RU2143920C1 - Конструирование и получение вакцины - Google Patents
Конструирование и получение вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2143920C1 RU2143920C1 RU96112189A RU96112189A RU2143920C1 RU 2143920 C1 RU2143920 C1 RU 2143920C1 RU 96112189 A RU96112189 A RU 96112189A RU 96112189 A RU96112189 A RU 96112189A RU 2143920 C1 RU2143920 C1 RU 2143920C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ala
- val
- peptide
- ile
- gly
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 45
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- -1 R 5 represents Val Chemical compound 0.000 claims description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 4
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 claims description 3
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 13
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 6
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- HIGSLXSBYYMVKI-UHFFFAOYSA-N pralidoxime chloride Chemical compound [Cl-].C[N+]1=CC=CC=C1\C=N\O HIGSLXSBYYMVKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 3
- 101001050984 Apple stem grooving virus (strain Korea) Putative movement protein Proteins 0.000 description 2
- 101001050983 Apple stem grooving virus (strain P-209) Probable movement protein Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- JDRAOGVAQOVDEB-KTKRTIGZSA-N (3-hydroxy-2,3,3a,5,6,6a-hexahydrofuro[3,2-b]furan-6-yl) (z)-octadec-9-enoate Chemical compound OC1COC2C(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC21 JDRAOGVAQOVDEB-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical group O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MENAYYMPBRSAAE-AWEZNQCLSA-N 3-[[5-[[(2s)-1-carboxy-3-oxopropan-2-yl]carbamoyl]pyridin-2-yl]methylsulfamoyl]benzoic acid Chemical compound N1=CC(C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C=O)=CC=C1CNS(=O)(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 MENAYYMPBRSAAE-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical group OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000007757 Media 199 Substances 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Chemical group OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Chemical group 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011126 aluminium potassium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000009841 combustion method Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000012351 deprotecting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940050271 potassium alum Drugs 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/085—Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/823—Bacterial vaccine for bovine species, e.g. cattle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение предназначено для определения и получения пептидов, связанных с бактериальной адгезией к эластичным эпителиальным тканям молочных желез, которые могут быть использованы в вакцинах для предупреждения мастита сельскохозяйственных животных. Для определения наличия специфических белков у бактерий например у Str. aureus, обладающих способностью прилипать или не прилипать к эластичным эпителиальным клеткам, получают и экстрагируют стенки клеток бактерий. Белки, присутствующие у адгезирующих бактерии, но отсутствующие у бактерий, используют для получения пептидного субфрагмента. Этот пептид составляет основу маститной вакцины настоящего изобретения. Изобретение позволит получить эффективную вакцину против мастита, блокирующую адгезию штаммов Str. aureus к эластичным эпителиальным клеткам молочных животных. 5 c. и 3 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
Настоящее изобретение предлагает способы определения механизмов микробного прилипания. Знание механизмов, лежащих в основе адгезии микробов, дает возможность выявить молекулу микроба, ответственную за прилипание и, следовательно, позволяет создать вакцину, которая могла бы быть использована для предупреждения или снижения до минимума адгезии микробов к клеткам, медицинским инструментам, протезам и т.д. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммунологии и микробиологии.
Адгезия различных бактерий и других микроорганизмов к специфическим клеткам, а также к имплантируемым приспособлениям, таким как протезы, имплантируемые дефибрилляторы, сердечные ритмоводители, искусственные сосуды и др. , является серьезной клинической проблемой. Устойчивость прилипающих организмов к антибиотикам и противогрибковым препаратам еще больше усложняет задачу.
Настоящее изобретение включает методы определения природы микробной адгезии посредством оценки несоответствия между поверхностями слипшихся клеток микроорганизмов и неслипшихся организмов. Действенность и необходимость настоящего изобретения иллюстрируется применением описанных выше методов для определения природы адгезии различных видов Staphy-lococcus aureus к эпителиальным клеткам молочных желез коров. Маститная вакцина настоящего изобретения, которая представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, иллюстрирует вакцины, получаемые в соответствии со способами настоящего изобретения.
Как известно, целый ряд грам-положительных организмов вызывает маститы. Грам-положительные организмы, такие как, например,. Streptococci, Staphylococci и Corynebacteria spp., часто рассматривают в качестве агентов, вызывающих маститы.
Способность микроорганизмов вызывать маститы коррелируется со способностью этих организмов прилипать к эластичным эпителиальным клеткам вымени коров (А. J. Frost, Infection and Immunity, 12:1554-1556 (1975)).
В маститных вакцинах настоящего изобретения используется зависимость между способностью микроорганизмов прилипать к эластичным эпителиальным клеткам вымени коров и конечным патогенезом. С целью определения наличия специфичных белков у бактерий, обладающих способностью прилипать к эластичным эпителиальным клеткам, и бактерий, не обладающих способностью прилипать к названным клеткам, получают и экстрагируют стенки клеток бактерий. Белки, присутствующие в слипшихся бактериях, но отсутствующие в бактериях, не способных прилипать к соответствующим клеткам, в дальнейшем используют для получения пептидного субфрагмента, который составляет основу рассматриваемой маститной вакцины настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предлагает способы конструирования вакцин путем получения экстрактов клеточных стенок или мембран, выявления молекул, обуславливающих адгезию при сравнении слипшихся и неслипшихся микробов, биохимического описания молекул, обуславливающих адгезию и использования полученной информации с целью рационального создания вакцины, которая вызывает иммунные реакции, вызывающие, в свою очередь, нарушение способности микроба к адгезии.
Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения предлагает пептидный субфрагмент, который связан с бактериальной адгезией к эластичным эпителиальным клеткам, а также его производные формулы I:
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7- R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15- R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, lLe, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lys или Arg;
R5 представляет собой Val, lle или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой lle, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arcg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой lle, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, lle или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой lle, Ala, Vai или Leu;
R24 представляет собой ОН, Ala или Ser.
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7- R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15- R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, lLe, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lys или Arg;
R5 представляет собой Val, lle или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой lle, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arcg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой lle, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, lle или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой lle, Ala, Vai или Leu;
R24 представляет собой ОН, Ala или Ser.
Настоящее изобретение также предлагает пептид сложного антигенного представления с формулой II:
где пептид1, пептид2, пептид3 и пептид4 независимо друг от друга выбирают из числа соединений формулы 1.
где пептид1, пептид2, пептид3 и пептид4 независимо друг от друга выбирают из числа соединений формулы 1.
Настоящее изобретение также предлагает пептиды и сложные антигенные пептиды в рецептурах, в которых достигается максимальная иммунная реакция на указанные пептиды или указанные пептиды сложного антигенного представления.
Эффективная борьба с маститами коров имеет огромное значение. Молочных животных, страдающих маститом, необходимо лечить с помощью антибиотиков, а такое лечение может привести к накоплению этих антибиотиков в молоке, что по современным регулирующим законам недопустимо. Таким образом, разработка эффективной вакцины против мастита коров имеет коммерческое значение и дает возможность исключить необходимость лечения животных антибиотиками.
Соединение формулы I
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 -Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15- R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lys или Arg);
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Vai или Leu;
R24 представляет собой ОН, Ala или Ser,
было получено в результате интенсивных исследований, направленных на определение механизма, посредством которого этиологические маститные агенты прилипают к эластичным эпителиальным клеткам молочных желез молочного скота. Штаммы Staphylococcus aureus сравнивают по их способности прилипать к эластичным эпителиальным тканям молочных желез и затем разделяют на две соответствующие группы. Из сросшихся и несросшихся штаммов S. aureus экстрагируют препараты внешних мембран и сравнивают на наличие белков, обнаруженных в сросшихся штаммах, но отсутствующих в несросшихся штаммах. Выявлено три белка, которые присутствуют в сросшихся, но отсутствуют в несросшихся штаммах. Молекулярный вес этих белков составляет 36 кДа, 47кДа и 65 кДа. После химического описания указанных белков белок 36 кДа был выбран как наиболее приемлемый с точки зрения для получения вакцин, защищающих от мастита. Пептид из 22 аминокислот, соответствующий аминному концу белка 36 кДа, был в конечном итоге выбран в качестве оптимального иммуногена для получения противомаститной вакцины. Природная последовательность 22 аминокислот N-конца является предпочтительной для вакцины. Следовательно, в формуле I предпочтительными аминокислотными заместителями являются следующие:
R1 представляет собой атом водорода, R2 представляет собой Ala, R3 представляет собой Val, R4 представляет собой Lys, R5 представляет собой Val, R6 представляет собой Ala, R7 представляет собой Ile, R8 представляет собой Asp, R9 представляет собой Gly, R10 представляет собой Phe, R11 представляет собой Cly, R12 представляет собой Arg, R13 представляет собой Gle, R25 представляет собой Arg, R16 представляет собой Leu, R18 представляет собой Phe, R21 представляет собой Ile и R24 представляет собой гидроксигруппу. Другие возможные заместители в формуле 1 выбираются на основе известных биохимических и иммунологических свойств аминокислот, имеющих аналогичные функциональные группы. Настоящее изобретение включает также иммуногенный субфрагмент соединения формулы I. Пептид сложного антигенного представления формулы II дает представление сложных иммуногенных пептидов формулы I и, таким образом, обеспечивает более крупную молекулу иммуногенных субъединиц, которая может более эффективно вызывать иммунные реакции. Пептиды формулы I, присутствующие в сложном антигенном представлении пептида формулы II, могут быть одним и тем же пентидом или любым сочетанием пептидов формулы I.
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 -Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15- R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lys или Arg);
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Vai или Leu;
R24 представляет собой ОН, Ala или Ser,
было получено в результате интенсивных исследований, направленных на определение механизма, посредством которого этиологические маститные агенты прилипают к эластичным эпителиальным клеткам молочных желез молочного скота. Штаммы Staphylococcus aureus сравнивают по их способности прилипать к эластичным эпителиальным тканям молочных желез и затем разделяют на две соответствующие группы. Из сросшихся и несросшихся штаммов S. aureus экстрагируют препараты внешних мембран и сравнивают на наличие белков, обнаруженных в сросшихся штаммах, но отсутствующих в несросшихся штаммах. Выявлено три белка, которые присутствуют в сросшихся, но отсутствуют в несросшихся штаммах. Молекулярный вес этих белков составляет 36 кДа, 47кДа и 65 кДа. После химического описания указанных белков белок 36 кДа был выбран как наиболее приемлемый с точки зрения для получения вакцин, защищающих от мастита. Пептид из 22 аминокислот, соответствующий аминному концу белка 36 кДа, был в конечном итоге выбран в качестве оптимального иммуногена для получения противомаститной вакцины. Природная последовательность 22 аминокислот N-конца является предпочтительной для вакцины. Следовательно, в формуле I предпочтительными аминокислотными заместителями являются следующие:
R1 представляет собой атом водорода, R2 представляет собой Ala, R3 представляет собой Val, R4 представляет собой Lys, R5 представляет собой Val, R6 представляет собой Ala, R7 представляет собой Ile, R8 представляет собой Asp, R9 представляет собой Gly, R10 представляет собой Phe, R11 представляет собой Cly, R12 представляет собой Arg, R13 представляет собой Gle, R25 представляет собой Arg, R16 представляет собой Leu, R18 представляет собой Phe, R21 представляет собой Ile и R24 представляет собой гидроксигруппу. Другие возможные заместители в формуле 1 выбираются на основе известных биохимических и иммунологических свойств аминокислот, имеющих аналогичные функциональные группы. Настоящее изобретение включает также иммуногенный субфрагмент соединения формулы I. Пептид сложного антигенного представления формулы II дает представление сложных иммуногенных пептидов формулы I и, таким образом, обеспечивает более крупную молекулу иммуногенных субъединиц, которая может более эффективно вызывать иммунные реакции. Пептиды формулы I, присутствующие в сложном антигенном представлении пептида формулы II, могут быть одним и тем же пентидом или любым сочетанием пептидов формулы I.
Синтез пептидов формулы I может быть легко осуществлен с использованием хорошо известных методик твердофазного синтеза белка. Схемы твердофазных белковых синтезов настоящего изобретения основаны на использовании защитных групп с последующим их снятием. Несмотря на достаточно рутинную природу современных твердофазных пептидных синтезов, для облегчения реализации на практике настоящего изобретения заявители рекомендуют три обзорные работы - G. Barany, et al. International Journal of Peptide and Protein Research, 30: 705-739 (1987); J. M. Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984); P.D. Bailey, An Introduction to Peptide and Protein Chemistry, John Wiley and Son. New York (1992) которые могут быть полезны при выборе обычных защитных групп и условий проведения реакций, реагентов для снятия защиты и соответствующих методик, расщепляющих реагентов и рекомендуемых условий и т.д., в тех случаях, когда квалифицированный специалист затрудняется в выборе предпочтительных условий и методик проведения синтеза. Заявители использовали автоматизированный синтезатор пептидов фирмы Applied Biosystems, который полностью укомплектован производителем описанием рекомендуемых методик, растворителями, реагентами и т. д. Конкретные описания практического использования твердофазных синтезов представлены в примерах.
Ниже для более полного понимания настоящего изобретения приведены некоторые термины и аббравеатуры, используемые в данном описании. "Boc" означает трет. -бутоксикарбонил, "Тозил" означает п-толуолсульфонил, "Chxl" означает циклогексил. "2Cl-Z" относится к 2-хлорбензилоксикарбонилу, "С1-С16-карбоновая кислота" означает неразветвленный углеводород, содержащий от 1 до 16 атомов углерода в дополнение к "аминоконцевой" карбоновой кислоте. Необязательная С1-С16-карбоксильная группа формулы 1 является только концевой аминогруппой. В степени замещения и насыщения остатка С1-С16-карбоновой кислоты существует определенная свобода. Примерами подходящих алициклических карбоновых кислот являются: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая, энантовая, каприловая, пеларгоновая, каприновая, ундекановая и додекановая кислоты. Как указывалось выше, могут также использоваться ненасыщенные алициклические монокарбоновые кислоты и замещенные насыщенные и ненасыщенные монокарбоновые кислоты. Квалифицированный специалист будет оценивать генетическую пластичность каждого фрагмента, единственная функция которого заключается в формировании конца. Таким образом, настоящее изобретение включает C1-C16-карбоновые кислоты и их рассмотренные выше модификации.
LYS в формуле II означает лизин. Субъединицы (R1-R24) соединения формулы (I) обычно представляют собой L-аминокислоты, за исключением пропионовой кислоты в положении R4 и D-Vai в положении R3. Соответственно связи между субъединицами представляют собой пептидные связи. Концы пептидов в формулах I и II (R1-R24) определяют таким образом, чтобы учесть наличие атома водорода или гидроксильной группы, которые при добавлении другой аминокислоты исключаются. Таким образом, когда заместитель R1 = H, атом водорода не является дополнительным атомом водорода, а является атомом водорода соответствующей аминокислоты или пропионовой кислоты R2. Аналогично, когда заместитель R24 = ОН, гидроксильная группа является не дополнительной OH-группой, а OH-группой аминокислоты R23. Если заместитель R24=Ala или Ser, то присутствует полная аминокислота и концевая карбоксильная группа карбоновой кислоты доступна для образования амидной связи, если необходимо получение соединения формулы II. Пропионовая кислота в положении R2 может быть либо н-пропионовой кислотой, либо изо-пропионовой.
Предпочтительно выделение (по технологии генной инженерии) пептидов формулы I, которые состоят из L-аминокислот. Таким образом, пептиды формулы 1, которые содержат только природные аминокислоты, могут быть наиболее эффективно получены по технологии генной инженерии с использованием аминокислотных последовательностей и известного вырождения генетического кода для создания экспрессирующего вектора, способного выделять большие количества пептида при минимальных затратах.
Современное состояние молекулярной биологии, промышленная доступность обычных ДНК-последовательностей и экспрессирующих векторов для использования в бактериях, дрожжах и клетках млекопитающих таково, что нет необходимости в подробном обсуждении генной инженерии. Специалист, желающий на практике реализовать достижения генной инженерии для получения пептидов настоящего изобретения, может обратиться к работами J. Sambrook, et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed" 1989); F.M. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (1989). Названные выше работы служат прекрасным дополнением к любому обсуждению генной инженерии.
Рецептуры, подходящие для того, чтобы вызвать иммунную реакцию, хорошо известны. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ, CFA), по-видимому, является наилучшим адъювантом из числа известных адъювантов, обеспечивающих получение оптимальной иммунной реакции. Однако присутствие в полном адъюванте Фрейнда Micobacteria и воспаление, появляющееся при его повторных введениях, ограничивают применение такого адъюванта для лечения молочных животных.
В настоящее время существует целый ряд адъювантов на основе природных и синтетических масел, и они легко могут быть использованы в настоящем изобретении. Краткое обсуждение таких адъювантов приводится ниже.
К адъювантам может быть отнесен любой препарат, который при одновременном введении с антигеном повышает иммунную реакцию на антиген. Антигены представляют собой материалы, которые отрицательно воздействуют на иммунную систему хозяина и вызывают иммунную реакцию на материал, нарушающий работу иммунной системы (то есть антиген).
Механизм действия адъювантов недостаточно ясен, но полагают, что они притягивают иммунореактивные лимфоциты к сайту антигена, локализуют антиген на сайте воспаления (депо-эффект), задерживают катарболизм антигена, активируют метаболизм реактивных клеток и стимулируют взаимодействие лимфоидных клеток.
Адъюванты могут действовать и по другим механизмам. Например, они могут связывать и модифицировать аутоантиген, изменять его конфигурацию на границе раздела вода/масло адъюванта Фрейнда или неспецифически стимулировать Т и/или В- лимфоциты.
Большое число адъювантов также может продуцировать и неспецифическое "увеличение" иммунореактивности, если их вводят без специфического антигена. Эффективными адъювантами являются масла, минеральные соли, двухспиральные нуклеиновые кислоты, продукты микроорганизмов и целый ряд других агентов.
Наиболее широко известными масляными адъювантами являются полный и неполный адъюванты Фрейнда, которые кратко описаны выше. Эти адъюванты содержат эмульсию воды или солевого раствора в масле. Обычно растворимый антиген растворяют в солевом растворе и эмульгируют в равных частях масла; например,- Bayol FTM (42.5% парафина, 31.4% моноциклических нафталинов и 26.1% полициклических нафталинов) или Arlacel А (монолат маннита). Добавление нейтрализованных Mycobacteria значительно повышает активность адъювантов и такие адъюванты называют полными, в отличие от неполных адъювантов, не содержащих Mycobacteria. Другие микробные продукты, в том числе экстракты липидов белка, также могут быть использованы вместо микобактерий. Установлено, что наблюдаемое повышение эффективности антигенов в присутствии полных адъювантов обусловлено, главным образом, гликолипидной и пептидогликановой частями (воск Д) Mycobacteria.
Вакцины, в которых используется одноэмульсионная система адъювантов, наиболее эффективны при подкожном или внутрикожном введении. Двойные эмульсии (вода-в масле-в воде) представляют собой более "свободно-текучие" эмульсии и имеют больше возможных вариантов введения.
Использование минеральных солей является еще одним способом повышения иммуногенности и, следовательно, эффективности вакцины. Растворы антигенов, осажденных минеральными солями, такими как фосфат калия, двуокись кремния, квасцы (алюмокалиевые квасцы или фосфат алюминия) или паста окиси алюминия, продуцируют гранулемы на участке инъекции и в лимфатических узлах, которые денируют область инъекции. Иммунная гранулема функционирует аналогично гранулеме, продуцируемой адъювантом Фрейнда. Осажденные квасцами антигены используются для повышения иммунной реакции у человека при профилактической вакцинации к антигенам, например, к дифтерийному токсину.
Нерастворимые коллоидные носители составляют еще один класс адъювантов. Кроме осадков квасцов для приготовления адъювантов могут быть использованы коллоидные носители или отдельно, или в сочетании с микробными продуктами или экстрактами и антигеном. Для стимулирования продуцирования антитела против абсорбированных антигенов, как оказалось, может быть использована blood charcoal. Свойствами адъювантов обладают также альгинат кальция или альгинат натрия с контролируемой длиной полимерной части. Полиакриламидные гели также достаточно эффективно стимулируют продуцирование антитела к небольшим количествам инкапсулированного антигена. В качестве эффективного адъюванта успешно используют бентонит.
Метилированный сывороточный альбумин и другие положительно заряженные белки достаточно эффективны в качестве адъювантов при смешении с образованием осадка с отрицательно заряженным антигеном, ДНК или полинуклеотидом с образованием.
Использование микробных экстрактов в качестве адъювантов уже кратко описывалось. Эндотоксины, такие как внутриклеточные липополисахариды грам-отрицательных бактерий, обладают способностью увеличивать иммунную реакцию. Эндотоксины могут выполнять функцию адъюванта, если они назначаются систематически, но более эффективным, если их вводят вместе с антигеном. Большое число эндотоксинов способно стимулировать синтез антител и пролиферацию В-клеток, а также увеличивать фагоцитарную активность посредством макрофагов. Предпочтительными эндотоксинами являются эндотоксины из E. coli 0111:В4. видов S. Typhimurium; S. enteriditis и S, minnesota. Клетки стенок Mycobacteria и некоторые грибы также повышают иммунную реакцию. Эти агенты, по-видимому, притягивают и активируют макрофаги, увеличивая таким образом фагоцитоз на участке воспаления, вызванного антигеном, что в свою очередь приводит к увеличению антигенного проявления А-клетками и в свою очередь увеличивает возбуждение антиген-реактивных клеток В-лимфоцитов, а также медиаторные функции клеток (Т-клеток).
Полинуклеопептиды, особенно двухспиральные полинуклеотиды, такие как полиинозин-полицитидиловая (поли-ИЦ) кислота или полиадениловая-полиуридиловая (полу-АУ) кислота являются потенциальными адъювантами и иммуностимуляторами. Они, как оказалось, действуют путем активации антигенреактивности Т-клеток. Полинкулеотиды также могут служить для активации макрофагов.
В качестве адъювантов находят применение Baccillus cal-mette guerin (BCG). : Cogynebacterium parvum., Listeria monocytogenes и Bordetella pertussis или экстракты этих бактерий. Левамизол (антигельминтное средство) также выполняет функцию адъюванта, вероятно, за счет своей способности активировать Т-клетки, повышать уровни комплементарные и активировать макрофаги.
Выбор адъюванта или сочетания адъювантов может быть легко сделан квалифицированным в данной области специалистом. Адъюванты, которые обсуждались выше, могут быть использованы при проведении экспериментальных исследований, а также в практической ветеринарии. Маститные вакцины настоящего изобретения могут быть рецептурированы с использованием любого из названных выше адъювантов, и такое использование любого из адъювантов в сочетании и в комбинации с заявляемыми пептидами подразумевается настоящим изобретением и входит в его объем.
Маститные вакцины настоящего изобретения, как оказалось, эффективно вызывают гуморальные реакции, в том числе образование антител, которые блокируют связывание прилипающих бактериальных штаммов к культивируемым эпителиальным клеткам молочных желез. Протоколы вакцинации и детальное описание метода оценки бактериальной адгезии к эпителиальным клеткам молочных желез коров представлены в примерах. В табл. 1 приведены данные, подтверждающие эффективность маститных вакцин настоящего изобретения с точки зрения стимулирования гуморальных реакций, ингибирующих адгезию S. aureus к эластичным эпителиальным клеткам молочных животных.
Понятие "До" относится к нормализованной способности животных блокировать связывание до вакцинации. Понятие "После" относится к уровню после вакцинации. Величины "БУСТ" соответствуют величинам, наблюдаемым после проведения бустер-вакцинации, описанной в примерах. Методики, используемые при получении данных, представленных в табл. 1, приведены в примере 6.
Вакцины настоящего изобретения особенно полезны в ветеринарии при лечении мастита у молочного скота. Прилипание бактерий к эластичным эпителиальным клеткам при мастите особенно чувствительно к вакцинам настоящего изобретения вследствие того, что способность вакцины блокировать прилипание бактерий приводит к выходу бактерий через нормальные молочные каналы.
Представленные выше обсуждение и результаты относятся в первую очередь к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, в котором заявляемый способ используется для конструирования маститных вакцин. Квалифицированный специалист понимает, что настоящее изобретение может быть экстраполировано на множество других областей, где микробная адгезия составляет проблему и, следовательно, подразумевает и другие варианты применения настоящего изобретения, которые также входят в объем настоящего изобретения.
Примеры, в которых описаны конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, иллюстрируют его, но не ограничивают.
Пример 1.
Синтез AVKVAIDGFGRIGRIAFRAIQG-OH
С помощью циклов двойного связывания на пептидном синтезаторе Applaied Biosystems 430А получают 328 мг (0.25 мМ) смолы Boc- GlyOCH2PAM (Applied Biosystems) с использованием Вое аминокислот со следующими группами, защищающими боковые цепи: Arg (тозил), Asp (Chx1) и Lys (2-Cl-Z). С полученной смолы снимают N-концевую Boc-группу с помощью TFA-цикла для снятия защиты. Затем смолу переносят в HF реакционный сосуд, где удаляют растворитель и сушат смолу в вакууме. Получают 1.03 г. Затем в сосуд добавляют 1 мл м-крезола и подсоединяют к устройству для получения фтористого водорода (HF, Penninsula Lab.), охлаждают до -78oC, откачивают и конденсируют в сосуде приблизительно 15 мл жидкого фтористого водорода. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при охлаждении в ледяной бане, затем удаляют HF и полученный остаток суспендируют в 200 мл этилацетата. Твердый продукт фильтруют через фильтр Шотта и дважды промывают эфиром. Пептид солюбилизируют и отделяют от смолы путем промывания собранного продукта 15 мл 50%-ной водной уксусной кислоты (AcOH) (2 раза). 15 мл 10%-ной водной AcOH (2 раза) и 15 мл воды (1 раз). Объединенные водные фильтраты замораживают и леофилизируют.
С помощью циклов двойного связывания на пептидном синтезаторе Applaied Biosystems 430А получают 328 мг (0.25 мМ) смолы Boc- GlyOCH2PAM (Applied Biosystems) с использованием Вое аминокислот со следующими группами, защищающими боковые цепи: Arg (тозил), Asp (Chx1) и Lys (2-Cl-Z). С полученной смолы снимают N-концевую Boc-группу с помощью TFA-цикла для снятия защиты. Затем смолу переносят в HF реакционный сосуд, где удаляют растворитель и сушат смолу в вакууме. Получают 1.03 г. Затем в сосуд добавляют 1 мл м-крезола и подсоединяют к устройству для получения фтористого водорода (HF, Penninsula Lab.), охлаждают до -78oC, откачивают и конденсируют в сосуде приблизительно 15 мл жидкого фтористого водорода. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при охлаждении в ледяной бане, затем удаляют HF и полученный остаток суспендируют в 200 мл этилацетата. Твердый продукт фильтруют через фильтр Шотта и дважды промывают эфиром. Пептид солюбилизируют и отделяют от смолы путем промывания собранного продукта 15 мл 50%-ной водной уксусной кислоты (AcOH) (2 раза). 15 мл 10%-ной водной AcOH (2 раза) и 15 мл воды (1 раз). Объединенные водные фильтраты замораживают и леофилизируют.
Леофилизированный продукт снова растворяют в 15 мл 50%-ной водной AcOH, 15 мл 10%-ной водной AcOH и 3 мл CH3CN. Отбирают 5 мкл полученного раствора, разбавляют 500 мкл 0.1% TFA и 25 мкл впрыскивают на колонку Vydac С18 (0.46 х 15 см) с использованием для анализа жидкостной хроматографии быстрого разрешения (ЖХБР) (Pharmacia). Объемная скорость потока составляет 0.5 мл/мин. Хроматографию проводят при комнатной температуре. Для постоянного контроля за разделением используют УФ-монитор с фильтром 214 нм и регулировочную шкалу 0.2А на мониторе системы ЖХБР. В качестве раствора для хроматографии А используют 0.1% TFA, в качестве раствора В - 0.1% TFA/50% CH3CN с градиентом 50%В, 5%В, 1%В, 40%В, 0%В и 5%B.
Оставшийся раствор загружают на колонку Vydac С18 (2.2 х 25 см) для препаративной очистки с помощью ЖХБР с использованием градиента 25% В в течение 50 мин, затем с градиентом от 25 до 65% в течение 450 мин. Собирают пятиминутные фракции (25 мл). УФ-поглощение при 214 нм контролируют с помощью регулировочной шкалы 2.0А монитора ЖХБР. Образцы по 40 мкл фракций 60-74 разбавляют в соотношении 1 :10 с помощью 0.1% TFA и 20 мкл каждого образца анализируют с помощью ВЭЖХ. Фракции 64-68 объединяют, замораживают и леофилизируют, получают 112 мг. Образец полученного продукта исследуют с помощью аминокислотного анализа и масс-спектрометрии. Мольные отношения аминокислот подтверждают получение желаемого продукта.
Масс-спектрометрия при бомбардировке быстрыми атомами указывает на наличие помимо желаемого продукта с молекулярным весом 2315.75 двух компонентов с более высоким молекулярным весом (2375.0 и 2357.4). В соответствии с данными ВЭЖХ степень чистоты продукта составляет более 90%.
Пример 2.
Синтез больших количеств AVKVAIDGFGRIGRIAFRAIQG-QH
Методика синтеза, расщепления и очистки аналогична методике, описанной в примере 1. При синтезе AVKVAIDGFGRIGRL-AFRAIQG-OH используют 0.65 г (0.5 мМ) смолы Boc-GlyOCH2PAM и получают 2.1 г конечной пепидилированной смолы (выход 98%). При расщеплении фтористым водородом используют 1.5 мл м-крезола и 20 мл фтористого водорода, после леофилизации получают 1.06 г сырого продукта. В соответствии с данными ВЭЖХ полученный продукт имеет степень чистоты 75%, а аминокислотный анализ показывает, что присутствуют все необходимые аминокислоты. Аминокислотные отношения находятся в ожидаемом для сырого пептида интервале, но разброс величин несколько выше предполагаемого. В масс-спектре отсутствует продукт с массой 2315.75. Отсутствие продукта с такой массой приписывают наличию фрагмента Asp-Gly в положениях 7 и 8 и HF-расщеплению.
Методика синтеза, расщепления и очистки аналогична методике, описанной в примере 1. При синтезе AVKVAIDGFGRIGRL-AFRAIQG-OH используют 0.65 г (0.5 мМ) смолы Boc-GlyOCH2PAM и получают 2.1 г конечной пепидилированной смолы (выход 98%). При расщеплении фтористым водородом используют 1.5 мл м-крезола и 20 мл фтористого водорода, после леофилизации получают 1.06 г сырого продукта. В соответствии с данными ВЭЖХ полученный продукт имеет степень чистоты 75%, а аминокислотный анализ показывает, что присутствуют все необходимые аминокислоты. Аминокислотные отношения находятся в ожидаемом для сырого пептида интервале, но разброс величин несколько выше предполагаемого. В масс-спектре отсутствует продукт с массой 2315.75. Отсутствие продукта с такой массой приписывают наличию фрагмента Asp-Gly в положениях 7 и 8 и HF-расщеплению.
Пример 3.
Синтез AVKVAIEGFGAIGRIAFRAIQG-OH
Синтез, очистку и расщепление проводят по методике примера 1. При проведении данного синтеза положения 7 и 8 отличаются от соответствующих положений продукта примера 2. Положения 7 и 8 этого пептида выбраны так, чтобы они были совместимы с условиями расщепления фтористым водородом данного процесса. С помощью синтеза, при котором для защиты боковой цепи Gly7 служит Chxl, получают 650 мг (0.5 мМ) смолы Вос" GlyOCH2PAM. Двойное связывание осуществляют на пептидном синтезаторе АВ1 430А в соответствии с методикой примера 1. После сушки получают 2.08 г (97%) пепидилированной смолы. По методике примера 2 проводят HF- расщепление. Выделенный и промытый водой твердый продукт анализируют с помощью ВЭЖХ, а оставшиеся 100 мл водного раствора очищают с помощью препаративной хроматографии.
Синтез, очистку и расщепление проводят по методике примера 1. При проведении данного синтеза положения 7 и 8 отличаются от соответствующих положений продукта примера 2. Положения 7 и 8 этого пептида выбраны так, чтобы они были совместимы с условиями расщепления фтористым водородом данного процесса. С помощью синтеза, при котором для защиты боковой цепи Gly7 служит Chxl, получают 650 мг (0.5 мМ) смолы Вос" GlyOCH2PAM. Двойное связывание осуществляют на пептидном синтезаторе АВ1 430А в соответствии с методикой примера 1. После сушки получают 2.08 г (97%) пепидилированной смолы. По методике примера 2 проводят HF- расщепление. Выделенный и промытый водой твердый продукт анализируют с помощью ВЭЖХ, а оставшиеся 100 мл водного раствора очищают с помощью препаративной хроматографии.
Фракции 90-107 объединяют, замораживают и леофилизируют, получают 400 мг. В соответствии с данными ВЭЖХ чистота продукта - 95%. Аминокислотные отношения соответствуют теоретическим значениям, а данные масс-спектрометрии подтверждают наличие продукта с желаемым молекулярным весом (2329.78).
Пример 4.
Синтез cложного антигенного представления маститного пептида: (AVKVAIDGFGRIGKLAFRAIQG)4 (САП с 4 ответвлениями)
По методике примера 1 с помощью твердофазного синтеза на синтезаторе пептидов АВ1 430А (Applied Biosynthesis) получают 1 г (0.5 мМ) сложного антигенного представления (САП) трет. -Вос-смолы с 4 ответвлениями. После сушки получают 2.7 г пептида и при расщеплении используют 25 мл жидкого фтористого водорода. После удаления HF и осаждения эфиром отфильтровывают твердый продукт, который промывают эфиром, пептид экстрагируют путем промывания 50%-ной водной AcOH (2 раза), 10%-ной волной AcOH (2 раза) и водой. Объединенные водные экстракты замораживают и леофилизируют. Получают 830 мг. При анализе с помощью ВЭЖХ проявляется один широкий пик, а аминокислотный анализ показывает, что аминокислотные отношения лежат в интервале от 68 до 127% от теоретических значений. Содержание белка, как установлено, соответствует 36%. Полученный продукт используют для вакцинации без дополнительной очистки и описания.
По методике примера 1 с помощью твердофазного синтеза на синтезаторе пептидов АВ1 430А (Applied Biosynthesis) получают 1 г (0.5 мМ) сложного антигенного представления (САП) трет. -Вос-смолы с 4 ответвлениями. После сушки получают 2.7 г пептида и при расщеплении используют 25 мл жидкого фтористого водорода. После удаления HF и осаждения эфиром отфильтровывают твердый продукт, который промывают эфиром, пептид экстрагируют путем промывания 50%-ной водной AcOH (2 раза), 10%-ной волной AcOH (2 раза) и водой. Объединенные водные экстракты замораживают и леофилизируют. Получают 830 мг. При анализе с помощью ВЭЖХ проявляется один широкий пик, а аминокислотный анализ показывает, что аминокислотные отношения лежат в интервале от 68 до 127% от теоретических значений. Содержание белка, как установлено, соответствует 36%. Полученный продукт используют для вакцинации без дополнительной очистки и описания.
Пример 5.
Композиция вакцины
Предпочтительную маститную вакцину настоящего изобретения готовят в виде двойной эмульсии (вода-в масле-в воде). Необходимое количество предпочтительного пептида растворяют в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР), содержащем 0.5% CaCl2, и эмульгируют в эквивалентном объеме полного адъюванта Фрейнда (Difco) с помощью смесителя Omni Corp., снабженного микроприспособлениями. Для предупреждения термического повреждения пептида используют ледяную баню. Другая методика эмульгирования заключается в использовании двух шприцов и запорного вентиля (Leur Lock Valve) для многократного перемещения эмульсии между шприцами. Независимо от способа эмульгирования эмульсия должна быть проверена с точки зрения устойчивости к рассеиванию в воде. Для проведения такой оценки каплю эмульсии помещают на поверхность воды и наблюдают за рассеиванием эмульсии. Если эмульсия остается на поверхности воды в течение пары минут, то она считается хорошей.
Предпочтительную маститную вакцину настоящего изобретения готовят в виде двойной эмульсии (вода-в масле-в воде). Необходимое количество предпочтительного пептида растворяют в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР), содержащем 0.5% CaCl2, и эмульгируют в эквивалентном объеме полного адъюванта Фрейнда (Difco) с помощью смесителя Omni Corp., снабженного микроприспособлениями. Для предупреждения термического повреждения пептида используют ледяную баню. Другая методика эмульгирования заключается в использовании двух шприцов и запорного вентиля (Leur Lock Valve) для многократного перемещения эмульсии между шприцами. Независимо от способа эмульгирования эмульсия должна быть проверена с точки зрения устойчивости к рассеиванию в воде. Для проведения такой оценки каплю эмульсии помещают на поверхность воды и наблюдают за рассеиванием эмульсии. Если эмульсия остается на поверхности воды в течение пары минут, то она считается хорошей.
Пептид в ФБР (исходная водная фаза), эмульгированный в масле (адъювант Фрейнда), затем эмульгируют в равном объеме 2% TWEENTM 80 (Sigma) с использованием смесителя, снабженного микроприспособлениями. Также можно использовать шприцы с запорным вентилем.
Пример 6.
Протоколы вакцинации
Вакцинация крупных молочных животных
До начала вакцинации у каждого животного отбирают небольшую пробу крови. В табл. 1, значения, полученные для этих образцов, представлены в столбце "До". При проведения вакцинации используют 1 мл указанного инъекционного средства и все инъекции проводят подкожно. Животным контрольной группы вводят по 1 мл ФБР каждый раз, когда животным подопытной группы вводят вакцину. Начальная вакцинация включает 50 мкг предпочтительного пептида, эмульгированного в модифицированном полном адъюванте Фрейнда, описанном в примере 5. Через 7 дней после первичной инъекции каждому "подопытному животному" вводят подкожно вторую инъекцию 75 мкг в модифицированном неполном адъюванте Фрейнда (суммарный объем 1 мл). Подопытные животные получают 100 мкг предпочтительного пептида в модифицированном неполном адъюванте Фрейнда. Бустер-вакцинацию проводят через 7 дней после начала вакцинации для всех подопытных животных, получивших 100 мкг модифицированного неполного адъюванта Фрейнда. Отбирают образцы крови и оценивают на наличие антител, которые могут блокировать адгезию бактерий к эластичным эпителиальным клеткам.
Вакцинация крупных молочных животных
До начала вакцинации у каждого животного отбирают небольшую пробу крови. В табл. 1, значения, полученные для этих образцов, представлены в столбце "До". При проведения вакцинации используют 1 мл указанного инъекционного средства и все инъекции проводят подкожно. Животным контрольной группы вводят по 1 мл ФБР каждый раз, когда животным подопытной группы вводят вакцину. Начальная вакцинация включает 50 мкг предпочтительного пептида, эмульгированного в модифицированном полном адъюванте Фрейнда, описанном в примере 5. Через 7 дней после первичной инъекции каждому "подопытному животному" вводят подкожно вторую инъекцию 75 мкг в модифицированном неполном адъюванте Фрейнда (суммарный объем 1 мл). Подопытные животные получают 100 мкг предпочтительного пептида в модифицированном неполном адъюванте Фрейнда. Бустер-вакцинацию проводят через 7 дней после начала вакцинации для всех подопытных животных, получивших 100 мкг модифицированного неполного адъюванта Фрейнда. Отбирают образцы крови и оценивают на наличие антител, которые могут блокировать адгезию бактерий к эластичным эпителиальным клеткам.
Вакцинация коз
Высокая стоимость проведения исследований на крупных молочных животных привела к тому, что для предварительных исследований с целью определения сероконверсии (продуцирование антител против предпочтительного пептидного иммуногена настоящего изобретения) используют коз. Протокол вакцинации, график отбора проб и полученные результаты приведены ниже.
Высокая стоимость проведения исследований на крупных молочных животных привела к тому, что для предварительных исследований с целью определения сероконверсии (продуцирование антител против предпочтительного пептидного иммуногена настоящего изобретения) используют коз. Протокол вакцинации, график отбора проб и полученные результаты приведены ниже.
Неделя 1 2 3 4 6 7 8 10
Введение вакцины х х х х х
Отбор образцов крови х х х х х х х
% ингибирования 8.8 31 37 46 55 56 52
Пример 7
Препарат эпителиальных клеток молочных желез коров
А. Выделение тканей
Отбирают животных с учетом нормального функционирования вымени, то есть с учетом отсутствия заболеваний или повреждений. Животных безболезненно умерщвляют и отделяют вымя. Вымя тщательно промывают стерильным 0.85%-ным солевым раствором при комнатной температуре. Затем вымя рассекают на две части параллельно среднему лигаменту. Отбирают здоровые ткани. Выбор здоровых тканей требует определенного навыка. Даже когда специалист, выполняющий данную процедуру, не имеет достаточной квалификации, заявители настоящего изобретения предполагают, что отбираются ткани, которые по внешнему виду являются гранулярными. Отобранные образцы ткани разрезают на мелкие кусочки до тех пор, пока фрагменты ткани не будут проходить через иглу 20-го размера. Фрагменты тканей помещают в стерильный контейнер, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (Difco), который содержит гентамицин и фунгизон (50 частей/миллион). Существует две модификации HBSS, одна из которых содержит Mg и Ca. HBSS без Mg и Ca обозначается HBSS-. Квалифицированный специалист понимает необходимость промывания полученных хирургическим путем образцов с помощью физиологически приемлемых растворов, содержащих потенциальные антибиотики и противогрибковые препараты, для снижения вероятности загрязнения получаемых культур. Могут быть использованы также и другие солевые растворы, антибиотики и противогрибковые препараты.
Введение вакцины х х х х х
Отбор образцов крови х х х х х х х
% ингибирования 8.8 31 37 46 55 56 52
Пример 7
Препарат эпителиальных клеток молочных желез коров
А. Выделение тканей
Отбирают животных с учетом нормального функционирования вымени, то есть с учетом отсутствия заболеваний или повреждений. Животных безболезненно умерщвляют и отделяют вымя. Вымя тщательно промывают стерильным 0.85%-ным солевым раствором при комнатной температуре. Затем вымя рассекают на две части параллельно среднему лигаменту. Отбирают здоровые ткани. Выбор здоровых тканей требует определенного навыка. Даже когда специалист, выполняющий данную процедуру, не имеет достаточной квалификации, заявители настоящего изобретения предполагают, что отбираются ткани, которые по внешнему виду являются гранулярными. Отобранные образцы ткани разрезают на мелкие кусочки до тех пор, пока фрагменты ткани не будут проходить через иглу 20-го размера. Фрагменты тканей помещают в стерильный контейнер, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (Difco), который содержит гентамицин и фунгизон (50 частей/миллион). Существует две модификации HBSS, одна из которых содержит Mg и Ca. HBSS без Mg и Ca обозначается HBSS-. Квалифицированный специалист понимает необходимость промывания полученных хирургическим путем образцов с помощью физиологически приемлемых растворов, содержащих потенциальные антибиотики и противогрибковые препараты, для снижения вероятности загрязнения получаемых культур. Могут быть использованы также и другие солевые растворы, антибиотики и противогрибковые препараты.
Б. Препарат тканей
Приблизительно 100 г ткани, приготовленной на стадии А, помещают приблизительно в 400 мл свежеприготовленного охлажденного льдом HBSS. Ткани выдерживают во льду до проведения следующих экспериментов, которые необходимо выполнять как можно быстрее. Образцы небольших фрагментов ткани извлекают из стерильного сосуда, в котором они измельчены до кашеобразной консистенции. Измельченные образцы объединяют и промывают холодным HBSS до тех пор, пока надосадочная жидкость не перестанет быть молочной.
Приблизительно 100 г ткани, приготовленной на стадии А, помещают приблизительно в 400 мл свежеприготовленного охлажденного льдом HBSS. Ткани выдерживают во льду до проведения следующих экспериментов, которые необходимо выполнять как можно быстрее. Образцы небольших фрагментов ткани извлекают из стерильного сосуда, в котором они измельчены до кашеобразной консистенции. Измельченные образцы объединяют и промывают холодным HBSS до тех пор, пока надосадочная жидкость не перестанет быть молочной.
В. Методика сжигания
Для сжигания внутриклеточных матриц и выделения отдельных клеток готовят ферментный "коктейль". Раствор ферментов готовят путем растворения в 400 мл HBSS-, содержащем гентамицин и фунгизон, следующих компонентов:
Коллагеназа - 1.38 г
Альфа-химотрипсин - 1 г
Эластаза - 20 мг
Гуалуронидаза - 1 г
Соевый трипсиновый ингибитор - 50 мг
Бычий сывороточный альбумин - 10 г
Указанные реагенты поставляются различными компаниями. Предпочтительными поставщиками являются Sigma Chemical Company и Worthington Biochemicals. Полученный ферментный коктейль фильтруют, стерилизуют и используют для сжигания приблизительно 100 г тканей. Сжигание проводят при 37oC в течение приблизительно 45 мин. Точное время зависит от температуры, смешения, размера фрагментов ткани", активности ферментов и т.д. Заявители настоящего изобретения рекомендуют периодически отбираль аликвоты сжигаемой смеси и оценивать на наличие скоплений, содержащих более 100 клеток. Для этих целей используют микроскоп и гемоцитометр.
Для сжигания внутриклеточных матриц и выделения отдельных клеток готовят ферментный "коктейль". Раствор ферментов готовят путем растворения в 400 мл HBSS-, содержащем гентамицин и фунгизон, следующих компонентов:
Коллагеназа - 1.38 г
Альфа-химотрипсин - 1 г
Эластаза - 20 мг
Гуалуронидаза - 1 г
Соевый трипсиновый ингибитор - 50 мг
Бычий сывороточный альбумин - 10 г
Указанные реагенты поставляются различными компаниями. Предпочтительными поставщиками являются Sigma Chemical Company и Worthington Biochemicals. Полученный ферментный коктейль фильтруют, стерилизуют и используют для сжигания приблизительно 100 г тканей. Сжигание проводят при 37oC в течение приблизительно 45 мин. Точное время зависит от температуры, смешения, размера фрагментов ткани", активности ферментов и т.д. Заявители настоящего изобретения рекомендуют периодически отбираль аликвоты сжигаемой смеси и оценивать на наличие скоплений, содержащих более 100 клеток. Для этих целей используют микроскоп и гемоцитометр.
Сосуд для сжигания извлекают из водяной бани с температурой 37oC или из инкубатора (предпочтительно использовать водяную баню вследствие быстрого установления температурного равновесия по сравнению с инкубатором) и жидкость декантируют в стерильные пробирки с использованием сита на 20 меш для фильтрации жидкости. Оставшиеся скопления, содержащие более 200 клеток, если они присутствуют, частично разрушают с использованием специальной резиновой палочки (вместо палочки можно использовать фиксатор шприца с резиновым наконечником). Сосуд для сжигания снова помещают в водяную баню, при тщательном контроле получают препарат со скоплениями из 50-100 клеток. Важно исключить избыточное сжигание, чтобы получить жизнеспособный препарат, который может быть использован.
Колбу извлекают из водяной бани и жидкость декантируют через стерильное сито CollectorTM (20 меш) с использованием при необходимости специальной палочки для разрыва любых остаточных скоплений, которые не проходят через отверстия. Ткани, оставшиеся на сите, выбрасывают, а препарат клеток переносят в пробирку для центрифугирования. Клетки собирают путем центрифугирования, дважды промывают HBSS и снова суспендируют в среде Media 199 с солью Эрла (Earl' s salt) (Difco), содержащей фетальную телячью сыворотку и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток приблизительно 6•106 клеток/мл.
Г. Хранение тканей
Препарат клеток со стадии В делят на аликвоты по 1 мл и помещают в пластиковые криопробирки на 2.0 мл (Sarstedt, W. Germany). Пробирки предварительно замораживают в холодильнике при -70oC в течение 24 ч, а затем переносят для хранения в жидкий азот.
Препарат клеток со стадии В делят на аликвоты по 1 мл и помещают в пластиковые криопробирки на 2.0 мл (Sarstedt, W. Germany). Пробирки предварительно замораживают в холодильнике при -70oC в течение 24 ч, а затем переносят для хранения в жидкий азот.
Пример 8
Оценка ингибирования связывания
А. Эпителиальные клетки молочных желез
Объединяют три криопробирки с эпителиальными клетками молочных желез и промывают три раза 40 мл ФБР, pH 7.2, при 25oC.
Оценка ингибирования связывания
А. Эпителиальные клетки молочных желез
Объединяют три криопробирки с эпителиальными клетками молочных желез и промывают три раза 40 мл ФБР, pH 7.2, при 25oC.
Б. Выращивание бактерий
С помощью петли переносят инокулят штамма Staphylococc-us aureus, который, как заранее установлено, прилипает к эпителиальным клеткам молочных желез, в 5 мл стерильного соевого бульона и инкубируют в течение 20 ч при 39oC. Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз равным объемом ФБР. После промывания клетки суспендируют в ФБР с концентрацией 106 клеток/мл.
С помощью петли переносят инокулят штамма Staphylococc-us aureus, который, как заранее установлено, прилипает к эпителиальным клеткам молочных желез, в 5 мл стерильного соевого бульона и инкубируют в течение 20 ч при 39oC. Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз равным объемом ФБР. После промывания клетки суспендируют в ФБР с концентрацией 106 клеток/мл.
В. Оценка бактериальной адгезии
В стерильной стеклянной пробирке (12 х 75 мм) смешивают промытые эпителиальные клетки молочных желез (0.5 мл, 104 клеток/мл суспензии) с 0.5 мл суспензии бактериальных клеток, полученной на стадии Б, и выдерживают в бане шейкера при 39oC в течение 30 мин. После инокулирования смесь клеток промывают четыре раза ФБР для удаления не прилипших бактерий. Берут мазки, сушат на воздухе и окрашивают с помощью фиолетового кристаллического грама в течение 15 мин. Количество бактерий, прилипших к 100 эпителиальным клеткам, определяют путем подсчета количества Staphylococcus aureus, прикрепившихся к 25 клеткам молочных желез в нескольких мазках.
В стерильной стеклянной пробирке (12 х 75 мм) смешивают промытые эпителиальные клетки молочных желез (0.5 мл, 104 клеток/мл суспензии) с 0.5 мл суспензии бактериальных клеток, полученной на стадии Б, и выдерживают в бане шейкера при 39oC в течение 30 мин. После инокулирования смесь клеток промывают четыре раза ФБР для удаления не прилипших бактерий. Берут мазки, сушат на воздухе и окрашивают с помощью фиолетового кристаллического грама в течение 15 мин. Количество бактерий, прилипших к 100 эпителиальным клеткам, определяют путем подсчета количества Staphylococcus aureus, прикрепившихся к 25 клеткам молочных желез в нескольких мазках.
Эффективность вакцин настоящего изобретения определяют, в частности, путем титрования сыворотки, полученной от вакцинированных животных, и сравнения способности разбавленных серий ингибировать адгезию. Полученные данные представлены в табл. 1.
Claims (8)
1. Пептид маститной вакцины, ответственный за бактериальную адгезию к эластичным эпителиальным клеткам, имеющий общую структурную формулу
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24,
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой lus или Arg;
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Val или Leu;
R24 представляет собой OH, Ala или Ser.
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24,
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой lus или Arg;
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Val или Leu;
R24 представляет собой OH, Ala или Ser.
2. Пептид по п.1, где R2 представляет собой Ala, R3 представляет собой Val, R4 представляет собой Lys, R5 представляет собой Val, R6 представляет собой Ala, R7 представляет собой Ile, R8 представляет собой Asp, R9 представляет собой Gly, R10 представляет собой Phe, R11 представляет собой Gly, R12 представляет собой Arg, R13 представляет собой Ile, R15 представляет собой Arg, R16 представляет собой Leu, R18 представляет собой Phe, R21 представляет собой Ile и R24 представляет собой гидроксигруппу.
3. Пептид сложного антигенного представления, ответственный за бактериальную адгезию, имеющий общую структурную формулу
где пептид1, пептид2, пептид3, пептид4 независимо друг от друга выбираются из числа соединений формулы
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24,
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lus или Arg;
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Val или Leu;
R24 представляет собой OH, Ala или Ser.
где пептид1, пептид2, пептид3, пептид4 независимо друг от друга выбираются из числа соединений формулы
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R15-R16-Ala-R18-Arg-Ala-R21-Gln-Gly-R24,
где R1 представляет собой атом водорода или C1-C16-карбоновую кислоту;
R2 представляет собой Ala, Gly, Ser или пропионовую кислоту;
R3 представляет собой Val, Ile, Leu или D-Val;
R4 представляет собой Lus или Arg;
R5 представляет собой Val, Ile или Leu;
R6 представляет собой Ala, Gly или Ser;
R7 представляет собой Ile, Leu или Val;
R8 представляет собой Asp, Asn или Glu;
R10 представляет собой Phe, Tyr или Trp;
R12 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R13 представляет собой Ile, Leu или Val;
R15 представляет собой Arg, Asn, Lys или His;
R16 представляет собой Leu, Ala, Ile или Val;
R18 представляет собой Phe, Asn, Lys или His;
R21 представляет собой Ile, Ala, Val или Leu;
R24 представляет собой OH, Ala или Ser.
4. Пептид по п.3, где каждый пептид1, пептид2, пептид3 и пептид4 включает соединение, в котором R2 представляет собой Ala, R3 представляет собой Val, R4 представляет собой Lys, R5 представляет собой Val, R6 представляет собой Ala, R7 представляет собой Ile, R8 представляет собой Asp, R9 представляет собой Gly, R10 представляет собой Phe, R11 представляет собой Gly, R12 представляет собой Arg, R13 представляет собой Ile, R15 представляет собой Arg, R16 представляет собой Leu, R18 представляет собой Phe, R21 представляет собой Ile и R24 представляет собой гидроксигруппу.
5. Фармацевтическая композиция против мастита, содержащая соединение по п.1 в адъюванте.
6. Фармацевтическая композиция против мастита, содержащая соединение по п.3 в адъюванте.
7. Способ определения пептида по п.1 или 3, отличающийся тем, что получают экстракты клеточных стенок или клеточных мембран адгезирующих и неадгезирующих штаммов возбудителя мастита, сравнивают полученные экстракты и при наличии пептида, присутствующего в адгезирующих и отсутствующего в неадгезирующих штаммах, определяют пептид, ответственный за адгезию.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что используют адгезирующие и неадгезирующие штаммы Staphylococcus aureus.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14776593A | 1993-11-05 | 1993-11-05 | |
| US08/147,765 | 1993-11-05 | ||
| US08/147.765 | 1993-11-05 | ||
| PCT/US1994/012752 WO1995012410A1 (en) | 1993-11-05 | 1994-11-04 | Vaccine design and production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96112189A RU96112189A (ru) | 1998-12-27 |
| RU2143920C1 true RU2143920C1 (ru) | 2000-01-10 |
Family
ID=22522813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96112189A RU2143920C1 (ru) | 1993-11-05 | 1994-11-04 | Конструирование и получение вакцины |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5679349A (ru) |
| EP (1) | EP0726774A4 (ru) |
| JP (1) | JPH09505039A (ru) |
| KR (1) | KR960705582A (ru) |
| CN (2) | CN1087953C (ru) |
| AU (1) | AU1050595A (ru) |
| BR (1) | BR9407988A (ru) |
| CA (1) | CA2175708A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ128896A3 (ru) |
| FI (1) | FI961869A (ru) |
| HU (1) | HUT75556A (ru) |
| NO (1) | NO961808L (ru) |
| NZ (1) | NZ276290A (ru) |
| PL (1) | PL314303A1 (ru) |
| RO (1) | RO116045B1 (ru) |
| RU (1) | RU2143920C1 (ru) |
| SG (1) | SG49830A1 (ru) |
| TW (1) | TW448185B (ru) |
| UA (1) | UA42741C2 (ru) |
| WO (1) | WO1995012410A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA948590B (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2333750A1 (en) * | 1998-06-23 | 1999-12-29 | Dale T. Umetsu | Adjuvant therapy |
| JP2003171291A (ja) * | 1999-10-29 | 2003-06-17 | Takeda Schering-Plough Animal Health Kk | 乳房炎用粘膜予防剤 |
| US6984381B2 (en) | 2002-07-05 | 2006-01-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Vaccine for the prevention of bacterial infection of the bovine mammary gland |
| GB0219524D0 (en) | 2002-08-21 | 2002-10-02 | Queen Mary & Westfield College | Therapeutic uses of monoclonal antibodies to the angiotensin-II type-1 receptor |
| GB0802931D0 (en) | 2008-02-18 | 2008-03-26 | Queen Mary & Westfield College | Synthetic scFv analogue to the 6313/G2 (anti angiotensin II type 1 receptor) monoclonal anitbody variable regions |
| CN102716475A (zh) * | 2012-06-29 | 2012-10-10 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0672123A1 (en) * | 1992-01-08 | 1995-09-20 | The Rockefeller University | Multifunctional surface protein of streptococci |
-
1994
- 1994-11-01 TW TW083110048A patent/TW448185B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-11-01 ZA ZA948590A patent/ZA948590B/xx unknown
- 1994-11-04 CN CN94194775A patent/CN1087953C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-04 CA CA002175708A patent/CA2175708A1/en not_active Abandoned
- 1994-11-04 HU HU9601191A patent/HUT75556A/hu unknown
- 1994-11-04 BR BR9407988A patent/BR9407988A/pt active IP Right Grant
- 1994-11-04 UA UA96051776A patent/UA42741C2/ru unknown
- 1994-11-04 EP EP95901154A patent/EP0726774A4/en not_active Withdrawn
- 1994-11-04 CZ CZ961288A patent/CZ128896A3/cs unknown
- 1994-11-04 WO PCT/US1994/012752 patent/WO1995012410A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-11-04 RO RO96-00919A patent/RO116045B1/ro unknown
- 1994-11-04 RU RU96112189A patent/RU2143920C1/ru active
- 1994-11-04 SG SG1996007162A patent/SG49830A1/en unknown
- 1994-11-04 AU AU10505/95A patent/AU1050595A/en not_active Abandoned
- 1994-11-04 PL PL94314303A patent/PL314303A1/xx unknown
- 1994-11-04 KR KR1019960702306A patent/KR960705582A/ko active IP Right Grant
- 1994-11-04 JP JP7513446A patent/JPH09505039A/ja not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-05-02 FI FI961869A patent/FI961869A/fi unknown
- 1996-05-03 NO NO961808A patent/NO961808L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-07-03 US US08/678,444 patent/US5679349A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-04 NZ NZ276290A patent/NZ276290A/en unknown
-
2002
- 2002-03-11 CN CN02107123A patent/CN1380422A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO961808D0 (no) | 1996-05-03 |
| FI961869A0 (fi) | 1996-05-02 |
| CN1380422A (zh) | 2002-11-20 |
| HU9601191D0 (en) | 1996-06-28 |
| AU1050595A (en) | 1995-05-23 |
| PL314303A1 (en) | 1996-09-02 |
| EP0726774A1 (en) | 1996-08-21 |
| ZA948590B (en) | 1996-05-02 |
| HUT75556A (en) | 1997-05-28 |
| BR9407988A (pt) | 1996-12-03 |
| UA42741C2 (ru) | 2001-11-15 |
| TW448185B (en) | 2001-08-01 |
| CA2175708A1 (en) | 1995-05-11 |
| US5679349A (en) | 1997-10-21 |
| NZ276290A (en) | 1997-11-24 |
| FI961869A (fi) | 1996-05-02 |
| WO1995012410A1 (en) | 1995-05-11 |
| EP0726774A4 (en) | 2001-06-27 |
| CN1141000A (zh) | 1997-01-22 |
| SG49830A1 (en) | 1998-06-15 |
| CZ128896A3 (en) | 1996-10-16 |
| RO116045B1 (ro) | 2000-10-30 |
| CN1087953C (zh) | 2002-07-24 |
| NO961808L (no) | 1996-06-27 |
| KR960705582A (ko) | 1996-11-08 |
| JPH09505039A (ja) | 1997-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nagai et al. | Specific skin-reactive protein from culture filtrate of Mycobacterium bovis BCG | |
| CN107056901B (zh) | 脑膜炎双球菌组合物及其方法 | |
| AU2006214534A1 (en) | Polypeptides from Staphylococcus aureus and methods of use | |
| CA2592627A1 (en) | Vaccine composition comprising a fibronectin binding protein or a fibronectin binding peptide | |
| TR201815419T4 (tr) | Ospa'nin mutant fragmanlari ve bunlarla i̇lgi̇li̇ yöntemler ve kullanimlar | |
| JPH11501809A (ja) | マイコプラズマに対する抗原組成物 | |
| EP2373332A1 (en) | Process for production of vaccines | |
| RU2143920C1 (ru) | Конструирование и получение вакцины | |
| Rotta et al. | Biological properties of cell wall mucopeptide of hemolytic streptococci | |
| CN113082202B (zh) | 一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法 | |
| CN104508120A (zh) | 编码肝素结合血凝素(hbha)融合蛋白质的重组分枝杆菌和其用途 | |
| Baker et al. | Delayed Hypersensitivity Reactions Provoked by Ribosomes from Acid-Fast Bacilli I. Ribosomal Isolation, Characterization, Delayed Hypersensitivity, and Specificity | |
| KR100649286B1 (ko) | 감독화톡신을 포함하는 백신제제 | |
| AU2003213233B2 (en) | Method of making CS6 antigen vaccine for treating, preventing, or inhibiting enterotoxigenic escherichia coli infections | |
| AU723173B2 (en) | Vaccine design and production | |
| RU2614115C1 (ru) | Рекомбинантный соматостатинсодержащий белок, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных, а также способ использования препарата | |
| GB1603189A (en) | Peptide complexes of desoxyribonucleic acid (dna) obtained from dna-containing organisms | |
| US20090252751A1 (en) | Immune adjuvant comprising ubiquinone | |
| CN114099660B (zh) | 一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法 | |
| US4898815A (en) | Novel synthetic peptide, process for its preparation and medicaments containing it | |
| Bredt et al. | Adherence of mycoplasmas: Phenomena and possible role in the pathogenesis of disease | |
| NZ272660A (en) | Pasteurella multocida antigens, antibodies, their production and use | |
| CN114196691A (zh) | 一种制备防治牛、羊棘球蚴病多表位重组疫苗的基因、蛋白质、疫苗和应用 | |
| EP3335726A1 (en) | Vaccine obtained by mixing inactivated staphylococcus aureus and leukocidin | |
| Rowland | LVIII. Besredka's method of vaccination |