CN101000345B - 一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有霍乱弧菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有霍乱弧菌特异性抗体，所述质控线含有能与所述霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体。本发明的免疫层析试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种霍乱弧菌的检测试纸及其制备方法，特别是涉及一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，具有发病急、传播快、波及面广的特点，是我国两类甲类传染病之一，也是当今三种国际检疫传染病中最重要的一种。

1817-1923的百余年间，在亚、非、欧、美、澳等洲发生的6次世界性霍乱大流行均是由古典生物型霍乱弧菌引起的，给人类带来了巨大灾难。1961年开始的第7次世界性霍乱大流行，是由埃尔托生物型霍乱弧菌引起的，至今已波及五大洲140个以上的国家和地区，报告病例数在400万以上，目前无停息迹象。而古典生物型霍乱弧菌引起的霍乱只在印度和孟加拉有少数病例报告，可经水、食物、生活接触、苍蝇而传播。

美军、日军还曾将霍乱弧菌作为细菌战剂使用过，霍乱弧菌引起的的腹泻可能是轻度或水样的，如不治疗，可因严重脱水，血容量降低和休克导致死亡，死亡率高达50％。

霍乱弧菌可通过消化道传染。因此，开发出霍乱弧菌的快速检测技术也是防生物战和反生物恐怖袭击的需要。

由于霍乱弧菌无荚膜。在应对霍乱弧菌引起的生物危害突发事件中，霍乱弧菌病原体的快速检测显得尤为重要。目前，其快速检验方法主要有以下几种：

(1)凝集：将患者粪便放于5mL含特异性抗霍乱弧菌血清的碱性蛋白胨水中37℃下孵育2-7小时，可见霍乱弧菌凝块沉在试管底部。

(2)显微镜暗视野检察：可见粪便中霍乱弧菌似流星样运动，可用特异性抗血清抑制，菌量在10⁵/mL即可查出。

(3)免疫荧光抗体技术：经蛋白胨水增菌后可利用该技术检查病原体。

在实践中，上述霍乱弧菌的检测方法暴露出一些共同的劣势，如费时费力，敏感性低，而且需要技术熟练的操作人员和特殊的仪器设备，此外，还常受到血片制作、染色质量和镜检人员专业水平等主客观因素影响而容易引起误诊或漏诊，为使结果可信，常需要进行多次预试验和设立多项对照，试验操作繁琐，至少需要2小时以上，不适于现场及基层大规模使用，亦不能达到现代霍乱控制、监测、药物试验和疫苗研究的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸(Immuno-ChromatographicAssay，ICA)。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有霍乱弧菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有霍乱弧菌特异性抗体，所述质控线含有能与所述霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体。

所述霍乱弧菌特异性抗体可为以古典生物型、小川血清型霍乱弧菌，古典生物型、稻叶血清型霍乱弧菌，埃尔托生物型、小川血清型霍乱弧菌和埃尔托生物型、稻叶血清型霍乱弧菌中的一株或几株的全菌体为抗原免疫动物得到的抗体。当用几株的混合物来免疫动物时，得到的抗体能够更广谱，适用性会更广泛。但是用一株来免疫动物时，也应该能够达到本发明的目的，因为不同型的霍乱弧菌还是具有很多相同的抗原决定簇的。所述免疫动物的选择是多种多样的，如兔、羊、马、鸡或鼠等常用的免疫动物，优选为兔；所述霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体优选为抗兔抗抗体。所述检测线含有的霍乱弧菌特异性抗体的浓度可为3-5mg/mL，所述质控线含有的能与霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度可为3-5mg/mL。

所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。

检测样品时可将上述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的背面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备霍乱弧菌特异性抗体和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体；将霍乱弧菌特异性抗体溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述检测线的一端；

2)制备霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测霍乱弧菌的免疫层析试纸。

上述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备方法中，步骤1)中所用的霍乱弧菌特异性抗体为以古典生物型、小川血清型霍乱弧菌，古典生物型、稻叶血清型霍乱弧菌，埃尔托生物型、小川血清型霍乱弧菌和埃尔托生物型、稻叶血清型霍乱弧菌中的一株或几株的全菌体为抗原免疫动物得到的抗体。当用几株的混合物来免疫动物时，得到的抗体能够更广谱，适用性会更广泛。但是用一株来免疫动物时，也应该能够达到本发明的目的，因为不同型的霍乱弧菌还是具有很多相同的抗原决定簇的。所述免疫动物的选择是多种多样的，如兔、羊、马、鸡或鼠等常用的免疫动物，优选为兔；所述霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体优选为抗兔抗抗体；检测线含有的霍乱弧菌特异性抗体的浓度可为3-5mg/mL，质控线含有的能与霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度可为3-5mg/mL；可将步骤1)中喷有霍乱弧菌特异性抗体溶液和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥0.5-1.5小时，再粘贴吸水垫。

为使霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向步骤2)中的霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；为使金标垫更易与纤维素膜粘贴，可将金标垫在-20℃至-50℃冷冻5-8小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。

为了使用更加方便，所述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的背面还可再紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

所述霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法，可包括以下步骤：

1)将质量百分浓度为0.01％的氯化金(HAuCl₄)水溶液加热煮沸，并将每100mL0.01％HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.6mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为30μg/mL的霍乱弧菌特异性抗体，搅拌15-25分钟，然后加入5mL10％BSA，搅拌15-25分钟，再加入1mL10％PEG20000，搅拌15-25分钟，在2000-5000rpm下离心5-15分钟，吸出上清，将上清在8000-15000rpm再离心20-30分钟，弃上清，将沉淀保存于10-15mL质量百分浓度0.25-0.3％的四硼酸钠溶液中，得到霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液。

在上述霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针的制备方法中，步骤1)中可用浓度为0.15-0.25M(优选为0.2M)的K₂CO₃溶液或浓度为0.08-0.12M(优选为0.1M)的HCl溶液调节胶体金溶液的pH值；为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。

在实际应用中，所述纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，厚度控制在2-3mm为宜；所述吸水垫可为吸水纸，宽度为20-40mm，厚度为1.5-3mm；所述金标垫的宽度为5-10mm；所述样品垫为玻璃纤维膜，宽度为20-40mm。

本发明提供了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸利用了免疫胶体金技术及双抗体夹心检测法，用其检测霍乱弧菌或霍乱弧菌抗原的基本原理是：用霍乱弧菌特异性抗体包被纤维素膜，用以捕捉标本中的霍乱弧菌或霍乱弧菌抗原，然后用标记了霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体的免疫胶体金探针进行检测。本发明的免疫层析试纸具有以下优点：1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试纸可用于检测10^6-7cfu/mL霍乱弧菌菌悬液标本，并且不与其它生物发生交叉反应；2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的霍乱弧菌或霍乱弧菌经过5分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为霍乱弧菌病的治疗争取了时间，很适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在霍乱弧菌的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的正面和纵截面结构示意图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。

实施例1、检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备

以检测霍乱弧菌的免疫层析试纸为例说明本发明检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备方法，具体过程包括以下步骤：

1、霍乱弧菌特异性抗体的制备

本实施例采用霍乱弧菌全菌体为抗原制备霍乱弧菌特异性抗体，具体方法如下：

1)霍乱弧菌抗原的制备

将霍乱弧菌860084(古典生物型，小川血清型)、860072(古典生物型，稻叶血清型)、860103(埃尔托生物型，小川血清型)和860120(埃尔托生物型，稻叶血清型)的冻干菌种(购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心)接种于TCBS琼脂培养基(中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司)中，在37℃、5％CO₂孵箱中培养20小时，将在TCBS琼脂培养基上长出的四株菌的菌落再划线接种于TCBS琼脂平板上，在37℃、5％CO₂孵箱中培养24小时，观察平板上菌落形态，挑取四株菌典型的单个菌落，分别转种至碱性蛋白胨培养基(中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司生产)，在37℃、5％CO₂孵箱中培养24小时，进行细菌形态学观察、血清学试验以及应用法国生物梅里埃公司(bioMerieux)API20E系统进行细菌鉴定，结果如下：

形态特征：霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，呈香蕉状或逗点状，单端偏生菌毛，不形成芽孢和荚膜，液滴观察运动极为活泼。

培养特性：霍乱弧菌在碱性蛋白胨琼脂培养基上有氧生长良好，菌落属光滑型，边缘整齐、圆润、透明、扁平，微带蓝灰色乳光。

血清学试验：与霍乱弧菌标准血清凝集良好。

生化鉴定：使用法国生物梅里埃公司API20E系统鉴定为霍乱弧菌。

对鉴定后的四株霍乱弧菌进行扩大培养，具体方法为：培养24-48小时后，用无菌生理盐水从培养斜面上洗下四株菌的菌苔，收集菌液，沸水浴3小时，冷却至室温，用无菌生理盐水调菌浓度为2×10⁸cfu菌/mL，将四株菌的菌液等比混合后，即为霍乱弧菌抗原，4℃保存。

2)霍乱弧菌特异性抗体的制备

选用体重约2kg健康雌性大耳白家兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心，实验前测定家兔的自然抗体，有自然抗体者淘汰)，首次用福氏完全佐剂与步骤1)获得的霍乱弧菌菌体抗原混合乳化后皮下多点注射，2×10⁸cfu菌/1mL/只，然后分别于初次免疫后第20日、第30日、第40日追加免疫水剂1针，追加剂量和途径与初次免疫相同，末次免疫后10天试血，用玻片凝集试验检测血清效价，结果效价大于1:640，颈动脉采血，离心收集抗血清。采用常规的饱和硫酸铵盐析法(33％饱和硫酸铵盐析3次，透析脱盐后收集抗体)对抗血清中的霍乱弧菌特异性抗体进行纯化，得到霍乱弧菌特异性抗体。采用紫外分光光度仪测定抗体浓度，方法：将纯化抗体适当稀释后，分别在280nm及260nm波长下测定A值，代入公式：蛋白含量(mg/mL)＝(1.45×A_280nm-0.74×A_260nm)×稀释倍数，计算得到蛋白的浓度。结果按照上述方法纯化所得的抗体蛋白浓度约为10mg/mL。

2、制备免疫胶体金探针

用下述方法制备霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针：

1)制备胶体金溶液

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄(购自Sigma公司，1g/瓶包装)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠水溶液，肉眼可见淡黄色的氯金酸水溶液在加入1％柠檬酸三钠溶液后很快变灰白色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成葡萄酒红色，全过程约5分钟，然后继续加热煮沸10分钟，冷却后用蒸馏水恢复至原体积，得到胶体金溶液。取制作好的胶体金溶液1滴，附在有Formvar膜的铜网上，随后用滤纸吸走多余的液体，空气中自然干燥，于透射电镜下观察，胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，计数100个金颗粒，颗粒直径约为25nm，符合实验设计要求。

2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度

用0.2MK₂CO₃调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至9.0，准备5支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1制备的经纯化的霍乱弧菌特异性抗体稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入10μl、15μl、25μl、35μl，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量即为稳定1mL胶体金溶液所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μl，即25μg/mL，故选择偶联抗体浓度为30μg/mL。

3)金标垫的制备

取50mL胶体金溶液，加0.2MK₂CO₃0.5mL调pH值为9.0，按30μg/mL加入已纯化的霍乱弧菌特异性抗体，得到含有浓度为30μg/mL霍乱弧菌特异性抗体的免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌20分钟，然后加入5mL10％BSA，搅拌20分钟，再加入1mL10％PEG20000，搅拌20分钟，在2800rpm下离心10分钟，吸出上清，将上清在11000rpm再离心25分钟，弃上清，将沉淀用质量百分浓度0.25-0.3％的四硼酸钠溶液洗涤后保存于5mL质量百分浓度0.25-0.3％的四硼酸钠溶液中，得到霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液。以0.25-0.3％四硼酸钠溶液作为对照，测量530nm的OD值，结果霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液的OD_530nm为2.5。取霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液5mL，加入0.5g蔗糖，充分溶解后均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃放置5-8小时，冻干机抽干，得到金标垫。

3、检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备

如图1所示(图中a为检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的正面结构图，图中b为检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的纵截面结构图，请确认该图)，检测霍乱弧菌的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上设有检测线5和质控线6，该试纸的制备方法包括以下步骤：

1)最佳抗体包被浓度检测

用霍乱弧菌(小川型血清型、稻叶血清型，均购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心)检测用0.01M pH7.2PBS稀释至不同浓度(2、4、8mg/L)霍乱弧菌特异性抗体及羊抗兔IgG(3、4、5mg/L，购自博奥生物公司)包被NC膜的检测效果，用BioDot公司XYZ3000点样仪包被NC膜，室温晾干。结果见表1，选择霍乱弧菌抗体包被检测线浓度为4mg/mL，羊抗兔IgG包被质控线浓度为4mg/mL。

表1抗体包被浓度的确定

2)NC膜3的包被

霍乱弧菌特异性抗体和质控抗体羊抗兔IgG(购自博奥生物公司)的包被：用0.01MpH7.2PB稀释步骤1制备的霍乱弧菌特异性抗体至终浓度为4mg/mL，用于包被检测线。用0.01M pH7.2的PBS稀释羊抗兔IgG至终浓度为4mg/mL，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽、2.5mm厚的硝酸纤维素膜3上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥1.5小时。

3)检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备

将用吸水滤纸(购自Millipore公司)制的吸水垫4用双面胶粘贴于步骤2)得到的设有有检测线5和质控线6的NC膜3靠近质控线6的一端；将在步骤2中制备的金标垫2用双面胶粘贴于NC膜3靠近检测线5的一端；再在金标垫2的上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫(购自Millipore公司)1，得到检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。

4、检测霍乱弧菌的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤3制备的检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的背面再紧密连接一塑料背板(购自北京燕华公司)，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

5、检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相二抗结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

实施例2、检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的敏感性和特异性测定

分别将不同株的霍乱弧菌860084(古典生物型，小川血清型)、860072(古典生物型，稻叶血清型)、860064(古典生物型，稻叶血清型)、860103(埃尔托生物型，小川血清型)、860104(埃尔托生物型，小川血清型)、860120(埃尔托生物型，稻叶血清型)、860122(埃尔托生物型，稻叶血清型)和大肠埃希氏菌270014、沙门氏菌460046、痢疾志贺氏菌51258、绿脓假单胞菌10101、鼠疫菌EV76、霍乱弧菌55227、军团菌LDB-1、金黄色葡萄球菌26067(均购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心)接种各自适宜的培养基，待长出菌苔后用生理盐水洗下，制成10⁸cfu/mL、10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL菌悬液，作为样品检测液。

取实施例1制备的装有本发明检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的试剂盒，分别于点样口中加入上述样品检测液3滴(约150ul)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。

结果报告：仅于质控观测窗口“C”(质控线)处出现1条红色沉淀线为阴性，即无霍乱弧菌检出；于检测观测窗口“T”(检测线)和质控观测窗口“C”(质控线)处出现2条红色沉淀线为阳性，即有霍乱弧菌检出；如质控观测窗口“C”(质控线)处未出现红色沉淀线，则说明检测试纸失效，此时无论检测观测窗口“T”(检测线)处是否出现沉淀线，检测结果不成立。

本发明检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的敏感性和特异性初步检测结果见表2，从表2可以看出，不同生物型(如古典型、埃尔托型)和不同血清型(如小川型、稻叶型)霍乱弧菌的10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL和10⁸cfu/mL菌悬液检测样品在检测线和质控线处均出现沉淀线，即有霍乱弧菌抗原检出，而大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞菌、鼠疫菌、霍乱弧菌、军团菌、金黄色葡萄球菌各个浓度菌悬液检测样品仅在质控线处出现沉淀线，即无霍乱弧菌抗原检出。表明本发明检测霍乱弧菌的免疫层析试纸可与不同生物型(如古典型、埃尔托型)和不同血清型(如小川型、稻叶型)霍乱弧菌反应，不与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞菌、鼠疫菌、霍乱弧菌、军团菌、金黄色葡萄球菌发生交叉反应，显示了较好的敏感性和特异性。

表2检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的敏感性和特异性检测结果

Claims (5)

1.一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有霍乱弧菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有霍乱弧菌特异性抗体，所述质控线含有能与所述霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体；

所述检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备霍乱弧菌特异性抗体和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体；将霍乱弧菌特异性抗体溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述检测线的一端；

2)制备霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测霍乱弧菌的免疫层析试纸；

步骤1)中所述霍乱弧菌特异性抗体为以古典生物型、小川血清型霍乱弧菌，古典生物型、稻叶血清型霍乱弧菌，埃尔托生物型、小川血清型霍乱弧菌和埃尔托生物型、稻叶血清型霍乱弧菌中的一株或几株的全菌体为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物为兔、羊、马、鸡或鼠；所述检测线含有的霍乱弧菌特异性抗体的浓度为3-5mg/mL，所述质控线含有的能与霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度为3-5mg/mL；将喷有霍乱弧菌特异性抗体溶液和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥0.5-1.5小时，再粘贴吸水垫；

向所述步骤2)中的霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；将金标垫在-20℃至-50℃冷冻5-8小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴；

步骤2)中所述霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法，包括以下步骤：

1)将质量百分浓度为0.01％的HAuCl₄水溶液加热煮沸，并将每100mL 0.01％HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.6mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为30μg/mL的霍乱弧菌特异性抗体，搅拌15-25分钟，然后加入5mL 10％BSA，搅拌15-25分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌15-25分钟，在2000-5000rpm下离心5-15分钟，吸出上清，将上清在8000-15000rpm再离心20-30分钟，弃上清，将沉淀保存于5-10mL质量百分浓度0.25-0.3％的四硼酸钠溶液中，得到霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液。

2.根据权利要求1所述的检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸紧密连接有背板。

3.一种制备权利要求1或2所述的检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备霍乱弧菌特异性抗体和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体；将霍乱弧菌特异性抗体溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述检测线的一端；

2)制备霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测霍乱弧菌的免疫层析试纸；

步骤1)中所述霍乱弧菌特异性抗体为以古典生物型、小川血清型霍乱弧菌，古典生物型、稻叶血清型霍乱弧菌，埃尔托生物型、小川血清型霍乱弧菌和埃尔托生物型、稻叶血清型霍乱弧菌中的一株或几株的全菌体为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物为兔、羊、马、鸡或鼠；所述检测线含有的霍乱弧菌特异性抗体的浓度为3-5mg/mL，所述质控线含有的能与霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度为3-5mg/mL；将喷有霍乱弧菌特异性抗体溶液和霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥0.5-1.5小时，再粘贴吸水垫；

向所述步骤2)中的霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；将金标垫在-20℃至-50℃冷冻5-8小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴；

步骤2)中所述霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法，包括以下步骤：

1)将质量百分浓度为0.01％的HAuCl₄水溶液加热煮沸，并将每100mL 0.01％HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.6mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为30μg/mL的霍乱弧菌特异性抗体，搅拌15-25分钟，然后加入5mL 10％BSA，搅拌15-25分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌15-25分钟，在2000-5000rpm下离心5-15分钟，吸出上清，将上清在8000-15000rpm再离心20-30分钟，弃上清，将沉淀保存于5-10mL质量百分浓度0.25-0.3％的四硼酸钠溶液中，得到霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述霍乱弧菌特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法的步骤1)中用浓度为0.15-0.25M的K₂CO₃溶液或浓度为0.08-0.12M的HCl溶液调节胶体金溶液的pH值。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述吸水垫为吸水纸；所述样品垫为玻璃纤维膜。

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