TR201815419T4 - Ospa'nin mutant fragmanlari ve bunlarla i̇lgi̇li̇ yöntemler ve kullanimlar - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, Borrelia enfeksiyonunun önlenmesi ve tedavisi için bileşimler ve yöntemler ile ilgilidir. Mevcut buluş özellikle, bir dış yüzey proteini A'nın (OspA) mutant bir fragmanını içeren bir polipeptit, bunu kodlayan bir nükleik asit, bu polipeptit ve/veya nükleik asidi içeren bir farmasötik bileşim (özellikle, bir Borrelia enfeksiyonunu tedavi etmeye ya da önlemeye dair bir yöntemde bir ilaç olarak kullanım için) ile ilgilidir.

Description

Tarifname, ilaçlarin hazirlanmasi için bulusa ait polipeptidlerin, nükleik asitlerin, antikorlarin, farmasötik bilesimlerin veya asilarin kullanimlarini saglar. Diger ilgili yaklasimlar da mevcut bulusta saglanmaktadir.

Bulus sahipleri tarafindan buradaki "içeren , içerir" ve "içerir" terimlerinin, her durumda, sirasiyla, "olusan", ”olusur” ve "olusur" terimleriyle istege bagli olarak yer degistirebilmeleri amaçlanmaktadir. ”Içerir" terimi "ihtiva eder" anlamina gelir. Dolayisiyla, kapsam aksini gerektirmedikçe, "içermek" kelimesi ve ”içerme” ve ”içeren" gibi varyasyonlarin, belirtilen bir bilesigin veya bilesimin (örnegin, nükleik asit, polipeptid, antikor) veya adimin ya da bilesiklerin gruplarini veya adimlarin dahil edilmesini, ancak bunlarin herhangi bir bilesiginin, bilesiminin, adimlarinin veya gruplarinin hariç tutulmadigini ima ettigi anlasilacaktir. “e.g. (ör.)” kisaltmasi, Latince exempli gratia'dan türetilir ve burada, sinirlayici olmayan bir örnegi belirtmek için kullanilir. Böylece "ör.” kisaltmasi "örnegin" terimi ile esanlamlidir.

Bulusun, buradaki "asi bilesimleri" ile ilgili düzenlemeleri, bulusun "farmasötik bilesimleri" ile ilgili düzenlemelere de uygulanabilir ve bunun tersi de geçerlidir.

Aksi açiklanmadikça, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bu açiklamanin ait oldugu teknikte uzman bir kisi tarafindan genel olarak anlasilan ile ayni anlama sahiptir.

Moleküler biyolojide ortak terimlerin tanimlari, Oxford University Press tarafindan 1994'te (ISBN 0- ve VCH Publishers, Inc. Tarafindan 1995'te yayinlananRobert A. Meyers (ed.), Molecular bulunabilir.

”Bir", "tek" ve "bahsedilen" tekil terimleri, içerik açikça aksini belirtmedikçe çogul referanlari da içerir. Benzer sekilde, içerik aksini açikça göstermedigi sürece "veya" kelimesinin, "ve"'yi içermesi amaçlanmaktadir. "Birden fazla" terimi iki veya daha fazla anlamina gelir. Ayrica nükleik asitler veya polipeptitler için verilen tüm baz büyüklüklerinin veya amino asit boyutlarinin ve tüm molekül agirliginin veya moleküler kütle degerlerinin yaklasik olduklari ve açiklama için saglandigi anlasilmalidir. Ek olarak, bir antijen gibi bir maddenin konsantrasyonlarina veya seviyelerine göre verilen sayisal sinirlamalar yaklasik olabilir.

Mevcut bulusa göre olan polipeptidler için farkli düzenlemelerde veya mevcut bulusa göre olan bir nükleik asit molekülüne yönelik tercih edilen bir tasiyicisi veya eksipiyani, mevcut bulusa göre olan polipeptide karsi bagisiklik tepkisini daha fazla uyarmak için bir adjuvan gibi bir immünostimülatör bilesiktir veya bunun bir kodlayici nükleik asit molekülüdür.

Bulusun bilesimlerinde kullanilabilecek adjuvanlar asagidakileri içermekte, ancak bunlarla sinirli tutulmamaktadir: A. Mineral içeren bilesimler Bulusta adjuvan olarak kullanim için uygun mineral içeren bilesimler, alüminyum tuzlari ve kalsiyum tuzlari gibi mineral tuzlari içerir. Bulus, hidroksitler (ör., oksihidroksitler), fosfatlar (ör., hidroksifosfatlar, ortofosfatlar), sülfatlar, vb. gibi mineral tuzlari veya farkli mineral bilesiklerin herhangi bir uygun formu (ör., jel, kristal, amorf, vb. gibi) alan ve tercih edilen emilime sahip bilesikler ile karisimlarini içerir. Mineral içeren bilesimler ayrica metal tuzunun bir partikülü olarak da formüle edilebilir.

Yararli bir alüminyum fosfat adjuvani, 0.84 ve 0.92 arasinda molar orana sahip PO4/Al içeren amorf alüminyum hidroksifosfattir. Bir baska yararli alüminyum bazli adjuvan, alüminyum hidroksit + monofosforil lipit A`nin (MPL) bir kombinasyonu olan ASO4'dür.

B. Yag Emülsiyonlari Bulusta adjuvan olarak kullanim için uygun yag emülsiyonu bilesimleri arasinda, MF59 (%5 Skualen, %0.5 Tween 80 ve %05 Span 85, bir mikro akiskanlastirici kullanarak mikron alti partiküller halinde formüle edilmis), A503 (skualen, DL-oi-tokoferol ve Tween 80) ve AF03 (skualen, M0ntane® 80 ve Eumulgon® B1 PH) gibi su içinde skualen emülsiyonlari bulunur.

Tam Freund adjuvani (CFA) ve tamamlanmamis Freund adjuvani (IFA) da kullanilabilir.

Yararli su içinde yag emülsiyonlari tipik olarak en az bir yag ve en az bir yüzey aktif madde içerir, yag(lar) ve yüzey aktif madde(ler) biyolojik olarak parçalanabilir (metabolize olabilir) ve biyolojik olarak uyumludur. Emülsiyondaki yag damlaciklari genellikle 1 um'den küçüktür, bu küçük boyutlar kararli emülsiyonlar saglamak için bir mikro akiskanlastirici ile elde edilir.

Filtre sterilizasyonuna tabi tutulabildikleri için 220 nm'den daha küçük boyutlu damlaciklar tercih edilir.

Emülsiyon, bir hayvan (balik gibi) veya sebze kaynagindan olanlar gibi yaglari içerebilir.

Bitkisel yaglar için kaynaklar findik, tohum ve tahil içerir. En yaygin olarak bulunan fistik yagi, soya fasulyesi yagi, hindistan cevizi yagi ve zeytinyagi, findik yaglarini örneklemektedir. Örn ., jojoba fasulyesinden elde edilen jojoba yagi kullanilabilir. Tohum yaglari arasinda aspir yagi, pamuk tohumu yagi, ayçiçegi tohumu yagi, susam çekirdegi yagi ve benzeri yer alir. Tahil grubunda, en kolay temin edilebilen misir yagidir, ancak bugday, yulaf, çavdar, pirinç, teff, tritikale ve benzeri gibi diger tahil tanelerinin yagi da kullanilabilir. Gliserolün ve 1,2- propanediol'ün 6-10 karbonlu yag asidi esterleri, tohum yaglarinda dogal olarak olusmazken, findik ve tohum yaglarindan baslayan uygun malzemelerin hidrolizi, ayristirilmasi ve esterlestirilmesi ile hazirlanabilir. Memeli sütünden alinan kati ve sivi yaglar metabolize edilebilir ve bu nedenle bu bulusun uygulamasinda kullanilabilir. Hayvan kaynaklarindan saf yaglarin elde edilmesi için gerekli ayirma, saflastirma, sabunlastirma ve diger yöntemler için prosedürler, teknikte iyi bilinmektedir. Çogu balik, kolayca geri kazanilabilen metabolize edilebilir yaglar içerir. Örnegin, morina baligi karaciger yagi, köpek baligi karaciger yaglari ve ispermeçet gibi balina yagi, burada kullanilabilecek olan birkaç balik yagini örneklemektedir.

Bir dizi dalli zincirli yaglar 5-karbon izopren birimlerinde biyokimyasal olarak sentezlenir ve genellikle terpenoidler olarak adlandirilir. Köpek baligi karaciger yagi, burada özellikle tercih bir dallanmis, doymamis terpenoid içerir. Skualene benzer doymus skualan da tercih edilen bir yagdir. Skualen ve skualan içeren balik yaglari ticari kaynaklardan kolayca temin edilebilir veya teknikte bilinen yöntemlerle elde edilebilir. Tercih edilen diger yaglar tokoferollerdir (asagiya bakiniz). Yag karisimlari kullanilabilir.

Yüzey aktif maddeler, 'HLB' (hidrofiI/lipofil dengesi) ile siniflandirilabilir. Bulusun tercih edilen yüzey aktif maddeleri, en az 10, tercihen en az 15 ve daha tercihen en az 16 olan bir HLB`ye sahiptir. Bulus, bunlarla sinirli olmamak üzere asagidakileri içeren yüzey aktif maddelerle kullanilabilir: polioksietilen sorbitan esterleri yüzey aktif maddeleri (yaygin olarak Tweens olarak adlandirilir), özellikle dogrusal EO/PO kopolimerleri gibi DOWF AXT'V' ticari ismi altinda satilan polisorbat 20 ve polisorbat 80; etilen oksit (EO), propilen oksit (PO) ve/veya bütilen oksit (BO) kopolimerleri; özellikle ilgi çekici olan oktoksinol-9 (Triton X-1OO veya t- oktilfenoksipolietoksietanol) ile tekrar eden etoksi (oksi-1,2-etandiil) gruplarinin sayisi ile degisebilen oktoksinoller; (oktilfenoksi) polietoksietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfatidilkolin (Iesitin) gibi fosfolipitler; TergitolTM NP serileri gibi nonilfenol etoksilatlar; lauril, setil ve oleil alkollerden (Brij yüzey aktif maddeleri olarak bilinir) türetilen polioksietilen yag esterleri, mesela trietilenglikol monolauril eter (Brij 30); ve sorbitan trioleat (Span 85) ve sorbitan monolaurat gibi sorbitan esterleri (yaygin olarak SPAN'Iar olarak bilinir). Iyonik olmayan yüzey aktif maddeler tercih edilir. Emülsiyona dahil edilmek üzere tercih edilen yüzey aktif maddeler, Tween 80 (polioksietilen sorbitan monooleat), Span 85 (sorbitan trioleat), Iesitin ve Triton X-lOO'dür.

Yüzey aktif maddelerin karisimlari, örnegin, Tween 80/Span 85 karisimlari kullanilabilir.

Polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80) gibi bir polioksietilen sorbitan ester ve t- oktilfenoksi polietoksietanol (Triton X-100) gibi bir oktoksinolün bir kombinasyonu da uygundur. Bir baska yararli kombinasyon, Iaureth 9 arti bir polioksietilen sorbitan ester Yüzey aktif maddelerin tercih edilen miktarlari (% agirlikça) asagidaki gibidir: %0.01 ila %1 arasinda, özellikle %0.005 ila %002 arasinda oktil- veya nonilfenoksi polioksietanoller (Triton X-100 veya Triton serisindeki diger deterjanlar gibi), %0.1 ila %20 arasinda, tercihen %0.1 ila (Iauret9 gibi).

Tercihen, yag damlaciklarinin esas olarak hepsi (örnegin, sayica en az %90'i), 1 um'den daha küçük bir çapa sahiptir. Özel bir faydali mikron alti emülsiyonu, skualen, Tween 80 ve Span 85'ten olusur. Emülsiyon bilesimi hacimce yaklasik % 5 skualen, yaklasik %0.5 polisorbat sodyum sitrat tamponu içerir.

C. Saponin formülasyonlari Saponin formülasyonlari, bulusta adjuvanlar olarak da kullanilabilir. Saponinler, çok çesitli bitki türlerinin kabuklarinda, yapraklarinda, gövdelerinde, köklerinde ve hatta çiçeklerinde bulunan heterojen bir sterol glikozit ve triterpenoid glikozit grubudur. Quillaia saponaria Molina agacinin kabugundan elde edilen saponin, adjuvan olarak genis çapta arastirilmistir.

Saponin ayrica ticari olarak Smilax ornata (saparna), Gypsophilla paniculata (brideal veil) ve Saponaria officianalis'den (sabun kökü) elde edilebilir. Saponin adjuvan formülasyonlari, QC21 gibi saflastirilmis formülasyonlari ve ISCOM'Iar gibi lipit formülasyonlarini içerir. QSZl, StimulonTM olarak pazarlanmaktadir.

Saponin bilesimleri, HPLC ve RP-HPLC kullanilarak saflastirilmistir. (157, QS 17, QS 18, QSZl, QH-A, QH-B ve QH-C dahil olmak üzere bu teknikler kullanilarak spesifik saflastirilmis fraksiyonlar tanimlanmistir. Tercihen, saponin QSZl'dir. Saponin formülasyonlari ayrica kolesterol gibi bir sterol de içerebilir.

Saponinler ve kolesterol kombinasyonlari, bagisikligi uyarici kompleksler (ISCOM'Iar) adi verilen benzersiz parçaciklar olusturmak için kullanilabilir. ISCOM'Iar tipik olarak fosfatidiletanolamin veya fosfatidilkolin gibi bir fosfolipid içerir. Bilinen herhangi bir saponin, C'den birini veya daha fazlasini içerir. Istege bagli olarak, ISCOM'Iar ek deterjandan yoksun olabilir.

D. Virozomlar ve virüs benzeri parçaciklar Virozomlar ve virüs benzeri parçaciklar (VLP`Ier), bulusta adjuvanlar olarak da kullanilabilir.

Bu yapilar genellikle istege bagli olarak bir fosfolipid ile birlestirilmis veya formüle edilmis bir virüsten alinan bir veya daha fazla protein içerir. Bunlar, genellikle patojenik degildir, çogalmazlar ve genellikle dogal viral genomu içermezler. Viral proteinler rekombinant olarak bütün virüslerden üretilebilir veya izole edilebilir. Virozomlarda veya VLP'Ierde kullanim için uygun olan bu viral proteinler, influenza virüsünden (HA veya NA gibi), Hepatit B virüsünden (çekirdek veya kapsid proteinleri gibi), Hepatit E virüsünden, kizamik virüsünden, Sindbis virüsü, Rotavirüs, El Ayak Hastaligi virüsü, Retrovirüsler, Norwalk virüsü, Insan Papilloma virüsü, HIV, RNA-fajlari, Qß-faji (kaplama proteinleri gibi), GA-faji, fr-faji, APZOS faji ve Ty'den (retrotranspozon Ty proteini pi gibi) türetilen proteinler içerir.

E. Bakteriyel veya mikrobiyal türevler Bulusta kullanim için uygun adjuvanlar arasinda enterobakteriyel Iipopolisakkarit (LPS), Lipit A türevleri, immünostimülatör oligonükleotidler ve ADP-ribozile edici toksinler ve bunlarin zehri çikartilmis türevleri gibi bakteriyel veya mikrobiyal türevler bulunur.

LPS'nin toksik olmayan türevleri, monofosforil Iipit A (MPL) ve 3-O-deasilatlanmis MPL'yi (3dMPL) içerir. 3dMPL, 4, 5 veya 6 asile edilmis Zincirli 3 de-O-asile edilmis monofosforil Iipit A'nin bir karisimidir. 3dMPL'nin bu "küçük parçaciklari", 0.22 um'lik bir zardan steril olarak filtrelenecek kadar küçüktür. Diger toksik olmayan LPS türevleri arasinda, amino-alkil glukosaminit fosfat türevleri, örnegin RC-529 ve sentetik fosfolipit dimeri, E6020 gibi monofosforil Iipit A mimikleri bulunmaktadir.

Lipit A türevleri, OM-174 gibi Escheri'chia coli'den Iipit A türevlerini içerir. Bulusta adjuvan olarak kullanilmaya uygun immünostimülatör oligonükleotitler arasinda bir CpG motifi (bir guanosine fosfat bagi ile baglanmis metile edilmemis bir sitozin içeren bir dinükleotit sekansi) içeren nükleotit sekanslari bulunur. Palindromik veya poli (dG) sekanslar içeren çift iplikli RNA'Iar ve oligonükleotitlerin de immünostimülatör oldugu gösterilmistir.

CpG'ler, fosforotioat modifikasyonlari gibi nükleotid modifikasyonlari/analoglari içerebilir ve çift iplikli veya tek iplikli olabilir. CpG sekansi, GTCGTT veya TTCGTT motifi gibi TLR9'a yönlendirilebilir. CpG sekansi, bir CpG-A ODN gibi bir Th1 bagisiklik tepkisini uyarmaya özgü olabilir veya bir CpG-B ODN gibi bir B hücresi tepkisini uyarmak için daha spesifik olabilir.

Tercihen, CpG bir CpG-A ODN'dir.

Tercihen CpG oligonükleotidi, 5' ucunun reseptör tanima açisindan erisilebilir olmasi için olusturulur. Istege bagli olarak, iki CpG oligonükleotid sekansi, 3' uçlarinda "immünomerler" olusturmak için eklenebilir. immünostimülatör oligonükleotitlerin etrafina dayanan özellikle yararli bir adjuvan, IC31® olarak bilinir. Dolayisiyla, bulusta kullanilan bir yardimci madde, (i) bir en az bir (ve tercihen çoklu) Cpl motifleri (yani, bir dinükleotidi olusturmak için bir inosine baglanan bir sitozin) içeren bir oligonükleotidin (örnegin 15-40 nükleotid arasinda) ve (ii) en az bir (ve tercihen çoklu) Lys-Arg-Lys tripeptid sekansi (sekanslari) içeren bir oligopeptit (Örnegin, 5-20 amino asit arasinda) gibi bir polikatyonik polimerin bir karisimini içerebilir.

Oligonükleotit, 26-mer sekansi 5'-(dldC) içeren bir deoksinükleotit olabilir. Polikatyonik polimer, ll-mer amino asit sekansi, KLKLLLLLKLK'yi (SEQ ID NO: 33) içeren bir peptit olabilir.

Dogal kaynaklardan türetilen polikatyonik bilesikler, HIV-REV veya HIV-TAT (türetilmis katyonik peptitler, antennapedia peptitler, kitosan veya kitinin diger türevleri) veya bu peptitlerden veya proteinlerden biyokimyasal veya rekombinant üretim ile türetilen diger peptitleri içerir. Tercih edilen diger polikatyonik bilesikler, katelin veya katelin kaynakli veya bundan türetilmis maddelerdir. Örnegin faredeki katelin, NHZ- RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE-COOH (SEQ lD NO: 31) amino asit sekansina sahip olan bir peptittir. Ilgili veya türetilmis katelin maddeleri, en az 15-20 amino asit kalintisi olan katelin sekansinin tamamini veya kisimlarini içerir. Türetme, dogal amino asitlerin, 20 standart amino asit arasinda olmayan amino asitlerle ikamesi veya modifikasyonunu içerebilir. Ayrica, bu katelin moleküllerine baska katyonik kalintilar da sokulabilir. Bu katelin moleküllerinin, antijen ile birlestirilmesi tercih edilir. Bu katelin moleküllerinin, sasirtici bir sekilde, baska adjuvanlarin ilavesi olmadan bir antijen için bir adjuvan olarak da etkili oldugu ortaya çikmistir. Bu nedenle, daha fazla bagisiklik aktive edici madde içeren veya içermeyen asi formülasyonlarinda bu gibi katelin moleküllerini etkili yardimci maddeler olarak kullanmak mümkündür.

Bakteriyel ADP-ribozile edici toksinler ve bunlarin zehri çikartilmis türevleri, bu bulusta adjuvanlar olarak kullanilabilir. Tercihen, protein, E. co/i' (E. co/I isiya dayaniksiz enterotoksin ve parenteral adjuvanlar olarak kullanimi bilinmektedir. Toksin veya toksoid, tercihen hem A hem de B alt birimlerini içeren bir holotoksin formundadir. Tercihen, A alt birimi toksinden arindiran bir mutasyon içerir; tercihen B alt birimi mutasyona ugramamistir. Tercihen, adjuvan LT-K63, LT-R72, LT-G192 veya dmLT gibi detoksifiye edilmis bir LT mutantidir. Yararli bir CT mutanti, CT-E29H'dir.

F. Insan immünomodülatörleri Bulusta adjuvan olarak kullanim için uygun insan immünomodülatörleri arasinda interlökinler (örnegin, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, vb.), interferonlar (örnegin, interferon-y), makrofaj koloni uyarici faktör ve tümör nekroz faktörü gibi sitokinler bulunur. Tercih edilen bir immünomodülatör, IL-12'dir.

G. Biyoyapistiricilar ve Mukoyapistiricilar Biyoyapistiricilar ve mukoyapistiricilar bulusta adjuvanlar olarak da kullanilabilir. Uygun biyoyapistiricilar arasinda esterlenmis hiyalüronik asit mikroküreleri veya poliakrilik asit, polivinil alkol, polivinil pirolidon, polisakkaritler ve karboksimetilselülozun çapraz bagli türevleri gibi mukoyapistiricilar bulunur. Kitosan ve bunun türevleri de bulusta adjuvan olarak kullanilabilir.

H. Mikropartiküller Mikropartiküller de bulusta adjuvanlar olarak kullanilabilir. Biyolojik olarak parçalanabilen ve toksik olmayan malzemelerden (ör., bir poli(0i-hidroksi asit), bir polihidrobütirik asit, bir poliortoester, bir polianhidrit, bir polikaprolakton, bir poli(laktit-ko-glikolit), vb.) olusturulan mikropartiküller (yani çapi N 100 nm ila ~150 um arasinda, daha çok tercihen çapi ~200 nm ila~30 um arasinda ve en çok tercihen çapi ~500 nm ila ~1O um arasinda olan), burada poli(laktIt-ko-glikolit) tercih edilir, istege bagli olarak negatif yüklü bir yüzeye (ör., SDS ile) veya pozitif yüklü bir yüzeye (ör., CTAB gibi katyonik bir deterjan ile) sahip olacak sekilde muamele edilir.

Adjuvanlar olarak kullanim için uygun Iipozom formülasyonlarinin örnekleri bilinmektedir.

J. Polioksietilen eter ve polioksietilen ester formülasyonlari Bulusta kullanim için uygun adjuvanlar arasinda polioksietilen eterler ve polioksietilen esterler bulunur. Bu tür formülasyonlar ayrica bir oktoksinolün yani sira polioksietilen alkil eterleri ile kombinasyon halinde polioksietilen sorbitan ester yüzey aktif maddelerini veya bir oktoksinol gibi en az bir ilave iyonik olmayan yüzey aktif madde ile birlikte ester yüzey aktif maddelerini içerir. Tercih edilen polioksietilen eterler asagidaki gruptan seçilir: polioksietilen-9-lauril eter (Iaureth 9), polioksietilen-9-steoril eter, polioksietilen-8-steoril eter, polioksietilen-4-Iauril eter, polioksietilen-35-Iauril eter ve polioksietilen-23-Iauril eter.

K. Muramil peptidleri Bulusta adjuvan olarak kullanim açisindan uygun muramil peptitlerin örnekleri arasinda, N- asetiI-muramiI-L-treoniI-D-izoglutamin (thr-MDP), N-asetil-normuramiI-L-alanil-D- izoglutamin (nor-MDP) ve N-asetilmuramil-L-alaniI-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'- dipalmitoil-5n-glisero-3-hidroksifosforiloksi)-etiIamin (MTP-PE) bulunur.

Bulusta adjuvan olarak kullanilmaya uygun imidazokinolon bilesiklerinin örnekleri arasinda lmiquîmod ve bunun homologlari ( ör., "Resiquimod 3M") bulunur.

Bulus ayrica yukarida tanimlanan bir veya daha fazla adjuvanin yönlerinin kombinasyonlarini da içerebilir.

Tercihen, mevcut bulusa göre farmasötik preparattaki immünostimülatör bilesik, polikatyonik maddelerden, özellikle polikatyonik peptitler, immünostimülatör nükleik asit molekülleri, tercihen immünostimülatör deoksinükleotidler, su içinde yag veya yag içinde su emülsiyonlari, MF59, alüminyum tuzlari, Freund'un tam adjuvani, Freund`un tamamlanmamis adjuvani, nöroaktif bilesikler, özellikle insan büyüme hormonu veya bunlarin kombinasyonlari arasindan seçilir.

Bir alüminyum hidroksit ve/veya alüminyum fosfat adjuvaninin kullanilmasi özellikle tercih edilir ve antijenler genellikle bu tuzlara adsorbe edilir.

Ayrica, mevcut bulusa uygun olarak farmasötik bilesim, asagidaki bilesiklerin veya bunlarin kombinasyonlarinin en az birini içeren bir farmasötik bilesimdir: mevcut bulusa uygun nükleik asit molekülleri, çesitli düzenlemelerinde mevcut bulusa uygun polipeptitler, mevcut bulusa uygun vektör, mevcut bulusa uygun hücreler ve mevcut bulusa uygun antikor.

Bununla baglantili olarak, bu bilesiklerin herhangi biri, bir denege uygulanmaya uygun bir farmasötik tasiyici gibi, hücreler, dokular veya organizmalar ile kullanim için steril olmayan veya steril bir tasiyici veya tasiyicilar ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Bu tür tasiyicilar, bunlarla sinirli olmamak üzere, salin, tamponlu salin, dekstroz, su, gliserol, etanol ve bunlarin kombinasyonlarini içerebilir. Formülasyon uygulama tarzina uygun olmalidir.

Bir düzenlemede, farmasötik bilesim bir dengeleyici içerir. ”Dengeleyici" terimi, asinin immünojenik bilesimini, isitma veya donma sirasinda meydana gelenler gibi olumsuz kosullardan koruyan ve/veya immünojenik bilesimin stabilitesini veya kararli ve immünojenik kosul veya durumda raf ömrünü uzatan bir madde veya asi yardimci maddesini ifade eder.

Dengeleyicilerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, sakkaroz, Iaktoz ve mannoz gibi sekerler; manitol gibi seker alkolleri; glisin veya glutamik asit gibi amino asitler; ve insan serum albümini veya jelatin gibi proteinler bulunur.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, örnegin digerleri gibi topikal, oral, anal, vajinal, intravenöz, intraperitonal, intramüsküler, subkütanöz, intranazal, intratrakeal veya intradermal yollar dahil olmak üzere herhangi bir etkili, uygun sekilde uygulanabilir. Tercih edilen bir düzenlemede, farmasötik bilesimler deri altina veya kas içine, en çok tercihen kas içine uygulanir.

Tedavide veya bir koruyucu madde olarak, mevcut bulusun farmasötik bilesiminin etken maddesi, bir kisiye örnegin enjekte edilebilir bir bilesim olarak, örnegin, tercihen izotonîk olan steril bir sulu dispersiyon halinde verilebilir.

Alternatif olarak, bilesim, tercihen farmasötik bilesim, topikal uygulama için örnegin merhemleri kremler, losyonlar, göz merhemleri, göz damlalari, kulak damlalari, agiz gargarasi, ilaçli kompresler ve sütürler ve aerosoller formunda formüle edilebilir ve örnegin, koruyucu maddeler, ilacin penetrasyonuna yardimci olan çözücüler ve merhemler ve kremler içinde yumusaticilar dahil olmak üzere uygun geleneksel katki maddeleri içerebilir. Bu tür topikal formülasyonlar ayrica, krem veya merhem bazlari gibi uyumlu geleneksel tasiyicilari ve losyonlar için etanol veya oleil alkolü içerebilir. Bu tür tasiyicilar, formülasyonun agirlikça yaklasik %1 ila yaklasik %98'ini olusturabilir; daha genel olarak, formülasyonun agirlikça yaklasik %80'ini olusturacaklardir.

Yukarida tarif edilen tedaviye ek olarak, bu bulusun bilesimleri, genel olarak bakterilerin yara dokusunda maruz kaldigi matris proteinlere yapismasini önlemek için bir yara tedavi ajani olarak ve dis tedavisinde profilaktik kullanim için antibiyotik profilaksisine bir alternatif olarak veya bununla birlikte kullanilabilir.

Tercih edilen bir düzenlemede farmasötik bilesim bir asi bilesimidir. Tercihen, bu asi bilesimi uygun sekilde enjekte edilebilir formdadir. Bagisiklik tepkisini arttirmak için geleneksel adjuvanlar kullanilabilir. Bir protein antijeni ile asilama için uygun bir birim doz, yetiskinler için vücut agirliginin kilogrami basina 0.02 ug ve 3 ug antijen arasindadir ve çocuklar için vücut agirliginin kilogrami basina 0.2 ug ve 10 ug antijen arasindadir ve bu doz tercihen, 2 ila 24 haftalik araliklar ile 1 ila 3 kez uygulanir.

Belirtilen doz araliginda, bu bulusa ait bilesiklerle, uygun bireylere uygulanmalarini engelleyecek hiç bir olumsuz toksikolojik etki beklenmemektedir.

Açiklama, bir denege uygulama için bir veya daha fazla farmasötik formülasyon içeren, deneklere uygulamada kullanimlarini kolaylastiracak sekilde paketlenmis kitleri açiklamaktadir. Tercih edilen bir düzenlemede, kitler 2 mL'Iik bir son hacimde, daha çok tercihen 1 mL'lik bir son hacimde formülasyonu içerir.

Kitler, tek bir doz uygulama ünitesi üretmek için kullanilabilir. Kitler, çesitli yaklasimlarda, her biri hem bir kurutulmus proteine sahip bir birinci kap hem de bir sulu formülasyona sahip bir ikinci kap içerir. Ayrica bu bulusun kapsami dahilinde, tek ve çok bölmeli önceden doldurulmus siringalar (ör., sivi siringalar ve Iiyo siringalar) içeren kitler bulunur.

Bir baska düzenlemede, bu tip kitler, kapali bir sise veya kap gibi bir konteynir içinde paketlenmis ya da yöntemi uygularken bilesigin veya bilesimin kullanimini tarif eden ambalaj içinde ihtiva edilen, burada tarif edilen farmasötik bir formülasyonu (ör., bir terapötik proteini veya peptidi içeren bir bilesim) içerir. Bir düzenlemede, farmasötik formülasyon, kaptaki üst bosluk miktari (ör., sivi formülasyon ve kabin üstü arasindaki havanin miktari) çok küçük olacak sekilde kap içinde paketlenir. Tercihen, üst bosluk miktari ihmal edilebilirdir (yani hemen hemen hiç).

Bir yaklasimda, kit, bir terapötik proteine veya peptit bilesimine sahip olan bir birinci kap ve bilesim için fizyolojik olarak kabul edilebilir bir yeniden yapilandirma çözeltisine sahip bir ikinci kap ihtiva eder. Bir yaklasimda, farmasötik formülasyon, bir birim dozaj formunda paketlenir. Kit istege bagli olarak, ayrica farmasötik formülasyonu belirli bir uygulama yoluna göre uygulamak için uygun bir cihazi içerir. Bazi yaklasimlarda, kit, farmasötik formülasyonlarin kullanimini açiklayan bir etiket içerir.

Farmasötik bilesim bir dizi farkli antijen içerebilir. Antijenlerin örnekleri, tamamen öldürülen veya zayiflatilmis organizmalar, bu organizmalarin proteinlerin veya bunlarin en basit hali olan peptitlerin alt fraksiyonlaridir. Antijenler, bagisiklik sistemi tarafindan glikosile proteinler veya peptitler biçiminde de algilanabilir ve ayrica polisakkaridler veya lipitler olabilir veya bunlari içerebilir. Kisa peptitler kullanilabilir, çünkü sitotoksik T-hücreleri (CTL), genellikle kisa, 8-11 amino asitl uzunlugunda, peptidler halindeki antijenleri ana histo- uyumluluk kompleksi (MHC) ile birlikte tanirlar. B hücreleri, 4 ila 5 amino asit kadar kisa dogrusal epitoplari, bunun yani sira üç boyutlu yapilari (konformasyonel epitoplar) taniyabilir.

Tercih edilen bir düzenlemede, üçüncü yaklasima ait farmasötik bilesim ilave olarak, bir Borre/ia proteinine veya bunun bir aktif fragmanina veya varyantina, örnegin,WO hiperimmün serum-reaktif bir antijeni içerir.

Bulusa göre, üçüncü yaklasima uygun farmasötik bilesim, bir ilaç olarak, özellikle bir asi olarak, özellikle Borreli'a'dan kaynaklanan, bununla baglantili veya iliskili olan özellikle bir hastaliga ya da hastalikli duruma bagli olarak kullanilabilir.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimi, bir ilaç olarak, özellikle bir asi olarak, özellikle Borrelia'dan, daha çok tercihen herhangi bir patojenik Borrelia türlerinin herhangi birinden kaynaklanan, bununla baglantili veya iliskili olan özellikle bir hastaliga ya da hastalikli duruma bagli olarak kullanilabilir ve daha çok tercihen, bir Borre/ia enfeksiyonunun, özellikle de bir B. burgdorferi 5.5., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissetti'i, B. valai'siana, B.

Iusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii', B. turdi ya da B. Sinica enfeksiyonunun, tercihen bir B. burgdorferi 5.5., B. afze/ii or B. garini'i enfeksiyonunun tedavi edilmesine ya da önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanim için olabilir.

Bununla baglantili olarak, B. burgdorferi sl dahil olmak üzere çesitli Borrelia türlerinin, burada açiklananlar dahil olmak üzere çesitli türler ve suslar içerdigi not edilmelidir. Mevcut bulusa uygun olarak önlenecek ve/veya tedavi edilecek olan bakteriyel enfeksiyonla iliskili, bundan kaynaklanan veya buna bagli bir hastalik Lyme borreliosis (Lyme hastaligi) içerir. Diger yaklasimlar, Lyme borreliosis'in semptomlari, evreleri ve alt gruplari ve bunun yani sira giris bölümünde de dahil olmak üzere burada açiklanan, bu tür hastaliklardan muzdarip spesifik hasta gruplari buraya referans yoluyla dahil edilmektedir. Daha özel olarak, Lyme borreliosis genellikle her evrede farkli klinik hastalik belirtilerine sahip hafifleme ve siddetlenmeler ile kademeli olarak ortaya çikar. Erken enfeksiyon evresi 1, deride bölgesel enfeksiyondan olusur, bunu günler veya haftalar içinde 2. evre, yayilmis enfeksiyon ve aylar ila yillar sonrasinda ise 3. evre, kalici enfeksiyon izler. Bununla birlikte, enfeksiyon degiskendir; bazi hastalar sadece deride bölgesel enfeksiyonlara sahipken, digerleri yalnizca artrit gibi hastaligin daha sonraki belirtilerini gösterir.

Ayrica, ihtiyaç halindeki bir denekteki bir Borrelia enfeksiyonunun tedavi edilmesine veya önlenmesine dair bir yöntem açiklanmakta olup, üçüncü yaklasima göre bir farmasötik bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin denege uygulanmasi adimini içerir. tercihen bir memeliyi, daha çok tercihen bir insani tarif etmek için tarifname boyunca kullanilmaktadir. Bir insan hasta gibi spesifik bir hayvana özgü olan bu enfeksiyonlarin, kosullarin veya hastalik durumlarinin tedavisi için hasta terimi, bu spesifik hayvani ifade eder.

Tercihen, denek bir insandir; bununla birlikte, bilesimin tibbi kullanimi, tavuk, hindi, ördek veya kaz dahil kümes hayvanlari, at, inek veya koyun gibi çiftlik hayvanlari veya köpekler veya kediler gibi evcil hayvanlari da içerebilir.

”Etkili miktar" terimi, mevcut bulusun yönteminde kullanildiginda hedeflenen bir sonucu indüklemek için kullanilabilen mevcut farmasötik bilesimin bir miktarini tarif etmek için tarifname boyunca kullanilir. Mevcut bulusun çesitli yaklasimlarinda, etkili miktar terimi tedavi veya önleme ile baglantili olarak kullanilir. Diger yaklasimlarda, etkili miktar terimi, bir Borrelia enfeksiyonunun tedavi edilmesinin veya önlenmesinin istendigi, mevcut bulusa göre olan yöntemler dahil olmak üzere yararli veya faydali olarak görülen bir sonucu üreten bir maddenin bir miktarini ifade eder.

Hali hazirda tarif edilen bilesikler ve bilesimlere göre etkili miktar terimi, bir Borrelia ile iliskili hastaliktan muzdarip olan, özellikle bir insan hasta da dahil olacak sekilde bir memeli hastaya Borreli'a enfeksiyonunu azaltmak ya da önlemek için uygulanan, mevcut bulusa uygun bilesigin miktarini tarif etmek üzere tarifname boyunca kullanilmaktadir.

Bir denegin immünize edilmesi yöntemi, mevcut bulusun üçüncü yaklasimina ait farmasötik bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin denege uygulanmasi adimini içerir.

Yöntem, bir bireyde, bahsedilen bireyi hastaliktan korumak için bu hastalik bireyde halihazirda olsun ya da olmasin, antikorlar veya bir hücre aracili T hücresi yanitini, sitokin üreten T hücrelerini veya sitotoksik T hücrelerini üretmek için bir bagisiklik yanitini uyarmak üzere mevcut bulusa göre olan bir polipeptidin ya da nükleik asidin in vivo olarak uygulanmasi ile gen terapisi yoluyla veya baska bir sekilde bir bagisiklik tepkisinin uyarilmasini içerir.

Mevcut bulusun ürünleri, özellikle polipeptitler ve nükleik asitler, tercihen izole formda saglanir ve homojenlik saglanana kadar saflastirilabilir. Burada kullanildigi sekli ile "izole edilmis" terimi, "insan eli tarafindan" dogal halinden ayrilmasi anlamina gelir; yani, dogada meydana gelirse, degistirilmis ya da orijinal ortamindan uzaklastirilmistir ya da her ikisi de yapilmistir. Örnegin, dogal olarak olusan bir nükleik asit molekülü veya yasayan bir organizmada dogal olarak kendi dogal halinde bulunan bir polipeptit, "izole edilmemistir", ancak kendi dogal halinde bir arada bulundugu materyallerden ayrilmis ayni nükleik asit molekülü veya polipeptit, terimin burada kullanildigi sekliyle "izole edilmistir”. Izolasyonun bir parçasi olarak ya da sonrasinda, bu nükleik asit molekülleri, füzyon genlerini olusturmak üzere mutajenez için ve örnegin, bir konakçida yayilma ya da ekspresyon için diger nükleik asit moleküllerine, mesela DNA molekülleri ile birlestirilebilir. Izole edilmis nükleik asit molekülleri tek basina veya vektörler gibi diger nükleik asit molekülleri ile birlestirilmis halde konakçi hücrelere kültür içinde sokulabilir veya tüm organizmalar içinde sokulabilir. Kültür içinde veya tüm organizmalar içinde konakçi hücrelere sokulan bu gibi DNA molekülleri, terimin burada kullanildigi haliyle hala izoledir, çünkü bunlar dogal olarak olusan formlarinda ya da ortamlarinda degildirler. Benzer sekilde, nükleik asit molekülleri ve polipeptitler, ortam formülasyonlari, nükleik asit moleküllerinin veya polipeptitlerin örnegin hücrelere verilmesi için çözeltiler, örnegin, dogal olarak olusmayan bilesimler gibi kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar için bilesîmler ve çözeltiler gibi bir bilesim içinde olusabilirler ve burada, terimin kullanildigi anlam dahilinde izole edilmis nükleik asit molekülleri ya da polipeptitleri olarak Bulus, burada açiklanan belirli metodoloji, protokoller ve reaktiflerle sinirli degildir, çünkü bunlar degisebilir. Ayrica, burada kullanilan terminoloji sadece belirli düzenlemeleri tarif etmek içindir ve bu bulusun kapsamini sinirlandirmayi amaçlamamaktadir. Burada ve ekteki istemlerde kullanildigi sekliyle, "bir", "tek" ve "bahsedilen" tekil formlari, baglam açikça aksi belirtilmedikçe çogul referansi içerir. Benzer sekilde, "içerme , ihtiva etme" ve "kapsama" kelimeleri sadece münhasiran olmaktan ziyade kapsamli bir sekilde yorumlanmalidir.

Aksi belirtilmedikçe, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler ve kisaltmalar, bulus alanindaki teknikte uzman bir kisi tarafindan yaygin olarak anlasilanla ayni anlamlara sahiptir.

Burada tarif edilenlere benzer veya esdeger herhangi bir yöntem ve materyal mevcut bulusun uygulanmasinda kullanilabilmesine ragmen, tercih edilen yöntemler ve materyaller burada tarif edilmistir.

Mevcut bulus, bundan baska özelliklerin, düzenlemelerin ve avantajlarin anlasilabilecegi asagidaki Sekiller, Tablolar, Örnekler ve Sekans listesi ile daha fazla açiklanmaktadir.

Bu sekilde, tartisilan spesifik modifikasyonlar, bulusun kapsami üzerinde sinirlamalar olarak yorumlanmamalidir. Teknikte uzman kisi için, bulusun kapsamindan uzaklasmadan çesitli esdegerlerin, degisikliklerin ve modifikasyonlarin yapilabilecegi açiktir ve dolayisiyla, bu tür esdeger düzenlemelerin buraya dahil edildigi anlasilmalidir.

Mevcut bulus ile baglantili olarak Sekil 1, Borrelia'dan gelen OspA serotiplerinin 1-6 amino asit dizilimini göstermektedir.

Sekil 2, mevcut bulusa göre mutant OspA fragman heterodimerlerinin üretimini Sekil 3, üç farkli mutant OspA heterodimeri içeren mevcut bulusa ait bir olasi farmasötik bilesimin, bir "kombinasyon asisinin” polipeptit bilesenlerini sematik olarak temsil etmektedir.

Sekil 4, örnegin, mevcut bulusun Iipitlenmis polipeptidlerinin N-ucunda bulunan sistein ile ikame edilmis bir yag asidine ait bir örnegin, Pam3Cys'nin kimyasal yapisini göstermektedir.

Sekil 5, mutant OspA fragman heterodimer polipeptitleri ile asilanmis farelerden alinan antikorlarin OspA serotipleri 1-6'ya ait Borrelia'nin hücre yüzeyine baglanmasini göstermektedir.

Tablo 1, disülfit baglari (DO) içermeyen vahsi tip serotip 2 OspA fragmanina kiyasla, Dl ila D2 arasinda disülfit bagi tiplerine (isimlendirme için Tablo A-4'e bakiniz) sahip mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin katlanmasinin termal stabilitesini gösterir.

Tablo 2, PBS, tam uzunlukta OspA veya vahsi tip serotip 2 OspA fragmani (SZDO-His) ile asilanmis farelerden olusan kontrol gruplari da dahil olmak üzere 01 ila D5 arasinda disülfit bagi tiplerine (isimlendirme için Tablo A-4'e bakiniz) sahip mutant serotip 2 OspA fragmanlari ile asilamayi takiben Kene Testi Yöntemi ile B. afzelii (ISl susu) enfeksiyonundan farelerin korunmasini gösterir.

Tablo 3, PES veya tam uzunlukta OspA proteini ile asilanmis farelerin kontrol gruplari da dahil olmak üzere D1, D3 ve D4 (Lip-SZDl-His, Lip-SZD3-His ve Lip-SZD4-His) disülfit bagi tiplerine sahip Iipitlenmis mutant serotip 2 OspA fragmanlari ile asilamanin ardindan Kene Testi Yöntemi ile B. afzelii(lSl susu) enfeksiyonundan farelerin korunmasini gösterir.

Tablo 4, in vivo Borrelia testi modellerinde, bulusun mutant OspA heterodimerlerinin koruyucu kapasitesini gösterir. Fareler, Lip-SlDl-SZDl-His, Lip-S4D1-S3Dl-His, Lip- S4D1-SBDl veya Lip-SSDl-SGDl-His ile asilanmistir ve belirtilen Borre/ia OspA serotipi ile Kene veya Igne Testi Yöntemi vasitasi ile belirtilen sekilde test edilmistir. Kontrol grubu her deneyde, tek basina AI(OH)3 adjuvani ile asilanmistir.

Tablo 5, bulusa ait kombinasyon asisinin, OspA serotip 1 Borreli'a (igne testi yönteminde N40 susu) ve OspA serotip 2 Borrelia (kene testi yönteminde lSl susu) ile in vivo teste karsi koruyucu kapasitesini gösterir. Fareler, 1:1:1'Iik bir oranda üç antijen LipSlDl-SZDl, Lip-S4Dl-S3D1 ve Lip-55D1-56D1 (kombinasyon asisi) ile birlikte ve belirtilen kontrol antijenleri ile asilanmis ve belirtilen sekilde, Kene veya Igne Testi Yöntemi vasitasi ile test edilmistir. Kontrol grubu her deneyde, tek basina Al(OH)3 adjuvani ile asilanmistir.

Tarifnamede atifta bulunulabilecek sekiller ve tablolar asagida daha ayrintili olarak açiklanmaktadir.

Sekil 1 OspA serotiplerinin birden altiya kadar amino asit sekansi dizilimi. Dizilim, proteinin membrana bagli N-terminal kisminin, daha fazla açikta kalan C-terminal kismindan daha yüksek oranda korunan bir amino asit sekansina sahip oldugunu göstermektedir.

Sekil 2 Borre/ia sp. 'nin iki farkli OspA serotipinden mutant OspA C-terminal fragmanlarini içeren, bulusun bir mutant OspA heterodimerinin üretimi. (A) Lipilenmis bir mutant OspA heterodimeri kodlayan bir nükleik asidin sematik gösterimi. 5 'ila 3' arasindaki bilesenler, bir lipidasyon sinyal sekansi (Lip sinyali) için kodlama sekanslari, N-terminali lipidasyonu (Lipidasyon peptidi=LP) için bir küçük sistein, iki adet dogal olmayan sisteine sahip OspA'nin bir mutant C-terminali fragmani, bir kisa baglayici peptit (LNl), bunu takiben iki adet dogal olmayan sisteine sahip bir ikinci mutant OspA C-terminali fragmani içeren peptit içerir. (B) Ara mutant OspA heterodimer polipeptidi, dogrudan nükleik asit yapisinin translasyonunu takiben ortaya çikan ürünü içerir. Bu polipeptit N-ucundan C-ucuna kadar bir lipidasyon sinyal sekansindan (Lip sinyali), bir sistein içeren bir peptitten (LP), dogal olmayan bir disülfit bagina sahip olan bir mutant OspA fragmanindan bir kisa baglayici peptitten ve bunu takip eden dogal olmayan bir disülfit bagina sahip ikinci bir mutant OspA fragmanindan olusmaktadir. (C) Translasyonal sonrasi modifikasyonun ardindan Iipitlenmis nihai mutant OspA heterodimer polipeptit. Bu heterodimer, N-ucundan C-ucuna kadar sisteinle Iipitlenmis N-terminaline sahip kisa sistein içeren bir peptitten (”Lip" ile gösterilir), bir disülfit bagi ile stabilize edilmis bir mutant OspA fragmanindan, bir baglayici peptitten (LN1) ve bir disülfit bagi ile stabilize edilmis ikinci bir mutant OspA fragmanindan olusur. Lipidasyon sinyal sekansi, gösterildigi üzere translasyon sonrasi modifikasyon sirasinda bölünür.

Sekil 3 Mevcut bulusa göre tercih edilen bir farmasötik bilesime ait bir örnek. Her biri, iki farkli Borreli'a OspA serotipinden gelen mutasyona ugramis OspA fragmani içeren üç adet mutant OspA heterodimeri, bilesim içinde mevcuttur, birlikte, alti farkli Borre/ia OspA serotipinden OspA antijenleri saglarlar. Böyle bir farmasötik bilesim, alti Borre/ia serotipine karsi es zamanli immünizasyon saglar.

Sekil 4 Tam uzunlukta vahsi tip OspA proteininin N-terminali sisteininin bir yag asidi ikamesine ve bunun yani sira bulusun lipitlenmis mutant OspA fragmani monomerlerine ve heterodimerlerine ait bir örnek olan Pam3Cys'nin kimyasal yapisinin gösterimi. Bulusa ait bir tam uzunlukta OspA proteininin veya polipeptitlerinin translasyon sonrasi modifikasyonu sirasinda, N-terminali Iipidasyon sinyali sekansi bölünür ve yag asitleri, en yaygin sekilde üç palmitoil parçalari (”Pamg'), enzimatik olarak kovalent sekilde N-terminali sistein kalintisina baglanir (kükürt atomu, ”5”, bir ok ile gösterilmektedir). Pam3Cys kalintisindan C-ucunun sonunda bulunan, polipeptit zincirine ait kalan kalintilar, ”Xn” ile gösterilir. (Bouchon, vd.

Sekil 5 Bagisiklik kazandirilmis farelerden alinan antikorlarin Borreli'a spiroketlerinin hücre yüzeyine baglanmasi. Fareler, belirtilen antijenlerin her birinden 1 ug ile üç kez asilanmistir: OspA serotipleri 1-6'nin lipitlenmis ve His-etiketli, tam uzunlukta OspA proteinleri; tek basina Lip-SlDl-SZDl, Lip-S4Dl-S3Dl ya da Lip-SSDl-SGDl veya 1:1:1'lik bir oranda birlikte Lip- SlDl-SZDl, Lip-S iki haftalik araliklarla ve son dozdan bir hafta sonra serumlar toplanmistir. Serumlarin birkaç seyreltmesi, hücre boyama ve akis sitometrisi yoluyla Borrelia'nin hücre yüzeyine baglanmasi açisindan test edilmistir. Tek basina AI(OH)3 adjuvani ile asilanan kontrol farelerinden toplanan serumlar ile boyandiginda gözlenen floresan yogunluk degerleri, spesifik olmayan baglanmayi ortaya koymak için çikarilmistir. (Kullanilan Borrelia : B. burgdorferi', OspA serotip 1, N40 susu; B. afzelii, OspA serotip 2, "C” susu; B. garinii, OspA serotip 3, "D” susu; B. bavariensis, OspA serotip 4, Fin susu; B. garinii, OspA serotip 5, I`E” susu; B. garinii, OspA serotip 6, "B” susu.) Tablo 1. Disülfit baglarinin farkli yerlesimîne sahip, Iipitlenmemis, His-etiketli B. afzelii K78 mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin termal stabilitesi Farkli sistein bagi tiplerine (bakiniz Tablo A-4) sahip mutant serotip 2 OspA fragmanlari, 50 mM Tris-HCI, içinde çözünmüs ve vahsi tip serotip 2 OspA fragmani (SZDO) ile karsilastirilarak termal stabilite açisindan test edilmistir. Bir disülfit baginin varligi, vahsi tip serotip 2 OspA fragmanina kiyasla artmis bir erime sicakligina neden olmustur.

Serotip 2 OspA mutant fragmani SEQ ID NO: Erime Sicakligi (°C) SZDO-His* 1 47.6 SZDl-His 2 70.4 $2D2-His 3 54.6 SZDS-His 4 58.6 SZD4-His 5 58.4 S2D5-His 6 53.8 *Isimlendirme için Tablo A-4 ve A-5'e bakiniz.

Tablo 2. Kene Testi Yöntemi ile B. Afzeli'i (serotip 2) enfeksiyonuna karsi lipitlenmemis His- etiketli mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin azalan dozlarinin koruyucu kapasitesi Bes adet Iipitlenmemis His-etiketli mutant serotip 2 OspA fragmani, koruyucu kapasite açisindan iki farkli dozda (30 pg ve 5 ug) test edilmis ve vahsi tip serotip 2 OspA fragmani ile karsilastirilmistir. Tek basina AI(OH)3 adjuvani ile ya da lipitlenmemis tam uzunlukta serotip 2 OspA ile bagisiklik kazandirilan fare gruplari, sirasiyla negatif ve pozitif kontroller olarak görev yapmistir. Tüm antijenler His etiketlidir ve Iipitlenmemistir. Sunulan veriler, ayni kosullar altinda gerçeklestirilen çesitli deneylerin sonuçlarini birlestirmektedir.

Immünojen Kene ile yükleme (OspA 3 x 30 ug (11 3 x 5 ug (4 serotip 2: B.afzelii, ISi deney) deney) susu) Enfekte Enfekte olmus/toplam olmus/toplam AI(OH)3adjuvani tek basina Kene (OspA-STZ) 58/62 20/23 Tam uzunlukta OspA K78- Kene (OspA-STZ) 1/72 1/25 His (SEQ ID NO: 209) 2/30 4/27 S 5/35 2/11 Tablo 3. Kene Testi Yöntemi ile B. Afzelii enfeksiyonuna karsi lipitlenmis His-etiketli mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin azalan dozlarinin koruyucu kapasitesi Farkli disülfit bagi tiplerine sahip üç adet Iipitlenmis His-etiketli mutant serotip 2 OspA fragmani, koruyucu kapasite açisindan üç farkli dozda (3.0 ug, 1.0 ug ve 0.3 ug) test edilmistir. Tek basina Al(OH)3 adjuvani ile ya da Iipitlenmemis tam uzunlukta serotip 2 OspA ile bagisiklik kazandirilan fare gruplari, sirasiyla negatif ve pozitif kontroller olarak görev yapmistir. kosullar altinda gerçeklestirilen çesitli deneylerin sonuçlarini Sunulan veriler, ayni birlestirmektedir.

(OspA serotip 2: B. afzeli'i', IS1 ug (5 deney) Enfekte olmus/toplam Enfekte olmus/toplam Enfekte olmus/toplam AI(OH)3 adjuvani Kene (OspA-ST2) 58/59 - - tek basina (tüm dozlar için kontrol) Tam uzunlukta OspA K78-His (SEQ ID NO: 209) Kene (OspA-ST2) 0/14 Lip-SZDl-His (SEQ Kene (OspA-STZ) 0/17 Lip-52D3-His (SEQ Kene (OspA-STZ) 1/15 Lip-52D4-His (SEQ Kene (OspA-STZ) Tablo 4. Igne veya Kene Testi Yöntemleri vasitasi ile in vivo Borrelia testine karsi mutant OspA heterodimerlerinin koruyucu kapasitesi Fare gruplari, iki haftalik araliklarla, belirlenen dozlarda OspA heterodimeri ya da tek basina AI(OH)3 adjuvani ile üç kez asilanmistir.

Kullanilan immünojenler, Lip-SlDl-SZDl-His (Borreli'a OspA-STI ile test edilmis, Deneyler 1- 3), ayri ayri Lip-SlDl-SZDl-His, Lip-S4D1-S3Dl-His ve Lip-SSDl-SGDl-His (Borrelia OspA-STZ ile test edilmis, Deneyler 4-6), Lip-S4D1-53D1 (Borrelia OspA-ST4 ile test edilmis, Deneyler 7 ve 8) ve Lip-SSDl-SöDl-His (Borrelia OspA-STS ile test edilmis, Deneyler 9 ve 10; Borrelia OspA-ST6 ile test edilmis, Deneyler 11 ve 12) olmustur. Bagisiklik kazandirilmis farelere, son asilamadan iki hafta sonra Kene veya Igne Testi Modelleri vasitasiyla belirtilen sekilde test yapilmistir.

Immünojen Doz Igne ile yükleme(OspA- Enfekte olmus/toplam serotip 1: B. Deney 1 Deney 2 Deney 3 burgdorferi s.s., N40 susu) Lip-SlDl-SZDl-His 3 x Igne (OspA-STl) 0/10*** 0/9*** 4/10** (SEQ ID NO: 49) 5.0 ug tek basina Immünojen Doz Kene ile yükleme (OspA- Deney 4 Deney 5 Deney 6 serotip 2: B.afzelii, ISi Lip-SlDl-SZDl-His 3 x Kene (OspA-STZ) 0/10*** 0/9*** 0/6*** (SEQ ID NO: 49) 2.0 ug Lip-S4Dl-S3Dl-His 3 X Kene (OspA-STZ) 0/9*** 2/7* 0/6*** (SEQ ID NO: 81) 2.0 ug (SEQ ID NO:65) 2.0 ug AI(OH)3 adjuvani - Kene (OspA-STZ) 9/9 8/8 tek basina Immünojen Doz Igne ile yükleme(OspA- Deney 7 Deney 8 serotip 4: B. bavariensis, Scf susu) (Seq ID No: 194) 5.0 iig AI(OH)3 adjuvani - Igne (OspA-ST4) 9/10 9/10 - tek basina Immünojen Doz Igne ile yükleme(OspA- Deney 9 Deney 10 serotip 5: B. garinii') Lip-SSDl-SGDl-His 3 X Igne (OspA-STS) 1/10 2/10 - (SEQ ID NO:65) 5.0 ug AI(OH)3 adjuvani - Igne (ST5) 6/10 6/10 - tek basina Immünojen Doz Igne ile yükleme(OspA- Deney 11 Deney 12 serotip 6: B. garinii') (SEQ ID NO: 65) 5.0 ug AI(OH)3 adjuvani - Igne (OspA-ST6) 9/10 10/10 - tek basina P-degeri;Fisher'in kesinlik test, iki kuyruklu. *önemli (<0.05), **oldukça önemli (<0.01), Tablo 5. OspA serotip 1 ve serotip 2 Borrelia tehtidine karsi, bulusun mutant OspA heterodimer kombinasyon asisinin koruyucu kapasitesi. Fare gruplari, iki haftalik araliklarla, belirlenen dozlarda immünojen ya da tek basina AI(OH)3 adjuvani ile üç kez asilanmistir.

Kullanilan immünojenler, mutant OspA heterodimerleri LipSlDl-SZDl, Lip-S4D1-S3D1 ve Lip- 1:1:1'Iik bir kombinasyonuydu. Bagisiklik kazandirilmis farelere, son asilamadan iki hafta sonra Kene Testi Yöntemi (ST2, Deneyler 13 ve 14) veya Igne Testi Yöntemi (ST1, Deneyler 15 ve 16) vasitasiyla yükleme yapilmistir. immünojen Doz Kene ile yükleme (OspA-serotip Enfekte 2: B afzelii, I51 susu) olmus/toplam Lip-SlDl-SZDl (SEQ ID 3 x 0/6*** 0/7** Kombinasyon asisi: Lip-SlD1-52D1(Seq ID 3 x 5.0 ug Lip-SSD1-56D1(Seq ID 3 x 5.0 pg Al(OH)3 adjuvani tek - Kene (OspA-STZ) 7/7 Immünojen Doz Igne ile yükleme(OspA-serotip Deney Deney Lip-SlDl-SZDl (Seq ID 3 x 0/10*** 0/10*** Lip-OspAl-His (Seq ID 3 x 0/10*** 0/10*** (Seq ID No: 212) Kombinasyon asisi Lip-SlD1-52D1(Seq ID 3 x 1.0 ug Lip-S4D1-53D1 (Seq ID 3 x 1.0 ug No: 194) Igne (OspA-STl) 0/10*** 0/10*** Lip-55D1-56D1(Seq ID 3 x 1.0 ug P-degeri;Fisher'in kesinlik test, iki kuyruklu. *önemli (<0.05), **oldukça önemli (<0.01), ÖRNEKLER Örnek 1. Mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin termal stabilitesinin degerlendirilmesi Deneysel prosedür/er Termal stabilite Lipitlenmemis mutant serotip 2 OspA fragman monomerlerinin erime sicakliklari (Tm),PantoIian0, ve kayma analizi ile belirlenmistir. Floresan boya SYPRO® Orange protein jel boyasi (Sigma, ABD tarafindan DMSO içinde 5000 kat konsantre olarak tedarik edilmistir) protein açilimini izlemek için kullanilmistir. Her bir kuyucukta, 7.5 uL SYPRO® Orange (stok çözeltisinden ug) birlestirilmistir. Protein numuneleri, CFX96 Gerçek Zamanli Tespit Sisteminde (Bio-Rad, ABD) 0,2 °C/10 saniyelik bir hizda, 25 °C ila 95 °C arasinda isitilmis ve floresan degisiklikleri izlenmistir. Floresans yogunlugu, sirasiyla 490 ve 575 nm'lik eksitasyon ve emisyon dalga boylari ile ölçülmüstür. Tm, Bio-Rad CFX Manager 2.0 programi kullanilarak belirlenmistir.

Lipitlenmemis His etiketli serotip 2 OspA mutant fragmanlarinin Tmdegerleri, dört farkli tampon sisteminde ölçülmüstür: bir kontrol olarak Iipitlenmemis serotip 2 OspA vahsi tip fragman (SZDO) kullanilarak, 50 mM Tris-HCI, ; 50 mM Tris-HCI, .

Sonuçlar Bütün durumlarda, olusturulmus bir sistein bagina sahip mutant serotip 2 OspA fragmanlari, vahsi tip serotip 2 OspA fragmanindan (SZDO) daha yüksek Tm'ye sahip olmustur (bakiniz Tablo 1). Tm dört farkli tampon sisteminde benzer sonuçlar ile test edilmis (50 mM Tris-HCl, proteinlerin stabilitesinin genis bir pH araligi boyunca benzer oldugunu göstermistir. Bu sonuç, olusturulan disülfit baginin, OspA fragmanini stabilize ettigi hipotezine güvene katkida Örnek 2. Lipitlenmemis His etiketli mutant serotip 2 OspA fragman monomerlerinin koruyucu kapasitesinin Kene Testi Yöntemi'nde degerlendirilmesi (STZ, B. afzelii) Deneysel prosedür/er Rekombinant proteinlerin klonlanmasi ve ekspresyonu Sistein bagi tip 1-5 içeren mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin yani sira vahsi tip serotip 2 OspA fragmanina (sirasiyla, SEQ ID NO'Iar: 1, 2, 3, 4, 5 ve 6) GenScript, ABD tarafindan E. coliekspresyonu için kodon optimizasyonu yapilmistir. Lipitlenmemis mutant serotip 2 OspA fragmanlarinin, saflastirma amaciyla C-terminali His-etiketlidir. Gen fragmanlari, bir T7 promotörünün yani sira Kanamisin direnç kaseti içeren bir vektör olan pET28b(+) vectörüne (Novagen, ABD) klonlanmistir. Monomerler, 37 °C'de IPTG'nin ilave edilmesiyle BL21 StarTM (DE3) hücrelerinde (Invitrogen, USA) eksprese edilmistir. Hücreler, 4 saat sonra santrifüjleme ile toplanmis ve pelet, daha fazla islenmeden önce 12 aya kadar - 70 °C'de saklanmistir.

Lipitlenmemis His etiketli vahsi tip ve mutant OspA fragmani monomer proteinlerin saflastirilmasi Hücreler yüksek basinçli homojenizasyon ile mekanik olarak bozulmus ve His-etiketli OspA fragmanlarini içeren çözünür fraksiyon bir Ni-sefaroz kolonuna (Ni Sepharose 'M 6 Hizli Akis; GE Healthcare, Birlesik Krallik) uygulanmis ve His-etiketli OspA fragmanlari bir Imidazol gradyani ( üzerinde yürütülmüstür. Toplanan fraksiyonlar, ayrica bir jel filtrasyon kolonu (Superdex 200, GE Healthcare) üzerinde, bunu takiben bir tampon degisim kolonu (Sephadex G-25, GE Healthcare) ile saflastirilmistir. His-etiketli OspA fragmani pikleri, analitik boyut dislama kolonu ve ters fazli kromatografiye dayanarak toplanmistir. Steril filtrelemeden sonra, saflastirilmis proteinler formülasyona kadar -20 °C'de saklanmistir.

Farelerin Asilanmasi Tüm çalismalar için disi C3H/HeN (H-Zk) fareleri kullanilmistir (Harlan, Italya). Her testten önce, 8 haftalik bes fareden olusan gruplarin, kuyruk damari vasitasi ile kanlari alinmis ve bagisiklik öncesi serum hazirlanmis ve toplanmistir. Lipitlenmemis bes adet mutant serotip 2 OspA fragman proteini (sirasiyla, SZDl-S, SEO` ID NO'lar: 2, 3, 4, 5 ve 6) on bes farkli deneyde test edilmistir. Iki haftalik araliklarla asilama yapilmistir. Ilgili proteinin 30 ve 5 pg'lik kullanilan dozlari, sirasiyla 11. ve 4. deneyde test edilmistir. Tüm formülasyonlar, %0.15'lik bir nihai konsantrasyonda alüminyum hidroksit (AI(OH)3) içermistir. Üçüncü asilamadan bir hafta sonra, kan toplanmis ve hiper bagisiklik serumu hazirlanmistir.

Her deneyde, AI(0H)3 ile formüle edilmis PBS ile enjekte edilen bir grup, bir negatif kontrol olarak ihtiva edilmis ve bir grup fareye, B. Afzelii K78 susundan (SEQ lD NO: 1) gelen vahsi tip C-terminali OspA fragmani olan 5200 ile bagisiklik kazandirilmistir. B. Afzeli'i K78 susundan (SEQ ID NO: 209) gelen Iipitlenmemis bir tam uzunluktaki vahsi tip OspA proteini ile bagisiklik kazandirilmis, ayrica %3 ile formüle edilmis bir baska grup ise her hayvan çalismasina pozitif kontrol olarak dahil edilmistir. Tüm hayvan deneyleri Avusturya yasalarina (BGBl Nr. 501/1989) uygun olarak gerçeklestirilmis ve "Magistratsabteilung 58" tarafindan onaylanmistir.

Bagisiklik kazandirilmis farelere kene testi ve serum ve dokularin toplanmasi (burada ayrica ”Keneyle Test Yöntemi” olarak da ifade edilmektedir) Bagisiklik kazandirilmis farelerin kene testi, son asilamadan iki hafta sonra yapilmistir.

Bagisiklik kazandirilmis fareleri B. Afzelii' ile test etmek için her farenin sirtindaki tüyler Veet® Krem (Reckitt Benckiser, Birlesik Krallik) ile temizlenmis ve süper yapistirici ile cilde küçük bir hava alabilen kap yapistirilmistir (Pattex, Almanya). Daha sonra, B. afzelii, ISl susu ile enfekte edilen bir ya da iki I. Rici'nus Iarvasi her bir fareye uygulanmis ve tutunmalarina ve kan alarak beslenmelerine izin verilmistir. Beslenme durumu her bir kene için günlük olarak izlenmis ve sadece en az bir tam beslenmis kenenin toplandigi fareler son okumaya dahil edilmistir. Bir ya da iki tam beslenmis kenenin toplandigi fareler arasinda bir ayrim yapilmamistir.

Kene uygulamasindan alti hafta sonra, orbital kanama ile kan alinmis ve son serumlar hazirlanmis ve enfeksiyon durumunu belirlemek için VIsE ELISA analizi için kullanilmistir.

Fareler daha sonra servikal dislokasyon ile feda edilmis ve her bir fareden bir kulak toplanmis, DNA ekstrakte edilmis ve dokudaki Borrelia'yi tanimlamak için iç içe PCR analizine tabi tutulmustur.

Enfeksiyonun okunmasi Sadece uygulanan kenenin(lerin) kan alimi ile beslendigi ve toplanabildigi fareler, deneyin nihai okumasina dahil edilmistir. Fareler, kenenin uygulanmasindan 6 hafta sonra feda edilmis ve nihai serumlarin yani sira organlar toplanmistir. Nihai enfeksiyonun okunmasi, iki farkli analizi baz almistir (165-235 genler arasi aralayiciyi hedefleyen iç içe PCR ve asagida detayli olarak açiklandigi gibi VIsE (IR6) ELISA). 165-235 genleri arasi aralayiciyi hedefleyen iç içe PCR Her fareden bir kulak, asagidaki modifikasyon ile, üreticinin talimatlarina göre DNeasy Kan ve Doku Kiti (Qiagen, Almanya) kullanilarak DNA ekstraksiyonuna ve saflastirmaya tabi tutulmustur. Her bir kulak, rekombinant Proteinaz K, PCR derecesinde (Roche, 14-22 mg/mL) 60 °C'de gece boyunca sindirilmistir. DNA, 50 uL deiyonize steril su içinde yürütülmüs ve daha fazla analiz edilinceye kadar -20 °C'de saklanmistir. Negatif bir kontrol olarak, her DNA ekstraksiyonuna ve saflastirmasina bir bos saflastirma kolonu dahil edilmis ve elüat, iç içe PCR'ye tabi tutulmustur. Tüm DNA ekstraktlari, 30 saniye boyunca 94 °C'Iik ve 30 saniye boyunca 56 °C'Iik ve 60 saniye boyunca 72 °C'Iik 40 döngü içeren bir iç içe PCR prosedürü ile primerler (Ileri 5'-GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 26) ve Geri 5'- GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG-S' (SEQ ID NO: 27)) kullanilarak Borrelia DNA'sinin varligi açisindan taranmistir. Iç içe PCR reaksiyonu için 10 uL, 1 uL'Iik reaksiyon hacminden örnek olarak kullanilmistir. Iç içe PCR adimi, primerler (Ileri iç içe 5'- AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG-3' (SEQ ID NO: 28) ve Geri iç içe 5'- GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA-3' (SEQ ID NO: 29)) kullanilarak 30 saniye boyunca 94 °C'Iik ve reaksiyon hacmi, etidyum bromür içeren %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayrilmis ve bantlar, UV isiginda görsellestirilmistir.

Her bir PCR analizinde, B. afzeiii K78 susunun in vitro yetistirilen bir kültüründen saflastirilan DNA, bir pozitif kontrol örnegi olarak kullanilmistir. Ek olarak, ekstrakte edilmis DNA yerine negatif kontrol olarak PBS kullanilmistir. Nihai ürünün bes mikrolitresi, etidyum bromür içeren %l'lik bir agaroz jel üzerinde ayrilmis ve bantlar, UV isiginda görsellestirilmistir.

Degisken majör protein benzeri Sekans E proteinine ait Degismeyen Bölge 6 (IR6) ile ELISA B. gariniilP90 susunun sekansindan türetilmis biyotinlenmis bir 25-mer peptit (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) (SEQ ID NO: 30) analiz için kullanilmistir. (Liang FT, vd. plakalari (Nunc, Danimarka), %01 Tween 20 (PBS/0.1T) eklenmis PBS içinde kuyu basina biyotinlenmis peptit ile kaplanmistir. Plakalar gece boyunca 4 °C'de inkübe edilmistir. Peptit ile kaplandiktan sonra plakalar PBS/0.1T ile bir kez yikanmistir. Plakalar daha sonra PBS/0.1T ile tekrar yikanmadan önce kuyu basina 100 pL PBS + %2 BSA ile oda sicakliginda bir saat süreyle (RT) bloke edilmistir. Test sonrasi serumun peptide olan PBS/0.1T ile üç kez yikanmadan önce oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilmistir. Her bir kuyucuk daha sonra PBS + %1 BSA içinde HRP'ye (Dako, Danimarka) konjuge edilmis 50 uL'lik 1.3 ug/mL poliklonal tavsan anti-fare IgG'si almistir. Plakalar daha sonra oda sicakliginda 1 saat inkübe edilmistir. PBS/0.1T ile üç kez yikandiktan sonra, substrat olarak ABTS (50 uL/ kuyucuk) (Sigma-Aldrich, ABD) ilave edilmis ve 30 dakika boyunca renk gelisimi için birakilmistir. Absorbans 405 nm'de ölçülmüstür. Bütün serumlar iki kez test edilmis, negatif kontroller serumun yerine PBS ve bunun yani sira peptit ile kaplanmamis plakalar içermistîr.

B. afze/i'i'enfeksiyonu açisindan pozitif kültür olarak gösterilen farelerden alinan serum, pozitif kontroller olarak kullanilmistir.

Sonuçlar Keneyle test yönteminde koruma seviyeleri Test edilen her iki dozda da bes stabilize OspA B. afzelii fragmaninin tümü için yüksek seviyede koruma gözlenmistir (30 ug ve 5 ug, Tablo Z'ye bakiniz). PBS kontrol grubundaki yüksek enfeksiyon oranlari, kenelerin yüksek siklikla enfekte oldugunu göstermektedir. Ek olarak, B. afzelii K78 susundan gelen pozitif kontrol, Iipitlenmemis tam uzunlukta OspA'nin koruyuculugu yüksek olmustur. Bu kontrol gruplari birlikte, deneysel okumalarin yüksek güvenilirligini göstermektedir. ug'lik dozlarin (11 toplam deney) ve 5 ug'lik dozlarin (4 toplam deney) test edildigi deneylerden elde edilen koruma sonuçlari, Tablo 2'de özetlenmektedir. Enfeksiyonu dogrulamak için kullanilan iki yöntem, yani VIsE ELISA ve iç içe PCR, Keneyle Test Yöntemi'ndeki enfeksiyonu degerlendirmeye yönelik bu okuma yöntemlerinin dayanikliligini gösteren görsel olarak özdes sonuçlar (veriler gösterilmemistir) vermistir. Örnek 3. In vivo Borrelia testine karsi Iipitlenmis His etiketli mutant serotip 2 OspA fragman monomerlerinin, koruyucu kapasitesinin, Kene Testi Yöntemi vasitasi ile degerlendirilmesi (STZ, B. afzelii) Deneysel prosedür/er Lipitlenmis His etiketli mutant OspA fragman proteinlerinin klonlanmasi ve ekspresyonu OspA fragmanlari, OspA'dan (SEQ ID NO: 14) türetilmis bir lipidasyon sinyal sekansinin ve bunun ardindan, bir CKQN peptidinin (SEQ ID NO: 211), lipidasyon için bir N-terminali sisteini saglamak üzere dogrudan C ucunun sonuna eklenmesi ile degistirilmistir. Tüm mutant OspA fragmanlari, saflastirma amaçlari için C ucunun sonunda histidin etiketlidir. Gen fragmanlari, bir T7 promotörünün yani sira Kanamisin direnç kaseti içeren bir vektör olan pET28b(+) vektörüne (Novagen) klonlanmistir. Lipitlenmis monomerler, BL21 Star'M(DE3) hücrelerinde (Invitrogen) eksprese edilmis ve IPTG ile indüksiyondan sonra hücrelerin büyüme sicakligi, proteinlerin translasyon sonrasi islemlerinin etkinligini arttirmak için 37 °C'den 25 °C'ye düsürülmüstür. Hücreler, 4 saat sonra santrifüjleme ile toplanmis ve pelet, daha fazla islenmeden önce 12 aya kadar -70 °C'de saklanmistir.

Lipitlenmis His etiketli vahsi tip ve mutant OspA fragmani monomer proteinlerin saflastirilmasi Hücreler yüksek basinçli homojenizasyon ile mekanik olarak bozulmus ve Iipitlenmis His etiketli OspA fragmani monomer peptitleri, Iipit fazinda faz ayristirma ile deterjan olarak Triton X-114 kullanilarak zenginlestirilmistir. Ardindan, seyreltilmis deterjan fazi (20 ila 30 kat) bir Ni-sefaroz kolonuna (Ni Sepharose *M 6 Hizli Akis; GE Healthcare) uygulanmis ve lipitlenmis His-etiketli OspA fragmanlari Imidazol gradyani ( elüsyonu ile yürütülmüstür. Toplanan fraksiyonlar, ayrica bir jel filtrasyon kolonu (Superdex 200, GE Healthcare) üzerinde, bunu takiben bir tampon degisim kolonu (Sephadex G-25, GE Healthcare) ile saflastirilmistir. Lipitlenmis His-etiketli OspA fragmani pikleri, analitik boyut dislama kolonu ve ters fazli kromatografiye dayanarak toplanmistir. Steril filtrelemeden sonra, saflastirilmis proteinler formülasyona kadar -20 °C'de saklanmistir.

Farelerin Asilanmasi Üç Iipitlenmis mutant OspA proteini (Lîp-SZDl-His, Lip-SZDB-His ve Lip-SZD4-His), eksprese edilmis ve yukarida tarif edildigi gibi saflastirilmistir. Örnek 2'de tarif edildigi gibi sirasi ile negatif ve pozistif kontroller olarak tek basina AI(OH)3adjuvani ve Iipitlenmemis tam uzunlukta serotip 2 OspA kullanilarak in vivo koruma çalismalari gerçeklestirilmistir. Bütün immünojenler %3 ile formüle edilmistir. Farelere iki hafta araliklar ile üç kez, 3.0 ug, 1.0 ug ya da 0.3 ug'lik antijen içeren formülasyonlar deri altindan enjekte edilmis ve fareler, son asilamadan iki hafta sonra B. Afzelii ile enfekte edilmis kenelerle (lSl susu) test edilmistir. Kene testinden alti hafta sonra fareler feda edilmis ve enfeksiyon degerlendirilmistir.

Sonuçlar Keneyle test yönteminde koruma seviyeleri Üç lipitlenmis tüm mutant OspA fragmanlari, en düsük test edilen dozda bile B. afzelii testinde çok yüksek seviyede koruma saglamistir (Tablo 3). Tek basina AI(OH)3 adjuvani ile bagisiklik kazandirilmis farelerde enfeksiyon oranlari, kenelerin yüksek bir siklikla enfekte oldugunu göstermistir. Pozitif kontrol antijeni, B. afzelii' K78 susundan gelen tam uzunluktaki lipitlenmemis OspA da oldukça korucu olmustur. Bu kontrol gruplari birlikte, enfeksiyon yönteminin yüksek güvenilirligini gösterir ve böylece lipitlenmis mutant OspA fragmanlari ile asilamanin ardindan gözlemlenen sonuçlara yüksek güvenilirlik verir. Örnek 4. Igne veya Kene Testi Yöntemleri vasitasi ile in vivo Borrelia testine karsi bulusun mutant OspA heterodimerlerinin koruyucu kapasitesinin degerlendirilmesi Deneysel prosedürler Lipitlenmis His etiketli mutant OspA fragman heterodimerlerinin klonlanmasi ve ekspresyonu B. burgdorferi 5.5. 831 susu, B. afzelii K78 susu, B. garinii PBr susu, B. bavariensis PBI susu, B. garini'i PHEI susu ve B. garinii DK29 susundan gelen mutant OspA fragman monomerlerine, GenScript (ABD) ile E. co/iekpresyonu için kodon optimizasyonu yapilmistir. B. Burgdorferi afzeliiK78 susundan (SEQ ID NO: 18) gelen hLFA-l benzeri olmayan bir sekans olan NFTLEGKVAND ile degistirilmistir. Mutant OspA fragman heterodimerlerine eklenen lipidasyon sinyali sekansi, E. coli majör dis zar Iipoproteininden (Lpp) türetilmis ve dogrudan C-terminali takip edilmistir. Mutant OspA fragman heterodimerleri, yukarida tarif acid exchange of D gelen OspA'nin N-terminali yarisinin iki ayri kivrim bölgesinden kaynaklanan bir 21 amino asitli baglayici sekans vasitasi ile farkli bir OspA fragman monomerinin kaynastirilmasi ile üretilmistir. Heterodimerler saflastirma amaciyla bir His-etiketi ile olusturulmustur. Gen fragmanlari, bir T7 promotörünün yani sira Kanamisin direnç kaseti içeren bir vektör olan pET28b(+) vektörüne (Novagen) klonlanmistir. Stabilize edilmis heterodimerlerin lipoproteinleri Stabilizörler BL21 StarTM(DE3) hücrelerinde (Invitrogen) eksprese edilmis ve IPTG ile indüksiyondan sonra hücrelerin büyüme sicakligi, proteinlerin translasyon sonrasi islemlerinin etkinligini arttirmak için 37 °C'den 25 °C'ye düsürülmüstür. Hücreler, 4 saat sonra santrifüjleme ile toplanmis ve pelet, daha fazla islenmeden önce 12 aya kadar -70 °C'de saklanmistir.

Lipi'tlenmis His etiketli mutant OspA fragman heterodimerlerinin saflastirilmasi Hücreler yüksek basinçli homojenizasyon ile mekanik olarak bozulmus ve Iipitlenmis His etiketli mutant OspA fragmani heterodimerleri, lipit fazinda faz ayristirma ile deterjan olarak Triton X-114 kullanilarak zenginlestirilmistir. Ardindan, seyreltilmis deterjan fazi (20 ila 30 kat) bir Ni-sefaroz kolonuna (Ni Sepharose T” 6 Hizli Akis; GE Healthcare) uygulanmis ve lipitlenmis His-etiketli OspA heterodimerleri Imidazol gradyani ( elüsyonu ile yürütülmüstür. Toplanan fraksiyonlar, ayrica bir jel filtrasyon kolonu (Superdex 200, GE Healthcare) üzerinde, bunu takiben bir tampon degisim kolonu (Sephadex G-25, GE Healthcare) ile saflastirilmistir. Lipitlenmis His-etiketli mutant OspA heterodimer pikleri, analitik boyut dislama kolonu ve ters fazli kromatografiye dayanarak toplanmistir. Steril filtrelemeden sonra, saflastirilmis heterodimerler formülasyona kadar -20 r*C'de saklanmistir.

Lipitlenmis His etiketli olmayan mutant OspA fragman heterodimerlerinin klonlanmasi ve ekspresyonu Yukarida tarif edildigi gibi olusturulan yapilar, PCR amplifikasyonu ile bir durdurma kodonunun eklenmesiyle His-etiketi olmayan yapilarin üretimi için kullanilmistir. Gen fragmanlari, bir T7 promotörünün yani sira kanamisin direnç kaseti içeren bir vektör olan pET28b(+) vektörüne (Merck Millipore) klonlanmistir. Stabilize edilmis heterodimerlerin islemlerinin etkinligini arttirmak için 37 °C'den 25 °C'ye düsürülmüstür. Hücreler, 4 saat sonra santrifüjleme ile toplanmis ve pelet, daha fazla islenmeden önce 12 aya kadar -70 ”C'de saklanmistir.

Lipitlenmis His etiketli olmayan mutant OspA fragman heterodimerlerinin saflastirilmasi Hücreler yüksek basinçli homojenizasyon ile mekanik olarak bozulmus ve lipitlenmis mutant OspA fragmani heterodimerleri, Iipit fazinda faz ayristirma ile deterjan olarak Triton X-114 kullanilarak zenginlestirilmistir. Ardindan, seyreltilmis deterjan fazi, baglayici olmayan modda çalistirilan anyon degisim kromatografisine tabi tutulmustur. Elde edilen akis, bir hidroksiapatit kolonuna (Bio-Rad) yüklenmis ve Iipitlenmis proteinler, kolondan bir dogrusal tuz gradyani ile yürütülmüstür. Elüat, ayrica baglayici olmayan bir modda bir DEAE-Sefaroz kolonu (GE Healthcare) üzerinde saflastirmaya tabi tutulmus, ardindan tampon degisimi için jel filtrasyon kolonu (Superdex 200, GE Healthcare) eklenmistir. Lipitlenmis mutant OspA heterodimer pikleri, analitik boyut dislama kolonu ve SDS-PAGE'e dayanarak toplanmistir.

Steril filtrelemeden sonra, saflastirilmis heterodimerler formülasyona kadar -20 "C'de saklanmistir.

Farelerin Asilanmasi Tüm çalismalar için disi C3H/HeN fareleri (Janvier, Fransa) kullanilmistir. Her yüklemeden önce, 8 haftalik on fareden olusan gruplarin, yüz damari vasitasi ile kanlari alinmis ve bagisiklik öncesi serum hazirlanmis ve toplanmistir. Iki haftalik araliklarla her birine 100 uL'Iik üç deri alti (sc) asilama yapilmistir. Her doz, %O.15'Iik bir nihai konsantrasyonda alüminyum hidroksit (AI(OH)3) ile formüle edilen Tablo 4'te (doz) belirtilen immünojen miktarini içerir. Üçüncü asilamadan bir hafta sonra, yüz damarindan kari toplanmis ve hiper bagisiklik serumu hazirlanmistir. Her deneyde, tek basina AI(OH)3 ile bagisiklik kazandirilmis bir grup, negatif kontrol olarak dahil edilmistir. Tüm hayvan deneyleri Avusturya yasalarina (BGBl Nr. 501/1989) uygun olarak gerçeklestirilmis ve "Magistratsabteilung 58" tarafindan onaylanmistir.

Bagisiklik kazandirilmis farelere kene testi ve serum ve dokularin toplanmasi (burada ayrica ”Keneyle Test Yöntemi” olarak da ifade edilmektedir) Bagisiklik kazandirilmis fareleri B. Afzelii ile test etmek için her farenin sirtindaki tüyler Veet® Krem (Reckitt Benckiser) ile temizlenmis ve süper yapistirici ile cilde küçük bir hava alabilen kap yapistirilmistir (Pattex). Daha sonra, B. afzelii, lSl susu ile enfekte edilen bir ya da iki I.

Ricinus larvasi her fareye uygulanmis ve tutunmalarina ve fazlaca doyana ve ölene kadar kan alarak beslenmelerine izin verilmistir. Besleme durumu her bir kene için günlük olarak izlenmis ve sadece en az bir tam beslenmis kenenin toplandigi fareler son okumaya dahil edilmistir.

Son asilamadan iki hafta sonra, fareler seyreltilmis Borreli'a s.c. ile testi edilmistir. Yükleme dozlari susa baglidir; her bir susun virulansi (öldürücülügü) IDSÜ'nin belirlenmesine yönelik test deneyleri ile degerlendirilmistir.

Igne testi deneyleri için kullanilan dozlar IDso'nin 20 ila 50 kati arasinda degismistir.

Farelerin feda edilmesi ve materyalin toplanmasi Belirtilen Borrelici spp. ile igne testinden dört hafta sonra veya B. Afzelii ile kene testinden alti hafta sonra fareler servikal dislokasyon ile feda edilmistir. Orbital kanama ile kan alinmis ve son serumlar hazirlanmis ve enfeksiyon durumunu belirlemek üzere VIsE ELISA için kullanilmistir. Ek olarak, her fareden bir kulak toplanmis ve DNA ekstrakte edilmis ve Borrelia'nin belirlenmesi için kantitatif PCR'ye (qPCR) tabi tutulmustur. Son enfeksiyon okumasi iki farkli analize dayanmaktadir (VIsE ELISA ve recA 'yi hedefleyen qPCR).

VIsE 'nin Degismez Bölge 6'si (IR6) ile ELISA B. gariniiIP90 susunun sekansindan türetilen biyotinlenmis 25-mer peptidi (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) analiz için kullanilmistir (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. An immunodominant conserved region within the variable domain of VIsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. J Immunol. kaplanmistir. Plakalar gece boyunca 4 °C'de inkübe edilmistir. Peptit ile kaplandiktan sonra plakalar PBS/0.1T ile bir kez yikanmistir. Plakalar daha sonra PBS/0.1T ile tekrar yikanmadan önce kuyu basina bloke 1:800'Iük seyrelmede test edilmistir. Plakalar, PBS/0.1T ile üç kez yikanmadan önce oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilmistir. Her bir kuyucuk daha sonra PBS + %1 BSA içinde HRP'ye (Dako) konjuge edilmis 50 uL'Iik 1.3 ug/mL poliklonal tavsan anti-fare IgG'si almistir.

Plakalar daha sonra oda sicakliginda 1 saat inkübe edilmistir. PBS/0.1T ( (50 uL/kuyucuk) ile üç kez yikandiktan sonra, substrat olarak ABTS (50 uL/kuyucuk) (Sigma-Aldrich) ilave edilmis ve 30 dakika boyunca renk gelisimi için birakilmistir. Absorbans 405 nm'de ölçülmüstür.

Bütün serumlar iki kez test edilmistir. Negatif kontroller serumun yerine PBS ve bunun yani sira peptit ile kaplanmamis plakalar içermistir. B. afzeli'i enfeksiyonu açisindan pozitif kültür olarak gösterilen farelerden alinan serum, pozitif kontroller olarak kullanilmistir. recA 'yi hedefleyen qPCR Oligonükleotit primerleri, recA geni için, Lyme borreliosis'e neden olan tüm ilgili Borrelia türlerinin tanimlanmasi için qPCR'de kullanilabilecek sekilde tasarlanmistir (ileri: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, geri: CCCATTTCTCCATCTATCTC). recA fragmani, her bir reaksiyonda standart olarak kullanilmak üzere B. burgdorferi ss N40 susundan pET28b (+)'ye klonlanmistir. Fare kulaklarindan ekstrakte edilen kromozomal DNA, seyreltilmemis DNA ile gözlemlenen matris etkilerini azaltmak için su içinde 1: 8 oraninda seyreltilmistir. Her bir deney için 10 uL SSoAdvancedTM SYBR® Green Supermix, her bir primerden ve 7.4 uL su içeren bir ana karisim hazirlanmistir. On sekiz uL ana karisim, mikro-titre plakalarinda mesane veya kulaktan çikarilmis 2 piL seyreltilmis DNA ile karistirilmis ve DNA, bir CFX96 gerçek zamanli PCR saptama sistemi (Bio-Rad, ABD) kullanilarak çogaltilmistir. 50 çevrim ile denature edilmistir. Amplifikasyon sonrasi, DNA 95 °C'de 30 saniye, ardindan 55 °C'de 2 dakika boyunca denatürasyon ile erime egrisi analizi için hazirlanmistir. Erime egrisi analizi, çevrim basina 0.5 °C'Iik bir artis ile 55 °C'de 5 saniyelik ve 95 °C'de 5 saniyelik inkübasyon ile gerçeklestirilmistir. Her plakada, dört adet örneksiz kontrolün (NTC) yani sira ila 10.000 arasinda degisen örnek kopya numaralarina sahip olan çift halinde standart bir egri dahil edilmistir.

Sonuçlar Lipitlenmis mutant OspA fragmani heterodimerleri, on iki ayri deneyde koruyucu kapasite için test edilmistir. Fareler, üç deneyin her birinde B. burgdorferi' s.s., N40 susu, OspA serotipi 1 (STl, igne testi) ya da B. afzeli'ilSl susu, OspA serotipi 2 (STZ, kene testi) ile ya da iki deneyin her birinde B. bavariensis, Scf susu, OspA serotipi 4 (ST4, igne testi), B. gor/'nil', "A" susu, OspA serotipi 5 (STS, igne testi) ya da B. garini'i', “B" susu, OspA serotipi 6 (ST6, igne testi) ile test edilmistir. Tüm deneylerde, tek basina AI(OH)3 ile bagisiklik kazandirilmis bir grup fare, negatif kontrol olarak görev yapmistir. Keneler ile yükleme için fare basina 1-2 kene uygulanmis ve yalnizca, tamamen fazlaca doyana kadar beslenen en az bir kenenin alindigi fareler nihai okumaya dahil edilmistir. Bununla birlikte, bir ya da iki tam beslenmis kenenin toplandigi fareler arasinda bir ayrim yapilmamistir. On iki deneyden alinan koruma verileri Tablo 4'te özetlenmektedir.

Lipitlenmis His-etiketli OspA heterodimer (Lip-SlDl-SZDl-His), alti deneyin tümünde negatif kontrol grubu ile karsilastirildiginda hem OspA serotipi 1 ve OspA serotipi Z`ye karsi istatistiksel olarak anlamli, oldukça yüksek bir koruma (Fisher'in kesin testi, iki kuyruklu) göstermistir. Sasirtici bir sekilde, Lip-S4D1-S3D1-His ve Lip-SSDl-SGDl-His ile asilama da OspA serotipi 2 yüklemesine (Deneyler 4-6) karsi yüksek bir koruma kapasitesi saglamis, bu da mutant OspA fragmanlarinin diger serotipleri ile asilamanin çapraz koruyucu bir etkisinin olabilecegini göstermistir. Dahasi, Lip-S4Dl-S3Dl ile asilama, OspA serotipi 4 Borrelia (Denyler 7 ve 8) ile igne testine karsi istatistiksel olarak önemli bir koruma saglamistir. Son olarak, LipSSDI-SGDl-His ile asilama, hem OspA serotipi 5 (Deneyler 9 ve 10) hem de OspA serotipi 6 (Deneyler 11 ve 12) ile teste karsi koruma saglamistir. Her farenin enfeksiyöz durumu, recA qPCR ile kombinasyon halinde VIsE ELISA kullanilarak belirlenmistir.

En az bir yöntem pozitif sonuç verdiginde bir fare enfekte olarak kabul edilmistir.

Sonuç olarak, bulusun mutant OspA fragmani heterodimer polipeptitleri ile bagisiklik kazandirma, test edilen tüm Borrelia serotiplerine karsi koruma saglar ve ayrica, bazi durumlarda çapraz koruma saglayabilir.

Lipitlenmis His-etiketli OspA heterodimer (Lip-SlDl-SZDl-His), alti deneyin tümünde negatif kontrol grubu ile karsilastirildiginda hem OspA serotipi 1 ve OspA serotipi Z'ye karsi istatistiksel olarak anlamli, oldukça yüksek bir koruma (Fisher'in kesin testi, iki kuyruklu) göstermistir. Sasirtici bir sekilde, Lip-S4D1-S3D1-His ve Lip-SSDl-SGDl-His ile asilama da OspA serotipi 2 yüklemesine (Deneyler 4-6) karsi yüksek bir koruma kapasitesi saglamis, bu da mutant OspA fragmanlarinin diger serotipleri ile asilamanin çapraz koruyucu bir etkisinin olabilecegini göstermistir. Dahasi, Lip-S4Dl-S3D1 ile asilama, OspA serotipi 4 Borrelia (Denyler 7 ve 8) ile igne testine karsi istatistiksel olarak önemli bir koruma saglamistir. Son olarak, LipSSDl-S6D1-His ile asilama, hem OspA serotipi 5 (Deneyler 9 ve 10) hem de OspA serotipi 6 (Deneyler 11 ve 12) ile teste karsi koruma saglamistir. Her farenin enfeksiyöz durumu, recA qPCR ile kombinasyon halinde VIsE ELISA kullanilarak belirlenmistir.

En az bir yöntem pozitif sonuç verdiginde bir fare enfekte olarak kabul edilmistir.

Sonuç olarak, bulusun mutant OspA fragmani heterodimer polipeptitleri ile bagisiklik kazandirma, test edilen tüm Borrelia serotiplerine karsi koruma saglar ve ayrica, bazi durumlarda çapraz koruma saglayabilir. Örnek 5. Igne testi veya Kene Testi Yöntemleri vasitasi ile in vivo OspA serotipi 1 ve serotipi ZBorreIiatestine karsi, bulusun mutant OspA heterodimerlerinin 1:1:1'Iik bir kombinasyon asisinin koruyucu kapasitesinin degerlendirilmesi Deneysel prosedür/er Farelerin Asilanmasi Tüm çalismalar için disi C3H/HeN fareleri (Janvier, Fransa) kullanilmistir. Her yüklemeden önce, 8 haftalik on fareden olusan gruplarin, yüz damari vasitasi ile kanlari alinmis ve bagisiklik öncesi serum hazirlanmis ve toplanmistir. Iki haftalik araliklarla her birine 100 uL'Iik üç deri alti asilama yapilmistir. Fare gruplari, Lip-SlDl-SZDl, LipS4D1-S3D1 ve Lip-SSDl- 56D1'in her birinden 1 ug içeren kombinasyon asisi ile asilanmistir. Diger üç OspA tabanli antijen yükleme deneylerine dahil edilmistir: Lip-OspAl-His (tam uzunluklu serotip 1 OspA, Negatif (plasebo) kontrolü, tek basina AI(OH)3-adjuvanidir. Bütün antijenler, %O.15'lik nihai bir konsantrasyonda alüminyum hidroksit (AI(OH)3) ile PBS içinde formüle edilmistir. amino asidinden, serotip 1 OspA'nin 11-200 arasi amino asitlerinden olusan, serotip 2 OspA'nin C-terminali kismindan son 201-255 arasi amino asit ile kaynastirilmis bir OspA kimerasidir ve burada, serotip 1 OspA'nin (146-170) hLFA-l-benzeri sekansi bir serotip 2 OspA'dan gelen homolog sekans ile degistirilir. Serotip 2 OspA sekansini, vektördeki durdurma kodonunun önündeki klonlama bölgesinden (Xhol) dolayi eklenen iki amino asit takip eder. Üçüncü asilamadan bir hafta sonra, yüz damarindan kan toplanmis ve hiper bagisiklik serumu hazirlanmistir. Tüm hayvan deneyleri Avusturya yasalarina (BGBl Nr. 501/1989) uygun olarak gerçeklestirilmis ve "Magistratsabteilung 58" tarafindan onaylanmistir.

Son asilamadan iki hafta sonra, fareler seyreltilmis Borrelia spiroketal ile test edilmistir. Yükleme dozlari susa baglidir; her bir susun virulansi (öldürücülügü) lDso'nin belirlenmesine yönelik yükleme deneyleri ile degerlendirilmistir. Igne testi deneyleri için kullanilan dozlar IDso'nin 20 ila 50 kati arasinda degismistir. Igne ile yüklemeden dört hafta sonra, fareler feda edilmis ve enfeksiyon durumunu belirlemek üzere disari okuma yöntemleri için kan ve dokular toplanmistir.

Bagisiklik kazandirilmis farelere kene testi ve serum ve dokularin toplanmasi (burada ayrica ”Keneyle Test Yöntemi” olarak da ifade edilmektedir) Bagisiklik kazandirilmis fareleri B. Afzelii' ile test etmek için her farenin sirtindaki tüyler Veet® Krem (Reckitt Benckiser, Birlesik Krallik) ile temizlenmis ve süper yapistirici ile cilde küçük bir hava alabilen kap yapistirilmistir (Pattex, Almanya). Daha sonra, B. afzelii, ISl susu ile enfekte edilen bir ya da iki I. Ricinuslarvasi her fareye uygulanmis ve tutunmalarina ve fazlaca doyana ve ölene kadar kan alarak beslenmelerine izin verilmistir. Besleme durumu her bir kene için izlenmis ve sadece en az bir tam beslenmis kenenin toplandigi fareler son okumaya dahil edilmistir.

Sonuçlar His-etiketli olmayan, Iipitlenmis mutant OspA fragmani heterodimerleri, 1:1:1'Iik bir oranda birlestirilmis ve Borreli'a tehdidine karsi koruyucu kapasite bakimindan test edilmistir.

Bagisiklik kazandirilmis fareler, iki deneyin her birinde B. afzelii(ST2, lSl susu, kene testi) ile ya da B. burgdorferis.s. (STI, 257 susu, igne testi) ile teste edilmistir. Diger OspA tabanli antijenler, dört deneyin tümünde Lip-SlDl-SZDZ ve Deneyler 15 ve 16'da Lip-OspAl-His ve kazandirilmis bir grup fare, negatif kontrol olarak görev yapmistir. Keneler ile yükleme için fare basina 1-2 kene uygulanmis ve yalnizca, tamamen fazlaca doyana kadar beslenen en az bir kenenin alindigi fareler nihai okumaya dahil edilmistir. Bununla birlikte, bir ya da iki tam beslenmis kenenin toplandigi fareler arasinda bir ayrim yapilmamistir. Dört deneyden alinan koruma verileri Tablo 5'te özetlenmektedir. 1:1:1'Lik bir oranda üç Iipitlenmis mutant OspA fragmani heterodimeri içeren kombinasyon asisi, negatif kontrol grubuna kiyasla dört test deneyinin hepsinde istatistiksel olarak önemli bir koruma saglamistir. Her farenin enfeksiyöz durumu, recA qPCR ile kombinasyon halinde VlsE ELISA kullanilarak belirlenmistir. En az bir yöntem pozitif sonuç verdiginde bir fare enfekte olarak kabul edilmistir. Örnek 6: Mutant OspA fragmani heterodimerleri ile bagisiklik kazandirilmis farelerin serumlarindan antikorlarin Borrelia'nin hücre yüzeyine baglanmasi Deneysel prosedürler Farelerin Asilanmasi Tüm çalismalar için disi C3H/HeN fareleri kullanilmistir. Her testten önce, 8 haftalik yirmi fareden olusan gruplarin, yüz damari vasitasi ile kanlari alinmis ve bagisiklik öncesi serum hazirlanmis ve toplanmistir. Iki haftalik araliklarla her birine 100 uL'lik üç deri alti asilama yapilmistir. Her bir doz, ilgili proteinlerin her birinden 1 pg içerir: Lip-SlDl-SZDl, Lip-S4D1- 53D1 ve Lip-S5D1-SöDl (kombinasyon asisi) ya da 1 ug Iipitlenmis tam uzunlukta OspA proteini (belirtildigi gibi ST1-ST6) veya %0.15'Iik bir nihai konsantrasyonda alüminyum hidroksit ile desteklenmis tek basina 1 pg OspA heterodimer (belirtildigi gibi Lip-SlDl-SZDl, adjuvanidir. Üçüncü asilamadan bir hafta sonra, yüz damarindan kan toplanmis ve hiper bagisiklik serumu hazirlanmistir. Tüm hayvan deneyleri Avusturya yasalarina (BGBl Nr. 501/1989) uygun olarak gerçeklestirilmis ve "Magistratsabteilung 58" tarafindan onaylanmistir.

Borreli'a'ya baglanmayi degerlendirmek için akis sitometrisi Spiroketler (1x105), esit bir hacimde %4 paraformaldehit ile karistirilmis ve 96 kuyucuklu bir plakanin (Nunclon 96U, Nunc) içinde oda sicakliginda 2 saat süre ile inkübe edilmistir. Plaka, dakika boyunca 2,000 g'de santrifüjlenmis ve süpernatant atilmistir. Hücreler, %2 BSA (HBSS-B) içeren 150 pL HBSS ile yikanmis, yukaridaki gibi santrifüjlenmis ve süpernatant atilmistir. Fare serumlari, 35 dakika boyunca 56 "C'de inkübe edilerek isiyla inaktive edilmistir. Isiyla inaktive edilmis serumlar, HBSS-B içerisinde seyreltilmis ve Costar spin-X santrifüj tüpü filtreleri ( kullanilarak 3 dakika boyunca 4,000 g'de santrifüjlenerek steril olarak süzülmüstür. Spiroketler 100 uL serum içinde çözülmüs ve 45 dakika boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir. Plaka, 15 dakika boyunca 2,000 g'de santrifüjlenmis ve süpernatant atilmistir. Hücreler 150 pL HBSS-B ile bir kez yikanmis ve daha sonra 100 uL HBSS-B içinde çözünmüstür. Bir mikrolitre ikincil antikor (PE konjuge keçi anti- fare IgG, Beckman Coulter, ABD) hücrelere eklenmis ve oda sicakliginda, karanlikta 45 dakika süresince inkübe edilmistir. Spiroketler, 150 pL HBSS-B ile bir kez yikanmis ve daha sonra 25 uM SYTO-17 DNA boyasi içeren 200 pL HBSS içinde çözünmüs ve oda sicakliginda, karanlikta dakika süresince inkübe edilmistir. Boyanmis Spiroketler, 2000 g'de 5 dakika santrifüjlenerek pelet haline getirilmis ve ardindan, 200 pL HBSS içinde çözünmüstür. Etiketli Spiroketler, SYTO-17 pozitif durumlari için geçit verilen FC akis sitometrisi ile ölçülmüstür. Plasebo ile bagisiklik kazandirilmis gruptan alinan serumlarla elde edilen degerler, spesifik olmayan baglanmayi kontrol etmek için heterodimer ile bagisiklik kazandirilmis gruplardan alinan serumlardan gözlenen degerlerden çikartilmistir.

Sonuçlar Hiperimmün fare serumlarindaki antikorlarin baglanmasi, alti OspA serotipinin tamamini eksprese eden farkli Borreliae durumunda gözlemlenmis, bu da antijenlerin hepsine yanit olarak üretilen antikorlarin islevsel olarak aktif oldugunu ve dogal OspA'yi yerinde baglayabildigini göstermistir. Floresan yogunlugu, genis bir serum dilüsyonlari araligi boyunca lineerdir. OspA serotiplerinin çogu için, heterodimer ile üretilen serumlar ile gözlenen floresan yogunlugu, Iipitlenmis tam uzunlukta OspA ile üretilen serumlar ile görülen floresan yogunlugu ile karsilastirilabilir çikmistir. Örnek 7: Formülasyon Çalismalari Bulusun kombinasyon asisinin formülasyonu ile ilgili çalismalar stabiliteyi optimize etmek için gerçeklestirilmistir. Farkli tiplerde tamponlar ve stabilizatörler, alüminyum hidroksit ve antijen ile kombinasyon halinde çesitli konsantrasyonlarda test edilmistir. Üç heterodimerin SEKANSLAR SZDO-His: Borre/i'a afze/i'i susu K78'in 131-273 pozisyonlarindaki amino asitler, OspA serotipi 2, vahsi tip sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH).

ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSG EVT VALNDTN'l'I'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTI'OLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLDE LKNALKGLEHHHHHH SZDl-His: Borrelia afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 (182 ve 269 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTFÃENGTKLEYTEMKêbGTGKAKEVLkNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTN'l'l'OATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVOKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LQNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (182 ve 272 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNAQKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (244 ve 259 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTREN GTKLEYTEMKêbGTGKAKEVLkNFTLEGKVAND KVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTIQVQKYDSAGTNLEGTQVEIKTLDE LKNALKGLEH HHHHH içeren OspA serotipi 2 (141 ve 241 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTREQGTKLEYTEMKGDGTGKAKEVLKN FTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSG EVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTI'QLVFTKQQTlTVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (165 ve 265 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKGDGTGKAKEVLKNQTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTQDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (185 ve 272 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTQTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNAQKGLEHHHHHH SEO` ID NO: 8 içeren OspA serotipi 2 (199 ve 223 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT QALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTQTISVNSKKTTQLVFTKO DTlTVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (243 ve 262 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTQTVQKYDSAGTNLEGTAVEQKTLD ELKNALKGLEHHHHHH SZDQ-His: Borreli'a afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 9 içeren OspA serotipi 2 (184 ve 204 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGQVTLSKEIAKSGEVT VALNDQNTTQATKKTGAWDSKTSTLT|SVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (201 ve 214 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVT VAQNDTNTTQATKKTQAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (246 ve 259 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMK'SDGTGKAKEVL'KNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTQVEIKTLDE LKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (167 ve 178 amino asitleri), C-terminal His etiketi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKGDGTGKAKEVLKNFTQEGKVANDKVTQEVKEGTVTLSKEIAKSGEV TVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLD ELKNALKGLEHHHHHH Borre/i'a OspA Iipidasyon sinyali MKKYLLGIGLILALIA Borre/ia OspB lipidasyon sinyali MRLLIGFALALALIG MKATKLVLGAVILGSTLLAG B. Burgdorferis.s. susu BSl'den hLFA-l-benzeri sekans GYVLEGTLTAE B. afzelii' susu K78'den hLFA-l-benzeri olmayan sekans N FTLEG KVAN D B. afzelii' (sus K78; OspA serotip 2) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEM KVLVSKEKDKDG KYSLKATVDKIELKGTSDK DNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKT MTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVTVALNDT NTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKODTITVOKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK B. burgdorferi 5.5. (sus 831; OspA serotip 1) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDG KYDLIATVDKLELKGTSDK NNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKI IT RADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDS SAATKKTAAWNSGTSTLTlTVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEI KNALK SEQID NO: 21 B. garinii (sus PBr; OspA serotip 3) MKKYLLGIGLI LALIAC KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSD KSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKV VTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGElTVALN DT ETTPADKKTGEWKSDTSTLTlSKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEI KDLAELKAALK B. bavariensis (sus PBI; OspA serotip 4) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSD KSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEI FKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTIL RANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTI'LKVTEGTWLSKHIPNSGEITVELNDSNST QATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVElKTLDELKNALK B. garinii (sus PHei; OspA serotip 5) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGG MKVLVSKEKDKDG KYSLMATVEKLELKGTSD KN NGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLS KTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIV RANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGElTVALDDTDS SGN KKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK B. garinii (sus DK29; OspA serotip 6) MKKYLLGIGLILALIAC KONVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDK NNGSGTL EGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIV RANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGK'I'I'LKVTEGTWLSKNILKSGEITAALDDSDT TRATKKTG KWDSKTSTLTISVNSOKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVElTTLKELKNALK B. garini'i (sus T25; OspA serotip 7) MKKYLLGIGLI LALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDK NNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDG KTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVV TRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTL EGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNlSESGEITVELKDTE TTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKOLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK Ileri Primer Geri Primer SEQID NO: 28 Ileri Yuvalanmis Primer Geri Yuvalanmis Primer -mer peptidi MKKDDQIAAAMVLRG MAKDGQFALK SEQID NO: 31 Fare cathelin RLAG LLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE '-(d|dC)13-3' KLK peptidi B. afzelii (sus K78; serotip 2), OspA aa 126-273 FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAK SGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELKNALK B. afzelii (sus K78; serotip 2), OspA aa 131-273 ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTN'l'I'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKK'l'l'QLVFTKQDTlTVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE peptit baglayici peptit baglayici peptit baglayici peptit baglayici peptit baglayici peptit baglayici peptit baglayici SlD4-SZD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 1 ve 2'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri NFTLEGKVAND FN EKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSG KAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKN IS KS GEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEIKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKE VLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKE IAKSGEVTVALNDTN'TTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTOLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK Lip-SlD4-SZD4_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 1 ve 2'nin füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. colilpp Iipidasvon sinyali, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCT CTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACCACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGA Lip-SlD4-52D4_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 1 ve 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N- terminali Iipidasyonu, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGI KSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSK NISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEG SAVEITKLDElKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TlSVNSKKTI'OLVFTKQCTITVQKYDSAGTN LEGTAVElKTLDELKNALKGLEH HHHHH Lip-SlD4-SZD4_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 1 ve 2'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. coli Ipp Iipidasvon sinyali, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in SlDl-SZDl_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKS GEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKE VLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTl'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQDTlTVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK Lip-SlDl-SZD1_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve OspA serotipi 2'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' lpg lipidasyon sinyali, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri Lip-SlDl-SZDl_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N- terminali lipidasyonu, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTG|KSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQOYDSNGTKLEG SAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNAL KGLEHHHHHH Lip-SlDl-SZD1_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. coli' Ipp lipidasyon sinyali, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in SEQID NO:51 S3D4-S4D4_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve OspA serotipi 4'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGKLSEKVVTRACGfRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNIS KSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSOKPKOLVFTKECTITVONYNRAGNALEGSPA ElKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAK EVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKH IPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNIVFTKECTITVOKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK Lip-S3D4-S4D4_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve OspA serotipi 4'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpg Iipidasyon M, LN1 baglayici sekansi Lip-S3D4-S4D4_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotîpi 3 ve OspA serotîpi 4'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N-terminali lipidasyonu, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTL SKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALE GSPAElKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHlPNSGElTVELNDSNSTQATKKTG KWDSNTSTL TISVNSKKTKN IVFTKECTITVOKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-S3D4-S4D4_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotîpi 3 ve OspA serotîpi 4'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpp lipidasyon sinyali, $3D1-S4D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 3 ve 4'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNIS KSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPA ElKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAK EVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHlPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK Lip-S3D1-S4D1_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 3 ve 4'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli Igg Iigidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-S3D1-S4Dl_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 3 ve 4'ün heterodimer füzyon proteini, E. coli Ipp Iipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, N-terminali Iipidasyonu, LN1 baglayici sekansi C-terminali His etiketi LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTL SKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKP KQLVFTKENTITVQNYN RAG NALE GSPAEIKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADK'I'I'LKVTCGTVVLSKH IPNSG EITVELN DSNSTQATKKTG KWDSNTSTL TISVNSKKTKN IVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELC NALKGLEHH HHHH SEQID NO:58 Lip-S3Dl-S4D1_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 3 ve 4'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpp lipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi SSD4-SGD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 5 ve 6'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGEISEKTlVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKN ISKS GEITVALDDTDSSGNKKSG'IWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITT LKELKNALKGTSD KN NGSGSKEKN KDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDI KSDGSGKAKEVL KDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLS KN l LKSG EITAALDDS DTTRATKKTG KWDS KTST LTl SVNSQ KTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEI`I'I'LKELKNALK Lip-55D4-SöD4_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 5 ve 6'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpg lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-55D4-56D4_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 5 ve 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N- terminali Iipidasyonu, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTEGTVTLS KNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKOLVFTKECTITVONYDSAGTNLEGK AVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKN KDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNI LKSGEITAALDDSDTTRATKKTG KWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH Lip-SSD4-S6D4_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 5 ve 6'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpp lipidasyon sinyali, (GLEHHHHHH) AAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTAC GAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAAA ACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCA SEQID NO:63 $5D1-56D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGEISEKTlVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNlSKS GEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKOLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITI' LKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVL KDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK Lip-SSDl-SöDl_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpp Iipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-SSD1-56D1_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N-terminali LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTCGTVTLS KNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTlSKNRTKTKOLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNlLKSGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH Lip-SSDl-SGDl_HIs_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli Ipp Iipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi CAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCT GGAATACACCGACATCAAATCAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGC CAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAATCGTACG AAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAG GTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA CAACGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATA TACGGACATTAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGAWTTACGCTGGAA GGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCA AAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTA AACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGC SZD4-SlD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri NFTLEG KVAND FN EKGELSAKTMTRECGTKLEYTEM KSDGTGKAKEVLKN FTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKE lAK SGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKOCTl TVQKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKlITRACGTRLEYTG IKSDGSGKAKEV LKNFTLEG KVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTlTVNSK KTKDLVFTKECTITVQOYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK Lip-SZD4-51D4_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. colilgg ligidasyon M, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-1-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri Lip-SZD4-SlD4_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N-terminali lipidasyonu, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, C-terminali His etiketi LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLE GTAVEI KTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKI ITRACGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGLEHHHHHH Lip-SZD4-SlD4_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. colilpp Iipidasyon sinyali, olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCT 52D1-51D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, FN EKGELSAKTMTRE NGTKLEYTE M KSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKE IAK SGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVOKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKllTRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEV LKNFTLEG KVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELN DTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKENTITVOQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK Lip-52D1-51D1_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' IQQ Iigidasyon si_nya_li, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-1-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri Lip-SZD1-51D1_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKVTLEVKCGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTOLVFTKQDTlTVQKYDSAGTNLE GTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKENTlTVOQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGLEHHHHHH Lip-SZDl-SlD1_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. colilpp Iipidasvon sinyali, olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) l . 1,.” . ' . i i .

S4D4-53D4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi FNAKGELSEKTILRACGTRLEYTE[KSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKH lPNS GEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIK TLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKN DGSGKAKEV LKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGElTVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO:76 Lip-S4D4-53D4_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' I li idas on sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansii i 0 l t .« I ' l 4 .4 . A .' _ 4 i . I I Lip-S4D4-S3D4_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSK HIPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTN LEGN AVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT lSKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAElKDLAELKAALKGLEHHHHHH Lip-S4D4-SSD4_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpp lipidasvon sinyali, SEQID NO: 79 S4D1-S3D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTWLSKHIPNS GElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTlTVQKYDSAGTNLEGNAVElK TLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEV LKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNlSKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKOLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK Lip-S4D1-S3D1_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' Igp Iipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-S4D1-53D1_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNAKGELSEKTlLRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSK HIPNSGEITVELNDSNSTOATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKN lVFTKEDTlTVQKYDSAGTNLEGN AVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSG KAK EVLKGFALEGTLTDGG ETKLTVTCGTVTLSKN lSKSG E ITVALN DTETT PAD KKTG EW KS DTSTLT lSKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGLEHHHHHH Lip-S4D1-SSDl_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli Ipp Iipidasyon sinyali, $6D4-SSD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNlLK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEl TTLKELKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTlVRACGTRLEYTDIKSDKTG KAKEV LKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNlSKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 84 Lip-SGD4-SSD4_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpg ligîdasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi CCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAA Lip-56D4-55D4_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCSSFNGKG ETSEKTIVRACGTRLEYTD |KSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWL SKNlLKSGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLE GKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTG KAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKN RTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH Lîp-56D4-SSD4_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpp lipidasvon sinyali, $6D1-SSD1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKD FTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILK SGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEI TTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFN EKGEISEKTlVRANGTRLEYTDlKSDKTGKAKEV LKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVElTTLKELCNALK Lip-56D1-55D1_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' Igp lipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi CCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA Lip-56D1-55D1_His_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTN LE GKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKT GKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLS KNlSKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TISKN RTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTN LEGKAVEITTLKELCNALKG LEHHHHHH Lip-56D1-55D1_His_nt: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli Ipp lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi SlD4-52D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l- benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri FNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKS GEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEIKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFN EKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKE VLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKElAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQDTITVOKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELCNALK Lip-SlD4-52Dl_nt: Disülfit bagi tip 4 Içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. colilpp Iipidasvon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCT GCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACCGACAGCTCTGCGGC GTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCTCTGAAA GGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATAT ACGGAAATGAAAAGCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAG CGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAA Lip-SlD4-SZDl_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali lipidasyonu, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGI KSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVOQYDSNGTKLEG SAVElTKLDEIKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTN LEGTAVEIKTLDELCNALKGLEHHHHHH Lip-SlD4-SZDl_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, g coi'i Ipp lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip SlD1-52D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l- benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTL EGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKN lSKS GEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKE VLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTN'I'I'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQCTI TVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK Lip-SlDl-SZD4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. colilpp Iipidasvon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri Lip-SlD1-52D4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEG SAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TI SVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKG LEHHH HHH Lip-SlD1-52D4_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, â coli Ipp Iipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip SEQID NO: 99 $3D4-S4D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNlS KSGEHVALNDTETTPADKKRSBNKSDTSTLNSKNSQKPKQLVFTKECNTVQNYNRAGNALEGSPA BKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTkRANGTRLEYTEKSDGTGKAK EVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHlPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNlVFTKEDTITVOKYDSAGTNLEGNAVElKTLDELCNALK SEQID NO: 100 Lip-S3D4-S4D1_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli Ipp Iipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-S3D4-S4D1_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEI KN DGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTL SKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALE GSPAElKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHlPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKN IVFTKEDTlTVOKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGLEHHHHHH Lip-S3D4-S4Dl_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, Lab' lpg lipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) S3D1-S4D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3 ve dîsülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNIS KSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKE NTITVQNYNRAGNALEGSPA ElKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAK EVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKH lPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDS NTSTLTlSVN SKKTKNIVFTKECTITVOKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK Lip-53D1-54D4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpp Iipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi SEO` ID NO: 105 Lîp-S3D1-S4D4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LIpCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTElKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTL SKNlSKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYN RAG NALE GSPAEIKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKH lPNSGElTVELNDSNSTOATKKTGKWDSNTSTL TlSVNSKKTKN IVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-S3D1-S4D4_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpg Iigidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) SSD4-SGD1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGEISEKTlVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKN ISKS GEIWALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKN RTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITT LKELKNALKGTSD KN NGSGSKEKN KDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDI KSDGSGKAKEVL KDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKN ILKSGEITAALDDSDTTRATKKTG KWDS KTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVE ITTLKELCNALK Lip-SSD4-56D1_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli' Ipp Iipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-SSD4-56D1_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LIpCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTEGTVTLS KNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGK AVElTTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKN KDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH Lip-SSD4-S6Dl_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, M lpg Iipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) ACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAG 55D1-56D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKS GEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKN RTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITT LKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVL KD FTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKN l LKSG EITAALDDS DTTRATKKTGKWDS KTSTLTI SVNSQ KTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK Lip-SSDl-S6D4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6'nin orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coli lpp lipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-SSD1-56D4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu, C-terminali His etiketi LIpCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLS KNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITI'LKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNI LKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, Lo” lpg Iigidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) AAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTAC GAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAAA ACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCA CCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGG $2D4-SlD1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri FNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAK SGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIlTRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEV LKNFTLEG KVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELN DTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKENTITVOOYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK Lip-SZD4-SlD1_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, g coli'lpp lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri Lip-52D4-SlD1_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLE GTAVEI KTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIlTRADGTRLEYTGl KSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKENTlTVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGLEHHHHHH Lip-SZD4-SlDl_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. coli' lpg hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164- CAAGCTTCAACGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACT TGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTC AAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTFGCTCTGAACGATACGAATACCACGCAAGCG SEQID NO: 119 SZD1-SlD4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi, hLFA-1-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA 1'in 164-174 amino asitleri FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAK SGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKllTRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEV LKNFTLEG KVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSG EVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK Lip-SZDl-SlD4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, g coli Ipp Iipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri 7 `1.' .In . .i . 3,7 -, ',' `Mr' . -" 7' I .. -ivu't-'.-... ..i - - . _4 I .”I. i .si i.' Lip-SZDl-SlD4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali lipidasyonu, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVAN DKVTLEVKCGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLE GTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKG EVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDK'I'TLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVN SKKTKDLVFTKECTlTVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDl-SlD4_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. coli lpg lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164- S4D4-S3Dl_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNAKG E LSEKTILRACGTRLEYTE[KSDGTG KAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKH IPNS GEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIK TLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKN DGSGKAKEV LKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKN lSKSGElTVALNDTETTPAD KKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKOLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK SEQ ID NO: 124 Lip-S4D4-53D1_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, E. coIi' Ipp Iipidasvon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansiI I i ' i 'i v ' ' I 1 ~ Ata' °. ' ~ ' 2. .1 - - 4 Lip-S4D4-S3D1_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, N- terminali lipidasyonu, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCSSFNAKGELSEKTl LRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSK HIPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTN LEGN AVElKTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVI'RANGTRLEYTEIKNDGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKN l SKSGEITVALN DTETTPADKKTGEWKSDTSTLT SEQ ID NO: 126 Lip-S4D4-SSD1_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, Lo!] lpp lipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) S4D1-53D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNS GElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVElK TLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEV LKGFALEGTLTDG GETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALN DTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKOLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAE l KDLAELKAALK Lip-S4D1-S3D4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. co/i' Ipp Lip-S4D1-SSD4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSK HIPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTN LEGN AVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKN DGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGElTVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT lSKNSQKPKOLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGLEHHHHHH Lip-S4D1-SSD4_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpg Iipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C-terminali His etiketi (GLEHHHHHH) $6D4-SSD1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILK SGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEI TTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDG KYSFNEKGEISEKTlVRANGTRLEYTDIKSDKTG KAKEV LKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKEDTITVONYDSAGTNLEGKAVElTTLKELCNALK SEQ ID NO: 132 Lip-SGD4-SSD1_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, g coli Ipp Iipidasvon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi_ ----- _ l__ -___ _ __ ' 'o_v_ l iI._ -._›_ l_ ..1. I ,I _I I .7- V :4 l i i 4. i i ', . i ' v. i__. i i 4;› i . i . i i i Lip-56D4-SSD1_His_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LIpCSSFNGKG ETSEKTIVRACGTRLEYTD lKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVORYDSAGTNLE GKAVElTTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGElSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTG KAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH Lip-56D4-SSDl_His_nt: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpg lipidasyon sinyali, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH) $6D1-SSD4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, LN1 baglayici sekansi FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKD FTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILK SGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEI TTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFN EKGEISEKTIVRACGTRLEYTDlKSDKTGKAKEV LKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK Lip-56D1-55D4_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5'in orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, g coli lpp Iipidasyon sinyali, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi Lip-SSDl-SSD4_His_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu, C-terminali His etiketi LipCSSFNGKGETSEKTlVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKN ILKSGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTlTVQRYDSAGTNLE GKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKT GKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TISKNRTKTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTN LEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH Lip-SGDl-SSD4_His_nt: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini için kodlama sekansi, E. Coli lpg terminali His etiketi (GLEHHHHHH) Lip-SZDO-His: Borreli'a afzelii susu K78'in 131-273 pozisyonlarindaki amino asitler, OspA serotipi 2, vahsi tip sekansi, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C- terminali His etiketi (GLEHHHHHH).

LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKQDTITVOKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH LIp-SZDl-His: Borrelia afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 1 Içeren OspA serotîpi 2 (182 ve 2 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEl AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELQNALKGLEHHHHHH Lip-SZDZ-His: Borreli'a afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 2 içeren OspA serotîpi 2 (182 ve 272 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNAQKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (244 ve 259 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTIQVQKYDSAGTNLEGTQ VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (141 ve 241 amino asitleri), lipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTREQGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKQQTITVQ KYDSAGTN LEGTA VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDS-His: Borrelia afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 5 içeren OspA serotipi 2 (165 ve 265 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKQNELSAKTMTR ENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNQTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTN LEGTA VEIKTQDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDö-His: Borrelici afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 6 içeren OspA serotipi 2 (185 ve 272 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTQTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNAQKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (199 ve 223 amino asitleri), lipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEGKVAN'DKVTLEVKEGTVTLSKEi AKSGEVTQALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTQTlSVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lîp-SZDS-His: Borreli'a afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 8 içeren OspA serotipi 2 (243 ve 262 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKO NELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVAN-DKVTLEVKEGTVTLSKEl AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTOLVFTKQDTQTVQKYDSAGTNLEGT AVEQKTLDELKNALKGLEHHHHHH içeren OspA serotipi 2 (184 ve 204 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N-terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGQVTLSKEI AKSGEVTVALNDQNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDlO-His: Borrelia afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip içeren OspA serotipi 2 (201 ve 214 amino asitleri), Iipîtlerin eklenmesi için N- terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTVAQNDTNTTQATKKTQAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTlTVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDll-His: Borre/ia afzelii' susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 11 içeren OspA serotipi 2 (246 ve 259 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYD SAGTNLEGTQ VElKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDlZ-His: Borre/ia afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 12 içeren OspA serotipi 2 (167 ve 178 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CKQN, C-terminal His etiketi (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAK'I'MTRENGTKLEYTEMKSDGTGKÂKEVLKNFTQEGKVANEIKVTQEVKEG'I'VTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH Lip-SZDO: Borrelia afze/ii' susu K78'in 131-273 pozisyonlarindaki amino asitler, OspA serotipi 2, vahsi tip sekansi, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CKQN LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTOATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALK Lip-SZDl: Borreli'a afzeli'i susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 (182 ve 269 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELQNALK Lip-SZDZ: Borre/ia afze/ii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 2 içeren OspA serotipi 2 (182 ve 272 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKEl AKSG EV'TVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTOLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNAQK içeren OspA serotipi 2 (244 ve 259 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTIQVQKYDSAGTNLEGTQ VElKTLDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (141 ve 241 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKQNELSAKTMTREQGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKQQTITVQ KYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALK Lip-SZDS: Borre/i'a afze/ii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 5 içeren OspA serotipi 2 (165 ve 265 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNQTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTQDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (185 ve 272 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKONELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTQTLSKEI AKSG EVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVN SKKTTQLVFTKQ DTITVQ KY DSAGTN LEGTA VElKTLDELKNAQK SEO` ID NO: 160 içeren OspA serotipi 2 (199 ve 223 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELGAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTQALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTQTlSVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALK Lip-SZDS: Borreli'a afzelii susu K78'in 131-273 amino asitleri (aa), disülfit bagi tip 8 içeren OspA serotipi 2 (243 ve 269 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVN SKKTTOLVFTKQDTQTVQKYDSAGTNLEGT AVEQKTLDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (184 ve 204 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGQVTLSKEI AKSGEVTVALNDQNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (201 ve 214 amino asitleri), lipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTVAQNDTNTTQATKKTQAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (246 ve 259 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LIpCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSG EVTVALN DTN TTQATKKTGAW DS KTSTLTI SVNSKKTTQLVFTKQ DTITVQKYD SAGTN LEGTQ VElKTLDELKNALK içeren OspA serotipi 2 (167 ve 178 amino asitleri), Iipitlerin eklenmesi için N-terminali LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTQEGKVANDKVTQEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VElKTLDELKNALK SZDO: Borreli'a afze/ii susu K78'in 131-273 pozisyonlarindaki amino asitler, OspA serotipi 2, vahsi tip sekansi ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVT VALNDTN'I-I'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE OspA serotipi 2 (182 ve 269 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKElAKSGEVT VALNDTNTI'QATKKTGAWDSKTSTLTISVN SKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLDE OspA serotipi 2 (182 ve 272 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKQGTVTLSKElAKSGEVT VALNDTNTFQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLDE OspA serotipi 2 (244 ve 259 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTlQVQKYDSAGTNLEGTQVEIKTLDE OspA serotipi 2 (141 ve 241 amino asitleri) ELSAKiMTREQGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTI'OATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQQTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE SEQID NO: 171 OspA serotipi 2 (165 ve 265 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNQTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVN SKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTQDE SEQID NO: 172 OspA serotipi 2 (185 ve 272 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTQTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTOATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE SEQID NO: 173 OspA serotipi 2 (199 ve 223 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT QALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTQTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVOKYDSAGTNLEGTAVElKTLDE SEQID NO: 174 OspA serotipi 2 (243 ve 262 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEG KVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTOATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTO LVFTKQDTQTVQKYDSAGTN LEGTAVEQKTLD SEQID NO: 175 OspA serotipi 2 (184 ve 204 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGQVTLSKEIAKSGEVT VALNDQNTTOATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE içeren OspA serotipi 2 (201 ve 214 amino asitleri) ELSAK'I;MTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKElAKSGEVT VAQNDTNTTQATKKTQAWDSKTSTLTlSVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE içeren OspA serotipi 2 (246 ve 259 amino asitleri) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGWTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTI'QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQ DTlTVQKYDSAGTN LEGTQVEIKTLDE içeren OspA serotipi 2 (167 ve 17 amino asitleri) ELSAKTIMTRENGTKLEYTEMKSDGTG KAKEVLKN FTQEGKVANDKVTQEVKEGTVTLSKEIAKSGEV TVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTO LVFTKODTITVQ KYDSAGTN LEGTAVEl KTLD B. burgdorferi s.s. (sus B31, serotip 1), serotip 1 OspA'dan gelen hLFA-benzeri sekans ile degistirilmis OspA_aa 126-273 FNEKGEVSEKIlTRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKN IS KS GEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEl KNALK B. garini'i (sus PBr, serotip 3), OspA_aa 126-274 FNIDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNIS KSGElTVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTlSKNSQKP KQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPA EIKDLAELKAALK B.bavariensis (sus PBi, serotip 4), OspA_aa 126-273 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNS GEITVELNDSNSTOATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNlVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIK TLDELKNALK B. garini'i (sus PHei, serotip 5), OspA_aa 126-273 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKN ISKS GEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITT SEQID NO: 183 B. garinii (sus DK29, serotip 6), OspA_aa 126-274 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVN SOKTKNLVFTKEDTITVORYDSAGTNLEGKAVEI TTLKELKNALK SEQID NO: 184 degisimi) OspA'nin N-terminali yarisina ait iki ayri döngü bölgesinden yapilandirilan LN1 peptit baglayici GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS SEQID NO: 185 Lip-SlD4-SZD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 1 ve 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, LipCSSFNEKGEVSEKlITRACGTRLEYTGlKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSK NISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVOQYDSNGTKLEG SAVEITKLDElKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDG KYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TlSVNSKK'l'I'QLVFTKOCTlTVQKYDSAGTNLEGTAVElKTLD ELKNALK Lip-SlDl-SZDl_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGlKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTIWQQYDSNGTKLEG SAVElTKLDElCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK Lip-S3D4-S4D4_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu LIpCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTL SKNISKSGElTVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALE GSPAElKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTG KWDSNTSTL TlSVNSKKTKN IVFTKECTITVOKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK Lip-S3D1-S4D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 Içeren OspA serotipleri 3 ve 4'ün heterodimer füzyon proteini, lipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTElKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETK LTVTCGTVTL SKNlSKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKP KQLVFTKENTITVQNYN RAG NALE GSPAElKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKH lPNSGElTVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TlSVNSKKTKN lVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK Lip-SSD4-SGD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 5 ve 6'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LIpCSSFNEKGElSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTEGTVTLS KNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKN KDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKN I LKSGElTAALDDSDTTRATKKTG KWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK Lip-55D1-5601_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTCGTVTLS KNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGT'WDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNlLKSGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK Lip-SZD4-SlD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVAN DKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLE GTAVEl KTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKI ITRACGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVN SKKTKDLVFTKECTITVQOYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK Lip-SZD1-51D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 2 ve 1'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKL EYTEMKSDGTG KAKEVLKNFTLEGKVAN DKVTLEVKCGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTlTVQKYDSAGTNLE GTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIlTRADGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVN SKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVElTKLDEICNALK Lip-S4D4-SSD4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LIpCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSK HIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTG KWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTN LEGN AVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGElTVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT lSKNSOKPKOLVFTKECTlTVONYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK Lip-S4D1-S3D1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 4 ve 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNAKGELSEKTI LRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSK HIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNlVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGN AVElKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTElKNDGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKN lSKSGElTVALN DTETTPADKKTG EWKSDTSTLT lSKNSQKPKQLVFTKENTlTVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK Lip-56D4-55D4_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LIpCSSFNGKG ETSEKTlVRACGTRLEYTD lKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWL SKNlLKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLE GKAVElTTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTG KAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKN RTKTKOLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQID NO: 196 Lip-SöDl-SSD1_aa: Her ikisi de disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipleri 6 ve 5'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu EIpCSSFNGKGETSEKTlVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSOKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTN LE GKAVElTTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKT GKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TlSKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTN LEGKAVElTTLKELCNALK Lip-SlD4-52D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGl KSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEG SAVEITKLDEIKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKElAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL Tl SVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTN LEGTAVEl KTLDELCNALK Lip-SlDl-SZD4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-1-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGlKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSK NlSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEG SAVElTKLDElCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGT GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TlSVNSKKTTOLVFTKQCTITVOKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK Lip-S3D4-S4D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTR LEYTEI K N DGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETK LTVTEGTVTL SKN|SKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALE GSPAElKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHlPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKN IVFTKEDTlTVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK Lip-S3D1-S4D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTElKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTL SKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKP KQLVFTKENTITVQNYN RAG NALE GSPAEIKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGT GKAKEVLKDFALEGTLAADK'I'TLKVTEGTVVLSKH IPNSGEITVELN DSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKN IVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK Lip-SSD4-56D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LipCSSFNEKGElSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTEGTVTLS KNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTL KVTCGTVVLSKNILKSGE ITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAV EITTLKELCNALK Lip-SSDl-SGD4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6'nin heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali lipidasyonu LIpCSSFNEKGElSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADG KTTLKVTCGTVTLS KNISKSGElTVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGK AVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKN l LKSGEITAALDDSDTTRATKKTG KWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQID NO: 203 Lip-SZD4-SlD1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 1'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu LIpCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKL EYTEMKSDGTG KAKEVLKN FTLEGKVAN DKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSG EVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKOCTITVQKYDSAGTNLE GTAVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGI KSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKN lSKSG EVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKENTITVOQYDSNGTKLEGSAVElTKLDElCNALK Lip-SZD1-51D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 2 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, hLFA-l-benzeri olmayan sekans NFTLEGKVAND ile degistirilmis OspA serotip 1'in 164-174 amino asitleri, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKL EYTEMKSDGTGKAKEVLKN FTLEGKVAN DKVTLEVKCGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLE GTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKG EVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVN SKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK Lip-S4D4-53D1_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 3'ün heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu LIpCSSFNAKGELSEKTl LRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSK HIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNlVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGN AVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSG KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKN ISKSG EITVALN DTETTPADKKTGEWKSDTSTLT Lip-S4D1-53D4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 4 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 3'ün orta ve son heterodimer füzyon proteinleri için kodlama sekansi, Iipitlerin eklenmesi için N-terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali LIpCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSK HIPNSGElTVELNDSNSTOATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTN LEGN AVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKWTRACGTRLEYTElKN DGSG KAK EVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALN DTETTPAD KKTGEWKSDTSTLT lSKNSQKPKOLVFTKECTlTVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK Lip-56D4-55Dl_aa: Disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu LipCSSFNGKG ETSEKTIVRACGTRLEYTD lKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWL SKNlLKSGElTAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLE GKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGElSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTG KAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGElTVALD DTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKN RTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK Lip-S601-SSD4_aa: Disülfit bagi tip 1 içeren OspA serotipi 6 ve disülfit bagi tip 4 içeren OspA serotipi 5'in heterodimer füzyon proteini, Iipitlerin eklenmesi için N- terminali CSS, LN1 baglayici sekansi, N-terminali Iipidasyonu LIpCSSFNGKGETSEKTlVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLE GKAVElTTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGElSEKTlVRACGTRLEYTDIKSDKT GKAKEVLKDFTLEGTLAADGK'l'l'LKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TlSKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTN LEGKAVEITTLKELKNALK B. afzeli'i (sus K78; OspA serotip 2) aa 17-273, Iipidasyon sinyali sekansi çikartildi (aa CKQNVSSLDEKNSÄSVDLPGEMKVLVGKEKDKDGKYSLKATVDKlELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDK SKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMK SDGTGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAW DS KTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEH HHHHH B. burgdorferi (OspA serotip 1, sus ZS7) aa 17-273, Iipidasyon sinyali sekansi çikartildi CSSFKQNVSSLDEKN SVSVDLPGEMKVLVSKEKN KDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVK ADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKI ITRADGTRLEYTGI KSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLWKEGTVTLSKN lSKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNS GTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQOYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKLEHHHHHH Kimerik OspA Serotipl/SerotipZ, N-terminali Iipidasyonu LipCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKTNK SKVKLTISDD LGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKG EVSE KI lTMADGTRLEYTGIKS DGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSMNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSK TSTLTISVNSKKTTQLVFTKODTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKLE SEQID NO: 213 B. garinii susu T25'in126-274 konumlarindaki amino asitler, OspA serotip 7 FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTL'T'ADGETKLTVEAGTVTLSKNISE SGElTVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTlTVQKYNTAGTKLEGSPAEI Borre/i'a'ya ait RecA geni Için ileri oligonükleotid primeri SEQID NO: 215 Histidin etiketi SEQID NO: 216 BoneüdyaaüRecAgemigngeHoHgonüHeoüdpnnmn 4 _5.03 &5% ..Lv

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir polipeptit olup, özelligi; SEQ ID NO: 186'nin amino asit sekansina sahip polipeptidi; - SEQ ID NO: 186'nin sekansi ile en az %80, daha çok tercihen en az %85, daha da çok tercihen en az %90, en çok tercihen en az %95'Iik bir sekans özdesligine sahip olan ve - islevsel varyant ve plasebo (negatif) kontrol arasinda, koruyucu kapasitede (Apc) en az %50, özellikle en az %60, tercihen en az %70, daha çok tercihen en az %80, daha da çok tercihen %90, daha da çok tercihen %95, en çok tercihen en az %95'lik bir farka sahip olan, bahsedilen amino asit sekansinin herhangi bir islevsel varyantini içermesidir. istem 1'e göre polipeptit olup, özelligi; Lip-SlDl-SZDl'den (SEQ ID NO: 186) meydana gelmesidir. Bir nükleik asit olup, özelligi; istem 1 veya 2'ye göre olan polipeptidi kodlamasidir. Bir vektör olup, özelligi; istem 3'e göre nükleik asit molekülünü içermesidir. Istem 3'ün nükleik asidini veya istem 4'te tanimlanan gibi vektörü içeren bir konakçi hücre olup, özelligi; bahsedilen konakçi hücrenin tercihen E. Coli olmasidir. Istem 1 veya Z'ye göre olan polipeptidi eksprese eden bir hücreyi üretmeye yönelik bir proses olup, özelligi; uygun bir konakçi hücrenin, istem 4'e göre olan vektör ile dönüstürülmesini ve transfekte edilmesini içermesidir. Istem 1 veya Z'ye göre olan polipeptidi üretmeye yönelik bir yöntem olup, özelligi; asagidaki adimlar ile karakterize edilmesidir: a) istem 1 veya 2'ye göre olan polipeptidi kodlayan bir vektörün, bir konakçi hücresine sokulmasi, b) söz konusu polipeptidin ekspresyonuna olanak taniyan kosullar altinda konakçi hücrenin yetistirilmesi, c) bahsedilen konakçi hücrenin homojenlestirilmesi ve d) konakçi hücre homojenatinin saflastirma adimlarina tabi tutulmasi. Bir farmasötik bilesim olup, özelligi; istem 1 veya 2'ye göre bir polipeptit ve/veya istem 3'e göre bir nükleik asit ve istege bagli olarak, farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksîpiyan içermesidir. Istem 8'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi; farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanin, L-metiyonin içermesidir. Istem 8 veya 9'a göre farmasötik bilesim olup, özelligi; ayrica, Lyme borelyoza neden olan bir Borreli'a türünden türetilen en az bir ilave antijen içermesidir. Istemler 8 ila 10'dan herhangi birine göre farmasötik bilesim olup, özelligi; ayrica, en az bir Ilave antijen içermesi, bu ilave antijenin bir kene kaynakli patojenden gelmesi, bu kene kaynakli patojenin, Borreli'a hermsii', Borre/ia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia helvetica, Rickettsia parkeri', Francisella tu/arensis, Anap/asma phagocytophilum, Ehrli'chi'a sennetsu, Ehr/ichi'a chaffeensis, Coxiella burneti'i and Borre/ia /0nestari', Kene kaynakli ensefalit virüsü (TBEV), Kolorado kene atesi virüsü (CTFV), Kirim- Kongo kanamali atesi virüsü (CCHFV), Kyasanur orman hastaligi virüsü (KFDV), Powassan virüsü, Heartland virüsü, Omsk hemorajik ates virüsü (OHFV) ve Babesia spp.'yi içeren gruptan seçilmesidir. Istemler 8 ila 11'den herhangi birine göre farmasötik bilesim olup, özelligi; ayrica, tercihen polikatyonik polimerlerden, özellikle polikatyonik peptitlerden, immünostimülatör oligodeoksinükleotitlerden (ODN'ler), özel olarak da 0ligo(dIdC)13'den (SEQ ID NO: 32), en az iki LysLeuLys motifi içeren peptitlerden, özellikle peptit KLKLLLLLKLK'den (SEQ ID NO: 33), nöroaktif bilesiklerden, özellikle insan büyüme hormonundan, alüminyum hidroksit veya alüminyum fosfattan, Freund`un tam veya tamamlanmamis adjuvanlarindan ya da bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir immünostimülatör madde içermesidir. Istemler 8 ila 12'den herhangi birinin farmasötik bilesimi olup, özelligi; bahsedilen farmasötik bilesimin bir asi olmasidir. Istem 1 veya 2'ye göre polipeptit ya da istem 8 ila 13'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim olup, özelligi; bir ilaç olarak, özellikle bir asi olarak kullanim için olmasidir. Istem 1 veya 2'ye göre polipeptit veya istem 8 ila 13'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim olup, özelligi; bir Borreli'a enfeksiyonunun, özellikle bir B. burgdorferi's.s., B. garinii, B. afzeiii', B. andersoni, B. bavariensis, B. bissetti'i, B. valaisi'ana, B. lusitaniae, B. Spielmanii, B. japonica, B. tanukii', B. turdior B. sinica enfeksiyonunun, tercihen bir B. burgdorferis.s., B. afze/ii veya B. Garinii enfeksiyonunun tedavi edilmesine ya da önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanim için olmasidir.