CN103154013A - 三糖衍生物以及它们作为佐剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有取代的三糖核和任选的一个或多个阴离子基团的三糖衍生物作为佐剂的用途，所述三糖核被脂肪酸酯基团完全取代，涉及所述三糖衍生物，涉及制备所述三糖的方法，涉及由所述方法得到的三糖，涉及含有所述三糖衍生物的佐剂组合物以及涉及含有所述佐剂组合物的疫苗或试剂盒。

Description

三糖衍生物以及它们作为佐剂的用途
技术领域
本发明涉及新的三糖衍生物和它们作为佐剂的用途，所述三糖衍生物含有取代的三糖核和任选的一个或多个阴离子基团，所述三糖核被脂肪酸酯基团完全取代，本发明还涉及一种用于制备这些三糖衍生物的方法、通过该方法得到的三糖以及佐剂在疫苗中的用途。
背景技术
抗体为身体的血液和其它体液中以及组织中所含的物质，所述抗体能够与抗原结合而使其变得无害。抗体构成身体的天然防御机理之一。它们是高度特异性的，并且它们能够灭活、结合或使抗原变得无害，所述抗原能够诱导抗体的形成。
因此，与免疫系统接触的抗原激活复杂的系列细胞间相互作用，以消除抗原和/或再次建立之前的平衡。
抗原的两个特性是它们的免疫原性和它们的抗原性，免疫原性为它们诱导体内免疫响应(包括形成特异性抗体)的能力，抗原性为它们被起源为抗原的抗体选择性识别的能力。
已知如何借助疫苗通过用特异性抗原进行给药特意地刺激免疫响应。该处理促使生物体中保留了免疫响应状态，从而使得在与抗原的随后的接触过程中，生物体能够产生更快速和更有效的响应。
然而，一些抗原仅具有微弱的免疫原性，并且它们诱导不充分的免疫响应以产生对生物体的有效保护。如果抗原与佐剂一起共同给药（co-administered），可以显著地改进该免疫原性。
佐剂为增强抗原的免疫响应的物质，但是本身不需要具有免疫原性。通过保留抗原在局部给药部位附近，佐剂可起作用，以产生促进免疫系统的细胞缓慢、持续地释放抗原的持久效应（depot effect）。佐剂也可引起免疫系统的细胞进行抗原贮存（antigen depot）和刺激这些细胞引发免疫响应。
多年以来，佐剂已用于改进对例如疫苗的宿主免疫响应。内在的佐剂（Intrinsic adjuvants）通常为用作疫苗的灭活的或减毒的细菌的组分。外在的佐剂（Extrinsic adjuvants）为通常与抗原非共价连接并且制备成能够增强宿主免疫响应的免疫调节剂。
氢氧化铝和磷酸铝(统称为明矾)在人和兽的疫苗中是常规使用的佐剂。充分验证了明矾在提高白喉和破伤风类毒素的抗体响应的效力，且最近，HBsAg疫苗使用明矾作为佐剂。
大量的外在的佐剂可激发对抗原的免疫响应。这包括与膜蛋白抗原络合的皂角苷(免疫刺激络合物)、含有矿物油的普卢兰尼克聚合物（pluronicpolymers with mineral oil）、在矿物油中的灭活的分枝杆菌、弗氏完全佐剂、细菌产物例如胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)。
已研究了化学意义上的佐剂例如单磷酰基脂质A（monophosphoryl lipidA）、磷脂缀合物(参见Goodman-Snitkoff等人，J.Immunol.147:410-415(1991)使用脂蛋白体包封蛋白(参见Miller等人，J.Exp.Med.176:1739-1744(1992))。
还已评价合成的聚合物作为佐剂。这包括乳酸和乙二醇酸的均聚物和共聚物，它们已用于制备包封抗原的微球体(参见Eldridge等人，Mol.Immunol.28:287-294(1993))。
非离子嵌段共聚物为待评价的另一种合成的佐剂。已研究低分子量共聚物在基于油的乳液中的佐剂影响(参见Hunter等人，The Theory and ParticalApplication of Adjuvants(佐剂的理论和实际应用)(编辑Stewart-Tull，D.E.S.)John Wiley和Sons，NY.第51-94页(1995))和高分子量共聚物在含水制剂中的佐剂影响(Todd等人，Vaccin15:564-570(1997))。
理想佐剂的期望特性是缺少毒性和刺激长期持久的免疫响应的能力。在人类中最常用的佐剂之一为明矾。其它佐剂例如皂角苷、Quil A和油包水型佐剂、含有灭活的结节杆菌的弗氏(弗氏完全)佐剂或不含杆菌的弗氏(弗氏不完全)佐剂，由于它们的毒性作用而对人使用时是受限的；并且对动物的不良影响使人们更为担忧。
简单地说，已描述许多佐剂制剂，但是大多数从未接受用于常规疫苗，并且很少已被批准用于人类。这主要是由于它们的毒性。例如，在某些动物疫苗中用作佐剂的矿物油不容易降解并且在注射部位存留，从而引起不可接受的肉芽肿；并且，由于在注射部位贮存形成（depot formation），通常佐剂制剂(例如矿物化合物油乳液、脂质体和可生物降解的聚合物微球体)会引起局部反应。
目前在人疫苗中批准使用的佐剂的实例包括明矾、MF59(水包油型乳液)、MPL(糖脂)、VLR、免疫增强性重组流感病毒颗粒(IRIV)和霍乱毒素(参见Reed等人，Trends in Immunology30:23-32(2008))。
本领域已知的一组佐剂为所谓的磺基脂多糖（sulpholipopolysaccharides），即，含有脂肪酸酯和硫酸酯的多糖(Hilgers等人，Immunology60.，第141-146页，1986)。制备这些化合物的方法已在国际专利申请WO96/20222和WO96/20008中描述。用于制备磺基脂多糖的这些方法导致形成不同的磺基脂多糖衍生物，其中每个多糖分子存在的脂肪酸酯的数量、每个多糖分子存在的硫酸酯的数量、每个多糖分子羟基的数量以及脂肪酸酯、硫酸酯和羟基在多糖分子上的分布是不同的。这意味着在这些磺基脂多糖的制备过程中，能够得到许多不同的磺基脂多糖的混合物。因此，期望的磺基脂多糖的收率相对较低，或者必需使用的佐剂难以对引起组织调控的混合物进行表征。
在欧洲专利EP1233969中，要求保护一种佐剂组合物，其中，所述佐剂含有磺基脂二糖。还记载了一种用于制备该磺基脂二糖的方法。在一种实施方式中，制备的磺基脂二糖被脂肪酸酯或硫酸酯基团完全取代。然而，如以下进一步描述的，当在动物中用该磺基脂二糖作为佐剂时，会产生不期望有的副作用，例如平均体温上升(包括发烧)和局部刺激性（local irritation）(组织肿胀)的出现。
发明内容
鉴于前述，本发明的目的是提供相对容易和廉价制备的化合物，具有良好的辅佐性能，并且当在临床上使用时，所述化合物能够诱导最小的不期望有的副作用。本发明的其它目的是提供可用于佐剂组合物的化合物，例如与疫苗组合使用的化合物，所述化合物具有良好的安全性和副作用特性。
本发明的第一和第二方面涉及三糖衍生物和它们作为佐剂的用途。根据本发明所述的三糖衍生物含有取代的三糖核（trisaccharide core）和任选的一个或多个阴离子基团，所述三糖核被脂肪酸酯基团完全取代。
根据本发明所述的三糖衍生物特别适合用作疫苗的佐剂。它们具有比基于多糖衍生物的其它佐剂(例如基于二糖的佐剂)意外显著更好的副作用特性。与例如EP1233969的二糖衍生物相比，接种抗原组合物和含有根据本发明所述的三糖衍生物的佐剂组合物的动物表现出更低的平均体温上升。另外，当使用含有根据本发明所述的三糖衍生物的佐剂时，注射部位附近的局部反应(组织肿胀)的发生率更低。
本文使用的术语抗原是指能够在人或动物身体中诱导免疫反应的任何组分或材料，例如病毒、细菌、支原体、寄生虫或肿瘤细胞、微生物的亚单位（subunit）例如蛋白、多糖、肽、糖蛋白、多糖-蛋白缀合物、肽-蛋白-缀合物。
例如，抗原可以含有或由一种或多种活的生物体、失活的生物体或所谓的亚单位(后者例如通过合成方法制备，或通过重组体DNA方法制备，或从生物体中分离获得)组成。术语抗原还指在人或动物身体中可诱导免疫反应的任何组分。
本发明的衍生物的三糖核优选衍生自棉子糖、松三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖（nigerotriose）、麦芽三酮糖（maltotriulose）或蔗果三糖。特别优选三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，最优选棉子糖或麦芽三糖。这些三糖在它们的正常(即，未取代的)形式中具有十一个OH-基团，这些OH-基团可用于反应，例如与脂肪酸的酯化反应。然而，OH-基团中的一个或多个(优选一个)还可能与阴离子基团发生反应，从而得到例如硫酸酯或磷酸酯基团，优选得到硫酸酯基团。
在本发明的优选实施方式中，根据本发明所述的三糖衍生物不具有除脂肪酸基团以外的阴离子基团，优选相同的脂肪酸基团。
根据另一种优选的实施方式，根据本发明所述的三糖衍生物每个取代的三糖核分别含有一个或两个具有十个或九个脂肪酸基团的阴离子基团。优选所述脂肪酸基团是相同的。
本文使用的术语阴离子基团是指带负电荷的部分(即，在中性pH下或在使用衍生物的环境中的pH下，带负电荷)。例如，这样的阴离子基团可以为硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。优选的阴离子基团包括硫酸酯基团或磷酸酯基团。所述基团的实例为-O-SO2-ONa或-O-SO2-ONH4、-O-SO2-OTEA(即，三乙铵硫酸盐（sulphate triethylammonium）)。
在本发明的优选实施方式中，与取代的三糖核共价键合的脂肪酸酯基团为链长为4-20个碳原子，优选6-18，更优选8-16个碳原子，最优选10-14，高度优选12个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和的脂肪酸的酯。
虽然取代的三糖核被多于一种类型的脂肪酸酯所取代也在本发明的范围内，但是优选仅使用一种类型，即，所有的脂肪酸酯都是相同的。
高度优选使用脂肪酸，然而本发明还预期其它羧酸(优选与脂肪酸紧密相关的羧酸)也可以提供有效的结果。
优选地，脂肪酸酯为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸（例如丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、蓖麻油酸、瓦克岑酸、花生酸、鳕油酸、花生四烯酸、油酸或亚油酸，最优选月桂酸）的酯。
在优选的实施方式中，取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且为每个取代的三糖被相同的脂肪酸酯基团所完全取代的三糖衍生物，即，三糖核被十一个相同的脂肪酸酯基团取代。
在另一种优选的实施方式中，取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且具有一个或两个阴离子基团(例如硫酸酯或磷酸酯基团)，并且每个取代的三糖分别具有十个或九个相同的脂肪酸酯基团。最优选脂肪酸酯为月桂酸的酯。
本发明的第三方面涉及一种用于制备三糖衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供三糖并将其溶解于溶剂中；和ii)使用脂肪酸或脂肪酸源酯化三糖的所有OH-基团，任选地，三糖的至少一个OH-基团与阴离子试剂发生反应。
由于当所有的OH-基团与阴离子基团和/或脂肪酸都发生反应时，形成的杂质很少。这意味着不需要大量的纯化步骤，即可得到药学上可接受的纯形式（pure form）的目的三糖衍生物。如果仅使用一种类型的脂肪酸，例如月桂酸，得到药学上可接受的纯形式的目的三糖衍生物所需的纯化步骤甚至更少。本发明方法的另一个优点在于能够容易地相对大量地得到目的三糖衍生物，使得所述方法具有经济上的吸引力。
在本发明的优选实施方式中，制备的三糖衍生物不具有除脂肪酸基团（优选相同的脂肪酸基团）以外的阴离子基团，即，所有的OH-基团与脂肪酸或脂肪酸源发生反应。
根据另一种优选的实施方式，制备的三糖衍生物中每个取代的三糖核分别含有一个或两个具有十个或九个脂肪酸基团的阴离子基团。优选脂肪酸基团是相同的。
在以上提及的方法中使用的三糖优选为棉子糖、松三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三酮糖或蔗果三糖。更优选地，使用棉子糖、松三糖或麦芽三糖，最优选地，使用麦芽三糖或棉子糖。
在以上提及的方法中使用的脂肪酸的含义是指任何来源的脂肪酸，包括脂肪酸盐、脂肪酰卤（fatty acids halides）、脂肪酸酯和衍生物。优选地，在要求保护的方法中使用的脂肪酸为链长为4-20个碳原子，优选6-18，更优选8-16个碳原子，最优选10-14个碳原子，高度优选12个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和的脂肪酸。
优选地，所用的脂肪酸为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸，例如丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、蓖麻油酸、瓦克岑酸、花生酸、鳕油酸、花生四烯酸、油酸或亚油酸。最优选月桂酸。
如上所述，在本发明的优选实施方式中，至少一个OH基团与阴离子试剂发生反应。优选地，所用的阴离子试剂为硫酸酯化剂（sulphating agent）或磷酸酯化剂（phosphating agent），例如气态SO3、HCLSO3、SO3.吡啶、SO3-2-甲基吡啶、SO3-2,6-二甲基吡啶、SO3-二甲基甲酰胺、SO3-三甲基酰胺、SO3-三乙胺、SO3-二甲基丙氨酸（SO3-dimethylanaline）、SO3-N-乙基吗啉、SO3-二乙基丙氨酸、SO3-二氧杂环己烷和它们的组合。最优选磺酸酯化剂（sulphonating agent）为SO3.吡啶或SO3.三乙胺。
最优选的硫酸酯化剂为SO3.吡啶。进一步优选地，三糖的至少一个OH-基团与硫酸酯化剂的反应在三糖与脂肪酸的酯化反应之前进行。首先进行与硫酸酯化剂反应的优点在于硫酸酯化剂首先与所谓的主要OH-基团反应，随后再与其它OH基团反应，从而减少形成的异构体的量。
在优选的实施方式中，三糖:阴离子试剂:脂肪酸当量的比值为1:0-3:8-11，优选为1:0-1:10-11。在这些要求保护的范围内，能够有效地得到OH-基团被脂肪酸酯和任选的阴离子基团(例如硫酸酯)完全取代的三糖。
优选地，用于进行反应的溶剂为吡啶和二甲基甲酰胺的混合物。
在本发明方法的附加步骤中，三糖衍生物经历了使它们与药学上可接受的赋形剂或稀释剂混合的附加步骤，从而得到佐剂组合物。
本发明的第四方面涉及含有根据本发明所述的三糖衍生物或它们的混合物的佐剂组合物。当将所述三糖衍生物配制成为佐剂组合物时，它们优选与药学上可接受的赋形剂或稀释剂混合。优选地，将佐剂组合物配制成水包油型乳液。可使用的合适的油包括其他的动物油、植物油和矿物油，例如鱼油、维生素E、角鲨烷、角鲨烯。优选地，使用角鲨烷，优选与聚山梨醇酯（polysorbate）结合使用。
虽然可以仅使用一种类型的三糖衍生物，但是在佐剂组合物中使用根据本发明所述的不同三糖衍生物的混合物也在本发明的范围内。在优选的实施方式中，使用根据本发明所述的三糖衍生物与阴离子基团(例如硫酸酯基团)的混合物，以及不含阴离子基团的相同的三糖衍生物，例如磺基-脂-棉子糖和脂-棉子糖。最优选地，在所述混合物中使用的三糖衍生物的脂肪酸酯是相同的，例如月桂酸的酯。
本发明的第五方面涉及含有如上所述的佐剂组合物或三糖衍生物的疫苗。
佐剂组合物、抗原组合物或疫苗均优选通过肠胃外进行给药。用于肠胃外给药的合适的方式包括肌内给药、皮肤下给药(subcutaneousadministration)、皮下给药(subdermal administration)和真皮内给药(intradermaladministration)。用于肠胃外给药的合适的工具包括针(包括微针)注射器和经皮递送系统。
肠胃外制剂可以由本领域技术人员根据标准方法容易地制备。优选肠胃外制剂被制备为水包油型乳液。
采用本领域技术人员公知的标准药物技术，在无菌条件下可以容易地完成肠胃外制剂的制备，例如，通过过滤。
根据本发明所述的疫苗或佐剂组合物可以给药于人和许多不同的靶动物，例如猪、牛、家禽、犬、猫、马等。
本发明的第六方面涉及一种包括以上所述的佐剂组合物和抗原组合物的试剂盒。
可期望单独用佐剂组合物和抗原组合物或疫苗的组合进行给药。在这种情况下，佐剂组合物和抗原组合物可以方便地以试剂盒的形式组合。例如，所述试剂盒可以为双小瓶系统（two vial system）或双室注射器（dual chambersyringe）。
具体实施方式
现在通过以下非限制性的实施例来进一步描述本发明。
根据本发明所述的三糖衍生物的制备
实施例1：根据本发明所述的磺基-脂-三糖的常规合成
将三糖在真空烘箱中干燥，以除去结晶水。随后在配备回流-冷凝器的100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气流下，将三糖(5g)溶解于30mL DMF和14mL吡啶中。在剧烈搅拌条件下加入1.05当量的吡啶.SO3。1小时后，将烧瓶在冰水中冷却，并且在剧烈搅拌条件下，逐滴加入月桂酰氯，以防止加热反应混合物。15分钟后，将冰浴缓慢加热至40℃。通过HPLC监测反应的进程。反应完成后，在旋转蒸发器中将混合物真空浓缩(加热到60℃)。将粗产物在300mL庚烷和150mL盐水中处理。在500mL的分离漏斗中分离有机层，经硫酸钠干燥，并过滤。将庚烷溶液真空浓缩。得到的油溶解于200mL庚烷中，并逐滴加入三乙胺(2.37mL)。将得到的溶液过滤，并真空浓缩。将油再次溶解于100mL庚烷中，过滤，并将溶液真空浓缩。
实施例2：经由吡啶.SO 3 途径的磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma)的合成
采用在实施例1中描述的常规方法合成题述产物，具体如下：将麦芽三糖(5.1g，10mmol)在<10毫巴的真空炉中于40℃下干燥19小时，于70℃下干燥48小时，得到4.9g干燥的麦芽三糖。将干燥的麦芽三糖溶解于30mLDMF和14mL吡啶中，用悬浮于2mL DMF中的1.6g(1.05当量)的吡啶.SO3进行硫酸酯化。1小时后，在冰浴中使用11当量(25.5mL)的月桂酰氯使磺基-三糖酯化。将混合物缓慢加热至40℃，并反应3小时。通过HPLC-ELSD监测反应过程。提取后分离产物，用三乙胺进行交换。得到浓的褐-黄色糖浆：15.5g+5.5g(加热至50℃后，由蒸发烧瓶二次收获(second crop))。HPLC-ELSD色谱图：参见图1A。
实施例3：经由吡啶.SO 3 途径的磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma)的其他合 成方法
采用在实施例1中描述的常规方法合成题述产物，具体如下：将麦芽三糖(5.0g，10mmol)在<10毫巴的真空炉中于40℃下干燥20小时，于70℃下干燥90小时，得到4.9g干燥的麦芽三糖。将干燥的麦芽三糖溶解于30mLDMF中，加入悬浮于14mL吡啶中的1.6g(1.05当量)的吡啶.SO3。1小时后，在冰浴中使用11当量(25.2mL)的月桂酰氯使磺基-三糖酯化，并缓慢加热至40℃。在合成过程中，在有规律的时间点取用于HPLC-ELSD分析的样品。在环境温度下与月桂酰氯反应过夜。后处理按实施例1所述的方式进行。得到浓的褐-黄色糖浆：24.7g。HPLC-ELSD色谱图：参见图1B。
实施例4经由吡啶.SO 3 途径的磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra)的合成
采用在实施例1中描述的常规方法合成题述产物，具体如下：将五水合棉子糖(5.0g，10mmol)在<10毫巴的真空炉中于30℃下干燥24小时，于60℃下干燥90小时，得到4.3g干燥的棉子糖。将干燥的棉子糖溶解于30mLDMF和14mL吡啶中。一次性加入吡啶.SO3(1.6g，1.05当量)。1小时后，在冰浴中使用12当量(23.5mL)的月桂酰氯使磺基-三糖酯化，并缓慢加热至40℃。4小时后，将混合物真空浓缩，提取，用TEA处理，如实施例1所述。得到浓的黄-褐色糖浆：18.0g。HPLC-ELSD色谱图：参见图2。
实施例5脂-麦芽三糖(L11-Ma)的合成
采用在实施例1中描述的常规方法合成题述产物，具体如下：将麦芽三糖水合物(0.50g)在真空烘箱中干燥。将干燥的三糖(0.49g，0.97mmol)溶解于吡啶(1.4mL)和DMF(3mL)中，在冰浴中冷却，与月桂酰氯(3.36mL，15当量)在0℃下反应1小时，接着在室温下反应16小时。加入3mL庚烷和超声处理溶解的产物后，反应混合物变为凝胶。加入庚烷重复两次。用水洗涤有机相(75mL)，形成三层体系。仅将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，而得到浓的黄-褐色糖浆：1.39g。HPLC-ELSD色谱图：参见图3A。
实施例6脂-棉子糖(L11-Ra)的合成
将五水合棉子糖(0.50g)在真空烘箱中干燥。将干燥的棉子糖(0.41g，0.86mmol)在吡啶(1.4mL)和DMF(3mL)中通过冰浴进行冷却，并与月桂酰氯(2.97ml，15当量)于0℃下反应1小时，接着在室温下反应18小时。反应混合物用庚烷(50ml)稀释，并用水(25ml)洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到浓的黄-褐色糖浆：2.33g。HPLC-ELSD色谱图：参见图3B。
含有根据本发明所述的三糖衍生物的佐剂对抗GnRH滴定度、血清睾 酮水平和不良反应发生的影响。
进行了动物实验来评价与使用根据本发明所述的三糖作为佐剂相关的效力（efficacy）和可能的不良反应。在该研究中，在大鼠中，测试三种基于(磺基-)脂-三糖的佐剂：根据实施例3制备的磺基-脂-麦芽三糖(一个硫酸酯基团和十个月桂酰基酯基团，S1L10-Ma)；根据实施例4制备的磺基-脂-棉子糖(一个硫酸酯基团和十个月桂酰基酯基团，S1L10-Ra)；和根据实施例6制备的脂-棉子糖(棉子糖被月桂酰基酯基团完全取代，L11-Ra)。含有磺基-脂-麦芽三糖的佐剂也含有脂-麦芽三糖(被月桂酰基酯基团完全取代，L11-Ma)。含有磺基-脂-棉子糖的佐剂也含有脂-棉子糖(被月桂酰基酯基团完全取代，L11-Ra)。
按在0.008-8mg/剂量范围内变化的不同剂量测试基于磺基-脂的佐剂。测试与含有0.7μg缀合的GnRH/剂量的GnRH-KLH缀合物组合的佐剂。将佐剂的辅助性与阳性对照佐剂磺基-脂-蔗糖(含有一个硫酸酯基团和七个月桂酸酯基团的二糖，S1L7-Su)和由不含糖化合物的水包角鲨烷型乳液和一个仅接受PBS的基团组成的阴性对照佐剂的辅助性进行比较。
通过抗体滴定度和诱导的抗体对于睾酮水平的生物学影响来测定效力。为了测定使用佐剂免疫的不良反应，每日进行临床观察并且测定体温和注射部位反应。
佐剂乳液的制备
·糖：磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma)
磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra)
脂-棉子糖(L11-Ra)
·角鲨烷(A&E Connock)
·聚山梨醇酯-80(Fagron)
·无菌PBS-wit pH7.4(Mediabereiding ASG，莱利斯德市)
·MilliQ水
·Millex注射器驱动过滤器单元0.22μm PES，33mm，4.5cm2(Millipore)
·配备有相互作用室类型的微量流化装置M-110S：F20Y
·Microtrac Nanotrac Analyzer System NPA-253
按照如下组成制备实验佐剂。
表1.用于不同SLS的乳液的组成
Figure BDA00002739817300131
注示：对于第5组和第10组，将糖溶解于角鲨烷中。在这些溶液中，4.0056g(5)和4.0006g(10)用于进一步的乳液制备。在最终的乳液中，SLS含量为1mg/25ml。
在50ml的离心管（Falcon tube）中称重油相组分(糖、角鲨烷、聚山梨醇酯-80和MilliQ水，其量如表1所示)。使用涡流（vortex）将各组分混合，并且在50℃的水浴中加热，直至糖溶解。将温热的油相加入到水相(PBS)中，通过涡流将两相混合，并且在24000min-1下间隔性地均质（ultra-turrax）约30秒。随后，通过微量流化装置处理形成乳液。操作压力设定为500kPa(5巴)，在冰浴中在相互作用室的冷却下，将每一种混合物通过三次。每一种乳液经手动无菌过滤。使用Nanotrac粒径仪测量乳液的颗粒尺寸。
通过向水相(含有0.7μg缀合的GnRH)中加入相同体积的佐剂(含有如表2所示的糖化合物)配制疫苗1-13。疫苗14仅由PBS组成。制备以下疫苗：
表2实验设计
组 糖化合物 佐剂剂量
1 磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma-8) 8mg
2 磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma-2) 2mg
3 磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma-0.8) 0.8mg
4 磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma-0.08) 0.08mg
5 磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma-0.008) 0.008mg
6 磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra-8) 8mg
7 磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra-2) 2mg
8 磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra-0.8) 0.8mg
9 磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra-0.08) 0.08mg
10 磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra-0.008) 0.008mg
11 无糖(NS) 0
12 脂-棉子糖(L11-Ra) 8mg
13 磺基-脂-蔗糖(S1L7-Su-8) 8mg
14 PBS对照(无抗原，无佐剂) 0
动物和免疫
将10周大的雄性Wistar大鼠安放在笼子里，每只笼子3只大鼠。大鼠可随意接近食物和水。根据实验设计(表2)，在第0、14和28天，使用含有200μl水相和200μl佐剂的400μl疫苗免疫大鼠。在左右大腿内侧处进行两次肌内注射(每次100μl)，并且在颈部皮肤下注射2×100μl。每一组由5只大鼠组成。
在免疫之前和在第41天和第56天时，从所有的动物中收集血清的血液样品。
疫苗的效力
测定
通过ELISA测量GnRH特异性抗体。在室温下，将板(96孔)预先涂布0.2%的戊二醛（glutardialdehyde）在磷酸盐缓冲液中(pH5)保持3小时，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH8)洗涤，对于每个孔，涂布100μl含有10μg GnRH(Pepscan Presto，莱利斯德市，荷兰)每ml磷酸盐缓冲液(pH8)的溶液，并于37℃下温育3小时。涂布好的板用0.05%Tween-80洗涤。将血清样品在PEM(1%Tween-80和4%马血清)中稀释(1/10)。该稀释物在96-孔板中进行进一步稀释(100μl/孔，8个步骤)，并于37℃下温育1小时。使用0.05%Tween-80洗涤后，将100μl在PEM中缀合有过氧化物酶的山羊-抗-大鼠抗血清加入到孔中。将板于37℃下温育1小时，使用0.05%Tween-80洗涤12次。随后，将150μl含有2,2-连氮基-双-(3-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)加上H2O2的基底溶液加到板的孔中。将板在环境室温下温育45分钟，并在405nm下测量吸光度。抗体滴定度用稀释因子的10log表示，得到4倍于背景的光密度(约100)。
根据厂家提供的说明书，使用市售可得的睾酮EIA(Beckman Coulter，Woerden，荷兰)测量血清睾酮水平。
GnRH抗体滴定度
使用磺基-脂-麦芽三糖(S1L10-Ma)和磺基-脂-棉子糖(S1L10-Ra)处理的各组的GnRH抗体滴定度如图4A和4B所示。两种磺基-脂-三糖对GnRH诱导剂量依赖性的抗体滴定度。比起使用不含糖的佐剂(NS，第11组)处理的大鼠，使用0.08-8mg磺基-脂-三糖处理的大鼠的抗体滴定度基本都较高，这证明了磺基-脂-三糖对免疫响应的显著贡献。
图4C清楚地显示，与仅用角鲨烷乳液(NS)处理的大鼠相比，接受8mg根据本发明所述的糖化合物(即，S1L10-Ma-8，S1L10-Ra-8和L11-Ra-8)的大鼠的GnRH抗体滴定度基本都较高，这验证了S1L10-和L11-三糖二者的强辅助性。
血清睾酮
使用被含有根据本发明所述的磺基-脂-三糖(即，S1L10-Ma和S1L10-Ra)的佐剂乳化的GnRH-KLH缀合物进行免疫导致了血清睾酮水平的显著下降，从0.08mg磺基-脂-三糖开始可以看出(图5A-B)，而最低磺基-脂-三糖剂量(0.008mg)对血清睾酮的影响与不含糖化合物的水包油型乳液相近。使用脂化的三糖(lapidated trisaccharide)(L11-Ra-8)进行免疫也能诱导睾酮水平的下降(图5C)。
不良反应
平均体温的升高
对所有的动物进行每日至少一次的临床观察。在每一次免疫前后，通过直肠温度确定所有动物的平均体温(MBT)。每组的平均体温(MBT)也描述为预先免疫水平，参见图6。
在每一次接种后3小时，在使用8和2mg剂量的仅磺基-脂-三糖处理的大鼠中，观察到MBT的轻微升高，而注意到在0.8、0.08和0.008mg剂量下，对MBT无影响。然而，第二天，在接种疫苗后21小时，MBT几乎再次降至正常值(图6A和6B)。与此相反，在接种疫苗后3小时，比起三糖化合物，使用二糖化合物(S1L7-Su-8)进行免疫引起了稍高的MBT升高，在免疫后一天，不显示MBT的降低，在接种疫苗后21小时，MBT仍升高(图6C)。脂化的三糖(L11-Ra-8)不诱导任何的MBT升高。因此，从图6可以清楚的是，当与现有技术已知的二糖衍生物相比时，含有根据本发明所述的化合物(S1L10-三糖)作为佐剂的疫苗能够诱导意外显著较短的温度反应，而与不含糖化合物(NS)的水包油型乳液相似的脂化的三糖(L11-三糖)根本不诱导任何温度反应。
注射部位反应
在接种疫苗之前，评价注射部位是否存在异常情况或局部反应。如果不存在这些异常情况或局部反应，对动物在该部位上进行注射。在每一次免疫之后，检查注射部位的组织肿胀。测量皮肤下注射部位的尺寸(直径，以mm计)。由于难以测定后腿的肌内注射部位反应，因此仅确定肌内注射部位的存在(组织肿胀)，并且用任意值（arbitrary value）表示(存在=10mm，不存在=0mm)。在每一次检查时，将每只大鼠的四个注射部位的注射部位反应的分数相加，从而计算每组的平均值。结果如图7所示。
免疫后，在使用磺基-脂-三糖处理的大鼠中，主要在使用8mg和/或2mg处理的大鼠中，观察到了较小的剂量依赖性注射部位反应(图7A和7B)。在免疫后第3天，注射部位反应的尺寸逐渐缩小，并且在免疫后第5天，几乎无法检测到注射部位反应。而使用磺基-脂-二糖(S1L7-Su-8)免疫引起的注射部位反应显示出完全不同的方式：甚至在第4天，注射部位反应尺寸还在增大，并且比磺基-脂-三糖(参见图7C)大4倍，此外，在免疫后第5天的最终检查时，仍存在显著的注射部位反应。
脂化的三糖(L11-Ra-8)在注射部位处不诱导任何不良反应。清楚地，比起含有根据本发明所述的磺基-脂-三糖的疫苗，含有磺基-脂-二糖的疫苗制剂诱导更强烈的注射部位反应。
附图说明
图1A-B：经由吡啶.SO3途径合成的磺基-脂-麦芽三糖的HPLC-ELSD色谱图；
图2：经由吡啶.SO3途径合成的磺基-脂-棉子糖的HPLC-ELSD色谱图；
图3A-B：脂-麦芽三糖和脂-棉子糖的HPLC-ELSD色谱图；
图4A-C：使用各种疫苗制剂免疫的大鼠的GnRH抗体滴定度(平均)；
图5A-C：使用各种疫苗制剂免疫的大鼠的血清睾酮水平；
图6：使用各种疫苗制剂免疫的大鼠的平均体温；
图7：使用各种疫苗制剂免疫的大鼠的注射部位反应。

Claims (38)

1.三糖衍生物作为佐剂的用途，所述三糖衍生物含有取代的三糖核和任选的一个或多个阴离子基团，所述三糖核被脂肪酸酯基团完全取代。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三酮糖或蔗果三糖，优选棉子糖、松三糖或麦芽三糖，最优选棉子糖或麦芽三糖。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述取代的三糖核具有一个或两个硫酸酯或磷酸酯基团作为阴离子基团。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中，所述阴离子基团为硫酸酯。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中，所述脂肪酸酯基团为链长为4-20个碳原子，优选6-18，更优选8-16个碳原子，最优选10-14个碳原子，高度优选12个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和的脂肪酸的酯。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的用途，其中，所述脂肪酸酯为月桂酸的酯、肉豆蔻酸的酯、棕榈酸的酯、硬脂酸的酯或花生酸的酯，优选为月桂酸的酯。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的用途，其中，所述取代的三糖核的脂肪酸酯基团都是相同的。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的用途，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且其中所述三糖衍生物中每个取代的三糖被相同的脂肪酸酯基团完全取代。
9.根据权利要求1-7中任意一项所述的用途，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且其中所述三糖核中每个取代的三糖具有一个硫酸酯或磷酸酯基团以及十个相同的脂肪酸酯基团，或者每个取代的三糖具有两个硫酸酯或磷酸酯基团以及九个相同的脂肪酸酯基团。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的用途，其中，所述脂肪酸酯基团为月桂酸的酯。
11.作为佐剂的三糖衍生物，所述三糖衍生物含有取代的三糖核和任选的一个或多个阴离子基团，所述三糖核被脂肪酸酯基团完全取代。
12.根据权利要求11所述的三糖衍生物，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三酮糖或蔗果三糖，优选棉子糖、松三糖或麦芽三糖，最优选棉子糖或麦芽三糖。
13.根据权利要求11或12所述的三糖衍生物，其中，所述取代的三糖核具有一个或两个硫酸酯或磷酸酯基团作为阴离子基团。
14.根据权利要求11-13中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述阴离子基团为硫酸酯。
15.根据权利要求11-14中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述脂肪酸酯基团为链长为4-20个碳原子，优选6-18，更优选8-16个碳原子，最优选10-14个碳原子，高度优选12个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和的脂肪酸的酯。
16.根据权利要求11-15中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述脂肪酸酯为月桂酸的酯、肉豆蔻酸的酯、棕榈酸的酯、硬脂酸的酯或花生酸的酯，优选为月桂酸的酯。
17.根据权利要求11-16中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述取代的三糖核的脂肪酸酯基团都是相同的。
18.根据权利要求11-17中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且其中所述三糖衍生物中每个取代的三糖被相同的脂肪酸酯基团完全取代。
19.根据权利要求11-17中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述取代的三糖核衍生自棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且其中所述三糖核中每个取代的三糖具有一个硫酸酯或磷酸酯基团以及十个相同的脂肪酸酯基团，或者每个取代的三糖具有两个硫酸酯或磷酸酯基团以及九个相同的脂肪酸酯基团。
20.根据权利要求11-19中任意一项所述的三糖衍生物，其中，所述脂肪酸酯基团为月桂酸的酯。
21.用于制备三糖衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供三糖并将其溶解于溶剂中；和
ii)使用脂肪酸或脂肪酸源酯化三糖的所有OH-基团。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，三糖的至少一个OH-基团与阴离子试剂发生反应。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述阴离子试剂为硫酸酯化剂，例如吡啶.SO3或TEA.SO3，或磷酸酯化剂。
24.根据权利要求21-23中任意一项所述的方法，其中，所用的溶剂为二甲基甲酰胺、吡啶或它们的混合物。
25.根据权利要求21-24中任意一项所述的方法，其中，三糖:阴离子试剂:脂肪酸当量的比值分别为1:0-3:8-11，优选为1:0-1:10-11。
26.根据权利要求21-25中任意一项所述的方法，其中，所述三糖为棉子糖、松三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、麦芽三酮糖或蔗果三糖。
27.根据权利要求21-26中任意一项所述的方法，其中，所述三糖为棉子糖、松三糖或麦芽三糖。
28.根据权利要求21-27中任意一项所述的方法，其中，所述脂肪酸为链长为4-20个碳原子，优选6-18，更优选8-16个碳原子，最优选10-14个碳原子，高度优选12个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和的脂肪酸。
29.根据权利要求21-28中任意一项所述的方法，其中，所述脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或花生酸。
30.根据权利要求21-29中任意一项所述的方法，其中，所述三糖为棉子糖、松三糖或麦芽三糖，并且其中所述三糖被相同的脂肪酸完全酯化，或每个三糖被平均一个硫酸酯或磷酸酯基团以及十个相同的脂肪酸酯基团完全酯化，或者每个三糖两个硫酸酯或磷酸酯基团以及九个相同的脂肪酸酯基团完全酯化，所述脂肪酯优选为月桂酸的酯。
31.根据权利要求21-30中任意一项所述的方法得到的三糖衍生物。
32.根据权利要求31所述的三糖衍生物作为佐剂的用途。
33.根据权利要求11-20或31中任意一项所述的三糖，所述三糖用作佐剂。
34.佐剂组合物，所述佐剂组合物含有根据权利要求11-20或31中任意一项所述的三糖衍生物或它们的混合物以及药学上可接受的接受剂和/或稀释剂。
35.根据权利要求34所述的佐剂组合物，所述佐剂组合物被配制为水包油型乳液。
36.根据权利要求35所述的佐剂组合物，其中，所述乳液的油相含有角鲨烷和/或聚山梨醇酯。
37.疫苗制剂，所述疫苗制剂含有根据权利要求34-36所述的佐剂组合物。
38.一种试剂盒，所述试剂盒包括抗原组合物和根据权利要求34-37所述的佐剂组合物。
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