CN106153902A - 人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒及其制备方法，该人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒包括检测条，所述检测条包括金结合物垫和反应膜，所述金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，所述反应膜包括检测线和质控线，所述检测线包被有重组布氏杆菌抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。制备该人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒包括反应膜的制备、金结合物垫的制备、切割装配几个步骤。该人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，操作简便，适用广泛，适合于流行病学调查及现场应用。

Description

人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别是指一种人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

布氏杆菌病又称马尔他热或波状热，是由布氏杆菌(又称布鲁氏菌)引起的人畜共患的自然疫源性传染病。本病流行广泛，几乎遍布世界各地，已有160多个国家和地区存在布氏杆菌病的流行。布氏杆菌病可感染人类、家畜和野生动物，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。人感染布氏杆菌后危害较家畜布氏杆菌病更为严重。

人感染布氏杆菌病后无特征性症状，常因误诊误治而转为慢性，造成反复发作，治愈率低，病人终身难愈，迁延者可丧失劳动能力，严重的可以造成死亡，给个人、家庭和社会带来难以估量的损失。并且该病发病率高，病症复杂，各种器官均可感染，诊断困难。

目前对布氏杆菌的检测主要在实验室进行，主要方法有：

(1)分离培养法

该方法主要是通过血清葡萄糖琼脂分离培养样本，并利用柯兹洛夫斯基鉴别染色，通过形态学、染色状况来判定。分离培养布氏杆菌需在特定实验室里进行，初步培养需要5％-10％的CO₂环境，标本中必须有大量活菌方能培养成功。因此，该方法容易因培养方法影响，造成假阴性结果。而且培养周期较长，操作困难，此方法已逐步被淘汰。

(2)分子生物学方法

该方法主要包括聚合酶链式反应诊断、核酸杂交技术和荧光探针分析法。分子生物学方法需合成特定的引物，并配合相应的仪器、设备才可进行检测与结果分析，不适于现场应用及快速诊断。

(3)血清学诊断法

布氏杆菌病的血清学诊断方法种类较多，常用的有虎红平板凝集试验 (RBPT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)等方法，但该类方法特异性和灵敏性不高，操作繁琐，且血清用量较大，检测速度较慢。

因此，亟需建立操作更加简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，适于普及并可单份检测，更适合于流行病学调查及现场应用的布氏杆菌病诊断试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，操作简便，适用广泛，特异性好，灵敏度高。

基于上述目的本发明提供的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒包括金结合物垫和反应膜，所述金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，所述反应膜包括检测线和质控线，所述检测线包被有重组布氏杆菌抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

较佳的，所述重组布氏杆菌抗原为BP26和OMP31重组融合蛋白，浓度为2.0-10.0mg/mL。

较佳的，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4.0-10.0mg/mL；所述鼠抗人IgG单克隆抗体浓度为2.0-10.0mg/mL。

较佳的，人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒还包括样本稀释液，该样本稀释液为磷酸盐缓冲液。

可选的，所述检测条放置于长方形塑料盒中，构成检测卡，该检测卡上设有样品孔和检测孔，所述样品孔与所述检测条的所述样品垫位置对应，所述检测孔对应所述检测条的所述检测线和所述质控线。

基于相同的发明构思，本发明还提供一种制备上述人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

(1)反应膜的制备：

稀释所述重组布氏杆菌抗原和所述羊抗鼠IgG多克隆抗体，并喷涂至所述反应膜上，分别形成所述检测线与质控线，干燥备用；

(2)金结合物垫的制备：

将所述鼠抗人IgG单克隆抗体与胶体金进行偶联制得胶体金标的记鼠抗人IgG单克隆抗体溶液，调整浓度，并浸泡所述金结合物垫，铺金，干燥备用；

(3)切割装配：将所述反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配至所述反应板，切割后形成所述检测条。

较佳的，所述胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；

(2)加入鼠抗人IgG单克隆抗体，搅拌；

(3)加入10％牛血清白蛋白溶液，搅拌；

(4)离心，弃去上清液；

(5)加入胶体金结合物稀释液，即得。

较佳的，所述胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法步骤1)中，碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5。

本试剂盒的原理为：

采用胶体金免疫层析技术原理，在硝酸纤维素膜上的检测线包被多表位基因重组人布氏杆菌抗原，在质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体，在金标垫上包被胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体。用于定性检测全血或血清(浆)样本中的人布氏杆菌IgG抗体。

检测阳性样本时，样本中的人布氏杆菌IgG抗体可与胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆结合，形成免疫复合物，由于层析作用复合物及样本在硝酸纤维素膜内部向前流动。当复合物经过检测线时与包被的人布氏杆菌抗原结合，形成“胶体金-鼠抗人IgG单克隆抗体-人布氏杆菌IgG抗体-重组布氏杆菌抗原”而凝集显色。剩余的胶体金标记鼠抗人IgG单克隆抗体与指控线包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体结合而凝集显色，检测阴性样本时，样本中不含人布氏杆菌IgG抗体，致使不能形成免疫复合物，则只能在质控线处显色。

从上面所述可以看出，本发明提供的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有快速、简便、不需特殊设备，整个操作时间仅需15-20分钟，并且具有较高的灵敏性与特异性，适用于临床检测，以及流行病学调查，现场普查等。

附图说明

图1为本发明实施例人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒中检测条的结构示意图；

图2为本发明实施例人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒中检测卡的结构示 意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1：

在本实施例中，所述人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，包括检测条或检测卡、样本稀释液。图1为本发明实施例人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒中检测条的结构示意图，如图1所示，所述检测条包括反应板1，以及粘附于所述反应板上1的样品垫2、金结合物垫3、反应膜4、粗纤维滤纸5。

在本实施例中，所述金结合物垫3包被有胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体。作为一个较佳的实施例，所述鼠抗人IgG单克隆抗体标记胶体金前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳地，所述鼠抗人IgG单克隆抗体浓度为2mg/mL。用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，上样量为10μL时，该鼠抗人IgG单克隆抗体显示为重链和轻链各一条带。

在本实施例中，所述反应膜4为硝酸纤维素膜，包括检测线6和质控线7。

所述检测线6包被有重组布氏杆菌抗原浓度为2.0-10.0mg/mL。

(1)根据NCBI中gene bank获得布氏杆菌BP26和OMP31保守序列信息设计BP26(引物对1)和OMP31(引物对2)抗原PCR引物，提取布氏杆菌RNA并反转录PCR产物为模板，进行PCR扩增。PCR引物如下：

引物对1：

正向引物：

5'-AGCCATATGAACACTCGTGCTAGCAAT-3'

反向引物：

5'-GTCTGTCACTATATTGCAACACCTTGATTTCAAAAACGACAT-3'

引物对2：

正向引物：

5'-ATGTCGTTTTTGAAATCAAGGTGTTGCAATATAGTGACAGAC-3'

反向引物：

5'-GCACTCGAGTTAGAACTTGTAGTTCAGAC-3'。

经PCR扩增后，通过引物对1中正向引物酶切位点序列CATATG，和引 物对2中反向引物酶切位点序列CTCGAG拼接在一起所以显示为一条带。将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。在凝胶成像仪观测下，切下1300bp左右处目的条带。按照说明书，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)对目的片段进行纯化。

(2)回收后，将PCR片段克隆入pMD18T载体中，转化感受态细胞，酶切鉴定，并将测序，测序正确后，再次酶切并融入表达载体pET28a，转染表达宿主菌BL21表达。

(3)重组蛋白进行IPTG诱导表达，收集培养的大肠杆菌，经超声波破碎后，采用Ni柱亲和层析方法得到目的蛋白，用SDS-PAGE或其他方法测定，上样量为10μL时，仅49KD显示一条带。

较佳地，所述重组布氏杆菌抗原浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE或其他方法测定，上样量为10μL时，仅显示一条带。

在本实施例中，所述质控线7包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。作为一个较佳的实施例，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体包被前为无色透明液体，浓度为4.0-10.0mg/mL。较佳地，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4mg/mL。

在本实施例中，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体均购自北京万域美澜科技有限公司。

在本实施例中，所述样本稀释液为20mM pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

图2为本发明实施例人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒中检测卡的结构示意图，如图2所示，作为一个可选的实施例，所述检测条放置于特定的长方形塑料盒中，构成所述检测卡，该检测卡上设有一样品孔8和检测孔9。所述样品孔8用于滴加实验样品，与所述检测条的样品垫2位置对应；检测孔9对应检测条的检测线6和质控线7，通过检测孔9可以观察到所述反应膜4上检测线6和质控线7的变化。

实施例2：人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的制备方法：

利用重组布氏杆菌抗原包被反应膜4作为检测线；利用羊抗鼠IgG多克隆抗体包被反应膜4作为质控线；标记胶体金的鼠抗人IgG单克隆抗体包被金结合物垫，组装即得检测条。

(1)反应膜的制备：

用包被稀释液将重组布氏杆菌抗原稀释至最佳包被浓度1mg/mL；用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至最佳包被浓度2mg/mL；用点膜机 将两种包被液分别喷到反应膜4上，喷点量为0.1μL/mm，分别形成所述检测线6与质控线7；将已包被的反应膜4于37℃干燥3小时，并于室温保存。所述包被稀释液为0.05M的磷酸盐缓冲液。

(2)金结合物垫的制备：

将鼠抗人IgG单克隆抗体与胶体金进行偶联制得胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液。将胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液调整至最佳浓度10μg/mL，以1.5mL/条，浸泡所述金结合物垫，铺金，37℃干燥3小时，并于室温保存。

其中，胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备步骤如下：

1)用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；

2)加入10μg/mL鼠抗人IgG单克隆抗体，搅拌40分钟；

3)再加入10％的牛血清白蛋白至终浓度为1％，搅拌15分钟；

4)12000rpm/min，4℃离心15分钟，小心弃去上清液；

5)加入原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/2体积的胶体金结合物稀释液。

其中，所述胶体金结合物稀释液是将磷酸氢二钠5.372g、磷酸二氢钠0.78g、牛血清白蛋白5g、氯化钠8.5g、酪蛋白0.5g溶于1L去离子水中，混匀制备而成。

较佳地，步骤1)中用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5。

(3)切割装配：在内包间内将反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫等装配成反应板，再用切割机切成4mm宽的检测条组装成成品。

实施例3：人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的检测方法

1.检测前准备：检验前将试剂盒和样本恢复至室温。实验湿度应小于60％，实验温度为18-30℃。

2.样本准备：全血为指尖采血或者采用静脉采血。全血样本采集后不做保存，即采即用。血清样本按常规方法由静脉采集。血浆样本可采用肝素、柠檬酸钠、EDTA进行处理。血清或血浆样本5天内测定的样本可放置4℃保存。样本放置在-20℃至少可保存3个月。样本避免溶血或反复冻融。混浊或有沉淀的样本应离心或过滤澄清后再检测。

3.检测条检测方法

(1)从原包装铝箔袋中取出检测条，平置于台面上；

(2)取20μL血清或血浆样本，加到检测条指示箭头下端的加样处，再加样本稀释液100μL(约2-3滴)；

(3)15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

(4)检测结果判定：

阴性：只在质控线位置出现一条红色条带。

阳性：质控线和检测线位置出现两条红色条带。

无效：质控线位置没有出现红色条带

4.检测卡检测方法

(1)从铝箔袋中取出检测卡，放在水平工作台面上平置，并做好样本标记；

(2)取20μL血清、血浆或40ul全血样本，直接加入到加样孔中，再加样本稀释液100μL(约2-3滴)；

(3)15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

(4)检测结果判定：

阴性：只在质控线位置出现一条红色条带。

阳性：质控线和检测线位置出现两条红色条带。

无效：质控线位置没有出现红色条带。

实施例4：质控血清制备

质控血清制备方法：

1.质控血清的采集

(1)收集血清大于35mL(无明显溶血、黄疸、脂肪血或污染血清)，

(2)60℃加热1小时灭活；

(3)离心、过滤，除去沉淀物；

(4)稀释：需要稀释时，用正常人血清稀释；

(5)更换质控血清时，与欲被替换的原质控血清至少连续对照标定3次；

(6)分装、标识、保存：用1.5mL离心管分装，1mL/管，共35管，封口，贴签，-20℃冻存。

2.质控血清的鉴定

(1)人布氏杆菌IgG抗体阴性血清10份：阴性血清采集于健康献血员的血清，经市售布氏杆菌抗体检测试剂盒(酶联免疫法)鉴定为阴性血清，选 取10份作为抗体阴性质控血清。

(2)人布氏杆菌IgG抗体阳性血清10份：市售布氏杆菌抗体检测试剂盒(酶联免疫法)鉴定为人布氏杆菌IgG抗体阳性血清，分析检测结果，选择3份弱阳性血清、4份中阳性血清、3份强阳性血清，共10份，作为抗体阳性质控血清。

此外，与同类上市试剂盒对1050例临床标本进行临床对比研究，结果本试剂盒与同类试剂盒的总符合率为95.3％，阳性符合率为94.8％，阴性符合率为97.3％，本试剂盒与同类试剂盒检测结果无显著性差异。

(3)最低检出限指控血清：对其中一份弱阳性血清，其s/c值(样本值/cut-off值)为2.6左右进行系列稀释，当稀释至1：8时仍可检出，该系列血清为最低检出限血清。为保持今后最低检出限血清的一致性，在最低检出限血清原液选择时选择s/c值为2.6左右的弱阳性进行系列稀释，以保持批间一致性。

(4)精密性血清：选择一份人布氏杆菌IgG抗体弱阳性血清(s/c值为3.4左右)，作为精密性血清。

实施例5：人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒有效性验证

采用上述方法制备的质控血清检测本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的有效性：

1.阴阳性符合率检测：

(1)检测10份人布氏杆菌IgG抗体阳性指控血清，检测结果均为阳性。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有较好的阳性符合率。

(2)检测10份人布氏杆菌IgG抗体阴性指控血清，检测结果均为阴性。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有较好的阴性符合率。

2.灵敏度检测：

最低检出限指控血清检测，最低检出限血清原液，按1：8稀释后检测，检测结果为阳性。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒灵敏度较好。

3.精密性检测：

采用10个检测卡平行测定精密性血清，各检测卡显色速度及强度一致，均一性无差别。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒精密性较好。

4.特异性检测：

采用本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)检测含内源性 干扰物质和潜在交叉反应物质的样本，结果如下：

抗核抗体、抗线粒体抗体，抗双链DNA抗体、乙型肝炎病毒表面抗原抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒抗体、艾滋病毒抗体、戊型肝炎病毒IgG抗体、风疹病毒IgG抗体、肺炎支原体IgG抗体、肺炎衣原体IgG抗体、巨细胞病毒IgG抗体、不会对本品造成干扰。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒特异性高。

5.稳定性检测：

在长期稳定性实验过程中，4～30℃干燥避光保存14月依然可以满足产品性能指标要求；加速稳定性实验过程中，37℃条件下，16天后检测结果依然可以满足产品性能指标要求。说明本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有较好的稳定性。

6.其他：

(1)高浓度非特异性IgG抗体(血清总IgG)会与特异性IgG抗体竞争抗体的结合位点使检测灵敏度下降。

(2)样本中血脂含量高于6mmol/L、胆红素含量高于40μmol/L、血红蛋白大于5.0g/L时均会对实验结果产生影响。

(3)抗凝剂肝素处理血液、柠檬酸钠处理血液、EDTA处理血液和全血样本对检测结果无影响，与血清检测一致。

本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有以下优点：

(1)广泛适用性：本发明人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的检测线包被有BP26和OMP31重组融合蛋白，BP26蛋白为布氏杆菌细胞周质蛋白,在布氏杆菌感染牛、绵羊、山羊和人中均为优势免疫原。BP26存在于所有的布氏杆菌菌株中。OMP31蛋白为布氏杆菌外膜蛋白，B.abortus菌株为主要感染宿主,而B.abortus菌株天然缺失OMP31。OMP31在其他种布氏杆菌均为优势免疫原,Cassataro等用重组OMP31为间接ELISA包被抗原,用于人、羊和犬的血清学检测检出率分别为48％、61％和87％。如缺失OMP31抗原将减少检出率，因此将BP26和OMP31融合表达抗原的使用，可以很好的弥补这一点。将大大的提高检出率，防止OMP31的缺失漏检。另外，高纯度的鼠抗人IgG单克隆抗体包被胶体金，作为金结合物，可以有效的结合样本中人血清总IgG，排除其他类型抗体对检测的干扰，起到对样本中总IgG抗体的初筛作用。

(2)检测快速简便：本试剂盒检测整体操作仅需15-20分钟，仅需滴加样本至样本垫，等待结果即可。并且无需特定的实验仪器辅助，不需要专业培训，适于临床、居家使用，可快速筛检病人，适于现场普遍筛查、流行病学调查等。

(3)较高的灵敏性与特异性：将人布氏杆菌IgG抗体弱阳性血清(s/c值为2.6左右)稀释至1：8时仍可检出，说明具有较高的灵敏性；并且仅对人布氏杆菌IgG抗体阳性血清标本呈阳性，而对其他病原体感染的血清标本呈阴性结果，具有良好的特异性。

(4)较高的精密性：多个检测条平行检测同一样本，各检测条显色速度及强度一致，均一性无差别，说明具有良好的精密性。

(5)良好的稳定性：4～30℃干燥避光保存14个月，或37℃条件下保存14天，仍符合检测标准。

可见，本发明提供的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒具有快速、简便、不需特殊设备，准确和灵敏度高等特点，整个操作时间仅需15-20分钟。对于病人的早期诊断，临床检测都具有重要应用价值。并且，适合于流行病学调查及现场应用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，包括检测条，所述检测条包括金结合物垫和反应膜，所述金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，所述反应膜包括检测线和质控线，所述检测线包被有重组布氏杆菌抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述重组布氏杆菌抗原为BP26和OMP31重组融合蛋白，浓度为2.0-10.0mg/mL。

3.根据权利要求1所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4.0-10.0mg/mL；所述鼠抗人IgG单克隆抗体浓度为2.0-10.0mg/mL。

4.根据权利要求1所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，该样本稀释液为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测条放置于长方形塑料盒中，构成检测卡，该检测卡上设有样品孔和检测孔，所述样品孔与所述检测条的所述样品垫位置对应，所述检测孔对应所述检测条的所述检测线和所述质控线。

6.一种如权利要求1所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)反应膜的制备：

稀释所述重组布氏杆菌抗原和所述羊抗鼠IgG多克隆抗体，并喷涂至所述反应膜上，分别形成所述检测线与质控线，干燥备用；

(2)金结合物垫的制备：

将所述鼠抗人IgG单克隆抗体与胶体金进行偶联制得胶体金标的记鼠抗人IgG单克隆抗体溶液，调整浓度，并浸泡所述金结合物垫，铺金，干燥备用；

(3)切割装配：将所述反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配至所述反应板，切割后形成所述检测条。

7.根据权利要求6所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；

(2)加入鼠抗人IgG单克隆抗体，搅拌；

(3)加入10％牛血清白蛋白溶液，搅拌；

(4)离心，弃去上清液；

(5)加入胶体金结合物稀释液，即得。

8.根据权利要求7所述的人布氏杆菌IgG抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法步骤1)中，碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5。