CN103123358A - 人畜布鲁氏菌抗体免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人畜共患病免疫诊断领域，公开了一种基于胶体金为标记材料的布鲁氏菌病抗体检测免疫层析试纸条及其制备方法。该布鲁氏菌病抗体快速检测技术以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记40纳米的胶体金，喷涂在玻璃纤维上制成金标垫。从布鲁氏菌基因组中克隆出OMP31和BP26基因，构建成原核表达重组质粒，并转化到大肠杆菌中，表达出omp31和bp26蛋白，将这两种蛋白作为包被抗原分别包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同金标垫和特殊处理的上样垫和吸水纸组装成免疫层析检测装置。本发明具有特异性强、灵敏度高、方便、简单、经济等特点外，还具有可以对羊种和牛种布鲁氏菌病抗体的分型检测，对该病的监测和控制流行具有非常重要的意义和实际应用价值。

Description

人畜布鲁氏菌抗体免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫学诊断检测技术领域，具体步及一种检测布鲁氏菌感染的检测试纸及其制备方法。本发明还涉及布鲁氏菌外膜蛋白bp26和omp31基因工程抗原制备的方法，及其在这两种蛋白在布鲁氏菌抗体检测方面的应用。 

技术背景

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌为兼性胞内寄生菌，人感染后会关节炎、脑膜炎、心内膜炎等表现为持续性感染，目前尚无法根治；动物感染后公畜引起睾丸炎和附睾炎，母畜多发生流产、早产、死胎等是造成畜牧业重大损失的主要原因之一(赵凤菊，2011；文学忠，2007)。全球约有170个国家和地区流行此病，每年新发病例约50万人。近年来，布鲁氏菌病的人畜疫情在世界范围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势，愈演愈烈。我国各省市区均有人畜不同程度的布鲁氏菌病流行。根据布鲁氏菌的细菌学特征和感染宿主的亲嗜性，传统上将布鲁氏菌属分为6个种，即牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌和沙林鼠种布鲁氏菌。 

布鲁氏菌病是一种全身性的疾病，感染后不及时的诊断和治疗多呈现疗程长，预后差、劳动力损失大，卫生消费需求高等特点，给个人、家庭和社会造成极大的经济损失，甚至由此造成的因病致贫，因病返贫现象非常突出，已成为威胁经济发展和社会稳定的重要因素之一。由于没有典型的临床特征，而且在血液中的生长率很低，使得临床诊断往往表现出假阴性结果，并且血清学诊断也受许多条件的干扰和限制[许邹亮，2011]，及时和准确的诊断布鲁氏菌病显得尤为困难。而且在人类布病的临床特征，很容易与梅毒、结核病患者相混淆，并且开始发病时的临床病症多变，因此研究和发展布鲁氏菌病的临床诊断技术对控制布病的流行是非常重要的[张芳毓，钱爱东，2011]。目前实验室常规方法主要是血清学检验，包括有试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)。RBPT用于人布鲁氏菌的初筛，其优点为：快速，5min即可判定结果，适用于基层使用[陈泽祥，2009]，其缺点为：①其阳性结果有赖于其他实验确诊；②易产生假阳性，布鲁氏菌与大肠杆菌、小肠耶尔森菌等环境菌有共同抗原，易于发生交叉反应；③易产生假阴性，布鲁氏菌感染存在菌血症时期，血清学不易查出，存在漏检现象；④易于误判，其阳性结果，阴性结果有赖于有经验的医师观察。补体结合试验(CFT)足WHO最早的布鲁氏菌病血清学确诊方法，但由于该方法操作复杂要求条件高不适用于基层，目前临床上常用试管凝集试验(SAT)代替用于确诊布鲁氏菌病患者的诊断，其优点为：较为准确，24h出结果，设备简单，适用于基层实验室诊断，其缺点为：(1)易于与其他病原菌发生交叉反应，产生假阳性；(2)易产生假阴性，布鲁氏菌病感染存在溶血症事情，此期感染血清学不易查出，存在漏诊现象[张德贤，2010；张彦婷，2008；洪林娣，朱明东，2007]。ELISA检测布鲁氏菌病由于其较高灵敏度和特异性近年来受到越来越多的关注。ELISA方法的特异性强， 而且灵敏度也显著提高[C.Romero，1995]。 

然而在基层诊疗机构和畜牧兽医站缺少分子生物学检测与ELISA检测的仪器设备和专业技术人员，而且这两种方式又存在着检测时间长，短时间内难以给出检测结果，在老少边穷地区尤其是布鲁氏菌病高发地区很难推广使用。因此，开发一种具有简单经济、方便快速的检测方式对该病控制治疗显得尤为重要。以免疫层析法为代表的即时检测技术(point of care test，POCT)，由于其小型化的仪器或无需仪器设备、简单的操作和检测报告的即时化，使基层诊疗机构的布鲁氏菌病快速筛查成为了可能。因为简单(试纸条的形式呈现)、快捷(一个测试仅仅需要5min)、经济并且易于使用，免疫层析检测技术已经广泛应用于环境检测；动植物检疫；食品安全；临床诊断等方面。 

发明内容

本发明的目的在于满足我国人畜对布鲁氏菌病防疫的要求，提供一种敏感、特异性强，能够快速诊断布鲁氏菌病和对羊种和牛种布鲁氏菌病分型检测试纸条。本发明的利用各种布鲁氏菌的共同外膜蛋白均有而牛种布鲁氏菌没有的外膜蛋白omp31作为检测线1，将各种布鲁氏菌的共同外膜蛋白bp26作为检测2，将于SPA结合的IgG类抗体作为质控线，用柠檬酸二纳还原氯金酸制备30纳米左右的胶体金作为标记材料，标记金黄色葡萄球菌蛋白A，并喷涂在玻璃纤维膜上制成一种检测人畜血清中布鲁氏菌抗体的检测试纸条。 

本发明的提供了以上的试纸条的制备方法的同时，为了实现人畜血清中布鲁氏菌抗体的快速床边诊断的目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表达布鲁氏菌外膜蛋白抗原bp26和omp31，并通过免疫学技术对其免疫原性及特异性进行鉴定。实验表明，通过基因工程蛋白抗原的制备具有良好的特异性和灵敏度。进而，本发明提供一种布鲁氏菌病抗体检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述的反应膜上包被有bp26蛋白和omp31蛋白作为检测线，将与SPA结合的IgG类抗体作为指控线。其具体的操作步骤如下： 

通过基因工程手段制备布鲁氏菌外膜蛋白bp26和omp31、从布鲁氏菌基因组中扩增OMP31基因和BP26基因，分别克隆到pMD-18T载体，将重组质粒双酶切，再亚克隆入表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-omp31和重组质粒pET-32a-bp26，转化于大肠杆菌BL21(DE3)菌中，IPTG诱导表达，用亲和层析对omp31和bp26重组蛋白进行纯化，并用Western-blot检测其抗原性。 

将步骤(1)制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26和omp31作为检测线，将与SPA结合的IgG类抗体作为指控线包被在反应膜上。 

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备30nm胶体金：用纯去离子水溶解1％的氯金酸使其终浓度为0.01％，待溶液沸腾后快速加入0.5ml-1ml浓度为1.05％的柠檬酸三钠水溶液，氯金酸水溶液在约2min左右变为稳定的紫红色然后继续沸腾搅拌10min，反应停止后室温下冷却，用去离子水恢复至溶液原体积，用0.45μm的滤器过滤。将烧制好的胶体金溶液应在电镜下和紫外/可见光谱仪进行对粒径、分散性、形貌的表征。 

标记金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)及其钝化：在上述制备的30nm胶体金溶液中调节pH值为6.2，室温下快速搅拌5min，快速一次性加入300ul SPA(1mg/mL)，搅拌10min，再静置10min之后，磁力搅拌下加入10％BSA(含有5％的小牛血清)和10％聚乙二醇(分子量8000)各1mL，搅拌30min。将制备的免疫金4℃、3000rpm低速离心10min，弃去凝聚的胶体颗粒形成的沉淀。然后在12000rpm离心30min，轻轻弃上清，沉淀用胶体金复液，重悬成免疫胶体金，置于4℃备用。 

上样垫的制备及其金标释放垫的制备：将玻璃纤维膜裁剪成1.7cm×30cm，用上样垫处理液浸泡20min，37℃烘干备用。将质地较密的玻璃纤维膜裁剪成0.8cm×30cm，将上述免疫胶体金与胶体金缓冲液按1∶9混合，用喷金划线仪按1ul/cm的速度喷涂在裁剪好的玻璃纤维膜上制备结合物释放垫，37℃晾干备用。将上述制备好的反应膜、结合物释放垫、上样垫和吸水垫组装在支撑板上(如图1)，裁剪成一定规格的试纸条。 

本发明人畜布鲁氏菌抗体快速检测试纸条(胶体金法)具有以下优点： 

体现了快、边、便、易四个特点：快速，5-10分钟就能准确检测出结果；床边诊断；方便简单适用于家庭自检；结果易于读取。 

特异性强：该检测试纸条仅对布鲁氏菌各种人或动物血清中标本早阳性反应，而对其他病原体感染的血清标本呈现阴性结果。 

对血清样本中抗体可以进行羊种和牛种布鲁氏菌感染的分型检测，而且敏感性强和灵敏度高，保质期长等优点。 

本发明的试纸条利用胶体金标记的免疫层析技术，在基层医疗机构和畜牧兽医站等缺乏大型检测设备和专业技术人员等恶劣条件下实现对该病的定性和半定量测定，可快速筛查受感染患者和动物，对布鲁氏菌的控制流行起到非常重要的作用。同时，该检测方法具有方便、快速、简捷，不需要特殊的仪器设备和不需要对检测人员专业培训，结果清晰易于判读，操作简单方便推广，适合于现场检测和流行病学的调查。 

附图说明

图1是1.2％琼脂糖检测BP26基因及重组阳性质粒酶切鉴定(M：分子质量标准DL4500；1：EcoRI/XhoI酶切；2：PCR产物；3、4：重组质粒；5：阴性对照) 

图2是BP26蛋白SDS-PAGE分析(M：蛋白Marker；1：未经IPTG诱导的DE3空菌；2：经IPTG诱导的DE3空菌；3：未经IPTG诱导的pET28a空质粒；4：经IPTG诱导的pET28a空质粒；5：未经IPTG诱导的pET28a-bp26质粒；6-10：经IPTG诱导2h，3h，4h，5h，6h在大肠杆菌中表达的BP26蛋白；11、12：纯化后的BP26蛋白) 

图3是纯化的BP26蛋白及western bloting分析(M：蛋白Marker；1：纯化的BP26蛋白；2：western bloting结果) 

图4是重组质粒pMD18-omp31酶切鉴定(M：DNAMarker1000；1：pMD18-omp25质粒Nco I/Xho I双酶切；2-3：pMD18-omp31载体) 

图5是Omp31蛋白SDS-PAGE分析(1：未经IPTG诱导的DE3空菌；2：经IPTG诱导的DE3空菌；3：未经IPTG诱导的pET32a空质粒；4：经IPTG诱导的pET32a空质粒；5：未经IPTG诱导的pET32a-omp31质粒；6-9：经IPTG诱导0h，2h，4h，6h在大肠杆菌中表达的omp31蛋白；M：蛋白Marker) 

图6是纯化的BP26蛋白及western bloting分析(M：蛋白Marker；1：western bloting结果；2：纯化的OMP31蛋白) 

图7是胶体金紫外-可见光谱图(UV-Vis) 

图8是布鲁氏菌病抗体检测试纸条组装结构图 

图9是试纸条的结果判定(1～4布鲁氏菌病阴性血清；5、6绵羊布鲁氏菌病阳性血清；7牛布鲁氏菌病阳性血清) 

具体实施方式：

实施例1：布鲁氏菌外膜蛋白BP26的原核表达及纯化 

1.1引物的设计与合成 

参照GenBank是上已经公布的羊种布鲁氏菌参考株16M的BP26基因序列(登录号：U45996)，根据pGM-T克隆载体及pET-28a原核表达载体的特点，设计两端含有限制性内切酶Xho I/EcoR I酶切位点的引物。引物序列见表1-1。 

表1-1引物序列 

Table 1-1 Primer sequences 

1.2目的片段的PCR扩增 

以布鲁氏菌16M基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应体系见表1-2。采用反应条件为：94℃预变性5min；95℃50s，58℃45s，72℃1min，循环30次；72℃延伸7min；4℃∞。反应结束后取PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电泳分析，将目的片段用DNA回收试剂盒说明书进行回收。 

表1-2PCR反应体系 

Table 1-2PCR reaction systerm 

1.3 bp26基因DNA回收产物的连接转化 

将PCR回收产物与克隆载体pGM-T连接，16℃，连接18h；。连接反应体系见表1-3。 

表1-3T载体连接体系 

Table 1-3 Systerm of T vector ligeration 

将上述连接产物在含有氨苄抗性的平板上培养，培养皿上涂有8μl的IPTG和40μl的X-gal，避光倒置于37℃温箱50～60min。 

将5ul的连接产物加入100μl的感受态细胞中混匀，冰浴30min。42℃热激90s，再冰浴5min。将上述转化的感受态细胞加入800μl无抗性的LB液体培养基，37℃，120rpm振荡培养50mom，然后再800rmp离心5min。取沉淀的菌液涂于含IPTG/X-gal的氨苄板上，37℃温箱倒置培养过夜。 

1.4 pGM-T-bp26重组质粒的鉴定 

菌落PCR鉴定：在过夜培养的LB/IPTG/X-gal氨苄板上挑取单个的、形态大且圆的白色菌落摇于含800μl氨苄抗性的液体LB中，4～6h后取2μl作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。 

酶切鉴定：菌落PCR鉴定为阳性的提取质粒，。然后将pGM-T-bp26重组质粒进行EcoR I/Xho I双酶切，37℃酶切3h，酶切体系见表1-4。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察，结果如图1。 

表1-4 pGM-T-bp26重组质粒酶切体系 

Table 1-4 Enzyme ligest systerm of pGM-T-bp26 

1.5重组质粒与表达载体的双酶切 

将测序后正确的重组质粒以及实验室保存的表达载体pET-28a质粒进行EcoR I/Xho I双酶切，酶切体系同上，37℃酶切3h。取20μl反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察。将从pGM-T-bp26重组质粒上切下的BP26基因片段与pET-28a质粒切下的大片段进行回收。 

1.6 pET-28a-BP26重组质粒的连接、转化 

将双酶切后的目的片段采用T4DNA连接酶进行连接，恒温水浴槽16℃，连接18h；或者4℃连接24h～26h。连接反应体系见表1-5。 

表1-5 pET-28a-BP26重组质粒连接体系 

Table 1-5 ligase systerm of pET-28a-BP26 

将5.0μl连接产物加入到冰浴的DE3感受态中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min。加入无抗性的灭菌LB培养液800μL，37℃振荡(180rpm)50min，取60μl均匀涂布于含50μg/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37℃培养箱过夜培养。 

1.7 pET-28a-BP26蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析 

在过夜培养的卡那板上挑取白色菌落摇于含10mL 卡那抗性的液体LB中，6h后取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。将检测为阳性的pET-28a-BP26重组菌按1∶200进行活化，37℃振荡培养，同时测定菌液的OD值，当OD600在0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(1PTG)终浓度为1mmol/L进行诱导表达。诱导6h取样，各取1.5mL瞬时离心，取沉淀的菌体。在菌液中加入蛋白上样液，混匀，煮沸10min。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度的鉴定，结果如图2 

1.8重组蛋白的Ni柱亲和纯化 

4mL的Lysis Buffer裂解菌体反复冻融三次之后超声破碎，重复2～3次，直至菌体清亮为止；将菌体5000rpm离心15min，；将上清12000rpm离心30min取上清液；将上清液吸入清洗过的Ni柱里，在摇床上冰浴结合1h；取出，800rpm离心2min；再加4mL的Wash Buffer将柱子清洗三遍，800rpm离心2min。加1mL的Elution Buffer洗四遍，收集上清。将上清放入透析袋中，利用蔗糖进行浓缩、将浓缩的蛋白冷冻抽干，于-80℃保存备用。 

1.9Western-blot免疫鉴定 

按照实验1.7的方法，当SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳结束后，切下含有目的蛋白的凝胶，并在胶的一角做好标记。准备大小和凝胶相同的6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，浸泡在装有膜转移缓冲液的平皿中15min。将胶放于另一个装有膜转移缓冲液的平皿清洗一遍，浸泡10min。从下至上依次放置3层滤纸、凝胶、NC膜，3层滤纸于半干电转移仪中，200mA电泳1h。电转移后将NC膜放在杂交瓶中， 用10mL膜转移液洗1遍，10min，再用TBST洗两遍，每次10min。加入15mL膜封闭液，37℃封闭1h。倒去封闭液，用TBST再清洗3次，每次10min。加入100μl小鼠血清和4900mL的TBST作为一抗，37℃杂交1h。用10mL TBST洗涤3次，每次10min。以1∶1000倍用TBST稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG至5mL，37℃于杂交1h。杂交完成后，用10mLTBST洗涤3次，每次10min，最后加入1150μlHRP显色试剂，避光显色约1～3min。显色至目的条带清晰后，倒掉显色液，加入TBST清洗，终止反应，结果如图3。 

实施例2：布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的原核表达及纯化 

1.1引物的设计与合成 

参照GenBank是上已经公布的羊种布鲁氏菌参考株16M的OMP31基因序列，去掉信号肽78bp，根据pMD18-T simple克隆载体及pET-32a原核表达载体的特点，设计两端含有限制性内切酶Xho I/Nco I酶切位点的引物。引物序列见表1-1。 

表1-1引物序列 

Table 1-1 Primer sequences 

1.2目的片段的PCR扩增 

以羊种布鲁氏菌16M菌液80℃30分钟灭活为模板进行PCR扩增，PCR反应体系见表1-2。采用以下反应条件：95℃预变性4min；94℃30s，63℃30s，72℃1min，循环30次；72℃延伸7min；4℃∞。反应结束后取PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电水分析，将用的片段按照北京大根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行回收，-20℃冰箱保存。 

表1-2PCR反应体系 

Table 1-2 PCR reaction systerm 

1.3 OMP31基因DNA回收产物的连接转化 

将PCR回收产物与克隆载体pMD18-T Simple进行连接，16℃，连接18h；。连接反应体系见表1-3。 

表1-3 T 载体连接体系 

Table 1-3 Systerm of T vector ligeration 

将含有氨苄抗性的LB固体培养基上涂8μl的IPTG和40μl的X-gal，置于37℃温箱孵化50～60min；冰上取出DH5a感受态细胞，将5ul的连接产物加入100μl的感受态细胞中混匀，冰浴30min；顺时热激42℃，90s，之后冰浴放置5min；向1.5mlEP管中加入800μl无抗性的LB液体培养基，置于摇床37℃，120rpm振荡培养1h；800rmp离心2min；取80μl菌液涂于含氨苄的LB平板上，37℃温箱过夜培养。 

1.4 pGM-T-bp26重组质粒的鉴定 

菌落PCR鉴定：在过夜培养的LB/IPTG/X-gal氨苄板上挑取单个的、形态大且圆的白色菌落摇于含800μl氨苄抗性的液体LB中，4～6h后取2μl作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。 

酶切鉴定：经PCR鉴定为阳性的提取质粒。然后将pMD18-omp31重组质粒进行Nco I/Xho I双酶切，37℃酶切3h，酶切体系见表1-4。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察，结果如图4。 

表1-4 pMD18-omp31重组质粒酶切体系 

Table 1-4 Enzyme ligest systerm of pMD18-omp31 

1.5重组质粒与表达载体的双酶切 

将测序后正确的重组质粒以及实验室保存的表达载体pET-32a质粒进行Nco I/Xho I双酶切，酶切体系同上(1-4表)，在37℃恒温培养箱酶切3h。取20μl反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察。将从pMD18-omp31重组质粒上切下的omp31基因片段与pET-32a质粒切下的大片段进行回收。 

1.6 pET-32a-OMP31重组质粒的连接、转化 

将双酶切后的目的片段采用T4 DNA连接酶进行连接，恒温水浴槽16℃，连接18h；或者4℃连接24h～26h。连接反应体系见表1-5。 

表1-5 pET-32a-OMP31重组质粒连接体系 

Table 1-5 ligase systerm of pET-32a-OMP31 

将5.0μl连接产物加入到冰浴的DE3感受态中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min。加入无抗性的灭菌LB培养液800μL，37℃振荡(180rpm)50min，取60μl均匀涂布于含50μg/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37℃培养箱过夜培养。 

1.7 pET-32a-OMP31蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析 

在过夜培养的卡那板上挑取白色菌落摇于含10mL卡那抗性的液体LB中，6h后取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。将检测为阳性的pET-32a-OMP31重组菌按1∶200进行活化，37℃振荡培养，同时测定菌液的OD值，当OD600在0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1mmol/L进行诱导表达。诱导6h取样，各取1.5mL瞬时离心，取沉淀的菌体。在菌液中加入蛋白上样液，混匀，煮沸10min。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度的鉴定，结果如图5 

1.8重组蛋白的Ni柱亲和纯化 

4mL的Lysis Buffer裂解菌体反复冻融三次之后超声破碎，重复2～3次，直至菌体清亮为止；将菌体5000rpm离心15min，；将上清12000rpm离心30min取上清液；将上清液吸入清洗过的Ni柱里，在摇床上冰浴结合1h；取出，800rpm离心2min；再加4mL的Wash Buffer将柱子清洗三遍，800rpm离心2min。加1mL的Elution Buffer洗四遍，收集上清。将上清放入透析袋中，利用蔗糖进行浓缩。将浓缩的蛋白冷冻抽干，于-80℃保存备用。 

1.9 Western-blot免疫鉴定 

按照实验1.7的方法，当SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳结束后，切下含有目的蛋白的凝胶，并在胶的一角做好标记。准备大小和凝胶相同的6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，浸泡在装有膜转移缓冲液的平皿中15min。将胶放于另一个装有膜转移缓冲液的平皿清洗一遍，浸泡10min。从下至上依次放置3层滤纸、凝胶、NC膜，3层滤纸于半干电转移仪中，200mA电泳1h。电转移后将NC膜放在杂交瓶中，用10mL膜转移液洗1遍，10min，再用TBST洗两遍，每次10min。加入15mL膜封闭液，37℃封闭1h。倒去封闭液，用TBST再清洗3次，每次10min。加入100μl小鼠血清和4900mL的TBST作为一抗，37℃杂交1h。用10mL TBST洗涤3次，每次10min。以1∶1000倍用TBST稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG至5mL，37℃于杂交1h。杂交完成后，用10mL TBST洗涤3次，每次10min，最后加入1150μlHRP显色试剂，避光显色约1～3min。显色至目的条带清晰后，倒掉显色液，加入TBST清洗，终止反应，结果如图6。 

实施例3：制备血清中布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析试纸条 

1.1胶体金的制备 

将烧制胶体金的三角瓶清洗干净后再放在的王水中浸泡过夜；取出洗净后先用清水冲洗20遍，之后用蒸馏水清洗3～5遍，再用超纯水冲洗3遍，晾干后用5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中硅化1min，干燥后用超纯水水冲洗3遍，把三角瓶烘干用来烧金。 

将浓度为0.01％氯金酸49ml加入到硅烷化的二角瓶中，在磁力搅拌器上加热搅拌，待溶液沸腾后快速加入1ml浓度为1.05％的柠檬酸三钠水溶液，溶液颜色在约5min左右内变为稳定的紫红色，冷却后用去离子水恢复至溶液原体积，用0.45μm的滤器过滤，放置在室温下备用。烧制好的胶体金溶液应在电镜下和紫外/可见光谱仪观察其等离子共振吸收峰，峰型狭窄，吸收峰值在519nm，结果如图7。 

1.2胶体金标记金黄色葡萄球菌(SPA) 

据文献报道胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白所用的胶体金溶液的PH为6.0，用0.2mol/L碳酸钾把胶体金溶液的PH调至6.0附近，在磁力搅拌的条件下将300ul SPA(1mg/mL)溶液缓慢滴加到胶体金中，搅拌10min，静置15min后加入2mL封闭剂(5％牛血清白蛋白)，继续搅拌30min，4℃过夜。 

免疫金的纯化采用离心法，具体操作为将上述混合物转入两个50ml离心管中等重平衡后，3000rpm低 速离心10min，弃去沉淀；将上清液用4℃12000rpm条件下离心30min，弃去上清液，沉淀用免疫层析工作液重悬后4℃保存备用。 

1.3金标释放垫的制备 

将玻璃纤维膜(型号为SB06)裁剪成30×0.8cm大小，浸泡在金标垫处理液(含有0.1％曲拉通-100和0.1％TWEEN-20的水溶液)中10min，然后置于37℃烘箱中4h烘干备用。 

将制备并纯化后好的免疫金，用上海金标单维平面划膜喷金仪以每厘米30μl的量喷涂在上述处理好的玻璃纤维素膜上室温下晾干备用。 

1.4上样垫的制备 

将玻璃纤维膜(型号为SB08)裁剪成30×1.7cm大小，浸泡在上样垫处理液中10min，然后置于37℃烘箱中4h烘干备用。在此步骤中上样垫处理液配制方法为：称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP)3g；Triton X-1005g；量取10×PB 10ml然后混合后用超纯水定容至100ml。 

1.5试纸条的组装 

将用原核表达制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26和omp31作为检测线，和与SPA结合的IgG类抗体作为质控线用喷金划膜仪包被在硝酸纤维素膜上，室温下晾干备用。 

将吸水纸CH27裁剪成30×1.7cm，然后将处理好的样品垫、金标结合垫、上述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜按图8组装在尺寸在30×6.0cm的PVC支撑板上最后用裁条机裁剪成宽度为4mm的试纸条，加干燥剂密封在铝箔袋中置于4℃保存备用。 

1.6对检测样本的检测方法 

将试剂条放入待测样本中，10min内读取结果。试剂条除质控线显色外，另外两条检测线都显色或任何一条检测线显色均为布鲁氏菌阳性血清，检测其他细菌的血清只有质控线显色；如果质控线上没有红色线出现，无论检测线是否出现，则该试纸条无效。阳性检测结果和阴性结果如图9。 

Claims (6)

1.一种人和动物血清中布鲁氏菌抗体的检查试纸条，其包括反应膜和金标结合物释放垫、上样垫、和吸水垫，其中所述的反应膜上包被有布鲁氏菌膜蛋白omp31和bp26蛋白作为质检线，以及可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体作为质控线。 

2.由权利要求1所述的试纸条，其特征在于，其中所述的布鲁氏菌特异抗原bp26和omp31膜蛋白是通过基因工程方法重组表达获得。 

3.由权利要求1所述的试纸条，其特征在于，标记材料为10nm-70nm的亲水性纳米金，然后制备的纳米标记金黄色葡萄球菌蛋白A，溶解在免疫金工作液中，喷涂在结合物释放垫上。 

4.如权利要求1所述的血清中布鲁氏菌抗体检测试纸条，特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；所述结合物释放垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维，上样垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后用上垫处理液浸泡，然后15℃到60℃烘干或冷冻干燥。 

5.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述的反应膜的两条检测线为布鲁氏菌膜蛋白bp26和omp31，其中膜蛋白omp31在牛种布鲁氏菌中不表达，因此可以通过检测线出线的情况，区分血清中抗体是牛种或是羊种布鲁氏菌抗体；反应膜上的指控线为能与SPA结合的IgG类抗体。 

6.将制备好的反应膜以及结合物释放垫、上样垫、吸水垫和反应膜组装在支撑板上然后裁剪成不同规格的试纸条，检测试纸条结合一定模具制备成布鲁氏菌抗体检测卡和检测试纸笔。 

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