JPH09505039A

JPH09505039A - ワクチンの設計および製造

Info

Publication number: JPH09505039A
Application number: JP7513446A
Authority: JP
Inventors: シェイフィンガー、カーティス・コーツ; スマイリー、デイビッド・リー
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-04
Publication date: 1997-05-20
Also published as: NO961808L; EP0726774A1; SG49830A1; RU2143920C1; HUT75556A; KR960705582A; PL314303A1; WO1995012410A1; CN1141000A; CZ128896A3; FI961869A0; UA42741C2; EP0726774A4; CN1087953C; BR9407988A; CA2175708A1; HU9601191D0; US5679349A; AU1050595A; RO116045B1

Abstract

(57)【要約】乳房延性上皮への細菌付着に関係するタンパクから得られるペプチドは、乳腺炎を予防するワクチン調製に有用である。微生物付着を決定する方法は、合理的なワクチンの設計を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチンの設計および製造本発明は、微生物付着機構を決定する(determining)方法を提供する。微生物付着の基礎となる機構は、付着の原因となる微生物分子の同定を可能にすることから、細胞、医療用装置、プロテーゼ等への微生物付着を抑制する、または最小とするのに有用なワクチンの設計を可能とする。従って、本発明は、免疫学および微生物学の分野に属する。種々の細菌および他の微生物の、特異的細胞型への付着、さらにはまたプロテーゼ、植込み可能な細動除去器、心臓ペースメーカー、人工関節等といったような植込まれた装置への付着は、そのような感染の治療に相当な臨床的障害を提起する。そのような多くの付着性生物の抗生物質または抗真菌薬耐性が、この問題を混乱させる。本発明は、付着性微生物と非付着性生物との間の細胞表面の相違を評価することによって微生物付着の性質を決定する方法を包含する。本発明の実用性と好ましさは、ウシ乳腺炎を引き起こす、Ｓtaphylococcus aureus型のウシ乳房上皮細胞への付着の性質を決定する上述の方法の使用により説明される。本発明の好ましい態様である本発明の乳腺炎ワクチンは、本発明の方法により製造される本発明のワクチンの実例となるものである。種々のグラム陽性微生物は、乳腺炎を引き起こすことが知られている。Ｓtrep tococci 、Ｓtaphylococci、およびＣorynebacteriaの菌株といったようなグラム陽性生物は、乳腺炎の原因となる物質として関係することが多い。微生物が乳腺炎を引き起こす傾向は、その微生物がウシ乳房の延性上皮細胞に付着する能力と関連がある［Ａ.Ｊ.Ｆrost，Ｉnfection and Ｉmmunity，１２：１５５４−１５５６（１９７５）］。本発明の乳腺炎ワクチンは、微生物がウシの乳房延性上皮細胞に付着する能力とその結果として生ずる病理発生との間の相関関係を利用する。細菌細胞壁を調製して抽出し、延性上皮細胞への付着を示す細菌と延性上皮細胞に付着する能力に欠ける細菌との間で特定のタンパクの存在を測定した。次いで、付着性細菌には存在するが、非付着性細菌には存在しないタンパクを利用して、本発明の実例となる乳腺炎ワクチンの主成分であるペプチドサブフラグメントを生成した。本発明は、細胞壁または細胞膜抽出物を調製して、付着性微生物−対−非付着性微生物の比較により付着に関係する分子を決定し、付着関連分子の生化学的特性を決定し、また免疫応答を誘発した後、微生物が付着する能力を阻止するワクチンの合理的設計のためにその情報を用いることによるワクチンの設計方法を提供する。本発明の好ましい態様は、式（Ｉ）：式（Ｉ）Ｒ¹-Ｒ²-Ｒ³-Ｒ⁴-Ｒ⁵-Ｒ⁶-Ｒ⁷-Ｒ^8-Ｇly-Ｒ¹⁰-Ｇly-Ｒ¹²-Ｒ¹³-Ｇly-Ｒ¹⁵-Ｒ¹⁶- Ａla-Ｒ¹⁸-Ａrg-Ａla-Ｒ²¹-Ｇln-Ｇly-Ｒ²⁴ ［式中、Ｒ¹は水素またはＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸であり；Ｒ²はＡla、Ｇly、Ｓerまたはプロピオン酸であり；Ｒ³はＶal、Ｉle、ＬeuまたはＤ-Valであり；Ｒ⁴はＬysまたはＡrgであり；Ｒ⁵はＶal、ＩleまたはＬeuであり；Ｒ⁶はＡla、ＧlyまたはＳerであり；Ｒ⁷はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ⁸はＡsp、ＡsnまたはＧluであり；Ｒ¹⁰はＰhe、ＴyrまたはＴrpであり；Ｒ¹²はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹³はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ¹⁵はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹⁶はＬeu、Ａla、ＩleまたはＶalであり；Ｒ¹⁸はＰhe、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ²¹はＩle、Ａla、ＶalまたはＬeuであり；Ｒ²⁴はＯＨ、ＡlaまたはＳerである］で示される、延性上皮細胞への細菌付着に関係するタンパクのペプチドサブフラグメント、さらにはまたそれらの誘導体化型を提供する。本発明はまた、式（II）：［式中、ペプチド¹、ペプチド²、ペプチド³、およびペプチド⁴は、式（Ｉ）で示される化合物から独立して選択される］で示される複合(multiple)抗原性提示ペプチドも提供する。本発明はまた、該ペプチドおよび該複合抗原性提示ペプチドに対する最大免疫応答の誘発に適当な製剤中での該ペプチドおよび該複合抗原性ペプチドも提供する。ウシ乳腺炎の有効な抑制が重要である。乳腺炎を患っている酪農動物は抗生物質で治療しなければならず、また抗生物質を用いての酪農動物の治療は、牛乳中の抗生物質濃度を現在の規制ガイドラインの下には許容され得ないものとする。従って、ウシ乳腺炎に有効なワクチンの開発は、商業的に重要なことであり、また乳腺炎の家畜病治療処置における抗生物質治療の必要性を排除する可能性を与える。式（Ｉ）：Ｒ¹-Ｒ²-Ｒ³-Ｒ⁴-Ｒ⁵-Ｒ⁶-Ｒ⁷-Ｒ⁸-Ｇly-Ｒ¹⁰-Ｇly-Ｒ¹²-Ｒ¹³-Ｇly-Ｒ¹⁵-Ｒ¹⁶- Ａla-Ｒ¹⁸-Ａrg-Ａla-Ｒ²¹-Ｇln-Ｇly-Ｒ²⁴ ［式中、Ｒ¹は水素またはＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸であり；Ｒ²はＡla、Ｇly、Ｓerまたはプロピオン酸であり；Ｒ³はＶal、Ｉle、ＬeuまたはＤ-Ｖalであり；Ｒ⁴はＬysまたはＡrgであり；Ｒ⁵はＶal、ＩleまたはＬeuであり；Ｒ⁶はＡla、ＧlyまたはＳerであり；Ｒ⁷はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ⁸はＡsp、ＡsnまたはＧluであり；Ｒ¹⁰はＰhe、ＴyrまたはＴrpであり；Ｒ¹²はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹³はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ¹⁵はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹⁶はＬeu、Ａla、ＩleまたはＶalであり；Ｒ¹⁸はＰhe、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ²¹はＩle、Ａla、ＶalまたはＬeuであり；Ｒ²⁴はＯＨ、ＡlaまたはＳerである］で示される化合物は、乳腺炎の病因物質が乳牛の乳房延性上皮細胞に付着する機構を決定することを目的とした広範囲にわたる研究から得られた。Ｓtaphylococ cus aureus の菌株を、乳房延性上皮組織に付着するそれらの能力に関して比較した後、付着するもの−対−付着しないものというグループに細分した。付着性Ｓ . aureus −対−非付着性Ｓ．aureusに由来する外膜調製物を抽出して、付着性株には見い出されるが、非付着性株には存在しないタンパクの存在に関して比較した。付着性株には３つのタンパクが存在していたが、非付着性株には存在していなかった。これらのタンパクの分子量は、３６kＤ、４７kＤ、および６５kＤであった。そのタンパクを生化学的に特性決定して、３６kＤのタンパクが乳腺炎保護ワクチンの調製に最も有望な候補として選択された。最終的には、３６kＤのタンパクのアミノ酸末端に対応する２２のアミノ酸ペプチドを乳腺炎ワクチンの製造に最適な免疫原として選択した。２２のアミノ酸のＮ−末端の天然配列がワクチン調製の目的に好ましい。従って、式（Ｉ）中、好ましいアミノ酸置換基は以下の通りである：Ｒ¹は水素であり；Ｒ²はＡlaであり；Ｒ³はＶalであり；Ｒ⁴はＬysであり；Ｒ⁵はＶalであり；Ｒ⁶はＡlaであり；Ｒ⁷はＩleであり；Ｒ⁸ はＡspであり；Ｒ⁹はＧlyであり；Ｒ¹⁰はＰheであり；Ｒ¹¹はＧlyであり；Ｒ¹² はＡrgであり；Ｒ¹³はＩleであり；Ｒ¹⁵はＡrgであり；Ｒ¹⁶はＬeuであり；Ｒ¹⁸ はＰheであり；Ｒ²¹はＩleであり；またＲ²⁴はヒドロキシである。式（Ｉ）の他の可能な置換基は、同様の官能基を有するアミノ酸の既知の生化学的および免疫学的特性に基づいて選択された。本発明はまた、式（Ｉ）で示される化合物の免疫学的サブフラグメントも含んでなる。式（II）で示される複合抗原性提示ペプチドは、式（Ｉ）で示される複合免疫学的ペプチドの提示を可能にすることから、免疫応答をより有効に誘発することができる、より大きな分子の免疫学的サブユニットを提供する。式（II）で示される複合抗原性提示ペプチドに存在する式（Ｉ）で示されるペプチドは、同じペプチドであっても、式（Ｉ）で示されるペプチドのいずれの組み合わせであってもよい。式（Ｉ）で示されるペプチドの合成は、当業界において周知の固相タンパク合成を用いて容易に行うことができる。本発明の固相タンパク合成スキームは、通常の保護基と脱保護スキームとを利用する。現在の技術の進歩した状態における固相ペプチド合成の決まった性質にもかかわらず、本発明者らは、本発明の実施を容易にするため、固相合成に関する３つの開示を推奨した。当業者が好ましい条件および合成プロトコルを考え出していない場合には、従来の保護基およびそれらの使用に関する条件、脱保護試薬およびプロトコル、開裂試薬およびそれらの使用に関して推奨される条件等に関して、Ｇ.Ｂaranyら，Ｉnternational Ｊo urnal of Ｐeptide and Ｐrotein Ｒesearch ，３０：７０５−７３９（１９８７）；Ｊ.Ｍ.ＳtewartおよびＪ.Ｄ.Ｙoung，ＳＯＬＩＤＰＨＡＳＥＰＥＰＴＩＤＥＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｐierce Ｃhemical Ｃompany，Ｒockford，イリノイ（１９８４）；およびＰ.Ｄ.Ｂailey，ＡＮＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＴＯＰＥＰＴＩＤＥＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｊohn Ｗiley ＆Ｓons，ニューヨーク（１９９２）を参照することができる。本発明者らは、Ａpplied Ｂiosystemsの自動化ペプチド合成装置を利用したが、これは推奨されるプロトコル、溶媒、試薬等が製造業者により十分に補われる。固相合成において利用される具体的プロトコルを実施例に詳述する。完全な理解が得られるよう、明細書中に使用するある用語および略語を定義する。「Ｂoc」という用語は、t−ブチルオキシカルボニルを意味する。「トシル」という用語は、p−トルエンスルホニルの略語である。「Ｃhxl」という用語は、シクロヘキシルの略語である。「２Ｃl-Ｚ」という用語は、２−クロロベンジルオキシカルボニルの略語である。「Ｃ₁−Ｃ₁₆カルボン酸」という用語は、「アミノ末端」カルボン酸の他に１〜１６個の炭素を有する非分枝鎖状の炭化水素を意味する。式（１）の任意のＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸基は単に、アミノ末端基である。従って、Ｃ₁−Ｃ₁₆カルボン酸において起こり得る飽和度および置換には相当な自由がある。適当な非環式モノカルボン酸の例には以下のものが含まれる：エタン酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸。先に論じた通り、不飽和非環式モノカルボン酸および置換飽和並びに不飽和非環式モノカルボン酸もまた使用することができる。当業者は、その官能基のみが末端を提供するべきであるいずれの部分においても固有の融通性を認めるであろう。従って、本発明は、先に論じたＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸およびその変種を包含する。式（II）のＬＹＳは、リジンの略語である。式（Ｉ）で示される化合物のサブユニット(Ｒ²〜Ｒ²⁴)は、プロピオン酸がＲ⁴に位置し、またＤ-ＶalがＲ³に位置する例外はあるが、通例、Ｌ−アミノ酸である。従って、サブユニット間の結合はペプチド結合である。式（Ｉ）および（II）のペプチド末端(Ｒ¹およびＲ²⁴) は、別のアミノ酸を付加したなら、除去されてペプチド結合を形成するであろう水素またはヒドロキシル基を考慮に入れて定義される。従って、Ｒ¹がＨである場合、そのＨはさらなるＨではなく、Ｒ²の各々のアミノ酸またはプロピオン酸のＨである。同様に、Ｒ²⁴がＯＨである場合、そのＯＨはさらなるＯＨではなく、Ｒ²³の各々のアミノ酸のＯＨである。Ｒ²⁴がＡlaまたはＳerの場合、完全なアミノ酸が存在し、また式（II）で示される化合物が所望なら、カルボキシ末端カルボン酸をアミド結合形成に利用できる。Ｒ²に位置するプロピオン酸基は、n- プロピオン酸基でも、イソプロピオン酸基でもよい。遺伝子工学技術により、Ｌ−アミノ酸からなる、式（Ｉ）で示されるペプチドを発現するのが好ましい。従って、天然アミノ酸のみを含む、式（Ｉ）で示されるペプチドが、そのアミノ酸配列および遺伝暗号の既知の縮退を利用して、多量のペプチドを最小のコストで発現することができる発現ベクターを構築し、遺伝子工学技術により最も有効に製造されるであろう。分子生物学における技術の進歩した状態、カスタム(custom)ＤＮＡ配列、および細菌、酵母並びに哺乳動物細胞での使用のための発現ベクターが商業的に入手可能であるので、遺伝子工学についての冗長な開示は必要ない。本発明のペプチドの製造のために遺伝子工学を実行しようと望む技術者は、Ｊ.Ｓambrookら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，（第２版１９８９）およびＦ. Ｍ.Ａusubelら，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ,（１９８９）を参照すべきである。前述の方法は、遺伝子工学におけるいずれの開示にも優れた技術上の補足を提供する。免疫応答の誘発に適当な配合物は、当業界において周知である。完全フロインドアジュバント(ＣＦＡ)が恐らく、最適な免疫応答の誘発に最良の公知のアジュバントであろう。しかし、完全フロインドアジュバント(ＣＦＡ)中のマイコバクテリアの存在とＣＦＡの反復投与によって示される結果として生ずる炎症とが、酪農動物の治療におけるこのアジュバントの有用性を制限する。種々の他の天然および合成油をベースとするアジュバントは入手可能であり、また本発明の目的に容易に則し得る。アジュバントについての簡単な議論を以下に与える。アジュバントは、抗原と同時に投与した場合に抗原に対する免疫応答を増加させる、全ての調製物として定義することができる。抗原は、宿主の免疫系を混乱させる結果、攻撃物質（抗原）に対して免疫応答を引き起こす物質である。アジュバントの作用機構は完全には解明されていないが、免疫反応性リンパ球を抗原沈着部位に誘引して、抗原を炎症性部位に局在化し(沈着効果)、抗原異化作用を遅延し、反応性細胞の代謝を活性化して、リンパ系細胞の相互作用を刺激することであると考えられる。アジュバントはまた以下のような幾つかの他の機構によっても作用し得る：自己抗原に結合して、それらを修飾することにより、それらの配置をフロインドアジュバントの水−油界面で簡単に変えることにより、またはＴおよびＢリンパ球の非特異的刺激により。多くのアジュバントはまた、特異的抗原なしに投与したなら、免疫反応性の「非特異的」増加を起こすであろう。有効なアジュバントには、油類、無機塩類、二本鎖核酸類、微生物の産生物類、および種々の他の物質が含まれる。最も広く知られている油を基剤とするアジュバントは、簡単に上記した完全または不完全化フロインドアジュバントである。これらのアジュバントは、油(またはワックス)中の水または生理食塩水のエマルションからなる。典型的には、可溶性抗原を生理食塩水に溶解して、等量の、Ｂayol Ｆ^TM(４２.５％パラフィン、３１.４％単環式ナフタレン、および２６.１％多環式ナフタレン)またはＡr lacel Ａ(マンニットモノオレイン酸エステル)といったような油に乳化する。死亡したマイコバクテリアの添加は、アジュバント活性を非常に増加させ、またそのようなアジュバントは、マイコバクテリアを有しない不完全アジュバントとは対照的に「完全」アジュバントと呼ばれる。脂質タンパク抽出物を含め、他の微生物産生物をマイコバクテリウムに代えて使用することができる。マイコバクテリアの糖脂質およびペプチドグリカン部分(ワックスＤ)は、完全アジュバントを使用した場合に見られるアジュバント効果の増加について主たる原因となることが決定されている。単一エマルションのアジュバント系を利用するワクチンは、皮内または皮下注射する場合に最も有効である。ダブルエマルション(水中油中水型)は、より「自由に流動する」エマルションであり、また投与経路のより大きな自由を達成する。無機塩類は、免疫原性、従って、ワクチンの効能を増加させる別の方法である。リン酸カルシウム、シリカ、ミョウバン(硫酸カリウムアルミニウムもしくはリン酸アルミニウム)、またはアルミナクリームといったような無機塩類と共に沈殿させた抗原の溶液は、注入部位で、また注入領域をドレインするリンパ節で肉芽腫を発生させる。免疫肉芽腫機能は、フロインドアジュバントにより生ずるものと同じである。ミョウバンで沈殿させた抗原は、ジフテリアトキソイドのような抗原に対する免疫応答の範囲を予防免疫接種にまで増大するために、ヒトにおいて使用されている。不溶性コロイド状担体は、別の群のアジュバントである。ミョウバン沈殿の他に、他のコロイド状担体を単独で、または微生物産生物もしくは抽出物および抗原と組み合わせて使用して、アジュバントを構成してもよい。血液炭(charcol) は、吸収した抗原に対する抗体の産生を刺激する際に有用であることが分かっている。長さを調節したアルギン酸カルシウムまたはナトリウムのポリマーは、アジュバント特性を有する。ポリアクリルアミドゲルは、少量のトラップされた抗原に対して抗体産生を刺激するのに大変有効であることが分かっている。ベントナイトもまた、アジュバントとして上手く利用されている。メチル化ウシ血清アルブミンおよび他の正に荷電したタンパクは、負に荷電した抗原、ＤＮＡまたはポリヌクレオチドと混合して沈殿を生ずる場合にアジュバントとして大変有効である。微生物抽出物をアジュバントにおけるそれらの有用性に関して簡単に述べた。グラム陰性細菌の細胞内リポポリサッカライドのようなエンドトキシンは、免疫応答を増強する際に効力がある。エンドトキシンは、全身投与した場合にアジュバントとして機能し得るが、抗原と共に単独で注入するなら、より有効である。エンドトキシンの多くは、抗体合成およびＢ細胞増殖を刺激することができ、さらにはまたマクロファージによる食細胞活性を増大することができる。好ましいエンドトキシンには、Ｅ.coli ０１１１：Ｂ４、Ｓ.typhimurium型、Ｓ.enteriditis およびＳ.minnesotaに由来するものが含まれる。マイコバクテリアおよびある真菌の細胞壁もまた免疫反応性を高める。これらの物質は、マクロファージを誘引して活性化することから、後に抗原が誘発する炎症部位で食作用を増大させた後、補助細胞による抗原表示の増大を起こし、次いで、抗原反応性Ｂリンパ球の活性化を増大させ、さらにはまた細胞が媒介する(Ｔ細胞)機能を増大させるらしい。ポリヌクレオチド、ポリイノシン−ポリシチジル(ポリ(ＩＣ))酸またはポリアデニル−ポリウリジル(ポリ(ＡＵ))酸といったような、特に二本鎖のポリヌクレオチドは、強力なアジュバントおよび免疫活性化剤である。それらは、抗原反応性Ｔ細胞の活性化によって作用するらしい。ポリヌクレオチドはまた、マクロファージを活性化するために働くこともできる。Ｂacillus calmetteゲラン(guerin)(ＢＣＧ)、Ｃorynebacterium parvum、Ｌi steria monocytogenes 、およびＢordetella pertussisまたはこれらの細菌の抽出物は、アジュバントとして使用されている。駆虫薬であるレバミゾールもまた、Ｔ細胞を活性化し、補体レベルを増加して、マクロファージを活性化するその能力によって、アジュバントとして機能する。アジュバントまたはアジュバントの組み合わせの選択は、完全に当業者の免疫学者の技術の範囲内である。先に論じたアジュバントには、実験設定において有用なアジュバントが含まれており、さらにはまた家畜病治療適用の可能性があるアジュバントが含まれていた。本発明の乳腺炎ワクチンは、前述のアジュバントのいずれを用いても製剤化することができ、また本発明のペプチドと組み合わせての、または本発明のペプチドと共なる、そのようないずれのアジュバントの使用も熟考されおり、従って、本発明の範囲内である。本発明の乳腺炎ワクチンは、さもなければ付着性細菌株の、培養する乳房上皮細胞への結合を阻害する抗体を含んでなる体液性応答を誘発する際に有効であることが分かった。免疫処置プロトコルおよびウシ乳房上皮細胞／細菌付着アッセイに関する詳細を実施例に与える。表Ｉは、Ｓ.aureusの、酪農動物の管(ductal )上皮細胞への結合を阻害する体液性応答を誘発するための、本発明の乳腺炎ワクチンの有効性を証明するデータを示す。「ＰＲＥ」という用語は、付着を阻害する、動物血清の標準化された免疫処置前の能力を示す。「ＰＯＳＴ」は、免疫処置後のレベルを表す。「ＢＯＯＳＴ」値は、実施例に記載するようなブースター免疫処置の投与後に観察される値である。表Ｉのデータを得るために利用したプロトコルを実施例６に与える。本発明のワクチンは、乳牛における乳腺炎の家畜病治療処置に特に有用である。細菌付着を阻害する本発明のワクチンの能力により、細菌は標準コースの搾乳において流されてしまうので、乳腺炎の疾患状態における細菌の延性上皮細胞への付着は、本発明のワクチンに特に影響されやすい。先に与えた議論とデータは、主として、本発明の乳腺炎ワクチンを設計するための本発明の方法の使用という、本発明の好ましい態様に関する。当業者は、その種々の態様において、本発明が、細菌付着が問題である無数の他の領域に外挿され、従って、本発明のそれらの他の応用が本発明の範囲内であることを認めるであろう。以下の実施例は、本発明の具体的態様を記載し、またさらに説明することを意図するものであって、本発明の範囲を何ら制限しようとするものではない。実施例１ＡＶＫＶＡＩＤＧＦＧＲＩＧＲＬＡＦＲＡＩＱＧ−ＯＨの合成Ｂoc ＧlyＯＣＨ₂ＰＡＭ樹脂［Ａpplied Ｂiosystems］３２８mg(０.２５mＭ) に対し、以下の側鎖保護基：Ａrg(トシル)、Ａsp(Ｃhxl)、およびＬys(２-Ｃl- Ｚ)を有するＢocアミノ酸を用いて、Ａpplied Ｂiosystems ４３０Ａペプチド合成装置でダブルカップリングサイクルを達成した。Ｎ−末端のＢoc基をＴＦＡ脱保護サイクルにより完成したペプチジル樹脂から取り除いた後、その樹脂をＨＦ反応容器に移して、過剰の溶媒を除去し、その樹脂を減圧下に乾燥して、１. ０３ｇ得た。m-クレゾール１mlを添加して、その容器をＨＦ装置［Ｐenninsula Ｌabs］に取り付け、−７８℃まで冷却し、排気して、液体フッ化水素(ＨＦ)約１５mlを凝縮した。その反応物を氷浴中で１時間撹拌した後、ＨＦを減圧下に除去して、その樹脂をエチルエーテル２００mlに懸濁させた。固体物質を６０mlのガラス製濾過用漏斗によって濾過した後、エーテルで２回洗浄した。ペプチドを可溶化して、集めた物質を５０％酢酸水溶液(aq ＨＯＡc)１５mlで２回、１０％ aq ＨＯＡc １５mlで２回、また水１５mlで１回洗浄することにより、その樹脂から分離した。合わせた水性濾液を凍結して、凍結乾燥した。凍結乾燥した物質を５０％ aq ＨＯＡc １５ml、１０％ aq ＨＯＡc １０ml、およびＣＨ₃ＣＮ３mlに再び溶解した。その溶液の５μlを除去し、０.１％ＴＦＡで５００μlに希釈して、分析用ＦＰＬＣ［Ｐharmacia］システムを用いる０.４６×１５cmのＶydac Ｃ１８カラムに２５μlを注入した。０.５ml／分の流量を使用した。クロマトグラフィーを室温で行った。ＦＰＬＣのモニターに２１４nmのフィルターと０.２Ａの目盛設定とを有するＵＶモニター［Ｐharmacia ］を使用して、分離をモニターした。クロマトグラフィー溶液Ａは、０.１％ＴＦＡであった。クロマトグラフィー溶液Ｂは、０.１％ＴＦＡ／５０％ＣＨ₃ＣＮであり、また５０％Ｂ、５％Ｂ、１％Ｂ、４０％Ｂ、０％Ｂ、および５％Ｂのグラジエントを使用した。残りの溶液をＦＰＬＣの分離精製用２.２×２５cmのＶydac Ｃ１８カラムに充填した。２５％Ｂの５０分間、次いで、２５〜６５％Ｂの４５０分間のグラジエントを使用した。５分(２５ml)の画分を集めた。２.０ＡのＦＰＬＣモニター目盛設定を用いて、ＵＶ吸光度を２１４nmでモニターした。６０−７４からの種々の画分の試料４０ulを０.１％ＴＦＡで１：１０に希釈して、各々の２０μl をＨＰＬＣにより分析した。画分６４−６８を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、１１２mg得た。生成物の試料をアミノ酸分析および質量分析計分析にかけた。アミノ酸モル比により所望の生成物が得られたことを確認した。高速原子衝突質量分析データは、所望の生成物(２３１５.７５)の他に、２つのより高い分子量成分(２３７５.０および２３５７.４)を示した。生成物のＨＰＬＣ分析は、９０％以上の純度を示した。実施例２ＡＶＫＶＡＩＤＧＦＧＲＩＧＲＬＡＦＲＡＩＱＧ−ＯＨの大規模合成その合成、開裂および精製を実質的には実施例１の教示に従って続けた。Ｂoc ＧlyＯＣＨ₂ＰＡＭ樹脂０.６５ｇ(０.５mＭ)をＡＶＫＶＡＩＤＧＦＧＲＩＧＲＬＡＦＲＡＩＱＧ−ＯＨの合成に使用して、完成したペプチジル樹脂２.１ｇを得た(理論重量増加(gain)の９８％)。m−クレゾール１.５mlおよびＨＦ２０ml を開裂に使用して、集めた固体の水性洗浄物の凍結乾燥で粗生成物１.０６ｇを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、約７５％の純度を示し、またアミノ酸分析は、予測される残留物が全て存在することを示した。アミノ酸の割合は、粗ペプチド調製に関して予期される範囲内であったが、その割合における可変性は、所望のものより幾分高かった。質量分析では、２３１５.７５の質量を有する生成物は検出されなかった。２３１５.７５の分子量の生成物が存在しないことは、７および８の位置でのＡsp−Ｇlyの存在およびＨＦ開裂に帰せられた。実施例３ＡＶＫＶＡＩＥＧＦＧＡＩＧＲＬＡＦＲＡＩＱＧ−ＯＨの合成その合成、開裂および精製を実質的には実施例１に従って行った。この合成における７位および８位は、実施例２の反応生成物の対応する位置とは異なる。このペプチドの７位および８位は、該工程のＨＦ開裂態様との適合性に関して選択された。Ｂoc ＧlyＯＣＨ₂ＰＡＭ樹脂６５０mg(０.５mＭ)に対し、Ｇlu⁷に使用する側鎖保護がＣhxlである所望の合成を達成した。実施例１に記載した通り、ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置でダブルカップリングを行った。ペプチジル樹脂２.０８ｇ(９７％)を乾燥後に得た。ＨＦ開裂を実質的には実施例２に従って行った。集めた固体の水性洗浄物のＨＰＬＣ分析を行って、残りの水溶液１００mlを分取クロマトグラフィーにより精製した。画分９０−１０７を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、４００mg得た。ＨＰＬＣ分析は、約９５％＋の純度を示した。アミノ酸の割合は理論値と一致し、また質量分析データにより、所望の分子量(２３２９.７８)の生成物の存在を確認した。実施例４複合抗原性提示乳腺炎ペプチド： (ＡＶＫＶＡＩＤＧＦＧＲＩＧＲＬＡＦＲＡＩＱＧ)₄ＭＡＰＳ４−分枝の合成ＭＡＰ４−分枝 t−Ｂoc樹脂［Ａpplied Ｂiosysrems］１ｇに対し、Ｂocアミノ酸を用いて、ダブルカップリングと同時にＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置で実施例１と同じ固相合成を行った。乾燥して、ペプチジル樹脂２.７ｇを得て、m−クレゾール２mlおよび液体ＨＦ２５mlを開裂に使用した。ＨＦの除去およびエーテルによる沈殿後、固体を濾過し、エーテルで洗浄して、５０％ aq ＨＯＡcで、１０％ aq ＨＯＡcで、また水で洗浄することにより、ペプチドを集めた固体から抽出した。合わせた水性濾液を凍結し、凍結乾燥して、８３０mg得た。高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)分析は広幅のハンプ(hump)のみを示し、またアミノ酸分析は、理論値の６８％〜１２７％に及ぶ割合を与えた。タンパク含量は、３６％であることが分かった。その生成物をさらなる精製／特性決定なしに免疫処置に使用した。実施例５ワクチンの製剤化本発明の好ましい乳腺炎ワクチンをダブルエマルション(水中油中水型)として調製した。所望の量の好ましいペプチドを、０.５％ＣaＣl₂を含む無菌リン酸塩緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)に溶解して、マイクロアタッチメントを有するＯmn i社の混合機を用い、等量のＣＦＡ［Ｄifco］に乳化した。氷浴を使用して、ペプチドに対する熱傷害を防いだ。別の乳化プロトコルでは、２本のガラス製シリンジとＬeurのロックバルブを使用し、エマルションを２つのシリンジの間に繰り返し移さなくてはならない。乳化方法に関係なく、エマルションを水性媒体中での分散に抵抗する能力に関して試験すべきである。一滴のエマルションを水に入れて、エマルションの分散に関して観察することにより、エマルションの試験を行う。エマルションの液滴が水に数分間安定なら、そのエマルションは十分である。次いで、マイクロアタッチメントを有する混合機を用い、油(ＣＦＡ)に乳化したＰＢＳ(初期水相)中のペプチドを等量の２％ＴＷＥＥＮ^TM８０［Ｓigma］に乳化した。同様にＬeurのロックバルブを有するシリンジが乳化に十分働くであろう。実施例６免疫処置プロトコルウシでの研究免疫処置手順を開始する前に、少量の血液試料を各々の動物から採取した。各々の研究動物に関するプレブリード(prebleed)値をＰＲＥとして表Ｉに与える。全ての免疫処置は、示された注射物質１mlからなっており、また注射は全て皮下であった。実験グループがワクチンを投与されるたびに、対照グループの動物にはＰＢＳ１mlを与えた。初期免疫処置は、実施例５に詳述したような改質した完全フロインドアジュバントに乳化した好ましいペプチド５０μgからなっていた。初めに注射してから７日後、各々の「実験動物」には、改質した不完全フロインドアジュバント中の７５μg(全量１ml)の第二注射を皮下注射により与えた。実験動物には、改質した不完全フロインドアジュバント中の好ましいペプチド１００μgを与えた。全ての実験動物に改質した不完全フロインドアジュバント１００ugを与えて最初に免疫処置した後７週間にブースターを与えた。血液試料を採取して、細菌の延性上皮細胞への結合を阻害することができる抗体の存在に関して評価した。ヤギでの研究ウシでの研究を行うことに伴う途方もないコストにより、予備研究をヤギで行って、血清変換(本発明の好ましいペプチド免疫原に対する抗体産生)を記録証明することになった。免疫処置プロトコル、ブリーディング(bleeding)計画およびそこから得られた結果を以下に与える。実施例７ウシ乳房上皮細胞調製Ａ．組織回収動物は、正常な乳房活性、すなわち病気または外傷がないことに関して選択された。捕虜ボルトを用いて安楽死させて、乳房全体を除去した。その乳房を無菌の０.８５％生理食塩水で広範囲にわたり室温で洗浄した。乳房を正中靭帯(medi an ligament)と平行に二等分した。健康な組織を採取した。健康な組織の認識には、このタイプの組織に関する知識が幾らか必要である。この手順を行うことを望む技術者がそのような事柄に対する技量を持っていないならば、本発明者らは、見た目が顆粒状である組織のみを採取することを示唆する。組織フラグメントが２０ゲージ針を通過するであろうものとなるまで、採取した組織標本をより小さな片に切り分ける。その組織フラグメントを、ゲンタマイシンおよびフンギゾン(５０ppm)が補われているＨanksの平衡塩類溶液(ＨＢＳＳ)［ＧＩＢＣＯ］を含む無菌容器に入れる。ＨＢＳＳは、ＭgおよびＣaを含む２つの変種で入手できる。以下、ＭgおよびＣaを含んでいないＨＢＳＳをＨＢＳＳ−と呼ぶ。当業者らは、結果として生ずる初代培養における汚染の危険を最小とするために、外科的に採取した試料を、強力な抗生物質および抗真菌薬を含む生理学的に許容し得る溶液で洗浄することの必要性を認めるであろう。他の塩類溶液、抗生物質および抗真菌薬は作用するであろうし、また単に選択の問題である。Ｂ．組織調製工程Ａで調製した組織約１００ｇを新たな氷冷ＨＢＳＳ約４００mlに入れた。その組織を、その後の処置の間、可能な限り氷上で維持して、これらの手順を出来る限り迅速に行った。その小組織片の試料を無菌皿に取り除いて、軟らかな稠度となるまで細かく切り刻んだ。細かく切り刻んだ試料をプールして、その上清が見た目で白く濁らなくなるまで冷ＨＢＳＳで洗浄した。Ｃ．消化手順酵素「カクテル」を調製し、細胞内マトリックスを消化して個々の細胞を遊離させた。その酵素溶液は、以下の成分を、ゲンタマイシンおよびフンギゾンを含むＨＢＳＳ−４００mlに溶解することにより調製した：コラゲナーゼ−１.３８ｇ；α−キモトリプシン−１ｇ；エラスターゼ−２０mg；ヒアルロニダーゼ−１ｇ；大豆トリプシン阻害剤−５０mg；およびウシ血清アルブミン−１０ｇ。前述の試薬は、多くの生物学的試薬業者から入手できる。Ｓigma Ｃhemical社およびＷorthington Ｂiochemicalsが好ましい入手元である。先に調製した酵素カクテルを濾過滅菌して、組織約１００ｇを消化するために使用した。消化を３７℃で約４５分間続けた。正確な時間は、温度、混合、組織フラグメントの大きさ、酵素の活性等により左右されるであろう。本発明者らは、消化混合物のアリコートを定期的に除去して、約１００個以上の細胞を含むクランプの存在に関して観察することを推奨した。顕微鏡および血球計数器がこの目的に十分である。消化管を３７℃の水浴またはインキュベーター(インキュベーターに比べて迅速な熱平衡により、水浴が好ましい)から取り除いて、液体を濾過するために２０メッシュの篩を用い、液体を無菌ビーカーにデカントした。約２００個以上の細胞を含む残りのクランプがもしあれば、ゴム製ポリスマン(適切なゴム製末端を有するシリンジプランジャーもまた働くであろう)を用いることにより部分的に破壊する。消化物を水浴に戻し、綿密にモニターして、１つのクランプにつき５０〜１００個の細胞からなる腺房の調製物を得た。過剰消化の回避は生産可能性、また従って、調製物の有用性に必須である。フラスコを水浴から取り除いて、液体を無菌ＣＥＬＬＥＣＴＯＲ^TM篩(２０メッシュ)に通してデカントして、必要ならばポリスマンを用い、メッシュを通過しなかった残りのクランプを全て破壊した。メッシュに残っている組織を捨てて、細胞調製物を遠心分離管に入れた。その細胞を遠心分離によりペレットとし、ＨＢＳＳで２回洗浄して、２０％ウシ胎児血清および１０％ジメチルスルホキシドを約６×１０⁶細胞／mlの細胞濃度で含む、アールの塩類［ＧＩＢＣＯ］を加えたメディア１９９に再び懸濁させた。Ｄ．組織貯蔵工程Ｃから得られた細胞調製物を１mlのアリコートに分けて、２.０mlのプラスチック製冷凍バイアル［Ｓarstedt,Ｗ.，ドイツ］に入れた。そのバイアルを −７０℃のフリーザー中で２４時間あらかじめ凍結しておいた後、最終的な貯蔵では液体窒素中に移した。実施例８結合阻害アッセイＡ．乳房上皮細胞３つの冷凍バイアルの乳房上皮細胞をプールして、ＰＨＳ４０ml(２５℃でp Ｈ７.２)で３回洗浄した。Ｂ．細菌増殖以前、乳房上皮細胞に付着することが測定されているＳtaphylococcus aureus 株の１播種ループを無菌トリプチカーゼ(trypticase)大豆ブロス５mlに移して、３９℃で２０時間インキュベートした。細胞を遠心分離により収集して、等量のＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、その細胞を１０⁶細胞／mlの割合でＰＢＳに懸濁させた。Ｃ．細菌付着アッセイ無菌の１２×７５mＭのガラス管中、洗浄した乳房上皮細胞(１０⁴細胞／ml 懸濁液の０.５ml)を工程Ｂで調製した細菌細胞懸濁液０.５mlと混合して、振盪浴上、３９℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞混合物をＰＢＳで４回洗浄して、付着していない細菌を全て除去した。塗抹標本をつくった後、空気乾燥して、グラムクリスタルバイオレット染色材で１５秒間染色した。多くの塗抹標本で２５個の乳房細胞に結合したＳtaphylococcus aureusの数を計数することにより、１００個の上皮細胞に結合する細菌の数を測定した。一部は、免疫処置した動物から得られる血清をタイタリングして(tittering) 、希釈系列が結合を阻害する能力に関連づけることにより、本発明のワクチンの有効性を測定した。これらの研究から得られたデータを１１頁の表Ｉに要約する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．一般構造式：Ｒ¹-Ｒ²-Ｒ³-Ｒ⁴-Ｒ⁵-Ｒ⁶-Ｒ⁷-Ｒ⁸-Ｇly-Ｒ¹⁰-Ｇly-Ｒ¹²-Ｒ¹³-Ｇly-Ｒ¹⁵-Ｒ¹⁶- Ａla-Ｒ¹⁸-Ａrg-Ａla-Ｒ²¹-Ｇln-Ｇly-Ｒ²⁴ ［式中、Ｒ¹は水素またはＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸であり；Ｒ²はＡla、Ｇly、Ｓerまたはプロピオン酸であり；Ｒ³はＶal、Ｉle、ＬeuまたはＤ-Ｖalであり；Ｒ⁴はＬysまたはＡrgであり；Ｒ⁵はＶal、ＩleまたはＬeuであり；Ｒ⁶はＡla、ＧlyまたはＳerであり；Ｒ⁷はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ⁸はＡsp、ＡsnまたはＧluであり；Ｒ¹⁰はＰhe、ＴyrまたはＴrpであり；Ｒ¹²はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹³はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ¹⁵はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹⁶はＬeu、Ａla、ＩleまたはＶalであり；Ｒ¹⁸はＰhe、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ²¹はＩle、Ａla、ＶalまたはＬeuであり；またＲ²⁴はＯＨ、ＡlaまたはＳerである］を有する乳腺炎ワクチンペプチド。２．式中、Ｒ²がＡlaであり；Ｒ³がＶalであり；Ｒ⁴がＬysであり；Ｒ⁵がＶal であり；Ｒ⁶がＡlaであり；Ｒ⁷がＩleであり；Ｒ⁸がＡspであり；Ｒ⁹がＧlyであり；Ｒ¹⁰がＰheであり；Ｒ¹¹がＧlyであり；Ｒ¹²がＡrgであり；Ｒ¹³がＩleであり；Ｒ¹⁵がＡrgであり；Ｒ¹⁶がＬeuであり；Ｒ¹⁸がＰheであり；Ｒ²¹がＩleであり；またＲ²⁴がＯＨである、請求項１に記載の乳腺炎ワクチンペプチド。３．一般構造式：［式中、ペプチド¹、ペプチド²、ペプチド³、およびペプチド⁴は、式：Ｒ¹-Ｒ²-Ｒ³-Ｒ⁴-Ｒ⁵-Ｒ⁶-Ｒ⁷-Ｒ⁸-Ｇly-Ｒ¹⁰-Ｇly-Ｒ¹²-Ｒ¹³-Ｇly-Ｒ¹⁵-Ｒ¹⁶- Ａla-Ｒ¹⁸-Ａrg-Ａla-Ｒ²¹-Ｇln-Ｇly-Ｒ²⁴ （式中、Ｒ¹は水素またはＣ₁−Ｃ₁₆カルボン酸であり；Ｒ²はＡla、Ｇly、Ｓerまたはプロピオン酸であり；Ｒ³はＶal、Ｉle、ＬeuまたはＤ-Ｖalであり；Ｒ⁴はＬysまたはＡrgであり；Ｒ⁵はＶal、ＩleまたはＬeuであり；Ｒ⁶はＡla、ＧlyまたはＳerであり；Ｒ⁷はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ⁸はＡsp、ＡsnまたはＧluであり；Ｒ¹⁰はＰhe、ＴyrまたはＴrpであり；Ｒ¹²はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹³はＩle、ＬeuまたはＶalであり；Ｒ¹⁵はＡrg、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ¹⁶はＬeu、Ａla、ＩleまたはＶalであり；Ｒ¹⁸はＰhe、Ａsn、ＬysまたはＨisであり；Ｒ²¹はＩle、Ａla、ＶalまたはＬeuであり；またＲ²⁴はＯＨ、ＡlaまたはＳerである）で示される化合物から独立して選択される］を有する複合抗原性提示ペプチド。４．式中、ペプチド¹、ペプチド²、ペプチド³、およびペプチド⁴が各々、式中、Ｒ²がＡlaであり；Ｒ³がＶalであり；Ｒ⁴がＬysであり；Ｒ⁵がＶalであり；Ｒ⁶ がＡlaであり；Ｒ⁷がＩleであり；Ｒ⁸がＡspであり；Ｒ⁹がＧlyであり；Ｒ¹⁰がＰheであり；Ｒ¹¹がＧlyであり；Ｒ¹²がＡrgであり；Ｒ¹³がＩleであり；Ｒ¹⁵がＡrgであり；Ｒ¹⁶がＬeuであり；Ｒ¹⁸がＰheであり；Ｒ²¹がＩleであり；またＲ²⁴ がＯＨである化合物からなる、請求項３に記載の複合抗原性提示ペプチド。５．アジュバント中に請求項１に記載の化合物を含んでなる医薬品製剤。６．アジュバント中に請求項３に記載の化合物を含んでなる医薬品製剤。７．付着の原因となる分子を決定する方法であって、（ａ）微生物の付着性および非付着性変種の細胞壁または細胞膜抽出物を調製して、（ｂ）工程（ａ）の抽出物を比較して、付着性変種には存在するが、非付着性変種には存在しない分子を決定する、ことを含んでなる方法。８．微生物がグラム陽性細菌である、請求項７に記載の方法。９．乳腺炎に関係する細菌である、請求項８に記載のグラム陽性細菌。１０．請求項７の方法により同定される免疫原性ペプチドを含んでなるワクチン。