CN102426244B

CN102426244B - 快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制法

Info

Publication number: CN102426244B
Application number: CN201110371614.7A
Authority: CN
Inventors: 徐宁; 姚航平
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2031-11-21
Also published as: CN102426244A

Abstract

本发明公开了一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，包括上样垫(1)、含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫(2)、包被质控线(3)和检测线(6)的硝酸纤维素膜(5)、吸样垫(4)以及支撑板(7)；检测线(6)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，质控线(3)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜(5)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(4)位于胶体金垫(2)的上表面。本发明还同时公开了上述免疫层析试纸的制备方法。该免疫层析试纸适合于基层现场快速检测培养物中的结核分枝杆菌。

Description

快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制法

技术领域

本发明属于临床微生物快速检测的免疫层析技术领域，特别是涉及一种利用抗ESAT-6蛋白抗体相关的免疫层析显色来早期鉴定培养物中结核分枝杆菌的方法。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球已有近1/3的人口感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％-10％携带者可发展为活动性结核病。我国结核病人数居全球第二位，每年死于结核病的人是各类传染病死亡人数总和的两倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的结核分枝杆菌携带者发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，更是影响我国发展的重大社会和经济问题。提高结核病及HIV合并结核感染的早期准确诊断水平，发展一种适合我国国情的快速、灵敏便宜的结核分枝杆菌早期检出方法刻不容缓。

结核分枝杆菌培养分离是目前结核病诊断的金标准，但细菌的遗传特性决定了其生长周期特别长，使用普通罗氏培养基需要4-8周时间，改良酸性罗-琼氏培养平均也需要25天，无法充分满足临床快速诊断的需要。针对结核分枝杆菌的快速培养，目前出现了各种改良的液体培养基和自动培养系统(马俊，王自立.结核分枝杆菌快速培养的研究进展及其临床意义[J]中国脊柱脊髓杂志，2007，17(5).388-390)。液体变色培养基最先由德国Heipha/Biotest公司研制，称为MB Redox系统，目前国内也有类似产品的研发。自动培养系统包括以Bactec MGIT 960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统以及BBLMGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统等。不管是液体培养基还是自动培养系统，都还存在污染率高的问题，对于仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定阳性，费事费力。自动培养系统更由于仪器和试剂价格昂贵，难以得到普及。因此研究开发新一代结核分枝杆菌的快速检测试剂非常必要。

结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白。它具有良好的免疫原性，且仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而不存在于BCG及其他非致病性分枝杆菌(Harboe M.Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulentMycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG[J].Infection and Immunity，1996，64(1)：16-22.)，因此在诊断结核杆菌感染的过程中可以区别是结核分枝杆菌感染还是非致病性结核分支杆菌感染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用简便快捷、灵敏度和特异性高、适合于基层现场快速检测培养物中结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，包括上样垫、含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、吸样垫以及支撑板；检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜的上表面分别设置胶体金垫和吸样垫，上样垫位于胶体金垫的上表面，硝酸纤维素膜的下表面与支撑板固定相连。

本发明还同时提供了上述快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

A、抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3和TBEA8的制备：

用于包被检测线的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，其能特异性识别ESAT-6的aa 1-14MTEQQWNFAGIEAA抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：C201080；

用于胶体金垫中金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，其能特异性识别ESAT-6的aa 24-36 SIHSLLDEGKQSL抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201081；

制备方法如下：

1)、单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶能产生TBEF3或TBEA8的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，用于测定抗体效价；

2)、TBEF3或TBEA8单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TBEF3或TBEA8单克隆抗体；

B、制作包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜；然后将包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴在支撑板上；

包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制作方法依次进行如下步骤：

1)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3配制成浓度为0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线；

2)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线；

3)、将划线后的硝酸纤维素膜于36.5～37.5℃的温度和小于30％的相对湿度的条件下干燥8～10小时；得包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

C、制备含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫：

将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液加入玻璃纤维膜(为亲水性)或聚酯纤维膜(为亲水或相对亲水性，或者为聚脂膜泡)，干燥(于20～25℃、小于30％相对湿度的条件下干燥2～4小时)后，得胶体金垫；将胶体金垫粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜(5)的上表面的左侧；

TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下：

1)、将质量浓度0.01％的HAuCL₄水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL₄水溶液在磁力加热(于100-110℃)搅拌下加入1.7～1.8ml的质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液(柠檬酸三钠水溶液按照该用量比为迅速一次性的加入)，继续加热(于98～102℃)搅拌8～12分钟；得胶体金溶液；

2)、调节胶体金溶液至pH7.0，将抗体TBEA8按0.85～0.95mg抗体TBEA8/100ml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBEA8的免疫胶体金探针溶液；

3)、将上述TBEA8的免疫胶体金探针溶液离心(例如可为4℃15000r/min离心30min)后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2)所用胶体金溶液体积的3/8～5/8；

所述重悬液的制备方法如下：在每L 0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中加入9～11g的BSA、48～52g的蔗糖、0.28～0.32g的PEG20000制备而得；

D、在步骤C所得的胶体金垫的上表面粘贴上样垫；在硝酸纤维素膜的上表面的右侧搭接吸样垫；得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

作为本发明的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法的改进：步骤C中：将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液按1ml溶液铺23～27cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。

本发明的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸属于双抗体夹心法快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

在本发明的免疫层析试纸的制备方法中，确定了所述单个试纸最终材料宽度控制在2.5～5mm；所述胶体金垫的材料为亲水玻璃纤维膜或相对亲水聚脂纤维膜(厚度约为0.25～0.8mm)；所述上样垫为亲水玻璃纤维膜(厚度约为0.25-0.8mm)；所述吸样垫的材料为吸水滤纸(厚度约为0.45～1.9mm)；检测结果的最佳判定时间为5-30min以内。

本发明的有益效果是：利用抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3和TBEA8来制备胶体金免疫层析试纸，可快速检测液体培养基中的结核分枝杆菌分泌性抗原靶蛋白ESAT-6从而鉴定是否为人的致病结核分枝杆菌，即使非专业人员也能按照说明书即可操作，5-30分钟内观察结果，最少可检出ESAT-6蛋白2.4ng/ml。该ESAT-6免疫检测试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，而且价格便宜适于基层现场使用。

本发明用到胶体金免疫层析技术出现于20世纪80年代初期，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单、快速等优点，在医学检验中得到广泛应用。其基本原理为将与待检物ESAT-6配对的抗体包被在膜上用于捕捉，然后用另一配对的免疫胶体金探针检测，阳性样品2-5分钟后出现肉眼可见的沉淀线。该技术与其他方法比较，优势在于样品处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业人员按照说明书即可操作，并迅速观察结果，适合基层使用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是透射电镜下的胶体金颗粒(×100000)；

图2是本发明的免疫层析试纸的主视结构的爆破示意图；

图3是图2的俯视示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、图2和图3结合给出了一种快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6免疫层析试纸的制备，选用如下主要材料：

氯金酸(HAuCL₄·4H₂O)，分析纯，Sigma公司；

柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，分析纯，中国医药集团上海化学试剂总公司；

羊抗鼠IgG抗体，上海金标公司；

聚乙二醇(PEG)20000，分析纯，Sigma公司；

蔗糖(C12H19Cl3O8)，分析纯，Sigma公司；

牛血清白蛋白(BSA)，上海生工生物工程公司；

硝酸纤维素(NC)膜，Millipore公司；

其他常用试剂均为分析纯。

步骤：

1、制备并纯化抗ESAT-6小鼠单克隆抗体TBEF3和TBEA8

1)、单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶能产生TBEF3或TBEA8的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价。

上述能产生小鼠单克隆抗体TBEF3或TBEA8的阳性杂交瘤细胞来源于中国典型培养物保藏中心；保藏编号分别为CCTCC NO：C201080和CCTCC NO：C201081。

上述阳性杂交瘤细胞在专利201010504707.8和专利201010504714.8中有明确告知。

2)、单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的TBEF3或TBEA8单克隆抗体。

2、制作包被检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5；将TBEF3单克隆抗体溶液以及羊抗鼠IgG溶液分别喷到硝酸纤维素膜5上，晾干后将其粘贴在支撑板7的有粘胶面的中下方；

包被检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5的制作方法如下：

1)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜5的下表面以1ul/cm的参数划线，包被成检测线6；

2)、用0.01mol/LPH7.4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成0.5mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜5的上表面以1ul/cm的参数划线，包被成质控线3；

3)、将上述划线后的硝酸纤维素膜5于37℃的温度和小于30％(例如为20％～30％)的相对湿度的条件下干燥8～10小时，得包被了检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5。

3、制备制备含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫2(即制备抗ESAT-6免疫胶体金探针和相应的TBEA8抗体金标垫)：

1)、将0.01％(质量浓度)HAuCL₄水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL₄水溶液在磁力加热(于100-110℃)搅拌下迅速一次性加入1.75ml的1％(质量浓度)柠檬酸三钠水溶液，继续加热(于100℃)搅拌10分钟，得胶体金溶液；

2)、胶体金颗粒的电镜观察：

透射电镜下可见胶体金溶液中的胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，计数100个金颗粒，颗粒直径约为19.5nm，如图1所示。结果表明，按照以上技术路线制备的胶体金颗粒合格。

3)、确定最低偶联抗体浓度：

调节胶体金溶液至pH7.0(可利用浓度为0.1mol/L K₂CO₃进行调节)用于稀释抗体TBEA8。

分别取5ul，10ul，15ul，20ul，25ul抗体加入各自对应的1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％(质量浓度)NaCL水溶液0.1ml混匀后静置，10～20min后胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定1ml胶体金溶液所需最低偶联抗体量；

4)、在本实施例中，最少抗体量对应的是0.75mg每100ml胶体金溶液的比例。

5)、将120％重量倍的上述最低偶联抗体量的抗体TBEA8按比例加入到50ml胶体金溶液中(即将抗体TBEA8按0.9mg每100ml胶体金溶液的比例偶联)，混匀后室温静置1小时。4℃15000r/min离心30min后轻轻弃去上清，以1/2体积(即25ml)的重悬液重悬沉淀物，得TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液；

该重悬液为0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液(含1％BSA，5％蔗糖，0.3mg/mL PEG20000)，即，该重悬液的制备方法如下：在每L 0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中加入10g的BSA、50g的蔗糖、0.3g的PEG20000制备而得；

6)、将上述5)的TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液按1ml溶液铺25cm²的比例均匀地铺在亲水玻璃纤维膜或相对亲水聚酯纤维膜(厚度约为0.25-0.8mm)上，再置干燥间，于20-25℃小于30％相对湿度的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫2，备用。该胶体金垫2为含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫。

4、检测ESAT-6免疫层析试纸的组装：

检测抗ESAT-6的免疫层析试纸由上样垫1、包被了检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5(以下简称包被抗体的硝酸纤维素膜5)、胶体金垫2、吸样垫4和支撑板7五部分组成。

将制备好的包被抗体的硝酸纤维素膜5粘贴在支撑板7上(硝酸纤维素膜5的下表面与支撑板7相接触，即，检测线6正对支撑板7)，胶体金垫2右端的下表面与包被抗体的硝酸纤维素膜5左端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)；上样垫1右端的下表面与胶体金垫2左端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)。吸样垫4左端的下表面与包被抗体的硝酸纤维素膜5右端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)；最后按宽度0.25cm-0.5cm切割(如图3所示)，即为检测抗ESAT-6蛋白的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

实验1、结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6检测试验

1、试纸检出ESAT-6的敏感性

以Creative Biomart公司购买的重组蛋白ESAT-6为标准，经生理盐水有限稀释后，作为样品检测液，取ESAT-6检测试纸(即实施例1所得的免疫层析试纸)，分别浸入不同ESAT-6浓度样品检测液中，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告：出现1条红色(对照)沉淀线为阴性，即无ESAT-6检出；出现2条红色(样品和对照)沉淀线为阳性，即有ESAT-6检出。具体检测结果如表1所述。

本发明所提供的ESAT-6试纸可检出最低限2.4ng/ml。

表1、试纸条敏感性

注：阳性：+；阴性：-

2、ESAT-6检测试纸对致病和非致病结核分枝杆菌的鉴别：

将待检培养物上清用生理盐水按1∶10稀释，取实施例1中制备的结核分枝杆菌感染的免疫层析试纸1条，浸入经上述稀释的样品中，2min后开始观察结果，30min观察终止。出现1条红色(对照)沉淀线，为结核分枝杆菌检测阴性，即无结核分枝杆菌生长；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为结核分枝杆菌检测阳性，即有结核分枝杆菌生长。将不同种类结核分枝杆菌培养上清液用试纸检测结核特异抗原ESAT-6水平，结果如下：

表2、检测临床样本培养上清中ESAT-6的阳性率

样本分类	例数	EAST-6阳性检出数
			人结核分枝杆菌培养上清液	38	38
鸟胞内分枝杆菌培养上清液	10	0
			堪萨斯分枝杆菌培养上清液	10	0

3、检测临床培养物样品中的ESAT-6

测试方法同上述“2”，检测结核分枝杆菌生长的免疫层析试纸检测培养基样品结果如表3所示，表明试纸的检测结果与最终培养鉴定的结果一致，具有特异性。

表3检测临床样本培养上清中ESAT-6的阳性率

对比实验1、

将0.01％(质量浓度)HAuCL₄水溶液置于用酸酐浸泡并干燥过的烧瓶中，摇匀后置于磁力加热搅拌器上加热煮沸，用铝膜封上瓶口以防水化蒸汽而大量溢出。每50mlHAuCL₄水溶液在100-110℃磁力加热搅拌至沸腾后迅速一次性加入1.75ml的1％(质量浓度)柠檬酸三钠水溶液，继续加热一定时间后停止，室温冷却，最后用纯水定容至50mL。对加入1％柠檬酸三钠水溶液后反应时间进行优化，对其粒子的平均粒径、均一性、分散性等在电镜下通过图形计数和测量粒子直径进行表征分析，以优化最佳制备因素。

表4反应时间优化分析

以上实验结果表明，加入柠檬酸三钠后反应时间显著影响胶体金颗粒的均匀度，本发明中加入柠檬酸三钠后最佳反应时间是十分钟。

对比实验2、

如表5所示，在其他条件相同的情况下，重悬液F稀释后且重悬液为原体积1/2×的金标抗体滴加到亲水玻璃纤维膜或相对亲水聚酯纤维膜上得到的金标垫颜色最深，分布最均匀，显色最清晰，吸附和释放速度快，因此选用稀释液F，即0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液(含1％BSA，5％蔗糖，0.3mg/mL PEG20000)作最佳重悬液，且金标抗体稀释度为1/2×(即所述重悬液是所用胶体金溶液体积的1/2)。

表5、重悬液的结果比较

A

B

C

D

E

F

1×

±

1/2×

±

+

注：+显色较好，线形规则；±显色较浅，线形扩散；

A：0.01mol/L pH7.4的PBS；

B：0.01mol/L pH7.4的PBS(1％BSA，10％蔗糖)；

C：0.01mol/L pH7.4的PBS(1％BSA，5％蔗糖)；

D：0.01mol/L pH7.4的PBS(1％BSA，5％蔗糖，0.05％Tween-20，0.3mg/mL PEG20000)；

E：0.01mol/L pH7.4的PBS(1％BSA，5％蔗糖，0.3mg/mL PEG10000)；

F：0.01mol/L pH7.4的PBS(1％BSA，5％蔗糖，0.3mg/mL PEG20000)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，其特征是：包括上样垫（1）、含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫（2）、包被质控线（3）和检测线（6）的硝酸纤维素膜（5）、吸样垫（4）以及支撑板（7）；所述检测线（6）为包被在硝酸纤维素膜（5）上的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，所述质控线（3）为包被在硝酸纤维素膜（5）上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜（5）的上表面分别设置胶体金垫（2）和吸样垫（4），上样垫（4）位于胶体金垫（2）的上表面，硝酸纤维素膜（5）的下表面与支撑板（7）固定相连；

上述快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法包括以下步骤：

A、抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3和TBEA8的制备：

用于包被检测线（6）的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201080；

用于胶体金垫（2）中金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201081；

制备方法如下：

1）、单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶能产生TBEF3或TBEA8的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心；

2）、TBEF3或TBEA8单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TBEF3或TBEA8单克隆抗体；

B、制作包被检测线（6）和质控线（3）的硝酸纤维素膜（5）；然后将包被检测线（6）和质控线（3）的硝酸纤维素膜（5）粘贴在支撑板（7）上；

所述包被检测线（6）和质控线（3）的硝酸纤维素膜（5）的制作方法依次进行如下步骤：

1）、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3配制成浓度为0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜（5）的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线（6）；

2）、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜（5）的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线（3）；

3）、将划线后的硝酸纤维素膜（5）于36.5～37.5℃的温度和小于30%的相对湿度的条件下干燥8～10小时；得包被检测线（6）和质控线（3）的硝酸纤维素膜（5）；

C、制备含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫（2）：

将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液加入玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，干燥后，得胶体金垫（2）；将胶体金垫（2）粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜（5）的上表面的左侧；

所述TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下：

1）、将质量浓度0.01%的HAuCL₄水溶液加热煮沸，每50m1HAuCL₄水溶液在磁力加热搅拌下加入1.7～1.8m1的质量浓度1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌8～12分钟；得胶体金溶液；

2）、调节胶体金溶液至pH7.0，将抗体TBEA8按0.85～0.95mg抗体TBEA8/100ml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBEA8的免疫胶体金探针溶液；

3）、将上述TBEA8的免疫胶体金探针溶液离心后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2）所用胶体金溶液体积的3/8～5/8；

所述重悬液的制备方法如下：在每L0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中加入9～11g的BSA、48～52g的蔗糖、0.28～0.32g的PEG20000制备而得；

D、在步骤C所得的胶体金垫（2）的上表面粘贴上样垫（1）；在硝酸纤维素膜（5）的上表面的右侧搭接吸样垫（4）；得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

2.根据权利要求1所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，其特征是：所述步骤C中：将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液按1ml溶液铺23～27cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。