CN101382549A - 一种结核分枝杆菌快速检测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学分子生物学检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速检测系统，包括结核菌液体培养基和结核分枝杆菌检测试剂条，结核分枝杆菌检测试剂条利用胶体金免疫层析技术对结核分枝杆菌特异性抗原MPB64进行特异性检测，该试剂条依次由样品垫、标记垫、延展垫、吸收垫组成。同时还公开了一种利用上述系统的检测方法，具体步骤如下：第一步：样本处理；第二步：接种后的液体培养基，放入到5％－10％CO2的培养箱中，35℃－38℃培养；第三步：样本在液体培养基中培养7－14天，添加到试剂条的样品垫上10min－15min读出检测结果。本发明具有成本低且检测特异性好、灵敏性高的优点。

Description

一种结核分枝杆菌快速检测系统及方法

技术领域

本发明属于医学分子生物学检测技术领域，具体是指一种利用细菌学培养技术以及胶体金检测方法来对结核病人临床样本进行快速检测的系统和方法。

背景技术

结核病是由结核杆菌引起的慢性传染病，主要发生于肺部，给人类健康和社会发展带来严重后果。世界卫生组织(WHO)指出：全球每年有900万新结核病例，每年约有350万死于结核，占各种传染病死亡人数68.3％，是各种传染病死亡总和的一半以上。在结核病发病分布上，非洲、亚洲是高发地区，患病率常在500-700/10万，发病率100-200/10万，死亡率20—70/10万。我国结核病疫情居高不下，其中严重的传染性肺结核病人约135万，每年约13万人死于结核病。西方发达国家结核病疫情以10—15％递减，每5-7年可使疫情减少50％。但是，近几年由于全球人口增长、流动和难民增加，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染流行，造成结核病卷土重来。鉴于此，世界卫生组织(WHO)在1993年宣布：“全球结核病紧急状态”，致使结核病再次成为全球最紧迫的公共卫生问题。结核病也成为我国重点防治的疾病之一。

传统的结核分枝杆菌检测方法主要是利用罗氏固体培养基斜面培养，4～8周后，观察斜面是否存在结核菌菌落。但是，这种方法的主要问题就是结核菌在固体培养基上生长比较慢，不能及时得到检测结果。为了缩短结核病样本检验时间，突破结核菌生长慢、检测时间滞后的技术瓶颈，研发人员开发了一系列以液体培养基为基础的结核菌培养检测系统。

液体培养基的主要优势就是样本在液体培养基中繁殖速度，极大的缩短培养时间。但是，由于样本在液体状态下培养，很难观察培养结果，这个问题也是科研人员需要突破的技术瓶颈。针对这个问题目前已出现了能较好解决上述问题的BACTEC 460TB自动检测系统、BACTEC MGIT 960检测系统和3D检测系统，但上述介绍的结核菌检测系统，都存在几个问题：首先，检测系统的准确性太低，各个系统几乎都是利用细菌学检测方法检测培养基颜色变化来表征样本中是否存在阳性样本，最终得出检测结果；其次，检测系统还需要配备一系列的检测设备，检测成本比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌快速检测方法，本发明克服了上述背景技术中存在的问题，无需大型仪器设备，仅仅需要一台普通细菌培养箱就可以满足检测条件，在中小型结核菌控制检验实验室就可以使用，大大降低了成本且检测特异性好、灵敏性高。

本发明的另一个目的是提供了一种快速且培养阳性率高的结核菌液体培养基和结核分枝杆菌快速检测的胶体金免疫层析检测试剂条。

本发明的技术方案如下：一种结核分枝杆菌快速检测系统，包括结核菌液体培养基和结核分枝杆菌检测试剂条，结核分枝杆菌检测试剂条利用胶体金免疫层析技术对结核分枝杆菌特异性抗原MPB64进行特异性检测，该试剂条依次由样品垫、标记垫、延展垫、吸收垫组成：样品垫用于承接吸收样本；标记垫上含有胶体金标记的MPB64蛋白单克隆抗体，其制备过程如下：取胶体金标记MPB64蛋白单克隆抗体溶液，均匀含浸在标记垫上，然后将标记垫放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥制得；

延展垫上设有两个条带，一条是检测线T线，T线上固定MPB64蛋白另一单克隆抗体，其制备过程如下：将MPB64蛋白另一单克隆抗体用0.01M PBS稀释成浓度为2.5±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于延展垫上形成T线；一条是控制线C线，C线上固定有免疫球蛋白多克隆抗体，其制备过程如下：将免疫球蛋白多克隆抗体用0.01M PBS稀释成浓度为2±0.1mg/ml的抗体溶液，和T线间隔为0.8cm的位置，用点膜仪以1μl/cm的量将抗体溶液喷于延展垫上，形成C线，最后将设有T线和C线的延展垫置37℃烤箱中干燥30min，充分干燥制得；

吸收垫用于拉动液体样本通过整个试剂条完成检测反应；上述样品垫、标记垫、延展垫、吸收垫依次设在底板上。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的结核菌液体培养基以Middle brook7H9肉汤培养基为基础成分，经高压灭菌冷却后，添加小牛血清白蛋白、生物素、过氧化氢酶以及维生素B6，上述各个成分在液体培养基中的终浓度是：小牛血清白蛋白1-20g/L；生物素0.01-1mg/L；过氧化氢酶1-10mg/L；维生素B60.01-1mg/L。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的结核菌液体培养基中小牛血清白蛋白、生物素、过氧化氢酶以及维生素B6在液体培养基中的终浓度是：小牛血清白蛋白浓度2-10g/L；生物素浓度0.1-0.5mg/L；过氧化氢酶浓度2-5mg/L；维生素B6浓度0.05-0.3mg/L。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的结核菌液体培养基中还添加有多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林的一种或多种，培养基中的浓度是：多粘菌素B浓度0.1-100U/mL；萘啶酸0.1-50浓度mg/mL；阿莫西林浓度0.1-20mg/mL。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统中添加的多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林在培养基中的浓度是：多粘菌素B浓度20-60U/mL；萘啶酸浓度10-30mg/mL；阿莫西林浓度1-10mg/mL。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的延展垫采用硝酸纤维膜材料制成。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的检测方法如下：第一步：样本处理；第二步：结核菌液体培养基中培养：接种后的液体培养基，放入到5％-10％CO2的培养箱中，35℃-38℃培养；第三步：试剂条检测：样本在液体培养基中培养7-14天，吸取适量培养液，添加到试剂条的样品垫上，试剂条室温水平放置，10min-15min读出检测结果。

本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的检测方法中一个样本利用2～3个试剂条同时检测。

本发明具有如下优点：该系统突破了结核菌样本中含量低，培养基培养生长慢，细菌学检测特异性、灵敏性不高的技术瓶颈；结合了菌体在液体培养基中生长速率快，免疫学检测特异性、灵敏性高的优势，能够快速、准确地检测出样本中的结核分枝杆菌。

附图说明：

图1是本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的试剂条结构示意图；

图2是本发明检测过程中培养液在试剂条中的流向示意图；

图3是本发明的结核分枝杆菌快速检测系统的检测过程流程图。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例对本发明的结核分枝杆菌快速检测系统及方法作进一步的描述。

液体培养基是结核分枝杆菌快速检测系统的重要组成部分，主要目的是为结核病临床样本中的结核菌繁殖提供丰富的营养物质，快速培养、富集结核菌，为胶体金免疫层析试剂条对样本定性检测提供样本。

液体培养基是以Middle brook 7H9肉汤培养基为基础。其中，Middle brook7H9肉汤培养基主要含有氨基酸、柠檬酸以及镁离子、纳离子、钾离子等成分，为结核菌的生长提供基本的营养物质以及稳定的pH生长环境；

为了促进结核菌在液体培养基中快速生长，Middle brook 7H9肉汤培养基添加小牛血清复合物。小牛血清复合物的主要含有小牛血清白蛋白、生物素、过氧化氢酶以及维生素B6；

考虑到结核病人样本中结核菌在样本中含量比较低，杂菌比较多，液体培养基中营养物质丰富，并且，结核菌本身的特性就是生长速度非常慢，在短时间繁殖很难与杂菌竞争营养物质，所以，我们针对结核病样本中出现比较多的杂菌开发了一种抑菌剂复合物，选择性的抑制样本中的杂菌在液体培养基中的生长，为结核菌的生长减少压力。

本发明结核分枝杆菌快速检测系统中的结核分枝杆菌检测试剂条是利用胶体金免疫层析技术中的双抗体夹心方法，对结核分枝杆菌分泌的MPB64蛋白进行检测。MPB64蛋白是人结核分枝杆菌特异性产出的细胞外分泌蛋白，MPB64蛋白分泌最多，并且，MPB64在比较短的时间内大量分泌，所以，MPB64蛋白在结核分枝杆菌快速检测作为检测目标分子提供有利的依据。在胶体金标记检测试剂条中，标记垫上的胶体金标记MPB64蛋白单克隆抗体与延展垫T线上固定MPB64蛋白另一单克隆抗体，对MPB64蛋白进行特异性检测。

实施例：

一、首先制备需要用来检测的试剂条，试剂条的结构如图1和2所示，依次由样品垫8，标记垫6，延展垫4和吸收垫2组成，其制备过程如下：

①、胶体金的制备：

本发明试剂条用抗体标记的胶体金颗粒是采用氯金酸化学还原法制备。先将100ml 0.01％的HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入1.3ml 1％柠檬酸三钠溶液，加热至出现红色后继续煮沸7～10min。最后将体积定容至100ml，室温放置冷却，就得到100mL胶体金溶液。

②、胶体金—抗体结合物制备

a、取胶体金颗粒溶液100ml，在磁力搅拌器搅拌的状态下，用0.2M K₂CO₃溶液调解胶体金颗粒溶液的pH值至8.2。

b、利用0.01M PBS溶液将标记用MPB64蛋白单克隆抗体5稀释成1mg/ml抗体溶液。取5支试管各加入1ml胶体金溶液，分别在前4管中加入30μl、40μl、45μl、50μl待标记抗体，最后一管作为对照，混匀均匀后，室温放置5min。然后，前4管中各加入100μl浓度为10％的NaCl溶液。混匀后室温放置10min，和对照管对比，以没有变蓝色的一管所加入的抗体量作为最佳抗体标记使用量。

c、根据体积和标记使用量计算标记所需抗体的量，将1mg/ml的单克隆抗体缓慢加入胶体金溶液中，室温下搅拌20min。

d、加10％BSA溶液，至终浓度为1％，室温搅拌5min。

e、7000rpm/min离心25min，小心吸去上清，用120mL胶体金保存液悬浮沉淀，从而得到120mL胶体金标记MPB64蛋白单克隆抗体5。

③、标记垫6的处理：

先将15mm×300mm的玻璃纤维膜摆放在不锈钢盘上，取90mL胶体金标记MPB64蛋白单克隆抗体溶液，均匀含浸在玻璃纤维膜上，然后将不锈钢盘放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥制得标记垫6。

④、延展垫4上固定检测用抗体：

选用硝酸纤维膜作为延展垫4的材料，检测用抗体固定在硝酸纤维膜上，具体操作如下：

a、T线11抗体的固定：

将MPB64蛋白另一单克隆抗体3用0.01M PBS稀释成浓度为2.5±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于硝酸纤维膜上，形成T线11，即检测线。

b、C线10抗体的固定：

将免疫球蛋白多克隆抗体1用0.01M PBS稀释成浓度为2±0.1mg/ml的抗体溶液。和T线11间隔为0.8cm的位置，用点膜仪以1μl/cm的量将抗体溶液喷于硝酸纤维膜上，形成C线10，即控制线。

c、把固定有抗体的硝酸纤维膜置37℃烤箱中干燥30min，充分干燥制得延展垫4。

⑤、组装：

a、在PVC底板12中间位置粘贴处理后的延展垫4。

b、在PVC底板12上固定延展垫4位置的顶端，粘附吸收垫2，底端粘附标记垫6。吸收垫2和标记垫6一般要覆盖延展垫4边沿约2mm左右。

c、标记垫6下方粘附样品垫8，样品垫8覆盖胶体金垫约2mm。

d、组装后的试纸用切割机切成0.5cm宽的试剂条待用。

在实际使用中，一般试剂条是预先制备好的成品，可直接取出使用，不需要现场新鲜制备。

二、结核菌液体培养基的制备：

①、配置小牛血清复合物，其配制过程如下：

配制100mL小牛血清复合物，按照各成分浓度小牛血清白蛋白8.0g/L、生物素0.3mg/L，过氧化氢酶3.0mg/L、维生素B6 0.12mg/L配制；

先量取100mL纯化水，倒入烧杯中，然后称取0.8g小牛血清白蛋白、生物素0.03mg、过氧化氢酶0.3mg、维生素B6 0.012mg，依次加入纯化水中。利用搅拌器搅拌20min，使小牛血清复合物各个成分充分溶解。

小牛血清复合物充分溶解后，在无菌环境下，利用0.22um的滤膜，过滤除菌。过滤好的小牛血清复合物进行无菌检验，无菌检验合格后，方可使用。然后配制500mL液体培养基：

②、配制450mL Middle brook 7H9肉汤培养基：

称取2.36gMiddle brook 7H9肉汤培养基干粉，加入450mL纯化水，电炉加热使之完全溶解。然后，利用高压灭菌锅121℃高压灭菌20min。

③、添加小牛血清复合物：

高压灭菌后的450mL Middle brook 7H9肉汤培养基，放置室温冷却，待培养基冷却到45℃左右，在无菌条件下，添加上述配置好的50mL小牛血清复合物，混合均匀。

④、添加抑菌剂复合物：

抑菌剂复合物按照在培养基中的终浓度是多粘菌素B 35U/mL、萘啶酸20mg/mL、阿莫西林8.5mg/mL分别先利用一定量的预溶剂溶解，再添加到液体培养基中，混合均匀。将上述配置好的液体培养基放置备用。

三、结核分枝杆菌快速检测系统检测过程：

整个检测操作建议在生物安全级别3级以上的实验室中操作，其过程如图3所示：

第一步：痰液碱处理

首先，进行痰液消化，将采集的咳痰加入2倍量的4％氢氧化钠溶液，充分混匀，在常温下静置15分钟，然后，在“消化液”中添加10倍量的pH值为6.8的无菌磷酸缓冲液，混匀后，在3000×g离心20分钟，最后，取1mL沉淀物利用等量的无菌缓冲液悬浮，取0.5mL接种到制备好的液体培养基中。

第二步：液体培养基中培养

接种后的液体培养基，放入到5％CO2的培养箱中，36±1℃培养，每天观察样本培养状态；

第三步：试剂条检测

样本在液体培养基中培养到变浑浊或者培养到7天时，吸取100uL培养液，添加到试剂条的样品垫8上，在室温条件下，水平放置15min。如图2所示，由于毛细管层析的作用，促使液体在试剂条上按照液流方向9移动。当培养液流到标记垫6，胶体金标记的MPB64蛋白单克隆抗体5溶出，和样本中的抗原MPB647形成含有金颗粒标记的免疫复合体。免疫复合体再通过层析作用移动到延展垫4，T线11固定的MPB64蛋白另一单克隆抗体3特异性捕获含有胶体金颗粒的免疫复合体，含有金颗粒的免疫复合体不断在T线11聚集，形成一条肉眼可以看见的紫红色条带。由于层析作用，样本液体在延展垫4上继续向试剂条的另外一端流动，当流动到C线10的位置，C线10固定的免疫球蛋白多克隆抗体非特异性捕获T线11反应剩余的金颗粒标记免疫复合体或胶体金标记的抗MPB64蛋白单克隆抗体5，在C线10的位置形成肉眼可以观察到的紫红色条带。

最后通过判断试剂条上出现的检测线的有无，来定性判决结果。当检测后，若出现C线10，则表示试剂条检测功能正常，若仅仅出现C线10，表示样本是阴性；若C线10和T线11同时出现，表示样本是阳性。

一般一个样本，为了检测结果的重复性，可利用2～3个试剂条同时检测。

本系统兼容性好，在实际检测中对结核病临床样本要求不是很严格，大部分样本均可以检测，例如血液、血清、尿液、脑脊液、胸膜液以及机体组织。不局限与上述实施例中的痰液样本。只是不同的样本处理方法不同：痰液样本一般利用NALC-NaOH碱处理，当然也可以利用胰酶消化的方法；血液、血清、尿液、脑脊液或胸膜液则可以直接接种液体培养基中培养。

Claims (8)

1、一种结核分枝杆菌快速检测系统，包括结核菌液体培养基和结核分枝杆菌检测试剂条，其特征在于：结核分枝杆菌检测试剂条利用胶体金免疫层析技术对结核分枝杆菌特异性抗原MPB64进行特异性检测，该试剂条依次由样品垫、标记垫、延展垫、吸收垫组成：

样品垫用于承接吸收样本；

标记垫上含有胶体金标记的MPB64蛋白单克隆抗体，其制备过程如下：取胶体金标记MPB64蛋白单克隆抗体溶液，均匀含浸在标记垫上，然后将标记垫放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥制得；

延展垫上设有两个条带，一条是检测线T线，T线上固定MPB64蛋白另一单克隆抗体，其制备过程如下：将MPB64蛋白另一单克隆抗体用0.01M PBS稀释成浓度为2.5±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于延展垫上形成T线；一条是控制线C线，C线上固定有免疫球蛋白多克隆抗体，其制备过程如下：将免疫球蛋白多克隆抗体用0.01M PBS稀释成浓度为2±0.1mg/ml的抗体溶液，和T线间隔为0.8cm的位置，用点膜仪以1μl/cm的量将抗体溶液喷于延展垫上，形成C线，最后将设有T线和C线的延展垫置37℃烤箱中干燥30min，充分干燥制得；

吸收垫用于拉动液体样本通过整个试剂条完成检测反应；

上述样品垫、标记垫、延展垫、吸收垫依次设在底板上。

2、如权利要求1所述的结核分枝杆菌快速检测系统，其特征在于：所述的结核菌液体培养基以Middle brook　7H9肉汤培养基为基础成分，经高压灭菌冷却后，添加小牛血清白蛋白、生物素、过氧化氢酶以及维生素B6，上述各个成分在液体培养基中的终浓度是：小牛血清白蛋白1-20g/L；生物素0.01-1mg/L；过氧化氢酶1-10mg/L；维生素B6 0.01-1mg/L。

3、如权利要求2所述的结核分枝杆菌快速检测系统，其特征在于：所述的结核菌液体培养基中小牛血清白蛋白、生物素、过氧化氢酶以及维生素B6在液体培养基中的终浓度是：小牛血清白蛋白浓度2-10g/L；生物素浓度0.1-0.5mg/L；过氧化氢酶浓度2-5mg/L；维生素B6浓度0.05-0.3mg/L。

4、如权利要求2或3所述的结核分枝杆菌快速检测系统，其特征在于：结核菌液体培养基中还添加有多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林的一种或多种，培养基中的浓度是：多粘菌素B浓度0.1-100U/mL；萘啶酸0.1-50浓度mg/mL；阿莫西林浓度0.1-20mg/mL。

5、如权利要求4所述的结核分枝杆菌快速检测系统，其特征在于：添加的多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林在培养基中的浓度是：多粘菌素B浓度20-60U/mL；萘啶酸浓度10-30mg/mL；阿莫西林浓度1-10mg/mL。

6、如权利要求1所述的结核分枝杆菌快速检测系统，其特征在于：延展垫采用硝酸纤维膜材料制成。

7、利用权利要求1或2所述的结核分枝杆菌快速检测系统的检测方法如下：第一步：样本处理；第二步：结核菌液体培养基中培养：接种后的液体培养基，放入到5％-10％CO2的培养箱中，35℃-38℃培养；第三步：试剂条检测：样本在液体培养基中培养7-14天，吸取适量培养液，添加到试剂条的样品垫上，试剂条室温水平放置，10min-15min读出检测结果。

8、如权利要求7所述的结核分枝杆菌快速检测系统的检测方法如下，其特征在于：一个样本利用2～3个试剂条同时检测。

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