CN111999492A - 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联合检验新型冠状病毒COVID‑19 N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，由卡壳、设置于卡壳上的两个加样孔和含有N抗原检测试纸条或S蛋白抗体检测试纸条的两个观察窗构成，其中所述检测试纸条由依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫构成；本发明通过同时检测新型冠状病毒N抗原及S蛋白抗体的IgM抗体和IgG抗体，能够快速确定被检者是否感染新型冠状病毒COVID‑19，避免了“假阴性”结果，为临床诊治新型冠状病毒肺炎提供了帮助。本发明的胶体金免疫层析检测卡特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，也不需要专业人员的操作，可广泛应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的辅助筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一种联合检测病毒抗原和抗体的检测卡，尤其涉及一种联合检验新型冠状病 毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，属于生物检测技术领域。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等症状为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困 难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒 和出凝血功能障碍。迄今COVID-19还没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物 仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时 间。眼下当务之急应是尽快研究有效的诊断试剂，采取早诊断、早隔离、切断传播途 径，控制疫情蔓延。
目前针对新型冠状病毒COVID-19的检测主要是以PCR为基础的病毒核酸检测，其 检测原理是以病毒独特的基因序列为检测靶标，通过PCR扩增，使靶标DNA序列指数 级增加，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产 生荧光信号，扩增出来的靶基因越多，累积的荧光信号就越强，意味着有被检病毒。 而没有病毒的样本中，由于没有靶标DNA序列扩增，因此就检测不到荧光信号增强。 所以，核酸检测，其实就是通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。
新型冠状病毒COVID-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等症状为主要表现，少数患者 伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重 者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障 碍。迄今COVID-19还没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物仍需更多的临床实践 证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。眼下当务之急应是尽快 研究有效的诊断试剂，采取早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。
目前针对新型冠状病毒COVID-19的检测主要是以PCR为基础的病毒核酸检测，其检测 原理是以病毒独特的基因序列为检测靶标，通过PCR扩增，使靶标DNA序列指数级增加，每 一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩 增出来的靶基因越多，累积的荧光信号就越强，意味着有被检病毒。而没有病毒的样本中， 由于没有靶标DNA序列扩增，因此就检测不到荧光信号增强。所以，核酸检测，其实就是 通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。
新型冠状病毒COVID-19核酸检测有较高的特异性和灵敏度，但是该检测方法对技术要 求高，对新型冠状病毒的检测用时长，容易出现假阴性，标本需要特殊处理，还要求具备PCR 扩增仪及凝胶电泳等专业的仪器设备，需专业技术人员操作和判断才能给出检测结果。不便 应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层对新型冠状病毒COVID-19的早期初步 筛查。基于此，亟需一种更早期、更准确、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒COVID-19 的诊断试剂或试剂盒，以便于进行早期鉴别辅助诊断。胶体金免疫层析技术是近年来发展迅 速的一种简便、快速的免疫学检测方法，但是目前国内关于胶体金免疫层析技术检测新型冠 状病毒COVID-19的研究报道较少，经检索目前市面上还没有通过同时检测新型冠状病毒 COVID-19N抗原及S蛋白抗体的IgM抗体和IgG抗体，能够准确的判断机体的免疫学反应状 态的有关联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡的 报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种联合检验新型冠状病毒COVID-19 N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡。
本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析 检测卡，所述检测卡由卡壳、设置于卡壳上的两个加样孔和含有COVID-19N抗原检测试纸 条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条的两个观察窗构成，其特征在于：
所述卡壳上的加样孔与观察窗间隔状直线排列，每组加样孔与观察窗同方向设置且间隔 状平行排列；所述COVID-19N抗原检测试纸条由依次相连的第一样品垫、第一结合垫、第 一反应垫和第一吸水垫构成；其中所述第一结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒 COVID-19N蛋白单克隆抗体，所述第一反应垫上沿样品流动方向依次设有第一检测线和第 一质控线，第一检测线上包被有新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体，第一质控线上包 被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19S蛋白抗体检测试纸条由依次相连的第二样品垫、第二结合垫、第二反应垫和第二吸水垫构成；其中所述第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠 状病毒COVID-19重组S蛋白抗原；所述第二反应垫上沿样品流动方向依次设有第二检测线、 第三检测线和第二质控线，第二检测线上包被有抗人IgM抗体，所述第三检测线上包被有抗 人IgG抗体，第二质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19N抗原检测试纸条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条分别设置在卡壳上的每组加样孔与观察窗所在的位置，每组 中的加样孔与所述第一样品垫或第二样品垫相对应，组中相应的观察窗与所述第一反应垫或 第二反应垫相对应；所述第一反应垫上的第一检测线与第一质控线的间距不少于1cm，所述 第二反应垫上第二检测线、第三检测线和第二质控线之间的距离不少于1cm。
本发明中对胶体金的具体的制备方法没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的制备方 法即可，例如：采用柠檬酸三钠还原法制备等方法，可以通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加 入比例来改变和控制胶体金的粒径大小。对胶体金具体的标记过程不作特别限定，采用本领 域技术人员熟知的方法即可。
上述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡， 优选的实施方式是：所述胶体金标记中所采用的胶体金的粒径为20-30nm；胶体金的质量比 浓度为万分之六。
针对新型冠状病毒COVID-19这种新型冠状病毒的检测，如何提高检测的灵敏度仍然是 技术难题。发明人在研究中发现，即使参照现有的冠状病毒胶体金免疫层析试纸条制备新型 冠状病毒COVID-19胶体金免疫层析试纸条，检测的灵敏度不高。为了解决现有技术中针对 新型冠状病毒COVID-19检测N抗原时的胶体金免疫层析试纸条灵敏度低的技术问题，发 明人进一步深入研究发现，通过在胶体金标记中采用粒径为20-30nm的胶体金，使所述胶 体金的浓度为万分之六，检测N抗原时，采用喷有胶体金标记的新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体作为检测抗体，并在第一检测线上包被新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，可以提高N 抗原检测时的灵敏度。
上述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡， 优选的实施方式是：所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体与胶体金的结合浓度为 每100ml体金浓液加入0.8mg N蛋白单克隆抗体；所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋 白抗原与胶体金的结合浓度为每100ml体金浓液加入0.8mg重组S蛋白抗原。
进一步优选的实施方式是：第一检测线上包被有浓度为1.2mg/ml的新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体；第二检测线上包被有浓度为1.8mg/ml的抗人IgM抗体，所述 第三检测线上包被有浓度为1.6mg/ml的抗人IgG抗体。
上述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡， 优选的实施方式是：所述第一或第二样品垫采用玻纤SB06，所述第一或第二结合垫为玻纤 8965，所述第一或第二反应垫为赛多利斯CN140。
上述优选的实施方式可以大大提高胶体金免疫层析检测新型冠状病毒COVID-19的灵 敏度及特异度，并能达到最好的性价比。
上述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡， 优选的实施方式是：第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白抗 原及鼠IgG，其中重组S蛋白抗原与鼠IgG的体积比为2:1。
本发明中，所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白和S蛋白可按照本领域常规技术制备， 不作特别限定。
上述联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡中， 所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白优选以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19N蛋白基因序列，将其连入表达载体pET-28，构建重组表达载体pET-28-N，经测序鉴定正确后转化至表达菌E.coli Rosetta中，以IPTG诱导蛋白表达，收集发酵产物进行超声破碎，经Ni柱纯化即制得新型冠状病毒COVID-19N蛋白； 其中，所述表达载体pET-28的N端、C端均带有6×His标签。
上述联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡中， 所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白优选以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19S蛋白中S1域RBD的基因序列；将该基因序列插入带有pPICZα的表达载体中构建重组表达载体，经测序鉴定正确后以此表达载体转染酵母GS115细胞，收集发酵产物进行超声破碎，再通过Ni亲和纯化柱进行蛋白纯化制得新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白。
本发明所述第二反应垫上的抗人IgG抗体和抗人IgM抗体均为市售产品或可按照本领 域常规技术制备。
本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析 检测卡作为判定新型冠状病毒COVID-19有无测试装置的应用。
上述应用中，所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免 疫层析检测卡的使用方法是：
将被测样品溶液分别滴加到COVID-19N抗原检测试纸条和COVID-19S蛋白抗体检测 试纸条的样品垫上，其中所述被测样品是人血清、血浆或全血样本；待5～20分钟后，根据检 测线和质控线的显色情况，判断样品中是否含有新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗 体，判断方法如下：
对于COVID-19N抗原检测试纸条，1)阳性：第一质控线、第一检测线均呈现红色条带， 说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19N抗原；2)阴性：第一质控线呈现红色条带，第一 检测线不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19N抗原；3)失效：第一质控线、第一检测线均不呈现红色条带或仅有第一检测线呈现红色条带，说明COVID-19N抗原检测试纸条失效；
对于和COVID-19S蛋白抗体检测试纸条，1)阳性：第二质控线、第二检测线均呈现红 色条带，第三检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgM抗体；第二质控线、第三检测线均呈现红色条带，第二检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgG抗体；2)阴性：第二质控线呈现红色条带，第二检测线和第三检 测线均不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19S蛋白抗体；3)失效：无 论第二检测线、第三检测线是否呈现红色条带，第二质控线不呈现红色条带时，说明COVID-19抗体检测试纸条失效。
本发明公开了一种联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫 层析检测卡。新型冠状病毒COVID-19N抗原检测可以缩短窗口期，S蛋白检测可以反应病 毒的攻击力及传染性。通过同时检测新型冠状病毒COVID-19N抗原及S蛋白抗体的IgM抗体和IgG抗体，能够准确的判断该机体的免疫学反应状态，准确性高、特异性强，而且检测速度快、操作简便，无需专门设备，也不需要专业人员的操作，可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。
本发明的COVID-19N抗原检测试纸条的检测原理为：试纸条根据双抗体夹心法原理检 测样品中是否含有新型冠状病毒COVID-19N抗原。在试纸条的样品垫上滴加样品后，在层 析作用下，样品溶液向结合垫移动，流经结合垫时，金标抗体即被溶解。当样品中含有新型 冠状病毒COVID-19N抗原时，新型冠状病毒COVID-19N抗原将和金标抗体结合，形成金标抗体-抗原复合物，由于层析作用反应复合物移至反应垫的检测线时形成金标抗体-抗原- 抗体复合物，金标抗体被固定下来，在检测线上显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标抗 体移至质控线被羊抗鼠IgG捕获，呈现红色质控线条。不论检测样品中是否含有COVID-19 S蛋白抗体，第二质控线包被的羊抗鼠IgG都会与随待测样品移动的胶体金标记的鼠IgG反 应形成一条红色反应线作为质控。
本发明的COVID-19S蛋白抗体检测试纸条检测样品中是否含有COVID-19S蛋白IgG抗体及IgM抗体的原理为：在试纸条的样品垫上滴加样品后，在层析作用下，样品溶液向 结合垫移动，流经结合垫时，金标抗体即被溶解。当样品中含有新型冠状病毒COVID-19 抗体时，新型冠状病毒COVID-19抗体即和金标抗原结合，形成金标抗原-抗体复合物，由 于层析作用反应复合物移至反应垫的检测线；当样品中含有的新型冠状病毒COVID-19抗体 为IgM抗体时，在第二检测线上形成金标抗原-抗体-抗人IgM抗体复合物，金标抗体被固 定下来，在第二检测线上显示红色线条；或者当样品中含有的新型冠状病毒COVID-19抗体 为IgG抗体时，在第三检测线上形成金标抗原-抗体-抗人IgG抗体复合物，金标抗体被固定 下来，在第三检测线上显示红色线条。
综上，本发明所具有的有益效果是：
本发明中，通过同时检测新型冠状病毒COVID-19N抗原及S蛋白特异性的IgM抗体和IgG抗体，能够准确的判断该机体的免疫学反应状态及病毒的传染性，从而根据检测结果，给出准确的检测结果，有助于提高新冠病毒检出率，避免“假阴性”结果，防止漏检，进一步提升检查准确性，为临床诊治新型冠状病毒肺炎提供帮助。本发明的胶体金免疫层析检 测卡特异性强，而且检测速度快、操作简便，无需专门设备，也不需要专业人员的操作，可 应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断 结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场辅助检测手段，从而 及早预防疫情扩散。
附图说明
图1为本发明胶体金免疫层析检测卡的结构示意图。
图2为本发明COVID-19N抗原检测试纸条的结构示意图。
图3为本发明COVID-19S蛋白抗体检测试纸条的结构示意图。
上述图中：1、卡壳，2、加样孔，3、观察窗，4、第一样品垫，5、第一结合垫，6、第 一反应垫，7、第一吸水垫，8、第一检测线，9、第一质控线，10、第一底板，11、第二样 品垫，12、第二结合垫，13、第二反应垫，14、第二吸水垫，15、第二检测线，16、第三检 测线，17、第二质控线，18、第二底板。
图4为N蛋白的SDS-PAGE结果。
图5为S蛋白RBD区蛋白的SDS-PAGE结果。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较 佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形 式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰， 均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1：
一种联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡， 所述检测卡由卡壳、设置于卡壳上的两个加样孔和含有COVID-19N抗原检测试纸条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条的两个观察窗构成，其中：
所述卡壳上的加样孔与观察窗间隔状直线排列，每组加样孔与观察窗同方向设置且间隔 状平行排列；所述COVID-19N抗原检测试纸条由依次相连的第一样品垫、第一结合垫、第 一反应垫和第一吸水垫构成；其中所述第一结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒 COVID-19N蛋白单克隆抗体，所述第一反应垫上沿样品流动方向依次设有第一检测线和第 一质控线，第一检测线上包被有新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体，第一质控线上包 被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19S蛋白抗体检测试纸条由依次相连的第二样品垫、第二结合垫、第二反应垫和第二吸水垫构成；其中所述第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠 状病毒COVID-19重组S蛋白抗原；所述第二反应垫上沿样品流动方向依次设有第二检测线、 第三检测线和第二质控线，第二检测线上包被有抗人IgM抗体，所述第三检测线上包被有抗 人IgG抗体，第二质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19N抗原检测试纸条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条分别设置在卡壳上的每组加样孔与观察窗所在的位置，每组 中的加样孔与所述第一样品垫或第二样品垫相对应，组中相应的观察窗与所述第一反应垫或 第二反应垫相对应；所述第一反应垫上的第一检测线与第一质控线的间距不少于1cm，所述 第二反应垫上第二检测线、第三检测线和第二质控线之间的距离不少于1cm。
本实施例中对胶体金的具体的制备方法没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的制备 方法即可，例如：采用柠檬酸三钠还原法制备等方法，可以通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的 加入比例来改变和控制胶体金的粒径大小。对胶体金具体的标记过程不作特别限定，采用本 领域技术人员熟知的方法即可。
上述检测卡中，优选的实施方式是：
所述胶体金标记中所采用的胶体金的粒径为20-30nm；胶体金的质量比浓度为万分之六。
所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体与胶体金的结合浓度为每100ml体金浓 液加入0.8mg N蛋白单克隆抗体；所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白抗原与胶体金的 结合浓度为每100ml体金浓液加入0.8mg重组S蛋白抗原。
进一步优选的实施方式是：第一检测线上包被有浓度为1.2mg/ml的新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体；第二检测线上包被有浓度为1.8mg/ml的抗人IgM抗体，所述 第三检测线上包被有浓度为1.6mg/ml的抗人IgG抗体。
上述检测卡中，所述第一或第二样品垫优选采用玻纤SB06，所述第一或第二结合垫优 选为玻纤8965，所述第一或第二反应垫优选为赛多利斯CN140可以大大提高胶体金免疫层 析检测新型冠状病毒COVID-19的灵敏度及特异度，并能达到最好的性价比。
上述检测卡还可以采用：第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒COVID-19重组 S蛋白抗原及鼠IgG，其中重组S蛋白抗原与鼠IgG的体积比为2:1。
本发明中，所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白和S蛋白可按照本领域常规技术制备， 不作特别限定。
上述检测卡中，所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白优选以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19N蛋白基因序列，将其连入表达载体pET-28，构建重组表 达载体pET-28-N，经测序鉴定正确后转化至表达菌E.coli Rosetta中，以IPTG诱导蛋白表 达，收集发酵产物进行超声破碎，经Ni柱纯化即制得新型冠状病毒COVID-19N蛋白；其中，所述表达载体pET-28的N端、C端均带有6×His标签。
上述检测卡中，所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白优选以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19S蛋白中S1域RBD的基因序列；将该基因序列插入带有pPICZα的表达载体中构建重组表达载体，经测序鉴定正确后以此表达载体转染酵母GS115细胞，收集发酵产物进行超声破碎，再通过Ni亲和纯化柱进行蛋白纯化制得新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白。
上述检测卡中，所述新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备方法为：采用制备的新型冠 状病毒N蛋白，免疫的Balb/c小鼠，无菌取出已免疫的Balb/c小鼠脾脏，分离脾细胞，将 脾细胞与骨髓瘤细胞按9：1的比例混合，PEG促融合，于HAT培养液(20％胎牛血清/DMEM1XHAT)上融合成杂交瘤细胞，然后进行杂交瘤细胞筛选，获得阳性杂交瘤细胞后，进行 亚克隆，取细胞进行培养至对数生长期，接种于Balb/c小鼠体内，并产生腹水。采集腹水 后，离心去除细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，先经辛酸-硫酸铵法粗纯化，再上SepHadexG-50层析柱进行离子交换层析，用0.01M PBS(pH7.2)洗脱，收集第一洗脱峰，洗脱液用PEG20000浓缩20分钟，浓缩液即为纯化出的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
本实施例中第二反应垫上的抗人IgG抗体和抗人IgM抗体均为市售产品或可按照本领 域常规技术制备。
实施例2：
本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析 检测卡作为判定新型冠状病毒COVID-19有无测试装置的应用，其中所述检测卡的使用方法 是：
将被测样品溶液分别滴加到COVID-19N抗原检测试纸条和COVID-19S蛋白抗体检测 试纸条的样品垫上，其中所述被测样品是人血清、血浆或全血样本；待5～20分钟后，根据检 测线和质控线的显色情况，判断样品中是否含有新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗 体，判断方法如下：
对于COVID-19N抗原检测试纸条，1)阳性：第一质控线、第一检测线均呈现红色条带， 说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19N抗原；2)阴性：第一质控线呈现红色条带，第一 检测线不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19N抗原；3)失效：第一质控线、第一检测线均不呈现红色条带或仅有第一检测线呈现红色条带，说明COVID-19N抗原检测试纸条失效；
对于和COVID-19S蛋白抗体检测试纸条，1)阳性：第二质控线、第二检测线均呈现红 色条带，第三检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgM抗体；第二质控线、第三检测线均呈现红色条带，第二检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgG抗体；2)阴性：第二质控线呈现红色条带，第二检测线和第三检 测线均不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19S蛋白抗体；3)失效：无 论第二检测线、第三检测线是否呈现红色条带，第二质控线不呈现红色条带时，说明COVID-19抗体检测试纸条失效。
本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析 检测卡检测样品为血液，避免了目前核酸检测采集上呼吸道样品对医护人员暴露风险大的问 题，相对安全性高。
实施例3：
本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析 检测卡性能评价。
临床样品检测：实验开展的临床样品数是200例，其中包括23例确诊病例，这13例确 诊病例核酸检测结果是阳性，本发明的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗 体的胶体金免疫层析检测卡检测结果也是阳性，一致率达到100％。其中1例在出院复查是 其核酸及抗原为阴性，但是S蛋白IgG仍为阳性。证明本发明所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡可以作为判定新型冠状病毒COVID-19有无测试装置应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案， 均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，所述检测卡由卡壳、设置于卡壳上的两个加样孔和含有COVID-19N抗原检测试纸条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条的两个观察窗构成，其特征在于：
所述卡壳上的加样孔与观察窗间隔状直线排列，每组加样孔与观察窗同方向设置且间隔状平行排列；所述COVID-19N抗原检测试纸条由依次相连的第一样品垫、第一结合垫、第一反应垫和第一吸水垫构成；其中所述第一结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体，所述第一反应垫上沿样品流动方向依次设有第一检测线和第一质控线，第一检测线上包被有新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体，第一质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19S蛋白抗体检测试纸条由依次相连的第二样品垫、第二结合垫、第二反应垫和第二吸水垫构成；其中所述第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白抗原；所述第二反应垫上沿样品流动方向依次设有第二检测线、第三检测线和第二质控线，第二检测线上包被有抗人IgM抗体，所述第三检测线上包被有抗人IgG抗体，第二质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述COVID-19N抗原检测试纸条或COVID-19S蛋白抗体检测试纸条分别设置在卡壳上的每组加样孔与观察窗所在的位置，每组中的加样孔与所述第一样品垫或第二样品垫相对应，组中相应的观察窗与所述第一反应垫或第二反应垫相对应；所述第一反应垫上的第一检测线与第一质控线的间距不少于1cm，所述第二反应垫上第二检测线、第三检测线和第二质控线之间的距离不少于1cm。
2.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于：所述胶体金标记中所采用的胶体金的粒径为20-30nm；胶体金的质量比浓度为万分之六。
3.根据权利要求1或2所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于：所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体与胶体金的结合浓度为每100ml体金浓液加入0.8mg N蛋白单克隆抗体；所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白抗原与胶体金的结合浓度为每100ml体金浓液加入0.8mg重组S蛋白抗原。
4.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于：第一检测线上包被有浓度为1.2mg/ml的新型冠状病毒COVID-19N蛋白捕获抗体；第二检测线上包被有浓度为1.8mg/ml的抗人IgM抗体，所述第三检测线上包被有浓度为1.6mg/ml的抗人IgG抗体。
5.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于：第二结合垫上喷有胶体金标记的新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白抗原及鼠IgG，其中重组S蛋白抗原与鼠IgG的体积比为2:1。
6.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于：所述第一或第二样品垫采用玻纤SB06，所述第一或第二结合垫为玻纤8965，所述第一或第二反应垫为赛多利斯CN140。
7.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述新型冠状病毒COVID-19N蛋白以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19N蛋白基因序列，将其连入表达载体pET-28，构建重组表达载体pET-28-N，经测序鉴定正确后转化至表达菌E.coli Rosetta中，以IPTG诱导蛋白表达，收集发酵产物进行超声破碎，经Ni柱纯化即制得新型冠状病毒COVID-19N蛋白；其中，所述表达载体pET-28的N端、C端均带有6×His标签。
8.根据权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白以如下方法制得：
克隆新型冠状病毒COVID-19S蛋白中S1域RBD的基因序列；将该基因序列插入带有pPICZα的表达载体中构建重组表达载体，经测序鉴定正确后以此表达载体转染酵母GS115细胞，收集发酵产物进行超声破碎，再通过Ni亲和纯化柱进行蛋白纯化制得新型冠状病毒COVID-19重组S蛋白。
9.权利要求1所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡作为判定新型冠状病毒COVID-19有无测试装置的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的联合检验新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡的使用方法是：
将被测样品溶液分别滴加到COVID-19N抗原检测试纸条和COVID-19S蛋白抗体检测试纸条的样品垫上，其中所述被测样品是人血清、血浆或全血样本；待5～20分钟后，根据检测线和质控线的显色情况，判断样品中是否含有新型冠状病毒COVID-19N抗原和S蛋白抗体，判断方法如下：
对于COVID-19N抗原检测试纸条，1)阳性：第一质控线、第一检测线均呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19N抗原；2)阴性：第一质控线呈现红色条带，第一检测线不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19N抗原；3)失效：第一质控线、第一检测线均不呈现红色条带或仅有第一检测线呈现红色条带，说明COVID-19N抗原检测试纸条失效；
对于和COVID-19S蛋白抗体检测试纸条，1)阳性：第二质控线、第二检测线均呈现红色条带，第三检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgM抗体；第二质控线、第三检测线均呈现红色条带，第二检测线不呈现红色条带，说明样品中含有新型冠状病毒COVID-19IgG抗体；2)阴性：第二质控线呈现红色条带，第二检测线和第三检测线均不呈现红色条带，说明样品中不含新型冠状病毒COVID-19S蛋白抗体；3)失效：无论第二检测线、第三检测线是否呈现红色条带，第二质控线不呈现红色条带时，说明COVID-19抗体检测试纸条失效。
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