CN105695357A - 一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 - Google Patents
一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105695357A CN105695357A CN201610154720.2A CN201610154720A CN105695357A CN 105695357 A CN105695357 A CN 105695357A CN 201610154720 A CN201610154720 A CN 201610154720A CN 105695357 A CN105695357 A CN 105695357A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacterial strain
- haemolysis
- alpha toxin
- staphylococcus aureus
- screening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
<b>本发明公开了一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，包括以下步骤：（</b><b>1</b><b>）菌株的复苏和培养：用于保证候选菌株处于活化状态；（</b><b>2</b><b>）样品制备：规定α毒素样品的制备过程和方法；（</b><b>3</b><b>）溶血反应：规定溶血反应实施过程，对各反应体系的构成进行约束；（</b><b>4</b><b>）溶血记录：规定溶血反应结果判断的依据；（</b><b>5</b><b>）判定及结论：规定质量控制点和判断流程，完成筛选过程。该筛选方法利用国际标准血清证明菌株产生</b><b>a</b><b>溶血素、连续稀释的菌株培养物滤液溶血活性对比</b><b>a</b><b>溶血素多少，高效筛选出高产</b><b>a</b><b>毒素菌株，具有特异性高，耐用性好，操作简单快速适用于大规模菌株筛选的特点。</b>
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选菌株的方法，特别是涉及一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，主要是临床分离的金黄色葡萄球菌中能高产α毒素菌株的筛选，属于生物检测领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是人类重要条件致病菌，引起人和动物的软组织感染、肺炎、菌血症等疾病。金黄色葡萄球菌α-溶血素是金葡菌感染过程中一种重要的毒力因子，在金黄色葡萄球肺炎致病过程中起重要的作用。α毒素是具有良好的抗原性的外毒素，也成为金黄色葡萄球菌疫苗重要的靶点，因此筛选高产a毒素金黄色葡萄球菌菌株为金黄色葡萄球疫苗生产用菌株或相关领域研究用菌株愈显重要。目前，对α毒素的定量主要是利用ELISA方法；对于菌株筛选采用ELISA方法对仪器设备技术要求高，试剂及实验材料成本高、实验重复性差，不利于大规模筛选的应用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出一种新型筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法。本发明可以特异性检出产生α毒素的金黄色葡萄球菌菌株，亦可通过对比菌株培养滤液对兔血红细胞的溶血活力的强弱，筛选出相对高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株。本方法克服其他溶血试验仅能定性弊端，且操作简单，耐用性好，可用于大规模菌株的筛选。
本发明给出的技术方案是：一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，其特征在于有以下步骤：
（1）菌株的复苏和培养
（2）样品制备
（3）溶血反应
（4）溶血记录
（5）判定及结论。
所述步骤（1）菌株的复苏和培养：适当保存形式的临床分离株2株，SA59、SA79、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC® 10832™，用营养琼脂斜面复苏（37℃）2代后待用；取菌株斜面培养物用接种环接种至5ml营养肉汤培养基，37℃培养24小时。
所述步骤（2）样品制备：菌株的营养肉汤培养物用0.22μm针头除菌滤器过滤除菌制备α毒素滤液样品。
所述步骤（3）溶血反应：共设9个反应管，分别为溶血组1至5、中和组1、中和组2、阳性对照组、阴性对照组。各反应管 加入对应试剂或溶液。室温放置30min后，加入300μl 10%兔血红细胞（50%兔血红细胞用无菌生理盐水5倍稀释），置37℃1h，后常温放置1h。
所述步骤（4）溶血记录：用“++++”表示完全溶血（透光程度与阳性对照组一致）、“+++”介于完全溶血与50%溶血之间、“++”表示50%溶血、“+”表示25%溶血、“-”表示未溶血（与阴性对照管一致）。
所述步骤（5）判定及结论：阳性对照组出现完全溶血且阴性对照组不出现溶血，方法过程成立；溶血组管出现完全溶血（++++）、中和组管不出现溶血（-），可说明该菌株产生a毒素；通过对比50%溶血出现的溶血组，可以筛选出a毒素产生能力相对高的菌株。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：通过对比菌株培养滤液对兔血红细胞的溶血活力的强弱，筛选出相对高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株。本方法克服其他溶血试验仅能定性弊端，且操作简单，耐用性好，结果快速，适用于大规模菌株筛选；利用国际标准血清，方便多实验室结果对比 。
具体实施方式
实施例1。
材料及材料。
培养基：营养肉汤、营养琼脂斜面。
菌株：临床分离金黄色葡萄球菌菌株SA59、SA79、（中国医科大学附属盛京医院检验科采集）、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC® 10832™。
2IU/ml标准血清：2IU/ml金黄色葡萄球菌α毒素国际标准抗血清配制：将抗金黄色葡萄球菌α毒素标准血清（220IU，购自NIBSC）用无菌生理盐水溶解并定容110ml，分装，-40℃保存。
50%兔血红细胞：消毒兔耳中动脉，5ml注射器（含抗凝剂）吸取5ml血液；血液在4℃，1500rpm条件下离心5min。弃上清，用无菌生理盐水洗涤。重复2次后目视细胞层体积，加入等体积无菌生理盐水，即得50%兔血红细胞。4℃保存，12小时内可用。
稀释液：无菌生理盐水（0.9%NaCl溶液）。
实施例2。
菌株的复苏和培养。
适当保存形式的临床分离株2株，SA59、SA79、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC® 10832™，用营养琼脂斜面复苏（37℃）2代后待用；取菌株斜面培养物用接种环接种至5ml营养肉汤培养基，37℃培养24小时。
实施例3。
样品制备。
菌株的营养肉汤培养物用0.22μm针头除菌滤器过滤除菌制备α毒素滤液样品。
实施例4。
溶血反应。
共设9个反应管，分别为溶血组1至5、中和组1、中和组2、阳性对照组、阴性对照组。各反应管如下表1加入对应试剂或溶液。室温放置30min后，加入300μl 10%兔血红细胞（50%兔血红细胞用无菌生理盐水5倍稀释），置37℃1h，后常温放置1h。
表1反应体系
实施例5。
溶血记录。
用“++++”表示完全溶血（透光程度与阳性对照组一致）、“+++”介于完全溶血与50%溶血之间、“++”表示50%溶血、“+”表示25%溶血、“-”表示未溶血（与阴性对照管一致）。
实施例6。
判定及结论。
阳性对照组出现完全溶血且阴性对照组不出现溶血，方法过程成立。
溶血组管出现完全溶血（++++）、中和组管不出现溶血（-），可说明该菌株产生a毒素。
通过对比50%溶血出现的溶血组，可以筛选出a毒素产生能力相对高的菌株。
按实施例5，判定菌株CMCC26002为高产a毒素菌株。
本发明使用的金黄色葡萄球菌菌株为：SA59（Staphylococus aureus59）、SA79（Staphylococus aureus79）、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC® 10832™。其中，SA59（Staphylococus aureus59）、SA79（Staphylococus aureus79）均来自于中国医科大学附属盛京医院。本公司将金黄色葡萄球菌的采集和初步筛选工作委托给中国医科大学附属盛京医院来完成。中国医科大学附属盛京医院负责采集和筛选来自中国华南、东南、西北、西南及东北五个地域的三甲医院临床分离的菌株。根据《用于PSP疫苗的匹配菌株采集协议》中国医科大学附属盛京医院提供125株金黄色葡萄球菌原始菌株。根据项目研究要求，本公司筛选出2株金黄色葡萄球菌作为本试验方法的的菌株。菌株CMCC26068、CMCC26002菌来源于中国食品药品检定研究院。菌株ATCC® 10832™来源于ATCC。
Claims (6)
1.一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，其特征在于：
利用国际标准血清筛选高产α毒素的生产菌株，其过程包括以下步
骤：
（1）菌株的复苏和培养：用于保证候选菌株处于活化状态；
（2）样品制备：规定α毒素样品的制备过程和方法；
（3）溶血反应：规定溶血反应实施过程，对各反应体系的构成进行约束；
（4）溶血记录：规定溶血反应结果判断的依据；
（5）判定及结论：规定质量控制点和判断流程，完成筛选过程。
2.根据权利要求1所述的筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法，其特征在于所述步骤（1）菌株的复苏和培养：适当保存形式的临床分离株2株，SA59、SA79、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC® 10832™，用营养琼脂斜面复苏（37℃）2代后待用；取菌株斜面培养物用接种环接种至5ml营养肉汤培养基，37℃培养24小时。
3.根据权利要求1所述的筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法，其特征在于所述步骤（2）样品制备：菌株的营养肉汤培养物用0.22μm针头除菌滤器过滤除菌制备α毒素滤液样品。
4.根据权利要求1所述的筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法，其特征在于步骤（3）溶血反应：是指共设9个反应管，分别为溶血组1至5、中和组1、中和组2、阳性对照组、阴性对照组，各反应管加入定量试剂或溶液，室温放置30min后，加入300μl 10%兔血红细胞（50%兔血红细胞用无菌生理盐水5倍稀释），置37℃1h，后常温放置1h。
5.根据权利要求1所述的筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法，其特征在于步骤（4）溶血记录：是指用“++++”表示完全溶血（透光程度与阳性对照组一致）、“+++”介于完全溶血与50%溶血之间、“++”表示50%溶血、“+”表示25%溶血、“-”表示未溶血（与阴性对照管一致）。
6.根据权利要求1所述的筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法，其特征在于步骤（5）判定及结论：是指阳性对照组出现完全溶血且阴性对照组不出现溶血，方法过程成立；溶血组管出现完全溶血（++++）、中和组管不出现溶血（-），可说明该菌株产生a毒素；通过对比50%溶血出现的溶血组，可以筛选出a毒素产生能力相对高的菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610154720.2A CN105695357A (zh) | 2016-03-18 | 2016-03-18 | 一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610154720.2A CN105695357A (zh) | 2016-03-18 | 2016-03-18 | 一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105695357A true CN105695357A (zh) | 2016-06-22 |
Family
ID=56231294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610154720.2A Pending CN105695357A (zh) | 2016-03-18 | 2016-03-18 | 一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105695357A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182350A (zh) * | 2007-11-02 | 2008-05-21 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 金黄色葡萄球菌α-溶血素及其编码序列 |
| CN101466406A (zh) * | 2006-06-12 | 2009-06-24 | Nabi生物制药公司 | α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途 |
-
2016
- 2016-03-18 CN CN201610154720.2A patent/CN105695357A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101466406A (zh) * | 2006-06-12 | 2009-06-24 | Nabi生物制药公司 | α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途 |
| CN101182350A (zh) * | 2007-11-02 | 2008-05-21 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 金黄色葡萄球菌α-溶血素及其编码序列 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PRAKASH KUDUMALA REDDY等: "Evaluation of IgY capture ELISA for sensitive detection of Alpha hemolysin of Staphylococcus aureus without staphylococcal protein A interference", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
| 姬云堂: "《医用诊断细菌学（第1版）》", 30 April 1986, 人民军医出版社 * |
| 李迪等: "金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备", 《军事医学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chapman et al. | Verotoxin-producing Escherichia coli infections in Sheffield: cattle as a possible source | |
| CN102154167B (zh) | 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法 | |
| Sickles et al. | Recently classified types of coxsackie virus, group A. Behavior in tissue culture | |
| CN100580091C (zh) | 人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒 | |
| CN102735851A (zh) | 一种猪肺炎支原体多重组抗原elisa检测试剂盒 | |
| CN105784999A (zh) | 结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒 | |
| CN110151984A (zh) | 一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法 | |
| CN104962639B (zh) | 一种快速检测多主棒孢菌的lamp引物组及检测方法 | |
| CN103184171A (zh) | 猪肺炎支原体dj-166株及其应用 | |
| CN101182350A (zh) | 金黄色葡萄球菌α-溶血素及其编码序列 | |
| CN103819557A (zh) | 一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN101382549A (zh) | 一种结核分枝杆菌快速检测系统及方法 | |
| RU2607006C1 (ru) | Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae | |
| CN101493454A (zh) | 结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法 | |
| CN106434994A (zh) | 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法 | |
| CN105567660A (zh) | 一种大肠杆菌重组表达结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法及其应用 | |
| CN109395099B (zh) | 一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法 | |
| CN105695357A (zh) | 一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法 | |
| CN104099269B (zh) | 猪肺炎支原体强毒株及其应用 | |
| CN105936936A (zh) | 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 | |
| CN113957007B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 | |
| Alger | In vitro development of Plasmodium berghei ookinetes | |
| CN103757112A (zh) | 分枝杆菌分离培养试剂盒及其测试方法 | |
| JP6404072B2 (ja) | アカントアメーバの消毒評価方法 | |
| Pease | Identification of bacteria from blood and joint fluids of human subjects as Bacillus licheniformis. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160622 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |