CN1433423A - 单糖和二糖衍生物 - Google Patents

单糖和二糖衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN1433423A
CN1433423A CN00818691A CN00818691A CN1433423A CN 1433423 A CN1433423 A CN 1433423A CN 00818691 A CN00818691 A CN 00818691A CN 00818691 A CN00818691 A CN 00818691A CN 1433423 A CN1433423 A CN 1433423A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sucrose
monose
csfv
squalane
adjuvant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00818691A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100345592C (zh
Inventor
卢卡斯·阿方修斯·特奥多鲁斯·希尔格斯
安内科·乔治亚娜·布洛姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protherics Medicines Development Ltd
Original Assignee
CoVaccine BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8240940&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1433423(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by CoVaccine BV filed Critical CoVaccine BV
Publication of CN1433423A publication Critical patent/CN1433423A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100345592C publication Critical patent/CN100345592C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C07H13/06—Fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及新的单糖衍生物和二糖衍生物的家族并涉及其制备方法。本发明所述的单糖和二糖衍生物包括至少一种脂肪酸酯，并可进一步包括一种或多种阴离子基团，而且其可用于医学、药学、化妆品和食品应用中。

Description

单糖和二糖衍生物
本发明涉及新的单糖衍生物和二糖衍生物的家族并涉及其制备方法。本发明进一步涉及所说的衍生物在医学、药学、化妆品和食品应用中的使用。
糖脂肪酸酯以其乳化能力而广为所知。它们可以以小的油浸水或水浸油型的连续相对大的分散相进行乳化。另外，糖脂肪酸酯以其广泛的HLB值(亲水—亲脂平衡，蔗糖脂的HLB值可在＜1到16之间变化)为人所熟知。糖脂肪酸酯的HLB值依每个糖分子的脂肪酯数和该脂肪酸酯碳链的长度而定。
糖脂肪酸酯进一步以几种其它的应用所熟知，例如它们增强或抑制脂肪和油结晶的能力、它们的抗菌效果、它们的浸润和分散效果、它们在蛋白热变性和冷变性抑制作用中可能的用途及它们非特异性宿主防御的增强效果。
Nigam等人(大英癌症杂志，1982，46，782-793页)公开了各种阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖脂肪酸酯胞内和胞外的免疫刺激效果。抗体应答的增长指数在1到＜10之间变化。
Nigam等人(癌症研究，1978，38，3315-3312页)公开了二糖脂肪酸酯，尤其是麦芽糖四棕榈酸酯，的免疫强化活性。
Nishikawa等人(化学药品公告，1981，29，505-513页)公开了蔗糖脂肪酸酯的抗肿瘤活性。
Azuma(EP 1,572,368)公开了糖脂肪酸酯在疫苗效应力(此处称作“佐剂活性”或“辅佐性”)方面的增强效果。
与水包油型乳液结合在一起的二糖脂肪酸酯以其对疫苗效应力的刺激效果而为人熟知。
Nigam等人(大英癌症杂志，1982，46，782-793页)也公开了一种蔗糖脂肪酸酯和角鲨烯的水包油型乳液的组合物及其它们作为佐剂的用途。然而，已经证明，蔗糖octaoleate酯对疫苗效应力的刺激效果，如果有的话也是非常微弱的(参见下面的实施例)。即使蔗糖octaoleate酯与角鲨烯的水包油型乳液的组合物也只对疫苗效应力有微弱的的增强效果，这使其并不适合作为疫苗佐剂来使用(参见下面的实施例)。
蔗糖硫酸酯也为人所熟知。美国专利3,432,489公开了一种合成各种二糖多聚硫酸酯和其铝复合物的方法，及其相关的治疗仪器。该专利更具体地描述了蔗糖与多种硫酸化试剂(包括在各种试剂(包括吡啶)中的氯磺酸或SO3-吡啶)的反应。另外，美国专利3,432,489公开了蔗糖硫酸酯，尤其是蔗糖octaoleate酯与铝盐的复合物(也被称作sucralfate)，的药学及医学用途。Sucralfate在治疗胃肠道失调方面的应用也为人所熟知。
W/O 90/02133公开了一种制备蔗糖硫酸酯及其铝复合物的方法以及其医学用途的配方。
Bazin等人(碳水化合物研究，1998，309，189-205页)公开了通过酰基蔗糖的磺酸化作用区域选择合成基于蔗糖的表面活性剂的方法。其公开的衍生物每个蔗糖分子包含一个酰基基团和一个磺酸基团。其公开的方法为对蔗糖分子衍生某些羟基的区域选择方法。该方法使用二丁基甲锡亚烷基复合物来封闭某些羟基。该方法的一个缺点是其过于复杂。
Hilgers等人(免疫学，1986，60，141-146页)公开了含脂肪酸酯和硫酸酯的多糖(也称作磺化脂-多糖)，及其它们在疫苗中作为佐剂的用途。另外，Hilgers等人(免疫学，1986，60，141-146页；WO 96/20222)公开了一种通过将多糖与酰氯(acoylchloride)相接触然后再与磺化剂相接触制备磺化脂-多糖的方法。
Mashihi和Hilgers(EP-A-0-295,749)公开了一种磺化脂-多糖和水包油乳液的组合物，尤其是亲水性磺化脂-多糖与水包角鲨烷(squalane)乳液的组合物。Mashihi和Hilgers(EP-A-0-295,749)也公开了磺化脂-多糖(尤其是亲水性磺化脂-多糖)与水包油乳液(尤其是水包角鲨烷乳液)的组合物在非特异性宿主防疫机制上增强效果。
Hilgers等人(疫苗，1994，12，653-660页；疫苗，1994，12，661-665页；WO 96/20008；疫苗，1999，17，219-228页)公开了磺化脂-多糖(尤其是亲水性磺化脂-多糖)与水包油乳液(尤其是水包角鲨烷乳液、水包矿物油乳液、水包大豆油乳液和水包十六烷)的组合物。也公开了制备磺化脂-多糖(尤其是亲水性磺化脂-多糖)与水包油乳液(尤其是水包角鲨烷乳液、水包矿物油乳液、水包大豆油乳液和水包十六烷)组合物稳定制剂的方法。
制备在WO 96/20008中公开的磺化脂-多糖的方法包括两步；(1)首先，将该多糖与酰氯相接触，然后(2)将油脂的多糖衍生物与磺化剂相接触。两步都被认为是随机的化学加成反应，就是说多糖分子上每个羟基被酯化的可能性是相等的，并且在处理过程中不会改变。该制备磺化脂-多糖的方法产生了不同磺化脂-多糖衍生物的配方，其变化在于每多糖分子中脂肪酸酯的数目、每多糖分子中硫酸酯的数目、每多糖分子中羟基的数目和脂肪酸酯、硫酸酯和羟基在多糖分子中的分配。通过起始材料中不同多糖分子的数目和每个多糖分子的羟基数目可以确定在制备中获得的化学上有不同的磺化脂-多糖衍生物的数目。
为对在磺化脂-多糖制备物中存在许多化学上不同的磺化脂-多糖衍生物进行例证，特将Hilgers等人(WO 96/20008)公开的实施例叙述如下。
本领域中已知的、化学限定最清楚的磺化脂-多糖衍生制备物为由β-环糊精获得的磺化脂-多糖制备物(也称作磺化脂-环糊精)。该磺化脂-环糊精制备物由每个多糖分子有7个葡萄糖分子的多糖获得。该磺化脂-环糊精制备物来自最低分子量的多糖，并且具有所公开的最少的羟基数。β-环糊精的分子量为1153 Da并且每个分子有21个羟基。这些羟基可以通过脂肪酸酯或硫酸酯而进行化学加成，或者可保持不变。存在于磺化脂-环糊精制备物中的衍生物在每个β-环糊精分子的脂肪酸酯数目、每个β-环糊精分子的硫酸酯数目、每个β-环糊精分子的羟基数目和这些脂肪酸酯、硫酸酯和羟基在β-环糊精分子上的分配上各有不同。按照本领域已知的方法(疫苗，1999，17，219-22页；WO 96/20222)制备的磺化脂-环糊精制备物中的化学上不同的衍生物的数目是非常高的。如果不将脂肪酸酯、硫酸酯和羟基在β-环糊精分子上的分配计算在内的话，在磺化脂-环糊精制备物中化学上不同的衍生物的数目可以有几百个(例如210个)。另外，如果将脂肪酸酯、硫酸酯和羟基在β-环糊精分子上的分配计算在内的话，在磺化脂-环糊精制备物中化学上不同的衍生物的数目为33+{(33)7-33}/7＝1,494,336,195。
如Hilgers等人(WO 96/20008)所公开的，存在于磺化脂-环糊精制备物中的该化学上不同的衍生物的浓度可通过改变起始材料，即β-环糊精、酰氯和磺化剂的摩尔比例或者重量比例来进行调整。存在于磺化脂-环糊精制备物中的该化学上不同的衍生物的浓度可进行数学上的估计。如果在磺化脂-环糊精制备物中涉及的这两种化学反应是完全随机的，那么存在于磺化脂-环糊精制备物中的某一衍生物的最高浓度大部分时候都会少于5％。由每分子多糖的羟基数比β-环糊精还多的多糖获得的磺化脂-多糖制备物会含有更多数量的化学上不同的衍生物并且相应来说每种衍生物的浓度更低。
因此，可以得出结论，如Hilgers等人(WO 96/20002；WO96/20008)公开的那样获得的磺化脂-多糖制备物含有许多化学上不同的衍生物，其在一定环境下可能是不利的。而且，特定衍生物的量很低这一事实可能是不利的。
该磺化脂-多糖的缺点是它们有着各种不同的物理、化学和物理化学性质(如溶解度、表面活性)，在它们适于进行某种使用时(例如去垢剂或乳化剂)，它们却不适合与其它分子一起使用和/或不适于其它用途。为此，需要将“不适合的”磺化脂-多糖衍生物与“适合的”的磺化脂-多糖衍生物分开。这样的分离过程可以通过本领域中熟知的经典的分离技术进行。然而，如所提及的那样，磺化脂-多糖制备物中“适合的”衍生物的浓度相对较低。而且，“不适合的”磺化脂-多糖衍生物的化学和物理性质与“适合的”的磺化脂-多糖衍生物的化学和物理性质可能会非常相似。因此，该分离方法可能会很复杂、昂贵而又费时。
Hilgers等人(WO 96/20002；WO 96/20008)公开的磺化脂-多糖制备物的另一个缺点是其使用了相对来说大量的有机溶剂，而这些溶剂需要从最终的磺化脂-多糖制备物中除去。这通常也是困难的并/或涉及一些困难、昂贵甚至是危险(尤其对于工业规模来说)方法的使用。
因此，对可以满足各种目的的广泛使用、具有物理化学和/或生物学和/或生物医药性质的糖衍生物仍有明显的需求。而且对容易、安全又便宜的工业规模上制备这样的糖衍生物的方法也有需求。
本发明的目的就是提供可以与各种不溶于水的分子形成稳定制剂的糖衍生物。目的糖衍生物应具有高的优势物理和/或物理化学和/或生物学和/或药学性质，从而使它们适和在各种应用(例如医学应用，如在疫苗和/或疫苗佐剂的制备中)中使用。本发明的另一个目的是提供一种简单的、容易的并且便宜的制备这样的糖衍生物的方法。
本发明提供了具有高优势化学、物理和物理化学性质的糖衍生物。这些衍生物是对单糖和二糖分子进行各种化学(和/或酶学)修饰所得到的。
本发明涉及糖衍生物，其中单糖分子的至少一个游离羟基(单糖分子上有3、4或5个游离羟基)或者二糖分子的至少一个游离羟基(二糖分子上优选有8个游离羟基)已被修饰。这些修饰是用各种取代基团对或者是羟基上的氢原子或者是整个羟基基团本身进行的取代。以此方式，根据进行取代的数量和类型的不同，可以获得具有所需性质的单糖或二糖衍生物。
具体来说，本发明涉及一种新的、具有1到N-1个脂肪酸酯基团的单糖或二糖衍生物，其中N指获得衍生物的单糖或二糖的羟基数。在一优选实施方案中，单糖或二糖衍生物还含有1到N-1个阴离子基团并且其中脂肪酸酯基团和阴离子基团的组合数目不超过N。阴离子基团和脂肪酸酯基团的组合数目在1到N之间。优选地，单糖或二糖衍生物的游离羟基不多于两个，羟基、脂肪酸酯和阴离子基团的组合数不超过N。
在一优选实施方案中，二糖衍生物的脂肪酸酯至少有2个、优选3个、更优选4或5个、最优选6个，并且阴离子基团至少有1个、但不多于N-2个、优选N-3个、更优选N-4个或N-5个、最优选N-6个，其中脂肪酸酯和阴离子基团的组合数不超过N，其中N是获得该衍生物的二糖的羟基数。
本发明所述的单糖衍生物优选具有至少2个、更优选3或4个、但不多于N-1个脂肪酸酯并且至少一个、但不多于N-2个，更优选N-3个阴离子基团，其中脂肪酸酯和阴离子基团总的组合数不超过N，其中N是获得该衍生物的二糖的羟基数。
因此，本发明所述的、特别优选的衍生出的单糖具有至少一个阴离子基团和至少两个脂肪酸酯，其中阴离子基团和脂肪酸酯的总数在3-5之间，而且特别优选的衍生出的二糖具有至少一个、优选1或4个阴离子基团及至少一个脂肪酸酯，其中阴离子基团和脂肪酸酯的总数在6-8之间，优选7或8。
此处所用的术语“脂肪酸酯基团”或“脂肪酸基团”是指含有至少8个碳原子的直链烃的脂肪酸酯基团。此处所用术语“阴离子基团”是指带负电荷的部分(即在中性pH或使用该衍生物的环境pH下带负电荷)。例如，这样的负电荷基团可以是硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。优选的阴离子基团包括“硫酸酯基团”即具有SO2-OR通式的基团，“磷酸酯基团”即具有PO2-(OR)2，其中R选自形成单价阳离子的原子和/或分子。术语“羟基”是指具有-OH化学式的基团。
此处所用泛称“糖衍生物”是指单糖或二糖的衍生物。
本发明的糖衍生物可作为乳化剂优先用于不溶于水的分子。值得注意的是，考虑到生物可利用性、生物活力和不溶于水分子制剂的稳定性，不溶于水的分子与本发明的糖衍生物的络合为此提供了明显的优势。在糖衍生物和靶标分子之间配对的改进可以在不溶于水分子的生物可利用性、生物学和/或药学活性和物理性质(例如稳定性)方面产生协同改进。同阴离子基团的反离子性质和脂肪酸酯基团的类型和性质一样，本发明所述的单糖和二糖衍生物的物化性质依存在的阴离子基团的数目(和比例)及(对)脂肪酸酯基团数目(和对更小程度的羟基数目)而变。本发明的单糖衍生物优选具有至少1个、但不多于3或4个的阴离子基团，而二糖衍生物优选具有至少1个、但不多于7个的阴离子基团。
另外，本发明糖衍生物高度适合用作疫苗的佐剂。值得注意的是，考虑到提高抗原组份制剂的生物可利用性、生物活性和稳定性，抗原组份与本发明所述的糖衍生物的络合可以为此提供明显的优势。在糖衍生物和抗原组份之间配对的改进可以提供疫苗效应力和/或稳定性的协同改进并增强免疫反应或激活免疫系统。此处所用术语抗原组份是指抗原本身的任何组份或材料，例如病毒、细菌、支原体、寄生虫或肿瘤细胞、微生物的亚单位、变应原，例如蛋白、多糖、多肽、糖蛋白、多糖-蛋白缀合物、多肽-蛋白缀合物等等或任何其它引发免疫应答的实体。例如，该抗原组份可由(或含有)一或多个活的生物体、失活的生物体或所谓的亚单位组成(后者可通过例如合成、重组DNA方法或从生物体中分离的方法进行制备)。术语抗原组份进一步指可诱导抗原(例如可被整合进免疫主体()宿主细胞(的DNA)的DNA或RNA序列)发生的任何组份，它可于此诱导抗原部分的形成。含有该核酸序列的疫苗也指DNA疫苗或RNA疫苗。
本发明的单糖衍生物优选来自有C5H10O5通式的戊糖或来自有C6H12O6通式的己糖。适合的戊糖可选自阿拉伯糖、核糖、木糖。适合的己糖可选自allolose、altriose、果糖、半乳糖、葡萄糖、古罗糖、肌醇、甘露糖和山梨糖。该新的单糖衍生物优选来自果糖、半乳糖或葡萄糖。本发明的二糖衍生物优选来自具有C12H22O11通式的二糖或者可适当选自纤维二糖、龙胆二糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖和松二糖。该新的二糖衍生物优选来自乳糖、麦芽糖或蔗糖。本发明糖衍生物最优选选自蔗糖。
脂肪酸酯基团优选具有直碳链、有-O-(C＝O)-(CH2)x-CH3通用化学结构的酯基团(其中x在4到24之间、优选在4到22之间、更优选在6到18之间、最优选在6到14之间)、具有-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3通用结构的酯基团(其中x+y在4和24之间、优选在4和22之间、更优选在6和14之间)或-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3通用结构的酯基团(其中x+y+z在4和20之间、优选在4和18之间、更优选在6和14之间)。这些脂肪酸酯基团的组合物也可存在。
具有通用结构-O-(C＝O)-(CH2)x-CH3的脂肪酸酯基团特别优选那些x是4(己酸)、6(辛酸)、8(癸酸)、10(月桂酸)、12(肉豆蔻酸)、14(软脂酸)和16(硬脂酸)的。具有通用结构-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3的脂肪酸酯基团优选那些其中x+y是14(例如油酸)的。具有通用结构-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3的脂肪酸酯基团优选那些其中x+y+z是12(例如亚油酸)的。
阴离子基团优选具有O-SO2-OR或-PO2-(OR)2通用结构，其中R选自形成单价阳离子的的原子和/或分子。它们包括H+、Na+、K+、Li+或NH4 +。特定的实施方案包括具有硫酸酯基团O-SO2-OH、O-SO2-ONa或O-SO2-ONH4的糖衍生物。这些硫酸酯基团的组合物也可以存在。
本发明进一步涉及一种简便、安全且便宜的制备上述单糖和二糖衍生物的方法。该方法包括使单糖或二糖与酰氯和磺化剂反应。该单糖或二糖可以与所说的酰氯和磺化剂以任何顺序或同时反应。
如下面将要详细讨论的那样，我们已经发现通过下列任何一种方法：(1)改变所用单糖或二糖的性质；(2)改变各种所用起始材料的数量(比例)；(3)改变所用酰氯的性质；和/或(4)改变用来纯化的水溶液中使用的阳离子，都可以获得不同的、具有特定物化性质的单糖或二糖衍生物的制备物。进行如此调整的单糖或二糖衍生物的性质包括在水性(水)和非水性(非极性)溶剂中的溶解度、形成胶束和与其它分子形成混合胶束的能力、对疏水表面的吸收能力、对亲水表面的吸收能力、对生物材料的吸收能力和表面活性/张力活性。
优选的酰氯为己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯(月桂酰氯)、十四酰氯(肉豆蔻酰氯)、十六酰氯(软脂酰氯)、十八酰氯(硬脂酰氯和油酰氯)及其组合物。
在一特定实施方案中，此处所公开的是具有高水溶解性、低有机溶剂溶解性、很小的结合疏水分子能力和很小的结合疏水表面能力的单糖或二糖。在此方面，酰氯优选选自辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯、十四酰氯及其组合物。在此方面，酰氯更优选选自辛酰氯、癸酰氯和/或十二酰氯。在此方面，酰氯最优选选自癸酰氯和/或十二酰氯。
在另一实施方案中，此处所公开的是具有低水溶解性、高有机溶剂溶解性、很大的结合疏水分子能力和很大的结合疏水表面能力的单糖或二糖。在此方面，酰氯优选选自十二酰氯、十四酰氯、十六酰氯、十八酰氯及其组合物。在此方面，酰氯更优选选自十四酰氯、十六酰氯和/或十八酰氯。在此方面，酰氯最优选选自十六酰氯和/或十八酰氯。
优选的磺化剂为气态的SO3、HClSO3(氯磺酸)、SO3-吡啶、SO3-2-甲基吡啶、SO3-2，6-二甲基吡啶、SO3-二甲基甲酰胺、SO3-三甲胺、SO3-三乙胺、SO3-二甲基苯胺、SO3-N-乙基吗啉、SO3-二乙基苯胺、SO3-二噁烷及其组合物。磺化剂优选SO3-吡啶或气态的SO3。
单糖或二糖优选与酰氯以1∶1到1∶N-1之间的比例，并与磺化剂以1∶1到1∶N-1之间的比例进行反应，其中酰氯酯的数量加上磺化剂的数量总数不超过N，N是该衍生物所来自的单糖或二糖的羟基数。通过适当选自试剂间的摩尔比，技术人员可方便地制备出具有所需脂肪酸酯和硫酸酯基团数目的单糖或二糖衍生物。
该单糖或二糖优选与酰氯和磺化剂在无水疏质子介质中反应。该方法优选在体积尽量小的有机溶剂中进行。优选那些通过例如沉淀、过滤、结晶或蒸发，可容易地从反应化合物中除去的有机溶剂。优选的有机溶剂为吡啶和N-甲基吡咯烷。高度优选无水二甲基甲酰胺与无水吡啶的混合物及无水N-甲基吡咯烷与无水吡啶的混合物。
如果使用吡啶的话，其用量优选小于酰氯用量的两倍。更优选，吡啶的用量与酰氯的量相当。
例如，在与磺化剂反应之前，单糖或二糖有可能与酰氯反应形成二糖脂肪酸酯。
单糖或二糖优选与酰氯在约60到70℃反应4到8小时，优选约6小时。随后，可以使反应混合物于环境温度保持18小时以内。该与磺化剂的反应优选在环境温度与70℃之间至少进行6小时。在一优选实施方案中，单糖或二糖与酰氯和磺化剂在约60到70℃同时反应至少6小时。
随后，可以使反应混合物于环境温度保持18小时以内。
在另一优选实施方案中，单糖或二糖首先与酰氯并且与磺化剂在环境温度反应，然后将温度提升至约50-70℃、优选55-70℃、更优选约60℃。
在这方面，值得注意的是，该方法在环境温度下执进行是指温度对该方法来说并不是非常重要的。这一性质使得该方法可以在很广的温度范围内及在很广的、同时又很节省的条件下进行。我们可以预期，温度低至约10℃的也是可以接受的。优选的环境温度不低于15℃，更优选不低于18℃。而且，环境温度优选不高于50℃，更优选不高于40℃，最优选不高于25℃。
本发明的单糖或二糖衍生物以单糖或二糖与酰氯和磺化剂的两步反应获得。在一优选实施方案中，该反应以单糖或二糖与酰氯和磺化剂同时反应的一步法进行。当然，也有可能由单糖脂肪酸酯或二糖脂肪酸酯起始，例如蔗糖月桂酸酯L-195(Mitsubishi，日本)、蔗糖月桂酸酯L-595(Mitsubishi，日本)或蔗糖硬脂酸酯S-195(Mitsubishi，日本)，而且该起始材料与一或多种磺化剂反应以形成所需的单糖或二糖衍生物。
如已提及的那样，优选使用尽可能少的有机溶剂量。在这方面，优选通过加热将单糖或二糖溶剂在该有机溶剂中，以产生半透明的、匀质溶液。该制备匀质溶液的方法尤其适用于那些在有机溶剂中的溶解度相对很小或很难溶于有机溶剂的糖，例如蔗糖和乳糖。为将这些糖溶解在最少量或最少体积的有机溶剂中，温度增至＞80℃。有机溶剂的温度优选增至＞90℃。
在一优选的实施方案中，在反应完成之后，将有机溶剂中的单糖或二糖衍生物用NaOH、NH4OH、KOH进行中和，使之形成具有硫酸酯基团(包括Na+、K+或NH4 +阳离子中的一个)的单糖或二糖衍生物。
可以通过冷却使之形成两个或三个或更多不同的相(其中一个富含该单糖或二糖衍生物)来回收目的单糖或二糖衍生物。这可以通过本领域熟知的方法，包括过滤、倾析等等，来进行回收。残余的有机溶剂可通过例如在增加温度并减少压力的条件下进行蒸发或用水相进行洗涤从该相中除去。冷却之后，此有机溶剂和任何在反应中形成的副产品将会存在于不含或几乎不含任何该单糖或二糖衍生物的一个或两个相中。该相或这些相可以通过本领域所熟知的方法(包括过滤、倾析等等)除去。衍生出的糖可通过本领域中已知的技术进行进一步的纯化。
单糖或二糖衍生物可以使用与制备该单糖或二糖衍生物中所使用的有机溶剂不互溶的液体从反应混合物中萃取出来。因此，单糖或二糖衍生物得以与副产品和制备中使用的有机溶剂分开或分离开。在这方面，所说的液体优选挥发性的有机溶剂或是糖衍生物最终制剂的一种成分。所说的液体更优选一种油，最终的制剂为一种乳液。所说的液体最优选角鲨烷。
这两个涉及本发明单糖衍生物和二糖衍生物合成的化学反应被认为是随机的反应，从而导致产生出不同单糖或二糖衍生物的集合，这些单糖或二糖衍生物每分子硫酸酯基团的数目不同，和/或每分子脂肪酸酯基团的数目不同，并因此使得其所具有的结构和物理化学性质也不同。
然而，值得注意的是，单糖或二糖衍生物制备物中的化学上不同的衍生物的数量比上述详细讨论过的Hilgers等人(WO96/20222，WO 967/20008)所公开的磺化脂-多糖制备物中的要低的多。如果不把脂肪酸酯基团、硫酸酯基团和羟基基团在二糖分子上的分布计算在内的话，则按本发明所述，在由具有8个羟基基团的二糖所获得的制备物中，不同衍生物的数量为28个。如果把脂肪酸酯基团、硫酸酯基团和羟基基团在二糖分子上的分布计算在内的话，则按本发明所述，由具有8个羟基基团的二糖所获得的不同衍生物的数量为38＝6,561个。与硫酸酯-环糊精的那些(其分别为210和1,494,336,195)比起来，这些数量的衍生物在其使用与制备方面，具有相当大的优势。
因此，该制备单糖或二糖衍生物的方法产生了这样一种衍生物的混合物。这些衍生物可以通过使用例如结晶、沉淀、过滤、蒸发、透析或超滤技术得以分离。优选将去除所使用的有机乳液和所形成的副产品与获得的不同单糖和二糖衍生物的分离同时进行。其优选通过相分离、层析、沉淀、溶解、萃取或这些技术的组合来完成。更优选地，通过冻干将该单糖或二糖衍生物与有机乳液分开，从而获得干的单糖或二糖衍生物制备物。该冻干方法优选在室温、内压小于10mbar并且冷槽低于-25℃的条件下进行。
具体说来，此处所公开的是一种制备富含具有一定脂肪酸酯基团和阳离子基团数目和类型的二糖衍生物的方法，其步骤为使约1摩尔的二糖与约7摩尔、用于制备每个二糖分子中每一个脂肪酸酯基团的酰氯相接触并与约1摩尔、用于制备每一个硫酸酯基团的磺化剂或与约1摩尔、用于制备每个二糖分子中每一个磷酸酯的磷酸化试剂相接触，其中酰氯和磺化剂的摩尔总数不超过N，而N是其所接触二糖的羟基总数。
本发明的单糖或二糖衍生物制备物的的水溶解性可以通过如下方法增加：(1)增加本发明方法中所使用的磺化剂或磷酸化试剂的量和/或减少本发明方法中所使用的酰氯的量，从而使产生的单糖或二糖衍生物具有相对所存在的脂肪酸酯基团数目更多的阳离子基团数。高的水溶解性也可以通过(2)使用具有短碳链的酰氯，使其产的单糖或二糖衍生物生具有相对短碳链的脂肪酸酯基团。具体来说可以通过使用十八酰氯、癸酰氯、十二酰氯(月桂酰氯)和/或十四酰氯作为酰氯试剂来完成。
可以通过执行相反的步骤使水溶解性下降或使在非极性溶剂中的溶解性上升。具体来说可以通过使用十二酰氯(月桂酰氯)、十四酰氯和/或十八酰氯作为酰氯试剂来实现。同样的方法可使单糖或二糖衍生物与疏水表面的结合能力增强。
本发明的单糖或二糖衍生物形成胶束的能力可以通过增加在本发明方法中使用的磺化或磷酸化试剂的量或通过增加酰氯的量来产生。同样的方法可使表面活性/张力活性增加。
在这方面值得注意的是，本发明的单糖或二糖衍生物可与气态化合物形成大的混合胶束。例如，已经发现，单糖衍生物与硫酸酯/脂肪酸酯(每个单糖分子1个硫酸酯基团对3个脂肪酸酯基团的比例)，或二糖衍生物与硫酸酯/脂肪酸酯(每个二糖分子1个硫酸酯基团对7个脂肪酸酯基团的比例)可以形成具有聚山梨醇酯80的混合胶束。这些胶束不能通过具有高分子量阻断的超滤膜。这些具有其它化合物的混合胶束的大小依亲水基团(即硫酸酯)和疏水基团(即脂肪酸酯)的比例及所结合分子的物理性质而定。
已经发现，富含具有一定数目和类型阳离子基团(例如硫酸酯基团和脂肪酸酯基团)的单糖或二糖衍生物的制备物能够与特定的与水不互溶的分子(例如食品配料、染料、调料、油、药物分子和抗原，它们具有调整该特定分子的温度性、反应性、流动性和/或生物可利用性的能力)形成复合物。
本发明的单糖或二糖衍生物可用于各种医学和药学应用。
本发明所述单糖或二糖衍生物，当与分子(例如药物分子或抗原化合物)复合时，会使固体、半固体和/或液体制剂中的该分子的生物可利用性提高。其也可以使稳定性增强并使保存期限提高。另外，其也可以减少与其形成复合物的分子的副面影响(毒性)。最后，其使得(来自难溶药物的)均匀的、易于操作的、可注射的溶液供应品成为可能。
本发明的单糖和二糖(及其制备物)的使用具有极大优势的医学应用方面的一个例子为在疫苗佐剂中的应用。适合的佐剂包括通常指的那些水包油乳液(包括水包角鲨烷乳液、水包矿物油乳液、水包十六烷、水包大豆油乳液、水包蔗糖脂肪酸酯乳液等)、油包水乳液(包括矿物油包水、角鲨烷包水、蔗糖脂肪酸酯包水等)或水包油包水乳液(包括水包矿物油包水、水包角鲨烷包水、水包蔗糖脂肪酸酯包水等)。
接种疫苗是人及动物健康中费用最低廉的防止和控制传染疾病的方法。接种疫苗或免疫包括使适当类型的、抗相关抗原成分和/或抗原决定簇的免疫反应产生足够的水平和时间长度。该免疫反应可通过例如测定血清中的抗体滴度、淋巴细胞的增殖反应、抗人工或天然感染的保护级数、保护时间、无反应动物数等等进行测定。
在许多靶标动物物种(例如猪、牛、家禽、狗、猫、马、人等)中，由病毒、细菌、寄生虫或任何其它感染媒介(例如流感病毒、肝炎病毒、麻疹病毒、脊椎灰质炎病毒、细小病毒、狂犬病毒、链球菌、脑膜炎双球菌、梭状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、放线杆菌、利斯塔氏菌、疟疾、锥体虫、肺蠕虫、原生动物、枝原体、衣原体等等)引起的疾病都可以通过接种疫苗得以防止或控制。
大多数情况下，抗灭活抗原及有些情况下也抗活抗原的免疫反应太低而无法建立起足够的保护水平或足够的保护时间长度。因此，就要向这些抗原中添加刺激该免疫反应的佐剂。
理想的佐剂可增强抗该抗原和/或抗原决定簇相关保护的相关类型的免疫反应(体液的和/或细胞的)，而不会有明显的副反应。刺激某一免疫的类型的佐剂可能适于某些用途，但不适于其它用途。强的佐剂会增强例如抗许多不同抗原的抗体介导的和细胞介导的免疫。佐剂对不同抗原的不同效果是个明显的缺点，尤其是涉及含几种不同抗原的组合接种中。在抗原类型、动物物种、免疫反应类型方面有很强活性的佐剂具有重要的优势。
在DNA或RNA疫苗中使用的佐剂可以于胞内诱导抗原，其也优选帮助该DNA或RNA序列成功地整合进入宿主细胞DNA(转染)。
已知有许多不同类型的佐剂，但仅有几个用于市售的人或兽医疫苗。选作疫苗的佐剂类型由几个因素决定，包括靶标动物物种、佐剂的效应力、佐剂的毒性、佐剂的质量、佐剂的价格等等。如人们所熟知的，佐剂的效应力和毒性是与相关的，高效应力伴有高毒性，而低毒性则效应力也低。高毒性是作为局部反应，例如发炎、肿胀、脓肿形成、肉芽肿、坏死等等和/或系统反应，例如疼痛、发烧、高血压、过敏、厌食。体重下降等等而出现的。佐剂的毒性是限制其使用的重要因素，而且其可以为一些动物物种所接受时，可能对其它动物物种则是不能接受的。
在实验动物中，标准的佐剂是Freund完全佐剂，其是一种强佐剂。由于其毒性的缘故，尤其是其局部效应，其无法在人类或食用动物(food animals)或伴生动物(companion animals)中进行应用。在，例如牛、绵羊和猪中，经常以矿物油乳液作为佐剂。例如水包矿物油乳液(O/W)、矿物油包水乳液(W/O)和水包矿物油包水乳液(W/O/W)。这些佐剂会产生高的免疫反应(但比Freunde完全佐剂的要小)。包括局部和系统副作用在内的毒性使它们在伴生动物和人身上的应用受到了限制。在伴生动物例如猫、狗和马中，使用的是相对安全的佐剂，例如ISCOM、Al(OH)3和聚丙烯酸酯。总体来说，这些佐剂所诱导的反应要比矿物油乳液的低，而且严重的副作用也要低的多。在人身上，铝盐是唯一许可使用的佐剂。它们诱发的反应要比许多在兽医疫苗中使用的佐剂低，而且被认为是相对安全的。
因此，强佐剂的一个缺点就是它们的毒性相对较高。安全佐剂的缺点则是它们的效应力相对较低。
除了效应力和毒性以外，佐剂和含佐剂疫苗的质量也是十分重要的。质量的标准包括粘度、化学稳定性、物理稳定性、物化稳定性等等。粘度高会妨碍产品的操作，例如将产品吸入针筒或将产品对动物给药。粘度低会有利于产品的操作。低的化学、物理或物化稳定性会减少疫苗的保存期限并需要严格的产品贮藏和运输条件。高的化学、物理和物化稳定性会使保存期限延长并对产品的后勤运输有利。正如人们所熟知的，在食用动物中使用的含矿物油乳液的疫苗具有粘度高并且不稳定。
由以上叙述我们清楚地认识到对具有高效应力且低毒性、有效地抗各种抗原并且容易操作的佐剂仍然具有迫切的需求。
本发明提供了这样的佐剂。我们已经发现，上述的单糖或二糖衍生物高度适于在各种类型疫苗作为佐剂使用。因此，本发明也涉及以本发明所述的单糖或二糖衍生物形式出现的佐剂，并涉及制备含一或多种所说单糖或二糖衍生物疫苗的佐剂配方。该佐剂配方可进一步含有药学上可接受的载体。例如，适合的载体包括生理盐水和水包油乳液，优选水包角鲨烯乳液。
按本发明所述，特别优选的佐剂配方含有本发明所述的单糖或二糖衍生物(I)、与水不互溶的液相或固相(II)、乳化剂或稳定剂(III)及任选地水相(IV)。
任何本发明所述的糖衍生物都可作为佐剂使用。例如，该衍生物可以是具有1-3个、优选1或2个脂肪酸基团和0-3个、优选1或2个阴离子基团的戊糖，其中阴离子和脂肪酸基团的总数不超过4个。
按本发明所述，具有1-4个、优选1-3个脂肪酸基团和0-4个、优选1-3个阴离子基团(其中阴离子和脂肪酸基团的总数不超过5个)的己糖也特别适合作为佐剂使用。
优选的作为佐剂的二糖衍生物可以含有1-7个、更优选3-7个、最优选4-7个脂肪酸基团和0-7个、更优选0-6个、最优选1-5个阴离子基团，其中阴离子和脂肪酸基团的总数不超过8个。
用具有一个阴离子基团、优选一个硫酸酯基团和5-7个脂肪酸酯基团的二糖衍生物已经取得了特别好的结果。一个具有4个阴离子基团、优选硫酸酯基团和4个脂肪酸酯基团的衍生二糖作为佐剂也有非常令人满意的表现。
一或多种本发明所述的糖衍生物，在本发明所述佐剂配方中作为佐剂存在的浓度通常为0.1-1000g/l、优选0.5-500g/l、更优选1-320g/l。
与水不互溶的液相优选油。适合的油包括，例如大豆油、花生油、canola油、橄榄油、红花油、玉米油、mazola油、鳕鱼肝油、扁桃油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、软脂酸异丙酯、矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二烷醇(octyldodecanol)、杏仁油、芝麻油、油酸肉豆蔻酯、十六烷基油酸酯(cetyl oleate)和软脂酸肉豆蔻酯。其它适合的油包括由饱和的、不饱和的和/或部分氢化的脂肪酸硅基油、合成油(例如由饱和和不饱和C12-C24脂肪酸链组成的甘油三酸酯，例如油酸的甘油三酸酯、萜烯、linolene、角角鲨烯、角鲨烷、squalamine)和氟化油(包括称作FC-40、FC-43、FC-72、FC-77、FC-70、FC-75的全氟化物、全氟己烷、全氟辛基溴化物(perfluorooctylbromide)(也叫perfluorobron)、全氟辛烷碘或其混合物组成的生物亲和油。
用一种与水不互溶的相(II)为角鲨烷、角角鲨烯、矿物油、植物油、十六烷、碳氟化合物或硅油的佐剂配方已经取得了很好的结果。
通常存在于佐剂配方中的与水不互溶相(II)的浓度为0-640g/l，优选0-480g/l，更优选10-320g/l。
如果该佐剂配方含有与水不互溶的固相(II)，那么该固相优选不溶于水的盐。特别适合的是不溶的铝或钙盐或其混合物。优选的盐包括氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙二氧化硅及其混合物。
乳化剂的稳定剂(III)可以是去污剂。适宜的乳化和/或稳定化试剂包括，例如，胆固醇、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单和二甘油酯、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆184、泊洛沙姆181)、非离子嵌段共聚物(例如BASF的PLURONICS)、聚氧乙烯50硬脂酸、polyoxyl 35蓖麻油、polyoxyl 10油烯醚、polyoxyl 20 cetostearyl醚、polyoxyl 40硬脂酸、多乙氧基醚20、多山梨醇酯40、多山梨醇酯60、多乙氧基醚80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、单月桂酸山梨醇酯、单油酸山梨醇酯、单软脂酸山梨醇酯、单硬脂酸山梨醇酯、硬脂酸、Triton X-100、皂角苷、纯皂角苷、(例如QS21)、多聚物(例如聚丙烯酸脂)。
用一种乳化剂或稳定剂(III)是非离子去污剂(亲水-亲脂平衡值大于10)、糖脂肪酸酯或阴离子去垢剂(亲水-亲脂平衡值大于10)的佐剂配方已经取得了非常好的结果。
优选的乳化剂或稳定剂(III)包括多山梨醇20、多山梨醇80、多山梨醇85、Triton-X 100、皂角苷、卵磷脂、非离子嵌段共聚物、蔗糖脂肪酸酯、糖月桂酸酯(例如Mitsubishi-Kagaku食品有限公司的Ryoto糖酯1695)。特别优选的是多山梨醇80和蔗糖脂肪酸酯。
本发明所述的单糖或二糖也可以优先用作佐剂配方中的乳化剂或稳定剂(III)。用具有至少3个、优选至少4个单不多于N-1个阴离子基团并且有至少1个但不多于N-3个、优选不对于于N-4个脂肪酸酯基团的单糖或二糖衍生物(其中N是衍生出该衍生物的该单糖或二糖的羟基数，而且脂肪酸和阴离子基团的组合数不超过N个)已经取得了特别好的结果。
通常存在于本发明所述的佐剂配方中的一或多种乳化剂或稳定剂额总浓度为0到640g/l、优选1-480g/l、更优选1-320g/l。
适合的水相(IV)包括，例如盐水、磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸缓冲盐溶液、等渗离子溶液、等渗非离子溶液等等。水相的量可以在很大范围内变化，通常从0到999.9g/l、优选10-990g/l、更优选640-990g/l。
本发明还涉及于本发明所述的佐剂配方中最优的、含有抗原化合物和本发明单糖或二糖衍生物的疫苗。该疫苗可以含有0.05-250g/l、优选0.25-125g/l、更优选1-80g/l的单糖或二糖衍生物或该衍生物的混合物作为佐剂。其可再含有一或多种总浓度从0到640g/l、优选1-480g/l、更优选1-320g/l的乳化剂或稳定剂及一种浓度为0到640g/l、优选1-480g/l、更优选1-320g/l的与水不互溶液相(优选油)。
该疫苗可以含有如上所述的任何抗原组份。对于该疫苗的制备来说，其抗原组份或者是在使用前就混好了的或者刚好在使用前混合。
例如，本发明所述的疫苗可以用于人和动物的免疫(后者包括例如哺乳动物、鸟和啮齿类动物例如猪、牛、绵羊、马、狗、牛和家禽)。
该疫苗、佐剂或佐剂配方可以通过肠道外的或非肠道的途径，例如肌肉内的、皮内的、经皮的、皮下的、腹膜内的、皮内的、鼻内的、鼻的、口的、阴道内的、泄殖腔内的等等，进行应用。
值得注意的是，本发明也预示了一种已知佐剂与以本发明单糖或二糖形式出现的佐剂的组合物的用途。
对于食用动物来说，本发明的佐剂与已经得到应用的佐剂比较的优势在于，例如局部和系统副作用较小、对动物接种疫苗的不舒适度较小、由于减少了按体重获利动物的致命性影响而使经济损失较小、由于含残留疫苗的肉类损失而使经济损失较小、对疫苗施用者自动注射的危险性较低、疫苗的易操作性提高、产品的稳定性提高等等。
对伴生动物而言，本发明的佐剂与已经得到应用的、已知的佐剂比较的优势在于，例如免疫反应的水平较高、免疫时间的提高、应答动物数量的提高、可与该佐剂组合的抗原数量更多等等。
本发明将通过下面的、非限制性实施例进行进一步的阐述。实施例
下面实施例中描述的一些实验是同时进行的。为便于比较，每个实施例都对列出了所选组的结果。重要的是，在几个实施例中有对照组的结果。
实施例#1
如前面对所谓的硫酸酯-多糖所述(Hilgers等，1986)，合成蔗糖衍生物。简单地说，通过在90℃、＜50mbar条件下加热并加入无水N-甲基吡咯酮(NMP；Merck)和无水吡啶(Merck)，对细粉状蔗糖(Merck)进行干燥。将混合物于80℃搅拌直至获得澄清溶液。加入十二酰氯(Merck)，并将反应混合物于60℃保持约6小时。加入SO3-吡啶(Merck)，并将反应混合物于室温温浴约18小时。用4M NaOH将其pH调至7.0(±0.3)。以增加温度(＜80℃)、减少压力(＜10mbar)的方法进行广泛性蒸发(＞6h)，并于4℃冷凝，直至残留的重量损失小于0.1g/30分钟为止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。不同衍生物所使用的起始材料的量被列于表#1.1。
表#1.1
蔗糖衍生物 蔗糖 十二酰氯 SO3-吡啶   NMP   吡啶 摩尔比例
 (g)   (g)    (g)   (g)   (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(十二酰)7-蔗糖 6.8   30.7   0.0   30.1  15.8  7.0  0.0
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 6.8   30.7   3.2   30.1  15.8  7.0  1.0
(十二酰)5-蔗糖 6.8   21.9   0.0   30.1  15.8  5.0  0.0
(硫酸酯)1-(十二酰)5-蔗糖 6.8   21.9   3.2   30.1  15.8  5.0  1.0
(十二酰)3-蔗糖 6.8   13.1   0.0   30.1  15.8  3.0  0.0
(硫酸酯)1-(十二酰)L3-蔗糖 6.8   13.1   3.2   30.1  15.8  3.0  1.0
(十二酰)1-蔗糖 6.8   4.4   0.0   30.1  15.8  1.0  0.0
(硫酸酯)1-(十二酰)1-蔗糖 6.8   4.4   3.2   30.1  15.8  1.0  1.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的十二酰氯摩尔数；S/蔗糖：每摩尔蔗糖的SO3-
吡啶摩尔数。
通过薄层色谱(TLC)对获得的产物进行分析。将0.5g衍生物样品溶于4.5ml NMP，所得每种溶液各取2μl点在TLC硅胶板上(HPLC-TLC，正常相；Anatech，Newark；DElaware；美国)并用233ml二乙醚+100ml正己烷+3.3ml乙酸的混合物展开。用溶于甲醇的50％v/v的硫酸溶液喷洒此硅胶板并于120℃加热10-30分钟，以对板上的斑点进行显色。结果列于图#1。
表#1.1中的不同蔗糖衍生物的配方由10g蔗糖衍生物与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)、190g 0.01w/v％硫柳汞(Sigma)磷酸缓冲盐溶液(PBS-硫柳汞；pH7.0)混合制得。于环境温度下、以至少400巴的内压，三次通过Y110型微流化装置(Microfluidics公司，Newton，美国)对所得的每一种混合物进行乳化。于显微镜下对每一乳液进行检测。如果在放大1000倍的显微镜下，每10个受检视野中有多于10个直径大于1μm的油滴，那就重复进行该乳化过程。将所得的乳液保存于4℃直至使用。
在猪身上对这些制剂的佐剂活力进行了测定。将一体积的抉择制剂与一体积的含由昆虫细胞产生的(如Hulst等人(1994)所述)、32μg/ml典型猪瘟病毒糖蛋白E2(CSFV-E2；ID-DLO，Lelystad，荷兰)的抗原制剂混合制得疫苗。
五头猪为一组(10周龄)，以2ml疫苗/头进行肌肉内注射免疫。三周以后，用同样的疫苗重复免疫。在二次免疫三周之后，以Terpstra等(微生物兽医学，1984，9，113-120页)所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV-E2的抗体滴度。计算每组的几何平均滴度(GMT)、标准偏差(STDEV)和反对数(2阶GMT)。结果列于表1.2。
在该动物试验中包括了硫酸酯-环糊精/水包角鲨烷乳液(SL-CD/角鲨烷/多乙氧基醚80；Hilgers等，疫苗，1999，17，219-228页)。
表1.2
组 疫苗 增强3周后血清中2-logCSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.32  0.00  10
 2  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 3.84  1.12  14
 3  CSFV-E2 (十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10.36  1.35  1.311
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.47  0.78  22,739
 5  CSFV-E2 (十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10.24  2.29  1,208
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.07  1.72  2,154
 7  CSFV-E2 (十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.56  1.82  3,011
 8  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.16  1.57  2,282
 9  CSFV-E2 (十二酰)1-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 9.39  1.90  671
 10  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)1-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 9.91  0.00  960
 11  CSFV-E2 SL-CD/角鲨烷/多乙氧基醚80 13.36  1.56  10,484
GMT＝几何平均滴度，即同组单个动物2对数滴度的平均值；
STDEV：标准偏差；反对数＝2次幂(GMT)。
实施例#2
将34.2g(0.1摩尔)无水蔗糖(Merck)、149g(1.5摩尔)无水N-甲基-吡咯酮和79g(1摩尔)无水吡啶放在圆底烧瓶中，然后将其连到旋转蒸发器TM(Buchi，瑞士)上旋转混合。将该混合物加热到90℃直至得到澄清的溶液。然后将温度调到60℃并向该蔗糖溶液中加入153.3g(0.7摩尔)的十二酰氯。将烧瓶中的反应混合物于60℃保持6小时。向烧瓶中的反应混合物中加入15.9g(0.1摩尔)SO3-吡啶，并与60℃保持6小时，然后与环境温度保持12小时。将该反应混合物于4℃保持24小时，从而形成晶体沉淀和两个液相。收集上相并在旋转蒸发器TM上以增加温度(＜60℃)、减少压力(＜10mbar)的方法进行蒸发，并于4℃冷凝，直至残留的重量损失小于0.1g/30分钟为止，以除去溶剂(组份I)。向组份I的样品中加入正己烷和N-甲基吡咯酮。将该混合物于1000g离心10分钟从而形成了透明的黄色上相(组份II)、乳白色的中间相(组份III)和透明的下相。在旋转蒸发器TM上以增加温度(＜60℃)、减少压力(＜10mbar)的方法进行蒸发，并于4℃冷凝，直至残留的重量损失小于0.1g/30分钟为止，以除去组份II和组份III的溶剂。
通过实施例1中所述的TLC对所得的产物进行分析。
制备几种制剂并按上述实施例1中所述的方法测定它们对CSFV-E2的抗体反应。结果列于表#2.2。
取该蔗糖衍生物各组份(组份I、组份II和组份III)各10g与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞，按实施例#1中所述的方法制备制剂。这些制剂分别于组3、6和18中进行检测。
按实施例#1中所述的方法制备10g实施例#1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖与10g多乙氧基醚80、40g角鲨烷和190g PBS-硫柳汞的制剂。该制剂于组2和5中进行检测。
按实施例#1中所述的方法制备10g表#1.1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖与10g多乙氧基醚80、10g角鲨烷和220g PBS-硫柳汞的制剂。该制剂于组4中进行检测。
按实施例#1中所述的方法制备10g蔗糖衍生物表#1.1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖与10g多乙氧基醚80和230g无角鲨烷PBS-硫柳汞的制剂。该制剂于组7中进行检测。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g多乙氧基醚80、40g角鲨烷(Merck)和200g PBS-硫柳汞的制剂。该制剂于组9中进行检测。
本实验包括了一种矿物油包水浸水CSFV-E2疫苗(ID-Lelystad，Lelystad，荷兰)，其为阳性对照。该制剂于组10中进行检测。
表#2.2
组 疫苗 增强3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 4.2  0.7  18
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖(实施例#1)/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.1  0.4  2,228
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-I/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.2  0.7  285
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖(实施例#1)/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 10.7  0.9  1.689
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖(实施例#1)/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] ≥11.3  0.0  ≥2,560
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-II/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.4  0.9  347
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖(实施例#1)/多乙氧基醚80[40/40] 9.3  2.1  619
 8  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-III/角鲨烷/多乙氧基醚80 ≥11.3  0.0  ≥2,560
 9  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 8.3  1.3  309
 10  CSFV-E2 水浸水包矿物油乳液 ≥11.3  0.0  ≥2,560
该水浸水包矿物油乳液获自ID-Lelystad，Lelystad，荷兰。
除了抗体反应以外，用外周血单核细胞(PBMC)进行淋巴细胞增殖分析来对这些佐剂中的一些在细胞介导的免疫反应方面的效应进行测定。二次免疫6天之后，从组1、组2和组10的每只猪身上收集12ml肝素血。用3倍体积的PBS对该血样进行稀释并在12ml 50-ml聚丙烯管(Falcon)里的Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上涂层。以1000g离心20分钟，然后收集含PBMC的界面并用PBS将细胞洗涤两次，然后对该悬液于1000g离心10-15分钟。通过放大100倍的台盼蓝排除法测定活细胞数，并将悬液调整至5×106细胞/ml介质[补加100IE/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、4μl β-巯基乙醇/L和10％正常猪血清的RPMI 1640介质(Flow10-601-22)]。将每个悬液中100μl的样品以6倍放在平底96孔板的孔里。用50μlRPMI介质对三个副本进行补加(阴性对照)，并用50μl 7.1μg CSFV-E2/ml介质溶液对三个副本进行添加。将细胞于37℃、5％CO2(于CO2培养箱中)条件下培养4天。培养之后，向每个孔里添加25μl含50μCi甲基3H-胸苷(AmershamTRA 120；1mCi/ml)/ml介质的介质。培养4小时以后，使用细胞收获机(Tomtec Harvester 96 match IIIM)在滤器(Wallac)上对细胞的DNA进行收集。于70℃对滤器进行干燥并将其放在滤器袋里(Wallac)。加入5ml闪烁液(Wallac bataplate scint；Wallac，Turku，芬兰)并将袋子封住，以β-计算器(Wallac 1450型Microbeta PLUSβ-计算器，Wallac)对每个样品的放射性进行测定。用仅以介质培养的2或3个副本每分钟数的平均数(cmp)减去用抗原刺激的2或3个副本每分钟数的平均数，算出各头动物淋巴细胞悬液的刺激指数。算出每组动物刺激指数的数学平均值(AMT)及其标准偏差(STDEV)。结果列于表#2.3。
表#2.3
组 疫苗 刺激指数(cpm)
抗原 佐剂配方 ATM  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 1,993  448
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖(实施例#1)/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 27,081  16,236
 10  CSFV-E2 矿物油包水/多乙氧基醚80 2,384  1,174
实施例#3
如实施例#1所述，合成各种蔗糖衍生物。通过在90℃、＜50mbar条件下加热6小时并加入无水N-甲基吡咯酮(Merck)和无水吡啶(Merck)，对细粉状蔗糖(Merck)进行干燥。将混合物于80℃搅拌直至获得澄清溶液。加入十二酰氯(Merck)、十四酰氯(Merck)、十六酰氯(Merck)或十八酰氯(Merck)，并将反应混合物于60℃温浴6小时。加入SO3-吡啶(Merck)，并将反应混合物于室温温浴18小时。将该反应混合物于4℃保持24小时，使其形成二或三相。收集上相，并以增加温度(＜60℃)、减少压力(＜10mbar)的方法进行蒸发，并于4℃冷凝，直至残留的重量损失小于0.1g/30分钟为止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。
所使用的起始材料的量被列于表#3.1。
表#3.1
蔗糖衍生物 蔗糖 酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) (类型) (g) (g) (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(十二酰)7-蔗糖 6.8  30.7 十二酰氯 0.0  30  16  7.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖 6.8  30.7 十二酰氯 1.6  30  16  7.0  0.5
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖 6.8  34.6 十二酰氯 3.2  30  16  7.0  1.0
(十四酰)7-蔗糖 6.8  34.6 十四酰氯 0.0  30  16  7.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十四酰)7-蔗糖 6.8  34.6 十四酰氯 1.6  30  16  7.0  0.5
(硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖 6.8  34.6 十四酰氯 3.2  30  16  7.0  1.0
(十六酰)7-蔗糖 6.8  38.5 十六酰氯 0.0  30  16  7.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十六酰)7-蔗糖 6.8  38.5 十六酰氯 1.6  30  16  7.0  0.5
(硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖 6.8  38.5 十六酰氯 3.2  30  16  7.0  1.0
(十八酰)7-蔗糖 6.8  42.4 十八酰氯 0.0  30  16  1.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十八酰)7-蔗糖 6.8  42.4 十八酰氯 1.6  30  16  1.0  0.5
(硫酸酯)1-(十八酰)7-蔗糖 6.8  42.4 十八酰氯 3.2  30  16  1.0  1.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的酰氯摩尔数；S/蔗糖：每
摩尔蔗糖的SO3-吡啶摩尔数。
通过上述实施例#1中所述的TLC方法对一些获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g表#3.1中的蔗糖衍生物与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
如上述实施例#1中所述，在猪身上测定这些制剂中的几种在抗CSFV-E2免疫反应方面的效果。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#3.2。
另外，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗CSFV的抗体滴度。为此，通过将50μl含2.5μg/ml免疫亲和色谱纯CSFV-E2的碳酸缓冲液(pH9.6)分到每个孔里对ELISA板进行涂布，然后于4℃温浴18小时或37℃温浴2小时。用0.02％Tween 20对平板洗涤5次，并用200μl/孔的溶于磷酸盐缓冲液(PBS；pH7.2；0.05M)中的2％(w/v)脱脂牛奶(Difco)进行封闭，然后于37℃温浴1小时。用含2％(w/v)脱脂牛奶的PBS(PBS/SM)对血清样品预稀释10或100倍，并在ELISA平板上以PBS/SM按顺序对50μl预稀释液稀释两倍。接下来，于37℃温浴平板1小时。在用0.02％Tween 20洗涤5个循环之后，向孔中加入50μl含与过氧化物酶(Dako；按厂商说明书进行稀释)共轭的兔抗猪Ig抗血清PBS/SM，并于37℃再次温浴该平板1小时。用0.02％Tween 20洗涤平板10次，并向孔里加入100μl含2，2’-aziono-二-[3-乙基-benzthiazoline磺酸(ABTS)+H2O2(kirkegaard & Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MA)的底物溶液。将平板于20℃温浴1小时并用Titertek Multiscan(ICN/Flow，Oxfordshire，英国)测定405nm的吸收。抗体滴度以血清浓度曲线图线性部分的退化系数对相当于血清样品稀释因子的吸收值(其给出了在ELISA中高于背景值1个吸收单位的最适密度；吸收值0.0至1.4之间的线性化非常明显)来表示。表#3.3和#3.4分别列出了增强免疫3周和12周之后的抗体滴度。
按上述实施例#2中所述方法测定这些制剂对细胞介导的抗CSFV-E2的效应。结果列于表#3.5。
表#3.2
组 疫苗 增强3周后血清中2-logCSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.4  1.2  11
 2  CSFV-E2 (十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 9.8  2.6  916
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-I/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.9  0.5  31,042
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 13.3  2.8  10,240
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10.0  2.1  993
表#3.3
组 疫苗 增强3周后血清中2-log抗-E2 ELISA抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 5.53  1.2  46
 2  CSFV-E2 (十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.05  1.7  2.120
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-I/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.78  1.2  14,067
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 13.05  2.1  11,585
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.24  1.2  2,419
表#3.4
组 疫苗 增强12周后血清中2-log抗-E2 ELISA抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 0.89  0.8  2
 2  CSFV-E2 (十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4.80  1.6  28
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份-I/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 7.69  1.8  207
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 6.51  2.0  91
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4.94  1.0  31
表#3.5
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 ATM  STDEV  ATM  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 2,216  556  3,468  2,657
 2  CSFV-E2 (十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 3,872  3,336  17.195  11,664
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8,306  5,943  22,018  28.194
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4,629  5,939  10,693  9,707
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 3.100  4,400  15,413  22,485
在猪身上测定了几种制剂在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11(下面分别叫做A/Swine和MRC-11)和抗失活假狂犬病病毒(PRV)血清中的抗体反应效应。用有或无佐剂的4.4μg A/Swine、4μg MRC-11和108.3 TCID 50(TCID 50是胞外引起50％组织培养物感染的剂量)的失活PRV(Fort DodgeAnimal Health Holland，Weesp，荷兰；Hilger等，疫苗1994)于0周和3周对动物进行注射。第一次免疫(3周)三周之后和第二次免疫(6周)三周之后，以ELISA测定抗A/Swine和MRC-11的抗体反应。为此，通过将50μl含5μg HA/ml的碳酸缓冲液(pH 9.6)分散到每个孔里，用以蔗糖梯度纯化的流感病毒对ELISA板进行涂布，然后于4℃温浴18小时或37℃温浴2小时。用0.02％Tween20对平板洗涤5次，并用200μl/孔的溶于磷酸盐缓冲液(PBS；pH7.2；0.05M)中的2％(w/v)脱脂牛奶(Difco)进行封闭，然后于37℃温浴1小时。用含2％(w/v)脱脂牛奶的PBS(PBS/SM)对血清样品预稀释10或100倍，并在ELISA平板上以PBS/SM按顺序对50μl预稀释液稀释两倍。接下来，于37℃温浴平板1小时。在用0.02％Tween 20洗涤5个循环之后，向孔中加入50μl含与过氧化物酶(ID-Lelystad；于PBS/SM进行1/2000稀释)共轭的鼠抗猪总IgG单克隆抗体，并于37℃再次温浴该平板1小时。用0.02％Tween 20洗涤平板10次，并向孔里加入100μl含2，2’-连氮-双-[3-乙基-苯并噻唑啉磺酸(ABTS)+H2O2(Kirkegaard & Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MA)的底物溶液。将平板于20℃温浴60分钟并用Titertek Multiscan(ICN/Flow，Oxfordshire，英国)测定405nm的吸收。抗体滴度以血清浓度曲线图线性部分的退化系数对相当于血清样品稀释因子的吸收值(其给出了在ELISA中高于背景值1个吸收单位的最适密度；吸收值0.0至1.4之间的线性化非常明显)来表示。表#3.6和#3.7分别列出了首次免疫(基础)和二次免疫(增加)3周之后的抗体滴度。
在6周，以Hilgers等(疫苗，1994，12，653-660页)所述的病毒中和试验测定抗iPRV的抗体反应。结果列于表#3.8。
按上述实施例#2中所述方法在猪身上测定这些制剂对细胞介导的抗流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11的免疫应答。PBMC受浓度为0.5和1.5μg HA/ml细胞培养基的A/Swine和MRC-11激发。结果分别列于表#3.9和#3.10。
表#3.6
组 疫苗 首次免疫3周后血清中2-log A/Swine ELISA的抗体滴度 增强免疫3周后血清中2-log A/Swine ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数  GMT  STDEV 反对数
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 4.26  0.6  19  7.69  1.3  207
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 9.14  1.4  564  12.03  1.5  4,182
 3 A/Swine+MRC-11 水包矿物油乳液(Suvaxyn；FDAHH) 8.09  1.1  272  10.44  0.8  1,389
表#3.7
组 疫苗 首次免疫3周后血清中2-log MRC-11 ELISA的抗体滴度 增强免疫3周后血清中2-log MRC-11 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数  GMT  STDEV 反对数
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 6.97  0.9  125  10.30  1.1  1,260
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.30  1.0  2,521  14.16  1.3  18,306
 3 A/Swine+MRC-11 水包矿物油乳液(Suvaxyn；FDAHH) 10.55  0.8  1,499  12.93  1.1  7,806
表#3.8
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗-PRV的中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 0.00  0.00  1
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 5.03  1.4  33
 3 A/Swine+MRC-11 水包矿物油乳液(Suvaxyn；FDAHH) 4.07  2.0  17
表#3.9
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 ATM  STDEV  ATM  STDEV
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 15,485  23,017  26,242  26,526
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8,287  7,940  35,467  13,637
 3 A/Swine+MRC-11 水包矿物油乳液(Suvaxyn；FDAHH) 4,312  3,298  21,467  14,822
表#3.10
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 ATM  STDEV  ATM  STDEV
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 12,186  15,108  27,571  27,320
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 15,300  18,333  48,117  40,758
 3 A/Swine+MRC-11 水包矿物油乳液(Suvaxyn；FDAHH) 4,527  3,287  19,882  18,894
实施例#4
如实施例#3中所述，合成各种蔗糖衍生物。所使用的起始材料的量被列于表#4.1。
表#4.1
蔗糖衍生物 蔗糖 酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) 类型 (g) (g) (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(十二酰)8-蔗糖 6.8  35.0 十二酰氯 0.0  30  16  8.0  0
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖 6.8  30.7 十二酰氯 1.6  30  16  7.0  0.5
(硫酸酯)1-(十二酰)6-蔗糖 6.8  26.3 十二酰氯 3.2  30  16  6.0  1.0
(硫酸酯)1.5-(十二酰)5-蔗糖 6.8  21.9 十二酰氯 4.8  30  16  5.0  1.5
(硫酸酯)2-(十二酰)4-蔗糖 6.8  17.5 十二酰氯 6.4  30  16  4.0  2.0
(硫酸酯)2.5-(十二酰)3-蔗糖 6.8  13.1 十二酰氯 8.0  30  16  3.0  2.5
(硫酸酯)3-(十二酰)2-蔗糖 6.8  8.8 十二酰氯 9.4  30  16  2.0  3.0
(硫酸酯)3.5-(十二酰)1-蔗糖 6.8  4.4 十二酰氯 11.0  30  16  1.0  3.5
(硫酸酯)4-蔗糖 6.8  0.0 十二酰氯 12.6  30  16  0.0  4.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的十二酰基氯摩尔数；S/蔗糖：每摩尔蔗糖的SO3-吡啶摩尔数。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g表#4.1中不同的蔗糖衍生物与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
实施例#5
如实施例#3中所述，合成各种蔗糖衍生物，所使用的起始材料的量被列于表#5.1。
表#5.1
蔗糖衍生物 蔗糖 十二酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
# (g) (g) (g) (g) (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(十二酰)8-蔗糖 6.8  35.0  0.0  30  16  8.0  0.0
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 6.8  30.7  3.2  30  16  7.0  1.0
(硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖 6.8  26.3  6.4  30  16  6.0  2.0
(硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖 6.8  21.9  9.5  30  16  5.0  3.0
(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖 6.8  17.5  12.7  30  16  4.0  4.0
(硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖 6.8  13.1  15.9  30  16  3.0  5.0
(硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖 6.8  8.8  19.1  30  16  2.0  6.0
(硫酸酯)7-(十二酰)1-蔗糖 6.8  4.4  22.3  30  16  1.0  7.0
(硫酸酯)8-蔗糖 6.8  0.0  25.4  30  16  0.0  8.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的十二酰基氯摩尔数；S/蔗糖：每摩尔蔗糖的SO3-
吡啶摩尔数。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g表#5.1中的蔗糖衍生物与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2的免疫应答的效应。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#5.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定二次免疫3周和12周后(增强后)的抗体滴度。结果列于表#5.3和#5.4。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#5.5。
表#5.2
 组 疫苗 增强3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.4  1.2
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.9  0.5  31,042
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.7  3.0  13,512
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] ≥15.3  0.0  ≥40,960
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.1  0.4  35,658
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.2  1.4  19,335
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 13.5  2.4  11,332
表#5.3
组 疫苗 增强3周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 5.53  1.2  46
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.78  1.2  14,067
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.96  1.9  7,968
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 13.50  0.7  11,585
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.02  0.4  33,225
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.76  0.7  27,746
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 14.39  1.1  21,469
表#5.4
组 疫苗 增强12周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 0.89  0.8  2
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 7.69  1.8  207
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 5.99  1.7  64
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 5.95  1.5  62
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.70  1.5  416
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.73  0.7  425
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 8.26  1.3  307
表#5.5
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 ATM  STDEV  ATM  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 2,216  556  3,468  2,657
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8,306  5,943  22,018  28,194
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4,524  3,168  17,856  4,218
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8,669  9,617  20,052  10,576
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 24,158  13,512  7,218  2,987
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 1,982  2,264  15,897  11,279
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12,896  15,615  23,204  25,355
通过上述实施例#3中所述的ELISA在猪身上测定这些不同制剂在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗体反应的效应。结果列于表#5.6和#5.7。
表#5.6
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗A/Swine ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  A/Swine+MRC-11 无佐剂 7.69  1.3  207
 2  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.02  0.8  4,153
 3  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.43  0.6  5,518
表#5.7
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗MRC-11 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 10.30  1.1  1,261
 2 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.88  1.2  15,076
 3 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.03  0.8  33,456
实施例#6
如实施例#4中所述，合成各种二糖衍生物，起始材料的量被列于表#6.1。
表#6.1
蔗糖衍生物 二糖 十二酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) 类型 (g) (g) (g) (g) L/糖 S/糖
(十二酰)7-蔗糖 6.8 蔗糖 30.7  0.0  30  16  7.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖 6.8 蔗糖 30.7  1.6  30  16  7.0  0.5
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 6.8 蔗糖 30.7  3.2  30  16  7.0  1.0
(十二酰)7-麦芽糖 7.3 麦芽糖 30.7  0.0  30  16  8.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-麦芽糖 7.3 麦芽糖 30.7  3.2  30  16  8.0  0.5
(硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖 7.3 麦芽糖 30.7  6.4  30  16  8.0  1.0
(十二酰)7-乳糖 7.3 乳糖 30.7  0.0  30  16  8.0  0.0
(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-乳糖 7.3 乳糖 30.7  3.2  30  16  8.0  0.5
(硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖 7.3 乳糖 30.7  6.4  30  16  8.0  1.0
#摩尔比例：L/糖：每摩尔二糖的十二酰基氯摩尔数；S/糖：
每摩尔二糖的SO3-吡啶摩尔数。
麦芽糖＝麦芽糖单水合物(Merck)，乳糖＝α-乳糖单水合物
(Acros)。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备表#6.1中不同的蔗糖衍生物与多乙氧基醚80(ICI)、角鲨烷(Merck)和PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#6.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定二次免疫3周和12周后(增强后)的抗体滴度。结果列于表#6.3和#6.4。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#6.5。
表#6.2
组 疫苗 增强3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.4  1.2  11
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.9  0.5  31,042
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.2  1.7  9,176
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十四酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] ≥15.3  0.0  ≥40,960
表#6.3
组 疫苗 增强3周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 5.53  1.2  46
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.78  1.2  14,067
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.08  1.0  8,659
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.88  0.8  30,153
表#6.4
组 疫苗 增强12周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 0.89  0.8  2
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 7.69  1.8  207
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 6.96  1.1  124
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.48  1.1  357
表#6.5
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV  GMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 2,216  556  3,468  2,657
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8,306  5,943  22,018  28,194
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 2,602  1,508  18,130  12,111
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 6,415  7,392  27,595  24,289
通过上述实施例#3中所述的ELISA在猪身上测定这些不同制剂在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗体反应的效应。结果列于表#6.6和#6.7。
表#6.6
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗A/Swine ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  A/Swine+MRC-11 无佐剂 7.69  1.3  207
 2  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.02  0.8  4,153
 3  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10.80  1.0  1,783
 4  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.34  1.1  2,592
表#6.7
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗MRC-11 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  A/Swine+MRC-11 无佐剂 10.30  1.1  1,261
 2  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.88  1.2  15,076
 3  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.93  0.9  7,804
 4  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖-IV/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.29  1.2  10,016
实施例#7
通过使蔗糖脂肪酸酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)与SO3-吡啶在60℃接触约6小时，合成各种二糖衍生物。起始材料的量被列于表#7.1。
表#7.1
蔗糖衍生物 蔗糖脂肪酸酯L195  SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) (g) (g) L/糖* S/糖
L195  27.8  0  20  0  5.7  0.0
(硫酸酯)1-L195  27.8  3.2  20  0  5.7  1.0
(硫酸酯)2-L195  27.8  6.4  20  0  5.7  2.0
(硫酸酯)2.3-L195  27.8  7.3  20  0  5.7  3.0
#摩尔比例：L/糖＝每摩尔L195的十二酰基氯摩尔数；S/糖＝每摩尔L195的SO3-
吡啶摩尔数。
*参照L195的供应商。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g表#7.1中的蔗糖衍生物、10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#7.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定二次免疫3周和12周后(增强后)的抗体滴度。结果列于表#7.3和#7.4。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#7.5。
表#7.2
组 疫苗 二次接种3周后2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.4  1.2  11
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.5  1.1  23,525
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 13.8  1.3  13,834
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 14.6  0.9  25,631
表#7.3
组 疫苗 二次接种3周后2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 5.53  1.2  46
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.20  1.2  4,705
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.79  1.4  14,165
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 14.18  1.6  18,561
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 14.22  1.0  19,083
表#7.4
组 疫苗 二次接种12周后2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 0.89  0.8  2
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 5.89  0.6  59
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 7.13  0.9  140
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 7.37  1.7  165
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 8.41  1.0  340
表#7.5
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV  AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 2,216  556  3,468  2,657
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 7,157  8,943  18,807  20,879
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 3,104  2,062  18,710  26,432
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 8,310  9,680  29,835  36,351
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 513  932  6,515  5,337
通过上述实施例#3中所述的ELISA在猪身上测定这些不同制剂在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗体反应的效应。结果列于表#7.6和#7.7。
表#7.6
组 疫苗 二次接种3周后2-log抗A/Swine ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  A/Swine+MRC-11 无佐剂 7.69  1.3  207
 2  A/Swine+MRC-11 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.76  1.3  6,937
 3  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 12.78  1.0  7,033
 4  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 12.69  0.5  6,608
 5  A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 12.47  1.1  5,673
表#7.7
组 疫苗 二次接种3周后2-log抗MRC-11 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1 A/Swine+MRC-11 无佐剂 10.30  1.1  1,261
 2 A/Swine+MRC-11 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.76  1.4  27,746
 3 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)1-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.54  1.4  23,822
 4 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)2-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 14.39  0.7  21,469
 5 A/Swine+MRC-11 (硫酸酯)2.3-L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 14.59  0.7  24,662
实施例#8
按上述实施例#1中所述的方法制备40g L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)、10g多乙氧基醚80(ICI)和200gPBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g实施例#5的(硫酸酯)1-(十二酰基)7-蔗糖与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g L195(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#8.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定二次免疫3周和12周后(增强后)的抗体滴度。结果列于表#8.3和#8.4。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#8.5。
表#8.2
组 疫苗 二次接种3周后2-logCSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.4  1.2  11
 2  CSFV-E2 L195/多乙氧基醚80[160/40] 8.7  1.5  403
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/L195(实施例#5)/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.0  3.3  2,104
表#8.3
组 疫苗 二次接种3周后2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 5.53  1.2  46
 2  CSFV-E2 L195/多乙氧基醚80[160/40] 10.32  1.0  1,278
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/L195(实施例#5)/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.21  0.7  37,902
表#8.4
组 疫苗 二次接种12周后2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 0.89  0.8  2
 2  CSFV-E2 L195/多乙氧基醚80[160/40] 4.84  0.9  29
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/L195(实施例#5)/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.41  1.0  340
表#8.5
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂 AMT  STDEV  AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 2,216  556  3,468  2,657
 2  CSFV-E2 L195/多乙氧基醚80[160/40] 8,306  5,943  22,018  28,194
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/L195(实施例#5)/多乙氧基醚80[40/160/40] 3,801  4,775  4,605  2,490
实施例#9
通过使0.02摩尔蔗糖与0.15摩尔油酰氯(Merck)在60℃接触约6小时，合成(油酰)8-蔗糖。该蔗糖衍生物以正己烷进行抽提。通过上述实施例#2中所述的增加温度、减少压力的蒸发方法去除正己烷。通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
制备了3种不同的蔗糖octaoleate酯乳液。按表#9.1中所示的量将(油酰)8-蔗糖、角鲨烷、多乙氧基醚80和PBS-硫柳汞混在一起，并按上述实施例#1中所述方法进行乳化。此外，按表#9.1中所示的角鲨烷、多乙氧基醚80和PBS-硫柳汞的量混在一起，制备无蔗糖octaoleate的角鲨烷/多乙氧基醚80乳液。
表#9.1
乳液 (油酸)8-蔗糖(g) 角鲨烷(g) 多山梨醇酯(g) PBS-硫柳汞(g)
角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 0  40  10  200
(油酸)8-蔗糖/多乙氧基醚80[160/40] 40  0  10  200
(油酸)8-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10  40  10  190
(油酸)8-蔗糖/角鲨烷/多山梨醇酯[80/160/40] 20  20  10  200
按上述实施例#1中所述方法测定表#9.1中乳液对抗CSFV-E2病毒中和抗体反应的效应。SL-CD/角鲨烷浸水(Fort Dodge AnimalHealth Holland，Weesp，荷兰)被包括在内以作参考。结果列于表#9.2。
表#9.2
 组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.64  0.00  13
 2  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 5.36  1.48  41
 3  CSFV-E2 (油酸)8-蔗糖/多乙氧基醚80[160/40] 4.88  1.14  29
 4  CSFV-E2 (油酸)8-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 6.27  1.05  77
 5  CSFV-E2 (油酸)8-蔗糖/角鲨烷/多山梨醇酯[80/160/40] 5.68  2.00  51
 6  CSFV-E2 SL-CD/角鲨烷浸水(Fort Dodge AnimalHealth) 10.44  0.45  1,393
不同佐剂的配制被列于表#9.1。CSFV-E2的剂量为32μg/动物。
实施例#10
将市售的、含4.0和4.4μg HA/剂量的失活流感病毒菌株MRC-11和A/Swine及108.3TCID50/剂量的失活假狂犬病病毒的假狂犬病/流感病毒疫苗(Fort Dodge Animal Health Holland的SuvaxynO/W，Weesp，荷兰)与实施例#1的(硫酸酯)-(十二酰基)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80佐剂配方按体积比100/0、33/66、20/80和10/90混合。将各组猪免疫两次并按Hilgers等(疫苗，1994，12，653-660页)所述的病毒中和试验方法测定抗假狂犬病病毒的抗体反应。结果列于表#10.1。按实施例#3中所述的ELISA测定抗流感病毒菌株A/Swine和MRC-11的抗体反应。结果分别列于表#10.2和#10.3。
表#10.1
组 疫苗组成(体积％) 增强免疫3周后血清中2-logPRV的中和抗体滴度
SyvaxynO/W (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]  GMT  STDEV 反对数
 1  100  0  4.07  2.0  17
 2  33  66  5.54  1.8  47
 3  20  80  1.95  2.1  4
 4  10  90  0.80  1.1  1
表#10.2
组 疫苗组成(体积％) 增强免疫3周后血清中2-logA/Swine ELISA抗体滴度
SyvaxynO/W (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]  GMT  STDEV 反对数
 1  100  0  10.44  0.8  1,389
 2  33  66  12.44  0.7  5,557
 3  20  80  11.43  1.2  2,759
 4  10  90  11.51  1.1  2,916
表#10.3
组 疫苗组成(体积百分比) 增强免疫3周后血清中2-logMRC-11 ELISA抗体滴度
SyvaxynO/W (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]  GMT  STDEV 反对数
 1  100  0  12.93  1.1  7,804
 2  33  66  15.01  0.8  32,996
 3  20  80  14.73  0.8  27,175
 4  10  90  14.74  1.2  27,364
实施例#11
按实施例#1中所述，合成蔗糖衍生物。所用起始材料的量被列于表#11.1。
表#11.1
蔗糖衍生物 蔗糖 酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) (类型) (g) (g) (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 17.1  76.7 十二酰氯 8  74  40  7.0  1.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的酰氯摩尔数；S/蔗糖：每摩尔蔗糖的SO3-吡啶
摩尔数。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备表#10.1中的蔗糖衍生物与多乙氧基醚80(ICI)、角鲨烷(Merck)和PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#1中所述的病毒中和试验测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#11.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定抗体滴度。结果列于表#11.3。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#11.4。
表#11.2
组 疫苗 增强3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.7  0.3  13
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 7.4  3.0  675
 4  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 5.8  1.7  89
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 12.0  1.8  7,424
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40]与抗原分开注射 10.2  3.0  3,787
表#11.3
组 疫苗 增强3周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 2.5  0.7  6
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 6.3  1.8  80
 3  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 3.1  2.4  8.7
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 9.1  1.4  555
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40]与抗原分开注射 7.9  0.9  241
表#11.4
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV  GMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 184  196  325  543
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 2,257  1,389  7,601  7,186
 3  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 1,298  1,324  516  789
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 1,654  760  37,204  28,026
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40]与抗原分开注射 5,195  5,134  14,210  12,003
实施例#12
按实施例#1中所述，合成几种蔗糖衍生物。将蔗糖与十二酰氯(Merck)、癸酰氯(Merck)、十八酰氯(Merck)或十六酰氯(Merck)接触，并与SO3-吡啶接触。所用起始材料的量被列于表#12.1。
表#12.1
蔗糖衍生物 蔗糖 酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) (类型) (g) (g) (g) L/蔗糖 S/蔗糖
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 17.1  76.7 十二酰氯 8  74  40  7.0  1.0
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 17.1  66.8 癸酰氯 8  74  40  7.0  1.0
(硫酸酯)1-(辛酰)7-蔗糖 17.1  56.9 辛酰氯 8  74  40  7.0  1.0
(硫酸酯)1-(己酰)7-蔗糖 17.1  47.1 己酰氯 8  74  40  7.0  1.0
#摩尔比例：L/蔗糖：每摩尔蔗糖的酰氯摩尔数；S/蔗糖：每摩尔蔗糖的SO3-吡啶
摩尔数。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备表#12.1中的蔗糖衍生物与多乙氧基醚80(ICI)、角鲨烷(Merck)和PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。结果列于表#12.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定抗体滴度。结果列于表#12.3。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#12.4。
表#12.2
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-logCSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.7  0.3  13
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 12.0  1.8  7,424
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 14.1  1.6  25,088
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(辛酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 13.4  1.9  17,152
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(己酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 9.7  2.3  2,280
表#12.3
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 2.5  0.7  6
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 9.1  1.4  555
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 11.0  2.0  2,062
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(辛酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 10.1  1.2  1,113
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(己酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 7.9  1.3  243
表#12.4
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV  GMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 184  196  325  543
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 1,654  760  37,204  28,026
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 8,627  7,816  52,791  24,632
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(辛酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 2,995  1,899  33,172  27,272
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(己酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/1600/40] 1,310  547  34,809  31,555
实施例#13
按上述实施例#中所述的方法制备蔗糖酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)、多乙氧基醚80(Merck)、角鲨烷(Merck)、实施例#9中的(油酰)8-蔗糖、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDA；Eastman Kodak公司，Rochester，NY)、聚羧乙烯934PH(BFGoodrich，Cleveland，OH)的制剂。所用起始材料的量被列于表#13.1。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。结果列于表#13.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定抗体滴度。结果列于表#13.3。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#13.4。
表#13.1
乳液 组成
角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 40g角鲨烷+10g多乙氧基醚80+190g PBS-硫柳汞
L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g蔗糖酯L195+40g角鲨烷+10g多乙氧基醚80+190gPBS-硫柳汞
L195/(油酰)8-蔗糖/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g蔗糖酯L195+40g(油酰)8-蔗糖+10g多乙氧基醚80+190g PBS-硫柳汞
L195/DDA/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/160/40] 10g蔗糖酯L195+10g DDA+40g角鲨烷+10g多乙氧基醚80+180g PBS-硫柳汞
L195/聚羧乙烯/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/4/160/40] 10g蔗糖酯L195+1g聚羧乙烯+40g角鲨烷+10g多乙氧基醚80+189g PBS-硫柳汞
表#13.2
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.7  0.3  13
 2  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 5.8  1.7  89
 3  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.0  2.1  18,176
 4  CSFV-E2 L195/(油酰)8-蔗糖/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.1  0.9  312
 5  CSFV-E2 L195/DDA/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/160/40] 11.0  1.7  3,488
 6  CSFV-E2 L195/聚羧乙烯/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/4/160/40] 12.8  0.6  7,424
表#13.3
组 增强免疫3周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 2.5  0.7  6
 2  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 3.1  2.4  9
 3  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 9.0  1.4  495
 4  CSFV-E2 L195/(油酰)8-蔗糖/多乙氧基醚80[40/160/40] 6.4  0.6  84
 5  CSFV-E2 L195/DDA/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/160/40] 9.3  1.3  609
 6  CSFV-E2 L195/聚羧乙烯/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/4/160/40] 9.0  0.7  510
表#13.4
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV  AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 184  196  325  543
 2  CSFV-E2 角鲨烷/多乙氧基醚80[160/40] 1,298  1,324  516  789
 3  CSFV-E2 L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 3,363  2,077  15,626  9,599
 4  CSFV-E2 L195/(油酰)8-蔗糖/多乙氧基醚80[40/160/40] NT  1,629  1,226
 5  CSFV-E2 L195/DDA/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/160/40] 17,145  20,804  34,536  30,990
 6  CSFV-E2 L195/聚羧乙烯/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/4/160/40] NT  46,345  31,655
NT＝未检测
实施例#14
按实施例#1中所述，合成甘露糖衍生物。所用起始材料的量被列于表#14.1。
表#14.1
蔗糖衍生物 甘露糖 酰氯 SO3-吡啶 NMP 吡啶 摩尔比例
(g) (g) (类型) (g) (g) (g) L/麦芽糖 S/麦芽糖
(硫酸酯)1-(十二酰)4-甘露糖 9.0  43.8 十二酰氯 8.0  74  40  4.0  1.0
#摩尔比例：L/甘露糖：每摩尔甘露糖的酰氯摩尔数；S/甘露糖：每摩尔甘露糖的
SO3-吡啶摩尔数。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g表#14.1中的甘露糖衍生物与10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。结果列于表#14.2。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定抗体滴度。结果列于表#14.3。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#14.4。
表#14.2
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-logCSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.7  0.3  13
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)4-甘露糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11.8  1.1  4,352
表#14.3
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 2.5  0.7  6
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)4-甘露糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 8.7  0.9  411
表#14.4
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV  AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 184  196  325  543
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)4-甘露糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4,292  2,503  30,146  26,889
实施例#15
按实施例#1中所述，合成(硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油。将4.6g无水甘油(Merck)溶于无水N-甲基-吡咯酮(Merck)和无水吡啶(Merck)中。加入21.9g的十二酰氯(Merck)并将反应混合物于60℃温浴6小时。加入8.0g SO3-吡啶(Merck)并将反应混合物于室温温浴18小时。将该反应混合物于4℃保持24小时，使其形成两相。收集上相，并以增加温度(＜60℃)、减少压力(＜10mbar)的方法进行蒸发，并于4℃冷凝，直至残留的重量损失小于0.1g/30分钟为止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的(硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油进行分析。
按上述实施例#1中所述的方法制备10g甘油衍生物、10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鲨烷(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。结果列于表#15.1。
以上述实施例#3中所述的ELISA测定抗体滴度。结果列于表#15.2。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#15.3。
表#15.1
组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log CSFV-中和抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 3.7  0.3  13
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 4.8  2.0  51
表#15.2
 组 疫苗 增强免疫3周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 2.5  0.7  6
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 3.9  2.0  15
表#15.3
组 疫苗 刺激指数 刺激指数
首次接种3周后 二次接种3周后
抗原 佐剂配方 AMT STDEV  AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 184  196  325  543
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] NT  2,842  853
NI＝未检测
实施例#16
按上述实施例#1中所述的方法制备1.3g蔗糖酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)、1.3g多乙氧基醚80(Merck)、10.8g角鲨烷(Merck)、237.7g PBS-硫柳汞的制剂。
按上述实施例#1中所述的方法制备1.3g实施例#12中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、1.3g多乙氧基醚80(Merck)、10.8g角角鲨烯(Merck)和238.1g PBS-硫柳汞的制剂。
在猪身上测定了这几种制剂在抗失活人流感病毒菌株A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi血清中的ELISA抗体反应效应。为此，将一剂(0.5ml)市售Solvay药厂(Weesp，荷兰)的流感病毒疫苗INFLUVACTM与1ml任一佐剂配方混合，并对5组猪进行免疫。首次免疫三周后，以实施例#3中所述的ELISA测定抗体反应。通过测定用没有佐剂的Solvay药厂INFLUVACTM二次免疫后的抗体反应，来测定免疫记忆的诱导作用。
首次免疫后抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗体滴度的结果分别列于表#16.1、#16.2和#16.3。无佐剂的二次免疫一周后，抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗体滴度的结果分别列于表#16.4、#16.5和#16.6。无佐剂的二次免疫三周后，抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗体滴度的结果分别列于表#16.7、#16.8和#16.9。
表#16.1
组 疫苗 首次免疫3周后血清中2-log抗-A/Panama ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 4.4  0.8  22
 2  INFLUVAC L195/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.3  0.8  322
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 7.9  0.8  241
表#16.2
组 疫苗 首次免疫3周后血清中2-log抗-A/New Caledonia ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 4.3  0.8  19
 2  INFLUVAC L195/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.0  0.5  259
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.0  1.0  247
表#16.3
组 疫苗 首次免疫3周后血清中2-log抗-B/Yamanashi ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 4.9  0.9  29
 2  INFLUVAC L195/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 9.0  0.5  503
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.7  1.0  411
表#16.4
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-A/Panama ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 5.8  1.4  56
 2  INFLUVAC L195/角角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 10.6  1.6  1,513
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 10.1  1.1  1,061
表#16.5
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-A/New Caledonia ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 5.8  1.3  57
 2  INFLUVAC L195/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 10.9  1.0  1,898
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 10.4  1.2  1,313
表#16.6
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-B/Yamanashi ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 6.3  1.3  81
 2  INFLUVAC L195/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 11.1  1.0  2,260
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 11.9  1  1,868
表#16.7
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-A/Panama ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 5.8  1.8  54
 2  INFLUVAC L195/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 9.2  1.6  573
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.6  1.0  383
表#16.8
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-A/New Caledonia ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 6.1  2.0  70
 2  INFLUVAC L195/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 9.0  0.9  496
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.7  1.2  419
表#16.9
组 疫苗 二次免疫3周后血清中2-log抗-B/Yamanashi ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  INFLUVAC 无佐剂 6.1  1.6  68
 2  INFLUVAC L195/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 9.3  1.1  613
 3  INFLUVAC (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[5/43/5] 8.9  0.9  472
实施例#17
按实施例#1中所述方法，通过使205.2g蔗糖与198g十二酰氯和98g SO3-吡啶接触，合成(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖。该蔗糖酯按上述实施例#2中所述方法用正己烷进行抽提。
按实施例#1中所述方法，通过使23.9g蔗糖与67.5g十二酰氯和45.6g SO3-吡啶接触，合成(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
用角鲨烷(Merck)、角鲨烯(Merck)、十六烷(Acros，Geel，比利时)、三油精(Sigma，St.Louis，MI)、Markol(Esso)、全氟辛基溴化物(perfluorooctylbromide)(Acros)或硅油作为油，多乙氧基醚80(Merck)、多乙氧基醚20(Baker)、L1695(Mitsubishi-Kagaku)、Triton X-100(Sigma)、皂角苷(Fluka，Zwijndrecht，荷兰)或(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖作为乳化剂及PBS-硫柳汞或WFI(ID-Lelystad的注射用水，Lelystad，荷兰)作为水相，按下述表#17.1中所示的量制备(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖佐剂配方。
这些制剂按上述实施例#1中所述方法进行乳化。
表#17.1
乳液 组成
蔗糖酯 油 乳化剂/稳定剂 水相
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烷 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/十六烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g十六烷 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/十六烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g三油精 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/Markol/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40gMarkol 52 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/硅油/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g硅油 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/fluorbron/多乙氧基醚80[40/160/40] 5g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 20gperfluorooctylbromide 5g多乙氧基醚80 95g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10gL1695 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚20[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g多山梨醇酯20 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/Triton X-100[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10gTritonX-100 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/皂角苷[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g皂角苷 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[80/3200/80] 20g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 80g角鲨烷 20g多乙氧基醚80 130g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[120/480/120] 30g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 120g角鲨烷 30g多乙氧基醚80 70g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[160/640/120] 40g(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖 160g角鲨烷 40g多乙氧基醚80 10g WFI
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。1组和2组各有5头猪，3组和10组各有4头猪。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#3中所述的ELISA测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#17.2。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#17.3。
表#17.2
组 疫苗 增强免疫1周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 6.4  2.0  86
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.9  0.9  60,720
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[80/320/80] 16.2  0.8  72,977
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.2  0.8  18,940
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 14.7  1.1  26,489
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖[40/160/40] 12.3  1.1  4,897
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖[80/320/80] 13.4  1.6  10,925
 8  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/Markol/多乙氧基醚80[40/160/40] 15.6  1.2  49,123
 9  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/硅油/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.5  1.5  11,281
 10  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/全氟辛基溴化物/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.4  1.2  11,059
表#17.3
组 疫苗 增强免疫1周后的刺激指数
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 176  95
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 11,719  13,401
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[80/320/80] 7,112  3,247
 4  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 5,557  3,933
 5  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 4,092  2,718
 6  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖[40/160/40] 3,072  3,832
 7  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖[80/320/80] 8,351  3,885
 8  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/Markol/多乙氧基醚80[40/160/40] 7,078  1,428
 9  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/硅油/多乙氧基醚80[40/160/40] 25,760  25,126
 10  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/全氟辛基溴化物/多乙氧基醚80[40/160/40] 19,209  35,430
NT＝未检测
实施例#18
按实施例#1中所述方法，通过使23.9g蔗糖与94g癸酰氯和11.1g SO3-吡啶接触，合成(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖。该蔗糖酯按上述实施例#2中所述方法用正己烷进行抽提。
按实施例#1中所述方法，通过使24g蔗糖与54.4g癸酰氯和45g SO3-吡啶接触，合成(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖。通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。结果列于图#18。
用角鲨烷或角鲨烯作为油，多乙氧基醚80、L1695(Mitsubishi-Kagaku)或(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖作为乳化剂和/或稳定剂及PBS-硫柳汞，按表#18.1中所示的量制备这些蔗糖酯的几种佐剂配方。这些制剂按上述实施例#1中所述方法进行乳化。
表#18.1
乳液 组成
蔗糖酯 油 乳化剂/稳定剂 水相
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烷 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/L1695[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烷 10g L1695 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烷/(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烷 10g(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g多乙氧基醚80 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g L1695 190g PBS-硫柳汞
(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖[40/160/40] 10g(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖 190g PBS-硫柳汞
表#18.1之说明：角鲨烷(Merck)、角鲨烯(Merck)、多乙氧基醚80(Merck)、多乙氧基醚20(Baker)、L1695(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)，WFI为注射用水(ID-Lelystad，Lelystad，荷兰)。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些(几个)制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。1组有5头猪，2组和3组各有4头猪。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#3中所述的ELISA测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#18.2。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#18.3。
表#18.2
组 疫苗 增强免疫1周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 6.4  2.0  86
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 13.6  1.0  12,024
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 14.6  0.5  25,063
表#18.3
组 疫苗 增强免疫1周后的刺激指数
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 176  95
 2  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 2,609  866
 3  CSFV-E2 (硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/L1695[40/160/40] 3,353  2,092
NT＝未检测
实施例#19
用L195(Mitsubishi)、角鲨烯(Merck)、L1695(Mitsubishi)和PBS-硫柳汞或WFI，按表#19.1中所示的量制备制剂。这些制剂按上述实施例#1中所述方法进行乳化。
表#19.1
乳液 组成
蔗糖酯 油 乳化剂/稳定剂 水相
L195/角鲨烯/L1695[40/160/40] 10gL1695 40g角鲨烯 10gL1695 190g PBS-硫柳汞
L195/角鲨烯/L1695[80/320/80] 20gL1695 80g角鲨烯 20gL1695 130g PBS-硫柳汞
L195/角鲨烯/L1695[120/480/120] 30gL1695 120g角鲨烯 30gL1695 70g PBS-硫柳汞
L195/角鲨烯/L1695[160/640/160] 40gL1695 160g角鲨烯 40gL1695 10g WFI
角鲨烯(Merck)、L195和L1695(Mitsubishi-Kagaku)、PBS-硫柳汞和WFI(ID-
Lelystad，Lelystad，荷兰)。
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这两个制剂抗CSFV-E2免疫应答的效应。1组有5头猪，2组和3组各有4头猪。疫苗简单地由一体积佐剂配方和一体积抗原制剂混合制得。按上述实施例#3中所述的ELISA测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#19.2。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#19.3。
表#19.2
组 疫苗 增强免疫1周后血清中2-log抗-E2 ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 6.4  2.0  86
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烯/L1695[40/160/40] 13.0  1.5  8,212
 3  CSFV-E2 L195/角鲨烯/L1695[80/320/80] 13.0  1.5  7,887
表#19.3
组 疫苗 增强免疫1周后的刺激指数
抗原 佐剂配方 AMT  STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 176  95
 2  CSFV-E2 L195/角鲨烯/L1695[40/160/40] 2,949  2,418
 3  CSFV-E2 L195/角鲨烯/L1695[80/320/80] 7,338  4,515
NT＝未检测
实施例#20
按实施例#1中所述方法合成(癸酰)7-蔗糖酯。使23.9g细粉状蔗糖(Merck)与94g癸酰氯(Merck)接触。该蔗糖酯按上述实施例#2中所述方法用正己烷进行抽提。
通过实施例#1中所述的TLC方法对获得的产物进行分析。
按上述实施例#1中所述方法，用(癸酰)7-蔗糖酯、角鲨烯、多乙氧基醚80和PBS-硫柳汞，按表#20.1中所示的量制备这些制剂并进行乳化。
表#20.1
乳液 组成
蔗糖酯 油 乳化剂/稳定剂 水相
(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 10g(癸酰)7-蔗糖 40g角鲨烯 10g L1695 190g PBS-硫柳汞
(癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[120/480/120] 30g(癸酰)7-蔗糖 120g角鲨烯 30g L1695 195g PBS-硫柳汞
按上述实施例#1中所述方法在猪身上测定这些制剂中的一个抗CSFV-E2免疫应答的效应。1组有5头猪，2组有4头猪。按上述实施例#3中所述的ELISA测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#20.2。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#20.3。
表#20.2
组 疫苗 增强免疫1周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
抗原 佐剂配方 GMT  STDEV 反对数
 1  CSFV-E2 无佐剂 6.4  2.0  86
 2  CSFV-E2 (癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 14.1  1.4  17,604
表#20.3
组 疫苗 增强免疫1周后的刺激指数
抗原 佐剂配方 AMT STDEV
 1  CSFV-E2 无佐剂 176  95
 2  CSFV-E2 (癸酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 3,023  2,647
NT＝未检测
实施例#21
研究了首次免疫和二次免疫之间的时间间隔对免疫应答的影响。用实施例#17的CSFV-E2+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40]，以间隔三周(第0周和第3周)和间隔两周(第1周和第3周)对几组猪免疫两次。按上述实施例#3中所述的ELISA测定血清中抗CSFV的抗体滴度。结果列于表#21.1。
按上述实施例#2中所述的淋巴细胞增殖试验测定细胞介导的抗CSFV的应答。结果列于表#21.2。
表#21.1
组 疫苗：CSFV-E2+实施例17的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烯/多乙氧基醚80[40/160/40] 增强免疫1周后血清中2-log抗-E2ELISA的抗体滴度
首次免疫 二次免疫 GMT  STDEV 反对数
 1 第0周 第3周 12.3  1.1  4,897
 2 第1周 第3周 11.2  1.1  2,327
表#21.2
组 疫苗 增强免疫1周后的刺激指数
首次免疫 二次免疫 AMT  STDEV
 1 第0周 第3周 3,072  3,832
 2 第1周 第3周 3,439  1,803
实施例#22
按实施例#13中所述方法制备的L195//角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]佐剂配方与相似体积的含3μg/ml口蹄疫病毒菌株O/Taiwan的抗原溶液混合。用2ml疫苗对3组猪免疫两次。按vanMaanen和Terpstra所述的病毒中和抗体检测(免疫方法杂志，1989，124，111-119页)以不同时间间隔测定抗O/Taiwan病毒中和抗体反应。
结果列于表#22.1。
表#22.1
10log抗-O/Taiwan的抗体滴度
组 首次免疫 二次免疫 10天 17天 24天 28天
GMT  STDEV  GMT  STDEV  GMT  STDEV  GMT  STDEV
 1  0天 无增强剂 0.90  0.46  0.55  0.23  0.58  0.22  0.65  0.31
 2  0天 3天 1.80  0.45  2.05  0.17  1.70  0.38  1.60  0.23
 3  0天 7天 1.35  0.26  1.35  0.45  1.20  0.52  1.10  0.23
 4  0天 14天 0.75  0.15  0.90  0.52  2.05  0.43  2.00  0.62
 5  0天 21天 1.45  0.38  1.45  0.38  1.30  0.38  2.80  0.61
实施例#23
按实施例#1中所述方法对160g L195、640g角鲨烷、160g多乙氧基醚80和40g注射用水(L195/角鲨烷/多乙氧基醚80[160/640/160])佐剂配方进行乳化。用一体积的该佐剂配方与一体积含3μg/ml口蹄疫病毒菌株O/Taiwan的抗原溶液混合。用2ml疫苗对5组猪免疫一次并按实施例#22中所述方法以不同时间间隔测定抗体反应。结果列于表#23.1。
表#23.1
接种后不同时间间隔10log抗-O/Taiwan的抗体滴度
0天 7天 14天 21天 28天
GMT  STDEV  GMT  STDEV  GMT  STDEV  GMT  STDEV  GMT  STDEV
＜0.3  ND  0.81  0.57  1.83  0.33  1.44  0.31  1.32  0.33
实施例#24
将实施例#2中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]佐剂与按Oonk等(疫苗，1998，16，1074-1082)所述制备的、与卵清蛋白共轭的促性腺释放激素肽(G6k-GnRH-串联-二聚体-OVA缀合物)混合。用187μg G6k-GnRH-串联-二聚体-OVA缀合物+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]对10头猪(第一组)免疫两次，并用无抗原的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40]对5头猪(第二组；对照)免疫。以第10周首次免疫和第17周二次免疫之后不同的时间间隔，用购自Amersham医药生物技术公司(Buckinghamshire，英格兰)的碘化GnRH，按Meloen等(疫苗，1994，12，741-746)所述的RIA方法测定血清样品(1/2000稀释)中抗GnRH的抗体滴度。结果列于表#24.1。按Meloen等(疫苗，1994，12，741-746)所述方法测定第24周的睾丸重量。结果列于表#24.2。
表#24.1
组 疫苗 接种后不同时间间隔抗-GnRH的抗体滴度
10周 14周 17周 20周 24周
AMT  STDEV  AMT  STDEV  AMT  STDEV  AMT  STDEV  AMT  STDEV
 1 G6k-GnRH-串联二聚体OVA缀合物+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80  0.0  0.0  5.4  5.6  3.4  3.2  67.5  31.5  51.4  29.2
 2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80  NT  NT  NT  0.5  0.3  NT
NT＝未检测。
表#24.2
组 疫苗 睾丸重量(g)
24周
平均值 STDEV
 1 G6k-GnRH-串联二聚体OVA缀合物+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80  77.2  79.1
 2 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III/角鲨烷/多乙氧基醚80  227.6  59.2
实施例#25
将实施例#17的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、角鲨烷、多乙氧基醚80和PBS-硫柳汞按表#25.1中所列的量混合，制备佐剂配方。这些混合物按实施例#1中所述的方法进行乳化。
表#25.1
乳液 (硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/ 角  鲨烷 多乙氧基醚80  PBS-硫柳汞
(g) (g) (g) (g)
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/多乙氧基醚80[40/20] 10  0  5  235
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/多乙氧基醚80[40/40] 10  0  10  230
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/20/20] 10  5  5  230
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/20/40] 10  5  10  225
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/40/40] 10  10  10  220
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/80/40] 10  20  10  210
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/160/40] 10  40  10  190
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/320/40] 10  80  10  150
(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80[40/320/80] 10  80  20  140
实施例#26
将10g实施例#17的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、10g多乙氧基醚80(Baker)和230ml 3w/v％氢氧化铝悬液(Alhydrogel ofSuperfos Biosector a/s，Vedbaeck，丹麦)混合，制备佐剂配方。
图例
图1a：按实施例#1所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#1的(十二酰)7-蔗糖；
3道：实施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖；
4道：实施例#1的(十二酰)-蔗糖；
5道：实施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)5-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图1b：按实施例#1所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#1的(十二酰)3-蔗糖；
3道：实施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)3-蔗糖；
4道：实施例#1的(十二酰)1-蔗糖；
5道：实施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)1-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图2a：按实施例#3所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#3的(十二酰)7-蔗糖；
3道：实施例#3的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖；
4道：实施例#3的(十四酰)7-蔗糖；
5道：实施例#3的(硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图2b：按实施例#3所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#3的(十六酰)7-蔗糖；
3道：实施例#3的(硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖；
4道：实施例#3的(十八酰)7-蔗糖；
5道：实施例#3的(硫酸酯)1-(十八酰)7-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图3a：按实施例#4所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#4的(十二酰)8-蔗糖；
3道：实施例#4的(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖；
4道：实施例#4的(硫酸酯)1.0-(十二酰)6-蔗糖；
5道：实施例#4的(硫酸酯)1.5-(十二酰)5-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图3b：按实施例#4所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#4的(硫酸酯)2.0-(十二酰)4-蔗糖；
3道：实施例#4的(硫酸酯)2.5-(十二酰)3-蔗糖；
4道：实施例#4的(硫酸酯)3.0-(十二酰)2-蔗糖；
5道：实施例#4的(硫酸酯)3.5-(十二酰)1-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图4a：按实施例#5所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#5的(十二酰)8-蔗糖；
3道：实施例#5的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖；
4道：实施例#5的(硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖；
5道：实施例#5的(硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图4b：按实施例#5所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#5的(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖；
3道：实施例#5的(硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖；
4道：实施例#5的(硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖；
5道：实施例#5的(硫酸酯)7-(十二酰)1-蔗糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图5：按实施例#6所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#6的(十二酰)7-麦芽糖；
3道：实施例#6的(硫酸酯)1-(十二酰)7-麦芽糖；
4道：实施例#6的(十二酰)7-乳糖；
5道：实施例#6的(硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图6：按实施例#7所述方法制备的衍生物的薄层色谱。
1道(左)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III；
2道：实施例#7的L195；
3道：实施例#7的(硫酸酯)1-L195；
4道：实施例#7的(硫酸酯)2-L195；
5道：实施例#7的(硫酸酯)2.3-L195；
6道(右)：实施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖组份III。
图7：本发明蔗糖衍生物的化学结构，其中R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3和R’4是H或-O-S(＝O)(＝O)-OR(其中R是H、Na、K或NH4)或-O-C(＝O)(-CH2)n-CH3(其中n在6到24之间)。
图8-12：肌内注射含本发明佐剂，尤其是(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鲨烷/多乙氧基醚80乳液，的CSFV-E2疫苗(实施例#2的第5组)3周(a)和6周(b)后，5头动物中局部反应的宏观表现。对轻微的纤维化和水肿进行了记录。
图13-17：肌内注射含矿物油包水浸水佐剂的CSFV-E2疫苗(实施例#2的第10组)3周(a)和6周(b)后，5头动物中局部反应的宏观表现。对Granumola、脓肿和坏死进行了记录。
参考文献
1.Hilgers等，免疫1986，60，141-146页。
2.Hilgers等，疫苗1994a，12，653-660页。
3.Hilgers等，疫苗1994b，12，661-665页。
4.Hilgers等，疫苗1999，17，219-228页。
5.Mashihi等，EP-A-0 295 749。
6.Higers & Platenburg.EP 0549074(EP 92/204034)。
7.Higers，WO 96/20222或BE 95/00120(SL-CD作为新的化学实体)。
8.Higers，WO 96/20008(SL-CD/角鲨烷作为佐剂)。
9.Nigam等，癌症研究1978，38，3315-3312页。
10.Nigam等，大英癌症杂志1982，46，782-793。
11.美国专利第3,432,489号。
12.WO 90/02133
13.Bonaventura等，国际免疫药学杂志1984，6，259-267页。
14.Behling等，免疫学杂志1976，117，847-851页。
15.Azuma EP 1,572,368(1977)。
16.Nishikawa等，化学医药公告1981，29，505-513页。
17.Bazin等，碳水化合物研究1998，309，189-205页。

Claims (30)

1.单糖或二糖衍生物，所说的衍生物具有至少一个但不多于N-1个脂肪酸酯基团，其中N是衍生该衍生物的单糖或二糖的羟基数目。
2.权利要求1所述的单糖或二糖衍生物，其进一步包括至少一个但不多于N-1个阴离子基团，其中脂肪酸酯和阴离子基团的组合数不超过N。
3.权利要求2所述的单糖或二糖衍生物，其具有至少2个、优选至少3个但不多于N-1个脂肪酸基团并且具有至少1个但不多于N-2个、优选不多于N-3个阴离子基团。
4.权利要求3所述的单糖或二糖衍生物，其具有至少4个但不多于N-1个脂肪酸基团并且具有至少1个但不多于N-3个、优选不多于N-4个阴离子基团。
5.前述任何一项权利要求所述的衍生的单糖，其具有至少一个阴离子基团和至少两个脂肪酸酯，其中阴离子基团和脂肪酸酯的总数在3-5范围内。
6.权利要求1-4中任何一项所述的衍生的二糖，其具有至少一个阴离子基团、优选1或4个阴离子基团，和至少一个脂肪酸酯，其中阴离子基团和脂肪酸酯的总数在6-9范围内、优选7或8个。
7.权利要求1-5中任何一项所述的单糖衍生物，其衍生自具有C5H10O5通式的戊糖或具有C6H12O6通式的己糖。
8.权利要求1-5或7中任何一项所述的单糖衍生物，其中该单糖衍生物来自N是3或4的单糖。
9.权利要求1-4或6中任何一项所述的二糖衍生物，其来自具有通式C12H22O10的二糖。
10.前述任何一项权利要求所述的单糖或二糖衍生物，其衍生自allolose、altriose、果糖、半乳糖、葡萄糖、古罗糖、肌醇、甘露糖、山梨糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、松二糖、蜜二糖。
11.权利要求2-10中任何一项所述的单糖或二糖衍生物，其中至少一个阴离子基团为具有通式-SO2-OR的硫酸酯，或具有通式-PO2-(OR)2的磷酸酯，其中R为单价阳离子。
12.权利要求11所述的单糖或二糖衍生物，其中任何一个R都独立地选自H+、K+、Na+、Li+和NH4 +。
13.前述任何一项权利要求所述的单糖或二糖衍生物，其中每一个脂肪酸酯基团由通式-O-C(＝O)-(CH2)x-CH3、其中x至少是4，-OC(＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3、其中x+y至少是4并优选不多于24，或-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3、其中x+y+z在2到20之间代表。
14.权利要求13所述的单糖或二糖衍生物，其中每一个脂肪酸酯基团由通式-OC(＝O)-(CH2)x-CH3、其中x在6到14之间代表。
15.权利要求13所述的单糖或二糖衍生物，其中每一个脂肪酸酯基团由通式-OC(＝O)-(CH2)x-CH3、其中x是6或8或10或12代表。
16.前述任何一项权利要求所述单糖或二糖衍生物作为佐剂的用途。
17.佐剂配方，其含有权利要求1-15任何一项所述的单糖或二糖衍生物(I)、与水不互溶的液相(II)、乳化剂或稳定剂(III)和任选地水相(IV)。
18.权利要求17所述的佐剂配方，其中该与水不互溶的液相(II)为油。
19.权利要求17或18所述的佐剂配方，其中该与水不互溶的液相(II)为角鲨烷、角鲨烯、矿物油、植物油、十六烷、碳氟化合物或硅油。
20.权利要求17-19中任何一项所述的佐剂配方，其中该乳化剂或稳定剂(III)为亲水-亲脂平衡值大于10的非离子去污剂、糖脂肪酸酯或亲水-亲脂平衡值大于10的阴离子去污剂。
21.权利要求17-20中任何一项所述的佐剂配方，其中该乳化剂或稳定剂(III)为权利要求1-15中任何一项所述的单糖或二糖衍生物。
22.佐剂配方，其含有权利要求1-15中任何一项所述的单糖或二糖衍生物(I)、与水不互溶的固相(V)和任选地水相(IV)。
23.权利要求22所述的佐剂配方，其中该与水不互溶的固相(V)为不溶盐。
24.权利要求23所述的佐剂配方，其中该不溶盐为铝或钙盐，优选氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、二氧化硅或其混合物。
25.含有权利要求1-15中任何一项所述单糖或二糖衍生物或权利要求17-24中任何一项所述佐剂配方，另外还包括抗原组份的疫苗。
26.制备权利要求1-15中任何一项所述单糖或二糖衍生物的方法，其中该单糖或二糖按顺序或同时与酰氯和磺化剂反应。
27.权利要求26所述的方法，其中该单糖或二糖首先与酰氯并与磺化剂在环境温度中反应，接下来将单糖或二糖、酰氯和磺化剂的混合物的温度提升至约50-70℃。
28.权利要求26或27所述的方法，其中所说的酰氯为己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯、十四酰氯、十六酰氯、十八酰氯、油酰氯或其混合物。
29.权利要求26-28中任何一项所述的方法，其中该磺化剂选自气态SO3、HClSO3、SO3-吡啶、SO3-2-甲基吡啶、SO3-2，6-二甲基吡啶、SO3-二甲基甲酰胺、SO3-三甲胺、SO3-三乙胺、SO3-二甲基苯胺、SO3-N-乙基吗啉、SO3-二乙基苯胺、SO3-二噁烷或其混合物。
30.权利要求1-15中任何一项所述的单糖或二糖衍生物作为乳化剂的用途。
CNB00818691XA 1999-11-30 2000-11-30 单糖和二糖衍生物 Expired - Lifetime CN100345592C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99204044.4 1999-11-30
EP99204044A EP1104767A1 (en) 1999-11-30 1999-11-30 Mono- and disaccharide derivatives containing both fatty acid ester and sulfate ester groups

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007101271975A Division CN101108250B (zh) 1999-11-30 2000-11-30 单糖和二糖衍生物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1433423A true CN1433423A (zh) 2003-07-30
CN100345592C CN100345592C (zh) 2007-10-31

Family

ID=8240940

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB00818691XA Expired - Lifetime CN100345592C (zh) 1999-11-30 2000-11-30 单糖和二糖衍生物
CN2007101271975A Expired - Lifetime CN101108250B (zh) 1999-11-30 2000-11-30 单糖和二糖衍生物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007101271975A Expired - Lifetime CN101108250B (zh) 1999-11-30 2000-11-30 单糖和二糖衍生物

Country Status (12)

Country Link
US (5) US20030220270A1 (zh)
EP (2) EP1104767A1 (zh)
JP (1) JP5025869B2 (zh)
CN (2) CN100345592C (zh)
AT (1) ATE388160T1 (zh)
AU (1) AU779904B2 (zh)
CA (1) CA2393072C (zh)
DE (1) DE60038248T3 (zh)
DK (1) DK1233969T4 (zh)
ES (1) ES2300285T3 (zh)
PT (1) PT1233969E (zh)
WO (1) WO2001040240A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103154013A (zh) * 2010-06-11 2013-06-12 爱木诺公司 三糖衍生物以及它们作为佐剂的用途
CN104884042A (zh) * 2012-12-14 2015-09-02 英特维特国际股份有限公司 含有非活的药用物质的乳剂
CN104892694A (zh) * 2015-05-24 2015-09-09 广西师范学院 蔗糖硫酸酯铜类化合物及其制作方法和用途
CN104926889A (zh) * 2015-05-24 2015-09-23 广西师范学院 蔗糖硫酸酯铜银类化合物及其制作方法和用途
CN107075085A (zh) * 2014-08-22 2017-08-18 蒙彼利埃大学 多糖苷脂肪酸多元酯衍生物

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2591786B1 (en) 2003-10-16 2017-04-12 Cancure Limited Immunomodulating compositions and uses therefor
AU2011211337B2 (en) * 2003-10-16 2014-10-02 Cancure Limited Immunomodulating compositions and uses therefor
FR2878746B1 (fr) 2004-12-02 2007-02-23 Vetoquinol Sa Sa Nouvelle composition pharmaceutique utilisable dans le domaine des vaccins
US8850964B2 (en) 2005-10-20 2014-10-07 Conagra Foods Rdm, Inc. Cooking method and apparatus
US9211030B2 (en) 2005-10-20 2015-12-15 Conagra Foods Rdm, Inc. Steam cooking apparatus
US8302528B2 (en) 2005-10-20 2012-11-06 Conagra Foods Rdm, Inc. Cooking method and apparatus
US9132951B2 (en) 2005-11-23 2015-09-15 Conagra Foods Rdm, Inc. Food tray
CA2527770C (en) 2005-11-21 2014-07-22 Steven M. Parsons Food tray
MX2009009239A (es) 2007-03-02 2009-09-08 Conagra Foods Rdm Inc Sistema de empaquetado de componente multiple.
US20100015293A1 (en) * 2007-03-02 2010-01-21 Conagra Foods Rdm, Inc. Multi-component packaging system and apparatus
US8613249B2 (en) 2007-08-03 2013-12-24 Conagra Foods Rdm, Inc. Cooking apparatus and food product
TW200927928A (en) * 2007-09-24 2009-07-01 Nobilon Internat B V Inactivated influenza vaccine
TW201010719A (en) * 2008-08-19 2010-03-16 Wyeth Corp Immunological composition
USD680426S1 (en) 2012-06-12 2013-04-23 Conagra Foods Rdm, Inc. Container
USD717162S1 (en) 2012-06-12 2014-11-11 Conagra Foods Rdm, Inc. Container
US9027825B2 (en) 2012-06-12 2015-05-12 Conagra Foods Rdm, Inc. Container assembly and foldable container system
CA2954740C (en) 2014-07-11 2022-10-18 National Research Council Of Canada Sulfated-glycolipids as adjuvants for vaccines
AU2015294769B2 (en) * 2014-07-24 2020-07-16 Litevax B.V. Adjuvants
SG11201903890QA (en) * 2016-11-04 2019-05-30 Baxalta Inc Adeno-associated virus purification methods
CA3083576A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Hawaii Biotech, Inc. Filovirus vaccine and methods of use

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS533514A (en) 1976-06-25 1978-01-13 Ichirou Azuma Adjuvant containing sugarlipid as effective component
US4243663A (en) * 1976-06-25 1981-01-06 Ichiro Azuma Glycolipid compositions for transplanted tumor immunotherapy
EP0143840B1 (en) † 1983-05-06 1990-08-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Monosaccharide compounds having immunostimulating activity
GR860379B (en) † 1985-02-22 1986-06-11 Akzo Nv Novel disaccharide and trisaccharide derivatives of the lipid a type
US4746742A (en) † 1985-11-28 1988-05-24 Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A
EP0295749A1 (en) * 1987-06-15 1988-12-21 Duphar International Research B.V Sulpholipopolysaccharides as stimulators of the non-specific defence mechanism
US4912094B1 (en) † 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3941061A1 (de) * 1989-12-13 1991-06-20 Henkel Kgaa Fettsaeuresorbitanestersulfate
GB9105992D0 (en) † 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP3723231B2 (ja) * 1991-12-23 2005-12-07 ディミナコ アクチェンゲゼルシャフト アジュバント
SG48309A1 (en) † 1993-03-23 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
AU3191495A (en) * 1994-08-09 1996-03-07 Nisshin Oil Mills, Ltd., The Peroral immunogen composition and process for producing the same
BE1008978A5 (fr) * 1994-12-27 1996-10-01 Solvay Adjuvants pour vaccins.
US5814321A (en) * 1995-11-30 1998-09-29 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Oil adjuvant vaccine and method for preparing same
CA2211949A1 (en) * 1997-07-21 1999-01-29 David Farley Johnson Nonaqueous compositions for parenteral administration
SG102614A1 (en) † 2001-02-24 2004-03-26 Urah Resources Nigeria Ltd Solvent-free trans-acidolysis process for the preparation of edible surface-active carbohydrate fatty-acid esters

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103154013A (zh) * 2010-06-11 2013-06-12 爱木诺公司 三糖衍生物以及它们作为佐剂的用途
CN103154013B (zh) * 2010-06-11 2017-03-15 爱木诺公司 三糖衍生物以及它们作为佐剂的用途
CN104884042A (zh) * 2012-12-14 2015-09-02 英特维特国际股份有限公司 含有非活的药用物质的乳剂
CN107075085A (zh) * 2014-08-22 2017-08-18 蒙彼利埃大学 多糖苷脂肪酸多元酯衍生物
CN107075085B (zh) * 2014-08-22 2019-07-09 蒙彼利埃大学 多糖苷脂肪酸多元酯衍生物
CN104892694A (zh) * 2015-05-24 2015-09-09 广西师范学院 蔗糖硫酸酯铜类化合物及其制作方法和用途
CN104926889A (zh) * 2015-05-24 2015-09-23 广西师范学院 蔗糖硫酸酯铜银类化合物及其制作方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1233969A2 (en) 2002-08-28
CA2393072A1 (en) 2001-06-07
AU2558601A (en) 2001-06-12
AU779904B2 (en) 2005-02-17
ES2300285T3 (es) 2008-06-16
US20050256060A1 (en) 2005-11-17
EP1104767A1 (en) 2001-06-06
EP1233969B1 (en) 2008-03-05
EP1233969B2 (en) 2016-12-14
CN101108250A (zh) 2008-01-23
US8052981B2 (en) 2011-11-08
PT1233969E (pt) 2008-04-17
US20120288528A1 (en) 2012-11-15
US20110305730A1 (en) 2011-12-15
CN101108250B (zh) 2012-01-11
US20030220270A1 (en) 2003-11-27
US20090304723A1 (en) 2009-12-10
DE60038248D1 (de) 2008-04-17
DE60038248T2 (de) 2009-03-12
WO2001040240A2 (en) 2001-06-07
CA2393072C (en) 2009-05-26
DE60038248T3 (de) 2017-05-18
DK1233969T3 (da) 2008-06-09
DK1233969T4 (en) 2017-03-20
JP2003515542A (ja) 2003-05-07
CN100345592C (zh) 2007-10-31
US8637659B2 (en) 2014-01-28
ATE388160T1 (de) 2008-03-15
JP5025869B2 (ja) 2012-09-12
WO2001040240A3 (en) 2002-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100345592C (zh) 单糖和二糖衍生物
CN1230151C (zh) 通过皮肤的非侵入性接种的透皮疫苗
CN1181086C (zh) 氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯化合物及其作为佐剂和免疫效应物的用途
CN86104185A (zh) N-(2-氨基酰氨基-2-去氧-己糖基)-酰胺类、氨基甲酸酯类和一脲类的制备工艺及其医药用途
CN1055093C (zh) 葡糖胺二糖类、其制备方法和用途、以及含有这些二糖的药物组合物
CN1248736C (zh) 疫苗组合物
CN1028106C (zh) 嘌呤核苷的制备方法
CN100350972C (zh) 含有铝佐剂和组氨酸的疫苗
CN1703427A (zh) 通过同时加载和激活抗原呈递细胞的选定的亚型产生并且控制t细胞的效应物谱的方法和组合物
CN1220483C (zh) 毫微分散体在药物最终制剂中的用途
CN1162144C (zh) 紫外线吸收性组合物
JP5538725B2 (ja) 新規糖脂質アジュバント組成物
CN1096032A (zh) 新的活性化合物
CN1753864A (zh) 用捕捉糖链的分子纯化/浓缩糖链的方法和分析糖链结构的方法
CN1681529A (zh) 免疫组合物及其诊断和治疗用途
CN1758900A (zh) 药物组合物
CN1243759C (zh) 聚亚烷基氧改性的磷脂及其制备方法
CN1798563A (zh) 免疫刺激剂
CN1863811A (zh) 稳定的维生素b6衍生物
CN1905896A (zh) 增强皮内隔室中的免疫反应的方法和其中使用的化合物
CN1771054A (zh) 改进的疫苗
CN1230184C (zh) 以细菌的菌体成分为有效成分的癌免疫治疗用制剂
CN1360507A (zh) 缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途
CN1251112A (zh) 具有胆汁酸吸收作用的交联乙烯基聚合物
CN1404398A (zh) 用于生产型动物的改良dna疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CI02 Correction of invention patent application

Correction item: Inventor

Correct: Hilgers Lucas Alfonsus Theodor|Blom Anneke Georgine

False: Schneider Giovanni Bloom

Number: 31

Page: The title page

Volume: 19

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: SI BOSEJIDALA GELIGELUOWA TO: LUKASIA SITE AO MULTI-PARTY REPAIR ERGE SI LU SIXI BOSEJIDALA GELIGELUOWA

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PROSSER FELIX MOLECULE DESIGN CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: COVACCINE B.V.

Effective date: 20090522

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20090522

Address after: British diesel

Patentee after: Molecular Design Co Ltd

Address before: Holland Lelystad

Patentee before: Covaccine B. V.

C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: PROTHERICS MEDICINES DEVELOPMENT LIMITED

Free format text: FORMER NAME: PROTHERICS MOLECULAR DESIGN CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: London, England

Patentee after: Protherics Medicines Dev Ltd.

Address before: British diesel

Patentee before: Molecular Design Co Ltd

CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20071031