ES2300285T3 - Derivados de mono- y disacarido. - Google Patents
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Abstract
Una formulación de adyuvante que comprende una solución salina fisiológica, o una emulsión de aceite en agua, o una fase sólida inmiscible en agua y opcionalmente una fase acuosa, y que comprende como adyuvante uno o más derivados de mono- o disacárido que tienen al menos uno pero no más de N-1 grupos ésteres de ácidos grasos, en la que N es el número de grupos hidroxilo del mono- o disacárido del que se deriva.
Description
\global\parskip0.950000\baselineskip
Derivados de mono- y disacárido.
La invención se refiere a formulaciones de
adyuvante que comprenden derivados de monosacárido y/o derivados de
disacárido.
Los ésteres de azúcar de ácidos grasos se
conocen bien por su capacidad emulsiva. Pueden emulsionar una fase
de dispersión grande con una fase continua pequeña en cualquiera del
tipo de aceite en agua y agua en aceite. Además, los ésteres de
azúcar de ácidos grasos se conocen bien por su amplio intervalo de
valor de HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo, los
valores de HLB de los ésteres de sacarosa pueden variar desde <1
hasta 16). El valor de HLB de los ésteres de azúcar de ácidos
grasos depende del número de ésteres grasos por molécula de azúcar
y de la longitud de la cadena carbonada del éster de ácidos
grasos.
Los ésteres de azúcar de ácidos grasos se
conocen además por otras aplicaciones varias, tal como por su
capacidad de potenciar o inhibir la cristalización de grasas y
aceites, sus efectos antibacterianos, sus efectos de dispersión y
humectación, su posible uso en la inhibición de la desnaturalización
térmica y por congelación de proteínas y por su efecto potenciador
de la defensa no específica del huésped.
Nigam et al. (Br. J. Cancer, 46, págs.
782-793, 1982) dan a conocer los efectos
inmunoestimuladores in vitro e in vivo de diversos
ésteres de ácidos grasos de arabinosa, galactosa, glucosa, manosa,
celobiosa, lactosa, maltosa y sacarosa. Los factores de aumento en
las respuestas de anticuerpos variaron desde 1 hasta < 10.
Nigam et al. (Cancer Res. 38, págs.
3315-3312, 1978) dan a conocer la actividad
inmunopotenciadora de ésteres de disacárido de ácidos grasos,
especialmente tetrapalmitato de maltosa.
Nishikawa et al. (Chem Pharm. Bull. 29,
págs. 505-513, 1981) dan a conocer la actividad
antitumoral de ésteres de sacarosa de ácidos grasos.
Azuma (documento EP 1.572.368) da a conocer los
efectos potenciadores de ésteres de azúcar de ácidos grasos sobre
la eficacia de una vacuna, que se designa en el presente documento
como "actividad adyuvante" o "adyuvanticidad".
Los ésteres de disacárido de ácidos grasos
combinados con una emulsión de aceite en agua se conocen bien por
sus efectos estimuladores sobre la eficacia de una vacuna.
Nigam et al. (Br. J. Cancer, 46, págs.
782-793, 1982) dan a conocer también una combinación
de ésteres de sacarosa de ácidos grasos y emulsiones de aceite en
agua de escualeno y su uso como adyuvante. Sin embargo, se ha
demostrado que los ésteres de octaoleato de sacarosa muestran sólo,
si acaso, débiles efectos estimuladores sobre la eficacia de una
vacuna (véanse también los ejemplos más adelante en el presente
documento). Incluso combinaciones de ésteres de octaoleato de
sacarosa y una emulsión de aceite en agua de escualano, demostraron
débiles efectos potenciadores sobre la eficacia de una vacuna, lo
que los hace inapropiados para el/los uso(s) como adyuvante
de vacuna (véanse también los ejemplos más adelante en el presente
documento).
El documento
EP-A-0.781.559 da a conocer una
vacuna del tipo agua en aceite que comprende un adyuvante de aceite
y que comprende como agente emulsivo un éster parcial derivado de un
alcohol polihidroxilado.
Los ésteres de sulfato de sacarosa también se
conocen bien. La patente estadounidense número 3.432.489 da a
conocer un procedimiento para la síntesis de diversos polisulfatos
de disacárido y de complejos de aluminio a partir de los mismos,
junto con sus utilidades terapéuticas relativas. Esta patente, más
específicamente, describe la reacción de la sacarosa con muchos
agentes sulfatantes incluyendo ácido clorosulfónico o
SO_{3}-piridina en diversos disolventes
incluyendo piridina. Además, la patente estadounidense número
3.432.489 da a conocer el/los uso(s) farmacéutico(s)
y médico(s) de los ésteres de sulfato de sacarosa,
especialmente los complejos de éster de octasulfato de sacarosa con
sales de aluminio, también conocidos como sucralfato. Se conoce bien
la aplicación de sucralfato en el tratamiento de trastornos
gastrointestinales.
El documento WO 90/02133 da a conocer un
procedimiento para la preparación de ésteres de sulfato de sacarosa
y complejos de aluminio de los mismos y formulaciones de los mismos
para uso(s) médico(s).
Bazin et al. (Carbohydrate Res. 309,
págs. 189-205, 1998) dan a conocer la síntesis
regioselectiva de tensioactivos a base de sacarosa a través de la
sulfonación de acilsacarosa. Los derivados dados a conocer
contienen un grupo acilo por molécula de sacarosa y un grupo sulfato
por molécula de sacarosa. El procedimiento dado a conocer es un
procedimiento regioselectivo para la derivatización de ciertos
grupos hidroxilo de la molécula de sacarosa. El procedimiento usa
complejos de dibutilestannileno para el bloqueo de ciertos grupos
hidroxilo. Una desventaja de este procedimiento de preparación es su
complejidad.
Hilgers et al. (Immunology 60, págs.
141-146, 1986) dan a conocer polisacáridos que
contienen tanto ésteres de ácidos grasos como ésteres de sulfato,
también conocidos como sulfolipo-polisacáridos, y su
uso como adyuvantes en vacunas. Además, Hilgers et al.
(Immunology 60, págs. 141-146, 1986; documento WO
96/20222) dan a conocer un procedimiento de preparación de
sulfolipo-polisacáridos poniendo en contacto el
polisacárido con un cloruro de acoílo y luego con un agente de
sulfonación.
Mashihi y Hilgers (documento
EP-A-0-295.749) dan
a conocer una combinación de sulfolipo-polisacáridos
y emulsiones de aceite en agua, especialmente
sulfolipo-polisacáridos hidrófilos con emulsiones de
escualano en agua. Mashihi y Hilgers (documento
EP-A-0-295.749) dan
a conocer además los efectos potenciadores de combinaciones de
sulfolipo-polisacáridos, especialmente
sulfolipo-polisacáridos hidrófilos y emulsiones de
aceite en agua, especialmente una emulsión de escualano en agua,
sobre los mecanismos de defensa no específica del huésped.
Hilgers et al. (Vaccine 12, págs.
653-660, 1994; Vaccine 12, págs.
661-665, 1994; documento WO 96/20008; Vaccine 17,
págs. 219-228, 1999) dan a conocer combinaciones de
sulfolipo-polisacáridos, especialmente
sulfolipo-polisacáridos hidrófobos y emulsiones de
aceite en agua, especialmente emulsiones de escualano en agua,
emulsiones de aceite mineral en agua, emulsiones de aceite de soja
en agua y hexadecano en agua. También se da a conocer un
procedimiento para la preparación de formulaciones estables de
combinaciones de sulfolipo-polisacáridos,
especialmente sulfolipo-polisacáridos hidrófobos y
emulsiones de aceite en agua, especialmente emulsiones de escualano
en agua, emulsiones de aceite mineral en agua, emulsiones de aceite
de soja en agua y hexadecano en agua.
El procedimiento para la preparación de
sulfolipo-polisacáridos tal como se da a conocer en
el documento WO 96/20008 incluye dos etapas; (1) en primer lugar,
se pone en contacto el polisacárido con un cloruro de acoílo y
luego (2) se pone en contacto el derivado de polisacárido lipídico
con un agente de sulfonación. Se considera que ambas etapas son
reacciones de adición química aleatorias, lo que significa que la
probabilidad de que cada hidroxilo en la molécula de polisacárido
se esterifique es igual y no cambia durante el procedimiento. Este
procedimiento de preparación de
sulfolipo-polisacáridos da como resultado la
formación de derivados de diferentes
sulfolipo-polisacáridos que varían en el número de
ésteres de ácidos grasos presentes por molécula de polisacárido, el
número de ésteres de sulfato presentes por molécula de polisacárido,
el número de grupos hidroxilo por molécula de polisacárido y la
distribución de los ésteres de ácidos grasos, los ésteres de sulfato
y los grupos hidroxilo en la molécula de polisacárido. El número de
derivados de sulfolipo-polisacáridos químicamente
distintos en una preparación obtenida se determina mediante el
número de moléculas de polisacárido distintas en el material de
partida y mediante el número de grupos hidroxilo por molécula de
polisacárido.
Para ilustrar este punto de los muchos derivados
de sulfolipo-polisacárido químicamente distintos
presentes en una preparación de
sulfolipo-polisacárido, se incluye el siguiente
ejemplo tal como se da a conocer por Hilgers et al.
(Documento WO 96/20008).
La mejor preparación de derivado de
sulfolipo-polisacárido químicamente definido
conocida en la técnica es la preparación de
sulfolipo-polisacárido obtenida a partir de
beta-ciclodextrina (también conocida como
sulfolipo-ciclodextrina). Esta preparación de
sulfolipo-ciclodextrina se obtiene a partir de un
polisacárido con 7 moléculas de glucosa por molécula de
polisacárido. Esta preparación de
sulfolipo-ciclodextrina se deriva del polisacárido
de peso molecular más bajo y con el menor número de grupos
hidroxilo dado a conocer. La beta-ciclodextrina
tiene un peso molecular de 1153 Da y tiene 21 grupos hidroxilo por
molécula. Estos grupos hidroxilo pueden añadirse químicamente
mediante un éster de ácidos grasos o un éster de sulfato o pueden
permanecer inalterados. Los derivados presentes en una preparación
de sulfolipo-ciclodextrina varían en el número de
ésteres de ácidos grasos por molécula de
beta-ciclodextrina, el número de ésteres de sulfato
por molécula de beta-ciclodextrina, el número de
grupos hidroxilo por molécula de beta-ciclodextrina
y la distribución de estos ésteres de ácidos grasos, ésteres de
sulfato y grupos hidroxilo en la molécula de
beta-ciclodextrina. El número de derivados
químicamente distintos en una preparación de
sulfolipo-ciclodextrina preparada según el
procedimiento conocido en la técnica (Vaccine 17, págs.
219-228, 1999; documento WO 96/20222) es
extremadamente alto. Cuando no se tiene en cuenta la distribución
de los ésteres de ácidos grasos, los ésteres de sulfato y los grupos
hidroxilo en la molécula de beta-ciclodextrina, el
número de derivados químicamente distintos en una preparación de
sulfolipo-ciclodextrina puede ser de varios cientos
(por ejemplo, 210). Además, cuando se tiene en cuenta la
distribución de los ésteres de ácidos grasos, los ésteres de sulfato
y los grupos hidroxilo en la molécula de
beta-ciclodextrina, el número de derivados
químicamente distintos en una preparación de
sulfolipo-ciclodextrina es
3^{3} +
\{(3^{3})^{7} - 3^{3}\}/7 =
1.494.336.195.
La concentración de los derivados químicamente
distintos presentes en una preparación de
sulfolipo-ciclodextrina puede modularse variando
las proporciones molares o las proporciones en peso de los
materiales de partida, es decir,
beta-ciclodextrina, cloruro de acoílo y agente de
sulfonación, tal como se da a conocer por Hilgers et al.
(documento WO 96/20222). La concentración de los derivados
químicamente distintos presentes en una preparación de
sulfolipo-ciclodextrina puede estimarse
matemáticamente. Con la condición de que ambas reacciones químicas
implicadas en la preparación de los derivados de
sulfolipo-polisacárido sean completamente
aleatorias, la concentración máxima de un cierto derivado presente
en una preparación de sulfolipo-ciclodextrina es
con la mayor frecuencia inferior al 5%. Una preparación de
sulfolipo-polisacárido obtenida a partir de un
polisacárido con incluso mayores números de grupos hidroxilo por
molécula que la beta-ciclodextrina contendrá un
número incluso superior de derivados químicamente distintos y
contiene por consiguiente concentraciones inferiores de cada
derivado.
Por tanto, puede concluirse que una preparación
de sulfolipo-polisacárido obtenida tal como se
describe por Hilgers et al. (documento WO 96/20222;
documento WO 96/20008) contiene muchos derivados químicamente
distintos, lo que puede ser desventajoso en ciertas circunstancias.
Además, el hecho de que esté presente un derivado específico sólo
en cantidades muy pequeñas podría ser desventajoso.
Una desventaja de los
sulfolipo-polisacáridos es que tienen propiedades
físicas, químicas y fisicoquímicas diversas (tales como
solubilidad, tensioactividad) que aunque son apropiadas para su uso
previsto (por ejemplo, como detergentes o emulsivos), no son
apropiadas para su uso con otras moléculas y/u otros usos. Por esta
razón, se desea separar los derivados de
sulfolipo-polisacárido "inapropiados" de los
derivados de sulfolipo-polisacárido
"apropiados". Tal separación podría llevarse a cabo mediante
técnicas de separación clásicas bien conocidas en la técnica. Sin
embargo, tal como se ha mencionado, la concentración del/de los
derivado(s) "apropiado(s)" en una preparación de
sulfolipo-polisacárido es relativamente baja.
Además, las propiedades químicas y físicas de los derivados de
sulfolipo-polisacárido "inapropiados" y de los
derivados de sulfolipo-polisacárido
"apropiados" pueden ser bastante similares. Por tanto, el
procedimiento de separación puede ser complicado, costoso y requerir
mucho tiempo.
Otra desventaja de la preparación de
sulfolipo-polisacáridos tal como se da a conocer por
Hilgers et al. (documento WO 96/20222; documento WO
96/20008) incluye el hecho de que se usan cantidades relativamente
grandes de disolventes orgánicos que es necesario eliminar de la
preparación de sulfolipo-polisacárido final. A
menudo esto puede resultar difícil y/o implicar el uso de
procedimientos que son difíciles, costosos e incluso peligrosos,
especialmente a escala industrial.
Por consiguiente, sigue habiendo una clara
necesidad de derivados de azúcar que tengan propiedades
fisicoquímicas y/o biológicas y/o biofarmacéuticas que permitan un
amplio uso para diversos fines. Sigue habiendo además una necesidad
de un procedimiento fácil, seguro y económico para la preparación de
tales derivados de azúcar a escala industrial.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar derivados de azúcar que pueden formar formulaciones
estables con una amplia variedad de moléculas inmiscibles en agua.
Los derivados de azúcar objetivo deben tener propiedades físicas
y/o fisicoquímicas y/o biológicas y/o farmacéuticas sumamente
ventajosas, que los hacen adecuados para su uso en una variedad de
aplicaciones, tales como aplicaciones médicas, por ejemplo en la
preparación de vacunas y/o adyuvantes para vacunas. Es otro
objetivo de la invención proporcionar un procedimiento sencillo,
fácil y económico para la preparación de tales derivados de
azúcar.
La presente invención proporciona formulaciones
de adyuvante que comprenden derivados de azúcar que tienen
propiedades químicas, físicas y fisicoquímicas sumamente ventajosas.
Estos derivados son el resultado de diversas modificaciones
químicas (y/o enzimáticas) en moléculas de monosacárido y
disacárido.
La presente invención se refiere a formulaciones
de adyuvante que comprenden como adyuvante un derivado de azúcar,
en las que se ha modificado al menos uno de los grupos hidroxilo
libres de la molécula de monosacárido (habiendo tres, cuatro o
cinco grupos hidroxilo libres en la molécula de monosacárido) o de
la molécula de disacárido (habiendo preferiblemente ocho grupos
hidroxilo libres en la molécula de disacárido). Estas modificaciones
son una sustitución del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo o
bien del propio grupo hidroxilo completo, por uno de una gran
variedad de grupos sustituyentes. De esta manera, dependiendo del
número y el tipo de sustitución/sustituciones realizada(s),
pueden obtenerse derivados de mono- o disacárido que presentan las
propiedades deseadas.
En particular, la invención se refiere a
formulaciones de adyuvante que comprenden como adyuvante un derivado
de mono- o disacárido novedoso que tienen entre uno y
N-1 grupos éster de ácidos grasos, en el que N es el
número de grupos hidroxilo del monosacárido o disacárido a partir
del cual se deriva el derivado. En una realización preferida, un
derivado de mono- o disacárido comprende además entre uno y
N-1 grupos aniónicos, y en el que el número
combinado de grupos éster de ácidos grasos y grupos aniónicos no
excede de N. El número combinado de grupos aniónicos y grupos éster
de ácidos grasos estará entre 1 y N. Preferiblemente, un derivado de
mono- o disacárido tiene no más de dos grupos hidroxilo libres, no
excediendo de N el número combinado de grupos hidroxilo, ésteres de
ácidos grasos y grupos aniónicos.
En una realización preferida, un derivado de
disacárido tiene al menos 2, más preferiblemente 3, incluso más
preferiblemente 4 ó 5, lo más preferido 6, pero no más de
N-1 ésteres de ácidos grasos y al menos uno pero no
más de N-2, más preferiblemente N-3,
incluso más preferiblemente N-4 o
N-5, lo más preferido N-6 grupos
aniónicos, en el que el número combinado total de ésteres de ácidos
grasos y grupos aniónicos no excede de N, y además en el que N es
el número de grupos hidroxilo del disacárido a partir del cual se
derivan los derivados.
Un derivado de monosacárido tiene
preferiblemente al menos 2, más preferiblemente 3 ó 4, pero no más
de N-1 ésteres de ácidos grasos y al menos uno pero
no más de N-2, más preferiblemente
N-3 grupos aniónicos, en el que el número combinado
total de ésteres de ácidos grasos y grupos aniónicos no excede de N,
y además en el que N es el número de grupos hidroxilo del
disacárido a partir del cual se derivan los derivados.
Por tanto, un monosacárido derivatizado
particularmente preferido tiene al menos un grupo aniónico y al
menos dos ésteres de ácidos grasos, en el que la suma total de
grupos aniónicos y ésteres de ácidos grasos está en el intervalo de
3-5 y un disacárido derivatizado particularmente
preferido tiene al menos un grupo aniónico, preferiblemente uno o
cuatro grupos aniónicos y al menos un éster de ácidos grasos, en el
que la suma total de grupos aniónicos y ésteres de ácidos grasos
está en el intervalo de 6-8, preferiblemente 7 u
8.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "grupos éster de ácidos grasos" o "grupo de ácido
graso" se refiere a grupos éster de ácidos grasos que comprenden
una cadena de hidrocarburo lineal de al menos seis átomos de
carbono. La expresión "grupo aniónico" tal como se usa en el
presente documento es un resto cargado negativamente (es decir,
cargado negativamente a pH neutro o al pH del entorno en el que se
aplica el derivado). Un grupo aniónico de este tipo puede ser por
ejemplo un sulfato, un sulfonato o un fosfato. Los grupos aniónicos
preferidos incluyen "grupos éster de sulfato", es decir, grupos
que tienen la fórmula general -SO_{2}-OR, y
"grupos éster de fosfato", es decir, grupos que tienen la
fórmula general -PO_{2}-(OR)_{2}, en las que R se
selecciona del grupo de átomos y/o moléculas que forman cationes
monovalentes. La expresión "grupo hidroxilo" se refiere a
grupos que tienen la fórmula -OH.
La expresión general "derivados de azúcar"
tal como se usa en el presente documento se refiere a derivados de
mono- y disacárido.
Los derivados de azúcar pueden usarse
ventajosamente como emulsivos para moléculas inmiscibles en agua. Se
observa que la complejación de una molécula inmiscible en agua con
los presentes derivados de azúcar proporciona ventajas
significativas con respecto a la biodisponibilidad, bioactividad y
estabilidad de la formulación de la molécula inmiscible en agua.
Las mejoras en la asociación entre los derivados de azúcar y la
molécula diana pueden proporcionar mejoras concomitantes en la
biodisponibilidad, actividad biológica y/o farmacéutica y las
propiedades físicas (por ejemplo, estabilidad) de la formulación de
la molécula inmiscible en agua. Las propiedades fisicoquímicas de
los derivados de mono- y disacárido dependen del número (y
proporción) de grupos aniónicos y el número de (a) grupos éster de
ácidos grasos (y en un grado menor del número de grupos hidroxilo)
que están presentes, así como de la naturaleza del contraión del
grupo aniónico y el tipo y la naturaleza del grupo éster de ácidos
grasos. Preferiblemente, el derivado de monosacárido tiene al menos
uno pero no más de 3 ó 4 grupos aniónicos, mientras que el derivado
de disacárido tiene preferiblemente al menos uno pero no más de 7
grupos aniónicos.
Los derivados de azúcar son además sumamente
adecuados para su uso como adyuvantes para vacunas. Se observa que
la complejación de un componente antigénico con un derivado de
azúcar según la invención puede proporcionar ventajas
significativas con respecto a la mejora de la biodisponibilidad,
bioactividad y estabilidad de la formulación del componente
antigénico. Las mejoras en la asociación entre el derivado de azúcar
y el componente antigénico pueden proporcionar una mejora
concomitante en la eficacia y/o estabilidad de la vacuna y potenciar
una reacción inmunitaria o activar el sistema inmunitario. La
expresión componente antigénico, tal como se usa en el presente
documento, se refiere a cualquier componente o material que es un
antígeno por sí mismo, tal como un virus, una bacteria, micoplasma,
un parásito o una célula tumoral, una subunidad de un
microorganismo, un alérgeno, tal como una proteína, polisacárido,
péptido, glicoproteína, conjugado de
polisacárido-proteína, conjugado de
péptido-proteína o cualquier otra entidad frente a
la cual pretende producirse una respuesta inmunitaria. Este
componente antigénico puede estar constituido por o contener, por
ejemplo, uno o más microorganismos vivos, microorganismos
inactivados o las denominadas subunidades (preparadas estas últimas,
por ejemplo, de manera sintética, o mediante procedimientos de ADN
recombinante o aisladas de los microorganismos). La expresión
componente antigénico se refiere además a cualquier componente que
pueda inducir un antígeno, por ejemplo una secuencia de ADN o ARN
que pueda incorporarse en (el ADN de) una célula huésped del sujeto
inmunizado, en el que puede inducir la formación de restos
antigénicos. Una vacuna que
\hbox{comprende una secuencia de
nucleótidos de este tipo se denomina también vacuna de ADN o vacuna
de ARN.}
Se prefiere que los presentes derivados de
monosacárido se deriven de pentosas con la fórmula general
C_{5}H_{10}O_{5} o de hexosas con la fórmula general
C_{6}H_{12}O_{6}. Pueden seleccionarse pentosas adecuadas del
grupo constituido por arabinosa, ribosa, xilosa. Pueden
seleccionarse hexosas adecuadas del grupo constituido por alolosa,
altriosa, fructosa, galactosa, glucosa, gulosa, inositol, manosa y
sorbosa. Preferiblemente, los derivados de monosacárido novedosos
se derivan de fructosa, galactosa o glucosa.
Los presentes derivados de disacárido se derivan
preferiblemente de disacáridos de fórmula general
C_{12}H_{22}O_{11} y pueden elegirse adecuadamente del grupo
constituido por celobiosa, gentiobiosa, lactosa, lactulosa, maltosa,
melibiosa, sacarosa y turanosa. Preferiblemente, los derivados de
disacárido novedosos se derivan de lactosa, maltosa o sacarosa. Lo
más preferiblemente, los presentes derivados de azúcar se derivan de
sacarosa.
Los grupos éster de ácidos grasos son
preferiblemente grupos éster (que tienen una cadena carbonadas
lineal) con la estructura química general de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH_{3} en la que
x está entre 4 y 24, preferiblemente entre 4 y 22, más
preferiblemente entre 6 y 18 y lo más preferiblemente entre 6 y 14,
grupos éster con la estructura general de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH_{3}
en la que x+y está entre 4 y 24, preferiblemente entre 4 y 22 y más
preferiblemente entre 6 y 14, o grupos con la estructura general de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH=CH-(CH_{2})_{z}-CH_{3}
en la que x+y+z está entre 2 y 20, preferiblemente entre 4 y 18 y
más preferiblemente entre 6 y 14. También pueden estar presentes
combinaciones de estos grupos éster de ácidos grasos.
Grupos éster de ácidos grasos particularmente
preferidos con la estructura general de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH_{3} son
aquéllos en los que x es 4 (ácido hexanoico), 6 (ácido octanoico), 8
(ácido decanoico), 10 (ácido dodecanoico; también denominado en el
presente documento como ácido láurico), 12 (ácido tetradecanoico,
también conocido como ácido mirístico), 14 (ácido hexadecanoico,
también conocido como ácido palmítico) y 16 (ácido octadecanoico,
también conocido como ácido esteárico). Los grupos éster de ácidos
grasos preferidos con la estructura general de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH_{3}
son aquéllos en los que x+y es 14 (por ejemplo, ácido oleico). Los
grupos éster de ácidos grasos preferidos con la estructura de
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH=CH-(CH_{2})_{z}-CH_{3}
son aquéllos en los que x+y+z es 12 (por ejemplo, ácido
linoleico).
\global\parskip0.950000\baselineskip
El grupo o grupos aniónicos tienen
preferiblemente la estructura general
-O-SO_{2}-OR o
-PO_{2}-(OR)_{2}, en las que R se selecciona del grupo
constituido por átomos y/o moléculas que forman cationes
monovalentes. Los ejemplos de miembros de tales grupos incluyen
H^{+}, Na^{+}, K^{+}, Li^{+} o NH_{4}^{+}. Las
realizaciones específicas incluyen derivados de azúcar que tienen
los grupos éster de sulfato
-O-SO_{2}-OH,
-O-SO_{2}-ONa u
-O-SO_{2}-ONH_{4}. También
pueden estar presentes combinaciones de estos grupos éster de
sulfato.
La invención da a conocer un procedimiento
fácil, seguro y económico para la preparación de los derivados de
mono- y disacárido anteriores. Este procedimiento comprende hacer
reaccionar un mono- o disacárido con un cloruro de acoílo y un
agente de sulfonación. El mono- o disacárido puede hacerse
reaccionar con dicho cloruro de acoílo y agente de sulfonación en
cualquier orden, o de manera simultánea.
Tal como se tratará a continuación extensamente,
se ha encontrado que: (1) variando la naturaleza del monosacárido o
disacárido usado; (2) variando la cantidad (proporciones) de los
diversos materiales de partida usados; (3) variando la naturaleza
del/de los cloruro(s) de acoílo usado(s); y/o bien (4)
variando el/los catión/cationes empleados en la disolución acuosa
usada para la purificación, pueden obtenerse diferentes
preparaciones de derivados de mono- o disacárido, que tienen
propiedades fisicoquímicas específicas. Las propiedades del derivado
de mono- o disacárido que pueden ajustarse así incluyen solubilidad
en disolventes acuosos (agua) y no acuosos (no polares), la
capacidad de formar micelas y micelas mixtas con otras moléculas, la
capacidad de adsorberse a superficies hidrófobas, la capacidad de
adsorberse a superficies hidrófilas, la capacidad de adsorberse a
materiales biológicos y actividad superficial/tensioactividad.
Los cloruros de acoílo preferidos son cloruro de
hexanoílo, cloruro de octanoílo, cloruro de decanoílo, cloruro de
dodecanoílo (cloruro de lauroílo), cloruro de tetradecanoílo
(cloruro de miristoílo), cloruro de hexadecanoílo (cloruro de
palmitoílo), cloruro de octadecanoílo (cloruro de estearoílo y
cloruro de oleílo), y combinaciones de los mismos.
En una realización específica, se dan a conocer
en el presente documento derivados de mono- y disacárido que tienen
una alta solubilidad en agua, baja solubilidad en disolventes
orgánicos, una pequeña capacidad de unirse a moléculas hidrófobas y
una pequeña capacidad de unirse a superficies hidrófobas. A este
respecto, se prefiere que el cloruro de acoílo se elija del grupo
de cloruro de octanoílo, cloruro de decanoílo, cloruro de
dodecanoílo, cloruro de tetradecanoílo y combinaciones de los
mismos. Más preferiblemente a este respecto, el cloruro de acoílo
se elige del grupo de cloruro de octanoílo, cloruro de decanoílo y/o
cloruro de dodecanoílo. Lo más preferiblemente a este respecto,
el/los cloruro(s) de acoílo es/son cloruro de decanoílo y/o
cloruro de dodecanoílo.
En otra realización, se dan a conocer en el
presente documento derivados de mono- y disacárido que tienen una
baja solubilidad en agua, una alta solubilidad en disolventes
orgánicos, una gran capacidad de unirse a moléculas hidrófobas y
una gran capacidad de unirse a superficies hidrófobas. A este
respecto, se prefiere que el cloruro de acoílo se elija del grupo
de cloruro de dodecanoílo, cloruro de tetradecanoílo, cloruro de
hexadecanoílo, cloruro de octadecanoílo y combinaciones de los
mismos. Más preferiblemente a este respecto, el/los
cloruro(s) de acoílo es/son cloruro de tetradecanoílo,
cloruro de hexadecanoílo y/o cloruro de octadecanoílo. Lo más
preferiblemente a este respecto, el/los cloruro(s) de acoílo
es/son cloruro de hexadecanoílo y/o cloruro de octadecanoílo.
Los agentes de sulfonación preferidos son
SO_{3} gaseoso, HClSO_{3} (ácido clorosulfónico),
SO_{3}.piridina,
SO_{3}-2-metilpiridina,
SO_{3}-2,6-dimetilpiridina,
SO_{3}-dimetilformamida,
SO_{3}-trimetilamida,
SO_{3}-trietilamina,
SO_{3}-dimetilanalina,
SO_{3}-N-etilmorfolina,
SO_{3}-dietilanalina,
SO_{3}-dioxano y combinaciones de los mismos. El
agente de sulfonación es preferiblemente SO_{3}\cdotpiridina o
SO_{3} gaseoso.
Se prefiere que se haga reaccionar un mono- o
disacárido con el/los cloruro(s) de acoílo en una proporción
molar de entre 1:1 y 1:N-1, y con el/los
agente(s) de sulfonación en una proporción molar de entre 1:1
y 1:N-1, en el que la suma de la cantidad del/de
los cloruro(s) de acoílo más la cantidad del/de los
agente(s) de sulfonación no excede de N, siendo N el número
de grupos hidroxilo del mono- o disacárido a partir del cual se
derivan los derivados. Eligiendo adecuadamente la proporción molar
entre los reactivos, el experto puede preparar convenientemente un
derivado de mono- o disacárido que tiene el número deseado de grupos
éster de ácidos grasos y éster de sulfato.
El mono- o disacárido se hace reaccionar
preferiblemente con el cloruro de acoílo y el/los agente(s)
de sulfonación en un medio anhidro, aprótico. El procedimiento se
lleva a cabo preferiblemente en un volumen de disolvente(s)
orgánico(s) tan pequeño como sea posible. Preferiblemente,
el/los disolvente(s) orgánico(s) se eligen de modo
que puedan eliminarse fácilmente de la mezcla de reacción mediante,
por ejemplo, precipitación, filtración, cristalización o
evaporación. Los disolventes orgánicos preferidos son piridina y
N-metilpirrolidinona. Se prefieren sumamente una
mezcla de dimetilformamida
\hbox{anhidra y piridina anhidra y
una mezcla de N-metil-pirrolidinona
anhidra y piridina anhidra.}
Si se usa piridina, su cantidad es
preferiblemente inferior a dos veces la cantidad del cloruro de
acoílo usado. Más preferiblemente, la cantidad de piridina usada es
similar a la cantidad de cloruro de acoílo.
Por ejemplo, es posible hacer reaccionar el
mono- o disacárido con el/los cloruro(s) de acoílo, que
forman un éster de disacárido de ácidos grasos, antes de hacerlo
reaccionar con el/los agente(s) de sulfonación.
El monosacárido o disacárido se hace reaccionar
preferiblemente con el/los cloruro(s) de acoílo durante un
periodo de 4 a 8 horas, preferiblemente de aproximadamente 6 horas,
a una temperatura de aproximadamente 60ºC a 70ºC. Puede desearse
dejar la mezcla de reacción en reposo en lo sucesivo durante hasta
18 horas a temperatura ambiente. La reacción con el/los
agente(s) de sulfonación se lleva a cabo preferiblemente
durante al menos 6 horas a entre temperatura ambiente y 70ºC. En
una realización preferida, el monosacárido o disacárido se hace
reaccionar simultáneamente con el/los cloruro(s) de acoílo y
el/los agente(s)
\hbox{de sulfonación durante al menos
6 h a aproximadamente de 60ºC a 70ºC.}
Puede desearse dejar la mezcla de reacción en
reposo en lo sucesivo durante hasta 18 horas a temperatura
ambiente.
En otra realización preferida, el mono- o
disacárido se hace reaccionar en primer lugar con acoilcolina y con
el agente de sulfonación a temperatura ambiente y posteriormente la
temperatura se lleva hasta aproximadamente
50ºC-70ºC, preferiblemente 55ºC-70ºC
y más preferiblemente hasta aproximadamente 60ºC.
A este respecto, se observa que la realización
del procedimiento a temperatura ambiente significa que la
temperatura no es crítica para el procedimiento. Tal característica
permite que el procedimiento se realice a un amplio intervalo de
temperaturas y en un amplio intervalo de condiciones con ahorros
concomitantes. Se contempla que podría ser aceptable una
temperatura ambiente de tan sólo aproximadamente 10ºC. Las
temperaturas ambiente preferidas no son inferiores a
aproximadamente 15ºC, más preferiblemente no inferiores a
aproximadamente 18ºC. Además, las temperaturas ambiente no son
preferiblemente superiores a aproximadamente 50ºC, más
preferiblemente no superiores a aproximadamente 40ºC, lo más
preferiblemente no superiores a aproximadamente 25ºC.
El presente derivado de mono- o disacárido se
obtiene en una reacción de dos etapas de un monosacárido o
disacárido con un cloruro de acoílo y un agente de sulfonación. En
una realización preferida, esta reacción se lleva a cabo en una
etapa en reacción simultánea del mono- o disacárido con el cloruro
de acoílo y el agente de sulfonación. Por supuesto, también es
posible partir de un éster de monosacárido de ácidos grasos o un
éster de disacárido de ácidos grasos, por ejemplo el éster de
sacarosa del ácido láurico L-195 (Mitsubishi,
Japón), éster de sacarosa del ácido láurico L-595
(Mitsubishi, Japón) o éster de sacarosa del ácido esteárico
S-195 (Mitsubishi, Japón), y hacer reaccionar este
material de partida con uno o más agente(s) de sulfonación
para formar el derivado de mono- o disacárido deseado.
Tal como se ha mencionado, se prefiere que se
use una cantidad de disolventes orgánicos tan pequeña como sea
posible. A este respecto, se prefiere que el mono- o disacárido se
disuelva en el/los disolvente(s) orgánico(s) mediante
calentamiento dando como resultado una disolución transparente,
homogénea. En particular, este procedimiento de preparación de una
disolución homogénea es adecuado para azúcares que son relativamente
poco solubles en los disolventes orgánicos o son difíciles de
disolver en los disolventes orgánicos, por ejemplo sacarosa y
lactosa. Para disolver estos azúcares en la menor cantidad o volumen
de disolventes orgánicos, la temperatura se aumenta hasta >
80ºC. Preferiblemente, la temperatura de los disolventes orgánicos
se aumenta hasta > 90ºC.
En una realización preferida, tras completarse
la reacción, se neutralizan los derivados de mono- o disacárido en
los disolventes orgánicos con una disolución de NaOH, NH_{4}OH,
KOH, dando como resultado derivados de mono- o disacárido que
tienen grupos éster de sulfato que incluyen uno de los cationes
Na^{+}, K^{+} o NH_{4}^{+}.
Los derivados de mono- o disacárido objetivo
pueden recuperarse mediante enfriamiento dando como resultado la
formación de dos o tres o más fases distintas de las cuales una es
rica es los derivados de mono- o disacárido. Ésta puede recuperarse
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo
filtración, decantación y similares. Se eliminan los disolventes
orgánicos residuales de esta fase, por ejemplo, evaporando a
temperatura aumentada y presión reducida, o lavando con una fase
acuosa. El/los disolvente(s) orgánicos y cualquier
subproducto formado durante la reacción estarán presentes, tras el
enfriamiento, en una o dos fases que no contienen o casi no
contienen nada de los derivados de mono- o disacárido. Esta fase o
estas fases pueden eliminarse mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica incluyendo filtración, decantación y
similares. El sacárido derivatizado puede purificarse
adicionalmente mediante otras técnicas conocidas en la técnica.
Los derivados de mono- o disacárido pueden
extraerse de la mezcla de reacción usando un líquido inmiscible con
los disolventes orgánicos usados para la preparación de los
derivados de mono- o disacárido. Por el presente documento, los
derivados de mono- o disacárido se separan o aíslan de los
subproductos y disolvente(s) orgánico(s) usados para
la preparación de los mismos. A este respecto, se prefiere que dicho
líquido sea un disolvente orgánico volátil o sea un componente de
la formulación final del derivado de azúcar. Se prefiere además que
dicho líquido sea un aceite, siendo la formulación final una
emulsión. Lo más preferiblemente, dicho líquido es escualano.
Se cree que las dos reacciones químicas
implicadas en la síntesis de los derivados de monosacárido y
derivados de disacárido de la presente invención son reacciones
aleatorias, que dan como resultado una colección de diferentes
derivados de mono- o disacárido, que varían en el número de grupos
éster de sulfato por molécula de mono- o disacárido y/o varían en
el número de grupos éster de ácidos grasos por molécula de mono- o
disacárido, y, por tanto, varían en la estructura y propiedades
fisicoquímicas que tienen los mismos.
Sin embargo, se observa que el número de
derivados químicamente distintos en una preparación de derivados de
mono- o disacárido es considerablemente inferior que en
preparaciones de sulfolipo-polisacáridos dadas a
conocer por Hilgers et al. (documentos WO 96/20222,
WO96/20008) tal como se trató anteriormente de manera extensa. Si
no se tiene en cuenta la distribución de los grupos éster de ácidos
grasos, los grupos éster de sulfato y los grupos hidroxilo en la
molécula de disacárido, el número de derivados distintos en una
preparación obtenida a partir de un disacárido con 8 grupos
hidroxilo según la presente invención es de 28. Si se tiene en
cuenta la distribución de los grupos éster de ácidos grasos, los
grupos éster de sulfato y los grupos hidroxilo en la molécula de
disacárido, el número de derivados distintos obtenidos a partir de
un disacárido con 8 grupos hidroxilo según la presente invención es
de 3^{8} = 6.561. Estos números inferiores en comparación con los
de sulfolipo-ciclodextrina (que eran de 210 y
1.494.336,195, respectivamente) tienen ventajas considerables con
respecto a su(s) uso(s) y preparación.
El presente procedimiento para preparar un
derivado de mono- o disacárido conduce por consiguiente a una mezcla
de tales derivados. Estos derivados pueden separarse usando
técnicas tales como cristalización, precipitación, filtración,
evaporación, diálisis o ultrafiltración. Se prefiere que la
eliminación del/de los disolvente(s) orgánico(s)
usado(s)
y los subproductos formados se lleve a cabo simultáneamente con la separación de los derivados de mono- y disacárido diferentes obtenidos. Esto se logra preferiblemente mediante separación de fases, cromatografía, precipitación, disolución, extracción o una combinación de tales técnicas. Más preferiblemente, los derivados de mono- o disacárido se separan del/de los disolvente(s) orgánico(s) mediante liofilización, con lo cual se obtiene una preparación seca de derivado de mono- o disacárido. Preferiblemente, tal liofilización se realiza a temperatura ambiente, a una presión interna inferior a 1000 Pa (10 mbar) y una trampa fría a menos de -25ºC.
y los subproductos formados se lleve a cabo simultáneamente con la separación de los derivados de mono- y disacárido diferentes obtenidos. Esto se logra preferiblemente mediante separación de fases, cromatografía, precipitación, disolución, extracción o una combinación de tales técnicas. Más preferiblemente, los derivados de mono- o disacárido se separan del/de los disolvente(s) orgánico(s) mediante liofilización, con lo cual se obtiene una preparación seca de derivado de mono- o disacárido. Preferiblemente, tal liofilización se realiza a temperatura ambiente, a una presión interna inferior a 1000 Pa (10 mbar) y una trampa fría a menos de -25ºC.
En particular, se da a conocer en el presente
documento un procedimiento para preparar preparaciones ricas en
derivados de disacárido que tienen números y tipos específicos de
grupos éster de ácidos grasos y grupos aniónicos mediante las
etapas de poner en contacto aproximadamente 1 mol de disacárido con
aproximadamente 7 moles de cloruro(s) de acoílo para cada
grupo éster de ácidos grasos por molécula de disacárido preparada
de ese modo y con aproximadamente 1 mol de agente(s) de
sulfonación para cada grupo éster de sulfato o aproximadamente 1
mol de agente(s) de fosfonación para cada éster de fosfato
por molécula de disacárido preparada de ese modo, en el que el
número total de moles de cloruro(s) de acoílo y de
agente(s) de sulfonación no excede de N y en el que N es el
número total de grupos hidroxilo del disacárido puesto en
contacto.
La solubilidad en agua de las preparaciones de
los presentes derivados de mono- o disacárido puede aumentarse (1)
aumentando la cantidad de agente(s) de sulfonación o
agente(s) de fosfonación empleados en el procedimiento dado
a conocer en el presente documento y/o disminuyendo la cantidad de
cloruro(s) de acoílo empleados en el procedimiento dado a
conocer en el presente documento, de modo que se proporcionan
derivados de mono- o disacárido que tienen mayores números de
grupos aniónicos en relación con el número de grupos éster de ácidos
grasos presentes. También puede lograrse una alta solubilidad en
agua (2) empleando cloruro(s) de acoílo con cadenas
carbonadas cortas, proporcionando derivados de mono- o disacárido
que tienen grupos éster de ácidos grasos con cadenas carbonadas
relativamente cortas. Esto puede lograrse particularmente empleando
cloruro de octanoílo, cloruro de decanoílo, cloruro de dodecanoílo
(cloruro de lauroílo) y/o cloruro de tetradecanoílo, como
reactivo(s) de cloruro de acoílo.
Puede disminuirse la solubilidad en agua, o
puede aumentarse la solubilidad en disolventes no polares tomando
las medidas opuestas. Esto puede lograrse particularmente empleando
cloruro de dodecanoílo (cloruro de lauroílo), cloruro de
tetradecanoílo y/o cloruro de octanoílo, como reactivo(s) de
cloruro de acoílo. Las mismas medidas aumentan la capacidad de los
derivados de mono- o disacárido de unirse a superficies
hidrófobas.
Puede proporcionarse la capacidad de los
presentes derivados de mono- o disacárido de formar micelas
aumentando la cantidad de agente(s) de sulfonación o
fosfonación empleado(s) en el procedimiento de la presente
invención y aumentando la cantidad de cloruro(s) de acoílo.
Las mismas medidas conducen a un aumento en la actividad
superficial/tensioactividad.
A este respecto, se observa que los presentes
derivados de mono- y disacárido pueden formar micelas mixtas
grandes con otros compuestos. Por ejemplo, se ha encontrado que los
derivados de monosacárido con una proporción de éster de
sulfato/éster de ácidos grasos de 1 grupo éster de sulfato y 3
grupos éster de ácidos grasos por molécula de monosacárido, o
derivados de disacárido con una proporción de éster de sulfato/éster
de ácidos grasos de 1 grupo éster de sulfato y 7 grupos éster de
ácidos grasos por molécula de disacárido, forman micelas mixtas con
polisorbato 80. Estas micelas no pasan a través de membranas de
ultrafiltración con un punto de corte de peso molecular alto. El
tamaño de las micelas mixtas con otros compuestos depende de la
proporción de los grupos hidrófilos (es decir, ésteres de sulfato)
y los grupos hidrófobos (es decir, ésteres de ácidos grasos) y de
las características físicas de la molécula que va a asociarse con
ellos.
Se ha encontrado que las preparaciones ricas en
derivados de mono- o disacárido que tienen números y tipos
específicos de grupos aniónicos (por ejemplo, grupos éster de
sulfato) y grupos éster de ácidos grasos pueden formar complejos
con moléculas inmiscibles en agua particulares, por ejemplo,
ingredientes alimentarios, pigmentos, aromas, aceites, moléculas de
fármaco y antígenos, que pueden modificar la estabilidad,
reactividad, movilidad y/o biodisponibilidad de la molécula
particular.
Los presentes derivados de mono- y disacárido
pueden emplearse en diversas aplicaciones médicas y
farmacéuticas.
Los derivados de mono- y disacárido según la
invención, cuando se complejan con una molécula (tal como una
molécula de fármaco o un compuesto antigénico), proporcionan una
biodisponibilidad mejorada de la molécula a partir de formulaciones
sólidas, semisólidas y/o líquidas. También proporcionan una
estabilidad potenciada y un término de caducidad mejorado. Además,
reducen los efectos secundarios (toxicidad) de la molécula con la
cual forman un complejo. Finalmente, hacen posible la provisión de
disoluciones inyectables uniformes fáciles de manejar (a partir de
fármacos escasamente solubles).
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Un ejemplo de una aplicación médica en la que el
uso de los presentes derivados de mono- y disacárido (y
preparaciones de los mismos) conduce a grandes ventajas es en
adyuvantes de vacunas. Los adyuvantes adecuados incluyen los
denominados comúnmente como emulsiones de aceite en agua (incluyendo
escualano en agua, aceite mineral en agua, hexadecano en agua,
aceite de soja en agua, ésteres de sacarosa de ácidos grasos en
agua), emulsiones de agua en aceite (incluyendo agua en aceite
mineral, agua en escualano, agua en éster de sacarosa de ácidos
grasos) o emulsiones de agua en aceite en agua (incluyendo agua en
aceite mineral en agua, agua en escualano en agua, agua en éster de
sacarosa de ácidos grasos en agua, y similares).
La vacunación es uno de los medios más rentables
de prevenir y controlar enfermedades infecciosas tanto en la salud
animal como humana. La vacunación o inmunización incluye la
generación de suficientes niveles y duración del tipo (o tipos)
adecuado de respuestas inmunitarias frente al componente (o
componentes) antigénico y/o epítopo (o epítopos) pertinentes. La
respuesta inmunitaria puede determinarse, por ejemplo, mediante los
títulos de anticuerpos en suero, las respuestas proliferativas de
linfocitos, el grado de protección frente a una infección
artificial o natural, la duración de la protección, los números de
animales que no responden y similares.
En muchas especies animales diana, por ejemplo
cerdos, reses, aves de corral, perros, gatos, caballos, seres
humanos y similares, pueden prevenirse o controlarse mediante
vacunación enfermedades producidas por virus, bacterias, parásitos
y cualquier otro agente infeccioso, por ejemplo, virus de la gripe,
virus de la hepatitis, virus del sarampión, virus de la polio,
parvovirus, virus de la rabia, Streptococcus,
Meningococcus, Clostridium, Escherichia,
Salmonella, Campylobacter, Actinobacillus,
Listeria, malaria, tripanosoma, estróngilo, protozoos,
micoplasma, Clamidia y similares.
En la mayoría de los casos, la respuesta
inmunitaria frente a antígenos inactivados y en algunos casos
también frente a antígenos vivos es demasiado baja para establecer
un nivel de protección suficiente o una duración de la protección
suficiente. Por tanto, se añaden adyuvantes a estos antígenos que
estimulan la respuesta inmunitaria.
El adyuvante ideal potencia el/los
tipo(s) pertinente(s) de respuesta inmunitaria
(humoral y/o celular) frente al/los antígeno(s) y/o
epítopo(s) pertinentes para la protección, sin efectos
secundarios significativos. Un adyuvante que estimula un cierto
tipo (o tipos) de inmunidad puede ser apropiado algún/algunos
uso(s) pero inapropiado para otro(s)
uso(s). Además, un adyuvante que estimula la inmunidad frente a ciertos antígenos puede ser apropiado para algún/algunos uso(s) pero no para otro(s) uso(s). Un adyuvante fuerte potencia, por ejemplo, la inmunidad mediada por anticuerpos y mediada por células frente a muchos antígenos diferentes. Los distintos efectos de un adyuvante sobre diferentes antígenos son una clara desventaja, especialmente en relación con vacunas de combinación que contienen varios antígenos diferentes. Los adyuvantes que ejercen fuerte actividad con respecto al/a los tipo(s) de antígeno, especie animal, tipo(s) de respuestas inmunitarias tienen ventajas importantes.
uso(s). Además, un adyuvante que estimula la inmunidad frente a ciertos antígenos puede ser apropiado para algún/algunos uso(s) pero no para otro(s) uso(s). Un adyuvante fuerte potencia, por ejemplo, la inmunidad mediada por anticuerpos y mediada por células frente a muchos antígenos diferentes. Los distintos efectos de un adyuvante sobre diferentes antígenos son una clara desventaja, especialmente en relación con vacunas de combinación que contienen varios antígenos diferentes. Los adyuvantes que ejercen fuerte actividad con respecto al/a los tipo(s) de antígeno, especie animal, tipo(s) de respuestas inmunitarias tienen ventajas importantes.
En el caso en el que se usa un adyuvante en una
vacuna de ADN o ARN, que puede inducir antígenos in vivo, el
adyuvante también ayuda preferiblemente a la incorporación
satisfactoria de la secuencia de ADN o ARN en el ADN de la célula
huésped (transfección).
Se conocen muchos tipos diferentes de adyuvantes
pero sólo unos pocos se aplican en vacunas humanas o veterinarias
comerciales. El tipo de adyuvante seleccionado para una vacuna se
determina mediante varios factores, incluyendo la especie animal
diana, la eficacia del adyuvante, la toxicidad del adyuvante, la
calidad del adyuvante, el precio de costo del adyuvante y
similares. Se conoce bien que la eficacia y toxicidad de los
adyuvantes están asociadas porque una alta eficacia está acompañada
por una alta toxicidad y una baja toxicidad con una baja eficacia.
La alta toxicidad se manifiesta como reacciones locales, por ejemplo
inflamación, hinchazón, formación de abscesos, granuloma, necrosis
y similares y/o reacciones sistémicas, por ejemplo dolor, fiebre,
hipertensión, anafilaxia, anorexia, pérdida de peso y similares. La
toxicidad de un adyuvante es una limitación importante para su uso
y aunque puede ser aceptable en algunas especies animales, puede no
ser aceptable en otras especies animales.
En animales de laboratorio, el adyuvante
convencional es el adyuvante completo de Freund, que es un adyuvante
fuerte. Debido a su toxicidad, especialmente sus efectos locales,
no puede aplicarse en seres humanos o animales destinados para la
alimentación o animales de compañía. En animales destinados para la
alimentación tales como ganado, ovejas y cerdos, las emulsiones de
aceite mineral son a menudo el adyuvante de elección. Los ejemplos
incluyen emulsiones de aceite mineral en agua (O/W), emulsiones de
agua en aceite mineral (W/O) y emulsiones de agua en aceite mineral
en agua (W/O/W). Estos adyuvantes producen respuestas inmunitarias
altas (pero inferiores a las del adyuvante completo de Freund). La
toxicidad, incluyendo efectos secundarios locales y sistémicos,
impide su aplicación en animales de compañía y seres humanos. En
animales de compañía tales como gatos, perros y caballos, se
aplican adyuvantes relativamente seguros, por ejemplo ISCOM,
Al(OH)_{3} y poliacrilatos. En general, estos
adyuvantes inducen respuestas más bajas que las emulsiones de aceite
mineral pero también tienen menos efectos secundarios
perjudiciales. En seres humanos, las sales de aluminio son los
únicos adyuvantes autorizados. Provocan respuestas inmunitarias más
bajas que
\hbox{muchos de los adyuvantes usados en vacunas
veterinarias pero se consideran relativamente seguros.}
Por tanto, una desventaja de los adyuvantes
fuertes es su toxicidad relativamente alta. Una desventaja de los
adyuvantes seguros es su eficacia relativamente baja.
Además de la eficacia y toxicidad, la calidad
del adyuvante y de las vacunas que contienen el adyuvante es
crucial. Los criterios de calidad incluyen viscosidad, estabilidad
química, estabilidad física, estabilidad fisicoquímica y similares.
Una alta viscosidad dificulta el manejo del producto, por ejemplo la
aspiración del producto en una jeringuilla o la administración del
producto al animal. Una baja viscosidad facilita el manejo del
producto. Una baja estabilidad química, física o fisicoquímica
reduce el término de caducidad de una vacuna y demanda condiciones
estrictas para el almacenamiento y transporte del producto. Una alta
estabilidad química, física y fisicoquímica da como resultado un
término de caducidad prolongado y facilita la logística del
producto. Se conoce bien que las vacunas que contienen emulsiones de
aceite mineral usadas en animales destinados para la alimentación,
tienen una viscosidad aumentada y son propensas a la
inestabilidad.
A partir de lo anterior, queda claro que existe
todavía una necesidad urgente de adyuvantes que tienen una alta
eficacia y baja toxicidad, son eficaces frente a una amplia gama de
antígenos y son fáciles de manejar.
La presente invención provee un adyuvante de
este tipo. Se ha encontrado que los derivados de mono- y disacárido
descritos anteriormente son sumamente adecuados para su uso como
adyuvantes en diversos tipos de vacunas. Por tanto, la invención
también se refiere a un adyuvante en forma de un derivado de mono- o
disacárido tal como se da a conocer en el presente documento y a
una formulación de adyuvante para preparar una vacuna que comprende
uno o más de dichos derivados de mono- o disacárido. La formulación
de adyuvante puede comprender además un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen soluciones
salinas fisiológicas y emulsiones de aceite en agua,
preferiblemente emulsiones de escualeno en agua.
Una formulación de adyuvante particularmente
preferida según la invención comprende un derivado de mono- o
disacárido (I) tal como se da a conocer en el presente documento,
una fase líquida inmiscible en agua o una fase sólida inmiscible en
agua (II), un emulsivo o estabilizador (III) y opcionalmente una
fase acuosa (IV).
Puede emplearse cualquiera de los derivados de
azúcar tal como se dan a conocer en el presente documento como
adyuvante. El derivado puede ser, por ejemplo, una pentosa con
1-3, preferiblemente 1 ó 2 grupos de ácido graso y
0-3, preferiblemente 1 ó 2 grupos aniónicos, en el
que la suma de grupos aniónicos y de ácido graso no excede
de
4.
4.
Un derivado de hexosa con 1-4,
preferiblemente 1-3 grupos de ácido graso y
0-4, preferiblemente 1-3 grupos
aniónicos en el que la suma de los grupos aniónicos y de ácido graso
no excede de 5, es también particularmente adecuado para su uso
como adyuvante según la invención.
Un derivado de disacárido preferido como
adyuvante puede comprender 1-7, más preferiblemente
3-7, lo más preferiblemente 4-7
grupos de ácido graso y 0-7, más preferiblemente
0-6, lo más preferiblemente 1-5
grupos aniónicos, en el que la suma de los grupos aniónicos y de
ácido graso no excede de 8.
Se han logrado resultados particularmente buenos
con un derivado de disacárido que tiene un grupo aniónico,
preferiblemente un grupo éster de sulfato y 5-7
grupos éster de ácidos grasos. Un disacárido derivatizado que tiene
cuatro grupos aniónicos, preferiblemente grupos éster de sulfato, y
cuatro grupos éster de ácidos grasos también mostró unas
prestaciones muy satisfactorias como adyuvante.
Uno o más derivados de azúcar están presentes
habitualmente como adyuvante en una formulación de adyuvante según
la invención en una concentración de 0,1-1000 g/l,
preferiblemente de 0,5-500 g/l y más preferiblemente
de 1-320 g/l.
La fase líquida inmiscible en agua es
preferiblemente un aceite. Los aceites adecuados incluyen, por
ejemplo, aceite de semilla de soja, aceite de cacahuete, aceite de
canola, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite
Mazola, aceite de hígado de bacalao, aceite de almendra, aceite de
semilla de algodón, oleato de etilo, miristato de isopropilo,
palmitato de isopropilo, aceite mineral, alcohol miristílico,
octildodecanol, aceite pérsico, aceite de sésamo, oleato de
miristilo, oleato de cetilo y palmitato de miristilo. Otros aceites
adecuados incluyen aceites biocompatibles constituidos por ácidos
grasos saturados, insaturados y/o parcialmente hidrogenados,
aceites a base de silicio, aceites sintéticos tales como
triglicéridos compuestos por cadenas saturadas e insaturadas de
ácidos grasos C_{12}-C_{24}, tales como por
ejemplo el éster del triglicérido glicerol de ácido oleico,
terpenos, linoleno, escualeno, escualano, escualamina y aceites
fluorados incluyendo compuestos perfluorados conocidos como
FC-40, FC-43, Fc-72,
FC-77, FC-70, FC-75,
perfluorohexano, bromuro de perfluorooctilo (también conocido como
perfluorobron), yoduro de perfluorooctilo, o una mezcla de los
mismos.
Se han logrado resultados muy buenos con una
formulación de adyuvante en la que la fase inmiscible en agua (II)
es un escualano, escualeno, aceite mineral, aceite vegetal,
hexadecano, fluorocarbono o un aceite de silicio.
La fase inmiscible en agua (II) está presente
normalmente en una formulación de adyuvante en una concentración
que varía desde 0-640 g/l, preferiblemente
0-480 g/l y más preferiblemente
10-320 g/l.
En el caso en el que la formulación de adyuvante
comprende una fase sólida inmiscible en agua, tal fase sólida es
preferiblemente una sal que es insoluble en agua. Son
particularmente adecuadas las sales insolubles de aluminio o calcio
o mezclas de las mismas. Las sales preferidas incluyen hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, sílice y mezclas
de los mismos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El estabilizador o emulsivo (III) puede ser un
detergente. Los agentes de emulsionamiento y/o estabilización
adecuados incluyen, por ejemplo, colesterol, dietanolamina,
monoestearato de glicerilo, alcoholes de lanolina, lecitina, mono-
y diglicéridos, monoetanolamina, ácido oleico, alcohol oleílico,
poloxámero, por ejemplo, poloxámero 188, poloxámero 184, poloxámero
181, polímeros en bloque no iónicos (por ejemplo, PLURONICS de
BASF), estearato de polioxietileno 50, aceite de ricino de polioxilo
35, oleil éter de polioxilo 10, cetoestearil éter de polioxilo 20,
estearato de polioxilo 40, polisorbato 20, polisorbato 40,
polisorbato 60, polisorbato 80, diacetato de propilenglicol,
monoestearato de propilenglicol, laurilsulfato de sodio, estearato
de sodio, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano,
monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, esteárico,
Triton X-100, saponinas, saponinas purificadas (por
ejemplo QS21), polímeros (por ejemplo poliacrilatos).
Se han logrado resultados particularmente buenos
con una formulación de adyuvante en la que el emulsivo o
estabilizador (III) es un detergente no iónico con un valor de
equilibrio hidrófilo-lipófilo superior a 10, un
éster de azúcar de ácidos grasos o un detergente aniónico con un
valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo superior a
10.
Los emulsivos o estabilizadores (III) preferidos
incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, polisorbato 85,
Triton-X 100, saponina, una lecitina, un copolímero
en bloque no iónico, un éster de sacarosa de ácidos grasos, un
éster de azúcar del ácido láurico, por ejemplo éster de azúcar Ryoto
L1695 de Mitsubishi-Kagaku Food corporation. Se
prefieren particularmente polisorbato 80 y ésteres de sacarosa de
ácidos grasos.
Un mono- o disacárido tal como se da a conocer
en el presente documento también puede usarse ventajosamente como
emulsivo o estabilizador (III) en una formulación de adyuvante. Se
han logrado resultados particularmente buenos con un derivado de
mono- o disacárido que tiene al menos 3, preferiblemente al menos 4,
pero no más de N-1 grupos aniónicos y al menos 1
pero no más de N-3, preferiblemente no más de
N-4 grupos éster de ácidos grasos en el que N es el
número de grupos hidroxilo del mono- o disacárido a partir del cual
se deriva el derivado y en el que el número combinado de grupos
aniónicos y de ácidos grasos no excede de N.
Normalmente, están presentes uno o más emulsivos
o estabilizadores en una formulación de adyuvante según la
invención en una concentración total desde 0 hasta 640 g/l,
preferiblemente 1-480 g/l y más preferiblemente
1-320 g/l.
Las fases acuosas (IV) adecuadas incluyen, por
ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato,
solución salina tamponada con citrato, disoluciones iónicas
isotónicas, disoluciones no iónicas isotónicas. La cantidad de fase
acuosa puede variar ampliamente y será habitualmente desde 0 hasta
999,9 g/l, preferiblemente desde 10-990 g/l y más
preferiblemente desde 640-990 g/l.
La invención se refiere además a una vacuna que
comprende un compuesto antigénico y un derivado de mono- o
disacárido tal como se da a conocer en el presente documento,
opcionalmente en una formulación de adyuvante según la invención.
Una vacuna de este tipo puede comprender 0,05-250
g/l, preferiblemente 0,25-125 g/l, y más
preferiblemente 1-80 g/l de un derivado de mono- o
disacárido como adyuvante o una mezcla de tales derivados. Puede
comprender además uno o más emulsivos o estabilizadores en una
concentración total desde 0 hasta 640 g/l, preferiblemente
1-480 g/l y más preferiblemente
1-320 g/l y una fase líquida inmiscible en agua,
preferiblemente un aceite, en una concentración que varía desde 0
\hbox{hasta 640 g/l, preferiblemente 1-480 g/l
y más preferiblemente 1-320 g/l.}
La vacuna puede contener cualquier componente
antigénico tal como se describió anteriormente. Para la preparación
de las vacunas, el componente antigénico se mezcla mucho antes o
bien justo antes de su uso.
Una vacuna según la invención puede usarse, por
ejemplo, para la inmunización de seres humanos y animales (estos
últimos incluyen, por ejemplo, mamíferos, aves y roedores, por
ejemplo cerdos, ovejas, caballos, perros, ganado y aves de
corral).
La vacuna, el adyuvante o la formulación de
adyuvante puede aplicarse por una vía parenteral o no parenteral,
por ejemplo intramuscular, intradérmica, transdérmica, subcutánea,
intraperitoneal, intracutánea, intranasal, nasal, oral,
intravaginal, intracloacal y similares.
Se observa que la invención también prevé el uso
de una combinación de un adyuvante conocido y un adyuvante en forma
del presente derivado de mono- o disacárido.
Con respecto a animales destinados para la
alimentación, el presente adyuvante tiene varias ventajas con
respecto a los adyuvantes ya aplicados, por ejemplo menos efectos
secundarios locales y sistémicos, menos molestias de la vacunación
para los animales, menos pérdidas económicas como resultado de la
disminución de los efectos perjudiciales sobre el aumento de peso
corporal, menos pérdidas económicas como resultado de la pérdida de
carne que contiene residuos de vacunas, riesgo inferior de
autoinyección para quien aplica la vacuna, facilidad mejorada de
manejo de la vacuna, estabilidad mejorada del producto y
similares.
En animales de compañía, el presente adyuvante
tiene varias ventajas con respecto a los adyuvantes conocidos ya
aplicados, por ejemplo niveles superiores de la respuesta
inmunitaria, duración mejorada de la respuesta inmunitaria, número
aumentado de animales que responden, un mayor número de antígenos
que pueden combinarse con el adyuvante y similares.
La invención se esclarecerá ahora adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.
Algunos de los experimentos descritos en los
ejemplos a continuación se llevaron a cabo simultáneamente. Con el
fin de facilitar la comparación, se presentan resultados de grupos
seleccionados por ejemplo. La consecuencia es que se presentan
resultados del/de los grupo(s) control en varios
ejemplos.
Ejemplo nº
1
Se sintetizaron derivados de sacarosa tal como
se describió anteriormente para los denominados
sulfolipo-polisacáridos (Hilgers et al.,
1986). En resumen, se secó sacarosa finamente pulverizada (Merck)
mediante calentamiento durante aproximadamente 6 h a 90ºC a <
5000 Pa (50 mbar) y se añadieron
N-metilpirrolidinona anhidra (NMP; Merck) y
piridina anhidra (Merck). Se agitó la mezcla a aproximadamente 80ºC
hasta que se obtuvo una disolución transparente. Se añadió cloruro
de dodecanoílo (Merck) y se mantuvieron las mezclas de reacción
durante aproximadamente 6 h a 60ºC. Se añadió SO_{3}. piridina
(Merck) y se incubaron las mezclas de reacción durante
aproximadamente 18 h a temperatura ambiente. Se ajustó el pH a 7,0
(\pm 0,3) con NaOH 4 M. Se eliminaron la
N-metilpirrolidinona y piridina mediante
evaporación extensa (> 6 h) a temperatura aumentada (< 80ºC),
presión reducida (< 1000 Pa (10 mbar)) y condensación a 4ºC,
hasta que la pérdida de peso del residuo era inferior a 0,1 g por
30 min. Las cantidades de los materiales de partida empleadas para
los diferentes derivados se exponen en la tabla nº 1.1.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se analizaron los productos mediante
cromatografía en capa fina (CCF). Se disolvieron muestras de 0,5 g
en 4,5 ml de NMP y se aplicaron 2 \mul de cada disolución sobre
una placa de CCF de gel de sílice (HPLC-CCF, fase
normal; Analtech, Newark; Delaware, EE.UU) y se eluyó con una mezcla
de 233 ml de dietiléter + 100 ml de n-hexano + 3,3
ml de ácido acético. Se visualizaron las manchas pulverizando la
placa con una disolución de ácido sulfúrico al 50% v/v en metanol y
calentando las placas durante 10 - 30 min. a 120ºC. Los resultados
se exponen en la figura
nº 1.
nº 1.
Se prepararon formulaciones de los diferentes
derivados de sacarosa de la tabla nº 1.1 mezclando 10 g del
derivado de sacarosa con 10 g de polisorbato 80 (ICI) y 40 g de
escualano (Merck) y 190 g de una disolución de timerosal al 0,01%
p/v (Sigma) - solución salina tamponada con fosfato
(PBS-timerosal; pH 7,0). Se emulsionó cada muestra
obtenida mediante tres pasajes a través de un microfluidizador
modelo Y110 (Microfluidics Corp., Newton, EE.UU) a una presión
interna de 40000 Pa (400 bar) y a temperatura ambiente. Se
inspeccionó cada emulsión al microscopio. Se repitió el
procedimiento de emulsificación si por 10 campos inspeccionados eran
visibles al microscopio más de 10 gotitas de aceite con un diámetro
superior a 1 \mum a un aumento de 1000 veces. Se almacenaron las
emulsiones obtenidas a 4ºC, hasta su uso.
Se determinó la actividad adyuvante de estas
formulaciones en cerdos. Se prepararon vacunas mezclando un volumen
de cualquier formulación con un volumen de una formulación de
antígeno que contenía 32 \mug/ml de la glicoproteína E2 del virus
de la fiebre porcina clásica (VFPC-E2;
ID-DLO, Lelystad, los Países Bajos) producida en
células de insecto tal como se describe por Hulst et al.
(1994).
Se inmunizaron grupos de cinco cerdos (10
semanas de edad) por vía intramuscular con 2 ml de vacuna por
animal. Tres semanas más tarde, se repitió la inmunización con la
misma vacuna. Tres semanas antes de la segunda inmunización, se
midieron los títulos de anticuerpos frente a VFPC-E2
en suero mediante ensayo de neutralización de virus tal como se
describe por Terpstra et al. (Vet. Microbiol. 9, págs.
113-120, 1984). Se calcularon el media geométrica
del título (MGT), la desviación estándar (DESV.EST.) de cada grupo y
el antilogaritmo (MGT exponente 2). Los resultados se exponen en la
tabla nº 1.2.
Se incluyó en el experimento con animales
emulsión de sulfolipociclodextrina/escualano en agua
(SL-CD/escuala-
no/polisorbato 80; Hilgers et al., Vaccine 17, págs. 219-228, 1999).
no/polisorbato 80; Hilgers et al., Vaccine 17, págs. 219-228, 1999).
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Ejemplo nº
2
Se alimentaron 34,2 g (0,1 moles) de sacarosa
anhidra (Merck), 149 g (1,5 moles) de
N-metil-pirrolidinona anhidra y 79
g (1 mol) de piridina anhidra en un matraz de fondo redondo que se
conectó luego a un Rotavapor^{TM} (Buchi, Suiza) y se mezclaron
mediante rotación. Se calentó la mezcla hasta 90ºC, hasta que se
obtuvo una disolución clara. Se ajustó la temperatura a 60ºC y se
alimentaron 153,3 g (0,7 moles) de cloruro de dodecanoílo a la
disolución de sacarosa. Se mantuvo la mezcla de reacción en el
matraz a 60ºC durante 6 horas. Se alimentaron 15,9 g (0,1 moles) de
SO_{3} piridina a la mezcla de reacción en el matraz y se mantuvo
la mezcla de reacción a 60ºC durante 6 horas y luego a temperatura
ambiente durante 12 horas. Se mantuvo la mezcla de reacción durante
24 horas a 4ºC, lo que dio como resultado la formación de un
precipitado cristalino y dos fases líquidas. Se recogió la fase
superior y se eliminaron los disolventes mediante evaporación a
temperatura aumentada (< 60ºC), presión reducida (< 1000 Pa
(10 mbar)) y condensación a 4ºC en el Rotavapor^{TM}, hasta que la
pérdida de peso del residuo era inferior a 0,1 g por 30 min.
(fracción I). A una muestra de la fracción I, se le añadieron
n-hexano y N-metilpirrolidinona. Se
centrifugó la mezcla durante 10 min. a 1000 g dando como resultado
una fase superior amarilla transparente (fracción II), una interfase
opalescente blanca (fracción III) y una fase inferior transparente.
Se eliminaron los disolventes de la fracción II y fracción III
mediante evaporación a temperatura aumentada (< 60ºC), presión
reducida (< 1000 Pa (10 mbar)) y condensación a 4ºC en el
Rotavapor^{TM}, hasta que la pérdida de peso del residuo era
inferior a 0,1 g por
30 min.
30 min.
Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo 1.
Se prepararon varias formulaciones y se
determinaron sus efectos sobre la respuesta de anticuerpos frente a
VFPC-E2 tal como se describió anteriormente en el
ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en la tabla nº 2.2.
Se prepararon formulaciones de 10 g de cada
fracción del derivado de sacarosa (fracción I, fracción II y
fracción III) con 10 g de polisorbato 80 (ICI), 40 g de escualano
(Merck) y 190 g de PBS-timerosal tal como se
describió anteriormente en el ejemplo nº 1. Se sometieron a prueba
estas formulaciones en el grupo 3, 6 y 8, respectiva-
mente.
mente.
Se preparó una formulación de 10 g de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 1 con 10 g de polisorbato 80, 40 g de escualano y 190 g
de PBS-timerosal tal como se describió en el ejemplo
nº 1. Se sometió a prueba esta formulación en el grupo 2 y 5.
Se preparó una formulación de 10 g de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa de
la tabla nº 1.1 con 10 g de polisorbato 80, 10 g de escualano y 220
g de PBS-timerosal tal como se describió en el
ejemplo nº 1. Se sometió a prueba esta formulación en el grupo
4.
Se preparó una formulación de 10 g de derivado
de sacarosa
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa de
la tabla nº 1.1 con 10 g de polisorbato 80 y 230 g de
PBS-timerosal sin escualano tal como se describió en
el ejemplo 1. Se sometió a prueba esta formulación en el grupo
7.
Se preparó una formulación de 10 g de
polisorbato 80, 40 g de escualano (Merck) y 200 g de
PBS-timerosal tal como se describió anteriormente
en el ejemplo nº 1. Se sometió a prueba esta formulación en el grupo
9.
Se incluyó una vacuna frente a
VFPC-E2 de agua en aceite mineral en agua
(ID-Lelystad, Lelystad, los Países Bajos) en el
experimento como control positivo. Se sometió a prueba esta
formulación en el grupo 10.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Además de las respuestas de anticuerpos, se
determinaron los efectos de algunos de estos adyuvantes sobre
respuestas inmunitarias mediadas por células mediante un ensayo de
proliferación de linfocitos con células mononucleares de sangre
periférica (CMSP). Seis días tras la segunda inmunización, se
recogieron aproximadamente 5 ml de sangre con heparina de cada
cerdo del grupo 1, grupo 2 y grupo 10. Se diluyeron las muestras de
sangre con 3 volúmenes de PBS y se estratificaron en 12 ml de
Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en tubos
de polipropileno de 50 ml (Falcon). Tras la centrifugación durante
20 min. a 1000 g, se recogieron las interfases que contenían las
CMSP y se lavaron las células dos veces con PBS centrifugando de ese
modo las suspensiones durante 10 - 15 min. a 1000 g. Se determinó
el número de células vivas mediante el procedimiento de exclusión
por azul trípano a un aumento de 100 x y se ajustaron las
suspensiones a 5 x 10^{6} células por ml de medio [medio RPMI
1640 (flujo 10-601-22) complementado
con penicilina 100 IE por ml, estreptomicina 0,1 mg por ml, 4
\mul de beta-mercaptoetanol por l y suero de cerdo
normal al 10%]. De cada suspensión, se pusieron muestras de 100
\mul en seis veces en los pocillos de una placa de 96 pocillos de
fondo plano. Se complementaron tres réplicas con 50 \mul de medio
RPMI (controles negativos) y se añadieron a las tres réplicas 50
\mul de una disolución de 7,1 \mug de VFPC-E2
por ml de medio. Se incubaron las células durante 4 días a 37ºC en
CO_{2} al 5% en un incubador de CO_{2}. Tras la incubación, se
añadieron a cada pocillo 25 \mul de medio que contenía 50 \muCi
de metil ^{3}H-timidina (Amersham TRA 120; 1 mCi
por ml) por ml de medio. Tras la incubación durante 4 horas, se
recogió el ADN de las células sobre filtros (Wallac) usando un
recolector de células (recolector Tomtec 96 match IIIM). Se secaron
los filtros a 70ºC y se pusieron en una manga para filtrar
(Wallac). Se añadieron cinco ml de fluido de centelleo (Wallac
betaplate scint; Wallac, Turku, Finlandia) y se sellaron las mangas
y se determinó la radiactividad de cada muestra en un contador beta
(contador beta de Wallac modelo 1450 Microbeta PLUS, Wallac). Se
calculó el índice de estimulación de las suspensiones de linfocitos
de animales individuales restando al número medio de cuentas por
min. (cpm) de las dos o tres réplicas estimuladas con el antígeno
el número medio de cuentas por minuto de las dos o tres réplicas
incubadas con medio solamente. Se calcularon el índice de
estimulación media aritmética de cada grupo (AMT) y la desviación
estándar (DESV.EST.). Los resultados se exponen en la tabla nº
2.3.
Ejemplo nº
3
Se sintetizaron diversos derivados de sacarosa
tal como se describió en el ejemplo nº 1. Se secó sacarosa
finamente pulverizada (Merck) calentando durante 6 h a 90ºC a <
5000 Pa (50 mbar) y se añadieron
N-metilpirrolidinona anhidra (Merck) y piridina
anhidra (Merck). Se agitó la mezcla a 80ºC hasta que se obtuvo una
disolución clara. Se añadió cloruro de dodecanoílo (Merck), cloruro
de tetradecanoílo (Merck), cloruro de hexadecanoílo (Merck) o
cloruro de octadecanoílo (Merck) y se incubaron las mezclas de
reacción durante 6 h a 60ºC. Se añadió SO_{3}.piridina (Merck) y
se incubaron las mezclas de reacción durante 18 h a temperatura
ambiente. Se mantuvieron las mezclas de reacción a 4ºC durante 24
h, lo que provocó la formación de dos o tres fases. Se recogieron
las fases superiores y se eliminaron la
N-metilpirrolidinona y piridina mediante evaporación
a temperatura aumentada (< 60ºC), presión reducida (< 1000 Pa
(10 mbar)) y condensación a 4ºC, hasta que la pérdida de peso del
residuo era inferior a 0,1 g por 30
min.
min.
Las cantidades de los materiales de partida
usadas se exponen en la tabla nº 3.1.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se analizaron algunos de los productos obtenidos
mediante CCF tal como se describió anteriormente en el presente
documento en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de los derivados de
sacarosa de 10 g de la tabla nº 3.1 con 10 g de polisorbato 80
(ICI), 40 g de escualano (Merck) y 190 g de
PBS-timerosal tal como se describió anteriormente en
el ejemplo
nº 1.
nº 1.
Se determinó el efecto de varias de estas
formulaciones sobre respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el ejemplo nº 1. Se midieron los títulos de
anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ensayo de
neutralización de virus tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en
la tabla nº 3.2. ensayo de neutralización tal como se describió en
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Los
resultados se exponen en la tabla nº 3.2.
Además, se midieron los títulos de anticuerpos
frente a VFPC mediante ensayo de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISA). Para este fin, se revistieron placas de ELISA
dispensando en cada pocillo 50 \mul de tampón carbonato (pH 9,6)
que contenía 2,5 \mug de VFPC-E2 purificada por
cromatografía de inmunoafinidad por ml e incubación posterior
durante 18 h a 4ºC o 2 h a 37ºC. Se lavaron las placas cinco veces
con Tween 20 al 0,02% y se bloquearon con 200 \mul por pocillo de
leche desnatada al 2% (p/v) (Difco) en solución salina tamponada
con fosfato (PBS; pH 7,2; 0,05 M) e incubación durante 1 h a 37ºC.
Se diluyeron previamente muestras de suero 10 ó 100 veces en PBS
que contenía leche desnatada al 2% (p/v) (PBS/SM) y se diluyeron en
serie 50 \mul de estas diluciones previas dos veces en PBS/LD en
las placas de ELISA. Posteriormente, se incubaron las placas
durante 1 h a 37ºC. Tras cinco ciclos de lavado con Tween 20 al
0,02%, se añadieron a los pocillos 50 \mul de PBS/LD que contenía
antisuero de conejo anti-Ig porcina conjugado con
peroxidasa (Dako) diluido según las instrucciones del proveedor y
se incubaron las placas de nuevo durante 1 h a 37ºC. Se lavaron las
placas 10 veces con Tween 20 al 0,02% y se añadieron a los pocillos
100 \mul de de una disolución de sustrato que contenía sulfonato
de
2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolina
(ABTS) más H_{2}O_{2} (Kirkegaard & Perry Labs, Inc.,
Gaithersburg, MA). Se incubaron las placas durante 1 h a 20ºC y se
midió la absorbancia a 405 nm mediante un aparato Titertek
Multiscan (ICN/Flow, Oxfordshire, Reino Unido). Se expresaron los
títulos de anticuerpos como el coeficiente de regresión de la parte
lineal del gráfico de la concentración sérica frente al valor de
absorbancia (la linealidad era significativa entre valores de
absorbancia de 0,0 y 1,4) que corresponde al factor de dilución de
la muestra de suero que da una densidad óptica de 1 unidad de
absorbancia por encima del fondo en el ELISA. Se exponen los
títulos de anticuerpos 3 y 12 semanas tras la inmunización de
refuerzo en la tabla nº 3.3 y 3.4, respectivamente.
Se determinó el efecto de estas formulaciones
sobre la respuesta inmunitaria mediada por células frente a
VFPC-E2 tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 2. Los resultados se exponen en
la tabla nº 3.5.
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Se determinó el efecto de varias de estas
formulaciones sobre las respuestas de anticuerpos en suero frente a
la cepa H1H1 del virus de la gripe inactivado A/Swine y la cepa H3N2
MRC-11 (designadas a continuación en el presente
documento A/Swine y MRC-11, respectivamente) y virus
de pseudorrabia inactivado (VPR) en cerdos. Se les inyectó a los
animales 4,4 \mug de A/Swine, 4 \mug de MRC-11 y
10^{8,3} DICT_{50} (DICT_{50} es la dosis que provoca un 50%
de infección del cultivo de tejido in vitro) de VPR
inactivado de Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, los Países
Bajos (Hilgers et al. Vaccine 1994) con o sin adyuvante en
las semanas 0 y 3. Tres semanas tras la primera inmunización (semana
3) y tres semanas tras la segunda inmunización (semana 6), se
midieron las respuestas de anticuerpos frente a A/Swine y
MRC-11 mediante ELISA. Para este fin, se
revistieron placas de ELISA con virus de la gripe purificado
mediante gradiente de sacarosa dispensando en cada pocillo, 50
\mul de tampón carbonato (pH 9,6) que contenían 5 \mug de HA por
ml e incubación posterior durante 18 h a 4ºC o 2 h a 37ºC. Se
lavaron las placas cinco veces con Tween 20 al 0,02% y se
bloquearon con 200 \mul por pocillo de leche desnatada al 2% (p/v)
(Difco) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,2; 0,05
M) e incubación durante 1 h a 37ºC. Se diluyeron previamente
muestras de suero 10 ó 100 veces en PBS que contenía leche
desnatada al 2% (p/v) (PBS/LD) y se diluyeron en serie 50 \mul de
estas diluciones previas dos veces en PBS/LD en las placas de ELISA.
Posteriormente, se incubaron las placas durante 1 h a 37ºC. Tras
cinco ciclos de lavado con Tween 20 al 0,02%, se añadieron a los
pocillos 50 \mul de PBS/LD que contenía anticuerpo monoclonal de
ratón anti-IgG total porcina conjugado con
peroxidasa (ID-Lelystad) diluido 1/2000 en PBS/LD y
se incubaron las placas de nuevo durante 1 h a 37ºC. Se lavaron las
placas 10 veces con Tween 20 al 0,02% y se añadieron a los pocillos
100 \mul de una disolución de sustrato que contenía sulfonato de
2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolina
(ABTS) más H_{2}O_{2} (Kirkegaard & Perry Labs, Inc.,
Gaithersburg, MA). Se incubaron las placas durante 60 min. a 20ºC y
se midió la absorbancia a 405 nm mediante un aparato Titertek
Multiscan (ICN/Flow, Oxfordshire, Reino Unido). Se expresaron los
títulos de anticuerpos como el coeficiente de regresión de la parte
lineal del gráfico de la concentración sérica frente al valor de
absorbancia (la linealidad era significativa entre valores de
absorbancia de 0,0 y 1,4) que corresponde al factor de dilución de
la muestra de suero que da una densidad óptica de 1 unidad de
absorbancia por encima del fondo en el ELISA. Los títulos de
anticuerpos 3 semanas tras la primera (sensibilización) y segunda
(refuerzo) inmunización se exponen en la tabla nº 3.6 y nº
3.7,
respectivamente.
respectivamente.
En la semana 6, se midieron las respuestas de
anticuerpos frente a VPRi mediante ensayo de neutralización de
virus tal como se describe por Hilgers et al. (Vaccine 12,
págs. 653-660, 1994). Los resultados se exponen en
la tabla nº 3.8.
Se determinó el efecto de estas formulaciones
sobre la respuesta inmunitaria mediada por células frente a la cepa
H1N1 del virus de la gripe A/Swine y la cepa H3N2
MRC-11 en cerdos tal como se describió anteriormente
en el presente documento en el ejemplo nº 2. Se estimularon las
CMSP con A/Swine y MRC-11 a concentraciones de 0,5
y 1,5 \mug de HA por ml de medio de cultivo celular. Los
resultados se exponen en la tabla nº 3.9 y nº 3.10,
respectivamente.
respectivamente.
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Ejemplo nº
4
Se sintetizaron diversos derivados de sacarosa
tal como se describió en el ejemplo nº 3. Las cantidades de los
materiales de partida usadas se exponen en la tabla nº 4.1.
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Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
\newpage
Se prepararon formulaciones de 10 g de los
diferentes derivados de sacarosa de la tabla nº 4.1 con 10 g de
polisorbato 80 (ICI), 40 g de escualano (Merck) y 190
PBS-timerosal tal como se describió anteriormente en
el ejemplo nº 1.
Ejemplo nº
5
Se sintetizaron diversos derivados de sacarosa
tal como se describió en el ejemplo nº 3 y las cantidades de los
materiales de partida se exponen en la tabla nº 5.1.
Se analizaron los productos obtenidos mediante
TLC tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de los derivados de
sacarosa de 10 g de la tabla nº 5.1 con 10 g de polisorbato 80
(ICI), 40 g de escualano (Merck) y 190 g de
PBS-timerosal tal como se describió anteriormente en
el ejemplo nº
1.
1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Se
prepararon vacunas mezclando simplemente un volumen de formulación
de adyuvante con un volumen de formulación de antígeno. Se midieron
los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ensayo de
neutralización de virus tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en
la tabla nº
5.2.
5.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos 3 y 12
semanas tras la segunda inmunización (tras el refuerzo) mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 5.3 y
nº 5.4.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
5.5.
5.5.
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(Tabla pasa a página
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Se determinó el efecto de estas formulaciones
sobre las respuestas de anticuerpos en suero frente a la cepa H1N1
de virus de la gripe inactivado A/Swine y la cepa H3N2
MRC-11 en cerdos mediante ELISA tal como se
describió anteriormente en el ejemplo nº 3. Los resultados se
exponen en las tablas nº 5.6 y nº 5.7.
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Ejemplo nº
6
Se sintetizaron diversos derivados de disacárido
tal como se describió en el ejemplo nº 4 y las cantidades de los
materiales de partida se exponen en la tabla nº 6.1.
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Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de los diferentes
derivados de sacarosa de la tabla nº 6.1 con polisorbato 80 (ICI),
escualano (Merck) y PBS-timerosal tal como se
describió anteriormente en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el ejemplo nº 1. Se prepararon vacunas mezclando
simplemente un volumen de formulación de adyuvante con un volumen
de formulación de antígeno. Se midieron los títulos de anticuerpos
en suero frente a VFPC mediante ensayo de neutralización de virus
tal como se describió anteriormente en el presente documento en el
ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en la tabla nº 6.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos 3 y 12
semanas tras la segunda inmunización (tras el refuerzo) mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 6.3 y
nº 6.4.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
6.5.
6.5.
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Se determinó el efecto de diversas de estas
formulaciones sobre las respuestas de anticuerpos en suero frente a
la cepa H1N1 de virus de la gripe inactivado A/Swine y la cepa H3N1
MRC-11 en cerdos mediante ELISA tal como se
describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 2.
Los resultados se exponen en la tabla nº 6.5 y nº 6.6.
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Ejemplo nº
7
Se sintetizaron diversos derivados de disacárido
poniendo en contacto éster de sacarosa de ácidos grasos L195
(Mitsubishi-Kagaku Foods Corp., Tokio, Japón) con
SO_{3}.piridina durante aproximadamente 6 horas a 60ºC. Las
cantidades de los materiales de partida se exponen en la tabla nº
7.1.
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Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de 10 g de los
derivados de sacarosa de la tabla nº 7.1, 10 g de polisorbato 80
(ICI), 40 g de escualano (Merck) y 190 g de
PBS-timerosal tal como se describió anteriormente en
el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Se
prepararon vacunas mezclando simplemente un volumen de formulación
de adyuvante con un volumen de formulación de antígeno. Se midieron
los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ensayo de
neutralización de virus tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en
la tabla nº
7.2.
7.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos 3 y 12
semanas tras la segunda inmunización (tras el refuerzo) mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 7.3 y
nº 7.4.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
7.5.
7.5.
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Se determinó el efecto de diversas de estas
formulaciones sobre las respuestas de anticuerpos en suero frente a
la cepa H1N1 de virus de la gripe inactivado A/Swine y la cepa H3N1
MRC-11 en cerdos mediante ELISA tal como se
describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 2.
Los resultados se exponen en la tabla nº 7.6 y nº 7.7.
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Ejemplo nº
8
Se preparó una formulación de 40 g de L195
(Mitshubishi-kagaku Foods Corp., Tokio, Japón), 10 g
de polisorbato 80 (ICI) y 200 g de PBS-timerosal
tal como se describió anteriormente en el ejemplo nº 1.
Se preparó una formulación de 10g de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 5 con 10 g de polisorbato 80 (ICI), 40 g de L195 (Merck)
y 190 g de PBS-timerosal tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Se
prepararon vacunas mezclando simplemente un volumen de formulación
de adyuvante con un volumen de formulación de antígeno. Se midieron
los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ensayo de
neutralización de virus tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en
la tabla nº
8.2.
8.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos 3 y 12
semanas tras la segunda inmunización (tras el refuerzo) mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 8.3 y
nº 8.4.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
8.5.
8.5.
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Ejemplo nº
9
Se sintetizó una
(oleoil)8-sacarosa poniendo en contacto 0,02
moles de sacarosa con 0,15 moles de cloruro de oleoílo (Merck)
durante aproximadamente 6 horas a 60ºC. Se extrajo el derivado de
sacarosa con n-hexano. Se eliminó el
n-hexano mediante evaporación a temperatura
aumentada y presión diminuida tal como se describió anteriormente
en el presente documento en el ejemplo nº 2. Se analizaron los
productos obtenidos mediante CCF tal como se describió en el
ejemplo nº 1.
Se prepararon tres emulsiones diferentes de
éster de octaoleato de sacarosa. Se mezclaron
(oleoil)8-sacarosa, escualano, polisorbato
80 y PBS-timerosal a las cantidades indicadas en la
tabla nº 9.1 y se emulsionaron tal como se describió anteriormente
en el presente documento en el ejemplo nº 1. Además, se preparó una
emulsión de escualano/polisorbato 80 sin octaoleato de sacarosa
mezclando las cantidades de escualano, polisorbato 80 y
PBS-timerosal indicadas en la tabla nº 9.1.
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Se determinó el efecto de las emulsiones de la
tabla nº 9.1 sobre la respuesta de anticuerpos neutralizantes
frente a VFPC-E2 tal como se describió en el ejemplo
nº 1. Se incluyó SL-CD/escualano en agua (Fort Dodge
Animal Health Holland, los Países Bajos) como referencia. Los
resultados se exponen en la tabla nº 9.2.
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Ejemplo nº
10
Se mezcló una vacuna de virus de la
gripe/pseudorrabia disponible comercialmente (Suvaxyn O/W de Fort
Dodge Animal Health Holland, Weesp, los Países Bajos) que contenía
las cepas del virus de la gripe inactivado MRC-11 y
A/Swine a 4,0 y 4,4 \mug de HA por dosis y virus de la
pseudorrabia inactivado a 10^{8,3} DICT_{50} por dosis con la
formulación de adyuvante de
(sulfato)-(dodecanoil)7-sacarosa/escualano/polisorbato
80 del ejemplo nº 1 a proporciones volumétricas de 100/0, 33/66,
20/80 y 10/90. Se inmunizaron grupos de cerdos dos veces y se
midieron las respuestas de anticuerpos frente al virus de la
pseudorrabia mediante el ensayo de anticuerpos neutralizantes
frente a virus tal como Hilgers et al. (Vaccine 12, págs.
653-660, 1994). Los resultados se exponen en la
tabla nº 10.1. Se midieron las respuestas de anticuerpos frente a
las cepas del virus de la gripe A/Swine y MRC-11
mediante ELISA tal como se describió en el ejemplo nº 3. Los
resultados se exponen en la tabla nº 10.2 y nº 10.3,
respectivamente.
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Ejemplo nº
11
Se sintetizó un derivado de sacarosa tal como se
describió en el ejemplo nº 1. Las cantidades de los materiales de
partida usadas se exponen en la tabla nº 11.1.
Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de los derivados de
sacarosa de la tabla nº 10.1 con polisorbato 80 (ICI), escualano
(Merck) y PBS-timerosal tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Se
prepararon vacunas mezclando simplemente un volumen de formulación
de adyuvante con un volumen de formulación de antígeno. Se midieron
los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ensayo de
neutralización de virus tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se exponen en
la tabla nº 11.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº
11.3.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº 11.4
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Ejemplo nº
12
Se sintetizaron varios derivados de sacarosa tal
como se describió en el ejemplo nº 1. Se puso en contacto la
sacarosa con cloruro de dodecanoílo (cloruro de dodecanoílo; Merck),
cloruro de decanoílo (Merck), cloruro de octanoílo (Merck) o
cloruro de hexanoílo (Merck) y con SO_{3}.piridina. Las cantidades
de los materiales de partida usadas se exponen en la tabla nº
12.1
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Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de los derivados de
sacarosa de la tabla nº 12.1 con polisorbato 80 (ICI), escualano
(Merck) y PBS-timerosal tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de estas formulaciones
sobre las respuestas inmunitarias frente a VFPC-E2
en cerdos tal como se describió anteriormente en el presente
documento en el ejemplo nº 1. Los resultados se expresan en la
tabla nº 12.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se expresan en la tabla nº
12.3.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se expresan en la tabla nº 12.4.
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Ejemplo nº
13
Se prepararon formulaciones de éster de sacarosa
L195 (Mitsubishi-Kagaku Foods Corp., Tokio, Japón),
polisorbato 80 (Merck), escualano (Merck),
(oleoil)8-sacarosa del ejemplo nº 9, bromuro
de dimetildioctadecilamonio (DDA; Eastman Kodak Company, Rochester,
NY), Carbopol 934 PH (BFGoodrich, Cleveland OH) tal como se
describió en el ejemplo nº. Las cantidades de los materiales de
partida usadas se exponen en la tabla nº 13.1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Los
resultados se expresan en la tabla nº 13.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se expresan en la tabla nº
13.3.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se expresan en la tabla nº 13.4.
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Ejemplo nº
14
Se sintetizó un derivado de manosa tal como se
describió en el ejemplo nº 1. Las cantidades de los materiales de
partida usadas se exponen en la tabla nº 14.1.
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Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se preparó una formulación del derivado de
manosa de 10 g de la tabla nº 14.1 con 10 g de polisorbato 80 (ICI),
40 g de escualano (Merck) y 190 g de PBS-timerosal
tal como se describió anteriormente en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. Los
resultados se expresan en la tabla nº 14.2.
Se midieron los títulos de anticuerpos mediante
ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento
en el ejemplo nº 3. Los resultados se expresan en la tabla nº
14.3.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se expresan en la tabla nº 14.4.
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Ejemplo nº
16
Se preparó una formulación de 1,3 g de éster de
sacarosa L195 (Mitsubishi-Kagaku Foods Corp., Tokio,
Japón), 1,3 g de polisorbato 80 (Merck), 10,8 g de escualeno
(Merck) y 237,7 g de PBS-timerosal tal como se
describió en el ejemplo nº 1. Se preparó una formulación de 1,3 g
de (sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa
del ejemplo nº 12, 1,3 g de polisorbato 80 (Merck), 10,8 g de
escualeno (Merck) y 238,1 g de PBS-timerosal tal
como se describió en el ejemplo nº 1.
Se determinó el efecto de varias de estas
formulaciones sobre la respuesta de anticuerpos de ELISA en suero
frente a cepas del virus de la gripe inactivado humano A/Panamá,
A/Nueva Caledonia y B/Yamanashi en cerdos. Para este fin, se mezcló
una dosis (0,5 ml) de vacuna INFLUWAC^{TM} del virus de la gripe
disponible comercialmente de Solvay Pharmaceuticals (Weesp, los
Países Bajos) con 1 ml de cualquier formulación de adyuvante y se
inmunizaron grupos de cinco cerdos. Tres semanas tras la primera
inmunización, se midieron las respuestas de anticuerpos mediante
ELISA tal como se describió en el ejemplo nº 3. Se determinó la
inducción de memoria inmunológica midiendo la respuesta de
anticuerpos tras una segunda inmunización con INFLUVAC^{TM} de
Solvay Pharmaceuticals sin adyuvante. Los resultados de los títulos
de anticuerpos frente a A/Panamá, A/Nueva Caledonia y B/Yamanashi
tras la primera inmunización se exponen en la tabla nº 16.1, nº 16.2
y 16.3, respectivamente. Los resultados de los títulos de
anticuerpos frente a A/Panamá, A/Nueva Caledonia y B/Yamanashi una
semana tras la segunda inmunización sin adyuvante se exponen en la
tabla nº 16.4, nº 16.5 y nº 16.6, respectivamente. Los resultados
de los títulos de anticuerpos frente a A/Panamá, A/Nueva Caledonia y
B/Yamanashi tres semanas tras la segunda inmunización sin adyuvante
se exponen en la tabla nº 16.7, nº 16.8 y nº 16.9,
respectivamente.
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Ejemplo nº
17
Se sintetizó un éster de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa
poniendo en contacto 205,2 g de sacarosa con 918 g de cloruro de
dodecanoílo y 98 g de SO_{3}-piridina tal como se
describió en el ejemplo nº 1. Se extrajo el éster de sacarosa con
n-hexano tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 2.
Se sintetizó un éster de
(sulfato)4-(dodecanoil)4-sacarosa
poniendo en contacto 23,9 g de sacarosa con 67,5 g de cloruro de
dodecanoílo y 45,6 g de SO_{3}.piridina tal como se describió en
el ejemplo nº 1.
Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de adyuvante de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa con
escualano (Merck), escualeno (Merck), hexadecano (Acros, Geel,
Bélgica), trioleína (Sigma, St. Louis, MI), Markol 52 (Esso),
bromuro de perfluorooctilo (Acros) o aceite de silicio (Acros) como
aceite, Polisorbato 80 (Merck), Polisorbato 20 (Baker), L1695
(Mitsubishi-Kagaku), Triton X-100
(Sigma), Saponina (Fluka, Zwijndrecht, los Países Bajos) o
(sulfato)4-(dodecanoil)4-sacarosa
como emulsivos y PBS-timerosal o WFI (agua para
inyecciones de ID-Lelystad, Lelystad, los Países
Bajos) como fase acuosa a las cantidades indicadas a continuación
en el presente documento en la tabla nº
17.1.
17.1.
Estas formulaciones se emulsionaron tal como se
describió anteriormente en el ejemplo nº 1.
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siguiente)
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Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. El grupo
1 y 2 consistieron en 5 cerdos por grupo y los grupos 3 a 10
consistieron en 4 cerdos por grupo. Se prepararon vacunas mezclando
simplemente un volumen de formulación de adyuvante con un volumen de
formulación de antígeno. Se midieron los títulos de anticuerpos
frente a VFPC mediante ELISA tal como se describió anteriormente en
el presente documento en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen
en la tabla nº 17.2.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
17.3.
17.3.
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Ejemplo nº
18
Se sintetizó un éster de
(sulfato)1-(decanoil)7-sacarosa
poniendo en contacto 23,9 g de sacarosa con 94 g de cloruro de
decanoílo y 11,1 g de SO_{3}.piridina tal como se describió en el
ejemplo nº 1. Se extrajo el éster de sacarosa con
n-hexano tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 2.
\newpage
Se sintetizó un éster de
(sulfato)4-(decanoil)4-sacarosa
poniendo en contacto 24 g de sacarosa con 54,4 g de cloruro de
decanoílo y 45 g de SO_{3}.piridina tal como se describió en el
ejemplo nº 1. Se analizaron los productos obtenidos mediante CCF
tal como se describió en el ejemplo nº 1 y los resultados se exponen
en la figura nº 18.
Se prepararon varias formulaciones de adyuvante
de estos ésteres de sacarosa con escualano o escualeno como aceite,
Polisorbato 80, L1695 (Mitsubishi-Kagaku) o
(sulfato)4-(decanoil)4-sacarosa como
emulsivos y/o estabilizadores y PBS-timerosal a las
cantidades indicadas en la tabla nº 18.1. Estas formulaciones se
emulsionaron tal como se describió anteriormente en el ejemplo nº
1.
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Se determinó el efecto de (varias de) estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se describió
anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 1. El grupo
1 consistió en 5 cerdos por grupo y los grupos 2 y 3 consistieron
en 4 cerdos por grupo. Se prepararon vacunas mezclando simplemente
un volumen de formulación de adyuvante con un volumen de formulación
de antígeno. Se midieron los títulos de anticuerpos en suero frente
a VFPC mediante ELISA tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en
la tabla nº 18.2.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
18.3.
18.3.
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Ejemplo nº
19
Se prepararon formulaciones de L195
(Mitsubishi), escualeno (Merck), L1695 (Mitsubishi) y
PBS-timerosal o WFI a las cantidades indicadas en
la tabla nº 19.1. Se emulsionaron las formulaciones tal como se
describió anteriormente en el ejemplo nº 1.
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Se determinó el efecto de dos de estas
formulaciones sobre las respuestas inmunitarias frente a
VFPC-E2 en cerdos tal como se determinó
anteriormente en el presente documento en el ejemplo 1. El grupo 1
consistió en 5 cerdos por grupo y los grupos 2 y 3 consistieron en
4 cerdos por grupo. Se prepararon vacunas mezclando simplemente un
volumen de formulación de adyuvante con un volumen de formulación de
antígeno. Se midieron los títulos de anticuerpos en suero frente a
VFPC mediante ELISA tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en
la tabla nº 19.2.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
19.3.
19.3.
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Ejemplo nº
20
Se sintetizó un éster de
(decanoil)7-sacarosa tal como se describió en
el ejemplo nº 1. Se pusieron en contacto 23,9 g de sacarosa
finamente pulverizada (Merck) con 94 g de cloruro de decanoílo
(Merck). Se extrajo el éster de sacarosa con
n-hexano tal como se describió anteriormente en el
presente documento en el ejemplo nº 2.
Se analizaron los productos obtenidos mediante
CCF tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Se prepararon formulaciones de éster de
(decanoil)7-sacarosa, escualeno, polisorbato
80 y PBS-timerosal a las cantidades indicadas en la
tabla nº 20.1 y se emulsionaron tal como se describió anteriormente
en el ejemplo nº 1.
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Se determinó el efecto de estas formulaciones
sobre las respuestas inmunitarias frente a VFPC-E2
en cerdos tal como se determinó anteriormente en el presente
documento en el ejemplo 1. El grupo 1 consistió en 5 cerdos por
grupo y el grupo 2 consistió en 4 cerdos por grupo. Se midieron los
títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ELISA tal
como se describió anteriormente en el presente documento en el
ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 20.2.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
20.3.
20.3.
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Ejemplo nº
21
Se estudió el efecto del intervalo de tiempo
entre la primera y segunda inmunización sobre la respuesta
inmunitaria. Se inmunizaron grupos de cerdos dos veces con
VFPC-E2 más
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa/escualeno/polisor-
bato 80 [40/160/40] del ejemplo nº 17 separadas tres (semana 0 y 3) y dos (semana 1 y 3) semanas. Se midieron los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 21.1.
bato 80 [40/160/40] del ejemplo nº 17 separadas tres (semana 0 y 3) y dos (semana 1 y 3) semanas. Se midieron los títulos de anticuerpos en suero frente a VFPC mediante ELISA tal como se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº 3. Los resultados se exponen en la tabla nº 21.1.
Se midió la respuesta mediada por células frente
a VFPC mediante el ensayo de proliferación de linfocitos tal como
se describió anteriormente en el presente documento en el ejemplo nº
2. Los resultados se exponen en la tabla nº
21.2.
21.2.
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Ejemplo nº
22
Se mezcló la formulación de adyuvante
L195/escualano/polisorbato 80 [40/160/40] preparada tal como se
describe en el ejemplo nº 13 con un volumen similar de disolución
de antígeno que contenía 3 \mug de la cepa del virus de la
enfermedad de pie y boca O/Taiwan por ml. Se inmunizaron grupos de 3
cerdos dos veces con 2 ml de vacuna. Se midió la respuesta de
anticuerpos neutralizantes anti-virus O/Taiwan a
diferentes intervalos de tiempo mediante la prueba de anticuerpos
neutralizantes frente a virus tal como se describe van Maanen y
Terpstra (J. Immunol. Meth. 124, págs. 111-119,
1989).
Los resultados se exponen en la tabla nº
22.1
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Ejemplo nº
23
Se emulsionó una formulación de adyuvante de 160
g de L195, 640 g de escualano, 160 g de polisorbato 80 y 40 g de
agua para inyecciones (L195/escualano/polisorbato 80 [160/640/160])
tal como se describió en el ejemplo nº 1. Se mezcló un volumen de
esta formulación de adyuvante con un volumen de una disolución que
contenía 3 \mug de la cepa del virus de la enfermedad de pie y
boca O/Taiwan por ml. Se inmunizaron grupos de 5 cerdos una vez con
2 ml de vacuna y se midió la respuesta de anticuerpos a diferentes
intervalos de tiempo tal como se describió en el ejemplo nº 22. Los
resultados se exponen en la tabla nº 23.1.
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Ejemplo nº
24
Se mezcló el adyuvante de fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa/escualano/polisorbato
80 [40/160/40] del ejemplo nº 2 con un péptido de la hormona
liberadora de gonadotropina conjugado con ovoalbúmina (conjugado
G6k-GnRH-tándem-dímero-OVA)
preparado tal como se describió por Oonk et al. (Vaccine 16,
págs. 1074-1082, 1998). Se inmunizaron diez cerdos
(grupo 1) dos veces con 187 \mug de conjugado
G6k-GnRH-tándem-dímero-OVA
más fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa/escualano/polisorbato
80 [40/160/40] y cinco cerdos (grupo 2; controles) con fracción III
de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa/escualano/polisorbato
80 [40/160/40] sin antígeno. A diferentes intervalos de tiempo tras
la primera inmunización en la semana 10 y la segunda inmunización
en la semana 17, se midieron los títulos de anticuerpos frente a
GnRH en muestras de suero diluidas 1/2000 mediante RIA tal como se
describió por Meloen et al. (Vaccine 12, págs.
741-746, 1994) con GnRH yodada adquirida de
Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Inglaterra). Los
resultados se exponen en la tabla nº 22.4. Se determinó el peso de
los testículos en la semana 24 tal como se describió por Meloen
et al. (Vaccine 12, págs. 741-746, 1994). Los
resultados se exponen en la tabla nº 24.2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo nº
25
Se prepararon formulaciones de adyuvante
mezclando
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 17, escualano, polisorbato 80 y
PBS-timerosal a las cantidades expuestas en la tabla
25.1 Estas mezclas se emulsionaron tal como se describió en el
ejemplo nº 1.
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Ejemplo nº
26
Se prepararon formulaciones de adyuvante
mezclando 10 g de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 17, 10 g de polisorbato 80 (Baker) y 230 ml de
suspensión de hidróxido de aluminio al 3% p/v (Alhydrogel de
Superfos Biosector a/s, Vedbaeck, Dinamarca).
Figura 1a: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)7-sacarosa del ejemplo nº 1;
Carril 3:
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 1;
Carril 4: (dodecanoil)-sacarosa
del ejemplo nº 1;
Carril 5:
(sulfato)1-(dodecanoil)5-sacarosa del
ejemplo nº 1;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 1b: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 1.
Carril 1 fracción III de (izquierda):
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)3-sacarosa del ejemplo nº 1;
Carril 3:
(sulfato)1-(dodecanoil)3-sacarosa del
ejemplo nº 1;
Carril 4:
(dodecanoil)l-sacarosa del ejemplo nº 1;
Carril 5:
(sulfato)1-(dodecanoil)1-sacarosa del
ejemplo nº 1;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 2a: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 3.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)7-sacarosa del ejemplo nº 3;
Carril 3:
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 3;
Carril 4:
(tetradecanoil)7-sacarosa del ejemplo nº
3;
Carril 5:
(sulfato)1-(tetradecanoil)7-sacarosa
del ejemplo nº 3;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 2b: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 3.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(hexadecanoil)7-sacarosa del ejemplo nº
3;
Carril 3:
(sulfato)1-(hexadecanoil)7-sacarosa
del ejemplo nº 3;
Carril 4:
(octadecanoil)7-sacarosa del ejemplo nº
3;
Carril 5:
(sulfato)1-(octadecanoil)7-sacarosa
del ejemplo nº 3;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 3a: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 4.
Carril 1 (izquierda):
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa
fracción III del ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)8-sacarosa del ejemplo nº 4;
Carril 3:
(sulfato)0.5-(dodecanoil)7-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 4:
(sulfato)1.0-(dodecanoil)6-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 5:
(sulfato)1.5-(dodecanoil)5-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 3b: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 4.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(sulfato)2,0-(dodecanoil)4-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 3:
(sulfato)2.5-(dodecanoil)3-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 4:
(sulfato)3.0-(dodecanoil)2-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 5:
(sulfato)3.5-(dodecanoil)1-sacarosa
del ejemplo nº 4;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 4a: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 5.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)8-sacarosa del ejemplo nº 5;
Carril 3:
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 4:
(sulfato)2-(dodecanoil)6-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 5:
(sulfato)3-(dodecanoil)5-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 4b: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 5.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(sulfato)4-(dodecanoil)4-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 3:
(sulfato)5-(dodecanoil)3-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 4:
(sulfato)6-(dodecanoil)2-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 5:
(sulfato)7-(dodecanoil)1-sacarosa del
ejemplo nº 5;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
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Figura 5: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 6.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2:
(dodecanoil)7-maltosa del ejemplo nº 6;
Carril 3:
(sulfato)1-(dodecanoil)7-maltosa del
ejemplo nº 6;
Carril 4:
(dodecanoil)7-lactosa del ejemplo nº 6;
Carril 5:
(sulfato)1-(dodecanoil)7-lactosa del
ejemplo nº 6;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: Cromatografía en capa fina de
derivados preparados tal como se describió en el ejemplo nº 7.
Carril 1 (izquierda): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2;
Carril 2: L195 del ejemplo nº 7;
Carril 3: (sulfato)1-L195
del ejemplo nº 7;
Carril 4: (sulfato)2-L195
del ejemplo nº 7;
Carril 5:
(sulfato)2.3-L195 del ejemplo nº 7;
Carril 6 (derecha): fracción III de
(sulfato)1-(dodecanoil)7-sacarosa del
ejemplo nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7: Estructura química del derivado de
sacarosa de la presente invención en la que R1, R2, R3, R4, R'1,
R'2, R'3 y R'4 son H o
-O-S(=O)(=O)-OR (en el que R es H,
Na, K o NH_{4}) o
-O-C(=O)-(CH_{2})_{n}-CH_{3}
(en el que n está entre 6 y 24).
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 8-12: Representaciones
macroscópicas de las reacciones locales en cinco animales
individuales, 3 (a) y 6 (b) semanas tras la inyección intramuscular
de vacunas contra VFPC-E2 que contenían el adyuvante
de la presente invención, especialmente emulsión de
(sulfato)1(dodecanoil)7-sacarosa/escualano/polisorbato
80 (grupo 5 del ejemplo nº 2). Se observan fibrosis y edema
ligeros.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 13-17: Representaciones
macroscópicas de las reacciones locales en cinco animales
individuales, 3 (a) y 6 (b) semanas tras la inyección intramuscular
de vacunas contra VFPC-E2 que contenían adyuvante de
agua en aceite mineral en agua (grupo 10 del ejemplo nº 2). Se
observan granuloma, abscesos y necrosis.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (22)
1. Una formulación de adyuvante que comprende
una solución salina fisiológica, o una emulsión de aceite en agua,
o una fase sólida inmiscible en agua y opcionalmente una fase
acuosa, y que comprende como adyuvante uno o más derivados de mono-
o disacárido que tienen al menos uno pero no más de
N-1 grupos ésteres de ácidos grasos, en la que N es
el número de grupos hidroxilo del mono- o disacárido del que se
deriva.
2. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 1, en la que dicho derivado de mono- o disacárido
comprende además al menos uno pero no más de N-1
grupos aniónicos, en la que el número combinado de grupos ésteres de
ácidos grasos y aniónicos no excede de N.
3. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 2, en la que dicho derivado de mono- o disacárido
tiene al menos 2, preferiblemente al menos 3, pero no más de
N-1 grupos éster de ácidos grasos y al menos 1 pero
no más de N-2, preferiblemente no más de
N-3 grupos aniónicos.
4. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 3, en la que dicho derivado de mono- o disacárido
tiene al menos 4, pero no más de N-1 grupos éster de
ácidos grasos y al menos 1 pero no más de N-3,
preferiblemente no más de N-4 grupos aniónicos.
5. Formulación de adyuvante según una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho derivado de
monosacárido comprende al menos un grupo aniónico y al menos dos
ésteres de ácidos grasos, en la que la suma total de grupos
aniónicos y ésteres de ácidos grasos está en el intervalo de
3-5.
6. Formulación de adyuvante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho derivado de
disacárido comprende al menos un grupo aniónico, preferiblemente
uno o cuatro grupos aniónicos, y al menos un éster de ácidos grasos,
en la que la suma total de grupos aniónicos y ésteres de ácidos
grasos está en el intervalo de 6-9, preferiblemente
7 u 8.
7. Formulación de adyuvante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho derivado de
monosacárido se deriva de una pentosa con la fórmula general
C_{5}H_{10}O_{5} o una hexosa con la fórmula general
C_{6}H_{12}
O_{6}.
O_{6}.
8. Formulación de adyuvante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1-5 ó 7, en la que dicho
derivado de monosacárido se deriva de un monosacárido siendo N 3 ó
4.
9. Formulación de adyuvante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1-4 ó 6, en la que dicho
derivado de disacárido se deriva de un disacárido con la fórmula
general C_{12}H_{22}O_{10}.
10. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
derivado de mono- o disacárido se deriva de alolosa, altriosa,
fructosa, galactosa, glucosa, gulosa, inositol, manosa, sorbosa,
sacarosa, maltosa, lactosa, lactulosa, arabinosa, xilosa, ribosa,
celobiosa, gentiobiosa, sacarosa, turanosa, melibiosa.
11. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en la que
al menos un grupo aniónico es un éster de sulfato que tiene la
fórmula general -SO_{2}-OR, o un éster de fosfato
que tiene la fórmula general -PO_{2}-(OR)_{2}, en las que
R es un catión monovalente.
12. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 11, en la que cualquier R se selecciona
independientemente del grupo constituido por H^{+}, K^{+},
Na^{+}, Li^{+} y NH_{4}^{+}.
13. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada uno de
los grupos éster de ácidos grasos está representado por una fórmula
general de
-O-C(=O)-(CH_{2})_{x}-CH_{3},
en la que x es al menos 4, por
-OC(=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH_{3},
en la que x+y es al menos 4 y preferiblemente no más de 24 o
-O-(C=O)-(CH_{2})_{x}-CH=CH-(CH_{2})_{y}-CH=CH-(CH_{2})_{z}-CH_{3},
en la que x+y+z está entre 2 y 20.
14. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 13, en la que cada uno de los grupos éster de ácidos
grasos está representado por una fórmula general de
-OC(=O)-(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en la que
x está entre 6 y 14.
15. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 1, en la que dicho derivado de disacárido es el éster
de sacarosa del ácido láurico L195.
16. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una
emulsión de aceite en agua, en la que dicha emulsión de aceite en
agua comprende una fase líquida inmiscible en agua que es escualano,
un aceite mineral, un aceite vegetal, hexadecano, un fluorocarbono
o un aceite de silicio.
17. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además
un emulsivo o estabilizador.
18. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 17, en la que el emulsivo o estabilizador es un
detergente no iónico con un valor del equilibrio
hidrófilo-lipófilo superior a 10, un éster de azúcar
de ácidos grasos o un detergente aniónico con un valor del
equilibrio hidrófilo-lipófilo superior a 10.
19. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 17 ó 18, en la que el emulsivo o estabilizador es un
derivado de mono- o disacárido, según lo definido en una cualquiera
de las reivindicaciones 1-15.
20. Formulación de adyuvante según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha fase
sólida inmiscible en agua es una sal insoluble.
21. Formulación de adyuvante según la
reivindicación 20, en la que la sal insoluble es una sal de aluminio
o calcio, preferiblemente un hidróxido de aluminio, fosfato de
aluminio, fosfato de calcio, sílice o una mezcla de los mismos.
22. Una vacuna que comprende una formulación de
adyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-21, comprendiendo además dicha vacuna un
componente antigénico.
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