CN106103469B - 突变型葡萄球菌抗原 - Google Patents

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Abstract

提供了对于人IgG的Fcγ部分具有降低的亲和力的突变型SpA。用EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、Hla和所述突变型SpA进行免疫在金黄色葡萄球菌感染的肾脓肿模型中提供了惊人的结果。

Description

突变型葡萄球菌抗原
本申请要求欧洲专利申请14161861.1(2014年3月26日提交)和14192913.3(2014年11月12日提交)(这两者的全部内容为了所有目的通过引用并入本文)的权益。
技术领域
本发明涉及针对金黄色葡萄球菌的感染的免疫。
背景技术
金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球菌。其每年在美国的死亡率超过任何其它感染性疾病(包括HIV/AIDS)的死亡率，并且金黄色葡萄球菌是血液、下呼吸道、皮肤和软组织感染的主要原因。它也是全世界骨感染的主要病因，并且这些感染是痛苦的，使人衰弱的且难以治疗。
由于金黄色葡萄球菌的许多菌株产生抗生素耐药性，金黄色葡萄球菌的治疗变得越来越有挑战性。在所有社区和医院感染中，有超过一半发现甲氧西林耐受的金黄色葡萄球菌(MRSA)。近几年已经看到对万古霉素(最后手段的抗生素)也耐受且基本上无法治疗的MRSA菌株的出现。
目前尚无授权的疫苗。在III期临床试验中，当与安慰剂组相比时，基于来自5型和8型细菌的表面多糖的混合物的 疫苗StaphVAX™无法减少感染。类似地，基于IsdB抗原[2]的V710疫苗[1]未能降低手术后金黄色葡萄球菌感染的比率[3]。
对于疫苗的需求特别急切，这是由于抗生素耐药性的问题和金黄色葡萄球菌感染由于其良好发展的免疫逃逸能力而不提供免于未来感染的免疫力的事实。金黄色葡萄球菌的免疫逃逸特性进而使得有效疫苗的开发更困难。免疫逃逸的机制没有得到完全理解，但至少部分是由于葡萄球菌蛋白A (SpA)，一种金黄色葡萄球菌表面分子，其结合免疫球蛋白(Ig)的Fc和VH3-B型细胞受体的Fab部分。SpA与B细胞受体的相互作用导致B细胞群体的克隆扩增和随后细胞死亡，导致适应性免疫应答的废除。SpA与Ig Fc的结合干扰多形核白细胞对葡萄球菌的调理吞噬性清除。
已经开发了对于免疫球蛋白具有降低亲和力的SpA的突变体形式。WO2011/005341描述了在五个Ig-结合结构域的每个中具有点突变的SpA，所述点突变降低所述蛋白结合IgG的能力。
参考文献4公开了各种方法来提供改进的金黄色葡萄球菌疫苗，包括被称为“Combo-1”和“Combo-2”的两种优选的免疫原组合。“Combo-1”包括五种抗原EsxA、EsxB、突变型Hla、FhuD2和Sta011，而“Combo-2”使用IsdA的片段代替突变型Hla。这两个组合均用氢氧化铝佐剂进行测试，并且当与单独的缓冲剂或与IsdB抗原相比时，它们增加了感染的小鼠模型中的中值存活时间。也已经用氢氧化铝佐剂和TLR7激动剂测试了“Combo-1”，并且TLR7激动剂的添加改善了应答[5]。
尽管“Combo-1”和“Combo-2”具有阳性结果，但仍然需要用于针对金黄色葡萄球菌免疫的另外的改进的组合物。
发明公开内容
蛋白A (SpA) (SEQ ID NO:43)，金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定的表面蛋白，提供了细菌逃逸固有和适应性免疫应答。蛋白A在免疫球蛋白的Fc部分处结合它们，与B细胞受体的VH3结构域相互作用，不适当地刺激B细胞增殖和凋亡，结合von Willebrand因子Al结构域以活化细胞内凝血，并且也结合TNF受体-1以有助于葡萄球菌性肺炎的发病机制。由于蛋白A捕获免疫球蛋白且展现毒性属性的事实，还没有严格探求该表面分子可以在人中作为疫苗发挥功能的可能性。此处，本发明人证实，蛋白A变体不再能够结合免疫球蛋白(其由此去除其产毒素潜力，即，是非产毒素的)，刺激保护免于葡萄球菌疾病的体液免疫应答。
因此，本发明提供了如下所述的突变型SpA抗原。所述突变体优选相对于未修饰的SpA对于人IgG的Fcγ部分具有降低的亲和力。相对于未修饰的SpA，所述突变体还可以对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力。
本发明人已经发现，已知的“Combo-1”疫苗可以通过添加突变型葡萄球菌蛋白A(SpA)而改进，所述突变型葡萄球菌蛋白A (SpA)已经被修饰以降低其对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的B细胞受体的Fab部分的亲和力。该额外抗原增加了所述组合的保护效力，并且在肾脓肿模型中提供了惊人的结果。参考文献4中测试的抗原组合无一包括SpA抗原。
因此，本发明还提供了包含EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla抗原的免疫原性组合物，其特征在于所述组合物还包含突变型SpA抗原，其中相对于未修饰的SpA，所述突变体对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力。
本发明还提供了免疫原性组合物，其包含：(i)至少一种选自EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla抗原的抗原；和(ii)相对于未修饰的SpA，对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力的突变型SpA抗原。因此，EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla中的1、2、3、4种或优选所有5种可以与突变型SpA组合使用。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与相关领域中的技术人员通常理解的具有相同的含义。
为了方便起见，提供了本说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语和短语的含义。
金黄色葡萄球菌抗原
本发明尤其涉及突变型SpA抗原。野生型SpA(葡萄球菌蛋白A)是细胞壁锚定的表面蛋白，其为对于肺感染、败血病和脓肿发展关键的毒力因子，并且由大多数临床金黄色葡萄球菌分离株表达。野生型SpA结合人IgG的Fc部分、含有VH3的B细胞受体、von Willebrand因子(在其A1结构域处)和TNF-α受体1。SpA与B细胞受体的相互作用导致对适应性和固有性免疫应答具有作用的B细胞群体的克隆扩增和随后细胞死亡，而其与IgG的Fcγ的结合干扰多形核白细胞对葡萄球菌的调理吞噬清除。成熟Spa的N-末端部分由四个或五个56-61残基Ig-结合结构域构成，其折叠成通过短接头连接的三个螺旋束，并且依次被指定为E、D、A、B和C[6]。这些结构域在氨基酸水平展现~80%同一性，长度为56至61个残基，并且被组织为串联重复[7]。C-末端区域由“XR”(高度重复、但可变的八肽)和“XC”(邻接SpA的细胞壁锚结构的结构域)构成。
在NCTC 8325菌株中，spa是SAOUHSC_00069，且具有氨基酸序列SEQ ID NO:43(GI:88193885)。在Newman菌株中，它是nwmn_0055 (GI:151220267)。本发明使用的SpA抗原可引发识别SEQ ID NO: 43的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:43具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:43的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Spa抗原包括SEQ ID NO:43的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:43的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ ID NO:43的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:43的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:43的至少一个表位。可以有用地省略SEQ ID NO:43的最后35个C-末端氨基酸。可以有用地省略SEQ ID NO:43的前36个N-末端氨基酸。参考文献8提示单个IgG-结合结构域可能是单独或组合有用的免疫原。
SEQ ID NO:43的有用片段是氨基酸37至325。该片段含有所有五个SpA Ig-结合结构域(从N-至C-末端以顺序E、D、A、B、C天然排列)，且包括SpA的最暴露的结构域。它还降低抗原与人蛋白的相似性。其它有用的片段可以省略天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个以防止过度B细胞扩增和随后的凋亡，如果spa作为B细胞超抗原发挥作用，则可能发生该情况。如参考文献18中所报道，其它有用的片段可以仅包括天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个，例如仅包含SpA(A)结构域，但不包含B至E，或仅包含SpA(D)结构域，但不包含A、B、C或E等。因此，可用于本发明的spa抗原可以包括1、2、3、4或5个IgG-结合结构域，但理想地具有4个或更少个。
因此，SpA的另一种有用片段包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列(其中位置60和61的氨基酸双体不是Gln-Gln)或由其组成。所述双体可以如下所述突变，例如，突变为Lys-Arg。因此，所述片段可以包含SEQ ID NO:51或52或由其组成。
如果抗原包含仅一种类型的spa结构域(例如仅Spa(A)、SpA(D)或Spa(E)结构域)，则它可在单一多肽链中包含多于一个拷贝的该结构域，例如多个SpA(E)结构域。它也可以包含一种类型的SpA结构域和另一种蛋白或多肽。因此，本发明的抗原可以是融合蛋白，其包含仅一种类型的SpA结构域，诸如SpA(E)结构域，和另一种蛋白抗原，诸如EsxA；EsxB；FhuD2；Sta011；和Hla。
本发明的SpA抗原相对于SEQ ID NO:43是突变的，使得它们对于人IgG的Fcγ部分具有降低的亲和力。例如，可以突变SEQ ID NO:43的残基60-61处的QQ二肽以降低对于免疫球蛋白的亲和力。下面讨论了对于QQ二肽有用的二肽置换，并且优选的置换是KR二肽。因此，有用的SpA抗原可以包含SEQ ID NO:49，其中11个XX二肽中的一个或多个(优选所有)与SEQ ID NO:43内的相应二肽不同。例如，所述SpA抗原可以包含SEQ ID NO:46，并且SEQ IDNO:46的优选实例为SEQ ID NO:47。当用N-末端甲硫氨酸表达时，包含SEQ ID NO:47的SpA抗原可以由SEQ ID NO:48组成。
本发明使用的SpA抗原可以相对于SEQ ID NO:43进一步突变，使得它们对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力。这可以通过例如遵循参考文献9中的指导实现和评价。因此，野生型SpA中的至少一个Gln-Gln二肽可以被突变(例如，突变为Lys-Lys；其它可能的突变包括Arg-Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Ala-Ala、Ser-Ser、Ser-Thr、Thr-Thr等)和/或野生型SpA中的至少一个Asp-Asp二肽可以被突变(例如，突变为Ala-Ala；其它可能的突变包括Lys-Lys、Arg-Arg、Lys-Arg、Arg-Lys、His-His、Val-Val等)。这些用于突变的目标序列在下面以下划线标注，其中破折号分开五个Ig-结合结构域：
Figure 267134DEST_PATH_IMAGE001
抗原内的单个结构域可以相对于SEQ ID NO:43在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸处突变(例如，关于Gln-Gln和Asp-Asp序列，参见上面，还参见参考文献错误！书签未定义，其公开了在结构域D的残基3和/或24、在结构域A的残基46和/或53等处的突变)。此类突变不应当去除抗原引发识别SEQ ID NO:43的抗体的能力，但将去除抗原结合IgG和/或其它人蛋白(诸如人血蛋白)的能力，如上所示。具体地，突变型SpA抗原具有包含在SEQ IDNO:43的位置43、44、70、71、104、105、131、132、162、163、190、191、220、221、247、248、278、279、305和/或306处的至少1个、更具体地至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19且甚至更具体地20个氨基酸中突变的SEQ ID NO:43或由其组成的序列。上面提及用于这些位置的有用置换。
此外，可以去除天然N-末端，并且可以有用地省略SEQ ID NO:43的头36个氨基酸。类似地，可以去除天然C-末端，并且可以有用地省略第五个Ig-结合结构域的下游的序列(即，SEQ ID NO:43中的Lys-327的下游)。因此，有用的SpA抗原包含SEQ ID NO:44：
Figure 243180DEST_PATH_IMAGE002
其中10个加下划线的XX二肽与SEQ ID NO:43内的相应二肽不同。因此，SEQ IDNO:43中在这些位置处的QQ将不是SEQ ID NO:44中的QQ，并且理想地不包含谷氨酰胺残基，例如它是KK。类似地，SEQ ID NO:43中在这些位置处的DD将不是SEQ ID NO:44中的DD，并且理想地不包含天冬氨酸残基，例如它是AA。用于与本发明使用的SpA的优选形式因此包含SEQ ID NO:45。
除了SEQ ID NO:44中在XX二肽处的置换以外，可能用最多达5个单一氨基变化修饰氨基酸序列，条件是修饰的序列可以引发仍然结合由SEQ ID NO:44组成的多肽的抗体。因此，可以通过在SEQ ID NO:44内的XX二肽之外的位置处的1、2或3个置换来修饰SEQ IDNO:45。例如，可以突变SEQ ID NO:44的残基60-61处的QQ二肽以进一步降低对于免疫球蛋白的亲和力。上面讨论对于QQ二肽有用的二肽置换，并且优选的置换是KR二肽。因此，有用的SpA抗原可以包含SEQ ID NO:49，其中11个XX二肽中的一个或多个(优选所有)与SEQ IDNO:43内的相应二肽不同。例如，所述SpA抗原可以包含SEQ ID NO:46，并且SEQ ID NO:46的优选实例为SEQ ID NO:47。当用N-末端甲硫氨酸表达时，包含SEQ ID NO:47的SpA抗原可以由SEQ ID NO:48组成。
如上所讨论，SpA的有用片段可以包含天然A、B、C、D和/或E结构域中的仅1、2、3或4个，例如仅包含SpA(E)结构域，但不包含D、A、B或C。因此，与本发明有用的SpA抗原可以仅包含如上所述突变的SpA(E)结构域，即包含在SEQ ID NO:54的位置60和61处的突变至少1个氨基酸的SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 或SEQ ID NO:49的氨基酸1至67或SEQ ID NO:48的氨基酸1至68或由其组成的氨基酸序列。例如，所述抗原可以包含SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52或SEQ ID NO. 53。所述抗原将优选不包含除了SpA以外的其它序列。它可以包含多于一个拷贝的SpA(E)结构域，和/或额外包含另一种蛋白抗原，诸如如本文所述的EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011或Hla抗原。
本发明的抗原组合使用以下抗原中的1、2、3、4种或所有5种：EsxA；EsxB；FhuD2；Sta011；和Hla。这五种抗原是本领域中已知的(例如，参见参考文献4-14)，并且下面给出进一步详情。特别有用的组合物包含这些抗原中的所有五种(优选地，其中Hla是无毒(即脱毒)突变体形式)。
NCTC 8325菌株中的'EsxA'抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:1 (GI:88194063)。本发明使用的EsxA可引发识别SEQ ID NO: 1的抗体(例如，当施用于人时)并且/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:1具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO:1的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多)。这些EsxA多肽包括SEQ ID NO:1的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:1的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ ID NO:1的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:1的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQID NO:1的至少一个表位。
NCTC 8325菌株中的'EsxB'抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:2 (GI:88194070)。本发明使用的EsxB可引发识别SEQ ID NO: 2的抗体(例如，当施用于人时)并且/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:2具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO:2的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更多)。这些EsxB多肽包括SEQ ID NO:2的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:2的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ ID NO:2的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:2的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:2的至少一个表位。有用的EsxB抗原缺乏SEQ ID NO:2的内部半胱氨酸残基，例如其包含SEQ ID NO:35，其中在位置30处的残基X不存在或者是无游离硫醇基(在还原条件下)的氨基酸残基，例如是除了半胱氨酸以外的任何天然氨基酸。
‘FhuD2’抗原被注释为'高铁色素-结合蛋白'，并且也已经在文献[15]中研究。它也被称为‘Sta006’(例如，在参考文献4-14中)。在NCTC 8325菌株中，FhuD2具有氨基酸序列SEQ ID NO:3 (GI:88196199)。本发明使用的FhuD2可引发识别SEQ ID NO: 3的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:3具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:3的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些FhuD2多肽包括SEQ ID NO:3的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:3的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ ID NO:3的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:3的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:3的至少一个表位。可以有用地省略SEQ ID NO:3的头17个N-末端氨基酸(以提供SEQ ID NO:6)。FhuD2的突变体形式报道于参考文献16。有用的FhuD2抗原缺乏SEQ ID NO:3的半胱氨酸残基，例如其包含SEQ ID NO:34，并且不包含具有游离硫醇基(在还原条件下)的任何氨基酸残基，例如它是不含半胱氨酸的。FhuD2抗原可以是脂化的，例如具有酰化的N-末端半胱氨酸。一种有用的FhuD2序列是SEQ ID NO:7，其在N-末端具有Met-Ala-Ser-序列；SEQ ID NO:37是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:7中存在的半胱氨酸。
'Sta011'抗原具有NCTC 8325菌株中的氨基酸序列SEQ ID NO:4 (GI:88193872)。本发明使用的Sta011抗原可引发识别SEQ ID NO: 4的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:4具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQID NO:4的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Sta011多肽包括SEQ IDNO:4的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:4的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ IDNO:4的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:4的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:4的至少一个表位。可以有用地省略SEQ ID NO:4的头23个N-末端氨基酸(以提供SEQ ID NO:33)。有用的Sta011抗原缺乏SEQ ID NO:4的半胱氨酸残基，例如其包含SEQ ID NO:36，并且不包含具有游离硫醇基(在还原条件下)的任何氨基酸残基，例如它是不含半胱氨酸的。Sta011抗原可以是脂化的，例如具有酰化的N-末端半胱氨酸。一种有用的Sta011序列是SEQ ID NO:8，其具有N-末端甲硫氨酸；SEQ ID NO:39是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:8中存在的半胱氨酸。可以用作Sta011抗原或用于制备Sta011抗原的SEQ ID NO:4的变体形式包括，但不限于具有各种Ile/Val/Leu置换的SEQ IDNO:9、10和11(并且这些序列的不含Cys的变体可以与本发明使用)。Sta011可以作为单体或寡聚体存在，其中Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使用Sta011的单体和/或寡聚体。
'Hla'抗原是'α-溶血素前体'，也称为'α毒素'或简称'溶血素'。在NCTC 8325菌株中，Hla具有氨基酸序列SEQ ID NO:5 (GI:88194865)。Hla是大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，其具有成孔和溶血活性。抗-Hla抗体可以中和毒素在动物模型中的有害作用，并且Hla特别可用于防止肺炎。
有用的Hla抗原可引发识别SEQ ID NO: 5的抗体(例如，当施用于人时)并且/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:5具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQID NO:5的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Hla抗原包括SEQ ID NO:5的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:5的表位。其它优选片段缺乏来自SEQ ID NO:5的C-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或来自SEQ ID NO:5的N-末端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:5的至少一个表位。可以有用地省略SEQ ID NO:5的头26个N-末端氨基酸(以提供SEQ ID NO:12)。也可以使用在C-末端的截短，例如留下仅50个氨基酸(SEQ ID NO:5的残基27-76)[17]。
具体地，Hla抗原是脱毒的Hla抗原，即Hla的突变体形式，其中已经去除Hla的天然毒性。可以通过化学灭活(例如，使用甲醛、戊二醛或其它交联剂)避免Hla的毒性。然而，反而优选使用Hla的突变体形式，其去除其毒性活性、同时保留其免疫原性。更具体地，脱毒的Hla抗原是Hla的突变体形式，其中已经去除Hla的毒性，同时已经保留Hla的免疫原性。此类脱毒突变体是本领域中已知的。优选的Hla抗原是这样的突变体金黄色葡萄球菌溶血素，其在SEQ ID NO:5的残基61、即成熟抗原的残基35(即省略前26个N-末端氨基酸之后 = SEQID NO:12的残基35)具有突变。因此，残基61可以不是组氨酸，并且可替代地是例如Ile、Val或优选Leu。也可使用在该位置的His-Arg突变。例如，SEQ ID NO:13是Hla的成熟H35L突变体形式的序列(即具有H35L突变的SEQ ID NO:12)，并且有用的脱毒Hla抗原具有包含SEQID NO:13或由其组成的序列。另一种有用的突变用短序列代替长环，例如用四聚体诸如PSGS (SEQ ID NO:14)代替SEQ ID NO:5的残基136-174的39聚体，如在SEQ ID NO:15(其还包括H35L突变)和SEQ ID NO:16(其不包括H35L突变)中。另一种有用的突变例如用亮氨酸替代残基Y101 (SEQ ID NO:17)。另一种有用的突变例如用亮氨酸替代残基D152 (SEQ IDNO:18)。另一种有用的突变体例如用亮氨酸替代残基H35和Y101(SEQ ID NO:19)。另一种有用的突变体例如用亮氨酸替代残基H35和D152(SEQ ID NO:20)。
另外的有用的Hla抗原公开于参考文献18和19。
SEQ ID NO:21、22和23是SEQ ID NO:5的三种有用的片段(分别为‘Hla27-76’、‘Hla27-89’和‘Hla27-79’)。SEQ ID NO:24、25和26是来自SEQ ID NO:13的相应片段。
一种有用的Hla抗原是SEQ ID NO:27。它具有N-末端Met，然后是来自表达载体的Ala-Ser二肽，然后是包含H35L突变的SEQ ID NO:13(来自NCTC8325菌株)。
当组合物同时包含EsxA和EsxB抗原两者时，这些可以作为单一多肽(即作为包含EsxA和EsxB或由其组成的融合多肽)存在。因此，单一多肽可以引发抗体(例如，当施用于人时)，所述抗体识别SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2两者。所述单一多肽可以包含：(i) 与SEQID NO:1具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)和/或包含SEQ ID NO:1的至少'n'个连续氨基酸的片段的第一多肽序列，如上述对于EsxA所定义；和(ii) 与SEQ ID NO:2具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)和/或包含SEQ ID NO:2的至少'n'个连续氨基酸的片段的第二多肽序列，如上述对于EsxB所定义。所述第一和第二多肽序列可以是任一顺序，N-至C-末端。SEQ ID NO:28(‘EsxAB’)和29 (‘EsxBA’)是此类多肽的实例，两者均具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID NO:30)。另一种‘EsxAB’杂合体包含SEQ ID NO:31，其可以额外地提供N-末端甲硫氨酸(例如，SEQ ID NO:32)。EsxAB的有用变体缺乏EsxB的内部半胱氨酸残基，例如其包含SEQ ID NO:40，其中在位置132处的残基X不存在或者是无游离硫醇基(在还原条件下)的氨基酸残基，例如是除了半胱氨酸以外的任何天然氨基酸。因此，用于本发明的优选的EsxAB抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:38。
因此，一种有用的多肽包含这样的氨基酸序列，其(a) 与SEQ ID NO:31具有80％或更高同一性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)同时包含来自SEQ ID NO:31的氨基酸1-96的至少'n'个连续氨基酸的片段和来自SEQ ID NO:31的氨基酸103-205的至少'n'个连续氨基酸的片段两者，其中'n'为7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些多肽(例如，SEQ ID NO:32)可以引发抗体(例如，当施用于人时)，所述抗体识别包含SEQ ID NO:1的野生型葡萄球菌蛋白和包含SEQ ID NO:2的野生型葡萄球菌蛋白两者。因此，所述免疫应答将识别抗原EsxA和EsxB两者。(b)的优选片段提供来自SEQ ID NO:1的表位和来自SEQ ID NO:2的表位。
本发明使用EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla中的1、2、3、4种或所有5种(优选无毒突变型HLA)。如上所提及，特别有用的组合物包含这些抗原中的所有五种，但在一些实施方案中，本发明包含这五种抗原中的仅1、2、3或4种，即组合物中不存在EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla中的1、2、3 或4种。
优选的组合物包含以下中的所有四种：(i) 单一多肽，其同时包含EsxA抗原和EsxB抗原两者，例如包含SEQ ID NO:31；(ii) FhuD2抗原，例如包含SEQ ID NO:6；(ⅲ)Sta011抗原，例如包含SEQ ID NO:33；和(iv) Hla的H35L突变体形式，例如包含SEQ ID NO:13。
尽管SEQ ID NO:31、6、33和13是组合中有用的氨基酸序列，但本发明不限于这些精确的序列。因此，这些序列中的1个、2个、3个或所有4个可以独立地通过最多达5个单一氨基变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸置换、缺失和/或插入)而修饰，条件是修饰的序列可引发仍结合至由未修饰的序列组成的多肽的抗体。
另一种有用的组合物包含以下中的所有四种：(i) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的第一多肽；(i) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的第二多肽；(i) 具有氨基酸序列SEQ IDNO:8的第三多肽；和(iv) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的第四多肽。
尽管SEQ ID NO:32、7、8和27是组合中有用的氨基酸序列，但本发明不限于这些精确的序列。因此，这四个序列中的1、2、3或所有4个可以独立地通过1、2、3、4或5个单一氨基变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸置换、缺失和/或插入)而修饰，条件是修饰的序列可引发仍结合至由未修饰的序列组成的多肽的抗体。在一个优选实施方案中，组合物因此包含这四个指定的多肽，其中SEQ ID NO:32、7、8和27中的1、2、3或所有4个独立地通过1个单一氨基酸置换、缺失和/或插入来修饰。
例如，野生型FhuD2、Sta011和EsxAB多肽序列(例如SEQ ID NO:6、31和33)各自包含单一半胱氨酸残基，这可以导致多肽间的二硫桥，同时形成同源二聚体和异源二聚体两者。此类互连的多肽是不期望的，所以可以修饰Sta006、Sta011和EsxB序列以去除其天然的半胱氨酸残基，使得其不含游离的硫醇基团(在还原性条件下)。野生型半胱氨酸可以缺失，或可以被不同的氨基酸置换。
因此：FhuD2抗原可以包含SEQ ID NO:34；Sta011抗原可以包含SEQ ID NO:36；且EsxB抗原可以包含SEQ ID NO:35(例如，作为包含SEQ ID NO:40的EsxAB杂合 体)。此类序列的实例包括但不限于：SEQ ID NO:37、39和38。这些序列可以单独作为对应野生型序列的替代物或组合地使用。因此，特别有用的组合物包含以下中的所有四种：(i) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的第一多肽；(i) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:37的第二多肽；(i) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:39的第三多肽；和(iv) 具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的第四多肽；
因此，本发明的优选组合物包含以下中的所有五种：(i) 单一多肽，其同时包含EsxA抗原和EsxB抗原两者，例如包含SEQ ID NO:31；(ii) FhuD2抗原，例如包含SEQ ID NO:6；(ⅲ) Sta011抗原，例如包含SEQ ID NO:33；(iv) Hla的H35L突变体形式，例如包含SEQID NO:13；和(v)突变型SpA，例如包含SEQ ID NO:45或47，或包含其单一结构域的抗原，例如SEQ ID NO. 50、51、52或53。所以，具体而言，根据本发明的组合物包含：
(i) 同时包含EsxA抗原和EsxB抗原两者的单一多肽，特别是包含SEQ ID NO:31或由其组成的序列；
(ii) FhuD2抗原，特别是包含SEQ ID NO:6或由其组成的序列；
(iii) Sta011抗原，特别是包含SEQ ID NO:33或由其组成的序列；
(iv) Hla的H35L突变体，特别是包含SEQ ID NO:13或由其组成的序列；和
(v) 突变型SpA抗原，特别是包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO. 52或由其组成的序列。
根据本发明的另一种优选组合物包含：
(i) 包含SEQ ID NO:32或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:32组成的序列的第一多肽；
(ii) 包含SEQ ID NO:7或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:7组成的序列的第二多肽；
(iii) 包含SEQ ID NO:8或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:8组成的序列的第三多肽；
(iv) 包含SEQ ID NO:27或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:27组成的序列的第四多肽；和
(v) 包含SEQ ID NO. 52或由其组成、更具体地包含通过最多达3个氨基酸置换修饰的SEQ ID NO:45或由其组成(例如，包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:48组成)的序列的第五多肽。
根据本发明的另一种优选组合物包含：
(i) 包含SEQ ID NO:38或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:38组成的序列的第一多肽；
(ii) 包含SEQ ID NO:37或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:37组成的序列的第二多肽；
(iii) 包含SEQ ID NO:39或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:39组成的序列的第三多肽；
(iv) 包含SEQ ID NO:27或由其组成、更具体地由SEQ ID NO:27组成的序列的第四多肽；和
(v) 包含SEQ ID NO. 52、更具体地通过最多达3个氨基酸置换修饰的SEQ ID NO:45或由其组成(例如，包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:48组成)的序列的第五多肽。
这些组合中的蛋白(i)至(v)可以，如上所解释，独立地通过最多达5个单一氨基变化而修饰，条件是修饰的序列可以引发仍然结合由未修饰的序列组成的多肽的抗体。在一些实施方案中，组合物可以包含一种或多种另外的多肽；在其它实施方案中，组合物中的唯一多肽是这五种制定的多肽，并且这些多肽甚至可以是组合物中的唯一免疫原性组分。
当存在不止一种多肽时，它们可以以基本相等的质量存在，即它们各自的质量在全部多肽的平均质量的+5%之内。因此，当存在五种多肽时，它们可以以a:b:c:d:e的质量比存在，其中a-e各自在0.95和1.05之间。
除了EsxA、EsxB、Hla、FhuD2、Sta011和SpA以外，存在其它金黄色葡萄球菌抗原，并且组合物可以任选地包含一种或多种另外的金黄色葡萄球菌抗原。例如，糖和多肽抗原两者对于金黄色葡萄球菌是已知的。因此，组合物可能包含金黄色葡萄球菌糖抗原，例如已知的糖抗原包括金黄色葡萄球菌的胞外多糖(其为聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG))和金黄色葡萄球菌的荚膜糖(其可以例如来自5型、8型或336型)。组合物还可能包含ClfA抗原、IsdA抗原、IsdB抗原、IsdC抗原和/或IsdH抗原(各自如参考文献5的第15-17页上所定义)。
在一些实施方案中，组合物包含如上所定义的金黄色葡萄球菌抗原，和还有来自不同生物体(例如，来自病毒或来自另一种细菌)的抗原。
免疫原性组合物和药物
根据本发明的免疫原性组合物可用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但将通常是预防性的。
组合物因此可以是药学上可接受的。它们将通常包含除了所述抗原以外的组分，例如它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。此类组分的充分讨论可见于参考文献121。
组合物将通常以水性形式施用于哺乳动物。然而，在施用前，该组合物可能已经呈非水形式。例如，尽管一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填装和分销和施用，但其它疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重构成水性形式。因此，组合物可以是干燥，诸如冻干制剂。参考文献10公开了使用冻干与金黄色葡萄球菌免疫原性组合物。
组合物可包含防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基本不含(即少于5μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了改善热稳定性，组合物可包含温度保护剂(参见下文)。
为了控制涨度，优选包含生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以以1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl存在。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物将通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)，更优选落在290-310 mOsm/kg的范围内。
组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris 缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将在5-20mM范围内。
组合物可以包含金属离子螯合剂，特别是二价金属离子螯合剂诸如EDTA。参考文献6公开了包含EDTA可以改善本文公开的组合物的稳定性。免疫原性组合物中的EDTA的最终浓度可为约1-50 mM，约1-10 mM或约1-5 mM，优选约2.5 mM。
组合物的pH将通常为5.0至8.1，更通常6.0至8.0，例如6.5至7.5，或 7.0至7.8。
该组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，例如每剂量含有<1 EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1 EU。该组合物优选不含谷蛋白。
所述组合物可包含用于单次免疫的材料，或者可包含用于多次免疫的材料(即“多剂量”药剂盒)。多剂量配置优选包含防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或除此以外)，所述组合物可盛放在具有用于移取材料的无菌接头的容器中。
金黄色葡萄球菌感染可影响身体的各个区域，所以，可以各种形式制备组合物。例如，可将组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。所述组合物可以制备用于局部施用，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末剂。所述组合物可制备用于口服施用，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地调味)。可将所述组合物制备为使用细粉或喷雾进行肺部施用，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如作为滴剂。可将所述组合物设计为药剂盒形式，使得在临施用于患者之前重构组合的组合物。此类药剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。
当组合物在临使用前制备(例如，当组分以冻干形式呈现时)且作为药剂盒呈现时，该药剂盒可包括两个小瓶，或者其可包括一个即填充(ready-filled)的注射器和一个小瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重新活化小瓶的内容物。
人疫苗通常以约0.5ml的剂量体积施用，但一半体积(即约0.25ml)也是可用的，例如用于儿童。
根据本发明施用的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地，所述免疫调节剂中的一种或多种包括一种或多种佐剂(参见下文)。
所述组合物可同时引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答两者。该免疫应答将优选诱导在暴露于金黄色葡萄球菌之后可以迅速响应的持久性(例如中和性)抗体和细胞介导的免疫。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医疗情况的评估和其它相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。当组合物中包含多于一种抗原时，则两种抗原可以彼此相同剂量或以不同剂量存在。
如上所提及，组合物可以包含温度保护剂，并且该组分可以特别用于佐剂化的组合物(特别是含有矿物质佐剂诸如铝盐的组合物)中。如参考文献20中所述，可以将液体温度保护剂添加至水性疫苗组合物中，以降低其凝固点， 例如将凝固点降低至0℃以下。因此，该组合物可以储存于0℃以下，但在其凝固点以上，以抑制热降解。所述温度保护剂也允许冷冻所述组合物，同时保护矿物质盐佐剂免于在冻融之后的凝聚或沉降，并且还可以在升高的温度下，例如高于40℃，保护该组合物。可以混合初始的水性疫苗和液体温度保护剂，使得所述液体温度保护剂构成最终混合物的1-80体积％。合适的温度保护剂应当对于人施用是安全的、容易混溶/可溶于水的、并且不应当损害组合物中的其它组分(例如抗原和佐剂)。实例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适的PEG可以具有范围为200-20,000 Da的平均分子量。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇可以具有约300 Da的平均分子量(‘PEG-300’)。
治疗的方法和免疫原性组合物的施用
本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物，其用作药物。
本发明还涉及根据本发明的免疫原性组合物，其用作金黄色葡萄球菌感染的预防和/或治疗中的药物。
本发明还提供了用于预防和/或治疗哺乳动物中的金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用免疫有效量的如上所定义的根据本发明的免疫原性组合物的步骤。有利的实施方案如上所定义。
本发明还提供了(i)至少一种选自EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla抗原的抗原，和(ii)相对于未修饰的SpA，对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力的突变型SpA抗原，在制备用于预防或治疗哺乳动物中的金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途。有利的实施方案如上所定义。
本发明还提供了(i)至少一种选自EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla抗原的抗原，和(ii)相对于未修饰的SpA，对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力的突变型SpA抗原，其用于免疫哺乳动物以预防或治疗金黄色葡萄球菌感染。有利的实施方案如上所定义。
本发明还提供了(i)至少一种选自EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla抗原的抗原，和(ii)相对于未修饰的SpA，对于人IgG的Fcγ部分和对于含有VH3的人B细胞受体的Fab部分具有降低的亲和力的突变型SpA抗原，其用于通过将治疗有效量的所述抗原施用于哺乳动物而免疫哺乳动物以预防或治疗金黄色葡萄球菌感染的方法中。有利的实施方案如上所定义。
如上所示，EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011和Hla中的1、2、3、4种或优选所有5种可以与突变型SpA组合使用。以该方式，本发明的方法、用途、组合物和抗原组合引发对于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染有效的免疫应答。所述免疫应答可以涉及抗体和/或细胞介导的免疫。通过这些用途和方法在哺乳动物中引起免疫应答，所述哺乳动物可以受保护免于金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，哺乳动物可以受保护免于皮肤感染、肺炎、脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症。本发明也可用于防止哺乳动物的骨和关节的金黄色葡萄球菌感染(并且因此用于预防病症，包括，但不限于，骨髓炎、脓毒性关节炎和假体关节感染)。在许多情况下，这些病症可能与金黄色葡萄球菌生物膜的形成相关。
金黄色葡萄球菌感染各种哺乳动物(包括牛、狗、马和猪)，但用于本发明的优选哺乳动物是人。所述人可以是儿童(例如幼童或婴儿)、青少年或成人。在一些实施方案中，人可以具有假体骨或关节，或者可以是此类假体的预期受体(例如，手术前整形外科手术患者)。旨在用于儿童的疫苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群。
检查治疗性治疗的效力的一种方式涉及在施用根据本发明的组合物或抗原之后监测金黄色葡萄球菌感染。检查预防性治疗的效力的一种方式涉及施用组合物之后监测针对施用的组合物中的抗原的全身免疫应答(诸如监测IgG1和IgG2a产生的水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生的水平)。评价所述组合物的免疫原性的另一种方式是重组表达抗原，其用于通过免疫印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品之间的阳性反应表明所述患者已经对目标蛋白产生免疫应答。通过用疫苗组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型(例如豚鼠或小鼠)，也可在体内测定疫苗组合物的效力。
通过用疫苗组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型(例如豚鼠或小鼠)，也可在体内测定疫苗组合物的效力。存在三种通常用于研究金黄色葡萄球菌感染性疾病的有用动物模型，即：(i) 鼠脓肿模型[21]，(ii) 鼠致死感染模型[21]和(iii) 鼠肺炎模型[22]。脓肿模型关注静脉内攻击后小鼠肾脏中的脓肿。致死感染模型关注通过静脉内或腹膜内途径被通常致死剂量的金黄色葡萄球菌感染后存活的小鼠的数目。肺炎模型还关注存活率，但使用鼻内感染。参考文献23中公开了另外的有用的模型，其用于研究关于生物膜介导的植入物感染、皮肤和软组织感染(SSTI)和脓毒症的金黄色葡萄球菌疾病。有用的疫苗在这些模型中的一种或多种中可以是有效的。例如，对于一些临床情况下，可能希望其可防止肺炎，而无需防止血液传播或促进调理作用；在其它情况下，主要愿望可以是防止血液传播或脓毒症。不同的抗原以及不同的抗原组合，可有助于有效疫苗的不同方面。
组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)，或经粘膜，诸如通过直肠、经口(例如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用完成。肌内注射是用于施用根据本发明的组合物的最典型途径。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。优选地，增强的全身和/或粘膜免疫反映为增强的TH1和/或TH2免疫应答。优选地，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。
剂量可通过单剂量方案或多剂量方案施用。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径(例如肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等)给予。多个剂量将通常间隔至少1周 (例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16 周等)进行施用。
可将免疫原性组合物与其它疫苗基本上同时(例如在相同用药咨询或访问健康护理专业人员或疫苗接种中心期间)施用于患者。
免疫原性组合物可以与抗生素组合施用于患者。例如，它们可以在与抗生素基本上相同的时间施用。类似地，它们可以施用于正在接受抗生素治疗的受试者。类似地，它们可以作为联合疗法的部分施用，所述联合疗法涉及同时施用如本文讨论的组合物和抗生素两者。所述抗生素将针对金黄色葡萄球菌细菌是有效的，例如β-内酰胺。
菌株和变体
上面通过参考现有命名(例如，“EsxA”)和作为GI编号和也在序列表中给出的示例性序列来讨论抗原。本发明不限于这些精确序列。金黄色葡萄球菌的几种菌株的基因组序列是可得的，包括MRSA菌株N315和Mu50[24]、MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300(剧毒)、JH1、JH9、NCTC 8325和Newman的那些。可使用标准的搜索和比对技术在任何这些(或其它)另外的基因组序列中鉴定本文提及的任何具体序列的同源物。而且，本文公开的具体序列可用于设计引物用于扩增来自其它菌株的同源序列。因此，本发明涵盖来自金黄色葡萄球菌的任何菌株的此类变体和同源物，以及非天然变体。通常，具体SEQ ID NO的合适变体包括其等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其突变体等。
因此，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，本发明使用的多肽可包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸置换，诸如保守置换(即用具有相关侧链的另一种氨基酸置换一种氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性氨基酸，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳香族氨基酸。通常，这些家族内的单一氨基酸的置换对生物活性不具有主要影响。相对于SEQ ID NO序列，多肽还可包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9等)单一氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO序列，多肽也可包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)插入(例如各1、2、3、4或5 个氨基酸)。
类似地，本发明使用的多肽可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
(a) 与序列表中公开的序列相同(即100％相同)；
(b) 与序列表中公开的序列(理想地在所述序列的整个长度)具有序列同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；
(c) 与(a)或(b)的序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单一氨基酸改变(缺失、插入、置换)，其可以在不同位置或可以是连续的；或
(d) 当使用逐对比对算法与来自序列表的特定序列比对时，每个从N-末端向C-末端移动x个氨基酸的窗口(使得对于延伸至p个氨基酸的比对，当p>x时，存在p-x+1 个此类窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；且如果x·y不是整数，则将其四舍五入至(rounded up to)最近的整数。优选的成对比对算法是 Needleman-Wunsch整体比对算法[25]，使用默认参数(例如缺口开放罚分＝10.0， 缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。该算法以EMBOSS软件包中的needle工具方便地执行[26]。
当使用杂合多肽时，所述杂合体内的单独抗原(即，单独-X-部分)可以来自一种或多种菌株。当n=2时，例如，X2可以来自与X1相同的菌株或来自不同的菌株。当n=3时，所述菌株可能是(i) X1=X2=X3 (ii) X1=X2/X3 (iii) X1/X2=X3 (iv) X1/X2/X3或(v) X1=X3/X2，等。
在组(c)内，缺失或置换可在N-末端和/或C-末端，或者可以在两端之间。因此，截短是缺失的一个实例。截短可涉及在N-末端和/或C-末端缺失最多达40个(或更多个)氨基酸。N-末端截短可去除前导肽，例如以促进在异源宿主中的重组表达。C-末端截短可去除锚定序列，例如以促进在异源宿主中的重组表达。
通常，当抗原包含与来自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时(例如，当它包含与之具有<100％序列同一性的序列表时，或当它包含其片段时)，优选的是，在各种单独情况下，该抗原可引发抗体，所述抗体识别相应的完整金黄色葡萄球菌序列。
本发明使用的多肽
本发明使用的多肽可采取各种形式(例如天然多肽、融合体、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化(lipidated)多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽等)。
本发明使用的多肽可通过各种方式(例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)制备。优选重组表达的蛋白，特别是杂合多肽。
本发明使用的多肽优选以纯化或基本纯化形式(即基本不含其它肽(例如，不含天然存在的多肽)，特别是不含其它葡萄球菌或宿主细胞多肽)提供，并且通常至少约50％纯(以重量计)，通常至少约90％纯，即组合物的少于约 50％，更优选少于约10％(例如5％)由其它表达的肽构成。因此，组合物中的抗原与表达该分子的完整生物体分离。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可包含修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸打断。该术语也涵盖已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。例如，还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或结合链产生。
尽管本发明的多肽的表达可以在葡萄球菌中发生，但本发明将通常使用异源宿主用于表达(重组表达)。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。它可以是大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟氏球菌 (Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明的多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，改变密码子以优化此类宿主中的表达效率而不影响所编码的氨基酸是有帮助的。
佐剂
如上所提及，根据本发明使用的免疫原性组合物可以包含一种或多种佐剂。可用于本发明的佐剂包括，但不限于：
A. 含有矿物质的组合物
适用作本发明中的佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，诸如铝盐和钙盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(例如参考文献27中公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化物和磷酸盐等，其中所述盐采用任何合适形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附至这些盐(例如，可以吸附所述抗原)。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒[28]。
可使用已知为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规的，但仅出于方便使用，因为其均不是存在的实际化合物的准确描述(例如参见参考文献29的第9章)。本发明可使用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂通常是羟基氧化铝盐(aluminum oxyhydroxide salts)(通常至少部分为晶体)。已知为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸(即硫酸羟基磷酸铝)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。
纤维形态(例如，如透射电子显微图中所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。已经报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附能力为1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++。
磷酸铝佐剂的PO4/Al摩尔比通常为0.3至1.2，优选0.8至1.2，并且更优选0.95+0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+/ml包括。磷酸铝将通常是颗粒(例如透射电子显微图所见的板状形态)。在任何抗原吸附后，颗粒的典型直径是范围0.5-20μm(例如约5-10μm)。对于磷酸铝佐剂已经报道在pH7.4 具有0.7-1.5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根对羟基的取代程度负相关，这种取代程度可取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4.0至7.0，更优选5.0至6.5，例如约5.7的PZC。
用于制备本发明的组合物的铝盐悬浮液可含有缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但这不总是必要的。所述悬浮液优选无菌且无热原的。悬浮液可包括游离的水性磷酸根离子，例如以1.0至20mM、优选5至15 mM、更优选约10 mM的浓度存在。所述悬浮液还可以包含氯化钠。
本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，可以存在比氢氧化铝更多的磷酸铝， 例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。
施用于患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选的范围是0.3-1mg/ml。优选0.85mg/剂量的最大值。
B. 水包油乳液
适用作本发明中的佐剂的水包油乳液组合物包括水包角鲨烯乳液，诸如MF59(参见参考文献29的第10章；也参见参考文献30)和AS03[31]。
各种水包油乳液佐剂是已知的，并且它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。所述乳液将包括亚微米油微滴，并且优选含有具有小于220nm的直径的微滴的乳液，因为它们可以进行过滤除菌。
所述乳液包含一种或多种油。合适的油包括来自例如动物(诸如鱼)和/或植物来源的油。所述油理想地是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最普遍可得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油作为坚果油的例子。可以使用(例如获得自霍霍巴豆的)霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中，玉米油是最容易获得的，但也可以使用其它谷物(诸如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等)的油。可从坚果油和种子油开始，通过水解、分离和酯化适当材料制备不是种子油中天然存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，所以可以使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方式的程序是本领域众所周知的。
大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)例举本文中可使用的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，其统称为萜类化合物。优选的乳液包含角鲨烯，作为支链不饱和萜类化合物的鲨鱼肝油。也可以使用角鲨烷，角鲨烯的饱和类似物。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通过本领域中已知的方法获得。
其它有用的油类是生育酚类，特别是与角鲨烯组合。当乳液的油相包含生育酚时，可以使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但α生育酚是优选的。D-α-生育酚和DL-α-生育酚两者均可用。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。可以使用包含角鲨烯和生育酚(例如，DL-α-生育酚)的油组合。
乳液中的油可以包含油的组合，例如角鲨烯和至少一种其它油。
乳液的水性组分可以是纯水(例如w.f.i.)，或者可以包括另外的组分，例如溶质。例如，它可以包含盐以形成缓冲剂，例如柠檬酸盐或磷酸盐，诸如钠盐。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲的水相是优选的，并且通常将包含5-20mM范围内的缓冲剂。
除了油和阳离子脂质以外，乳液可以包含非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。此类表面活性剂包括，但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商品名销售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，诸如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团数目不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(已知为苄泽(Brij)表面活性剂)，诸如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂基酯；和脱水山梨糖醇酯(通常已知为司盘(Spans))，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。用于乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80(吐温80；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可以使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物，或吐温80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇诸如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可以包含具有10-20的范围内的HLB值的表面活性剂(例如，具有15.0的HLB的聚山梨醇酯80)和具有1-10的范围内的HLB值的表面活性剂(例如，具有1.8的HLB的脱水山梨糖醇三油酸酯)。
最终乳液中的油的优选量(体积％)为2-20%之间，例如5-15%、6-14%、7-13%、8-12%。约4-6％或约9-11％的角鲨烯含量是特别有用的。
最终乳液中的表面活性剂的优选量(重量％)是0.001%至8%。例如：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(诸如聚山梨醇酯80) 0.2至4%，特别是0.4-0.6%，0.45-0.55%，约0.5%或1.5-2%，1.8-2.2%，1.9-2.1%，约2%，或0.85-0.95%，或约1%；山梨糖醇酯(诸如脱水山梨糖醇三油酸酯) 0.02至2%，特别是约0.5％或约1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(诸如曲通 X-100)0.001至0.1%，特别是0.005至0.02%；聚氧乙烯醚(诸如月桂醇聚醚9) 0.1至8%，优选0.1至10%，特别是0.1至1%或约0.5%。
油和表面活性剂的绝对量以及它们的比率可以在宽范围内变化，同时仍然形成乳液。技术人员可以容易地改变组分的相对比例以获得期望的乳液，但典型的油和表面活性剂的重量比在4:1和5:1之间(过量油)。
用于确保乳液的免疫刺激性活性的一个重要参数，特别是在大型动物中，是油微滴大小(直径)。最有效的乳液具有亚微米范围内的微滴大小。合适地，微滴大小将在范围50-750nm内。最有用地，平均微滴大小小于250nm，例如小于200nm，小于150nm。平均微滴大小有用地在80-180nm的范围内。理想地，乳液的油微滴中的至少80％(通过数目)、且优选至少90％直径小于250 nm。这些微滴大小可方便地通过技术诸如微流化法来实现。用于测定乳液中的平均微滴大小和大小分布的装置是市售的。这些通常使用动态光散射和/或单颗粒光学传感的技术，例如可得自Particle Sizing Systems (Santa Barbara, USA)的Accusizer™或Nicomp™系列仪器，或来自Malvern Instruments (UK)的Zetasizer™仪器，或来自Horiba (Kyoto, Japan)的粒径分布分析仪。
理想地，微滴大小的分布(通过数目)仅具有一个最大值，即在平均值(模式)附近分布的微滴的单一群体，而不是具有两个最大值。优选的乳液具有<0.4、例如0.3、0.2或更小的多分散性。
可用于本发明的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
• 角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。在重量方面，这些比率变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。这种佐剂已知为‘MF59’ [32-34]，如参考文献35的第10章和参考文献36的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
• 包含角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳液以体积计可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，且角鲨烯：生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。可通过以下制备一种此类乳液(‘AS03’)：将吐温80溶解于PBS以产生2％溶液，然后混合90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物，然后微流化该混合物。所得乳液可具有亚微米油微滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm。所述乳液也可以包括3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A (3d MPL)。另一种这种类型的有用乳液的单人剂量可包含0.5-10 mg角鲨烯、0.5-11 mg生育酚和0.1-4 mg聚山梨酸酯80 [37]，如以上述讨论的比率。
• 角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如曲通X-100)的乳液。所述乳液也可包含3d-MPL(参见下文)。所述乳液可含有磷酸盐缓冲液。
• 包含聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、曲通去污剂(例如曲通X-100)和生育酚(例如α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。所述乳液可包含质量比约75∶11∶10的这三种组分(例如750μg/ml聚山梨醇酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，并且这些浓度应当包括来自抗原的这些组分的任何贡献。所述乳液也可包含角鲨烯。所述乳液还可包含3d-MPL(参见下文)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
• 角鲨烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(“Pluronic™ L121”)的乳液。所述乳液可在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中配制。该乳液是胞壁酰二肽的有用递送载体，且已在“SAF-1”佐剂[38]中与苏氨酰-MDP一起使用(0.05-1％ Thr-MDP，5％角鲨烯，2.5％普朗尼克L121和0.2％聚山梨醇酯80)。它也可以不与Thr-MDP使用，如“AF”佐剂[39](5％角鲨烯，1.25％普朗尼克 L121和0.2％聚山梨醇酯80)中。优选微流化。
• 包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六十八烷基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或具有至少90％油微滴(以体积计)有小于200nm的大小[40]。该乳液也可包含以下中的一种或多种：醛糖醇；冷冻保护剂(例如，糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。该乳液也可包括TLR4激动剂[41]。此类乳液可以冻干。
• 角鲨烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳液[42]。佐剂化疫苗中这些组分的最终浓度(重量)为5％角鲨烯、4％泊洛沙姆105(普朗尼克多元醇)和2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16二甲聚硅氧烷；辛酸/癸酸甘油三酯)。
• 具有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献43中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米微滴大小是有利的。
• 不可代谢油(诸如轻矿物油)和至少一种表面活性剂(诸如卵磷脂，吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，诸如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂缀合物(诸如参考文献44中所述通过经由葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺添加至脱酰基皂苷而产生的GPI-0100)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
• 其中皂苷(例如QuilA或QS21)和甾醇(例如胆固醇)结合为螺旋胶束的乳液[45]。
• 包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[46]。
• 包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[46]。
在一些实施方案中，乳液可以在递送时与抗原即时混合，因此，所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销(distributed)的疫苗中，其备用于在使用时的最终配制。在其它实施方案中，乳液在制造过程中与抗原混合，并且组合物因此以液体佐剂化形式包装。抗原将通常是水性形式，使得通过混合两种液体制备最终疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。当组分的浓度在特定乳液的以上描述中给出时，这些浓度通常用于未稀释的组合物，并且与抗原溶液混合后的浓度将因此降低。
C. 皂苷制剂(参考文献29的第22章)
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂诸如QS21，以及脂质制剂诸如ISCOM。QS21以Stimulon™之名销售。
已使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，所述皂苷为QS21。产生QS21的方法公开于参考文献20。皂苷制剂也可包含甾醇，诸如胆固醇[48]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成被称为ISCOM的颗粒(参考文献29的第23章)。ISCOM通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献48-29中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含额外去污剂[51]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献52和53。
D.细菌或微生物衍生物
适用于本发明中的佐剂包括细菌或微生物衍生物，诸如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式公开于参考文献54。3dMPL的此类“小颗粒”小到足以通过0.22μm膜过滤除菌[54]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529(参见下文)。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A的衍生物，诸如OM-174。例如参考文献55和56中描述了OM-174。
适用作本发明中的佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也已显示是免疫刺激的。
CpG可以包含核苷酸修饰/类似物（诸如硫代磷酸酯）修饰，且可以是双链或单链的。参考文献57、58和59公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献60-65中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可针对TLR9，诸如基序GTCGTT或TTCGTT [37]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，诸如CpG-A ODN，或其可更特异地诱导B细胞应答，诸如CpG-B ODN。参考文献67-69中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选地，CpG为CpG-A ODN。
优选地，构建CpG寡核苷酸，使得5’末端可被受体识别。任选地，将两个CpG寡核苷酸序列在其3’末端连接以形成“免疫聚体(immunomers)”。参见例如参考文献66和70-72。
一种有用的 CpG佐剂是CPG7909，也称为ProMune™ (Coley PharmaceuticalGroup, Inc.)。另一种是CpG1826。作为使用CpG序列的替代方案，或除了使用CpG序列以外，可以使用TpG序列[73]，且这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，其可包含多于一个连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如TTTT，如参考文献73中所公开)，和/或其可具有含有＞25％(例如 ＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)胸苷的核苷酸组成。例如，其可包含多于一个连续的胞嘧啶核苷酸(例如CCCC，如参考文献73中所公开)，和/或其可具有含有＞25％(例如＞35％、＞40％、＞50％、 ＞60％、＞80％等)胞嘧啶的核苷酸组成。这些寡核苷酸可不含未甲基化的 CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸将通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。
基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂已知为IC-31™[74]。因此，本发明使用的佐剂可包含以下的混合物：(i)包含至少一个(且优选多个)CpI基序的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸) (即，连接至肌苷以形成二核苷酸的胞嘧啶)，和(ii)聚阳离子聚合物，诸如包含至少一个(且优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5'-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 41)的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是包含11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 42)的肽。所述寡核苷酸和聚合物可以形成复合物，例如，如参考文献75和76中所公开。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明中的佐剂。优选地，所述蛋白来源于大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌 (“PT”)。参考文献77中描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途，参考文献78中描述了其作为胃肠外佐剂的用途。所述毒素或类毒素优选呈全毒素(holotoxin)形式，其同时包含A和B亚单位。优选地，A亚单位含有脱毒突变；优选地，B亚单位未突变。优选地，所述佐剂为脱毒的LT突变体，诸如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可见参考文献79-86。有用的CT突变体是或CT-E29H [87]。氨基酸置换的数字参考优选基于参考文献88中记载的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对，所述参考文献具体以其整体通过引用并入本文。
E. TLR激动剂
组合物可以包含TLR激动剂，即，可以激动Toll样受体的化合物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。TLR激动剂可以活化TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11中任一者；优选它可以活化人TLR4或人TLR7。
化合物针对任何特定Toll样受体的激动剂活性可以通过标准测定法来测定。公司诸如Imgenex和Invivogen供应用人 TLR基因和NFκB加上合适的报告基因稳定共转染的细胞系，用于测量TLR活化通路。它们针对灵敏度、宽工作范围动力学而设计，并且可以用于高通量筛选。一种或两种特异性TLR的组成型表达在此类细胞系中是典型的。还参见参考文献89。许多TLR激动剂是本领域中已知的，例如，参考文献90描述了作为TLR2激动剂的某些脂肽分子，参考文献91-94各自描述了TLR7的小分子激动剂的类别，且参考文献95和96描述了用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。
与本发明使用的TLR激动剂理想地包括至少一个吸附部分。TLR激动剂中包括此类部分允许其吸附至不溶性铝盐(例如，通过配体交换或任何其它合适的机制)并改善其免疫原性行为[97]。含磷吸附部分是特别有用的，所以吸附部分可包含磷酸酯、膦酸酯、次磷酸酯、亚磷酸酯、次亚磷酸酯(phosphinite)等。优选地，所述TLR激动剂包含至少一个膦酸酯基团。
因此，在优选的实施方案中，组合物包含TLR激动剂(更优选TLR7激动剂)，其包含膦酸酯基。这种膦酸酯基可以允许激动剂吸附至不溶性铝盐[97]。
本发明可用的TLR激动剂可以包括单一吸附部分，或可以包括多于一个(例如， 2至15个)吸附部分。通常，化合物将包括1、2或3个吸附部分。
有用的含磷TLR激动剂可以由式(A1)表示：
Figure 846200DEST_PATH_IMAGE003
其中：
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L是接头，例如选自C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选被1至4个独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2的取代基取代；
各p独立地选自1、2、3、4、5 和6；
q选自1、2、3和4；
n选自1、2和3；且
A是TLR激动剂部分。
在一个实施方案中，根据式(A1)的TLR激动剂如下：RX和RY是H；X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选被1至2个卤素原子取代；p选自1、2和3；q选自1和2；且n是1。因此，在这些实施方案中，所述吸附部分包含磷酸酯基团。
具有式(A1)的其它有用的TLR激动剂公开于参考文献98的第6-13页。
组合物可以包含咪唑并喹诺酮化合物，诸如咪喹莫特(“R-837”)[99，100]，瑞喹莫德(“R-848”)[101]，以及它们的类似物；及其盐(例如盐酸盐)。关于免疫刺激的咪唑并喹诺酮的进一步详情可见于参考文献102至106中。
组合物可以包含TLR4激动剂，并且最优选人TLR4的激动剂。TLR4由固有免疫系统的细胞(包括常规的树突细胞和巨噬细胞)表达[107]。经由TLR4的触发诱导利用MyD88-和TRIF-依赖性通路的信号传导级联，分别导致NF-κB和IRF3/7活化。TLR4活化通常诱导稳健IL-12p70产生并强烈增强Th1型细胞和体液免疫应答。
多种有用的TLR4激动剂是本领域中已知的，其中许多是内毒素或脂多糖(LPS)的类似物。例如，所述TLR4激动剂可以是：3d-MPL(即，3-O-去酰化的单磷酰基脂质A；存在于GSK的‘AS04’佐剂中，进一步详述于参考文献108至111中；吡喃葡糖基脂质A (GLA)[112]或其铵盐；氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，诸如RC-529或CRX-524[113-115]；E5564[116, 117]：或如参考文献118中定义的式I、II或III的化合物，或其盐，诸如化合物‘ER803058’、‘ER 803732’、‘ER 804053’、‘ER 804058’、‘ER 804059’、‘ER 804442’、‘ER804680’、‘ER 803022’、‘ER 804764’或‘ER 804057’(也被称为E6020)。
当使用人TLR7激动剂，诸如式(K)的化合物时，本发明是特别有用的。这些激动剂详细讨论于参考文献119中：
Figure 755250DEST_PATH_IMAGE004
其中：
R1是H、C1-C6烷基、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5或-OL2R6；
L1是–C(O)-或–O-；
L2是C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L2的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基任选被1至4个氟基团取代；
各L3独立地选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L3的C1-C6亚烷基任选被1至4个氟基团取代；
L4是亚芳基或杂亚芳基；
R2是H或C1-C6烷基；
R3选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、-OL3R7、-OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5 和-C(R5)2OH；
各R4独立地选自H和氟；
R5是-P(O)(OR9)2，
R6是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R7是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R8是H或C1-C4烷基；
各R9独立地选自H和C1-C6烷基；
R10是H或C1-C4烷基；
各p独立地选自1、2、3、4、5和6，且
q是1、2、3或4。
具有式(K)的化合物优选具有式(K')：
Figure 90417DEST_PATH_IMAGE005
其中：
P1选自H，任选被COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代的C1-C6烷基；
P2选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
条件是P1和P2中的至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RB选自H和C1-C6烷基；
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选被1至4个独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2的取代基取代；
各p独立地选自1、2、3、4、5和6；且
q选自1、2、3和4。
在式(K')的一些实施方案中：P1选自任选被COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代的C1-C6烷基；
P2选自C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RB是C1-C6烷基；
X是共价键；
L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选被1至4个独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基取代；
各p独立地选自1、2和3；
q选自1和2。
用于本发明的具有式(K)的优选化合物是3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸，或化合物‘K1’：
Figure 22600DEST_PATH_IMAGE006
该化合物可以作为游离碱或药学上可接受的盐（例如精氨酸盐）的形式使用[120]。
F. 微粒
微粒也可以用作本发明中的佐剂。优选由生物可降解且无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)与丙交酯乙交酯共聚物形成的微粒(即直径为～100nm至～150μm，更优选直径 ～200nm至～30μm，最优选直径～500nm至～10μm的颗粒)，其任选经处理以具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂诸如CTAB处理)。
佐剂组合
组合中也可以包含上面所列的个别佐剂。例如，可以使用氢氧化铝和磷酸铝佐剂的组合。类似地，可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。
特别优选的佐剂组合是不溶性金属盐(例如铝盐，诸如氢氧化铝)和TLR激动剂(例如，人TLR7激动剂，诸如上述鉴定的化合物‘K1’)，如参考文献5和97中所公开。所以，具体而言，所述佐剂选自：
- 铝盐，特别是氢氧化铝和磷酸铝；
- 人TLR激动剂，特别是TLR7激动剂；和
- 其混合物。
TLR激动剂优选吸附至金属盐，且金黄色葡萄球菌抗原也可以被吸附至金属盐。
本发明的包含吸附至金属盐的TLR激动剂的组合物还可包含缓冲剂(例如， 磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)。然而，当此类组合物包含磷酸盐缓冲剂时，优选的是，所述缓冲剂中的磷酸根离子的浓度应当小于50mM，例如<40mM、<30mM、<20mM、<10mM或<5mM或1-15mM。组氨酸缓冲剂是优选的，例如1-50mM、5-25mM或约10mM。
组合物可包含羟基氧化铝(aluminium oxyhydroxide)和羟基磷酸铝两者的混合物，且TLR激动剂可以被吸附至这些盐中的一种或两种。
如上所提及，0.85mg/剂量Al+++的最大值是优选的。因为包含TLR激动剂可以改善铝盐的佐剂效果，则本发明有利地允许更低量的Al+++/每剂量，并且所以组合物可以有用地包含10至250μg/每单位剂量的Al+++。目前儿科疫苗通常包含至少300μg Al+++。在浓度方面，组合物可以具有10至500 μg/ml，例如10-300μg/ml、10-200μg/ml或10-100μg/ml的Al+++浓度。
通常，当组合物同时包含TLR激动剂和铝盐两者时，激动剂与Al+++的重量比将小于5:1，例如小于4:1，小于3:1，小于2:1，或小于1:1。因此，例如，以0.5mg/ml的Al+++浓度，TLR激动剂的最大浓度将为1.5mg/ml。但可以使用更高或更低水平。
当组合物包含TLR激动剂和不溶性金属盐时，优选的是所述组合物中至少50％(以质量计)的激动剂吸附至所述金属盐，例如>60%、>70%、>80%、>85%、>90%、>92%、>94%、>95%、>96%、>97%、>98%、>99%或甚至100％的激动剂吸附至所述金属盐。
因此，在一个实施方案中，本发明使用免疫原性组合物，其包含：
▪ 氢氧化铝佐剂；
▪ 具有式(K)的TLR7激动剂，诸如化合物K1；
▪ 第一多肽，其包含SEQ ID NO:6，或修饰的氨基酸序列，其通过最多达5个单一氨基变化而与SEQ ID NO:6不同，条件是所述修饰的序列可以引发结合由SEQ ID NO:6组成的多肽的抗体；
▪ 第二多肽，其包含SEQ ID NO:13，或修饰的氨基酸序列，其通过最多达5个单一氨基变化而与SEQ ID NO:13不同，条件是所述修饰的序列可以引发结合由SEQ ID NO:13组成的多肽的抗体；
▪ 第三多肽，其包含SEQ ID NO:31，或修饰的氨基酸序列，其通过最多达5个单一氨基变化而与SEQ ID NO:31不同，条件是所述修饰的序列可以引发结合由SEQ ID NO:31组成的多肽的抗体；
▪ 第四多肽，其包含SEQ ID NO:33，或修饰的氨基酸序列，其通过最多达5个单一氨基变化而与SEQ ID NO:33不同，条件是所述修饰的序列可以引发结合由SEQ ID NO:33组成的多肽的抗体；和
▪ 第五多肽，其包含SEQ ID NO:45，或修饰的氨基酸序列，其通过最多达5个单一氨基变化而与SEQ ID NO:45不同，条件是所述修饰的序列可以引发结合由SEQ ID NO:43组成的多肽的抗体；和，
其中所述TLR7激动剂和/或所述多肽中的至少一种被吸附至所述氢氧化铝佐剂。
例如，如本文别处更详细解释：所述第一多肽可以包含SEQ ID NO:34；所述第二多肽可以包含SEQ ID NO:13；所述第三多肽可以包含SEQ ID NO:40；所述第四多肽可以包含SEQ ID NO:36；且第五多肽可以包含SEQ ID NO:45，其任选通过最多达3个氨基酸置换修饰(除了在作为SEQ ID NO:44中的X的位置以外)。因此，所述组合物可以使用含有SEQ ID NO:37、27、38、39和45的五种多肽的混合物(除了SEQ ID NO:45可以通过最多达3个氨基酸置换进行修饰，如上所讨论)。
化学基团
除非别处具体定义，本文讨论的化学基团当用于本说明书中时具有以下含义：
术语"烷基"包括不饱和烃残基，包括：
- 最多达10个原子(C1-C10)，或最多达6个原子(C1-C6)或最多达4个原子(C1-C4)的直链基团。此类烷基基团的实例包括，但不限于，C1-甲基、C2-乙基、C3-丙基和C4-正丁基。
- 3至10个原子(C3-C10)，或最多达7个原子(C3-C7)，或最多达4个原子(C3-C4)的支链基团。此类烷基基团的实例包括，但不限于，C3-异丙基、C4-仲丁基、C4-异丁基、C4-叔丁基和C5-新戊基。
术语“亚烷基”是指衍生自烷基基团的二价烃基团，并且应当根据上述定义来解释。
术语“烯基”包括单不饱和烃残基，包括：
- 2至6个原子(C2-C6)的直链基团。此类烯基基团的实例包括，但不限于，C2-乙烯基、C3-1-丙烯基、C3-烯丙基、C4-2-丁烯基
- 3至8个原子(C3-C8)的支链基团。此类烯基基团的实例包括，但不限于，C4-2-甲基-2-丙烯基和C6-2,3-二甲基-2-丁烯基。
术语亚烯基是指衍生自烯基基团的二价烃基团，并且应当根据上述定义来解释。
术语“烷氧基”包括O-连接的烃残基，包括：
- 1至6个原子(C1-C6)或1至4个原子(C1-C4)的直链基团。此类烷氧基基团的实例包括，但不限于，C1-甲氧基、C2-乙氧基、C3-正丙氧基和C4-正丁氧基。
- 3至6个原子(C3-C6)或3至4个原子(C3-C4)的支链基团。此类烷氧基基团的实例包括，但不限于，C3-异丙氧基和C4-仲丁氧基和叔丁氧基。
卤素选自Cl、F、Br和I。卤素优选为F。
术语“芳基”包括含有6至10个碳原子的单环或稠合芳环系统；其中，除非另有说明，芳基的每次出现时可任选地被最多达5个取代基取代，所述取代基独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、卤素、CN、COOR14、CF3和NR14R15；如上所定义。通常，芳基将任选地被1、2或3个取代基取代。任选的取代基选自上述那些。合适的芳基基团的实例包括苯基和萘基(各自如上所述任选地被取代)。亚芳基是指衍生自芳基基团的二价烃基团，并且应当根据上述定义来解释。
术语“杂芳基”包括5、6、9或10元单环或双环芳环，其含有1或2个N原子和且任选NR14原子，或一个NR14原子和S或O原子，或者一个S原子或一个O原子；其中，除非另有说明，所述杂芳基可任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、卤素、CN、COOR14、CF3和NR14R15；如上所定义。合适的杂芳基基团的实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚、苯并咪唑基、苯并三唑基、喹啉基和异喹啉基(任选地如上所述被取代)。杂亚芳基是指衍生自杂芳基基团的二价烃基团，并且应当根据上述定义来解释。
术语“杂环基”是C-连接或N-连接的3至10元非芳族、单环或双环，其中所述杂环烷基环含有(当可能时)：1、2或3个独立地选自N、NR14、S(O)q和O的杂原 子；并且所述杂环烷基环任选地含有(当可能时)：1或2个双键，并且碳原子上任 选地被独立地1或2个取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、CN、CF3、卤素、COOR14、NR14R15和芳基。
上文中，定义R14和R15独立地选自H和(C1-C6)烷基。
当结构式用通过未指定的或“浮动的”键连接至分子核心的取代基定义时，例如，关于式(C)的情况中的基团P3，该定义涵盖所述未指定的取代基连接至所述浮动的键定位的环上的任何原子、同时符合该原子的化合价的情况。
在可以互变异构形式(即，以酮或烯醇形式)存在的本发明的化合物的情况下，例如式(C)或(H)的化合物，提及具体化合物任选包括所有此类互变异构形式。
一般原则
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。此类技术在文献中已详细解释，参见例如参考文献121-128等。
上文使用“GI”编号。GI编号，或“GenInfo标识符”，是当将序列添加至其数据库时连续分配至由NCBI处理的每个序列记录的一系列数位。GI编号与序列记录的登录号没有任何相似性。当更新序列(例如，用于校正，或添加更多注释或信息)时，则其接收新的GI编号。因此，与给定GI编号相关的序列从不改变。
当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。此类表位可以凭经验确定(例如，使用PEPSCAN [129，130]或类似方法)，或可以预测它们(例如，使用Jameson-Wolf抗原性指数[131]、基于矩阵的方法[132]、MAPITOPE[133]、TEPITOPE[134，135]、神经网络[136]、OptiMer & EpiMer[137，138]、ADEPT[139]、Tsites[140]、亲水性[141]、抗原性指数[142]或参考文献143-147中公开的方法等)。表位是由抗体或T-细胞受体的抗原结合位点识别且与之结合的抗原的部分，并且它们也可以被称作“抗原决定簇”。
当省略抗原“结构域”时，这可以涉及省略信号肽、胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指，例如，x±10％。
提到两种氨基酸序列之间的百分比序列同一性意指，当比对时，氨基酸的百分比在比较两种序列中是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域已知的软件程序(例如参考文献148的7.7.18部分中所述的程序)来确定。优选的比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法确定，其使用仿射缺口搜索，缺口开放罚分为12且缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。参考文献149中公开了Smith-Waterman同源性搜索算法。理想地在序列的整个长度计算与任何特定序列(例如，与SEQ ID)的百分比同一性。
可以通过本领域中已知的任何方法，包括表面等离振子共振、等温滴定量热法、竞争性结合测定法、热转变测定法等，测定结合亲和力。尽管使用不同方法的绝对数字可能变化，设想测定一种蛋白相对于另一种蛋白的测定相对结合亲和力不应当依赖于使用的方法。
本发明使用的含磷佐剂可以以各种质子化和去质子化形式存在，这取决于周围环境的pH，例如溶解它们的溶剂的pH。因此，尽管可以举例说明具体形式，但意欲这些举例说明仅仅是代表性的，并且不限于特定的质子化或去质子化形式。例如，在磷酸酯基团的情况下，这已经被举例说明为-OP(O)(OH)2，但该定义包括可以在酸性条件下存在的质子化形式[OP(O)(OH2)(OH)]+和-[OP(O)(OH)2]2+以及可以在碱性条件下存在的去质子化形式-[OP(O)(OH)(O)]-和[OP(O)(O)2]2-。
化合物可以作为药学上可接受的盐存在。因此，化合物(例如佐剂)可以以其药学上可接受的盐(即生理或毒理上可耐受的盐，当适当时，其包括药学上可接受的碱加成盐和药学上可接受的酸加成盐)的形式使用。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
用于实施本发明的方式
SpAkR突变体
SpA是金黄色葡萄球菌中的一种关键毒力因子，并且其通过干扰细菌的调理吞噬清除和通过去除适应性免疫应答而起作用。野生型序列SEQ ID NO:43包含如上所示的五个Ig-结合结构域(IgBD)，并且已知突变这些结构域内的氨基酸残基以废除Fc/Fab结合活性，同时保留免疫原性，例如参见参考文献错误！书签未定义，其用Lys-Lys替代Gln-Gln二肽和/或用Ala-Ala替代Asp-Asp二肽。
已经产生了新的突变型SpA，其中将另外的Gln-Gln二肽突变为Lys-Arg。基于参与Ig结合的额外位点的生物信息学分析和预测鉴定该二肽。具体而言，假设SEQ ID NO:43的残基96和97参与Ig结合。在早先的工作中忽视了该位点，因为它在保守的IgBD之外，并且不是解析的结构的部分。新的突变体被称为‘SpAkR’，并且它具有以下氨基酸序列，其中将相对于先前‘SpAkkAA’突变体的额外QQ/KR置换加框标注：
Figure 366994DEST_PATH_IMAGE007
已经证实所述SpAkR突变体相对于已知突变体对于免疫球蛋白具有降低的亲和力，同时保留免疫原性。
CD和DSC分析显示，KR突变体的引入没有实质上影响SpA的结构。SpAkkAA和SpAKR的CD光谱是相同的。来自DSC分析的Tm1和Tm2如下。Tm1：SpAkkAA 48.9℃；SpAKR 51.1℃。Tm2：SpAkkAA 68.1℃；SpAKR 68.0℃。
使用表面等离振子共振测试野生型SpA以及SpAkkAA和SpAkR突变体对于人IgG、IgA和IgM的亲和力。将蛋白固定在传感器芯片上，并且将人IgG、IgA和IgM用作被分析物。两种突变体与野生型相比均展现大大降低的结合能力，但尽管SpAkkAA显示与IgG和IgM的残余结合，但对于SpAkR没有看到与任何免疫球蛋白的可检测的相互作用。SpAkkAA对于IgG和IgM的残余结合活性非常低(比野生型低11-12倍)，但是可重复的并且是浓度依赖性的。
通过全血存活测定(WBA)评价在SpA (WT、SpAkkAA和SpAkR)存在的情况下的金黄色葡萄球菌的存活。将1ml来自健康供体的全血(补充有50mg/l来匹卢定抗凝剂(10µl/ml血液))与0.15µM SpA或与PBS在37℃孵育15分钟，然后添加BHI中稀释的约2.5 x 105 CFU金黄色葡萄球菌USA300 LAC (OD600, 0.4)。将该培养物的等分试样铺板在BHI-琼脂上以测定输入CFU。在37℃在振荡(180 RPM)下孵育2小时之后，在冰上以0.5%皂苷-PBS裂解嗜中性粒细胞3分钟。通过在BHI中连续十倍稀释和铺板在营养琼脂板上而测定活细菌的数目。将板在37℃孵育18小时之后计数菌落。对照是与PBS预孵育的血液样品。与孵育后CFU相比基于输入CFU计算相对存活率。一式三份进行实验；实验之间变化很小。
在WBA中，和与野生型SpA (p<0.001, Mann-Whitney)或与SpAkkAA (p<0.05)孵育相比，当与SpAKR孵育时，人全血中的金黄色葡萄球菌的相对存活率相当低。与SpAwt孵育导致金黄色葡萄球菌存活率与对照相比增加(p<0.001)，而与SpAkkAA孵育的WBA中的存活率与对照相当。与SpAkR孵育将存活率降低至对照的存活率的约一半。
发现用氢氧化铝佐剂配制的SpAkkAA或SpAkR自身在小鼠中免疫原性弱，但包含吸附的TLR7激动剂‘K1’显著增加了抗体滴度。因为与SpA免疫相关的作用机制似乎主要由抗体驱动，所以这是重要的改进。
金黄色葡萄球菌疫苗
在肾脓肿模型中测试单独的SpAkR、SpAkkAA、SpAkR E结构域和与HlaH35L融合的SpAkR E结构域，其用2mg/ml(总盐)的氢氧化铝(Al-H)佐剂化。对于肌内注射，抗原各自以10µg存在于100µL剂量中。
以14天时间间隔用引发-加强注射肌内(IM)免疫四或五周龄小鼠(CD1)。对照小鼠接受等量单独的佐剂。从接种前和后的小鼠收集血清，以记录针对组合疫苗中的各蛋白组分的血清抗体滴度。通过Luminex技术使用缀合至微球的重组疫苗抗原测量这些滴度。
肾脓肿模型：在第24天通过静脉内注射亚致死剂量的金黄色葡萄球菌Newman菌株(~ 2-6 x107 CFU)而攻击免疫的动物。在第28天，将小鼠安乐死，取出肾脏，并在2 mL PBS中均质化，并一式两份接种于琼脂培养基上，以测定菌落形成单位(CFU)。
与单独的佐剂相比，用单独的SpAKR、SpAkkAA、SpAkR E结构域和融合至HlaH35L的SpAkR E结构域接种后获得log10 CFU/ml的可比较的下降(约1 log下降)。
组合金黄色葡萄球菌疫苗
制备5-价和6-价疫苗。5-价疫苗包含由SEQ ID NO:7、8、27和32组成的抗原(FhuD2、Sta011、Hla-H35L和EsxAB)；6价疫苗还包含SpAkR突变体。所述疫苗用以下佐剂化：(ⅰ)氢氧化铝，Al-H；(ii) Al-H + 吸附的TLR7激动剂K1；或(iii)水包油乳液MF59。以2mg/ml(总盐)使用Al-H，K1以50µg/每剂量存在，且以1:1体积比混合MF59与抗原。对于肌内注射，抗原各自以10µg存在于100µL剂量中。
以14天时间间隔用引发-加强注射免疫四或五周龄小鼠(CD1)。对照小鼠接受等量单独的佐剂。从接种前和后的小鼠收集血清，以记录针对组合疫苗中的各蛋白组分的血清抗体滴度。通过Luminex技术使用缀合至微球的重组疫苗抗原测量这些滴度。
肾脓肿模型：在第24天通过静脉内注射亚致死剂量的金黄色葡萄球菌(~ 2-6x107 CFU，其中具体接种量根据攻击菌株而变化)而攻击免疫的动物。在第28天，将小鼠安乐死，取出肾脏，并在2 mL PBS中均质化，并一式两份接种于琼脂培养基上，以测定菌落形成单位(CFU)。还处理肾脏用于组织病理学。
腹膜炎模型：分别地，在第24天通过腹膜内注射致死剂量的金黄色葡萄球菌(~ 2-5x108 CFU)而攻击免疫的动物，然后每天监测，持续14天。
皮肤感染模型：通过在剃毛的右侧腹用2x107 CFU金黄色葡萄球菌LAC菌株(USA300克隆，这是全世界最重要的克隆之一，并且与社区获得性皮肤感染高度相关)皮下注射而接种免疫的小鼠。经7天的过程以24小时时间间隔监测肿块和脓肿形成(大小和皮肤坏死(dermonecrosis))。使用图像分析软件测定脓肿的大小和相关覆盖的皮肤坏死病变。在接种后第7天收获小鼠皮肤和脓肿用于CFU计数。该模型仅与Al-H/K1佐剂一起使用。
结果如下：
Figure 710644DEST_PATH_IMAGE008
*与对照相比，p<0.05；**与对照相比，p<0.01。
这些结果表明，突变型SpAkR在两种模型中均改善了5-价组合-1(Combo-1)产物。此外，使用Al-H/K1佐剂观察到了最佳结果。引人注目的是，肾脓肿模型中的结果，用Al-H/K1的6-价疫苗近似于灭菌(sterility)。
在腹膜炎模型中，当与阴性对照(参见上表)相比时，且还当与5-价Al-H疫苗相比时，具有Al-H/K1的6-价疫苗在统计学上是更优异的。在脓肿模型中，当与阴性对照(参见上表)、5-价Al-H疫苗和5-价Al-H/K1疫苗相比时，具有Al-H/K1的6-价疫苗在统计学上是更优异的，因此显示突变型SpA的贡献超过仅仅由于K1激动剂导致的增强。
在皮肤感染模型中，5-价和6-价疫苗均显著减少脓肿形成和CFU计数(参见上表)。接种小鼠中不存在皮肤坏死，而这在接受单独的佐剂(表中的‘N/A’)的所有小鼠中都观察到。此外，通过在疫苗中包括SpAkR而显著改善CFU减少，并且观察到更少的小鼠具有宏观水平的可辨认的脓肿(71％相比于88％)。
还针对三种佐剂比较了抗-SpA滴度。使用Al-H或MF59的中值滴度没有显著不同，但使用Al-H/K1的滴度比单独的Al-H(p=0.0047, Mann-Whitney检验)和比MF59 (p=0.01)显著更高。因此，在功能测定中表现最好的制剂是引发最高抗-SpA抗体滴度的制剂，这与以下假设一致：SpA作为疫苗抗原的活性取决于可以结合其且抑制其免疫-逃逸活性的抗体。
应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的范围和精神之内。
Figure 685553DEST_PATH_IMAGE009
Figure 901771DEST_PATH_IMAGE010
Figure 581014DEST_PATH_IMAGE011
Figure 199077DEST_PATH_IMAGE012
Figure 220254DEST_PATH_IMAGE013
序列表
<110> GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
<120> 突变型葡萄球菌抗原
<130> VN56501-WO-PCT
<140>
<141>
<150> EP 14192913.3
<151> 2014-11-12
<150> EP 14161861.1
<151> 2014-03-26
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 1
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln
1 5 10 15
Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu
35 40 45
Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu Leu Ile Met Ala Lys
50 55 60
Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp His Gln Lys Ala Ile
65 70 75 80
Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys
85 90 95
Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
100
<210> 3
<211> 302
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
Met Lys Lys Leu Leu Leu Pro Leu Ile Ile Met Leu Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser
20 25 30
Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys
35 40 45
Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu
50 55 60
Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val
65 70 75 80
Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val
85 90 95
Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr
100 105 110
Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val
115 120 125
Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys
130 135 140
Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu
145 150 155 160
Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr
180 185 190
Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe
195 200 205
Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly
210 215 220
Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr
225 230 235 240
Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys
260 265 270
Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe
275 280 285
Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
290 295 300
<210> 4
<211> 256
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn
35 40 45
Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln
65 70 75 80
Pro Asn Asn Glu Asp Met Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn
85 90 95
Arg Asn Thr Lys Thr Thr Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys
100 105 110
Asp Glu Asp Glu Gly Lys Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val
115 120 125
Lys Met Val Asp Asn Lys Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu
130 135 140
Lys Ile Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly
145 150 155 160
Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn
165 170 175
Pro Glu Val Pro Ser Tyr Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp
180 185 190
Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys
195 200 205
Ala Pro Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser
210 215 220
Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu
225 230 235 240
Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
245 250 255
<210> 5
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
Met Lys Thr Arg Ile Val Ser Ser Val Thr Thr Thr Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ser Ile Leu Met Asn Pro Val Ala Asn Ala Ala Asp Ser Asp Ile Asn
20 25 30
Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr
35 40 45
Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val
50 55 60
Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val
65 70 75 80
Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu
85 90 95
Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val
100 105 110
Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr
115 120 125
Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr
130 135 140
Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly
145 150 155 160
Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln
165 170 175
Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly
180 185 190
Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr
195 200 205
Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys
210 215 220
Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp Asn Phe Leu Asp Pro Asn
225 230 235 240
Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr
245 250 255
Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp
260 265 270
Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser
275 280 285
Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp Lys Trp Ile Asp Arg Ser
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Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn
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<210> 6
<211> 285
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 6
Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg
20 25 30
Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly
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Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu
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Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp
85 90 95
Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp
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Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp
145 150 155 160
Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr
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Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp
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Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn
225 230 235 240
Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val
245 250 255
Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met
260 265 270
Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 7
<211> 288
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 7
Met Ala Ser Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp
20 25 30
Pro Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys
35 40 45
Lys Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser
50 55 60
Lys Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly
65 70 75 80
Asp Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr
85 90 95
Ser Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val
100 105 110
Val Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu
115 120 125
Gly Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp
130 135 140
Trp Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile
145 150 155 160
Gly Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu
165 170 175
Tyr Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln
180 185 190
Ala Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys
195 200 205
Ala Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly
210 215 220
Asp Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu
225 230 235 240
Ser Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile
245 250 255
Val Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu
260 265 270
Asp Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 8
<211> 234
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 8
Met Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu
1 5 10 15
Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr
35 40 45
Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met
50 55 60
Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys
85 90 95
Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile
115 120 125
Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys
130 135 140
Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
180 185 190
Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile
195 200 205
Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 9
<211> 256
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 9
Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn
35 40 45
Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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145 150 155 160
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180 185 190
Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys
195 200 205
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210 215 220
Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu
225 230 235 240
Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
245 250 255
<210> 10
<211> 256
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 10
Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
Lys Val Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly
145 150 155 160
Asp Phe Lys Asn Ile Lys Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn
165 170 175
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Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys
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225 230 235 240
Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
245 250 255
<210> 11
<211> 256
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 11
Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn
35 40 45
Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln
65 70 75 80
Pro Asn Asn Glu Asp Met Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn
85 90 95
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Lys Leu Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
245 250 255
<210> 12
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 12
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
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50 55 60
Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp
65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys
225 230 235 240
Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr
245 250 255
Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp
260 265 270
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275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn
290
<210> 13
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 13
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp
65 70 75 80
Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala
85 90 95
Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp
195 200 205
Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe
210 215 220
Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys
225 230 235 240
Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr
245 250 255
Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp
260 265 270
Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys
275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn
290
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的替代四聚体肽”
<400> 14
Pro Ser Gly Ser
1
<210> 15
<211> 258
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 15
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu
145 150 155 160
Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp Asn Phe Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met
245 250 255
Thr Asn
<210> 16
<211> 258
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 16
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1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
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195 200 205
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Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met
245 250 255
Thr Asn
<210> 17
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 17
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys
275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn
290
<210> 18
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 18
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290
<210> 19
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 19
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275 280 285
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290
<210> 20
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 20
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100 105 110
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 21
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1 5 10 15
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<211> 63
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 22
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly
50 55 60
<210> 23
<211> 53
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 23
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu
50
<210> 24
<211> 50
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 24
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys
50
<210> 25
<211> 63
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 25
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly
50 55 60
<210> 26
<211> 53
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 26
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu
50
<210> 27
<211> 296
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 27
Met Ala Ser Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Asn Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp
35 40 45
Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile
50 55 60
Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly
65 70 75 80
Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn
85 90 95
Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr
100 105 110
Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr
115 120 125
Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser
130 135 140
Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu
145 150 155 160
Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn
165 170 175
Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro
180 185 190
Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys
195 200 205
Ala Ala Asp Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser
210 215 220
Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys
225 230 235 240
Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg
245 250 255
Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn
260 265 270
Thr Lys Asp Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp
275 280 285
Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn
290 295
<210> 28
<211> 207
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 28
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala
100 105 110
Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala
115 120 125
Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr
130 135 140
Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp
145 150 155 160
Val Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met
165 170 175
Ala Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys
180 185 190
Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 29
<211> 207
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 29
Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln
1 5 10 15
Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu
35 40 45
Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu Leu Ile Met Ala Lys
50 55 60
Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp His Gln Lys Ala Ile
65 70 75 80
Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys
85 90 95
Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro Ala Ser Gly Gly Gly Ser Met Ala
100 105 110
Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln Ser Tyr
115 120 125
Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr Arg
130 135 140
Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe Ser Arg
145 150 155 160
Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys Phe Ala
165 170 175
Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala Asp Ala
180 185 190
Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu Gln
195 200 205
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的接头肽”
<400> 30
Ala Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 205
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 31
Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe Ser
35 40 45
Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys Phe
50 55 60
Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu Gln
85 90 95
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly
100 105 110
Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp
115 120 125
Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu
130 135 140
Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu
145 150 155 160
Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp
165 170 175
His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp
180 185 190
Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 32
<211> 206
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 32
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp
100 105 110
Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys
115 120 125
Asp Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile
130 135 140
Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala
165 170 175
Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr
180 185 190
Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 33
<211> 233
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 33
Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys
1 5 10 15
Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp
35 40 45
Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met Val
50 55 60
Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr Asn
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys Pro
85 90 95
His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys Ile
100 105 110
Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile Glu
115 120 125
Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn
130 135 140
Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg
165 170 175
Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu Lys
180 185 190
Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu
195 200 205
Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser
210 215 220
Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 34
<211> 284
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 34
Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr Lys
1 5 10 15
Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg Ile
20 25 30
Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala
35 40 45
Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu Lys
50 55 60
Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu Lys
65 70 75 80
Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp Lys
85 90 95
Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp Tyr
100 105 110
Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys Ile Val
115 120 125
Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu Glu Thr
130 135 140
Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp Ala
145 150 155 160
Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr Gly
165 170 175
Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe Gly Leu
180 185 190
Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp Ala
195 200 205
Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr Ile Val
210 215 220
Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn Met
225 230 235 240
Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val Asp
245 250 255
Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met Arg
260 265 270
Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280
<210> 35
<211> 103
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 缺乏游离硫醇的任何氨基酸或不存在
<400> 35
Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala
1 5 10 15
Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp Ile Glu Ala Xaa Gln Lys
20 25 30
Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly
35 40 45
Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp His Gln Lys Ala Ile Asp
65 70 75 80
Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln
85 90 95
Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
100
<210> 36
<211> 231
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 36
Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu
1 5 10 15
Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly
20 25 30
Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp Ile Ile
35 40 45
Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met Val Ala Lys
50 55 60
Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr Asn Gly Tyr
65 70 75 80
Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys Pro His Asp
85 90 95
Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys Ile Ile Pro
100 105 110
Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe
115 120 125
Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Lys
130 135 140
Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr Ser Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg
165 170 175
Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ser
180 185 190
Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr
195 200 205
Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp
210 215 220
Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 37
<211> 287
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 37
Met Ala Ser Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro
20 25 30
Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys
35 40 45
Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys
50 55 60
Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp
65 70 75 80
Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser
85 90 95
Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val
100 105 110
Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly
115 120 125
Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp
130 135 140
Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly
145 150 155 160
Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr
165 170 175
Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala
180 185 190
Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala
195 200 205
Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp
210 215 220
Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser
225 230 235 240
Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val
245 250 255
Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp
260 265 270
Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 38
<211> 206
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 38
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp
100 105 110
Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys
115 120 125
Asp Ile Glu Ala Ala Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile
130 135 140
Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala
165 170 175
Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr
180 185 190
Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 39
<211> 234
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 39
Met Gly Ser Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu
1 5 10 15
Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr
35 40 45
Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met
50 55 60
Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys
85 90 95
Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile
115 120 125
Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys
130 135 140
Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
180 185 190
Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile
195 200 205
Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 40
<211> 205
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (132)..(132)
<223> 缺乏游离硫醇的任何氨基酸或不存在
<400> 40
Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe Ser
35 40 45
Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys Phe
50 55 60
Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu Gln
85 90 95
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly
100 105 110
Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp
115 120 125
Ile Glu Ala Xaa Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu
130 135 140
Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu
145 150 155 160
Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp
165 170 175
His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp
180 185 190
Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的免疫刺激性寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> 肌苷
<400> 41
ncncncncnc ncncncncnc ncncnc 26
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的阳离子寡肽"
<400> 42
Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys
1 5 10
<210> 43
<211> 516
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 43
Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro
20 25 30
Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr
35 40 45
Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
50 55 60
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
65 70 75 80
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln
85 90 95
Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys
130 135 140
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
145 150 155 160
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
165 170 175
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
180 185 190
Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln
195 200 205
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe
210 215 220
Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
225 230 235 240
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu
245 250 255
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn
260 265 270
Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
275 280 285
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys
290 295 300
Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu
305 310 315 320
Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys
325 330 335
Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys
340 345 350
Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys
355 360 365
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys
370 375 380
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys
385 390 395 400
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys
405 410 415
Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn
420 425 430
Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp
435 440 445
Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val
450 455 460
Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val
485 490 495
Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg
500 505 510
Arg Arg Glu Leu
515
<210> 44
<211> 291
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(35)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(69)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (95)..(96)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (126)..(127)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (153)..(154)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (184)..(185)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (211)..(212)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (242)..(243)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (269)..(270)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<400> 44
Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 45
<211> 291
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 45
Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 46
<211> 291
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (60)..(61)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<400> 46
Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn
115 120 125
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130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 47
<211> 291
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 47
Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 48
<211> 292
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 48
Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu
1 5 10 15
Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
20 25 30
Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn
50 55 60
Phe Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro
65 70 75 80
Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala
85 90 95
Ala Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn
100 105 110
Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys
115 120 125
Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln
130 135 140
Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala
145 150 155 160
Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
165 170 175
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
180 185 190
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
195 200 205
Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
210 215 220
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
225 230 235 240
Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
245 250 255
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro
260 265 270
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
275 280 285
Gln Ala Pro Lys
290
<210> 49
<211> 291
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(35)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (60)..(61)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(69)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (95)..(96)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (126)..(127)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (153)..(154)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (184)..(185)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (211)..(212)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (242)..(243)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (269)..(270)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<400> 49
Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa
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Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
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Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
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245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 50
<211> 67
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(35)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (60)..(61)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<400> 50
Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
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Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe
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65
<210> 51
<211> 67
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 除了Gln以外的任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(35)
<223> 除了Asp以外的任何氨基酸
<400> 51
Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
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35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe
50 55 60
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65
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<211> 67
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 52
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<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 53
Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
Phe Asn Lys Asp
65
<210> 54
<211> 67
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 54
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
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35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp
65

Claims (11)

1.突变型SpA抗原，其如SEQ ID NO:48的氨基酸序列所示。
2.免疫原性组合物，其包含根据权利要求1所述的突变型SpA抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述佐剂选自：
- 铝盐；
- 人TLR激动剂；
- 水包油乳液；
- 皂苷制剂；
- LPS的无毒衍生物；和
- 其混合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述铝盐选自氢氧化铝和磷酸铝。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述TLR激动剂是TLR7激动剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述TLR7激动剂是具有下式(K)的化合物：
Figure 731487DEST_PATH_IMAGE001
(K)
其中：
R1是H、C1-C6烷基、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5或-OL2R6；
L1是–C(O)- 或–O-；
L2是C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L2的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基任选被1至4个氟基团取代；
各L3独立地选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L3的C1-C6亚烷基任选被1至4个氟基团取代；
L4是亚芳基或杂亚芳基；
R2是H或C1-C6烷基；
R3选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、-OL3R7、-OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5和-C(R5)2OH；
各R4独立地选自H和氟；
R5是-P(O)(OR9)2，
R6是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R7是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R8是H或C1-C4烷基；
各R9独立地选自H和C1-C6烷基；
R10是H或C1-C4烷基；
各p独立地选自1、2、3、4、5和6，且
q是1、2、3或4。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述TLR7激动剂是3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸(K1)。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的组合物，其中所述佐剂包含吸附至铝盐的人TLR激动剂。
10.根据权利要求1所述的抗原或根据权利要求2至9中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所金黄色葡萄球菌感染是在人中。
CN201580014701.3A 2014-03-26 2015-03-24 突变型葡萄球菌抗原 Active CN106103469B (zh)

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