 대한 상표명이다. 이러한 화합물이 상기 표 1에 기재된 조성을 사용하여 보조제 용액을 제조할 때, 아세트산은 당지질에 대해 등몰량의 농도로 사용되고 당지질은 그 유리 염기 형태로 있으며, 당지질은 불용성을 나타내고 응집한다.
실시예 2
당지질의 농도에 비해 증가된 아세트산 농도라는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 성분을 사용하는 가용성 글라이코실아마이드 스톡 용액은 가용성 글라이코실아마이드 스톡 용액을 생성한다.
글라이코실아마이드 스톡 용액의 조성
시약 양(50 mL)
에탄올(60% v/vol) 44.64 mL
트윈 20 1.12mL
빙초산 0.68mL
Bay 15-5831® 3.49gm
본 실시예에서는 60% 에탄올(v/v)을 사용하고, 아세트산대 당지질의 몰비는 2.0이다. 실시예 1의 200-표준도수 에탄올을 60% 에탄올 물로 대체하였다. 생성된 글라이코실아마이드 스톡 용액은 광학적으로 투명하고 용기의 바닥에 어떠한 침전도 없었다. 이러한 글라이코실아마이드 스톡 용액을 다양한 완충제에 첨가하여 하기 실시예 3에서 당지질 보조제 용액을 제조한다.
실시예 3
당지질 보조제 용액의 제조
상이한 pH에서 포스페이트 완충제 용액을 제조하였다. 탈이온수 250 mL중 138g의 NaH2PO4·H2O 염을 비이커 내에 용해시키고 최종 부피가 500 mL가 되게 함으로써 일염기성 소듐 포스페이트의 2M 스톡 용액을 제조하였다. 마찬가지로, 탈이온수 300 mL중 142g의 NaH2PO4을 비이커 내에 용해시키고 최종 부피가 500 mL가 되게 함으로써 이염기성 소듐 포스페이트 용액의 2M 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 용액 둘다를 0.2 마이크론 필터를 사용하여 멸균 여과하였다.
상이한 pH에서 소듐 포스페이트 완충제 용액의 1M 스톡 용액의 조성
계산된 pH Na2HPO4용액
(mL)		 NaH2PO4·H2O 용액 (mL) 2M 스톡 용액의 총 부피(mL) 첨가된 멸균 DI수(mL) 1M 스톡 용액의 총 부피(mL)
6.0 87.7 12.3 100 100 200
6.5 68.5 31.5 100 100 200
7.0 39.0 61.0 100 100 200
7.5 16.0 84.0 100 100 200
7.8 8.5 91.5 100 100 200
표 3에 나타낸 바와 같이, 상이한 부피의 2M 일염기성 소듐 포스페이트 스톡 용액 및 이염기성 소듐 포스페이트 용액을 제조하였고, 이어서 소듐 포스페이트 완충 용액의 1M 스톡 용액을 상이한 pH 수준에서 수득하였다. 이어서 1M 포스페이트 완충제 용액을 50배 희석하고 20mM 포스페이트 완충제를 수득하였다.
당지질 보조제 용액을 이들 스톡 완충제 및 실시예 2로부터의 글라이코실아마이드 스톡 용액을 사용하여 제조하였다.
96 mL의 이들 20 mM 포스페이트 용액 각각에 실시예 2에서 제조된 5mL의 글라이코실아마이드 스톡 용액을 첨가하였다. 생성된 당지질 보조제 용액은 12.5 mM 아세트산 및 6.33mM 당지질을 함유하였다. 이로써 당지질은 아세테이트 형태가 된다.
실시예 4
당지질 보조제 용액의 최종 pH의 유의성
또 다른 세트의 실험에서, 다양한 용액의 최종 pH의 유의성을 시험하여 pH가 어떻게 응집에 영향을 미치는지에 대해 평가하였다. 20mM 포스페이트 완충제를 7.8의 초기 pH에서 제조하였다. 표 4는 실시예 1에서와 같이 제조된 글라이코실아마이드를 사용하여 제조된 당지질 보조제를 나타내고, 여기서 당지질 및 아세트산은 등몰량의 농도로 사용되었다. 최종 pH는 그렇게 많이 떨어지지 않았다는 것을 알 수 있고(표 4), 이는 완충제의 효능을 암시한다. NaCl 농도는 다양하다. 표 4에서 600 nm에서 광학 밀도 판독(O.D.)은 표 5에서 유사한 판독과 비교되고, 여기서 당지질 보조제 용액은, 실시예 2에서 제조한 바와 같이, 아세트산 대 당지질의 몰비가 2배가 되도록 함유하는 글라이코실아마이드 스톡 용액을 사용하여 제조하였다. 더 큰 농도 및 양의 아세트산을 사용하여 응집을 최소화한다. 응집은 여과된 샘플에서보다 비-여과된 샘플에서 더 높았다. 게다가, NaCl 농도가 증가함에 따라, 응집에서의 증가와 심지어 침전도 존재한다. 표 5에 설명한 당지질 보조제 용액은 8.0의 초기 pH를 갖는 포스페이트 완충제로 제조하였다. 당지질 보조제 용액의 최종 pH는 6.8 내지 7.0이었다. 당지질 보조제 용액의 최종 pH에서 추가의 감소가 탁도가 덜하고 응집이 전혀 없는 당지질 보조제 용액을 생성할 수 있다.
등몰량의 아세트산 및 당지질을 함유하는 글라이코실아마이드 조성물의 제조
(실시예 1 참조)
NaCl 농도(mM) 완충제의 부피(mL) 당지질 스톡 용액 조성물의 부피(mL) 최종 pH 600 nm에서 O.D.
0 480 25 7.42 1.693
15 480 25 7.39 1.873
100 480 25 7.33 2.742
당지질에 비해 2배의 아세트산을 함유하는 글라이코실아마이드 스톡 용액을
사용하는 당지질 보조제 용액의 제조(실시예 2 참조)
NaCl 농도(mM) 완충제의 부피(mL) 글라이코실아마이드 스톡 용액의 부피(mL) 최종 pH 600 nm에서 O.D.
0 480 25 6.93 0.146
15 480 25 6.88 0.487
100 480 25 6.84 2.826
0.1 미만의 광학 밀도(O.D.)는 반투명 용액을 나타낸다. 0.1 내지 0.5의 광학 밀도는 약간의 탁도로 균일하고, 0.5 내지 1.0의 광학 밀도는 어느 정도의 탁도를 갖고, 1.0 내지 1.5의 광학 밀도는 상당히 탁하다. 1.5 이상의 광학밀도는 탁하고 0.2 마이크론 필터를 사용하면서 여과되기가 쉽지 않다. 후자는 일반적으로 공업적으로 적절하다고 생각되지 않는다.
실시예 5
응집을 나타내기 위해 아세트산으로 당지질 보조제를 적정하면 역전될 수 있다. 응집을 나타내는 당지질 보조제에 증가량의 아세트산을 첨가하는 것이 응집을 풀어주는지를 확인하기 위해, 실시예 1에 설명된 바와 같은 당지질 보조제가 제조되었다. 이러한 당지질 보조제는 어떠한 NaCl이 없을 때에도 응집을 나타내었다. 증가하는 농도의 아세트산을 이러한 응집된 당지질 보조제 혼합물에 첨가하였다. 아세트산을 물로 16.6배 희석시키고 1몰 농도의 작업 용액 농도를 얻는다. 이어서, 이러한 1M 용액 15㎕를 15 mL의 당지질 보조제 혼합물에 첨가하고 아세트산 농도를 1mM만큼 증가시켰다. 아세트산의 농도가 증가함에 따라, 당지질 보조제의 pH는 감소하였고 응집물이 용해되었다. 그러나, 당지질 보조제는 다소 탁하게 남아 있었다. 이러한 관찰은, 증가하는 아세트산 농도가 Bay 15-5381의 자유 염기를 수용액 중에서 보다 높은 가용성을 나타내는 아세테이트 형태로 전환시킨다는 것을 확인시켜 주었다.
아세트산으로 당지질 보조제의 적정
당지질 보조제의 부피 첨가된 1N 아세트산의 부피 용액의 pH
15mL 0 7.25
15mL 15㎕(1mM) 7.21
15mL 30㎕(2mM) 7.10
15mL 60㎕(4mM) 6.97
15mL 150㎕(10mM) 6.44
15mL 750㎕(50mM) 4.57
실시예 6
NaCl을 함유하거나 함유하지 않은 제 2 안정한 당지질 보조제 용액의 제조
당지질 용액의 안정성을 유지하면서 아세트산의 양의 증가의 중요성을 확립한 후, 하기 표 7에 나타낸 조성을 사용하여 먼저 글라이코실아마이드 스톡 용액을 제조한 후,이를 사용형 NaCl을 포함하는 또 다른 당지질 보조제 용액 및 NaCl을 포함하지 않는 또 다른 당지질 보조제 용액을 제조하고자 하였다. 이러한 글라이코실아마이드 스톡 용액은 실시예 2의 용액과 유사하고, 총 부피의 4배이고 비교적 더 많은 양의 아세트산 및 트윈 20을 사용하였다.
글라이코실아마이드 스톡 용액의 조성
시약 양(200 mL)
60% 에탄올(v/v) 179mL
트윈 20 4.0mL
아세트산 3.0mL
Bay 15-5381 13.96g
변화하는 농도의 NaCl를 갖는 세가지 상이한 당지질 보조제 용액을 실시예 3으로부터 포스페이트 완충제 및 표 7에 제조된 글라이코실아마이드 스톡 용액을 사용하여 제조하였다.
실시예 4의 표 5에서의 제형과 같이, 0mM, 15mM 및 100mM NaCl을 함유하는 당지질 보조제 용액이 만들어졌다. 0mM 및 15mM NaCl 용액은 0.2 마이크론 필터를 통해 여과할 수 있었다. 100mM NaCl을 함유하는 당지질 보조제 용액은 0.2 마이크론 필터를 통해 여과할 수 없었다.
NaCl을 포함한 경우 및 포함하지 않은 경우의 안정한 당지질 보조제 용액의 제조
염화나트륨 농도(mM) 완충제의 부피(mL) 글라이코실아마이드 스톡 용액의 부피(mL) 최종 pH 600nm에서 O.D.
0 465 35 6.39 0.039
15 465 35 6.37 0.073
100 465 35 6.29 0.439
각각 당지질 보조제 용액 20 mL를 30 mL 유리 바이알 내에 넣고 실온 및 4℃에서 배양하였다. 일정한 간격을 두고 육안으로 관찰하였다. 처음에 0mM NaCl을 갖는 당지질 보조제 용액은 광학적으로 투명하였다. 15mM NaCl을 함유하는 당지질 보조제 용액은 약간 탁했고 600 nm에서 0.073의 O.D.를 가졌다. 100 mM NaCl를 함유하는 당지질 보조제 용액은 탁했고 600 nm에서 0.439의 O.D.를 가졌다(표 8). 이러한 당지질 보조제 용액중 어느 것도 실온 및 4℃ 모두에서 어떠한 응집의 징후를 나타내지 않았다. 이러한 당지질 보조제 용액은 외관 변화가 없는 1년 동안 관찰되었다.
실시예 7
NaOH를 사용한 안정한 당지질 보조제 용액의 적정
초기에 광학적으로 투명하고 안정한 당지질 보조제 용액이 NaOH 없이 수득되었다. 최소량의 NaOH의 제거 또는 사용이 응집을 방지하기 위해 필수적임을 확립하기 위해, NaOH의 구배적 첨가가 이러한 첨가가 없을 때 안정한 당지질 혼합물 중에서 응집을 유도할 것이라는 것을 입증할 필요가 있다. 적절한 부피의 1N NaOH를 하기 표 9에서 제조된 바와 같이 어떠한 NaCl도 첨가하지 않고 당지질 보조제 용액 15 mL에 첨가하였다. NaOH은 1mM으로부터 12mM까지 점차적으로 증가되었다(표 9). 이 실험에서 사용된 당지질 보조제 용액은 실시예 6에 기재된 글라이코실아마이드 스톡 용액을 사용하여 제조하였다. 당지질 보조제 용액중 NaOH의 농도가 증가함에 따라, 응집이 일어남에 따라 제형의 pH는 점진적으로 증가하였다.
NaOH로 안정한 당지질 보조제 용액의 적정
당지질 보조제의 부피 첨가된 1N NaOH의 부피(mM) 용액의 pH
15 mL 0 6.21
15 mL 15㎕(1mM) 6.38
15 mL 30㎕(2mM) 6.48
15 mL 60㎕(4mM) 6.68
15 mL 150㎕(10mM) 7.11
15 mL 750㎕(50mM) 12.17
실시예 8
HPLC를 사용한 당지질 성분의 정량화
하기 방법을 Bay 15-5831®의 HPLC 분석에 사용하였다. 표 10에 기재된 HPLC 인자를 사용하였다.
Bay 15-5381을 정량화하기 위한 HPLC 방법에 사용된 인자의 요약
인자 상세한 사항
칼럼 헤밀톤(Hamilton) PRP-1, 7 마이크론, 250 X 4.6mm
유동 1.5mL/분
주입 부피 10㎕
검출기 파장 210nm
이동상 A 0.4% 과염소산, v:v
이동상 B 아세트나이트라일
구배 0분 40% A/60% B
15분 30% A/70% B
20분 30% A/70% B
35분 10% A/90% B
50분 10% A/90% B
51분 40% A
실행 시간 65분
Bay 15-5381 보유 시간 대략 25분
Bay 15-5831®의 표준
표준 농도
1 0.103 mM
2 0.206 mM
3 0.412 mM
4 0.618 mM
5 0.824 mM
6 1.03 mM
0.10 내지 1.03 mM의 표준물질을 제조하고 HPLC 내로 주입하였다. 표준물질은 표 11에 요약되어 있다. 샘플을 실온까지 데우고 사용하기 전 5회 거꾸로 하였다. 1mL의 샘플을 10 mL 부피 플라스크 내의 6mL 메탄올에 첨가하였다. 이어서 샘플을 10분 동안 초음파 분해하고 부피 기준으로 희석하고 혼합하였다. 선형 회귀법을 표준 물질에 대해 수행하였고 피크 면적을 농도에 대해 도시하였다. 이어서 샘플을 곡선에 대해 계산하였다.
실시예 9
30 리터 규모 생산
실시예 6에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 당지질 보조제 용액의 30L 회분을 제조하였다. 이러한 회분은 15 mM NaCl을 함유하였다.
이러한 30L 제제를 사용하면서, 5개의 상이한 하위-용액(sub-solution)을 NaOH의 증가하는 농도로 제조하였다. NaOH 농도는 0 mM에서 1mM, 2mM, 4mM, 8mM 및 12mM까지 증가하였다. 각 NaOH 농도에 대한 샘플을 pH 측정 및 육안 검사를 위해 분취하였다. NaOH의 양이 증가함에 따라, 당지질 보조제의 pH는 증가된 응집과 함께 증가하였다. 응집은 실온에서 2mM NaOH 농도에서 나타나기 시작하였고, 4℃에서의 응집은 4 mM NaOH에서 나타나기 시작했다.
증가하는 농도의 NaOH를 갖는 30L 회분식 당지질 보조제의 특성화
샘플 번호 설명 측정된 농도(mM) 600nM에서 O.D. pH
30-L 샘플 1 15 mM NaCl, 0mM NaOH 6.21 0.218 6.42
30-L 샘플 2 15 mM NaCl, 1mM NaOH 6.3 0.137 6.52
30-L 샘플 3 15 mM NaCl, 2mM NaOH 6.24 0.137 6.59
30-L 샘플 4 15 mM NaCl, 4mM NaOH 6.17 0.15 6.80
30-L 샘플 5 15 mM NaCl, 8mM NaOH 6.26 0.129 7.06
30-L 샘플 6 15 mM NaCl, 12mM NaOH 6.15 0.062 7.54
표 12에 나타낸 모든 6개의 샘플에서 Bay 15-5381의 양을 실시예 8에 기재된 HPLC 방법을 사용하여 정량화하였다. 다양한 pH를 갖는 샘플은 동일한 농도의 Bay 15-5381을 나타냈고, 이는 보조제 성분이 NaOH를 첨가함에 따라 pH가 증가하고 응집을 수반하는 동안에 열화되지 않음을 암시한다.
실시예 10
가속 스트레스 시험을 사용한 안정성 평가
이 실시예는 당지질 보조제 용액에 대한 가속 스트레스 시험의 방법 및 결과를 설명한다. 실시예 6에 설명한 바와 같은 당지질 보조제 용액의 3개의 회분을 500L 규모에서 제조하였다. 모든 3개의 회분은 15mL NaCl을 함유하였고 어떠한 NaOH도 함유하지 않았다. 이러한 3개의 500L 회분으로부터의 당지질 보조제 용액을 가속 안정성 시험을 이용하여 당지질의 안정성을 연구하기 위해 사용하였다.
가속 스트레스 시험에 있어서, 당지질 보조제 용액을 37℃에서 7일 동안 진탕하고, 2일 동안 4℃에서 진탕하였다. 37℃에서의 7일 동안 진탕은 1년 동안 4℃에서의 시효경화를 나타낸다. 4℃에서의 2일 동안의 진탕은 수송하는 동안의 스트레스를 나타낸다.
당지질 보조제 용액의 한가지 세트는 7일 동안 37℃에서 정적인 상태를 유지하고 이어서 추가로 2일 동안 4℃에서 100rpm으로 진탕하였다. 4회 시점에서, 즉 T=0, 3, 7 및 9일에서 관찰 및 사진을 기록하였다. 2회 시점에서, 즉 T=0 및 9일에서 굴절률 및 입자 크기 분석을 수행하였다.
당지질 보조제 용액의 제 2 세트를 7일 동안 37℃에서 100rpm으로 진탕하고 추가로 2일 동안 4℃에서 100rpm으로 진탕하였다. 4개 시점, 즉 T=0, 3, 7 및 9일에서 관찰 및 사진을 기록하였다. 2개 시점, 즉 T=0 및 9일에서, 굴절률 및 입자 크기 분석을 수행하였다.
당지질 보조제 용액의 제 3 세트는 대조군으로서 9일 동안 4℃에서 정적 상태에 있었다. 4개 시점에서, 즉 T=0, 3, 7 및 9일에서 관찰 및 사진을 기록하였다. 2개 시점, 즉 T=0 및 9일에서 굴절률 및 입자 크기 분석을 수행하였다.
스트레스 시험 결과 입자 크기에서의 변화는 전혀 없었다. 모든 샘플은 제조된 직후 샘플에서 관찰된 바와 같이 서브-마이크론 입자 크기를 유지하였다. 게다가, 4℃에서 유지되거나 37℃에서 7일 동안 스트레스에 도입된 샘플에서 Bay 15-5831® 성분의 HPLC 측정은 Bay 15-5831®의 양에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
스트레스 시험 후 Bay 15-5831®의 정량화
당지질 보조제 용액의 배치(batch) 번호, 및 처리 측정 농도(mM)
배치 1, 4℃ 6.23
배치 1, 37℃ 진탕 6.29
배치 2, 4℃ 6.32
배치 2, 37℃ 진탕 6.30
배치 3, 4℃ 6.28
배치 3, 37℃ 진탕 6.29
표 13에서, 대조 샘플을 7일 동안 4℃에서 유지하였고, 시험 샘플을 7일 동안 37℃에서 진탕하였다. 7일 동안 37℃에서 취해진 샘플은 4℃에서 저장한 것과 동일한 농도를 갖는다.
실시예 11
당지질 보조제 용액의 살바이러스성 시험
살바이러스성 시험을, 실시예 9에서 위에서 설명된 바와 같은 30L 규모로 제조된 당지질 보조제 용액에 대해 수행하였다. 이러한 당지질 보조제 용액은 15mM NaCl을 함유하였고 NaOH는 함유하지 않았다.
당지질 보조제를 변형된 살아 있는 바이러스와 함께 희석제로서 사용하는 것에 대한 적합성에 대해 시험하였다. 변형된 살아 있는 바이러스 항원을 동결건조된 플러그로서 제조한다. 이러한 플러그를 적절한 당지질 보조제 용액으로 재수화할 때, 사용된 당지질 보조제 용액이 변형된 살아 있는 바이러스를 죽이지 않는다는 것을 확인하였다. 당지질 보조제 용액을 3개의 소 바이러스 항원에 대해 시험하였다: 소 호흡기 합포체 바이러스(BRSV; Bovine Respiratory Synctial virus), 파라-인플루엔자 바이러스 3(PI3; Para Influenza Virus), 및 감염성 소 라이노트라쉐티스 바이러스(IBR; Infectious Bovine Rhinotrachetis virus).
바이러스성 플러그를 당지질 보조제 용액을 사용하여 재수화하였다. 실온에서(RT) 1시간 동안 배양한 후, 순차적으로 희석한 샘플을 단일층의 허용성 세포주 상에서 평면배양하였다. 단일층 상에 나타난 바이러스 플러그의 수를 계수함으로써, mL 당 50% 조직 배지 감염성 투여량(TCID50/mL)을 멸균수 또는 당지질 보조제 용액으로 재수화된 각각의 바이러스 항원에 대해 수득하였다. 이러한 평가에서, 시험 당지질 보조제 용액으로 재수화한 후 0.7의 역가에서의 감소가 살바이러스성을 나타내는 것으로 간주하였다.
결과를 하기 표 14에 나타낸다. 당지질 보조제 용액은 이러한 3개의 소 바이러스에 대해 어떠한 살바이러스성 효과도 나타내지 않았다.
당지질 보조제 용액에 대한 살바이러스성 평가
바이러스 원래 역가 당지질 보조제를 사용한 최종 역가 멸균수를 사용한 최종 역가 역가 손실
tsIBR 051404 7.3±0.5 7.08 7.49 0.42
tsPI3 052604 7.6±0.5 7.74 7.49 -0.25
BRSV 081103 6.4±0.5 6.57 6.82 0.25
본 실시예는 상기 당지질 보조제 용액이 동물 건강 백신(Animal Health vaccine)의 공업적 제형에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 리스포발(Rispoval)®은 3가지의 상이한 소 바이러스 질병을 유발하는 3개의 변형된 살아있는 바이러스 항원을 함유한다. 이러한 소 바이러스 항원은 변형된 살아 있는 소 허피스 바이러스, 변형된 살아 있는 소 호흡기 합포체 바이러스 및 변형된 살아 있는 파라인플루엔자 바이러스 3이다. 이들 바이러스 항원은 동결건조된 케이크로서 생산되고 본 발명에 의해 생성된 당지질 보조제 용액은 이들 항원을 위한 희석 용액으로서 사용될 수 있다. 사용된 당지질은 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트였다.
이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 나타낸다. 이는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 많은 변화, 변이, 변형, 및 다른 용도 및 응용은 당해 기술분야의 숙련인에게 명백할 것이다.

Claims (15)

  1. a) 약산으로부터 유도된 염 형태의 하기 화학식 I의 당지질;
    b) HO-C1-3 알킬인 알콜;
    c) 1) 당지질의 몰당량의 1.25 내지 3배의 양으로 존재하고 2) 표준 표 또는 값을 사용할 때 1.0 내지 9.5의 pKa(Ka의 -log) 값을 갖는 임의의 산인 약산; 및
    d) 그 자신이 용해되어 있는 물질의 표면장력을 감소시키고 소수성의 한 성분과 친수성의 또 다른 성분을 갖는 물질인 비-이온성 계면활성제
    를 포함하는 조성물:
    화학식 I
    Figure 712011004622635-pct00017
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 알킬 라디칼이고;
    X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
    R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2-, -PO4 2- 또는 -COC1-10 알킬이고;
    R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파기닐, L-아스파틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-아이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오르니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이들의 D-이성질체이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 당지질이 하기 화학식 IIa의 화합물이고:
    화학식 IIa
    Figure 712011004622635-pct00025
    상기 약산이 아세트산, H(C2H3O2)(pKa 4.76); 아스코르브산(1), H2(C6H6O6)(pKa 4.10); 아세틸살리실산, H8(C9O4)(pK 3.5); 부탄산 H(C4H7O2)(pKa 4.83); 카본산, 형태 1, H2CO3(pKa 4.83); 크롬산, 형태 2, HCrO4 -(pKa 6.49); 시트르산, 형태 1, H3(C6H5O7)(pKa 3.14); 시트르산, 형태 2, (H2C6H5O7)-(pKa 4.77); 시트르산, 형태 3, (HC6H5O7)2-(pKa 6.39); 포름산, H(CHO2)(pKa 3.75); 푸마르산, H4(C4O4)(pKa 3.03); 헵탄산, H(C7H13O2)(pKa 4.89); 헥산산, H(C6H11O2)(pKa 4.84); 하이드로플루오르산, HF(pKa 3.20); 아이소시트레이트, H8(C6O7)(pKa 3.29); 락트산, H(C3H5O3)(pKa 3.08); 말레산, H4(C4O4)(pKa 1.83); 니코틴산, H5(C6NO2)(pKa 3.39); 옥살산, 형태 1, H2(C2O4)(pKa 1.23); 옥살산, 형태 2, (HC2O4)-(pKa 4.19); 펜탄산, H(C5H9O2)(pKa 4.84); 인산, 형태 1, H3PO4(pKa 2.16); 프로판산, H(C3H5O2)(pKa 4.86); 피루브산, H4(C3O3)(pKa 2.39); 및 숙신산 H6(C4O4)(pKa 4.19) 중 하나 또는 이들의 임의의 조합물에서 선택되는, 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 당지질이 하기 화학식 IIb의 화합물이고:
    화학식 IIb
    Figure 712011004622635-pct00026
    상기 약산이 아세트산, 아세틸살리실산, 시트르산, 포름산, 푸마르산, 하이드로플루오르산, 아이소시트레이트, 말레산, 니코틴산, 인산, 피루브산 및 숙신산 중 하나 또는 이들의 임의의 조합물에서 선택되는, 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 당지질이 하기 화학식 III의 구조를 갖는 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트이고:
    화학식 III
    Figure 712011004622635-pct00027
    상기 약산이 아세트산인, 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 약산이 아세트산; 아세틸살리실산; 시트르산, 형태 1; 시트르산, 형태 2; 시트르산, 형태 3; 포름산; 푸마르산; 하이드로플루오르산; 아이소시트레이트; 말레산; 니코틴산; 인산, 형태 1; 피루브산; 및 숙신산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약산이 당지질의 몰당량의 a) 1.25배, b) 2.0배, c) 2.5배, d) 2.7배, 또는 e) 3.0배의 양으로 존재하는, 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알콜이 에틸 알콜인, 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-이온성 계면활성제가 소비탄 모노라우레이트, 소비탄 모노팔미테이트, 소비탄 모노스테아레이트, 소비탄 트라이스테아레이트, 소비탄 모노올레에이트, 소비탄 트라이올레에이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 트라이올레에이트 또는 이들의 조합물인, 조성물.
  9. a) 약산으로부터 유도된 염 형태의 하기 화학식 I의 당지질;
    b) HO-C1-3 알킬인 알콜;
    c) 1) 당지질의 몰당량의 1.25 내지 3배의 양으로 존재하고 2) 표준 표 또는 값을 사용할 때 1.0 내지 9.5의 pKa(Ka의 -log) 값을 갖는 임의의 산인 약산;
    d) 그 자신이 용해되어 있는 물질의 표면장력을 감소시키고 소수성의 한 성분과 친수성의 또 다른 성분을 갖는 물질인 비-이온성 계면활성제; 및
    e) 백신 용도에 적합하고 다른 성분들의 pH를 6 내지 8의 pH 범위 내에서 유지할 수 있되, 50mM 이하의 NaCl을 사용하는 수성 완충제
    를 포함하는 조성물:
    화학식 I
    Figure 712011004622635-pct00021
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 또는 탄소수 20 이하의 포화 알킬 라디칼이고;
    X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
    R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2-, -PO4 2- 또는 -COC1-10 알킬이고;
    R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파기닐, L-아스파틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-아이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오르니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이들의 D-이성질체이다.
  10. 제 9 항에 있어서,
    용액의 pH가 수용액 중에서 6 내지 7의 비교적 일정한 pH로 조절되고,
    상기 완충제가, 소듐 포스페이트의 일염기성 염 및 이염기성 염중 하나 또는 이들 둘다, 또는 포타슘 포스페이트의 일염기성 염 및 이염기성 염중 하나 또는 이들 둘다, 또는 이들의 임의의 조합물을 동일하거나 상이한 비율로 갖는 포스페이트 완충제인, 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 완충제가, a) 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES로도 공지됨); b) 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS로도 공지됨); c) n-[트리스(하이드록시메틸)]-2-아미노에탄설폰산(TES로도 공지됨); d) 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES로도 공지됨); e) [트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신(TRIS로도 공지됨); 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 9 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 살아있는 소 허피스(herpes) 바이러스, 변형된 살아있는 소 호흡기 합포체(syncytial) 바이러스, 변형된 살아있는 파라인플루엔자 바이러스 3 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 추가로 포함하는 조성물.
  13. a) 하기 화학식 III의 구조를 갖는 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트:
    화학식 III
    Figure 712011004622635-pct00028
    b) 에탄올;
    c) 당지질 몰당량의 1.25 내지 3배의 양의 아세트산;
    d) 소비탄 모노라우레이트, 소비탄 모노팔미테이트, 소비탄 모노스테아레이트, 소비탄 트라이스테아레이트, 소비탄 모노올레에이트, 소비탄 트라이올레에이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이트 또는 폴리옥시에틸렌소비탄 트라이올레에이트인 비-이온성 계면활성제;
    e) 용액의 pH를 수성 완충 용액 중에서 6 내지 7의 비교적 일정한 pH로 조절하고 i) 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES로도 공지됨); ii) 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS로도 공지됨); iii) n-[트리스(하이드록시메틸)]-2-아미노에탄설폰산(TES로도 공지됨); iv) 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES로도 공지됨); v) [트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신(TRIS로도 공지됨) 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되되, 15 mM 이하의 NaCl을 사용하는 수성 완충제; 및
    f) 변형된 살아있는 소 허피스 바이러스, 변형된 살아있는 소 호흡기 합포체 바이러스 및 변형된 살아있는 파라인플루엔자 바이러스 3을 함유하는 항원
    을 포함하는 조성물.
  14. A) 하기 화학식 I의 당지질, B) HO-C1-3 알킬인 알콜, C) 당지질 몰당량의 1.25 내지 3배의 양인 약산, 및 D) 비-이온성 계면활성제를 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물의 제조방법:
    화학식 I
    Figure 712011004622635-pct00023
    상기 식에서,
    X, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 제 1 항에서 정의한 바와 같다.
  15. A) 하기 화학식 I의 당지질, B) HO-C1-3 알킬인 알콜, C) 당지질의 몰당량의 1.25 내지 3배의 양으로 존재하는 약산, 및 D) 비-이온성 계면활성제를 함께 혼합하는 단계; 및
    이후 E) 적절한 완충제를 첨가하는 단계
    를 포함하는, 조성물의 제조방법:
    화학식 I
    Figure 712011004622635-pct00024
    상기 식에서,
    X, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 제 1 항에서 정의한 바와 같다.
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