CN1279358C - 一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸及其制备方法。本发明所提供的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。本发明将在临床、突发事件以及基层的布鲁氏菌病的诊断中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测布鲁氏菌感染的试纸及其制备方法，特别涉及一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella sp.)感染引起的人兽共患疾病。布鲁氏菌广泛分布在世界各地，寄生宿主繁多，引起疾病严重，对人类健康和畜牧业发展危害严重。布鲁氏菌是经典的生物战剂，“9.11”以后在美国反恐预案中被列为生物恐怖病原菌。因此除环境和临床标本中布鲁氏菌的快速检出外，布鲁氏菌病(简称布病)的快速诊断也是非常重要的，临床标本中布鲁氏菌的培养和鉴定是重要的感染诊断方法，但布鲁氏菌属于苛养菌，对营养和培养条件要求苛刻，并且耗时较长，有时需要4-7天，使得临床诊断困难。由于布鲁氏菌感染1周后可出现特异血清抗体，因此血清学试验在国内外均被用于布病的临床诊断，常用的血清学试验有虎红试验(RB)、血清凝集实验(SA)、补体结合实验(CF)和ELISA。
近年来对于布鲁氏菌病血清学诊断方法的评价有多篇文章发表。在欧盟国家清除布病项目中，葡萄牙、荷兰等国家用不同血清学方法对牛和羊等牧群布鲁氏菌感染情况进行检测，所检测牧群包括已知感染布病的牧群，实验感染牧群，以及未感染牧群，所用方法有RB、CF和ELISA，结果显示：以上这些血清学方法的特异性都很高，几乎是100％，只是敏感性不同，分别是95.0％、92.7％和96.8％(Emmerzaal A，deWit JJ，Dijkstra T，etal.The Dutch Brucella abortus monitoring programmefor cattle：the impact of false-positive serological reactions and comparisonof serological tests.Animal Health Service，Deventer，The Netherlands.VetQ 2002 feb；24(1)：40-6；Ferreira AC，Cardoso R，Travassos Dias I，Mariano I，etal.Evaluation of a modified Rose Bengal test and an indirectEnzyme-Linked Immunosorbent Assay for the diagnosis of Brucella melitensisinfection in sheep.Vet Res.2003 May-Jun；34(3)：297-305)。
2002年南非报道了ELISA自动工作站对大量人工免疫、感染动物，以及健康动物血清进行布病检测的结果，其中南非3643份、加拿大625份、德国240份、法国73份、美国195份，该结果与在此之前的CF检测结果比较，特异性分别为99.8％和100％，敏感性分别为94-100％和83.3-88.0％。在834份RB、SA和CF均检出为阳性的血清中，ELISA检出825份(98.9％)，表明ELISA自动工作站可同时为大量布鲁氏菌抗体提供快速、简便、敏感、特异的诊断体系，可以用来替代RB、SA和CF等筛查实验(Paweska JT，Potts AD，HarrisHJ，etal.Validation of an indirectenzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody againstBrucella abortus in cattle sera using an automated ELISA workstation.Onderstepoort J Vet Res 2002 Mar；69(1)：61-77)；2003年意大利分别提取羊布鲁氏菌(ovis)和犬布鲁氏菌(canis)可溶性抗原，用作ELISA包被抗原，检测2328份狗血清中的布氏抗体，canis抗原检出9份阳性，ovis抗原检出15份阳性，其中与canis检出符合的有8份。接着用免疫印迹试验分析两种不同抗原，发现除两种抗原共同有35KDa、32-30KDa、23KDa、20-18KDa和15-12KDa条带外，canis抗原另外有94-80KDa、64-50KDa和28KDa条带，ovis抗原另外有25KDa条带，而ovis的25KDa条带可能与ELISA方法检测布氏血清的敏感性和特异性有关(Ebani VV，CerriD，Fratini F，Bey RF，Andreani E.Serological diagnosis of brucellosis causedby Brucella canis.New Microbiol.2003 Jan；26(1)：65-73)；2002年土耳其学者比较了不同血清方法检测人布氏血清的试验：184份已知布氏患者(92位急性布病，92份慢性布病)的血清和20份健康人血清作为对照，结果显示，SA、ELISA-IgG和ELISA-IgM对患者的血清布氏检出的阳性率分别为83.7％、4.9％和49.5％，对照人群血清检出均为阴性，而RB对患者血清牛布氏和羊布氏的检出率分别为61.9％和67.9％，对照人群的检测阳性率分别为25％和30％，表明SA是可靠的方法(Sirmatel F，Turker M，Bozkurt AI.[Evaluation of the methods used for theserologic diagnosis of brucellosis]Mikrobiyol Bul.2002 Apr；36(2)：161-7)。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸(dipstick试纸)。
本发明所提供的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸(dipstick试纸)，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。
为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸的方法。
本发明所提供的制备上述检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：
1)制备布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原；用0.01M pH7.2的PB将该抗原和可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体分别稀释至4-6mg/ml和1.5-2.5mg/ml，然后分别喷于纤维膜上形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2-4小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上；
2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针；将该探针溶于0.25％-0.40％四硼酸钠溶液中，使其终浓度为5％-10％，然后将玻璃纤维膜、树脂浸入上述探针溶液中，得到金标垫，在-20--50℃干燥8-12小时后，将其粘贴在步骤1)中得到的粘贴于吸水纸垫上面的喷有相互分离的检测线和质控线的纤维膜上面；
3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸。
为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。
本发明所提供的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸及其制备方法中，所述布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原可按下述方法制备：将布鲁氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养36-60h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1h，冷却至室温后8000rpm离心15min，上清即为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针，可按下述方法制备：用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.8ml，继续煮沸10-15分钟，用水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至8.2-8.5，搅拌加入SPA 0.7mg，15-20min后加入10％的聚乙二醇20000 2ml，继续搅拌20-30min，10000-13500rpm离心25-35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针；所述纤维膜可为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料可为玻璃纤维膜、树脂；所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体可为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG；为了得到更好的检测效果，所述检测线优选为牛布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原和羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原的混合物，其体积混合比例可为1∶3-1∶5。
其中，调节pH值的K2CO3的浓度可为0.1M-0.3M，优选为0.2M。
在实际应用中，所述纤维膜的厚度可为2.5-3mm；所述金标垫的厚度可为30-70mm；所述样品垫的厚度可为0.1-0.2mm。
本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸(dipstick试纸)原理与斑点免疫酶法检测原理相同，即将布鲁氏菌可溶性抗原包被在NC膜上，用于捕捉血清标本中布氏抗体，然后用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记的胶体金探针检测，阳性标本中，布氏抗体(IgG和IgM)的Fab端与NC膜上布鲁氏菌蛋白多糖复合物抗原结合，而Fc端与金颗粒上的SPA结合，层析2分钟后出现肉眼可见的沉淀线。
本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸由于层析作用，使血清标本中的布鲁氏菌抗体在试纸硝酸纤维(NC)膜上固相化抗原部位聚集，并发生特异性结合反应，短时间内出现肉眼可见的条带。因此比RB试验敏感。由于其操作起来更简便、快速，因而在布鲁氏菌病实验室诊断和群养家畜布鲁氏菌病的监测方面更具有优势。本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸经中国农业部兽医药品监察所细菌室的实验考核，其特异性为100％，敏感性为97％，除用于哺乳动物布鲁氏菌病诊断外，还可用于群养家畜布鲁氏菌病的监测。本发明将在临床、突发事件以及基层的布鲁氏菌病的诊断中发挥重要作用。
本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸(dipstick)要比现有血清学试验虎红试验(RB)、血清凝集实验(SA)、补体结合实验(CF)和ELISA等方法快速和方便，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可在2分钟后迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。
具体实施方式
实施例1、检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸的制备
材料
氯金酸(HAuCl4.4H2O)，分析纯，上海试剂一厂；
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O)，分析纯，北京化工厂；
碳酸钾(K2CO3)，分析纯，北京化工厂；
金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，购于Amersham Pharmacia Biotech公司；
牛布鲁氏菌(Brucella abortus)(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号为210105)，羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号为210301)；
羊抗人IgG(用常规方法制备，详见《精编分子生物学实验指南》，颜子颖，王海林译，1999，科技出版社)；
布鲁氏菌免疫兔血清以牛布鲁氏菌(Brucella abortus)(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号为210105)可溶性蛋白多糖复合物为抗原按常规方法制备；
自然感染布鲁氏菌牛血清按常规方法分离保存；
正常兔血清，健康牛、羊、猪血清，健康人血清均按常规方法分离保存。
1、牛布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原、羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原的制备
将牛布鲁氏菌(Brucella abortus)(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号为210105)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号为210301)分别按照以下方法操作，得到牛、羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原：将布鲁氏菌种接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养48h，用无菌生理盐水洗下菌苔，菌悬液约为比浊度1×108个菌体/ml，流通蒸汽1h，冷却至室温后8000rpm离心15min，上清即为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原。
2、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)胶体金探针的制备
用纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.8ml，继续煮沸12分钟，用纯水恢复原体积(100ml)，冷却至室温后用0.2M K2CO3调pH8.3，磁力搅拌下加入SPA 0.7mg，17min后加入10％的聚乙二醇20000 2ml，继续搅拌25min，11800rpm离心30min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针，用0.35％四硼酸钠保存液恢复至原体积的十分之一，即10ml，4C冰箱保存。
3、检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸的制备
检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸由吸水纸垫、硝酸纤维膜、金标垫和玻璃纤维膜样品垫四部分组成。
分别用0.01M pH7.2 PB稀释步骤1制备的牛、羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原，并按照体积比例1∶4混合至布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原浓度为5mg/ml，用0.01M pH7.2 PB稀释羊抗人IgG至2mg/ml，用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.7mm厚的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥3h，然后将其用双面胶粘贴在吸水纸垫上；将50mm厚的玻璃纤维膜浸于步骤2中制备的SPA标记胶体金探针液中制备成金标垫，在-35℃干燥10小时后，将该金标垫用双面胶粘贴在上述具有检测线和质控线的硝酸纤维膜上，再在该金标垫上面用双面胶粘贴0.15mm厚的玻璃纤维膜样品垫，最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。
实施例2、检测临床血清样品
将待检人或动物血清样品用生理盐水按1∶40稀释，取实施例1中制备的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸1条，浸入经上述稀释的血清样品中，2min后开始观察结果，15min观察终止，出现1条红色(对照)沉淀线，为布鲁氏菌血清学诊断阴性，即无布鲁氏菌感染；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为布鲁氏菌血清学诊断阳性，即有布鲁氏菌感染。
按常规方法用不同血清学方法检测不同滴度布鲁氏菌免疫兔血清的结果如表1所示，表明RB、SA和CF法可检出滴度1∶5的布鲁氏菌免疫血清，而本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸可检出滴度为1∶100的同份血清，说明其更灵敏。
表1.不同血清学方法检测不同滴度布鲁氏菌免疫兔血清
| 布氏免疫血清滴度 | RB | SA | CF | 检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸 |
| 1∶21∶51∶101∶100正常兔血清滴度1∶40 | ++--- | ++±-- | ++±-- | ++++- |
按常规方法用不同血清学方法检测自然感染布氏鲁氏菌牛血清的结果如表2所示，表明本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸(dipstick试纸)与SA比较，敏感性和特异性均为100％(30/30，30/30)，与CF比较，敏感性和特异性分别为96.4(53/55)和100％。
表2.不同血清学方法检测自然感染布鲁氏菌牛血清
| dipstick试纸 | SA | CF | ||||
| + | - | 合计 | + | - | 合计 | |
| +-合计 | 30030 | 03030 | 303060 | 53255 | 03838 | 534093 |
另外，利用本发明的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸还检测了5份正常兔血清、12份健康猪血清、30份健康羊血清和51份健康人血清，结果均为阴性。
Claims (10)
1、一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。
2、根据权利要求1所述的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，其特征在于：所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。
3、根据权利要求1或2所述的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，其特征在于：所述布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原可按下述方法制备：将布鲁氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养36-60h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1h，冷却至室温后8000rpm离心15min，上清即为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针，可按下述方法制备：用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.8ml，继续煮沸10-15分钟，用水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至8.2-8.5，搅拌加入金黄色葡萄球菌蛋白A 0.7mg，15-20min后加入10％的聚乙二醇200002ml，继续搅拌20-30min，10000-13500rpm离心25-35min，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针。
4、根据权利要求1或2所述的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，其特征在于：所述检测线为牛布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原和羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原的混合物，其体积混合比例为1∶3-1∶5。
5、根据权利要求1或2所述的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，其特征在于：所述纤维膜为硝酸纤维膜或醋酸纤维膜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜或树脂。
6、根据权利要求1或2所述的检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸，其特征在于：所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠或猴IgG。
7、一种制备检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：
1)制备布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原；用0.01M pH7.2的PB将该抗原和可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体分别稀释至4-6mg/ml和1.5-2.5mg/ml，然后分别喷于纤维膜上形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2-4小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上；
2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针；将该探针溶于0.25-0.40％四硼酸钠溶液中，使其终浓度为5-10％，然后将玻璃纤维膜或树脂浸入上述探针溶液中，得到金标垫，在-20--50℃干燥8-12小时后，将其粘贴在步骤1)中得到的粘贴于吸水纸垫上面的喷有相互分离的检测线和质控线的纤维膜上面；
3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。
9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原可按下述方法制备：将布鲁氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养36-60h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1h，冷却至室温后8000rpm离心15min，上清即为布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针，可按下述方法制备：用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.8ml，继续煮沸10-15分钟，用水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至8.2-8.5，搅拌加入金黄色葡萄球菌蛋白A 0.7mg，15-20min后加入10％的聚乙二醇200002ml，继续搅拌20-30min，10000-13500rpm离心，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针。
10、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述纤维膜为硝酸纤维膜或醋酸纤维膜；所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠或猴IgG；所述检测线为牛布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原和羊布鲁氏菌可溶性蛋白多糖复合物抗原的混合物，其体积混合比例为1∶3-1∶5。
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Granted publication date: 20061011 Termination date: 20180402 |