MX2008015814A

MX2008015814A - Uso de alfa-toxina para tratar y prevenir infecciones por staphylococcus.

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Publication number: MX2008015814A
Application number: MX2008015814A
Authority: MX
Inventors: Kimberly L Taylor; Ali I Fattom
Original assignee: Nabi Biopharmaceuticals
Priority date: 2006-06-12
Filing date: 2007-02-27
Publication date: 2009-01-12
Also published as: CN101466406B; TW200744632A; CA2655133C; AU2007259415A1; JP2009539979A; AR059688A1; CA2655133A1; EP2719397A1; KR20090019007A; WO2007145689A1; NZ597046A; JP2013151526A; EP2043690A1; CN102743747A; AU2007259415B2; NZ574057A; CN101466406A; US20090053235A1; US20080131457A1

Abstract

Se proporcionan vacunas que comprenden un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y un portador aceptable farmacéuticamente, y son útiles para tratar y prevenir infecciones. El antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede contener al menos dos alteraciones que reducen su toxicidad y/o pueden ser conjugados o co-administrados con otro antígeno bacteriano. Las vacunas pueden contener uno o más antígenos bacterianos diferentes. También se proporcionan composiciones de anticuerpos que comprenden anticuerpos para alfa-toxina y opcionalmente uno o más antígenos bacterianos diferentes, y son útiles para tratar y prevenir infecciones.

Description

USO DE ALFA-TOXINA PARA TRATAR Y PREVENIR INFECCIONES POR STAPHYLOCOCCUS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención concierne al tratamiento y prevención de infecciones bacterianas. En particular, la invención proporciona composiciones y métodos para tratar y prevenir infecciones por Staphylococcus aureus (S. aureus) y otras infecciones bacterianas, incluyendo infecciones asociadas con cepas de S. Aureus resistentes a meticilina tal como las que producen alfa-toxina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La bacteria Staphylococcus aureus, a menudo mencionada como "Staph" , "Staph. Aureus", o "S. Aureus", comúnmente coloniza la nariz y la piel de humanos saludables. Aproximadamente 20 - 30 % de la población está colonizada por S. Aureus en cualquier momento dado. Esta bacteria a menudo causa infecciones menores, tales como pústulas y furúnculos, en individuos saludables pero también causa infecciones generalizadas. Se consideran los patógenos oportunistas. Normalmente, las barreras mucósicas y epidérmicas (piel) protegen contra infecciones por S. Aureus. La interrupción de estas barreras naturales como un resultado de daños - tales como quemaduras, traumatismos o procedimientos quirúrgicos - dramáticamente incrementa el riesgo de infección. Enfermedades que comprometen el sistema inmune (por ejemplo, diabetes, enfermedad renal terminal, cáncer) también incrementan el riesgo de infección. Las infecciones oportunistas por S. Aureus pueden volverse muy serias, causando endocarditis, bacteremia y osteomielitis, las cuales a menudo dan como resultado mortalidad o morbilidad severas. S. aureus expresa a numerosos factores de virulencia incluyendo polisacáridos capsulares y toxinas proteínicas. Un importante factor de virulencia es la alfa-toxina (alfa-hemolisina) , una exo-proteína hemolítica y formadora de poro producida por la mayoría de las cepas patógenas de S. Aureus. Los estudios han mostrado que los glóbulos blancos humanos, eritrocitos, plaquetas y células endoteliales son particularmente susceptibles a los efectos hemolíticos de alfa-toxina. Dichos estudios establecen la relevancia de alfa-toxina para la patofisiología humana. Se ha mostrado que la inmunidad anti-alfa-toxina protege contra los efectos perjudiciales de la toxina, pero el diseño de vacunas contra alfa-toxina persiste siendo un reto significativo. Esto es así, a causa de que la necesidad de inducir una respuesta inmune protectora debe de ser equilibrada contra la necesidad de evitar causar enfermedad con relación a la actividad biológica de la toxina. Aunque las modificaciones moleculares y químicas de alfa-toxina, según los informes recibidos, puede reducir su toxicidad, ninguna modificación reportada individualmente elimina totalmente la toxicidad de alfa-toxina. Adicionalmente , existe un riesgo real que la alfa-toxina modificada debe revertir a su estado precoz más tóxico. Esto hace inadecuada cualquier alfa-toxina modificada individualmente para uso en una vacuna humana. Por consiguiente, persiste una necesidad en el arte por composiciones y métodos que puedan conferir inmunidad seguramente a la alfa-toxina y a la bacteria S. Aureus . La presente invención satisface esta y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona vacunas para tratar infecciones por S. Aureus, métodos de tratar y de prevenir infecciones por S. Aureus, composiciones de anticuerpos (incluyendo) composiciones de inmunoglobulina (IVIG) intravenosa, y métodos de elaborar las composiciones del anticuerpo. En una modalidad se proporcionó una composición de antígeno Staphylococcal pentavalente que comprende (i) un antígeno de S. Aureus de Tipo 5, (ii) un antígeno de S. Aureus de Tipo 8, (iii) un antígeno de S. Aureus 336, (iv)un antígeno de alfa-toxina de S. Aureus y (v)un antígeno de leucocidina Staphylococcal. En una modalidad, al menos uno de los antígenos Staphylococcal es un antígeno protector. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. Aureus está conjugado a al menos uno de los antígenos de tipo 5, antígeno de Tipo 8, antígeno 336 o antígeno de leucocidina. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina contiene al menos dos alteraciones, con relación a alfa- toxina de S. Aureus de tipo nativo, que reduce la toxicidad. En una modalidad, el antígeno de leucocidina Staphylococcal es seleccionado del grupo que consiste de sub-unidades de antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad de gama-hemolisina . En una modalidad, el antígeno de leucocidina Staphylococcal es seleccionado del grupo que consiste de (i) sub-unidad LukF-PV de PVL de S. Aureus, (ii)una sub-unidad LukS-PV de PVL de S. Aureus, (iii)una sub-unidad gama-hemolisina de HlgA de S. Aureus, (iv) una sub-unidad gama-hemolisina de HlgB de S. Aureus; (v) una sub-unidad de gama-hemolisina de HlgC de S. Aureus, (vi)LukD de S. Aureus, (vii)LukE de S. Aureus, (viii)LukM de S. Aureus, (ix) una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. Aureus, (x) una sub-unidad LukF-I de S. Intermedius; y (xi)una sub-unidad LukS-I de S. Intermedius . En una modalidad, la composición comprende adicionalmente uno o más antígenos bacterianos adicionales, tales como el antígeno Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de PS1 de S. Epidermidis, GP1 de S. Epidermidis , ácido lipoteicoico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva que reconocen a componentes de superficie microbiana (MSCRA M) , y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, se proporciona una composición que comprende un antígeno de alfa- toxina de S. Aureus y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde el antígeno de alfa- toxina contiene al menos dos alteraciones, en relación con la alfa- toxina de S. Aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad. En una modalidad, al menos una de las alteraciones es una alteración química. En otra modalidad, al menos una de las alteraciones es alteración molecular. En aún otra modalidad, al menos una de las alteraciones es una alteración química y al menos una es una alteración molecular. En una modalidad, una alteración molecular es una sustitución, inserción o eliminación en la secuencia de aminoácidos de la alfa- toxina- de S. Aureus de tipo nativo. En una modalidad, la alteración molecular es una sustitución en la secuencia de aminoácidos de la alfa-toxina de S. Aureus de tipo nativo. En una modalidad, la sustitución tiene lugar en una localización que corresponde a His-35 de la alfa-toxina de S. Aureus de tipo nativo. En una modalidad, la sustitución es una sustitución de Arg, Lys, Ala, Leu, o Glu, por His . En una modalidad, una alteración molecular es una sustitución o eliminación en el dominio de unión amino de la alfa-toxina de S. Aureus de tipo nativo. En una modalidad, la alteración molecular es una eliminación en el dominio de unión amino de la alfa-toxina de S. Aureus de tipo nativo. En una modalidad, la alteración molecular es una eliminación de la alfa-toxina alfa de S. Aureus de tipo nativo. En otra modalidad, se proporciona una composición que comprende: (i) un antígeno de alfa-toxina alfa de S. Aureus y(ii)uno o más antígenos bacterianos adicionales diferentes del antígeno de alfa-toxina de S. Aureus. En una modalidad, al menos uno de los uno o más antígenos bacterianos adicionales es un antígeno Staphylococcal adicional seleccionado del grupo que consiste de antígenos de Tipo 5 de S. aureus, Tipo 8 de S . aureus, 336 de S. aureus, de leucocidina Staphylococcal, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie bacteriana que reconocen las moléculas proteínicas de matriz adhesiva (MSCRAMM) , y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el antígeno Staphylococcal adicional es un antígeno protector. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. aureus está conjugado a al menos uno de los uno o más antígenos bacterianos adicionales. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina contiene al menos dos alteraciones, con relación a la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad. En otra modalidad, se proporciona un método para tratar o prevenir infecciones por S. aureus que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo cualquiera de las composiciones antigénicas anteriormente mencionadas. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar un agente seleccionado del grupo que consiste de un agente anti- infeccioso, un agente antibiótico, y un agente anti-microbiano, tales como vancomicina, lusostafina o clindamicina . En una modalidad, la infección por S. aureus está asociada con un S. aureus resistente a meticilina. En una modalidad, el S. aureus resistente a meticilina produce alfa-toxina. En otra modalidad, se proporciona un método de elaborar una preparación de inmunoglobulina intravenosa específica hiper-inmune (IVIG) , que comprende (i) administrar a un sujeto cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas, (ii) cosechar plasma del sujeto, y (iii) urificar una inmunoglobulina a partir del sujeto. En una modalidad, se proporciona una composición de anticuerpo Staphylococcal pentavalente que comprenda (i) un primer anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de Tipo 5 de S. aureus, (ii)un segundo anticuerpo que enlaza específicamente al antígeno de Tipo 8 de S . aureus, (iii)un tercer anticuerpo que enlaza específicamente al antígeno 336 de S. aureus, (iv) un cuarto anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y (v)un quinto anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal . En una modalidad, al menos uno del primer hasta el quinto anticuerpos es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, al menos uno del primer hasta el quinto anticuerpos es un anticuerpo neutralizante. En una modalidad, el quinto anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de las sub-unidades del antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad gama-hemolisina . En una modalidad, el quinto anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de (i) una sub-unidad LukF-PV de PVL de S. aureus, (ii)una sub-unidad LukS-PV de PVL de S. aureus, (iii)una sub-unidad HlgA de gama-hemolisina de S. aureus, (iv)una sub-unidad HlgB de gama-hemolisina de S. aureus; (v) una sub-unidad HlgC de gama-hemolisina de S. aureus, (vi)LukD de S. aureus, (vii)LukE de S. aureus, (viii) LukM de S. aureus, (ix)una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. aureus, (x)una sub-unidad LukF-I de S. intermedius; y (xi) una sub-unidad LukS-I de S. intermedius . En otra modalidad, se proporciona una composición de anticuerpo protector, que comprende (i) un primer anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y (ii)al menos un segundo anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno bacteriano diferente del antígeno de alfa-toxina de S. aureus mencionado. En una modalidad, al menos uno del primer y segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, al menos uno del primer y segundo anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En una modalidad, al menos uno del al menos un segundo anticuerpo enlaza específicamente a un anticuerpo Staphylococcal adicional seleccionado del grupo que consiste de antígenos de Tipo 5 de S . aureus, de Tipo 8 de S. aureus, 336 de S. aureus, de leucocidina de S. aureus, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, ácido lipoteicoico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva que reconocen a componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) . En una modalidad al menos uno del al menos un segundo anticuerpo específicamente enlaza al antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de sub-unidades del antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad de gama-hemolisina . EN una modalidad, al menos uno del al menos un segundo anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de (i) una sub-unidad LukF-PV de PVL de S. aureus, (ii) una sub-unidad LukS-PV de PVL de S. aureus, (iii) una sub-unidad HlgA de gama-hemolisina de S. aureus, (iv)una sub-unidad HlgB de gama-hemolisina de S. aureus; (v)una sub-unidad HlgC de gama-hemolisina de S. aureus, (vi)LukD de S. aureus, (vii)LukE de S. aureus, (viii)LukM de S. aureus, (ix)una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. aureus, (x)una sub-unidad LukF-I de S. intermedius; y (xi) una sub-unidad LukS-I de S. intermedius . En una modalidad, la composición comprende una cantidad sub-óptima de dicho primer anticuerpo y una cantidad sub-óptima de dicho segundo anticuerpo. En una modalidad, la composición es preparada por medio de un método que comprende (a) administrar (i) un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y (ii)uno o más antígenos bacterianos adicionales diferentes al antígeno de alfa-toxina de S. aureus mencionado a un sujeto humano, (b) cosechar plasma de dicho sujeto, y (c) purificar inmunoglob lina de dicho sujeto. En una modalidad, el método usa el antígeno de alfa-toxina de S. aureus conjugado a al menos uno de los uno o más antígenos bacterianos. En una modalidad, el método usa el antígeno de alfa-toxina de S. aureus que contenga al menos dos alteraciones, con relación a la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad. En una modalidad, la composición es preparada por medio de un método que comprende (a) seleccionar un sujeto humano al que no haya sido administrado un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y un antígeno bacteriano adicional diferente del antígeno de alfa-toxina de S. aureus adicional, (b) cosechar plasma de dicho sujeto, y (c) purificar inmunoglobulina de dicho sujeto. En otra modalidad se proporciona un método para tratar o prevenir la infección por S. aureus, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo cualquiera de las composiciones de anticuerpo anteriormente mencionadas. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar un agente seleccionado del grupo que consiste de un agente anti- infeccioso, un agente antibiótico, y un agente anti-microbiano, tal como vancomicina, lisostafina o clindamicina . En una modalidad, la infección por S. aureus está asociada con S. aureus resistente a meticilina. En una modalidad, la infección por S. aureus produce alf -toxina. En otra modalidad, se proporciona un método de neutralizar la infección por PVL de S. aureus que comprende administrar a un paciente en necesidad de éste, una composición que comprende (i) un antígeno de leucocidina Staphylococcal o (ii) un anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal . En otra modalidad se proporciona un método de neutralizar la infección por leucocidina Staphylococcal que comprende administrar a u paciente en necesidad de ésta una composición que comprenda (i) una sub-unidad del antígeno de PVL de S. aureus o (ii)un anticuerpo que enlaza específicamente a una sub-unidad del antígeno de PVL de S. aureus . BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA La Figura 1 es una inmunodifusión de proteínas de alfa-toxina con anti-ALD/H35K policlonal de conejo. A: muestras de proteína de antígenos de toxina ( (pocilios externos) ; Banda superior: antígeno á 200 µg/ml; Banda inferior: antígeno a 100 µg/ml ; 1: alfa-toxina, WT; 2rALD/H35K; 3 : rALD ; 4: rH35K; Pocilios centrales: suero de conejo (anti-rALD/H35K) DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona vacunas para tratar infecciones por S. aureus, métodos de tratar y de prevenir infecciones por S. aureus, composiciones de anticuerpos (incluyendo composiciones de IVIG) , y métodos de elaborar composiciones de anticuerpos. Al discutir estos aspectos de la invención, el uso de "un, una" (antes de consonante) , "un, una" (antes de vocal) y "el, la" significan "uno o más" a menos que se especifique de otra manera. Comúnmente se aprecia que los polisacáridos bacterianos (PS) son antígenos independientes de células T y, como tales, cuando se administran solos no provocan niveles significativos de anticuerpos en poblaciones naturales y en niños pequeños, es decir, no activan una respuesta inmune anamnésica. Similar a la vasta mayoría de polisacáridos bacterianos, PS1 de S. epidermidis solo (sin conjugar a una proteína) no provoca una respuesta inmune del anticuerpo específico. No obstante por medio de polisacáridos que se conjugan químicamente a proteínas (PR) , los polisacáridos adquieren propiedades de antígenos dependientes de células T, tales como memoria inmunológica y de respuesta de IgG de larga duración. La adecuabilidad de proteínas para funcionar como proteínas portadoras en las vacunas conjugadas PS-PR es evaluada usualmente midiendo las respuestas de anticuerpo específicas para PS .

En el caso del conjugado PSl-rALD/H35K descrito en la presente, la proteína portadora, rALD/H35K, es un antígeno clínicamente importante y los anticuerpos específicos para rALD/H35K puede neutralizar a la alfa-toxina nativa. Por consiguiente, la magnitud de la respuesta del anticuerpo anti-alfa-toxina inducida por PSl-rALD/H35K es de importancia clínica.

Composiciones de Vacunas La invención proporciona vacunas que comprenden un antígeno de alfa-toxina de S. aureus . Como se usa en la presente "antígeno de alfa-toxina de S. aureus" o "antígeno de alfa-toxina", se refiere a cualquier molécula que comprenda una porción antigénica de alfa-toxina de S. aureus, incluyendo la alfa-toxina de S. aureus de extensión total y fragmentos de la misma. Los fragmentos de alfa-toxina de S . aureus adecuados para uso en la presente invención poseen propiedades antigénicas similares a la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo. Por ejemplo, dichos antígenos inducen anticuerpos que enlazan específicamente a la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo. El antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede ser de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, o 300 aminoácidos de extensión. El antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede comprender aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 2230, 240, 250, 260, 270, 280, o 290 aminoácidos consecutivos de alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo. A través de su extensión, la secuencia de aminoácidos del antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede ser de aproximadamente 10, , 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo (SEC ID NO: 1) o una porción correspondiente de alfa-toxina de S. aureus. El antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede ser un antígeno recombinante, significa que el antígeno fue elaborado por medio de metodologías de ADN recombinante. Dichas metodologías de ADN recombinante son bien conocida sen el arte. Los antígenos de alfa-toxina de S. aureus recombinantes están generalmente libres de otras proteínas y componentes celulares con los cuales la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo está asociada en su estado nativo (es decir, proteínas y componentes celulares presentes en células de Staph.). Un huésped recombinante ejemplar para elaborar antígeno de alfa-toxina de S. aureus es E. coli. Los antígenos pueden primero ser expresados en células de E, coli y luego purificados a partir de E. Coli usando, por ejemplo, cromatografía de columna por afinidad. Los antígenos de alfa-toxina de S. aureus útiles en la presente invención pueden comprender una o más inserciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos en relación con la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de la alfa-toxina de S. aureus pueden ser sustituidos por otros aminoácidos de una pluralidad similar, los cuales actúan como un equivalente funcional dando como resultado una alteración silenciosa. Las sustituciones en el antígeno pueden ser seleccionadas a partir de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, aminoácidos mono-polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Positivamente, los aminoácidos cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, pueden hacerse alteraciones de aminoácidos no conservadoras discutidas posteriormente con más detalle en el contexto de desintoxificar antígenos de alfa-toxina de S. aureus . Por consiguiente, en algunas modalidades, se hace un cambio de aminoácido no conservador al antígeno de alfa-toxina de S. aureus para desintoxificario . De conformidad con la presente invención, los antígenos de alfa-toxina de S. aureus son alterados, en relación con el antígeno de alfa-toxina de S. aureus, para reducir su toxicidad. En una modalidad, los antígenos contienen al menos dos alteraciones, en relación con el antígeno de tipo nativo.

Esta modalidad minimiza la toxicidad y también reduce el riesgo de que el antigeno será revertido a un estado más tóxico. Las alteraciones pueden ser "alteraciones químicas" , pueden ser "alteraciones moleculares" , o puede ser una combinación de alteraciones químicas y moleculares. Para propósitos de conteo del número de alteraciones, la modificación química o molecular de un aminoácido individual o una secuencia de aminoácidos contiguos es considerada una alteración individual. Por consiguiente, la eliminación, sustitución o inserción de dos o más aminoácidos contiguos es una "alteración individual" como se usa en la presente. "Alteración química" , se refiere a una modificación afectada por tratamiento químico del antígeno de alfa-toxina de S. aureus o conjugación del antígeno de alfa-toxina de S. aureus a otra porción. Por ejemplo, de conoce la modificación química de histidinas en alfa-toxina de S. aureus con pirocarbonato de dietilo para reducir la actividad hemolítica de la alfa-toxina. La conjugación de la alfa-toxina de S. aureus a otras moléculas también reduce la actividad hemolítica de alfa-toxina. En una modalidad, la otra molécula es otro antígeno bacteriano, tal como un polisacárido bacteriano o una glicoproteína bacteriana. Los antígenos bacterianos pueden ser antígenos de S . aureus o pueden ser derivados de otras especies bacterianas. Antígenos bacterianos ejemplares incluyen de Tipo 5 de S . aureus, de Tipo 8 de S . aureus, 336 de S. aureus, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, leucocidinas tales como las sub-unidades de PVL (incluyendo las sub-unidades de PVL individuales, LukS-PV y LukF-PV) y de gama-hemolisina (HlgA, HlgB, HlgC) , LukD de S. aureus, LukE de S. aureus, LukM de S. aureus, LukF' -PV de S. aureus, una sub-unidad LukF-I de S. intermedius, o una sub-unidad LukS-I de S. intermedius, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a las proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) . Por consiguiente, las vacunas de la invención puede comprender un conjugado de Tipo 5-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de Tipo 8 - antígeno de alfa-toxina, un conjugado de Tipo 336 - antígeno de alfa-toxina, un conjugado de PVL - alfa-toxina, un conjugado de PS1-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de GP1 - antígeno de alfa-toxina, un conjugado de LTA- alfa-toxina, o un conjugado de MSCRAMM- alfa-toxina. De manera similar, vacunas de la invención pueden comprender un antígeno de alfa-toxina que es alterado y desintoxificado por conjugación a otra molécula, tal como otro polisacárido bacteriano, otro antígeno bacteriano Gram- positivo o un antígeno bacteriano Gram negativo.

"Alteración molecular" , se refiere a una modificación en la secuencia de aminoácidos de alfa-toxina de S. aureus . La modificación puede ser una inserción, una eliminación o una sustitución de uno o más aminoácidos . Las alteraciones moleculares pueden tener lugar en cualquier parte de la alfa-toxina de S. aureus. En una modalidad, el dominio de unión amino es modificado molecularmente . Por ejemplo, una porción del dominio de unión amino o el dominio de unión amino completo (Ala1 - Val20) puede ser eliminado, destoxificando así el antígeno de alfa-toxina. En otra modalidad, el dominio principal (Lys110 - Tyr148) es modificado molecularmente. Por ejemplo, una porción del dominio principal o el dominio principal completo puede ser eliminada. En otra modalidad, residuos de aminoácidos que forman la región del triángulo (Pro103 - Thr109 - y Val149 -Asp152) son modificados molecularmente. En otra modalidad, el dominio de cobertura es modificado molecularmente. En otra modalidad, el dominio de la periferia es modificado molecularmente. En otra modalidad, uno o más residuos de histidina son modificados, tales como His35, His48, his144 y His259. La modificación de His35 es ejemplar. Por ejemplo, la modificación puede ser una sustitución de His35Lys, His35Arg, His35Ala, His35Leu o His35Glu. La sustitución His35Lys es una modalidad particular. Otros residuos ejemplares que pueden ser modificados incluyen Asp24, Lys37, Lys58, Asp100, Ile107, Glu111, Met113, Asp127, Asp128, Gly130, Gly134, Lys147, Gln150, Asp152, Phe153, Lys154, Val169, Asn173, Arg200 , Asn214 y Leu219. Pueden lograrse las alteraciones moleculares por medio de métodos bien conocidos en el arte, incluyendo la extensión de cebador sobre un modelo de plásmido usando modelos de una hebra por medio del método Kunkel original (Kunkel, TA, Procc . Acad. Sci., USA, 82:488-492 (1985)) o modelos de ADN de doble hebra (Papworth y colaboradores, Strategies, 9(3) :3 -4 (1996)), y clonación por PCR (Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2 a ed. Humana Press, Totowa, NJ (2002) , Ishii y colaboradores, Meth. Enzymol . , 293, 53-71(1998), Kamman y colaboradores, Nucleic Acids Res., 17:5404 (1989), Hemsley y colaboradores, Nucleic Acids Res., 17:6545 - 6551 (1989), Giebel y colaboradores, Nucleic Acids Res., 18: 4947(1990), Landt y colaboradores, Gene, 96: 125 - 128 (1990), Stemmer y colaboradores, BioTechniques , 13: 214 - 220 (1992), Marini y colaboradores, Nucleic Acids Res., 21: 2277 - 2278 (1993), y einer y colaboradores, Gene, 151: 119 - 123 (1994) ) . Se conocen en el arte métodos de determinar si una alteración reduce la toxicidad de un antígeno de alfa-toxina de S. aureus . La alfa-toxina permeabiliza membranas, causando el rápido egreso de los componentes celulares.

Por consiguiente, la formación de poro y la muerte de células nucleadas pueden ser registrados convenientemente por medio de pruebas de exclusión de colorante convencionales, midiendo la captación de un colorante fluorescente tal como ioduro de propidio o bromuro de etidio, o por medición de las fugas de ATP. Técnicas útiles para medir la toxicidad de alfa-toxina incluyen microscopía flurescente o luminosa, citometría de flujo, y fluorometría . Bemheimer describió un ensayo hemolítico usando eritrocitos para medir toxicidad. (Bemheimer, A. W. , Methods Enzymol., 165:213 - 217 (1988)). El procedimiento estándar para determinar el título hemolítico es añadir una suspensión de eritrocitos a toxinas diluidas en serie. El recíproco de la dilución que provoca el 50 % de lisis en una hora a temperatura ambiente da el número de unidades hemolíticas (HU) , las cuales pueden ser expresadas por miligramos de proteína. La actividad específica de la alfa-toxina purificada está en el intervalo de 40,000 HU/mg de proteína, cuando se evalúa pro adición de un volumen de suspensión de eritrocitos al 2.5 % (2.5 x 108 células por mi) . El título hemolítico es más alto cuando los tiempos de incubación son prolongados y alcanzan 50,000 a 100,000 HU/mg después de 4 horas a temperatura ambiente. La conjugación de antígenos de alfa-toxina de S. aureus a otras moléculas no solamente reduce la actividad hemolítica del antígeno de alfa-toxina, sino que permite la inducción de una respuesta inmune a la otra molécula, Realmente, la conjugación de una molécula a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus puede mejorar el perfil antigénico de la molécula, o incrementar la resistencia de una respuesta inmune a la molécula. Esto es particularmente verdadero para moléculas de bajo peso molecular, tales como péptidos y oligosacáridos , los cuales no pueden, sobre sí mismos, inducir una respuesta inmune potente, de duración. Por consiguiente, los antígenos de alfa-toxina de S. aureus funcionan como proteínas portadoras efectivas . Hay portadores particularmente útiles para antígenos bacterianos . En algunas modalidades de la invención, por consiguiente, un antígeno de alfa-toxina de S. aureus es conjugado a otra molécula. En una modalidad, la otra molécula es otro antígeno bacteriano, tal como un polisacárido bacteriano o una glicoproteína bacteriana. El antígeno bacteriano puede ser un antígeno de S. aureus o puede ser derivado de otra especie bacteriana. Los antígenos bacterianos ejemplares incluyen los antígenos de Tipo 5 de S . aureus, el de Typo 8 de S . aureus, el 336 de S. aureus, leucocidinas , tales como de Leucocidina de Panton - Valentine (PVL) , tal como LukS-PV y LukF-PV, antígenos de la sub-unidad de gama hemolisis tal como HlgA, HlgB y HlgC, y otras leucocidinas tales como LukM y LukF'-PV de S. aureus, LukE y LukD de S. aureus, LukS-I y LukF-1 de S. intermedius, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis LTA y MSCRAM . Por consiguiente, las vacunas de la invención puede comprender un conjugado de Tipo 5-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de Tipo 8-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de Tipo 336-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de PSl-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de leucocidina-alfa-toxina, tal como un conjugado de PVL-alfa-toxina, un conjugado de GPl-antígeno de alfa-toxina, un conjugado de LTA-alfa-toxina, o un conjugado de MSCRAM -alfa-toxina. En una modalidad, el otro antígeno es un antígeno protector, por ejemplo, el antígeno induce anticuerpos neutralizantes. Están disponibles en el arte, métodos de conjugar un antígeno de alfa-toxina de s. aureus, tal como un antígeno bacteriano. Por ejemplo, un antígeno de PS1, de Tipo 5 o de Tipo 8 puede ser activado por 1- etil- 3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para formar derivados de cisteamina. La alfa-toxina es modificada con N- succinimidil- 3- (-2- piridiltio) propionato (SPDP) y luego conjugado al derivado de cisteamina de PS1 vía reemplazo del tiol. El conjugado resultante puede ser separado del antígeno no conjugado por cromatografía por exclusión de tamaños. En otra modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. aureus es conjugado a un antígeno 336, por ejemplo, por activación de los grupos hidroxilo sobre el antígeno 336 usando bromuro cianógeno o tetrafluoroborato de 1- ciano-4- dimetilamino- piridinio, y enlace a través de un enlazador que contenga grupos nucleofílicos o sin un enlazador, al antígeno de alfa-toxina. Los conjugados resultantes pueden entonces ser separados del antígeno sin conjugar . En otra modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. aureus está conjugado a un antígeno de PS1, por ejemplo, modificando el PS1 con dihidrazida de ácido adípico (ADH) vía una reacción facilitada por EDC para preparar hidrazida de ácido adípico derivada de PS1 (PSIAH) . El antígeno de alfa-toxina de S. aureus es entonces succinilado y el derivado succínico del antígeno de alfa-toxina es conjugado a PSIAH, una etapa mediada por EDC. También se conocen en el arte, otros método de conjugación útiles, por ejemplo oxidación por periodato con aminación reductora, tratamiento con carbodiimida, y combinaciones de dichos métodos . Dichos métodos pueden proporcionar enlace covalente directo o indirecto (mediante un enlazador) de moléculas a un portador de alfa-toxina.

Con respecto al método usado para conjugar la molécula al portador de alfa-toxina, el enlace covalente de una molécula al portador puede convertir la molécula a partir de un antígeno independiente de células T a un antígeno dependiente de células T. Como un resultado, el conjugado provocaría una respuesta de anticuerpo específica de la molécula en animales inmunizados, en contraste a ninguna respuesta después de administración de la molécula sola. Las vacunas de la invención pueden comprender también un portador aceptable farmacéuticamente. Un portador aceptable farmacéuticamente es un material que puede ser usado como un vehículo para el antígeno porque el material es inerte o de otra manera es aceptado médicamente, así como también compatible con el agente activo, en el contexto de administración de vacuna. Además de un excipiente adecuado, un portador aceptable farmacéuticamente puede contener aditivos para vacunas convencionales como diluyentes, adyuvantes y otros inmunoestimulantes , antioxidantes, conservadores y agentes solubilizantes . Por ejemplo, puede añadirse polisorbato 80 para minimizar la aglutinación y actuar como agente estabilizante, y puede añadirse un regulador para el control del pH. Generalmente, se conocen en el arte, métodos para elaborar vacunas. Ver por ejemplo, Di Tommaso y colaboradores, Vaccine, 15: 1218-24 (1997) y Fattom y colaboradores, Infect. And Immun. 58: 2367-2374 (1990) y 64:1659-1665 (1996). Las vas descritas en la presente permiten la adición de un adyuvante con una facilidad relativa y sin distorsionar la composición. Además, las vacunas de la presente invención pueden ser formuladas de modo de incluir un componente de "depósito" para incrementar la retención del material antigénico en el sitio de administración. A manera de ejemplo, además de un adyuvante (si se usó uno) , puede añadirse alúmina (hidróxido o fosfato de aluminio) , QS-21, sulfato de dextrano o aceite mineral para proporcionar este efecto de depósito . Como se describió anteriormente, las vacunas de la invención pueden comprender uno o más antígenos bacterianos diferentes de un antígeno de alfa-toxina de S. aureus . El otro antígeno bacteriano puede ser conjugado a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus, puede ser co-administrado con un antígeno de alfa-toxina de S. aureus como un componente separado de la misma composición, o puede ser administrado como parte de una composición completamente separada, antes de, durante o después de la administración del antígeno de alfa-toxina. En cualquier caso, el otro antígeno bacteriano puede ser uno de aquellos previamente descritos, tal como un polisacárido bacteriano o una glicoproteína bacteriana, incluyendo tanto antígenos de S. aureus como antígenos derivados de otras especies bacterianas. En una modalidad, el otro antigeno bacteriano es un antígeno protector que induce anticuerpos neutralizantes. Por consiguiente, el otro antígeno bacteriano puede ser los antígenos de Tipo 5 y de Tipo 8 descritos en Fattim y colaboradores, Infec. and Immun. , 58: 2367-2374 (1990), t Fattom y colaboradores, Infec. and Immun. 64: 1659-1665 (1996) . El otro antígeno bacteriano puede ser también el antígeno 336 de S. aureus descrito en las Patentes U.S. Nos. 5,770,208; 6,194,161; 6,537,559 o en antígeno 336 Staphylococcal descrito en la Patente U.S. No. 5,770,208 y No. 6,194,161 o anticuerpos de éste. Se conocen en el arte aún otros antígenos de S. aureus y son abarcados por la invención. Ver por ejemplo, Adams y colaboradores, J. Clin. Microbiol., 26: 1175-1180 (1988), Rieneck y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta., 1350:128-132 (1977) y O'Riordan y colaboradores., Clin. Microbiol. Rev., 17: 218- 34 (2004). Por ejemplo, el antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) , incluyendo sus sub-unidades individuales LukF-PV y LukS-PV, son abarcados por la invención. De manera similar la invención abarca antígenos de S. epidermidis. Por ejemplo, el antígeno de Tipo II de S. epidermidis, también mencionado para un PS1, se describe en las Patentes U.S. No. 5,961,975 y No. 5,866,140. Este antígeno es un antígeno polisacárido ácido que puede ser obtenido por medio de un proceso que comprende desarrollar células de un aislado de S. epidermidis que aglutina antisuero a ATCC 55254 (un aislado de Tipo II) . El antígeno GP1 de S. epidermidis es descrito en la solicitud de Patente U.S. 2005/018190 publicada. GP1 es común a muchas cepas de Staphylococcus negativas a coagulasa, incluyendo Staphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolyticus , y Staphylococcus hominis. El antígeno puede ser obtenido a partir de la cepa de Staphylococcus epidermis depositada como ATCC 202176. Aún otro antígeno de Staphylococcus abarcado por la presente invención es descrito en WO 00/56357. Este antígeno comprende aminoácidos y una hexosamina N-acetilada en una configuración alfa, no contiene grupos O-acetilo y no contiene hexosa. Específicamente enlaza con anticuerpos a una cepa de Staphylococcus depositada bajo ATCC 202176. el análisis del aminoácido del antígeno muestra la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina, y treonina en proporciones molares de aproximadamente 39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituyen aproximadamente el 32 % en peso de la molécula del antígeno. Otros antígenos útiles de conformidad con la presente invención incluyen leucocidinas . La clase de leucocidinas (también mencionadas como por ejemplo, leucotoxinas biocomponentes) incluyen pero no se limitan a componentes S, tales como LukS-PV, LukM de S. aureus, HlgA (gama-hemolisina) , HlgC (gama-hemolisina) , LukE de S. aureus, LukS-I (de S. intermedius) , y componentes F, tales como LukF-PV, LukF'-PV, HlgB (gama-hemolisina), LukD de S. aureus, y LukF-I (de S. intermedius). La presente invención abarca el uso de cualquiera de las especies del género leucocidina, incluyendo uno o más de los componentes S y F descritos en la presente. Así, la invención incluye una composición que comprende el antígeno de alfa-toxina, uno o más antígenos bacterianos adicionales, y un portador aceptable farmacéuticamente, donde el antígeno de alfa-toxina y uno o más antígenos bacterianos adicionales pueden ser proporcionados separadamente, o donde el antígeno de alfa-toxina está conjugado a uno o más antígenos bacterianos adicionales . Otra modalidad concierne a preparaciones de toxinas útiles, por ejemplo, para inducir anticuerpos neutralizantes. Preparaciones ejemplares de antitoxinas pueden comprender: (i) un antígeno de alfa-toxina de S. aureus; (ii)un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y una leucocidina, tal como un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) ; (iii)un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y una o más sub-unidades antigénicas de PVL, tal como LukS-PV o LukF-PV; cualquier combinación de (i) , (ii) , y (iii) , y otras preparaciones de toxinas que comprenden el antígeno de alfa- toxina. En una modalidad específica, una preparación de toxina comprende la alfa- toxina y al menos un antígeno de leucocidina, tal como al menos una sub-unidad PVL o al menos una sub-unidad de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB, o HlgC. Otra modalidad concierne a preparaciones opsónicas, tales que pueden inducir anticuerpos opsónicos. Las preparaciones opsónicas ejemplares pueden comprender un antígeno de alfa- toxina y uno o más antígenos opsónicos, tal como de Tipo 5, de Tipo 8, o 366 de S. aureus. Una preparación opsónica también puede comprender un antígeno de leucocidina, tal como el antígeno de PVL o una o más sub-unidades de PVL, tal como LukS-PV o LukF-PV. Una modalidad específica proporciona una preparación pentavalente que comprende un antígeno de alfa- toxina, un antígeno de leucocidina (tal como un antígeno de PVL, tal como PVL o una o más sub-unidades de PVL) , antígeno de Tipo 5, antígeno de Tipo 8, y antígeno 336. En otra modalidad es una combinación pentavalente de antígenos que incluye un antígeno rLukS-PV. Otra modalidad proporciona una preparación pentavalente que comprenda un antígeno de alfa-toxina, un antígeno de leucocidina, tal como uno o más antígenos de la sub-unidad de gama- Se ha descubierto que algunos antígenos reaccionan de manera cruzada y neutralizan de manera cruzada a infecciones asociadas con otros antígenos. Así, por ejemplo, antígenos de la sub-unidad de PVL, tales como LukS-PV o LukF-PV, pueden inducir anticuerpos que neutralizan infecciones asociadas con otra gama-hemolisina, leucocidina. Inversamente, un antígeno de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB y/o HlgC, puede inducir anticuerpos que neutralizan infecciones asociadas con PVL. Así, un aspecto de la invención incluye una composición que comprende uno o más antígenos de la sub-unidad de PVL que es útil, por ejemplo, contra infección por gama-hemolisina. Otro aspecto de la invención incluye una composición que comprende uno o más antígenos de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB o HlgC, que es útil, por ejemplo, contra infecciones por PVL. Así, la infección incluye composiciones que comprenden un tipo de antígeno que es útil contra infecciones asociadas con un antígeno de reacción cruzada pero diferente. Tratamiento y Prevención de Infecciones con Composiciones de Vacuna La presente invención también proporciona un método de tratar o de prevenir una infección administrando cualquiera de las vacunas descritas anteriormente a un sujeto en necesidad de éstas. Una población de sujetos objetivo para hemolisina, tal como HlgA, HlgB o HlgC, antígeno de Tipo 5, antígeno de Tipo 8, y antígeno 336. En una modalidad una preparación comprende ambos antígenos de superficie y antígenos de toxinas, útiles, por ejemplo, para prevenir infecciones por S. aureus . Una composición tal puede comprender antígenos de superficie, tal como los antigenos capsulares de Tipo 5 y/o de Tipo 8 y/o polisacáridos de superficie tales como el antígeno 336, combinado con antígenos de toxinas, tal como un antígeno de alfa-toxina (por ejemplo, rALD/H35K) y/o un antígeno de leucocidina tal como un antígeno de PVL o sub-unidad de PVL (por ejemplo, LukS-PV) o antígeno de la sub-unidad de gama-hemolisina . En una modalidad, la composición comprende (i) un conjugado de Tipo 5-rEPA, (ii)un conjugado de Tipo (-rEPA, (iii)un conjugado de 336-rEPA; y (iv) antigeno de alfa-toxina rALD/H35K. En otra modalidad, la composición comprende (i) un conjugado de Tipo 5-rEPA, (ii)un conjugado de Tipo 8 -rEPA, (iii)un conjugado 336-rEPA; (iv) antígeno de alfa-toxina rALD/H35K y (v)rLukS-PV. En otra modalidad, la composición comprende (i) un conjugado de Tipo %-rEPA, (ii) un conjugado de Tipo 8-rEPA, (iii)un conjugado 336-rEPA, (iv) antígeno de alfa-toxina rALD/H35K y (v) uno o más antígenos de sub-unidades de gama-hemolisina, tales como HlgA, HlgB o HlgC. los métodos de tratamiento y prevención descritos en la presente incluye mamíferos, tales como humanos, quienes son infectados con, en riesgo de ser infectados por, patógenos bacterianos, tal como un S. aureus . En algunas modalidades, la infección a ser tratada o prevenida está asociada con S. aureus resistente a meticilina. En modalidades particulares, el S. aureus resistente a meticilina produce alfa-toxina. Las vacunas pueden ser administradas conjuntamente con un antígeno adicional, como se describió anteriormente. El antígeno adicional ejemplar incluye antígenos del polisacárido capsular de S. aureus, tal como los antígenos de Tipo 5, Tipo 8, y 336 y otros S. aureus conocidos en el arte. Antígenos adicionales ejemplares también incluyen antígenos de S. epidermidis, tal como antígeno de PS1 o el antígeno de GP1, y otros antígenos de Staphylococcus, tal como el antígeno descrito en WO 00/56357. Otros antígenos ejemplares incluyen leucocidinas , tales como antígenos de Leucocidina de Panton-Valentín (PVL) , tal como LukS-PV y LukF-PV, antígenos de la sub-unidad de gama-hemolisina tal como HlgA, HlgB y HlgC, y otras leucocidinas tales como LukM y LukF' -PV de S . aureus , LukE y LukD de S . aureus , y LukS-I y LukF-I de S. intermedius . Como se indicó anteriormente, el uno o más antígenos adicionales pueden ser administrados separadamente desde la composición de vacuna del antígeno de alfa-toxina de S. aureus o puede ser incluido en la composición de vacuna. En vista de la reactividad cruzada y de la actividad neutralizante cruzada de algunos antígenos, indicadas anteriormente, la invención incluye métodos de neutralizar infecciones asociadas con un antígeno por administración de una vacuna, que comprende un antígeno diferente pero de reacción cruzada. Por ejemplo, la invención incluye métodos de neutralizar la infección por PVL usando vacunas que comprendan antígenos de gama-hemolisina tal como HlgA, HlgB y HlgC, así como también métodos para neutralizar infecciones por gama-hemolisina usando vacunas que comprendan antígenos de la sub-unidad PVL, tal como LukF-PV y LukS-PV.

Una cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente de las vacunas de la invención puede ser determinada por métodos rutinarios en el arte. Los expertos reconocerán que la cantidad puede variar con la composición de la vacuna, las características del sujeto particular, , la ruta de administración seleccionada, y la naturaleza de la infección bacteriana que es tratada o prevenida. Puede encontrarse una guía general, por ejemplo, en las publicaciones de la International Conference on Harmonization y en REMINGTON' S PHARMACEUTHICAL SCIENCES (Mack Publishing Company 1990) . Una dosificación de vacuna típica puede variar desde 1 µ a 400 µg de antígeno. La vacuna puede ser administrada con o sin adyuvante. Si se usa un adyuvante, éste es seleccionado de manera de evitara toxicidad inducida por el adyuvante. Por ejemplo, una vacuna de conformidad con la presente invención puede comprender un -glucano como se describió en la Patente U.S. No. 6,355,625, o un factor estimulador de la colonia de granulocitos . La vacuna puede ser administrada en cualquier forma de dosificación deseada, incluyendo formas de dosificación que pueden ser administradas a un humano intravenosa, intramuscular o subcutáneamente . La vacuna puede ser administrada en una dosificación individual, o de conformidad con un protocolo de dosificación múltiple. La administración puede ser por numerosas rutas, incluyendo subcutánea, intracutánea, e intravenosa. En una modalidad, se usa la administración intramuscular. El experto en la materia reconocerá que la ruta de administración variará dependiendo de la infección bacteriana a ser tratada o prevenida y de la composición de la vacuna. La vacuna puede ser administrada conjuntamente con un agente anti-infeccioso, un agente antibiótico, y/o un agente anti-microbiano, en una terapia en combinación. Los agentes anti-infecciosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a vancomicina y lisostafina. Los agentes antibióticos ejemplares y agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a penicilinas resistentes a penicilinasa, cefalosporinas y carbapenenos , incluyendo vancomicina, lisostafina, penicilina G, ampicilina, oxacilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefadrina, cefamandol, cefoxitina, imipenemo, metropenemo, gentamicina, teicoplanina, lincomicina y clindamicina . Las dosificaciones de estos antibióticos son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY, § 13, Capítulo 157, lOOava ed. (Beers & Berkow eds . 2004). Los agentes anti-infecciosos, antibióticos y/o antimicrobianos pueden ser combinados antes de administración, o pueden ser administrados concurrente o secuencialmente con la composición de vacuna. Anticuerpos La presente invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus (un "anticuerpo de alfa-toxina" ) y anticuerpos que enlazan específicamente a otro antígeno bacteriano (un "anticuerpo antigénico bacteriano"). El antígeno de alfa-toxina de S. aureus y otro antígeno bacteriano puede ser cualquier alfa-toxina como se encuentra naturalmente u otro antígeno bacteriano, o ser tal vez cualquiera de los antígenos descritos anteriormente. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales , anticuerpos monoclonales , fragmentos de anticuerpos o combinaciones de los mismos . Los anticuerpos pueden ser formulados con un portador aceptable farmacéuticamente. El término "anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de inmunoglobulina de extensión total (es decir, que se encuentra de manera natural o que es formada por medio de procesos recombinatorios de fragmentos genéticos de inmunoglobulina normal) (por ejemplo un anticuerpo IgG) o una porción activa inmunológicamente (es decir, que enlaza específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, que incluye un fragmento de anticuerpo. "Anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan sinónimamente en la presente. Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab' , Fab, Fv, sFv y los similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo enlaza con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de extensión total, y, en el contexto de la presente invención, enlaza específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus o a otro antígeno bacteriano. Son bien conocidos en el arte métodos de elaborar y de cribar fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo de alfa-toxina o anticuerpo antigénico bacteriano de la presente invención puede ser preparado por numerosos métodos diferentes. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser obtenidos a partir de sujetos a los que se ha administrado un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y/o un antígeno bacteriano. Los anticuerpos también pueden ser obtenidos a partir de plasma seleccionado para anticuerpos de alfa-toxina y/o anticuerpos antigénicos bacterianos, como se discute con más detalle posteriormente. En algunas modalidades, los anticuerpos pueden ser elaborados por medio de métodos recombinantes . Son bien conocidas en el arte técnicas para elaborar anticuerpos monoclonales recombinantes. Los anticuerpos monoclonales recombinantes pueden ser producidos por métodos análogos a los descritos en la Solicitud de Patente U.S. 2002/0009453 (Haurus y colaboradores), usando un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y/o un antígeno bacteriano como el inmunógeno. Un anticuerpo de alfa-toxina o anticuerpo antigénico bacteriano de conformidad con la invención, puede ser un anticuerpo de murina, humano o humanizado. Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la cual los CDRs de un anticuerpo de una especie, por ejemplo, un anticuerpo de roedor, conejo, perro cabra, caballo, o pollo (o cualquier otro anticuerpo de animal adecuado) , son transferidos de las cadenas pesada y ligera variables del anticuerpo del roedor al interior de los dominios pesado y ligero variables. Los dominios constantes de la molécula del anticuerpo son derivados de los de un anticuerpo de humano. Son bien conocidos en el arte los métodos para elaborar anticuerpos humanizados . Los anticuerpos anteriormente descritos pueden ser obtenidos por medio de métodos convencionales. Por ejemplo un antígeno de alfa- toxina y/u otro antigeno bacteriano puede ser administrados a un sujeto y el IgGs resultante puede ser purificado a partir de plasma cosechado del sujeto por metodología estándar. Los antígenos usados para obtener anticuerpos pueden ser cualquiera antígeno como se encuentra de manera natural, cualquiera de los antígenos descritos anteriormente, o cualquiera de los antígenos conocidos en el arte. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. aureus usado para obtener anticuerpo de alfa- toxina es convertido en no tóxico de acuerdo a lo expuesto anteriormente. Composiciones de anticuerpo La invención incluye composiciones de anticuerpos adecuadas para administración, tal como composiciones que comprenden un anticuerpo y un portador aceptable farmacéuticamente. Las composiciones de anticuerpos pueden ser formuladas para cualquier ruta de administración, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutánea y percutánea, por métodos que son conocidos en el arte. En una modalidad, la composición de anticuerpos proporciona una cantidad de anticuerpo efectiva terapéutica y profilácticamente, es decir, una cantidad suficiente para lograr un efecto benéfico. En una modalidad adicional, el anticuerpo es una composición de anticuerpo que neutraliza la infección y/o proporciona protección contra la infección. En una modalidad, la composición de anticuerpos es una composición de IVIG. Como se usa en la presente "IVIG", se refiere a una composición de inmunoglobulina adecuada para administración intravenosa. Las composiciones IVIG pueden contener, además de la inmunoglobulina, un portador aceptable farmacéuticamente. Las composiciones de IVIG pueden ser "IVIG específicas", significa que el IVIG contiene inmunoglobulinas que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y/u otro antígeno bacteriano deseado (como se describió anteriormente) . Las composiciones de IVIG también pueden ser "IVIG específica hiperinmune" . "IVIG específico hiperinmune" , se refiere a una preparación de anticuerpos que comprende altos títulos de anticuerpos de alfa-toxina. Una preparación de IVIG específica hiperinmune puede ser preparada a partir del plasma de un sujeto que ha sido estimulado con el antígeno de alfa- toxina de S. aureus objetivo y/o otros antígenos bacterianos deseados, o puede ser obtenido por cribado de plasma de sujetos a los que no se ha administrado el antígeno para altos títulos de anticuerpos. En cualquier caso, el sujeto puede ser cualquiera de un humano o animal En una modalidad, la composición de IVIG específico comprende ambos un anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus (y que opcionalmente neutraliza al antígeno de alfa-toxina) y un anticuerpo que enlaza específicamente a otro antígeno bacteriano (y que opcionalmente neutraliza al otro antígeno bacteriano) . Los anticuerpos y antígenos pueden ser cualquiera de aquellos descritos previamente. Por ejemplo, el otro antígeno bacteriano puede ser un polisacárido y puede se runa glicoproteína, incluyendo de Tipo 5 de S . aureus, de Tipo 8 de S . aureus, 336 de S. aureus, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, componentes de leucocidina tales como PVL (incluyendo las sub-unidades de PVL individuales, LukS-PV y LukF-PV) sub-unidades de gama -hemolisina (HlgA, HlgB, y HlgC, LukE o LukD de S. aureus, LukM o LukF' -PV de S. aureus, una sub-unidad LukF-I una LukS-I de S. intermedius, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRA M) . Una modalidad concierne a preparaciones de anti-toxina. Las preparaciones de anti-toxina ejemplares pueden comprender (i) anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus; (ii) anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y anticuerpos que enlazan específicamente a un aleucocidina, tal como un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) ; (iii) anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de la sub-unidad leucocidina, tal como una sub-unidad antigénica de PVL, tal como anticuerpos que enlazan específicamente a LukS-PV o LukF-PV; cualquier combinación de (i) , (ii) , y (iii) , y otras preparaciones de anti-toxina que comprenden anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de alfa-toxina. En una modalidad específica, una preparación de alfa-toxina comprende anticuerpos que enlazan específicamente a alfa-toxina y anticuerpos que enlazan específicamente a PVL, LukS-PV o LukF-PV o a otra leucocidina, tal como la sub-unidad de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB, o HlgC. Otra modalidad concierne a preparaciones de anticuerpos opsónicos, que comprenden anticuerpos opsónicos . Preparaciones de anticuerpos opsónicos ejemplares que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina y a uno o más anticuerpos opsónicos, tal como anticuerpos que enlazan específicamente a Tipo 5, Tipo 8 y 366 de S. aureus . Una preparación de anticuerpo opsónico también puede comprender anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de leucocidina, tal como el antígeno de PVL, o que enlaza específicamente a una o más sub-unidades de PVL, tal como LukS-PV o LukF-PV, o a la sub-unidad de gama-hemolisina, tal como HigA, HlgB, o HlgC. Una modalidad específica proporciona una preparación pentavalente que comprende anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de alfa-toxina, anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno de leucocidina tal como un antígeno de PVL (tal como PVL o una o más sub-unidades de PVL) o una sub-unidad de gama-hemolisina (tal como HlgA, HlgB, o HlgC) , anticuerpos que enlazan específicamente a antígeno de Tipo 5, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 8, y anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno 336. Por consiguiente, algunas modalidades proporcionan composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales y/o policlonales, los cuales son neutralizantes (tal como anticuerpos anti-alfa-toxina) y/o opsonizantes (dichos anticuerpos contra antígenos de superficie o capsulares) . Una composición comprende anticuerpos monoclonales y/o policlonales que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 5, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 8, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno 336, y anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de alfa-toxina rALD/H35K. Otra composición comprende anticuerpos monoclonales y/o policlonales que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 5, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 8, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno 336, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de alfa-toxina y anticuerpos que enlazan específicamente a rLukS-PV. Otra composición comprende anticuerpos monoclonales y/o policlonales que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 5, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de Tipo 8, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno 336, anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno de alfa-toxina y anticuerpos que enlazan específicamente a una sub-unidad gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB, o HlgC. Otra modalidad concierne a composiciones de anticuerpos de neutralización cruzada, de reacción cruzada. Por ejemplo, la invención incluye composiciones que comprenden anticuerpos que son específicos a un antígeno y que son de reacción cruzada o de neutralización cruzada con otro antígeno. Por ejemplo, la invención incluye composiciones que comprenden anticuerpos específicos a antígenos de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB y/o HlgC, que son útiles, por ejemplo, contra la infección por PVL, asi como también composiciones que comprenden anticuerpos específicos a antígenos de la sub-unidad PVL, tal como LukF-PV y LukS-PV, que son útiles contra la infección por gama-hemolisina. Como se indicó anteriormente, la invención proporciona composiciones de anticuerpos que proporcionan una cantidad de anticuerpo efectiva terapéutica y profilácticamente, es decir, una cantidad suficiente para lograr un efecto benéfico terapéutica o profilácticamente. En una modalidad adicional, el anticuerpo es una composición de anticuerpo protector que neutraliza la infección y/o proporciona protección contra la infección. Dichas composiciones protectoras pueden incluir una cantidad protectora de un anticuerpo de alfa-toxina y una cantidad protectora de anticuerpo contra otro antígeno bacteriano.

Alternativamente, una composición de anticuerpo protector puede comprender una cantidad sub-óptima de anticuerpo anti-alfa-toxina y una cantidad sub-óptima de anticuerpo contra otro antígeno bacteriano. Como se usa en la presente, cantidad "sub-óptima" significa una cantidad que no es protectora sobre sí misma, es decir, una cantidad que no es efectiva sobre sí misma, para neutraliza la infección o proporcionar protección contra la infección. Estas composiciones, aunque comprenden cantidades de anticuerpo que no son efectivas sobre sí mismas, no obstante neutralizan la infección y/o proporcionan protección contra la infección por medio de la actividad sinérgica de la combinación de anticuerpos. En una modalidad específica, la composición comprende una cantidad sub-óptima de anticuerpo anti-alfa-toxina y una cantidad sub-óptima de anticuerpo de Tipo 5 de S. aureus. En otra modalidad específica, la composición comprende una cantidad sub-óptima del anticuerpo anti-alfa-toxina y una cantidad sub-óptima del anticuerpo de Tipo 8 de S. aureus. Métodos de Elaborar Composiciones de IVIG La presente invención también proporciona métodos de elaborar composiciones de IVIG, incluyendo composiciones de IVIG específicas, y composiciones de IVIG hiperinmunes . Cualquiera de las composiciones antigénicas mencionadas anteriormente puede ser usadas para elaborar composiciones de IVIG. En una modalidad, una composición de IVIG es preparada administrando un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y otro antígeno bacteriano a un sujeto, luego cosechando el plasma del sujeto y purificando la inmunoglobulina a partir del plasma. El antígeno de alfa-toxina de S. aureus y otro antígeno bacteriano pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente, incluyendo antígenos de tipo nativo, y antígenos protectores que inducen anticuerpos neutralizantes, y pueden ser formulados en cualquiera de las vacunas descritas anteriormente. Por consiguiente, el otro antígeno bacteriano puede ser un polisacárido y puede ser una glicoproteína, y en una modalidad es seleccionado del Tipo 5 de S . aureus, Tipo 8 de S. aureus, 336 de S. aureus, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, leucocidinas , por ejemplo componentes de leucocidina tales como antígenos de Leucocidina de Panton -Valentine (PVL) , tal como LukS-PV y LukF-PV, antígenos de la sub-unidad gama-hemolisina tal como HlgA, HlgB, y HlgC, y otras leucocidinas tal como LukM y LukF' -PV de S. aureus, LukE y LukD de S. aureus, LukS-I y LukF-I de S. intermedius, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) . El antígeno bacteriano puede estar conjugado al antígeno de alfa-toxina de S. aureus. En una modalidad, el antígeno de alfa-toxina de S. aureus contiene al menos dos alteraciones, en relación con la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad, como se describió anteriormente. El sujeto que es estimulado, o al que se administró, el antígeno, tal como el antígeno de alfa-toxina de S. aureus y otro antígeno bacteriano, puede ser un humano o puede ser otro animal, tal como un ratón, un conejo, una rata, un pollo, un caballo, un perro, un primate no humano, o cualquier otro animal adecuado. Anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno pueden ser obtenidos a partir del plasma del animal por medio de la metodología de fraccionamiento de plasma convencional. En otra modalidad, se prepararon composiciones de IVIG por selección de un sujeto al que no se ha administrado el antígeno, tal como un sujeto al que no se ha administrado un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y otro antígeno bacteriano (es decir, un sujeto no estimulado) , luego se cosecha el plasma del sujeto y la inmunoglobulina a partir del plasma. En esta modalidad, el plasma de sujetos sin estimular es seleccionado por altos títulos de anticuerpos que enlazan específicamente a los antígenos, tales como los antígenos de alfa-toxina de S. aureus y otros antígenos bacterianos . El antígeno puede ser cualquiera de los descritos anteriormente. Por ejemplo, el otro antígeno bacteriano puede ser un polisacárido y puede ser una glicoproteína, y puede ser seleccionado del Tipo 5 de S . aureus, del Typo 8 de S . aureus, del 336 de S. aureus, de PS1 de S. epidermidis, del GP1 de S. epidermidis, una leucocidina tal como PVL (incluyendo las sub-unidades de PVL individuales, LukS-PV y LukF-PV) o/y sub-unidades gama-hemolisina (HlgA, HlgB, o HlgC) , LukE o LukD de S. aureus, LukM o LukF' -PV de S. aureus, una sub-unidad LukF-I o LukS-I de S . intermedius, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) . De conformidad con una modalidad, el plasma es seleccionado por títulos de anticuerpo de alfa-toxina y/u otro anticuerpo bacteriano que son dos veces o más, tres veces o más, cuatro veces o más, o cinco veces o más, superior a los niveles encontrados típicamente en preparaciones de IVIG estándares . De nuevo, el sujeto a ser seleccionado puede ser un humano o puede ser otro animal, tal como un ratón, un conejo, una rata o un primate no humano. La inmunoglobulina puede ser obtenida del plasma del animal por medio de la metodología de fraccionamiento de plasma convencional. Tratamiento y Prevención de Infecciones con Composiciones de Anticuerpos La presente invención también proporciona un método de tratar o de prevenir la infección por administración de las composiciones de anticuerpos anteriormente descritas, tales como las composiciones de IVIG anteriormente descritas, a un sujeto en necesidad de éstas. Una población de pacientes objetivo para el tratamiento y la prevención de la infección incluye mamíferos, tales como humanos, quienes son infectados con o están en riesgo de ser infectados por patógenos bacterianos. En una modalidad, la infección a ser tratada o prevenida es una infección por S. aureus, incluyendo una infección de S. aureus resistente a meticilina o de S . aureus que produce alfa-toxina, o una infección por S. epidermidis. De conformidad con una modalidad, al invención proporciona un método para tratar o prevenir una infección por S. aureus usando composiciones que comprenden un anticuerpo de alfa-toxina de S. aureus, un anticuerpo que enlaza específicamente a otro antígeno de S. aureus , y un portador aceptable farmacéuticamente. El anticuerpo de alfa-toxina de S. aureus y el anticuerpo que enlaza específicamente a otro antígeno de S. aureus, pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente. En una modalidad, la composición de anticuerpos es una composición de IVIG o una composición de IVIG específica hiperinmune . En otra modalidad, los anticuerpos son anticuerpos recombinantes o humanizados. En aún otra modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales . En vista de la reactividad cruzada y de la actividad neutralizante cruzada de algunos antígenos indicados anteriormente, la invención incluye métodos de neutralizar la infección asociada con un antígeno por administración de una composición de anticuerpos (que incluya una composición de IVIG) que comprenda el anticuerpo específico a un antígeno diferente que esté en reactividad cruzada y en neutralización cruzada con el primer antígeno. Por ejemplo, la invención incluye métodos de neutralizar infección por PVL usando composiciones de anticuerpos o de IVIG que comprendan el anticuerpo específico al antígeno de gama-hemolisina, tal como HlgA, HlgB y/o HlgC, así como también métodos de neutralizar infección por gama-hemolisina usando composiciones de anticuerpos o de IVIG que comprendan el anticuerpo específico a antxgenos de la sub-unidad PVL, tal como LukF-PV y LukS-PV. Una cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente de las composiciones de anticuerpos pueden ser determinadas por medio de métodos de rutina en el arte. Los expertos en la materia reconocerán que la cantidad puede variar de conformidad con los anticuerpos particulares en la composición, la concentración de anticuerpos en la composición, la frecuencia de administración, la severidad de la infección a ser tratada o prevenida, y detalles del sujeto, tales como edad, peso y condición inmune. En algunas modalidades, la dosificación será al menos de 50 mg de composición de IVIG por kilogramo de peso corporal (mg/kg) incluyendo al menos 100 mg/kg, al menos 150 mg/kg, al menos 200 mg/kg, al menos 250 mg/kg, al menos 500 mg/kg, al menos 750 mg/kg y al menos 1000 mg/kg. Las dosificaciones para composiciones del anticuerpo monoclonal típicamente pueden ser más bajas, tal como 1/10 de la dosificación de una composición de IVIG, tal como al menos aproximadamente 5 mg/kg, al menos aproximadamente 10 mg/kg, al menos aproximadamente 15 mg/kg, al menos aproximadamente mg/kg, o al menos aproximadamente 25 mg/kg. La ruta de administración puede ser cualquiera de las apropiadas para una vacuna pasiva. Por consiguiente se contemplaron las rutas de administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal y otras rutas de administración. Como se indicó anteriormente, una cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente de anticuerpo es una cantidad suficiente para lograr un efecto benéfico terapéutica o profilácticamente. Una composición de anticuerpo protectora puede neutralizar y/o prevenir la infección. Una composición de anticuerpo protectora puede comprender cantidades de anticuerpo anti-alfa-toxina y/o anticuerpo contra otro antígeno bacteriano que no sea protector sobre sí mismo, pero el cual, en combinación, produce una composición de anticuerpos protectora. La composición del anticuerpo puede ser administrada conjuntamente con un agente anti-infeccioso, u agente antibiótico, y/o un agente antimicrobiano, en una terapia en combinación. Los agentes anti-infecciosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a vancomicina, y lisostafina. Los agentes antibióticos y agentes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a penicilinas resistentes a penicilinasa, cefalosporinas y carbapenemos , incluyendo vancomicina, lisostafina, penicilina G, ampicilina, oxacilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefadrina, cefamandol, cefoxitina, imipenemo, meropenemo, gentamicina, teicoplanina, lincomicina y clindamicina . Las dosificaciones de estos antibióticos son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY, § 13, Capítulo 157, lOOava ed. (Beers & Berkow eds . 2004). Los agentes anti-infecciosos, antibióticos y/o antimicrobianos pueden ser combinados antes de administración, o pueden ser administrados concurrente o secuencialmente con la composición de IVIG. Algunas modalidades, relativamente pocas dosis de composición de anticuerpo son administradas, tal como una o dos dosis, y se empleó la terapia antibiótica convencional, la cual generalmente involucra dosis múltiples durante un período de días o semanas. Por consiguiente, los antibióticos pueden ser tomados una, dos o tres veces diariamente por un período de tiempo, tal como por al menos 5 días, 10 días o aún 14 o más días, aunque la composición del anticuerpo es usualmente administrada solamente una vez o dos veces. No obstante, las dosificaciones diferentes, sincronización de dosificaciones y cantidades relativas de composición de anticuerpo y antibióticos pueden ser seleccionadas y ajustadas por un experto en el arte.

Los siguientes ejemplos son solamente ilustrativos, en vez de limitantes, y proporcionan una comprensión más completa de la invención. Ejemplo 1 Este ejemplo demuestra la clonación y expresión de una alfa-toxina recombinante mutante ALD/H35K (rALD/H35K) en Escherichia coli. RALD/H35K contiene una eliminación del aminoácido de unión (ALD) y una mutación puntual en la posición del aminoácido 35, histidina a lisina (H35K) . Una construcción de expresión para la proteína mutante de alfa-toxina recombinante rALD/H35K sin marca de 6-histidina se prepararon como sigue. El gen de ALD/H35K fue amplificado por PCR a partir de una construcción marcada con histidina preparada previamente, pTrcHis-ALD/H35 . Los cebadores fueron diseñados para retirar la marca de histidina e incorporar sitios de restricción Ncol y BamHI en los terminis amino y carboxi, respectivamente. Después de amplificación y digestión de restricción el gen de ALD/H35K fue ligado en el vector de Invitrogen pTrcHisB en los sitios de restricción Ncol y BamHI. Al usar el ATG del sitio de restricción Ncol para iniciación de translación, la marca de histidina codificada por el vector y el sitio de fragmentación enteroquinasa fueron retirados. El resultado fue la expresión de la proteína sin aminoácidos N-terminal adicionales.

Se efectuó una doble digestión de restricción de pTrcHis-B usando Ncol y BamHI . Se usó entonces una reacción de PCR para crear el doble mutante ALD/H35K, sin la marca de His6. Los cebadores para la reacción de PCR fueron ALD-F ( 5 ' -GGCAGCATGCCATGGCAAATACTACAGTAAAAAC-3') (SEC ID NO: 1) y AGO- 2 (5'- GGAATTCGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC-3 ' ) (SEC ID NO: 2) . Después de PCR se efectuó la electroforesis a través de gel de agarosa. Después se analizó el gel y se fotografió, el gel fue colocado sobre un transiluminador de UV y el vector y el inserto (productos de PCR) fueron excisados. El vector y el inserto fueron extraídos a partir de las tajadas de agarosa usando un sistema de extracción de gel matriz. Se efectuó la precipitación por acetato de amonio/etanol del producto de PCR, seguido por una doble digestión de restricción del inserto extraído del gel usando Neo I y BamHI. Se efectuó entonces la purificación sobre resina de sílice del inserto digerido. El vector y el inserto fueron ligados de conformidad con las instrucciones del Equipo de Ligación Rápida de Genechoice™. Los productos de ligación fueron entonces transformados en células de alta eficiencia compatibles con GC10, las cuales fueron desarrolladas sobre placas de transformación. Se efectuó el cribado por "PCR de colonias" . Los cultivos de las colonias toda la noche que produjeron los aplicones del tamaño correcto (~ 800 pb) fueron desarrollados. Se prepararon perlas madres y minipreps de clones potenciales. Se efectuó un análisis por digestión de la enzima de restricción de las minipreps y las minipreps fueron cuantificadas para propósitos de secuenciación. Se efectuó la secuenciación usando cuatro cebadores: pTrcHis-en sentido directo (5'- GAGGTATATATTAATGTATCG-3 ' ) (SEC ID NO: 3), En sentido Directo-1 ( 5 ' -GGTACCATTGCTGG-3 ' ) (SEC ID NO: 4), En sentido directo- 2 (5 ' -CGATTGGTCATACACTG-3 ' ) (SEC ID NO: 5), y En sentido directo-3 (5'- CCAGACTTCGCTAC-3 ' ) (SEC ID NO: 6). La secuenciación verificó la secuencia de ADN correcta del inserto . Los cultivos también fueron desarrollados a partir de las perlas madres y se analizó la expresión de proteína por SDS-PAGE después de lisis celular. La sobre-expresión soluble del mutante de alfa-toxina rALD/H35K fue confirmada. Ejemplo 2 Este ejemplo demuestra la construcción de alfa-toxinas imitantes que carecieron de actividad tóxica o hemolítica de la alfa -toxina de tipo nativo de S. aureus . La sustitución/eliminación de His35 mutante, Eliminación del Amino de Unión (ALD) y la Eliminación Principal (SDD) fueron construidas para disruptar el poro heptamérico. Se cree que estas regiones desempeñan un papel crítico en la formación del poro. Se elaboraron los mutantes como proteínas recombinantes, y fueron construidos por técnicas de clonación por PCR. Los mutantes fueron entonces inducidos por IPTG para expresar a la proteína, las cuales fueron evaluadas por su actividad hemolítica/toxicidad. Se purificó el ADN genómico a partir de la cepa Wood 46 de S. aureus usando el equipo de purificación de ADN genómico Wizard™ de Promega. Se efectuó la PCR usando las combinaciones de cebadores que se exponen en las Tablas 1 y 2 siguientes.

Tabla 1 Nombre SEC Secuencia del ID cebador NO: KT01 7 5 ' GCATGCCATGGCAGATTCTGATATTAAT3 ' KT02 8 5 ' CGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC3 KT03 9 5 ' GAAAATGGCATGAAAAAAGTATTTTATAG3 ' KT04 10 5 ' CTATAAAATACTTTTTTCATGCCATTTTC3 ' AG01 11 5 ' GGCAGCATGCCATGGCAGATTCTGATATTAAT3 ' Tabla 1 (Continuación) Tabla 2 Mutante arca- PCR Primaria His C- terminal Modelo Cebadores Tipo- No ADN genómico AGOl y AG02 nativo H35del No ADN genómico AGOl y KT04,KT03 y AG02 H35A No ADN genómico AGOl y AG06,AG05 y AG02 H35L No ADN genómico AGOl y AG04,AG03 y AG02 ALD Si ADN genómico ALD-F y CTH-R H35K Si ADN genómico AGOl y H35K-R,H35K-F y CTH-R H35R Si ADN genómico AGOl y H35R-R,H35R-F y CTH-R H48E Si ADN genómico AGOl y H48E-R,H48E-F y CTH-R H48L Si ADN genómico AGOl y H48L-R, H48L-F y CTH-R SDD Si ADN genómico AGOly SDD-R, SDD-F y CTH-R H35R- Si H35R AGOl y H48E-R,H48E-F y CTH-R H48E H35K- Si H35K AGOl y H48E-R,H48E-F y CTH-R H48E Tabla 2 (continuación) Se efectuó entonces la doble digestión de restricción de los fragmentos de ADN amplificados por PCR y el ADN del vector pTrcHisB seguida por precipitación con acetato de amonio y etanol del ADN digerido Se ligaron el ADN del vector y el inserto digerido de restricción y precipitado en etanol, y células de E. coli competentes fueron transformadas con el ADN ligado y desarrolladas en placas de agar. Las colonias fueron picadas y se elaboraron preparaciones de plásmidos. Los plásmidos fueron digeridos con enzimas BamHI y Neo I y se corrieron sobre gel de agarosa para cribado para recombinante . Se elaboraron perlas madres a partir de las recombinantes y se secuenciaron. Los resultados de la secuenciación fueron emparejados con la secuencia de alfa-toxina de tipo nativo y se confirmó la presencia de las mutaciones deseadas. Se efectuó también la inducción por IPTG y la expresión de los mutantes . Los mutantes fueron expresados variadamente en formas solubles e insolubles. Las expresiones se confirmaron por SDS-PAGE. Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra la purificación y la caracterización de toxoide alfa de rALD/H35K sin una marca-his . Se lisaron células que contenían un plásmido de expresión y se indujeron para la expresión del toxoide alfa de rALD/H35K con lisozima. Luego se solubilizaron las membranas con ácido desoxicólico (DOC) . Se redujo la viscosidad del lisado celular por sonicación, seguido por una digestión de ADN/ARN con enzimas ADNasa y ARNasa. Los desechos celulares fueron retirados por centrifugación y el sobrenadante que contenía el toxoide alfa fue decantado para procesamiento adicional. Se efectuó la cromatografía sobre el sobrenadante usando una columna empacada con la resina Topopearl™ Fenil 650M. Las fracciones de la columna de Fenil 650 fueron analizadas por SDS-PAGE usando un método de tinción con Coomassie y se conjuntaron las fracciones, se seleccionó la pureza y la cantidad del alfa toxoide, fueron sometidas a diafiltración. Se efectuó cromatografía adicional usando una columna empacada con la resina Amersham Cibacron Blue Fast Flow™. Las fracciones de la columna fueron entonces analizadas otra vez por SDS-PAGE y se conjuntaron las fracciones, se seleccionadas por pureza y cantidad de alfa toxoide, fueron entonces sometidas a diafiltración. Se efectuó la cromatografía adicional usando una columna empacada con cerámica hidroxiapatita (CHT) . Las fracciones de la columna de CHT fueron analizadas por SDS-PAGE, y las fracciones seleccionadas fueron conjuntadas para su pureza y cantidad del alfa toxoide. Posteriormente se indica el proceso de purificación completo.

Se confirmaron el contenido de proteínas y el peso molecular por BCA, SDS-PAGE y cromatografía por exclusión de tamaño. La tinción Western y la secuenciación N-terminal confirmaron la identidad del alfa toxoide de rALD/H35K. La prueba ELISA en enparedado mostró que el proceso de purificación produjo 12 % de recuperación del alfa toxoide de rALD/H35K.

Se efectuó un ensayo hemolítico estándar sobre el alfa toxoide de rALD/H35K, y se mostró que el toxoide no tuvo actividad hemolítica. Ejemplo 4 Este ejemplo demuestra la purificación y caracterización del alfa toxoide recombinante para uso como una proteína portadora para elaborar el conjugado de proteína-PS. Se construyó un doble mutante de H35K/ALD (rALD/H35K) y se sobre-expresó en E. coli. El mutante fue purificado usando una primera columna por afinidad de Ni-NTA (carga de níquel) , luego se purificó adicionalmente por medio del uso de una columna de cerámica hidroxiapatita . Se evaluaron la antigenicidad y la toxicidad del alfa toxoide purificado por medio de la actividad hemolítica e inmunodifusión. Las células de E. coli fueron lisadas usando B-PER Benzonasa y PMSF. Se efectuó la centrifugación y se colectaron los sobrenadantes. Se efectuó la cromatografía usando una columna de Ni-NTA y las fracciones colectadas fueron analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones de alfa-toxina fueron conjuntadas y analizadas para proteína total por medio del ensayo para proteínas BCA. Las fracciones de alfa toxoide purificadas por Ni-NTA fueron entonces purificadas por cromatografía usando una columna de HPLC y se colectaron las fracciones. La alfa-toxina que contenía las fracciones fueron luego conjuntadas, concentradas y analizadas. Posteriormente se indica proceso de purificación. Diagrama de Purificación de Mutantes de Alfa-toxina Recombinante de H35K/ALD Se probaron la identidad y antigenicidad de la alfa-toxina purificada mutante, por inmunodifusión. Se efectuó también un ensayo hemolítico estándar sobre el alfa toxoide mutante, y éste mostró que el mutante no tuvo actividad hemolítica detectable . Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra que puede lograrse una protección pasiva sinérgica contra una alfa-toxina superior que produce el S. aureus aislado, por administración de AltaStaphTM en combinación con unos anticuerpos específicos derivados de a-toxina contra el a-toxoide de ALD/H35K recombinante mutante . AltaStaphTM (Nabi® Biopharmaceuticals , Rockville, Maryland) contiene altos niveles de anticuerpos a los antígenos del Tipo 5 y del Tipo 8 del polisacárido capsular de S. aureus. AltaStaphTM es producido por inmunización de voluntarios humanos saludables con StaphVAX® (Nabi® Biopharmaceuticals, Rockville, Maryland) , el cual comprende antígenos del Tipo 5 y del Tipo 8 del polisacárido capsular de S . aureus. Como se produce actualmente, AltaStaophTM es una solución al 5 % de proteína plasmática humana, estéril a pH de 6.2 en cloruro de sodio 0.075, clicina 0.15 M y polisorbato 80 al 0.01 %. Cada mi de solución contiene 50 mg de proteína, de los cuales la más del 96 % es inmunoglobulina IgG. Las clases IgA e IgB están presentes en concentraciones de < 1.0 g/1. Ochenta ratones hembras BALB/c fueron aleatorizados en jaulas limpias y encuarentenados por 6 días previos al inicio del estudio. Veinticuatro horas antes de la estimulación bacteriana, a 10 ratones por grupo se les administró dosis de anticuerpos en la cavidad intra-peritoneal . La designación del grupo para tratamiento con el anticuerpo individual se describe en la Tabla 3. Tabla 3 (Designación del grupo de estudio con base en el tratamiento con el anticuerpo) tamaño de todos los grupos fue El aislado 328 de Tipo 5 de S . aureus, un aislado que produce a-toxina superior, fué desarrollado toda la noche por ~ 20 horas en 10 mi de medio Columbia de Mg/CaCl2 a 37 °C con sacudidas constantes a 200 rpm. Al día siguiente, las bacterias fueron suspendidas en PBS a un O.D. de 0.1 a 540 nm. Este O.D. dio una concentración de ~ 2 x 107 U.F.C./ml que fue luego ajustado en serie a ~ 2 x 105 U.F.C./ml a volumen total de 25 mi. La suspensión bacteriana diluida fue colocada sobre hielo en preparación para la estimulación bacteriana en combinación con mucina de cerdo recientemente preparada. Se solubilizaron 5 gramos de mucina de cerdo en polvo en 50 mi de solución salina regulada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente por 5 -10 minutos con agitación constante. Después de mezclar, la suspensión fue autoclaveada por 10 minutos a ciclo sin interrupción, la suspensión fue enfriada en hielo y transferida a la instalación de los animales en un contendor lleno de hielo. En el momento de la inyección, la suspensión bacteriana fue suspendida en volúmenes iguales de mucina de cerdo al 10 %, se llenó en jeringas de 3 mi, y se inyectaron 500 µ? en la cavidad peritoneal de ratones usando jeringas adaptadas con agujas 25 G5/8. La dosis de estimulación actual calculada fue a 5.81 x 104 U.F.C. por 500 µ? de estimulante. Se registraron la mortalidad y la morbilidad post-estimulación por grupo de individuos a 16, 24, 41, 48, 65 y 168 horas. Se terminó el estudio en el quinto día de post- estimulación. Los datos de supervivencia por grupo de individuos tratados se indican en la Tabla 4 posterior. Los ratones a los que se administró 200 µg de IgG específica de T5CP (IGIV de AltaStaph™) suplementada con 4 mg de IgG de conejo total derivada de a-toxoide (rALD/H35K doble mutante) mostraron 100 % de protección. El nivel de protección declinó en ratones que fueron inmunizados con AltaStaphTM suplementado ya sea con 2 mg o 1 mg de IgG del toxoide. El índice de supervivencia para la dosis de 2 mg de IgG total fue de 90 % mientras que para la dosis de 1 mg fue de 60 % después de cinco días de estimulación. En contraste, AltaStaph no suplementada tuvo treinta por ciento de supervivencia, nientras que nos e observó ninguna protección con IgG de toxoide, IGIV de MEP.

Tabla 4 Protección pasiva sinérgica de IGIV de AltaStaph + IgG del toxoide (rALD/H35K) contra Staphylococcus aureus que secreta a-toxina altamente virulenta.

*Dosis total de IgG. ** = Supervivencia A = Grupo B = Administración de inmunoglobulina (IP) (Día 1 de la estimulación C = Estimulación con el asilado 328 de Staphylococcus aureus D = Supervivencia post-estimulación (horas postestimulación) a) 200 µ9 de la IgG de T5CP + 4 mg de IgG de a-toxoide* b) 200 µg de la IgG de T5CP + 2 mg de IgG de a-toxoide* c) 200 µg de la IgG de T5CP + 1 mg de IgG de oc-toxoide* d) 4 mg de IgG de oc-toxoide* e) 4 mg de IgG de conejo normal* f) 200 µg de la IgG de T5CP g) 5 x 104 U.F.C. en mucina al 5 % 200 µg de IgG específico de cápsula de IGIV de AltaStaphTM y el derivado de IgG de conejo contra ot-toxoide (rALD/H35 Mutante) no fue protectores contra la estimulación letal de S. aureus que secreta a-toxina muy hemolítica. No obstante, combinaciones de 200 µg de T5CP, IGIV humano de AltaStaphTM con anticuerpos de alfa-toxoide son 100 % protectores contra el estímulo letal de S. aureus hemolítico. La presencia de anticuerpos neutralizantes de la toxina en IGIV de AltaStaph proporciona eficiencia protectora adicional contra aislados de S. aureus que secretan a-toxina altamente virulenta.

Ejemplo 6. Generación del clon de Alfa-toxina rALD/H35K Se aisló el ADN genómico de la cepa de S. aureus ATCC # 10832, Wood 46, una cepa prototipo que produce la alfa-toxina (alf -hemolisina) obtenida del American Type Culture Collection (ATCC) , de conformidad con un protocolo de Promega modificado como se describe usando el equipo de purificación de Wizard Genómico DNA. Se diseñaron cebadores oligonucleótidos para crear una mutación puntual H35K y una eliminación del amino de unión (ALD, ??1-?17) . Los cebadores en sentido directo fueron diseñados para eliminar los péptidos de señal putativa e incorporar el sitio Ncol . El STG del sitio Ncol fue diseñado para servir como el codón de inicio de translación, eliminando las adiciones de los aminoácidos N- terminales codificados por el vector. Los cebadores en sentido contrario fueron diseñados para incorporar un sitio BamHI inmediatamente en el sentido de 3' a 5' del codón de inicio. Usando el gen hla del ADN genómico de Wood 46 como un modelo, se uso PCR para crear los mutantes individuales, H35K y ALD, y el doble mutante, ALD/H35K (con y sin las marcas de His6) . Cebadores usados: ALD: cebador en sentido directo con sitio Ncol, codón de inicio después de la secuencia del gen por ALD: 5' GGCAGCATGCCATGGCAAATACTACAGTAAAAAC 3' AG0-2 cebador en sentido contrario que codifica en al sitio BamHI y codón de inicio: ' G G A ATTCGTGG AT CCFF AATTTOTC ATTTCTTC 3 ' H35K-F: cebador en sentido directo que codifica a la mutación H35K: 5'GAAAATGGCATGAAAAAAAAAGTATTTTATAG H35K-R: cebador en sentido contrario que codifica a la mutación H35K: 5 'CTATAAAAT ACTTTTTTTTTCATGCC ATTTTG 3' CTH-R: Cebador C-terminal que codifica al codón de detención marcado con His6 y al sitio BamHI: 5 'GGAATTCGTGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGATT GTCATTTCTTC 3 ' AG01: cebador N-terminal que codifica al sitio Ncol, al codón de inicio, seguido por el gen hla: 5 'GGC AGCATGCC ATGGCAGATTCTGATATTAAT 3 ' Los productos de PCR fueron clonados en pTrcHisB o usando los sitios Ncol y BamHI como el procedimiento descrito por el fabricante (Invitrogen) . Además el inserto de Ncol-BamHI que contenía el gen hla-ALD/H35K fue subsecuentemente subclonado en pET28 (Novagen) .

Las construcciones resultantes fueron transformadas en células GC10 de E. coli usando el protocolo del fabricante (Gene Choice) . Se efectuó la secuenciación usando el ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing. Todos los clones con la secuencia correcta fueron transformados en GC10 de E. colli o BL21 (DE3 ) pLysS de E. coli para expresión. Ejemplo 7. Expresión y Purificación de rALD/H35K Se cultivaron en frascos de agitación la cepa GC10 o BL21 (DE3 ) pLysS de E, coli que contenían el plásmido rALD/H35K, en medios electivo a 37 °C hasta la fase media-log y se indujeron usando la concentración final de 1 mM de IPTG por 2 - 3 horas . Las células fueron cosechadas por centrifugación. El análisis de los cultivos de los frascos de agitación por SDS-PAGE y tinción Western mostraron una banda con un peso molecular aparente de 32 Kda que no fue evidente antes de la inducción. Este peso molecular que se observó fue consistente con las mutaciones presentes, mientras que la alfa-toxina recombinante de tipo nativo tiene un peso molecular aparente de 34 Kda.

Las células compactadas fueron re-suspendidas en 20 mM de TrisHCl, 50 mM de NaCl, pH de 8 y fueron tratadas con 2 mg/g de pasta de lisozima a temperatura ambiente por 20 minutos, seguido por disrupción de membrana con 0.25 % (peso/volumen) de ácido desoxicólico y sonicación con un sonicador Misonix. La suspensión celular disruptada fue mezclada con igual volumen de regulador de (NH4)2S04 2.25 M, 20 mM de Na2HP04 , pH de 7.0. El sobrenadante del lisado celular fue cosechado por centrifugación.

La proteína soluble fue cromatografiada en un ToyoPearl® Phenil 650M. El mutante rALD/H35K enlazado fue eluido usando un gradiente lineal de 1.5 a 0 M de (NH4)2S04 y 0 a 20 % de glicerol en regulador de 20 mM de Na2HP04, pH de 7. Las fracciones que contenían rALD/H35K fueron conjuntadas y diafiltradas contra 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 5 % de glicerol, pH de 7.0. las fracciones diafiltradas resultantes fueron aplicadas sobre una columna Blue Sepharose 6FF y eluida con un gradiente lineal de regulador de 0.1 a 2.5 M de NaCl en 20 mM de Tris, 5 % de glicerol, pH de 7.0. Las fracciones que contenían rALD/H35K fueron conjuntadas y diafiltradas contra regulador de 20 mM de Na2HP04, 100 mM de NaCl, 5 % de glicerol, pH de 6.8. El retenido fue entonces cromatografiado sobre columna de Cerámica Hidroxiapatita de Tipo 1 usando un gradiente lineal de 100 a 750 mM de NaCl en 20 mM de regulador de Na2HP04, 5 % de glicerol, pH de 6.8, el cual produjo rALD/H35K puro.

Para análisis por tinción Western las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF y fueron procesadas usando procedimientos estándares conocidos en el arte usando el anticuerpo monoclonal primario a mutante de alfa-toxina. Las manchas confirmaron la presencia del antígeno de rALD/H35K con una banda ásperamente a ~ 32 kDa. Además, la secuenciación N-terminal de rALD/H35K, confirmó la presencia del producto del gen hla-ALD/H35K. Las alfa- toxinas mutantes rALD y rH35K fueron purificadas usando la misma metodología. Ejemplo 8. Producción de Alfa-Toxinas, Anticuerpos Policlonales de rALD/H35K El rALD/H35K (50 µg) fueron inyectados en conejos New Zeland White con adyuvante (CFA seguido por IFA) en una proporción de 1:1, 3 veces, separadas 1 semana. El antisuero de rALD/H35K reconoció a rALD/H35K y a la alfa-toxina de S. aureus nativo (List Biological Laboratories) como un antígeno idéntico en un ensayo por inmunodifusión contra el antígeno. El antisuero de rALD/H35K reconoció a ambas alfa- toxinas de tipo nativo y mutante, como se muestra por tinción Western y ELISA. Estos resultados indican que la vacuna de rALD/H35K generó anticuerpos reactivos con alfa-toxina. Se combinaron mezclas positivas e IgGs se purificaron sobre una columna Protein G. La IgG anti-ALD/H35K purificada fue entonces usada en modelos animales. Ejemplo 9.Análisis Inirtunoquímico de Antígenos Anti - Alfa-Toxina Se llevó a cabo la inmunodifusión doble en gel de agarosa al 1 % para determinar la especificidad del antisuero de rALD/H35K, así como también para determinar la antigenicidad de antígenos de alfa-toxina. Resumiendo, 10 µ?/pocillo de 200 µ?/ml cada uno de antígeno de alfa-toxina (pocilios exteriores) y 10 µ?/pocillo de antisuero de rALD/H35K (pocilios del centro) se dejaron difundir a través del gel toda la noche en un ambiente húmedo. Los geles de agarosa fueron entonces lavados en PBS y comprimidos, secados y teñidos con azul de Coomassie. Los geles fueron analizados por bandas de precipitina, las cuales son formadas cuando el antígeno y el anticuerpo se enlazan juntos para formar un complejo antígeno-anticuerpo . Cuando dos antígenos, los cuales tienen epítopes compartidos que reaccionan en un antisuero, son colocados en pocilios adyacentes y difundidos contra el mismo antisuero, sus líneas de precipitina se fusionarán juntas para formar una "línea de identidad" . Se forma una línea de identidad parcial (una activación al punto de encuentro de dos líneas de precipitina) entre dos antígenos cuando no todos los antígenos los epítopes que reaccionan con Abs desde el antisuero están presentes en ambos antígenos. Cada una de las cuatro proteínas, la alfa-toxina nativa purificada a partir de S. aureus (List Biological Laboratories) , y imitantes recombinantes rALD/H35K, rALD y rH35K, reaccionaron con el antisuero anti-rALD/H35K como una banda de precipitina individual formando una línea de identidad que indica que el antisuero cultivado contra rALD/H35K reconoce a la alfa- toxina de S. aureus nativo, y al rALD y rH35K y rALD/H35K imitantes como antígenos idénticos o muy similares. Figura 1. Ejemplo 10. Producción del Hibridoma Alfa-Toxoide Se inmunizaron ratones BALB/c con rALD. Se colectaron los esplenocitos inmunizados de los ratones en este estudio y se fusionaron a células de mieloma Sp2/0, usando polietilen glicol al 50 %. Las células fusionadas fueron re-suspendidas en un medio de selección, se sembraron en placas para cultivo de tejido de 86 pocilios y se incubaron bajo condiciones humidificadas en una incubadora a 37 °C con C02 al 8 % . Los sobrenadantes de los cultivos desarrollados fueron cribados sobre placas ELISA recubiertas con el antígeno de rALD purificado, para anticuerpos monoclonales secretores (MAb) . Se generaron varios hibridomas y se establecieron 11 MAb secretores después de 2 procesos de clonación secuenciales . Las siembras madres fueron generadas a partir de cultivos de masa establecidos a partir de estos clones que fueron también usados para producir fluido de ascitas de ratón a partir del cual se prepararon MAbs purificados y se caracterizaron adicionalmente .

Ejemplo 11. Caracterización de Anticuerpos Monoclonales de Alfa-Toxina El análisis de caracterización reveló que 9 de 11 MAbs de alfa- toxinas (Alt ) establecidas, preparadas como se describió anteriormente enlazan específicamente a la alfa-toxina de S. aureus nativo (List Biological Laboratories) en evaluación por tinción Western, donde como 2 de 11 no reconocen a la alfa-toxina nativa. Todos los MAbs que fueron positivas a la tinción Western neutralizaron a la alfa- toxina de tipo nativo en experimentos hemolíticos de glóbulos rojos (RBC) (ver el Ejemplo 15) . La evaluación isotipificadora reveló que todos los MAbs establecidos son déla sub- clase kapa de IgGl . Las siembras madres fueron generadas a partir de cultivos en masa de clones establecidos que fueron también usados para producir fluido de ascitas de ratón a partir del cual se prepararon MAbs purificados y se caracterizaron adicionalmente . Ejemplo 12. Determinación In vitro de Actividad de Citotoxicidad por medio de Ensayo Hemolítico Se preparó una solución de 1.0 µg/ml de alfa-toxina purificada en una solución de 10 mM de Tris-HCl que contenía 0.85 % de cloruro de sodio (NaCl) , pH de 7.2 (dilución/regulador de lavado) . Se efectuaron diluciones de 2 veces en serie de antígenos de alfa- toxina en una placa de 96 pocilios. Se incluyeron en cada placa de ensayo, pocilios de células control que contenían solamente regulador de lavado (sin alfa- toxina) . Se lavaron secuencialmente, RBCs de conejo (Colorado Serum Co., # de cat. CS 1081), 2 veces a 10 volúmenes por lavado antes de re-ajuste a la concentración inicial con regulador de lavado. Un volumen igual de suspensión de RBC fue añadido a cada pocilio que contenía alfa-toxina y regulador de lavado. La placa fue incubada a 37 °C por 30 minutos para permitir a la alfa-toxina lisar los RBCs. La placa fue entonces centrifugada para compactar todos los RBCs y desechos celulares antes de efectuar la dilución de cada sobrenadante en regulador de lavado en los pocilios correspondientes de otra placa ELISA de poliestireno . Se midieron las Densidades Opticas (DO) de los sobrenadantes a 450 nm con la ayuda del lector de placas para ELISA que se sustrae de las OD de las células control (sin toxina) como referencia antes de reportar los datos. Se calculó entonces el por ciento de RBCs que fueron lisados debido a la actividad de la alfa-toxina. Se observo la hemolisis completa o casi del 100 % con 0.5 µg/ml de alfa-toxina de S. aureus o 0.5 µg/ml de alfa-toxina recombinante de tipo nativo (Tabla 5) No obstante, no se detectó ninguna actividad hemolítica medible con > de 185 veces más de antígeno de rALD/H35K (92.8 µg/ml) en este ensayo. Estos resultados demuestran que rALD/H35K no es hemolítico in vitro y por consiguiente podría ser usado como una vacuna para generar anticuerpos que sean reactivos con la alfa-toxina de S . aureus . Tabla 5 Actividad hemolítica de rALD/H35K en comparación con la alfa-toxina nativa y de tipo nativo Ejemplo 13. Neutralización del Anticuerpo Policlonal de la Alfa-toxina de S. aureus, Actividad Hemolítica Se efectuaron diluciones de dos veces en serie de anticuerpos de suero de conejo (anti-rALD/H35K de 4 conejos diferentes) o de suero de conejo normal en una placa de ensayo de 96 pocilios. Pocilios con células control que contenían regulador de lavado solamente (sin alfa-toxina y sin anticuerpos) y pocilios control con alfa-toxina (sin anticuerpos) , fueron incluidos en cada placa de ensayo. Un volumen igual de 4 x alfa- toxina concentrada (2 µg/ml) en regulador de lavado se añadieron a todos los pocilios con anticuerpo y aquellos con regulador de lavado solamente para control positivo de toxina. Se añadió regulador de lavado a volumen igual a todos los pocilios con células control que contenían solamente regulador de lavado. A cada pocilio con anticuerpo diluido, alfa-toxina y regulador de lavado para control celular, se añadieron RBCs en un volumen igual al de cada pocilio. Como un resultado, todas las concentraciones de anticuerpo y toxina son diluidas 4 veces las concentraciones iniciales . La placa fue incubada en una incubadora humidificada a 37 °C por 30 minutos. La placa fue entonces centrifugada para compactar todos los RBCs y desechos celulares antes de que se efectuara la dilución de cada sobrenadante en regulador de lavado en los pocilios correspondientes de otra placa ELISA de poliestireno . Se midieron las Densidades Opticas (OD) de los sobrenadantes a 450 nm con la ayuda de un lector de placas ELISA que se sustrae de las OD de células control (sin toxina) como referencia antes de reportar los datos. Se determinó la capacidad de neutralización de cada anticuerpo en relación con el control positivo con alfa-toxina. Los resultados (expuestos en la Tabla 6) demuestran que los cuatro conejos que fueron inmunizados con rALD/H35K produjeron anticuerpos que neutralizan a la alfa-toxina nativa de S. aureus . El suero anti-ALD/H35K hiper-inmune fue capaz de neutralizar aproximadamente 50 % a diluciones de aproximadamente 1:2648 a aproximadamente 1:6125, mientras que el suero de conejo normal no fue capaz de neutralizar 50 % de actividad hemolítica de alfa-toxina con suero 25 veces más concentrado a una dilución de 1:100. Estos datos demuestran claramente que anticuerpos específicos a ALD/H35K son efectivos al neutralizar la actividad de la alfa-toxina nativa in vitro.

Tabla 6 Neutralización in vitro de la actividad hemolítica de la alfa-toxina por medio de suero policlonal A = Factor de dilución del suero B = Por ciento de Neutralización por medio de C = Anti-rALD/H35K de conejo # 76b D = Anti-rALD/H35K de conejo # 76a E = Anti-rALD/H35K de conejo # 77a F = Anti-rALD/H35K de conejo # 77b G = Suero de conejo normal H = Factor de dilución al 50 % de neutralización N.M. = No medible Ejemplo 14. Inmunogenicidad de Antígenos de Alfa- Toxina y Reactividad de Anti-rALD/H35K y Actividad de Neutralización con Alfa-Toxina de S. aureus Se preparó suero policlonal de ratones hiper- inmunes por inmunización de 10 ratones por grupo. Se dio a los ratones 3 inyecciones, separados 1 semana, con 2.5 µg de antígeno (rALD/H35K, rH35K, rH35R, o rALD) , con o sin alúmina como adyuvante . Los ratones fueron exsangrados 1 semana después de la última inyección, se conjuntó el suero de los ratones para los antígenos respectivos, y se llevó a cabo ELISA estándar cuantitativa para determinar los títulos de IgG a alfa toxina de tipo nativo y al antígeno homólogo. Todos los sueros de ratón conjuntados reconocieron al antígeno homólogo y a la alfa- toxina nativa de S. aureus. Estos resultados demuestran que el rALD/H35K doble mutante fue capaz de producir niveles más altos de IgGs de alfa-toxina en comparación con otros antígenos de mutación puntual individual, y títulos mayores o similares al del antígeno de rALD. Los sueros de ratón conjuntados fueron también probados para neutralización de actividad hemolítica causada por la alfa-toxina de S. aureus in vitro como se describió en el Ejemplo 13. Los resultados (expuestos en la Tabla 7) muestran que el suero anti-rALD/H35K fue efectivo al neutralizar la actividad hemolítica.

Tabla 7 La inmunogenicidad, reactividad con alfa-toxina nativa, y neutralización de actividad hemolítica por suero de ratón policlonal. Suero de ratón IgG Anti- EU al 50 % de Alfa-toxina Neutralización Nativa (EU/ml) Anti-rALD/H35K 100 0.307 Anti-rALD/H35K con alumbre 189 0.459 Anti-rALD con alumbre* 69 0.194 Anti-rALD con alumbre* 207 0.396 Anti-rH35K con alumbre 17 NA Anti-rH35R 6 NA Anti-rH35K con alumbre 3 NA Anti-H35K 6 NA Anti-rALD con alumbre* 60 NA Anti-rALD 45 NA * Los resultados son reportados a partir de dos diferentes conjuntos de suero de ratón. Ejemplo 15. Neutralización de Actividad Hemolítica de Alfa-Toxina por Anticuerpos Monoclonales Sobrenadantes de cultivo de tejido que contenían MAbs de anti-alfa-toxina (obtenidos como se describe en el Ejemplo 10) fueron caracterizados por su habilidad para neutralizar a la alfa-toxina in vitro. Como controles negativos, un MAb específico al suero de conejo normal y con nicotina, respectivamente, fueron evaluados para actividad neutralizante. Se efectuaron diluciones de dos veces en serie de los anticuerpos en placas de ensayo de 96 pocilios. Pocilios de control celular que contenían regulador de lavado solamente (sin alfa-toxina y sin anticuerpos) y pocilios de control de alfa-toxina (sin anticuerpos) , fueron incluidos en cada placa de ensayo. Un volumen igual de alfa-toxina (2 µg/ml) en regulador de lavado fue añadido a todos los pocilios con anticuerpo y a aquellos con regulador de lavado solamente para control positivo de toxina. Se añadió regulador de lavado a volumen igual de todos los pocilios de control celular que contenían solamente regulador de lavado. A cada pocilio con anticuerpo diluido, alfa-toxina y regulador de lavado para control celular, se añadió RBCs lavados en un volumen igual al de cada pocilio. Como un resultado, todas las concentraciones de anticuerpo y toxina se diluyeron cuatro veces con respecto a las concentraciones iniciales. La placa fue incubada en una incubadora humidificada a 37 °C por 30 minutos. La placa fue entonces centrifugada para compactar todos los RBCs y desechos celulares antes de efectuar la dilución de cada sobrenadante en regulador de lavado en pocilios correspondientes de otra placa ELISA de poliestireno . Se midieron las Densidades Opticas (OD) de los sobrenadantes a 450 nm con la ayuda de un lector de placas ELISA que se sustrae de la OD de células control (sin toxina) como referencia antes de reportar los datos. Se determinó la actividad neutralizante de cada anticuerpo en relación con el control positivo de alfa-toxina. Los 9 MAbs que enlazan a la alfa-toxina nativa como se demostró por el análisis por tinción Western se mostró que neutralizan in vitro la actividad hemolítica por la alfa-toxina nativa (datos expuestos en la Tabla 8) . Los dos MAbs que fueron negativos para enlazar a la alfa-toxina nativa por tinción Western y un anticuerpo monoclonal no específico (2Nic311) fueron negativos para actividad neutralizante de la alfa-toxina.

Tabla 8 Neutralización in vitro de la actividad hemolítica de alfa-toxina por medio de anticuerpos monoclonales y policlonales .

NA = se detectó actividad neutralizante no medible o o se logró el 50 % de neutralización NA = Se detectó actividad neutralizante no medible o o se logró el 50 % de neutralización. Ejemplo 16 Neutralización de la Actividad Hemolítica de Alfa- toxinas a partir de Sobrenadantes de Cultivos Celulares de S. aureus por medio de Suero de Conejo Policlonal La habilidad de anticuerpos anti-rALD/H35K para neutralizar a la alfa-toxina secretada por S. aureus se demostró en un ensayo hemolítico in vivo. Toda la noche cultivos de S. aureus aislados ood (aislado prototipo de alfa-toxina ATCC # 10832) y aislado clínico de Nabi MRSA 328 fueron ajustados a OD5 onm de 2.0, centrifugados, y los sobrenadantes resultantes fueron filtrados. Los sobrenadantes diluidos cuatro veces fueron entonces añadidos luego a suero de conejo anti-rALD/H35K de conejo diluido en serie e incubados por 10 minutos. Después de la incubación, eritrocitos de conejo recientemente obtenidos fueron añadidos y las placas fueron incubadas por 30 minutos a 37 °C.

Después de incubación placas de micro-título fueron centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos y se cuantificó el grado de lisis midiendo los niveles de heme liberados usando un lector de ELISA a longitud de onda de 410 nm. Los resultados (expuestos en la Tabla 9) demuestran la actividad neutralizante del suero anti-rADL/H35K. A una dilución de 1:1000, anti-ALD/H35K fue capaz de neutralizar completamente 100 ng/ml de alfa-toxina nativa purificada y la alfa- toxina bacteriana secretada a partir de dos aislados clínicos in vitro de S. aureus. Tabla 9 Neutralización de la Actividad Hemolítica de Alfa- toxina a partir de Sobrenadantes de Cultivos Celulares de S. Aureus por medio del Suero de Conejo Anti -rALD/H35K .

Ejemplo 17 Neutralización In vivo de la Alfa-Toxina Nativa de S. Aureus por medio de Anticuerpos Clónales y Policlonales Se evaluó la eficiencia de neutralización in vivo de una de las MAbs de alfa-toxina obtenidas como se describió en el Ejemplo 10 (MAb lAlt660) y anticuerpos policlonales anti-rALD/H35K como sigue. Se administró intraperitonealmente (IP) a ratones BALB/c 100 µg de Mab lAlt660. Como un control a otro grupo de ratones de dio MAb generada contra componentes de la pared celular de E. colli (MAb 158) . De manera similar se administró a ratones 500 µg de IgG anti-ALD/H35K total obtenida a partir de conejos vacunados con rALD/H35K como se describió en el Ejemplo 8, con otro grupo de ratones a los que se administró un equivalente de IgG de conejo normal como un control. Veinticuatro horas después, los ratones fueron estimulados intra dérmicamente (ID) por medio de 10 µg de alfa-toxina nativa (List Biological Laboratories) , y se observaron para lesiones de piel y letabilidad por siete días. Los datos de inmunización pasiva mostraron que ambos el anticuerpo monoclonal lAlt660 y la IgG anti-ALD/H35K protegieron contra formación de heridas y la alfa-toxina indujo la mortalidad Los resultados se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10 Neutralización In vivo de Alfa-Toxina de S. Nativa Estimulada en Ratones BALB/c por medio Anticuerpos Monoclonales y Policlonales Ejemplo 18 Uso de la IgG Anti -rALD/H35K y de IgG de StaphVAX (IgG de Tipo 5 y de Tipo 8) Contra la Estimulación Letal de S. Aureus Para demostrar las ventajas de combinar neutralizantes y anticuerpos opsónicos en una terapia contra aislados de S. aureus muy virulentos, a ratones BALB/c se les administró vía la ruta intraperitoneal IgG de conejo anti-ALD/H35K (anticuerpos neutralizantes) en combinación con 200 µg de anticuerpos opsónicos, anticuerpos humanos de polisacáridos capsulares de Tipo y de Tipo 8 de S . aureus (AltaStaph, Nabi Biopharmaceuticals) . Como controles, se administró a ratones una dosis equivalente de anticuerpos que comprenden IgG anti-rALD/H35K o AltaStaph solos o IgG no inmune (IGIV humana estándar) . Veinticuatro horas después los ratones fueron estimulados IP por medio de 5 x 104 U.F.C. de Nabi MARSA 328 de S. aureus, la cual secreta altos niveles de alfa-toxina, en mucina de cerdo al 5 % y se monitorearon para morbilidad y mortalidad a 24 horas, 40 horas y 5-7 días después de estimulación bacteriana. Los resultados (expuestos en la Tabla 11) demuestran la eficiencia protectora de la combinación de neutralizante de S. aureus y anticuerpos opsónicos. Por consiguiente, los ratones inmunizados con IgG anti-rALD/H35K de conejo (neutralizante) en combinación con AltaStaph (IgG de polisacárido capsular anti-Tipo y Tipo 8 opsonisante) fueron protegidos de la estimulación con S. aureus altamente virulento, mientras que los ratones que recibieron ya sea IgG anti-rALD/H35K o bien AltaStaph solos no sobrevivieron a la estimulación. Tabla 11 Eficiencia de IgG anti-rALD/H35K y de IgG de StaphVAX Contra una Estimulación Letal de S. aureus.

Ejemplo 19 Método para la Preparación de la Vacuna Conjugada Usando rALD/H35K como una Proteína Portadora Se usó una alfa-toxina mutante no tóxica, rALD/H35K, como una proteína portadora en vacunas de conjugados proteína-polisacárido . Se describe un método para conjugar el antígeno PSl del polisacárido de S. epidermidis al rALD/H35K. Se preparó una solución de PSl (10 mg/ml) en regulador de MES 0.1 M. Se añadió dihidrazida de ácido adípico (ADH) como un polvo seco para producir una concentración final de 0.2 M. para iniciar la reacción, se añadió etil- 3- (3-dimetil aminopropil) carbodimida (EDC) a una concentración final de 0.05 M y luego se mantuvo en agitación por 30 minutos adicionales. La mezcla de reacción que contenía la PSl derivatizada (PS1-AH) , fue entonces dializada contra NaCl 1 M, seguida por agua destilada, y luego fue cromatografiada a través de una columna Sephadex G25 para remover la sal residual. La cantidad de ADH incorporado sobre el antígeno PS1-AH fue determinada colorimétricamente por medio del ensayo con ácido trinitrobencen sulfónico (TNBS) . Se preparó una solución que contenía rALD/H35K (2 mg/ml) en fosfato de sodio 0.05 M/regulador de imidazol 0.2 M que contenía NaCl 0.3 M. Subsecuentemente, se añadió anhídrido succínico a la proteína, proporción en peso de 2:1, y el pH se mantuvo a 8 usando NaOH 1 M por 2 horas mientras se agitaba. La proteína portadora derivatizada, rALD/H35K-suc, fue entonces dializada contra NaCl 0.2 M y fue purificada adicionalmente sobre una columna Sephadex-G25, conjuntada y concentrada. Se midió el contenido de proteína por BCA (Pierce) y se estimó la eficiencia de succinilación de la proteína midiendo los grupos amino antes de y después de la reacción por medio del ensayo con TNBS . Se preparó una solución que contenía 10 mg de PS1-AH y 10 mg de rALD/H35K-suc en 1 mi de regulado de MES 0.1 M/NaCl 0.2 M, pH de 5.7 - 5.8.A la mezcla de reacción se añadió EDC para producir una concentración final de 50 mM y la reacción se mantuvo por 30 minutos mientras se agitaba, y luego subsecuentemente se dializó contra NaCl 0.2 M. Se obtuvo el conjugado puro por cromatografía por exclusión de tamaño sobre columna Sephacryl S-300 eluida con NaCl 0.2 M. Se determinaron las cantidades de PS1 y de proteína portadora (rALD/H35K) en el conjugado por medio del ensayo con fósforo y el ensayo con BCA (Pierce), respectivamente. Como un control, se prepararon un conjugado de PS1 y un mutante no tóxico de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) (PSl-rEPA) usando la misma metodología. La Tabla 12 compara las características de PS1 de S. epidermidis-rALD/H35K a las del conjugado PSl-rEPA. Los derivados succínicos de rALD/H35K y rEPA tuvieron características muy similares en términos de eficiencia de succinilización según se monitoreó vía reducción en el número de grupos amino, la cual fue de 80 % y 75 %, respectivamente. Los conjugados PSl-rALD/H35K y PSl-rEPA resultantes tuvieron similares proporciones en peso de PS/PR (0.71 y 0.61) . Tabla 12 Caracterización de Conjugados de PSl de S. epidermidis Preparados con rALD/H35K o rEPA como una Proteína Portadora B = PS en el conjugado ^g/ml) C = PR en el conjugado ^g/ml) D = PS/PR (en peso) E = Cantidad de hidrazida en PSl (en peso) F = Reducción en el número de grupos NH2 en la proteína . Ejemplo 20 Inmunogenicidad de la Vacuna del Conjugado PSl-rALD/H35K Para evaluar la inmunegicidad de PSl-rALD/H35K, se inmunizaron 3 veces, 10 ratones BALB/c por grupo, con 2 semanas de separación, con 2.5 y 10 µg de conjugado PS1-rALD/H35K, con y sin adyuvante (QS-21) . Siete días después de la tercera inyección, los ratones fueron exsangrados y se colectó el suero. Se midieron las respuestas IgG anti-PSl e IgG antialfa-toxina en muestras de suero vía ELISA usando PS1 o alfa -toxina nativa (List Biological Laboratories) como un recubrimiento antigénico, respectivamente. Los resultados de inmunogenicidad se presentaron como el grupo de valores de la media geométrica (GM) de IgG en suero expresada en unidades ELISA/ml /UE/ml) . Los títulos de IgG anti-PSl fueron comparados con los asignados arbitrariamente al suero de referencia 100 UE/ml. El título de 100 UE/ml, representa la concentración de IgG específica que da OD450 nm de 2.0 a la dilución de 1:2000 en ELISA. Se calcularon los títulos de IgG anti-alfa-toxina por interpolación al asignado arbitrariamente al suero de referencia de 5,000 UE/ml. El título de 5000 UE/ml representa la concentración de IgG específica que da OD450 nm de 2.0 a la dilución de 1:5, 000 en ELISA. Se evaluaron todas las muestras de suero por neutralización de la actividad hemolitica in vitro de la alfa-toxina nativa como se describe en el Ejemplo 13. Después de inmunización, ambas respuestas de IgG anti-PSl y de IgG anti-alfa-toxina incrementaron en una forma dependiente de la dosis y se demostraron títulos crecientes cuando se usó un adyuvante durante la inmunización. Aunque se indujeron títulos anti-alfa-toxina significativos por medio del conjugado PSl-rALD/H35K, solamente los sueros titulados muy altos (> 300 UE/ml) fueron capaces de neutralizar la actividad hemolítica de la alfa-toxina nativa in vitro. Dichos niveles de neutralización de toxina relevantes de la IgG anti-alfa-toxina fueron inducidos en 90 a 100 % de los animales que recibieron 2.5 o 10 µg de PSl-rALD/H35K con adyuvante (QS-21) , mientras que sin adyuvante, la inmunización con 10 µg de conjugado indujo títulos de neutralización del 50 % en 2/10 animales. Estos datos muestran que puede usarse rALD/H35K como una proteína portadora para conjugados polisacáridos , por ejemplo, PSl-rALD/H35K, los cuales pueden ser usados para estimular ambos, títulos altos de anticuerpos de PS1 y también anticuerpos de alfa-toxina que son efectivos al neutralizar la actividad hemolítica de alfa-toxina nativa.

Tabla 13 Inmunogenicidad de la Vacuna Conjugada PSl-rALD/H35K epidermidis GM = Media Geométrica *Los valores de GM no fueron calculados si más de 6 sueros en el grupo de 10 no alcanzaron el título de neutralización de 50 % medible . El título mínimo de neutralización de 50 % es "4" y corresponde al uso de puro (suero sin diluir) en el ensayo de neutralización. A = Vacuna B = Dosis del conjugado C = MG de IgG anti-PSl (EU/ml) D = MG de IgG anti-alfa- toxina (EU/ml) E = MG de título neutralizante del 50 % (intervalo) F = No. de ratones/grupo con título de neutralización del 50 % > 4. Ejemplo 21 Producción de Anticuerpos Policlonales Opsónicos (Anti-Tipo 5, Anti-Tipo 8 y Anti-336) y Neutralizantes (Anti-LukS-PV y Anti-ALD/H35K) Se inyectaron antígenos en conejos New Zeland White 5 - 6 veces, separadas 2 semanas. Los conejos recibieron (1)50 µg de cada uno de los conjugados Tipo 5- rEPA, Tipo 8-rEPA, y 336-rEPA, (2)50 µg de cada uno de rALD/H35K y rLukS-PV con adyuvante (Titermax al 5 %) a una proporción de 1:1, (3) 50 µg de cada uno de los conjugados Tipo 5-rEPA, Tipo 8-rEPA y 336-rEPA, y 50 µg de cada uno de rALD/H35K y rLukS-PV con adyuvante (Titermax al 5 %) a una proporción de 1:1, o (4) PBS con adyuvante (Titermax al 5 %) a una proporción de 1:1. El antisuero generado por inmunización de los conejos con los conjugados Tipo 5-rEPA, Tipo 8-rEPA y 336-rEPA reconocieron polisacáridos de Tipo 5, Tipo 8 y 336 en ELISA e inmunodifusión. El antisuero generado al inmunizar conejos con rALD/H35K y rLukS-PV reconoció a la alfa-toxina de S. aureus (List Biological Laboratories) y rLukS-PV en ELISA e inmunodifusión. El antisuero generado por la inmunización de conejos con conjugados Tipo 5-rEPA, Tipo 8-rEPA y 336-rEPA y rALD/H35K y rLukS-PV reconocieron los polisacáridos Tipo 5, Tipo 8 y 336, alfa- toxina y LukS-PV en ELISA e inmunodifusión . Se combinaron las mezclas positivas y se las purificaron IgGs sobre una columna de proteína G o A. Los siguientes IgGs purificados fueron entonces usados en experimentos con modelo animal (1) IgG de polisacáridos capsulares anti-Tipo 5 y Anti-Tipo 8 e IgG anti-336 (anticuerpos opsónicos) ; (2) IgG anti-alfa- toxina ALD/H35K y anti-LukS-PV (anticuerpos neutralizantes) ; (3) IgG de polisacáridos capsulares anti-Tipo 5 y anti-Tipo 8, IgG anti-336, IgG anti-alfa- toxina ALD/H35K e IgG anti-LukS-PV (anticuerpos opsónico y neutralizante) . Ejemplo 22 Protección contra la estimulación de S. aureus por medio de la Inmunización Activa con Conjugado-Tipo 5, Conjugado-Tipo 8, Conjugado 336, rALD/H35K y rLukS-PV Se evaluó la habilidad de vacunas que comprenden conjugado-Tipo 5, conjugado- Tipo 8, conjugado- 336 , rALD/H35K y rLukS-PV para proteger contra infecciones de la piel inducidas por S. aureus. Se inmunizaron ratones hembras New Zeland, de 5 - 6 meses de edad, como se describió en el Ejemplo 21, para generar altos niveles de anticuerpos. Los conejos fueron sangrados siete días después de la 5a. o 6a. inyección y fueron evaluados para títulos del anticuerpo de IgG de polisacárido de Tipo 5, de Tipo 8, y 336, y alfa-toxina y LukS-PV por medio de ELISA. En todos los sueros relevantes, los títulos para estos antígenos fueron 1:105 a 106 de dilución parta una OD450 nm = 2. Las espaldas de los conejos fueron rasuradas e inyectadas intradérmicamente con 108 U.F.C/µ? de cepas de S. aureus, USA300-01114 (CA-MRSA productora de PVL) . Se observaron los animales para formación de lesiones dermonecróticas . La vacunación con conjugados de Tipo 5-rEPA, Tipo 8-rEPA y 336-rEPA, rALD/H35K y rLukS-PV indujeron altos títulos de anticuerpos por cada sub-unidad, respectivamente (dilución de 1:105 a 106 para una OD45onm = 2). Estos anticuerpos mostraron protección contra la formación de abcesos resultante de un S. aureus aislado que produce PVL (o CA-MRSA USA300) . Esto es, en el sitio de inyección, solamente se observó un ligero enrojecimiento en conejos inmunizados con la combinación pentavalente (conjugados de Tipo 5-rEPA, Tipo 8- rEPA, y 336-rEPA, rALD/H35K y rLukS-PV) . En contraste, se observó formación de abcesos en un conejo control, que recibió placebo (PBS más Titermax) . El conejo inmunizado con los cinco antígenos (conjugados de Tipo 5-rEPA, Tipo 8- rEPA, y 336-rEPA, rALD/H35K y rLukS-PV) estuvieron saludables en el día 8. No obstante, se observo que el conejo inmunizado con placebo tenía señales clínicas de morbilidad (pérdida de peso, letargía) . Por consiguiente, la inmunización con una vacuna de S. aureus pentavalente que contenía conjugados de Tipo 5, Tipo 8, 336, rALD/H35K y rLukS-PV previno infecciones por S. aureus, incluyendo infecciones inducidas por cepas productoras de PVL altamente invasoras . Ejemplo 23 Sinergia IgG de Tipo 5/Tipo 8/336 (IgG Opsónico) e IgG de Alfa-Toxina/PVL (IgG neutralizante) contra la estimulación por S. aureus Para demostrar las ventajas de la combinación de anticuerpos policlonales opsónicos y neutralizantes (pAbs) contra S. aureus aislado muy virulento, ratones BALB/c fueron inmunizados pasivamente intraperitonealmente con (1) IgG de polisacárido capsular de Tipo 5 y de Tipo 8 y PAbs opsónico IgG anti-336; (2)pAbs neutralizante IgG de conejo anti-alfa-toxina ALD/H35K y anti-LukS-PV; o (3) IgG de polisacárido capsular anti-Tipo 5 y anti-Tipo 8, IgG anti-336, IgG Anti-ALD/H35K e IgG anti-LukS-PV (por ejemplo, una combinación de pAbs opsónica y neutralizante) . Como controles, se administró a los ratones una dosis equivalente, 2 mg de IgG total de IgG de conejo. Veinticuatro horas después, los ratones fueron rasurados para retirar el forro de piel sobre sus espaldas y fueron estimulados vía ruta intradérmica (ID) por 1 x 108 U.F.C. de S. aureus USA300-01114 , una cepa de CA-MRSA que secreta PVL y alfa-toxina. Se observaron los ratones para lesiones dermonecróticas a 16 y 72 horas. Los resultados (expuestos en la Tabla 14) demuestran la eficiencia protectora de la combinación de pAbs opsónico y neutralizante de S. aureus. Por consiguiente, ratones inmunizados con la combinación de pAbs inmunizante y opsónico (anti- Tipo 5, anti-Tipo 8, anti-336, anti-alfa-toxina rALD/H35K y anti-rLukS-PV) fueron protegidos de la estimulación por S. aureus muy virulento, mientras que ratones que recibieron ya sea pAbs opsónico solo (anti-Tipo 5, anti-Tipo 8 y anti-336) o pAbs neutralizante solo (antialfa-toxina ALD/H35K y anti-LukA-PV) no fueron protegidos de esta estimulación.

Tabla 14 Sinergia de pAbs Neutralizante y Opsónica en Protección contra la Infección por S. aureus . Agente Inmunizante Número de ratones Postestimulación con lesiones necróticas 16 h 72 h IgG de conejo anti-Tipo 5, anti-Tipo 8, 0/10 1/10 anti-336 (pAbs opsónico, 1 rag de IgG total) IgG de conejo anti-Tipo 5, anti-Tipo 8, 0/10 5/10 anti-336 (pAbs opsónico, 1 mg de IgG total) e IgG de conejo normal (1 mg de IgG total) IgG de conejo anti-alfa-toxina 0/10 4/10 rALD/H35K y anti-LukS-PV (pAbs neutralizante, 1 mg de IgG total) e IgG de conejo normal (1 mg de IgG total) IgG de conejo normal (2 mg de IgG 0/10 9/10 total) PBS - Placebo 0/10 10/10 Ejemplo 14 Clonación, Expresión y Purificación de Sub-unidades Gama-Hemolisina de S. aureus Se extrajo ADN genómico de la cepa de S. aureus ATCC 49775, y se diseñaron cebadores para clonar los genes gama-hemolisina, hlgA, hlgb y hlgC, en el vector plásmido pTrcHisA que confiere resistencia a ampicilina. Usando la reacción en cadena polimerasa (PCR) , fue retirado el péptido de señal de los tres genes, y los sitios BaralII y Ncol fueron diseñados para clonación. El producto de PCR fue digerido con BamIII y Ncol, y los tres genes fueron ligados separadamente con el vector digerido similarmente . El ADN ligado fue entonces transformado en células GC-10 competentes químicamente de E. colli que fueron desarrolladas en placas de agar LB que contenían ampicilina. Se usó la PCR para cribar colonias por el inserto del gen correcto, y las colonias positivas fueron desarrolladas en caldo LB, después de lo cual se extrajo el ADN plásmido y fue digerido con BamHI y Ncol para confirmación. Las muestras del inserto del gen correcto fueron entonces secuenciadas , y los plásmidos con los insertos correctos fueron entonces transformados en células químicamente competentes BL21 (DE3 ) pLysS de E. colli para expresión de proteína. El mismo procedimiento se usó para purificar HlgA, HlgB, y HigC por desarrollo de E. colli que expresa a cada una de las sub-unidades separadamente en 2 litros de medio Circlegrow a 37 °C por inducción con IPTG a 30 °C. Las células bacterianas fueron entonces cosechadas por centrifugación y la pasta celular fue expuesta a un choque osmótico usando una solución de sacarosa al 20 % seguido por re-suspensión en un regulador hipo-osmótico. Se retiró el desecho celular por centrifugación y se filtró el sobrenadante y luego se cargó sobre una columna de intercambio catiónico de SP Sepharose. Se usó un gradiente lineal de solución de cloruro de sodio para elución, y las muestras eluidas fueron analizadas sobre una SDS-PAGE. Las muestra que contenían la proteína del tamaño correcto fueron conjuntadas y cargadas sobre una columna de cerámica hidroxiapatita (CHT) , y otra vez se usó un gradiente lineal de cloruro de sodio para elución. Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE y tinción Western. Por análisis por tinción Western, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF y fueron procesadas usando procedimientos estándares conocidos en el arte usando anticuerpos anti-LukS-PV o anti-LukF-PV. Las manchas confirmaron la presencia de los antígenos rHIgA, rHIgB, y rHIgC con una banda aproximadamente a ~ 32 - 34 kDa.

Ejemplo 25 Producción y Caracterización de Anticuerpos Policlonales de Leucocidina Se inyectaron rLukS-PV, rLukF-PV, rHIgA, rHIgB, o rHIgC (50 µg de cada uno) en conejos New Zealand White con adyuvante (Sigma Titermax o CFA seguido por IFA) a una proporción de 1:1, 3 a 6 veces, separados 2 semanas. El antisuero LukA-PV reconoció a rLukS-PV como un antígeno idéntico en un ensayo de inmunodifusión contra el antígeno, mientras que el antisuero rLukF-PV reconoció a LukF-PV. rLukS-PV o rLukF-PV no reaccionaron con el antisuero heterólogo . Ejemplo 26 Reactividad Cruzada de las Sub-unidades Leucocidina de S. aureus, HlgA, HlgB, HigC con anticuerpos de PVL Se llevó a cabo la doble inmunodifusión en gel de agarosa al 1 % para determinar la especificidad del antisuero de PVL, así como también para determinar la antigenicidad de antígenos de la sub-unidad HIg. Resumiendo, 10 µ?/pocillo de 200 µg/ml de antígeno de leucocidina (pocilios exteriores) y 10 µ?/pocillo de antisuero de LukS-PV o de antisuero de LukF-PV (pocilios del centro) se dejaron difundir a través del gel toda la noche en un ambiente húmedo. El gel de agarosa fue entonces lavado en PBS y comprimido, secado y teñido con azul de Coomassie.

Los geles fueron analizados para bandas de precipitina, las cuales se formaron cuando el antígeno y el anticuerpo se enlazan juntos para formar un complejo antigeno-anticuerpo. Cuando dos antígenos, los cuales tienen epítopes compartidos que reaccionan a un antisuero, son colocados en pocilios adyacentes y difunden contra el mismo antisuero, su líneas de precipitina fundirán juntas formando una "línea de identidad" . Una línea de identidad parcial (una activación en el punto de encuentro de las dos líneas de precipitina) entre dos antígenos es formada cuando no todos los epítopes reaccionan con Abs del antisuero están presentes en ambos antígenos . Tres sub-unidades S de leucocidina de S. aureus, rHIgA (A) , rHIgC y LukS-PV (S) reaccionaron con el suero anti-LukS-PV como una sola banda de precipitina formando una línea de identidad parcial y estas sub-unidades Son reaccionaron con antisuero anti-LukF-VP . Esto indica que el antisuero cultivado contra rLukS-PV reconoce a las sub-unidades S de gama-toxina de S. aureus, HlgA y HigC, como antígenos similares que tengan no todos pero algunos epítopes compartidos. De manera similar, dos sub-unidades de leucocidina F, rHIgB (B) y rLukF-PV (F) , reaccionaron con suero anti-LukF-PV como una banda única de precipitina formando una línea de identidad parcial y no reaccionaron con el antisuero LukS-PV. Esto indica que el antisuero cultivado contra rLukF-PV reconoce a la sub-unidad F de gama-hemolisina de S. aureus, HlgB, como antígenos similares que tienen no todos pero algunos epítopes compartidos. Por consiguiente, los anticuerpos de PVL tienen reacción cruzada con la leucocidina de S. aureus, gama-hemolisina . Se efectuó ELISA cuantitativo con ambos anticuerpos anti-LukS-PV y anti-LukF-PV, que confirmó que hay reactividad cruzada entre las sub-unidades S de leucocidina (rHIgA, rHIgC y rLukS-PV) , así como también reactividad cruzada entre las sub-unidades de leucocidina F (rHIgB, y rLukF-PV) , no se demostró reactividad cruzada entre las subclases S y F de leucocidina. Ejemplo 27 Reactividad de Anticuerpos de Leucocidina Se evaluaron los anticuerpos policlonales de conejo (anti-LukS-PV, anti-LukF-PV, anti-HlgA, anti-HlgB y anti-HlgC) , para reactividad con varios antígenos de leucocidina, incluyendo rLukS-PV, rLukF-PV, rHIgB y rHIgC, usando técnicas ELISA estándares. Resumiendo, Se recubrieron placas de 96 pocilios con 1 µg/ml del antígeno de leucocidina específico, y luego las placas se lavaron y luego se bloquearon con BSA. Las placas fueron lavadas de nuevo, y luego suero de conejo anti-leucocidina o suero de conejo control de referencia fueron diluidos en serie y depositados en las placas e incubadas . Las placas fueron lavadas de nuevo y se añadió un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano (HRP) . Las placas fueron lavadas y luego desarrolladas usando un sistema de sustrato de peroxidasa con reactividad determinada por lectura de OD450nm- Se consideró positiva la reactividad cruzada cuando OD a 450 nm fue mayor de 2. Los datos de ELISA demostraron que las sub-unidades de leucocidina S (rLukS-PV, rHIgA y rHIgC) son reactivas con los anticuerpos anti-LukS-PV, anti-HlgA y anti-HigC, mientras que las sub-unidades de leucocidina F (rLukF-PV y rHIgB) son reactivas con los anticuerpos anti-LukF-PV y anti-HlgB (Tabla 15) . Las sub-unidades de leucocidina S (rLukS-PV, rHIgA y rHIgC) no fueron reactivas con los anticuerpos anti-HlgB y anti-LukF-PV, mientras que las sub-unidades de leucocidina F (rLukF-PV y rHIgB) no fueron reactivas con los anticuerpos anti-LukS-PV, anti-HlgA, o anti-HlgC. Por consiguiente, los anticuerpos de leucocidina S tienen reacción cruzada con las sub-unidades de leucocidina S heterólogas y los anticuerpos de leucocidina F tienen reacción cruzada con las sub-unidades de leucocidina F. Tabla 15 Reactividad Cruzada de Anticuerpos de Leucocidina con Sub- unidades de Leucocidina O.D. a 450 nm para la dilución 1:1000 de Anti-suero Antígeno de Anti- Anti- Anti- Anti- Anti- recubrimiento HlgA HlgB HlgC LukS-PV LukF-PV Anti- HIgA 3.87 0.08 1.47 3.5 0.06 Anti- HIgB 0.06 2.52 0.14 0.06 3.52 Anti- HIgC 0.35 0, 18 1.95 3.43 0.07 Anti- LukS-PV 1.64 0.1 1.96 3.7 0.1 Anti- LukF-PV 0.12 0.38 0.08 0.1 3.4 Ejemplo 28 Neutralización de gama-hemolisina de S. aureus por medio de Anticuerpos Policlonales de Leucocidina Se desarrollaron células H-60 en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % en la presencia de DMSO por 7 días para inducir la diferenciación. Las células fueron entonces cosechadas por centrifugación a velocidad lenta, y fueron luego sembrada en una placa de 96 pocilios a 5 x 105 células/pocilio usando medio libre de FBS. Se incubaron concentraciones diferentes de gama-hemolisina (HlgA/HlgB o HigC/HlgB) con diluciones diferentes de anticuerpos anti-LukS-PV, anti-LukF-PV policlonales de conejo o suero de conejo normal por 30 minutos a 37 °C. Las mezclas de los anticuerpos y las toxinas fueron entonces añadidas a las células, y se dejaron incubar por 24 horas. Se añadió entonces solución de XTT(2, 3-Bis(2- metoxi- 4- nitro- 5- sulfofenil) - 2H-tetrazolio- 5- carboxanilida, sal interior) a las células y se midió la absorbancia a 450 nm para determinar la viabilidad celular. Como un control, se llevó a cabo la reacción sin la adición de cualquier suero de conejo. HlgA/HlgB y HlgC/HlgB fueron citotóxicas para células HL-60 a una concentración de 250 ng/ml y 32 µg/ml, respectivamente. Tanto el antisuero anti-LukS-PV como el anti-LukF-PV fueron capaces de neutralizar la citotoxicidad de HlgA/HlgB y HlgC/HlgB. El efecto de neutralización del anti-suero fue dependiente de la dilución, en contraste al efecto del suero de conejo normal que mostró un bajo nivel de neutralización no específica. La actividad citotóxica de HlgA/HlgB fue neutralizada por 84 % y 74 % por antisuero anti-LukF-PV y anti-LukS-PV a una dilución de 1:20. La citotoxicidad de HlgC/HlgB fue neutralizada por 91 % y 72 %, respectivamente por anti-LukF-PV y anti-LukS-PV a una dilución de 1:5. Esto demuestra claramente que anticuerpos anti-leucocidina tienen reacción cruzada con las leucocidinas heterólogas .

Tabla 16 Neutralización Cruzada de HlgA/HlgB y HlgC/HlgB de Gama- hemolisina con anticuerpos anti-LukS-PV y anti-LukF-PV Dilución del % de neutralización de la citotoxicidad anti-suero de HIgA/HIgB Suero de Anti-LukS-PV Ati-LuckF-PV conejo normal 1:20 22 74 84 1:40 21 63 65 1:80 17 48 66 1: 160 23 26 38 1:320 23 24 17 1:1000 23 12 13 Dilución del % de neutralización de la citotoxicidad anti-suero de HIgC/HIgB Suero de Anti-LukS-PV Ati-LuckF-PV conej o normal 1 : 5 13 72 91 1 : 10 16 50 53 1:20 13 28 28 1:40 16 9 19 1:80 6 13 13 1:160 9 9 13 Ejemplo 29 Neutralización de la Citotoxicidad de PVL de S. aure s por los Anticuerpos Policlonales de Leucocidina Se desarrollaron células HL-60 en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % en la presencia de DMSO por 7 días para inducir la diferenciación. Las células fueron entonces cosechadas por centrifugación lenta, y luego fueron sembradas en una placa de 96 pocilios a 5 x 105 células /pocilio usando medio libre de FBS . Se incubaron PVL (32 µg/ml de rLukS-PV y rLukF-PV) con diferentes diluciones de anticuerpos anti-HlgA, anti-HlgB, y anti-HlgC policlonales de conejo o suero de conejo normal por 30 minutos a 37 °C. Las mezclas de los anticuerpos y las toxinas fueron entonces añadidas a las células y se mantuvieron en incubación por 24 horas. Se añadió entonces solución de XTT(2, 3-Bis(2- metoxi- 4-nitro- 5- sulfofenil) - 2H- tetrazolio- 5- carboxanilida, sal interior) a las células y se midió la absorbancia a 450 nm para determinar la viabilidad celular. Como un control, se llevó a cabo la reacción sin la adición de cualquier suero de conejo. PVL fue citotóxicas para células HL-60 a una concentración de 32 µg/ml. Los antisueros anti-HlgA, anti-HlgB y anti-HlgC de conejo fueron capaces de neutralizar la citotoxicidad de PVL. El efecto de neutralización del anti-suero fue dependiente de la dilución, en contraste al efecto del suero de conejo normal mostró un bajo nivel de neutralización no específica. La actividad citotóxica de PVL fue neutralizada 32 % 26% y 26 % por antisuero anti-HlgA, anti-HlgB y anti-HlgC, respectivamente. El suero de conejo normal mostró muy poca o ninguna actividad de neutralización (1 %) a dilución de 1:1. Por consiguiente, los anticuerpos específicos de leucocidina demostraron la neutralización de las leucocidinas heterologas. Tabla 17 Neutralización Cruzada de la Toxina de PVL con anticuerpos anti-HlgA, anti-HlgB y anti-HlgC Ejemplo 30 Neutralización de la Citotoxicidad de Leucocidina de S. aureus por medio de Anticuerpos Policlonales de Leucocidina Se demostró la citotoxicidad de leucocidina y la neutralización de la citotoxicidad de leucocidina por medio de anticuerpos de leucocidina. Se incubaron leucocidinas (ya sea PVL o bien HigC/HlgB de gama-hemolisina, cada una a 400 ng/ral) , con diferentes diluciones de anticuerpos anti-HlgA, anti-HlgB, o anti-HlgC policlonales de conejo o suero de conejo normal por 30 minutos a 37 °C. Se añadieron las mezclas de anticuerpo/toxina a 5 x 105 células/pocilio de leucocitos polimorfonucleares humanos (PMNs) usando medio libre de FBS y se mantuvieron en incubación por 2 horas. Se añadió a las células solución de XTT (2, 3-Bis(2- metoxi-4- nitro- 5- silfofenil) - 2H- tetrazolio- 5- carboxanilida, sal interior) y se midió la absorbancia a 450 nm para determinar la viabilidad celular. Como un control, se llevó a cabo la reacción sin la adición de suero de conejo. PVL y gama-hemolisina (HlgC/HlgB) de S. aureus fueron citotóxicos a PMNs a una concentración de 400 ng/ml . Los anti-sueros anti-HlgA, anti-HlgB y anti-HlgC de conejo fueron capaces de neutralizar la citotoxicidad de PVL, y anti-Luk-PV, y anti-LukF-PV fueron capaces de neutralizar la citotoxicidad de HlgC/HlgB. El efecto de neutralización del anti-suero fue dependiente de la dilución, en contraste al efecto del suero de conejo normal, el cual mostró un bajo nivel de neutralización no específica. Estos datos muestran que anticuerpos específicos de leucocidina son capaces de neutralizar leucocidinas heterologas.

Tabla 18 Neutralización Cruzada de Leucocidinas, PVL, y gama- hemolisina de S. aureus, con anticuerpos de leucocidina Ejemplo 31 Sinergia de Anticuerpos Monoclonales de Tipo 5/Tipo 8/336 (Anticuerpos Opsónicos) y Anticuerpos Monoclonales de Alfa-Toxina/Leucocidina (Anticuerpos Neutralizantes) contra S. aureus Para demostrar las ventajas de combinar anticuerpos monoclonales neutralizantes y opsónicos (mAbs) en una terapia contra S. aureus aislados altamente virulentos, se inmunizaron pasivamente intraperitonealmente ratones BALB/c con (l)mAbs de polisacáridos capsulares anti-Tipo 5 y anti-Tipo 8 y mAbs anti-336 (mAbs opsónico) , (2) mAbs anti-Alfa-toxina y anti-Luk-PV (mAbs neutralizante de la toxina) , o (3) mAbs de polisacarido capsular anti-Tipo 5 y anti-Tipo 8 y mAbs anti-336, y mAbs anti-alfa- toxina y mAbs anti-LukS-PV (combinación de mAbs opsónico y neutralizante) . Como controles, se administró a los ratones anricuerpo monoclonal no específico o PBS . Veinticuatro horas después, los ratones fueron rasurados para retirar la piel sobre sus espaldas y fueron estimulados vía ruta intradérmica (ID) por 1 x 108 U.F.C. de S. aureus USA300-01114, una cepa de CA-MRSA que secreta PVL y alfa- toxina. Se observaron los ratones para infección en tejido blando y piel a 72 horas. Los resultados (expuestos en la Tabla 19) demuestran la eficiencia protectora de la combinación de anticuerpos opsónicos y neutralizantes de la toxina de S. aureus a 72 horas post estimulación bacteriana con S. aureus USA300 aislado, en comparación con el efecto protector de la inmunización con anticuerpos inmunizantes u opsónicos solos . Los ratones control que recibieron anticuerpo monoclonal no específico o PBS no fueron protegidos de la infección bacteriana porque todos los ratones desarrollaron lesiones necróticas de piel y tuvieron una velocidad más alta de contaminación bacteriana en órganos. Los ratones inmunizados con anticuerpos neutralizantes de toxina (anticuerpos monoclonales anti-alfa-toxina y anti-leucocidina) mostraron una reducción en el número de lesiones en piel, mientras que ratones inmunizados con anticuerpos opsónicos (anticuerpos monoclonales anti-Tipo 5, anti-Tipo 8 y anti-336) mostraron una reducción en la contaminación bacteriana en órganos . Los ratones inmunizados tanto con anticuerpos opsónicos como con anticuerpos neutralizantes (anticuerpos monoclonales anti-Tipo 5, anti-Tipo 8, anti-336, anti-alfa-toxina y anti-LukS-PV) estuvieron protegidos de la estimulación de S. aureus altamente virulento porque tuvieron número decreciente de lesiones en piel y una velocidad más baja de contaminación bacteriana en órganos. Por consiguiente, la combinación de los anticuerpos opsónico y neutralizante demostró un efecto protector en la prevención de infección en tejido blando y piel y en contaminación bacteriana en órganos . Tabla 19 Efecto Protector de Anticuerpos Opsónico y Neutralizante en la Protección contra la estimulación con S. aureus *Dosis alta: 500 µ? cada uno para anticuerpos opsónicos y 100 µ cada uno para anticuerpos neutralizantes **Dosis baja = 100 cada uno para anticuerpos opsónicos y 50 µ<3 cada uno para anticuerpos neutralizantes.

Aunque la invención ha sido descrita y ejemplificada con suficiente detalle para los expertos en el arte la elaboren y usen, varias alternativas, modificaciones, y mejoras serán obvias sin alejarse del espíritu y del alcance de la invención. Los ejemplos proporcionados en la presente son representativos, son ejemplares, y no se previeron como limitantes del alcance déla invención. Modificaciones en la presente y otros usos tendrán lugar para los expertos en el arte. Estas modificaciones son abarcadas en el espíritu de la invención y se definen por el alcance de las reivindicaciones . Todas las Patentes y Publicaciones mencionadas en la especificación son indicadoras de los niveles de aquellas de la experiencia en el arte al cual la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones se incorporan a la presente como referencia en el mismo grado que si cada publicación individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada como referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION
Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1.- Una composición de antígeno Staphylococcal caracterizada porque comprende (i) un antígeno de Tipo 5 de S. aureus aislado, (ii) un antígeno de Tipo 8 de S . aureus aislado, (iii) un antígeno 336 de S. aureus aislado, (iv) un antígeno de alfa-toxina de S. aureus aislado, y (v) un antígeno de leucocidina Staphylococcal aislado. 2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos uno de dichos antígenos Staphylococcal es un antígeno protector. 3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho antígeno de alfa- toxina de S. aureus es conjugado a al menos uno de dicho antígeno de tipo 5, dicho antígeno de Tipo 8, dicho antígeno 336, y un antígeno de leucocidina.
4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho antígeno de alfa toxina contiene al menos dos alteraciones, en relación con la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad.
5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno de leucocidina Staphylococcal es seleccionado del grupo que consiste de sub-unidades antigénicas de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad gama-hemolisina .
6. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antígeno de la leucocidina Staphylococcal es seleccionado del grupo que consiste de (i) una sub-unidad LukF-PV de PVL de S. aureus, (ii) una sub-unidad de PVL de S. aureus, (iii)una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgA, (iv)una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgB, (v)una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgC, (vi)LukD de S. aureus, (vii)LukE de S. aureus, (viii) LukM de S. aureus, (ix) una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. aureus, (x)LukF-I de 5. intermedius; y (xi)una sub-unidad LukS-I de S. intermedius .
7. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada adicionalmente porque comprende uno o más antígenos bacterianos adicionales.
8. - La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque al menos uno de uno o más antígenos bacterianos adicionales es un antígeno Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a las proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) , y combinaciones de las mismas.
9. - Una composición caracterizada porque comprende un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y un portador aceptable farmacéuticamente, caracterizada porque dicho antígeno de alfa-toxina contiene al menos dos alteraciones moleculares, en relación con la alfa -toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad.
10. -La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque al menos una de las alteraciones moleculares comprende una sustitución, inserción o eliminación de la secuencia de aminoácido de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
11. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizad aporque al menos una de dichas alteraciones moleculares comprende una sustitución en la secuencia de aminoácidos de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
12. - La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha sustitución tiene lugar en una localización que corresponde a His-35 de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque dicha sustitución es una sustitución de Arg, Lys, Ala, Leu, o Glu por His .
14. - La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque al menos una de dichas alteraciones moleculares comprende una sustitución, inserción o eliminación en el dominio de unión amino de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dicha alteración molecular es una eliminación en el dominio de unión amino de la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
16. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque dicha alteración molecular es una eliminación en el dominio principal de alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo.
17. - Una composición caracterizada porque comprende (i) un antígeno de alfa-toxina de S. aureus aislado; (ii) uno o más antígenos bacterianos adicionales diferentes del antígeno de alfa-toxina de S. aureus mencionado, en donde uno o más antígenos bacterianos aislados adicionales mencionados comprende un antígeno de leucocidina Staphylococcal aislado.
18. - La composición de conformidad con la reivindiación 17, caracterizada porque además comprende uno o más antígenos bacterianos seleccionados del grupo que consiste del Tipo 5 de S. aureus, Tipo 8 de S . aureus, 336 de S. aureus, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a las proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) , y combinaciones de las mismas.
19.- La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque dicho antígeno Staphylococcal adicional es un antígeno protector.
20.- La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicho antígeno de alfa-toxina de S. aureus es conjugado a al menos uno de dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales .
21. - La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque dicho antígeno de alfa-toxina contiene al menos dos alteraciones, en relación con la alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo, que reduce su toxicidad.
22. - Un método para hacer una preparación de inmunoglobulina intravenosa específica hiperinmune (IVIG) , caracterizado porque comprende: (i) administrar a un sujeto una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 ó 17, (ii) cosechar el plasma de dicho sujeto, y (iii) purificar una inmunoglobulina de dicho sujeto.
23. - Una composición de antígeno Staphylococcal caracterizada porque comprende (i) un primer anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un antígeno de Tipo 5 de S. aureus, (ii) un segundo anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un antígeno de Tipo 8 de S. aureus, (iii) un tercer anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un antígeno 336 de S. aureus, (iv) un cuarto anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus, y (v) un quinto anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal.
24. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque al menos uno de dichos primero a quinto anticuerpos es un anticuerpo monoclonal.
25. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque al menos uno de dichos primero a quinto anticuerpos es un anticuerpo neutralizante .
26.- La composición de conformidad con la reivindiación 23, caracterizada porque dicho quinto anticuerpo se enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de sub-unidades antigénicas de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad gama-hemolisin .
27. - La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho quinto anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de (i) una sub-unidad LukF-PV de PVL de S. aureus, (ii) una sub-unidad LukS-PV de PVL de S. aureus, (iii)una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgA, (iv)una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgB, (v)una sub-unidad gama-hemolisina se S. aureus HlgC; (vi)LukD de S. aureus, (vii)LukE de S. aureus, (viii)LukM de S. aureus, (ix)una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. aureus, (x) una sub-unidad LukF-I de S. intermedius; y (xi) una sub-unidad LukS-I de S. intermedius.
28. - Una composición de anticuerpo protector, caracterizada porque comprende (i) un primer anticuerpo aislado que enlaza significativamente a un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y (ii) al menos un segundo antígeno aislado que enlaza específicamente a un antígeno bacteriano diferente del antígeno de alfa-toxina de S. aureus mencionado.
29. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque al menos uno del primer y segundo anticuerpos mencionados es un anticuerpo monoclonal.
30.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque al menos uno del primer y segundo anticuerpos mencionados es un anticuerpo neutralizante .
31. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque al menos uno del al menos un segundo anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno Staphylococcal adicional seleccionado del grupo que consiste de antígenos de Tipo 5 de S. aureus, Tipo 8 de S. aureus 336 de S. aureus, de leucocidina Staphylococcal, PS1 de S. epidermidis, GP1 de S. epidermidis, ácido lipoteicoico (LTA) y componentes de superficie microbiana que reconocen a las proteínas moleculares de matriz adhesiva (MSCRAMM) .
32. - La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque al menos uno del al menos un segundo anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de sub-unidades del antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y antígenos de la sub-unidad gama-hemolisina .
33. - La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque al menos uno del al menos un segundo anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno de leucocidina Staphylococcal seleccionado del grupo que consiste de (i) una sub-unidad LukF-PV de PVL de S. aureus, (ii)una sub-unidad Lux-PV de PVL de S. aureus, (iii)una sub-unidad gama -hemolisina de S. aureus HlgA, (iv) una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgB; (v) una sub-unidad gama-hemolisina de S. aureus HlgC, (vi) LukD de S. aureus, (vii)LukE de S. aureus, (viii)LukM de S. aureus, (ix) una sub-unidad LukF' -PV de PVL de S. aureus, (x) una sub-unidad LukF-I de S. inter edius; y (xi)una sub-unidad LukS-I de S. intermedius.
34. -La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque comprende una cantidad sub-óptima del primer anticuerpo mencionado y una cantidad sub-óptima del segundo anticuerpo mencionado.
35. -La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque dicha composición es preparada por medio de un método que comprende (a) administrar (i) un antígeno de alfa-toxina de S. aureus y (ii) uno o más antígenos bacterianos adicionales diferentes del antígeno de alfa-toxina de S. aureus mencionado, a un sujeto humano, (b) cosechar plasma del sujeto mencionado, y (c) purificar la inmunoglobulina de dicho sujeto.
36. - La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el antígeno de alfa- toxina de S. aureus es conjugado a al menos uno de dichos antígenos bacterianos adicionales.
37.- La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque dicho antigeno de alfa-toxina contiene al menos dos alteraciones, en relación con la alfa- toxina de tipo nativo, que reduce su toxicidad.
38.- Una composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque dicha composición es preparada por medio de un método que comprende (a) cribar un sujeto humano al que no se haya administrado un antigeno de alfa-toxina de S. aureus y un antígeno bacteriano adicional diferente del antígeno de alfa-toxina de S. aureus y un antígeno bacteriano adicional diferentes del antígeno de alfa- toxina de S. aureus, (b) cosechar plasma del sujeto mencionado, y (c) purificar inmunoglobulina de dicho sujeto.
39.- Un método para tratar o prevenir la infección por S. aureus, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad de ésta, la composición de conformidad con las reivindicaciones 1, 9, 17, 28, o 33.
40. -El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende adicionalmente administrar un agente seleccionado del grupo que consiste de un agente anti- infeccioso, un agente antibiótico, un agente antimicrobiano.
41.- El método de conformidad con la reivindicación 40 ,· caracterizado porque dicho agente es seleccionado del grupo que consiste de Vancomicina, lisostafina y clindamicina .
42.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicha infección por S. aureus es asociada con S. aureus resistente a la metacilina.
43. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el S. aureus produce la alfa-toxina.
44. - Un método de neutralizar la infección por PVL de S. aureus caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de ésta, una composición que comprende (i) un antigeno de gama-hemolisina aislado o (ii) un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a un antígeno de gama-hemolisina.
45. -Un método de neutralizar la infección por gama -hemolisina Sthaphyilococcal, que comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma, una composición que comprende (i) una sub-unidad antigénica de PVL de S. aureus aislado, o (ii) un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a una sub-unidad antigénica de PVl de S. aureus .
46. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los componentes antigénicos de dicha composición consisten de (i) un antígeno de Tipo 5 de S. aureus aislado, (ii)un antígeno de Tipo 8 de S. aureus aislado, (iii)un antígeno 336 de S. aureus aislado, (iv) un antígeno de alfa- toxina de S. aureus aislado y (v) un antígeno de leucocidina Staphylococcal aislado.
47. - La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque dichas alteraciones comprenden (i) una sustitución que tiene lugar en una localización correspondiente a His-35 de alfa-toxina de S. aureus de tipo nativo y (ii) una alteración molecular que comprende una eliminación en el dominio de unión amino de la alfa toxina de S. aureus de tipo nativo.
48. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque al menos una de dichas alteraciones moleculares comprenden una eliminación en el dominio de unión amino de alfa- toxina de S. aureus de tipo nativo.