CN112611869A - 新型冠状病毒检测试剂条以及包括其的新型冠状病毒检测试剂盒 - Google Patents

新型冠状病毒检测试剂条以及包括其的新型冠状病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒检测试剂条以及包括其的新型冠状病毒检测试剂盒，涉及生物检测技术领域。该试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；其中所述量子点特异性蛋白复合物中的特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2‑ECD蛋白或新型冠状病毒S1‑RBD蛋白中的一种。上述试剂条采用量子点免疫层析技术，将新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2‑ECD蛋白和新型冠状病毒S1‑RBD蛋白作为检测抗原对待确诊新型冠状病毒患者的血浆进行检测，上述试剂条具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势。

Description

新型冠状病毒检测试剂条以及包括其的新型冠状病毒检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒检测试剂条以及包括其的新型冠状病毒检测试剂盒。
背景技术
核酸检测和CT影像学是新冠病毒感染者筛查的主要方法。核酸检测假阴性率高、操作人员和场地设备要求高、检测时间长。CT检查其它病毒性肺炎鉴别性诊断难、易交叉感染、卫生经济学可操作性不强。更为重要的是，以上两种方法均无法实现现场快速、大规模筛查，现阶段急需开发灵敏度更高、可信度更强、操作更便捷的快速检测产品。
与核酸检测比较，外周静脉血和末梢血新冠病毒抗体检测具有操作简易、检测时间短、通量高(每小时可检测数百个样本)等优势。更为重要的是，避免了核酸咽拭子或痰液检测采样气溶胶的高生物安全风险。然而，现有临床使用的新型冠状病毒抗体检测方法主要有酶联免疫法、化学发光法以及胶体金法。酶联免疫法和化学发光法可进行定量检测，是抗体检测的主要方法。胶体金法是一种即时检测(point-of-care testing，POCT)方法，具有快速、检测场地不受限制以及操作者要求低的优点，但胶体金法只能定性检测，与定量检测方法比较灵敏度和特异度欠佳。
目前，国内外商业化ELISA、化学发光法和胶体金法COVID-19抗体诊断产品主要包括总抗体以及IgM、IgG抗体联合检测试剂，然而各项检测方法敏感性在66％～97.8％之间，特异性在96.6～99.7％之间，该结果表明2.2％～34％的新冠肺炎患者漏检，0.3％～3.4％被检者错误诊断为新冠肺炎。更为重要的是，现有商业化COVID-19抗体检测试剂早期检出率低。在高流行地区，现有抗体测试将会产生漏检，无法达到精准防疫的目标。在低流行率人群中，现有的抗体测试可能产生和真实阳性结果一样多甚至更多的假阴性结果，造成不必要的人力物力浪费。
因此，研究开发一种新型冠状病毒检测试剂盒，以提高早期诊断率和降低假阳性率，其临床意义重大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种新型冠状病毒检测试剂条，所述新型冠状病毒检测试剂条的量子点标记物结合垫中吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物中的特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。上述试剂条通过量子点免疫层析检测的方法具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势，最大程度避免了弱阳性样本漏检和假阳性样本误检。
本发明的第二目的在于提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，该试剂盒包括上述新型冠状病毒检测试剂条。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供的一种新型冠状病毒检测试剂条，所述试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；
其中，所述量子点标记物结合垫吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物主要由量子点和特异性蛋白偶联得到；
所述特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。
进一步的，所述新型冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如Seq No.01所示；
优选地，所述新型冠状病毒S2-ECD蛋白的氨基酸序列如Seq No.02所示；
优选地，所述新型冠状病毒S1-RBD蛋白的氨基酸序列如Seq No.03所示。
进一步的，所述样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸设置于底卡上；
其中，所述层析反应膜设置于底卡的中间，所述量子点标记物结合垫和样品垫依次搭接在层析反应膜的一端上，所述吸水纸搭接在层析反应膜的另一端上。
进一步的，所述层析反应膜包括NC膜、PVDF膜或尼龙膜中的一种，优选为硝酸纤维素膜；
优选地，所述底卡为PVC底卡或PC底卡中的一种，优选为PC底卡；
优选地，所述释放垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
优选地，所述样品垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
优选地，所述吸水纸包括厚滤纸、玻璃纤维或滤血膜中的一种，优选厚滤纸。
进一步的，所述层析反应膜上设置有检测线和质控线；
所述检测线包括IgA检测线、IgG检测线、IgM检测线中的至少一条，其中，IgA检测线含有抗人IgA；IgG检测线含有抗人IgG；IgM检测线含有抗人IgM；
所述质控线含有羊抗兔IgG抗体；
优选地，所述检测线包括IgA检测线和IgG检测线。
更进一步的，所述IgA检测线中抗人IgA的浓度为0.2～1mg/ml；
优选地，所述IgG检测线中抗人IgG的浓度为0.2～1mg/ml；
优选地，所述IgM检测线中抗人IgM的浓度为0.2～1mg/ml；
更优选地，所述抗人IgA包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体中的任意一种；
更优选地，所述抗人IgG包括羊抗人IgG多克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体中的任意一种；
更优选地，所述抗人IgM包括羊抗人IgM多克隆抗体、鼠抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM多克隆抗体中的任意一种。
进一步的，所述量子点标记物结合垫中量子点特异性蛋白复合物的浓度为0.01～0.1mg/ml。
本发明提供的一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括上述新型冠状病毒检测试剂条。
进一步的，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条、特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S1-RBD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条；
优选地，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条。
进一步的，所述新型冠状病毒检测试剂盒还包括紫外照射装置。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的新型冠状病毒检测试剂条，所述试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；其中，所述量子点标记物结合垫吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物中的特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。上述试剂条采用量子点免疫层析技术，将新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白和新型冠状病毒S1-RBD蛋白作为检测抗原，使用量子点荧光微球标记N、S1-RBD和S2-ECD抗原蛋白形成量子点特异性蛋白复合物，随后对新型冠状病毒的血浆进行检测，上述试剂条具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势，最大程度避免了弱阳性样本漏检和假阳性样本误检。同时本发明使用的量子点免疫层析法检测迅速，10分钟内出结果，使用血清检测样本可降低医护人员暴露风险，简单培训即可现场操作，而且每台便携式荧光检测仪1小时能检测上百个样本。
本发明提供的新型冠状病毒检测试剂盒，该试剂盒包括上述新型冠状病毒检测试剂条。由上述试剂条的特性所决定，本申请试剂盒具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例12提供的新型冠状病毒检测试剂条结构示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种新型冠状病毒检测试剂条，所述试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；
其中，所述量子点标记物结合垫吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物主要由量子点和特异性蛋白偶联得到；
所述特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。
本发明提供的新型冠状病毒检测试剂条，所述试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；其中，所述量子点标记物结合垫吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物中的特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。上述试剂条采用量子点免疫层析技术，将新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白和新型冠状病毒S1-RBD蛋白作为检测抗原，使用量子点荧光微球标记N、S1-RBD和S2-ECD抗原蛋白形成量子点特异性蛋白复合物，随后对新型冠状病毒的血浆进行检测，上述试剂条具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势，最大程度避免了弱阳性样本漏检和假阳性样本误检。同时本发明使用的量子点免疫层析法检测迅速，10分钟内出结果，使用血清检测样本可降低医护人员暴露风险，简单培训即可现场操作，而且每台便携式荧光检测仪1小时能检测上百个样本。
注：所述新型冠状病毒S2-ECD蛋白；为2019-nCoVS2亚基胞外结构域(extra-cellular domain,ECD)蛋白；所述新型冠状病毒S1-RBD蛋白为2019-nCoV表面刺突蛋白S1亚基受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白；所述新型冠状病毒N蛋白为2019-nCoV主要蛋白核壳体蛋白(Nucleocapsid Protein,N蛋白)。
在本发明的一种优选实施方式中，所述新型冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如SeqNo.01所示；
在本发明的一种优选实施方式中，所述新型冠状病毒S2-ECD蛋白的氨基酸序列如Seq No.02所示；
在本发明的一种优选实施方式中，所述新型冠状病毒S1-RBD蛋白的氨基酸序列如Seq No.03所示。
在本发明的一种优选实施方式中，所述样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸设置于底卡上；
其中，所述层析反应膜设置于底卡的中间，所述量子点标记物结合垫和样品垫依次搭接在层析反应膜的一端上，所述吸水纸搭接在层析反应膜的另一端上。
在本发明的一种优选实施方式中，所述层析反应膜包括NC膜、PVDF膜或尼龙膜中的一种，优选为硝酸纤维素膜；
在本发明的一种优选实施方式中，所述底卡为PVC底卡或PC底卡中的一种，优选为PC底卡；
在本发明的一种优选实施方式中，所述释放垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
在本发明的一种优选实施方式中，所述样品垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
在本发明的一种优选实施方式中，所述吸水纸包括厚滤纸、玻璃纤维或滤血膜中的一种，优选厚滤纸。
在本发明的一种优选实施方式中，所述层析反应膜上设置有检测线和质控线；
所述检测线包括IgA检测线、IgG检测线、IgM检测线中的至少一条，其中，IgA检测线含有抗人IgA；IgG检测线含有抗人IgG；IgM检测线含有抗人IgM；
所述质控线含有羊抗兔IgG抗体；
作为一种优选的实施方式，上述新冠病毒N、S1 RBD和S2 ECD蛋白对IgA、IgG和IgM具有较强的特异性，申请人以正常健康人、新冠病毒确诊阴性上呼吸道感染发热患者的血浆/血清评价量子点免疫荧光层析检测方法学的特异性，发现新冠病毒N、S1 RBD和S2 ECD蛋白对应IgM特异度分别达98％、97％、100％；新冠病毒N、S1 RBD和S2 ECD蛋白对应IgG特异度分别达100％、100％、100％；新冠病毒N、S1 RBD和S2 ECD蛋白对应IgA特异度分别达100％、97％、100％，具体如下表所示：
Figure BDA0002850000590000081
由此可知，上述、IgM抗体为人体早期抗体，产生较早，是人体免疫组织的快速反应部队,占血清总Ig的5％～10％，而IgG是人体免疫的主力部队，免疫球蛋白G(IgG)是血清中免疫球蛋白的主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％，但仅对IgG和IgM进行检测会有漏检的情况出现，故加上了IgA抗体，IgA与IgM一样是人体早期免疫抗体是血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白的10～20％。
在本发明的一种优选实施方式中，所述检测线包括IgA检测线和IgG检测线。
在上述优选实施方式中，所述IgA检测线中抗人IgA的浓度为0.2～1mg/ml；
在上述优选实施方式中，所述IgG检测线中抗人IgG的浓度为0.2～1mg/ml；
在上述优选实施方式中，所述IgM检测线中抗人IgM的浓度为0.2～1mg/ml；
优选地，所述抗人IgA包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体中的任意一种；
优选地，所述抗人IgG包括羊抗人IgG多克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体中的任意一种；
优选地，所述抗人IgM包括羊抗人IgM多克隆抗体、鼠抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM多克隆抗体中的任意一种。
在本发明的一种优选实施方式中，所述量子点标记物结合垫中量子点特异性蛋白复合物的浓度为0.01～0.1mg/ml。
根据本发明的一个方面，一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括上述新型冠状病毒检测试剂条。
本发明提供的新型冠状病毒检测试剂盒，该试剂盒包括上述新型冠状病毒检测试剂条。由上述试剂条的特性所决定，本申请试剂盒具有灵敏度高、特异度高以及可定量检测的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条、特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S1-RBD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条中的至少一个；
在上述优选实施方式中，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条。
作为一种优选的实施方式，上述试剂盒六联(S1/S2/N-IgA/G)与新型四联(S2/N-IgA/G)在一周检出率16/34，等于九个项目联合检出率，大于其他组合检出率。六联(S1/S2/N-IgA/G)与新型四联(S2/N-IgA/G)在二周检出率60/62，略低于九个项目联合检出率61/62(但导致此差别的样本在第9天检测为阴性，第15天检测即为N-IgG/IgA、S1-IgG/IgA、S2-IgG/IgA阳性，该结果和取样间隔时间过长有关，故新型四联和六联具有明显的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述新型冠状病毒检测试剂盒还包括紫外照射装置。
下面将结合实施例和对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
制备新型冠状病毒重组抗原N蛋白、S1-RBD蛋白和S2-ECD蛋白：
(1)、采用基因克隆技术，PCR扩增编码新型冠状病毒抗原的N基因和S2-ECD基因、S1-RBD蛋白；
(2)、N基因转入大肠杆菌表达，S2-ECD基因转入293细胞中使其表达，S1-RBD蛋白转入293细胞中表达，获得新型冠状病毒重组抗原N蛋白和S2-ECD蛋白和S1-RBD蛋白。
实施例2
制备层析反应膜(IgA、IgG两条检测线)：
将25cm宽的NC膜有贴在PVC底卡中间区域，之后将抗人IgA、抗人IgG以及羊抗兔IgG抗体分别用PBS稀释液中稀释成0.2～1mg/ml并用喷金划膜仪划在NC膜相应的检测线区和质控线区。37℃烘箱12-24h烘干，封袋备用。
实施例3
制备层析反应膜(IgM、IgG两条检测线)：
将25cm宽的NC膜有贴在PVC底卡中间区域，之后将抗人IgM、抗人IgG以及羊抗兔IgG抗体分别用PBS稀释液中稀释成0.2～1mg/ml并用喷金划膜仪划在NC膜相应的检测线区和质控线区。37℃烘箱12-24h烘干，封袋备用。
实施例4
制备层析反应膜(IgA、IgM、IgG三条检测线)：
将25cm宽的NC膜有贴在PVC底卡中间区域，之后将抗人IgA、抗人IgM、抗人IgG以及羊抗兔IgG抗体分别用PBS稀释液中稀释成0.2～1mg/ml并用喷金划膜仪划在NC膜相应的检测线区和质控线区。37℃烘箱12-24h烘干，封袋备用。
实施例5
制备样品垫：
用移液枪和涂布棒将20～100mMTris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,0.5％PVP,0.5％TWEEN-20)均匀涂布在未处理释放垫上，37℃12～24h烘干，封袋备用。
实施例6
制备量子点-标记蛋白复合物(特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白)：
(1)、取200μl的qds加入800μl的MES(pH 6)缓冲液中，加入40～160μg EDC和10～40μg NHS活化，37℃活化15-60min。将活化后的溶液在一定条件下离心，用移液枪去除上清。
(2)、将步骤(1)离心后沉淀用1000μl的10～50mM MES(pH 6)缓冲液复溶沉淀，若复溶不彻底可用超声协助复溶。将复溶后的溶液在一定条件下离心，用移液枪去除上清，1000μl的10～50mM MES(pH 6)缓冲液复溶沉淀，若复溶不彻底可用超声协助复溶(可省略此步骤)。
(3)、向复溶溶液中加入20～100μl的已用10～50mM MES(pH 6)缓冲液稀释成1mg/ml的新型冠状病毒N蛋白，37℃偶联60-300min。
(4)、偶联结束后加入100μl的20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0,含100～500mM甘氨酸+10％BSA)进行封闭，37℃封闭30～120min。
(5)、将封闭好后的溶液在一定条件下离心，用移液枪去除上清。500-1000μlTris-HCl稀释液复溶沉淀，若复溶不彻底可用超声协助复溶，继续在一定条件下离心，用移液枪去除上清(可省略此步骤)。500-1000μl的20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0)复溶沉淀，若复溶不彻底可用超声协助复溶，4℃保存，得到量子点-标记蛋白复合物。
实施例7
制备量子点-标记蛋白复合物(特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白)：
本实施例除步骤(3)为：“向复溶溶液中加入20～100μl的已用10～50mM MES(pH6)缓冲液稀释成1mg/ml的新型冠状病毒S2-ECD蛋白，37℃偶联60-300min。”外，其余同实施例6。
实施例8
制备量子点-标记蛋白复合物(特异性蛋白为新型冠状病毒S1-RBD蛋白)：
本实施例除步骤(3)为：“向复溶溶液中加入20～100μl的已用10～50mM MES(pH6)缓冲液稀释成1mg/ml的新型冠状病毒S1-RBD蛋白，37℃偶联60-300min。”外，其余同实施例6。
实施例9
制备量子点标记物结合垫(特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白)：
将实施例6制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用划膜喷金仪喷点于已处理释放垫上，37℃12～24h烘干，得到量子点标记物结合垫。或者将实施例7制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用移液枪喷点在未处理的释放垫上，再用涂布棒涂布均匀，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥，待程序运行完毕后封袋备用。
实施例10
制备量子点标记物结合垫(特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白)：
将实施例7制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用划膜喷金仪喷点于已处理释放垫上，37℃12～24h烘干，得到量子点标记物结合垫。或者将实施例7制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用移液枪喷点在未处理的释放垫上，再用涂布棒涂布均匀，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥，待程序运行完毕后封袋备用。
实施例11
制备量子点标记物结合垫(特异性蛋白为新型冠状病毒S1-RBD蛋白)：
将实施例8制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用划膜喷金仪喷点于已处理释放垫上，37℃12～24h烘干，得到量子点标记物结合垫。或者将实施例7制备好的量子点-标记蛋白复合物用20～100mM Tris-HCl稀释液(pH8.0，含0.5％BSA,2％海藻糖)根据需求稀释20-100倍后用移液枪喷点在未处理的释放垫上，再用涂布棒涂布均匀，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥，待程序运行完毕后封袋备用。
实施例12
如图1所示，一种新型冠状病毒检测试剂条，所述试剂条的制备方法包括以下步骤：
将实施例4制得的层析反应膜、实施例9制得的量子点标记物结合垫、实施例5制得的样品垫以及吸水纸搭接粘附在PVC背板上；
其中样品垫和量子点标记物结合垫依次搭接在层析反应膜的一端，吸水纸搭接在层析反应膜的另一端，然后调整切条机参数进行切条，切成宽3-4mm的试纸条。
实施例13
本实施例除将实施例9制得的量子点标记物结合垫替换为实施例10制得的量子点标记物结合垫外，其余同实施例12。
实施例14
本实施例除将实施例9制得的量子点标记物结合垫替换为实施例11制得的量子点标记物结合垫外，其余同实施例12。
实施例15
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例3的层析反应膜外，其余同实施例12。
实施例16
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例3的层析反应膜外，其余同实施例13。
实施例17
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例3的层析反应膜外，其余同实施例14。
实施例18
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例2的层析反应膜外，其余同实施例12。
实施例19
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例2的层析反应膜外，其余同实施例13。
实施例20
本实施例除将实施例4的层析反应膜替换为实施例2的层析反应膜外，其余同实施例14。
上述实施例12～20中试剂条的特异性蛋白和检测线的设置如下：
Figure BDA0002850000590000141
Figure BDA0002850000590000151
实施例21
一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括实施例15和实施例16的检测试剂条。
实施例22
一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括实施例17和实施例18的检测试剂条。
实施例23
一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括实施例17、实施例18和实施例19的检测试剂条。
实施例24
一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括实施例12、实施例13和实施例14的检测试剂条。
由于市面上常见的组合方式(S1/S2-IgM/IgG)，申请人根据研究发现组合方式(S2/N-IgA/IgG、S1/S2/N-IgA/IgM/IgG)具有更好的性能，故对此进行比较分析。产品组合方式包括但不限于以上实施例。
实施例25检测阈值(CutOff)确定：
为了确定新冠病毒IgM、IgG和IgA的量子点免疫荧光层析检测方法cutoff值，我们分别检测健康人血浆/血清新冠病毒N、S1 RBD和S2 ECD蛋白特异性抗体IgM、IgA和IgG的平均值。
IgM与IgG检测阈值设定方法：如3倍平均值大于0.1，则检测阈值按3倍平均值计算；如3倍平均值小于0.1，则检测阈值设置为0.1；N-IgM、S1 RBD-IgM和S2 ECD-IgM分别为0.1、0.1、0.101，N-IgG、S1 RBD-IgG和S2 ECD-IgG分别为0.1、0.1、0.116(表1)。
IgA检测阈值设定方法：如3倍平均值大于0.05，则检测阈值按3倍平均值计算；如3倍平均值小于0.05，则检测阈值设置为0.05；N-IgA、S1RBD-IgA和S2 ECD-IgA分别为0.05、0.05、0.214，具体如下表所示：
Figure BDA0002850000590000161
实验例1新冠肺炎患者发病后一周的检测：
申请人收集了发病后1周来源于34例新冠肺炎患者的44个血液样本，分别使用实施例12～14的试剂条进就行检测，统计阳性病例以抗体血清转化最早时间为准，阴性病例以血清收集最迟时间为准。新冠肺炎患者发病1周内血清样本中，其中S2-IgG、N-IgA的检出率高，分别达35.29％(12/34)、38.24％(13/34)，S1-IgM和N-IgM的检出率低，均仅为5.88％(2/34)。各个单项检出情况见下表：
Figure BDA0002850000590000162
Figure BDA0002850000590000171
进一步的，申请人使用实施例20～23的试剂盒对发病后1周的新冠肺炎患者血液样本进行检测，具体结果如下表所示：
Figure BDA0002850000590000172
通过对上表的分析可知，实施例21～23的检出率均为47.06％(16/34)，即新冠肺炎患者发病1周内未单独出现N-IgM、S1RBD-IgM或S2ECD-IgM血清转化。因此，新冠肺炎患者发病1周内IgM未能与IgG或IgA有效互补，无法达到联合检测增加检出率的预期效果。同时，上述分析也表明了N-IgG/IgA、S1-IgG/IgA、S2-IgG/IgA的联合诊断效果，结果显示实施例21(四联)和实施例22(六联)的累计检出率一致，均为47.06％(16/34)，即新冠肺炎患者一周内未单独出现S1-IgA或S1-IgG的血清转化。S1RBD未能与N或S2ECD有效互补，无法达到联合检测增加检出率的预期效果。
此外，申请人也分析了N/S2ECD-IgG和N/S2ECD-IgA的联合检测效果，N-IgG和S2ECD-IgG联合检出率达35.29％(12/34)，N-IgA和S2ECD-IgA联合检出率达38.24％(13/34)，其中8.33％(3/34)、11.11％(4/34)的个体仅出现N/S2ECD-IgG或N/S2ECD-IgA阳性。进一步分析发现，23.53％(8/34)个体同时出现N和S2ECD抗原对应的IgG血清转化，0％(0/34)、11.76％(4/34)的个体分别出现N或S2ECD抗原对应的单独IgG血清转化。17.65％(6/34)个体同时出现N和S2ECD抗原对应的IgA血清转化，20.59％(7/34)、0％(0/34)的个体分别出现N或S2ECD抗原对应的单独IgA血清转化。
因此，实施例21的N-IgG、S2ECD-IgG、N-IgA和S2ECD-IgA有效互补能增加1周内检出率，其检测率47.06％(16/34)高于实施例20的S1-IgG、S1-IgM、N-IgG和N-IgM的组合检出率26.47％(9/34)。
实验例2新冠肺炎患者发病后二周的检测：
申请人收集了发病后第2周来源于62例新冠肺炎患者的91个样本，统计阳性病例以抗体血清转化最早时间为准，阴性病例以血清收集最迟时间为准。新冠肺炎患者发病第2周内血清样本中，其中S2-IgG、N-IgA的检出率高，分别达95.16％(59/62)、85.48％(53/62)，S1-IgG和N-IgM的检出率低，均仅为51.61％(32/62)、48.39％(30/62)。各个单项检出情况见下表：
Figure BDA0002850000590000181
进一步的，申请人使用实施例20～23的试剂盒对发病后2周的新冠肺炎患者血液样本进行检测，具体结果如下表所示：
Figure BDA0002850000590000191
由上述数据可知，实施例21～23的检测结果基本一致，即新冠肺炎患者发病第2周内基本无单独出现N-IgM、S1RBD-IgM或S2ECD-IgM血清转化。因此，新冠肺炎患者发病第2周内IgM未能与IgG或IgA有效互补，无法达到联合检测增加检出率的预期效果。同时，实施例21与实施例22的累计检出率一致，为96.77％(60/62)，即新冠肺炎患者第2周内未单独出现S1-IgA或S1-IgG的血清转化。因此，S1RBD未能与N或S2ECD有效互补，无法达到联合检测增加检出率的预期效果。
注：发病后2周N-IgG/IgA、S1-IgG/IgA、S2-IgG/IgA的联合检测阴性样本共2例，其中1例阴性样本检测时间为第9天，第15天复测时N-IgG/IgA、S1-IgG/IgA、S2-IgG/IgA均呈阳性，该例抗体阴性可能和采样间隔时间过长有关系；另1例阴性样本检测时间第10天，第26天复测时N-IgG/IgA、S1-IgG/IgA、S2-IgG/IgA均呈强阳性，该例抗体阴性可能和采样间隔时间过长有关系。
此外，申请人还分析了N/S2ECD-IgG和N/S2ECD-IgA的联合检测效果，N-IgG和S2ECD-IgG联合检出率达95.16％(59/62)，N-IgA和S2ECD-IgA联合检出率达87.10％(54/62)，其中9.68％(6/62)、1.61％(1/62)的个体仅出现N/S2ECD-IgG或N/S2ECD-IgA阳性。进一步分析发现，80.65％(50/62)个体同时出现N和S2ECD抗原对应的IgG血清转化，0％(0/62)、14.52％(9/62)的个体分别出现N或S2ECD抗原对应的单独IgG血清转化；56.45％(35/62)个体同时出现N和S2ECD抗原对应的IgA血清转化，29.03％(18/62)、1.61％(1/62)的个体分别出现N或S2ECD抗原对应的单独IgA血清转化。
因此，实施例21的N-IgG、S2ECD-IgG、N-IgA和S2ECD-IgA有效互补能增加2周内检出率，其检测率96.77％(60/62)高于实施例20的S1-IgG、S1-IgM、N-IgG和N-IgM的组合检出率87.10％(54/62)。
实验例3
由于新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高可确诊。因此，对于一些来自新冠高流行地区的疑似病例，IgG抗体阳性很有可能是既往感染，为更好区分急性感染和既往感染患者，我们对患者进行连续采样检测。
本实验例共收集了发病后2周内来源于76例新冠肺炎患者的136个样本，37例患者仅1次采样，未纳入研究。39例患者2次及以上的采样，IgG和/或IgA阳性数值升高4倍共12例，阴性转为阳性并升高到阈值4倍以上的样本共有10例，仅阴转阳未升高到阈值4倍的样本5例，10例首次采样过晚(超过1周)导致出现未出现阴转阳或没有升高4倍，2(5、8)例2周内均为阴性(注1例采样时间为第3天和第5天，第18天复测IgG和IgA强阳性；另1例采样时间为第6、8、10天，第26天复测IgG和IgA强阳性)。
发现8例的患者N/S2-IgG升高四倍，9例的患者N/S2-IgA升高四倍，IgG和IgA同时升高4倍的共有5例，3例仅IgG升高四倍，4例仅IgA升高四倍。因此IgA升高4倍同样可应用于急性感染和既往感染的鉴别，两者联合应用能有效互补。我们进一步分析了S1抗原对应的特异性IgA、IgG以及S2-IgM、S1-IgM、N-IgM升高4倍的现象，结果显示S1-IgA、S1-IgG、S2-IgM、S1-IgM、N-IgM升高4倍分别各2、2、2、1、1例。值得关注的是，S1抗原对应的特异性IgA、IgG、IgM各出现1例患者单独发生升高4倍，而S2-IgM和N-IgM未出现单独升高4倍的现象。出现S1-IgA单独升高4倍(43)的同时出现N-IgG/A阴转阳且达到阈值4倍以上；出现S1-IgM单独升高4倍的病人(90)观察到N-IgG、S2-IgG强阳性和S2-IgA阴转阳现象，出现S1-IgG单独升高4倍的病人(30)均观察到N-IgG、S2-IgG和N-IgA强阳性，S2-IgA阳性的现象，可能是发病后采样时间过晚导致无法观察其升高4倍的现象，具体如下表所示：
Figure BDA0002850000590000211
另外进一步研究发现阴性转为阳性并升高到阈值4倍以上的样本共有18例，其中仅N/S2ECD-IgG升高到阈值4倍的有5例，仅N/S2ECD-IgA升高到阈值4倍的有3例，共同升高到阈值4倍的有8例。故两者有联合诊断为病人是否处于应急期的效果。我们进一步分析了S1抗原对应的特异性IgA、IgG以及S2-IgM、S1-IgM、N-IgM从阴性转为阳性并升高到阈值4倍以上的现象，结果显示S1-IgA、S1-IgG、S2-IgM、S1-IgM、N-IgM升高4倍分别各5、9、3、2、3例，仅2例患者单独发生S1-IgG从阴性转为阳性并升高到阈值4倍以上升高4倍，其它病例均未单独升高4倍。其中一例(90)观察到N-IgG、S2-IgG强阳性和S2-IgA阴转阳现象，另外一例(53)观察到N-IgG、S2-IgG、S2-IgA强阳性和N-IgA阳性现象。可能是发病后采样时间过晚导致无法观察其阳性并升高到阈值4倍以上的现象。具体数据如下表所示：
Figure BDA0002850000590000221
发现阴转阳(未升高到阈值4倍以上)的样本共27例，其中N/S2ECD-IgG阴转阳的有9例，IgA阴转阳的有9例，IgG和IgA同时阴转阳的有3例，6例仅IgG阴转阳，6例仅IgA阴转阳。综上IgA与IgG有联合诊断的效果持续观察，直到数值升到阈值4倍以上可判断病人正处于急诊期。我们进一步分析了S1抗原对应的特异性IgA、IgG以及S2-IgM、S1-IgM、N-IgM从阴性转为阳性的现象，结果显示S1-IgA、S1-IgG、S2-IgM、S1-IgM、N-IgM升高4倍分别各8、3、9、14、3例。其中共有12例未出现N/S2-IgG/A阴转阳现象，但有9例出现N/S2-IgG/A升高4倍或阴转阳且升高到阈值4倍以上的现象，另外一例(30)均观察到N-IgG、S2-IgG、N-IgA强阳性和S2-IgA阳性的现象，一例(53)观察到N-IgG、S2-IgG、S2-IgA强阳性和N-IgA阳性现象，一例(5)仅观察到N-IgM阴转阳现象，之后111天观察到N-IgG、S2-IgG/A阳性，中间缺少样本采集，前两例可能是发病后采样时间过晚导致无法观察其升高4倍的现象，后一例可能是病人特殊，需延长观察期(两周后也许定时观察取样检测)。
Figure BDA0002850000590000231
进而，由上述数据得到，1-7天内，阈值附近的值很多：第8号病人，S2-IgM第三天出现阈值阳性，第8天转变为阴性，第18天后转为阳性；第15号病人，S2抗原第7天均为阴性，第15天均转化为阳性。8-14天，阈值附近的值很少，建议临床病人第一周每隔1-2天进行采样检测，且阈值2倍左右的值建议进行继续观察。
综上，在发病后第8天采血时，病人血液内可能已经含有较高的抗体阳性，无法有升高四倍或阴转阳的结果出现。再结合前面出现升高四倍和阴转阳的采血时间最早在第二天，最迟在第14天，若临床现象不能排除新冠嫌疑或核酸检测为阳性，可延长观察。故建议发病后首次采样时间在7天(一周)内，如有条件建议每隔1-2天跟踪采血。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述试剂条包括底卡、样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸；
其中，所述量子点标记物结合垫吸附有量子点特异性蛋白复合物，所述量子点特异性蛋白复合物主要由量子点和特异性蛋白偶联得到；
所述特异性蛋白包括新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S2-ECD蛋白或新型冠状病毒S1-RBD蛋白中的一种。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述新型冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如Seq No.01所示:
优选地，所述新型冠状病毒S2-ECD蛋白的氨基酸序列如Seq No.02所示:
优选地，所述新型冠状病毒S1-RBD蛋白的氨基酸序列如Seq No.03所示。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述样品垫、量子点标记物结合垫、层析反应膜和吸水纸设置于底卡上；
其中，所述层析反应膜设置于底卡的中间，所述量子点标记物结合垫和样品垫依次搭接在层析反应膜的一端上，所述吸水纸搭接在层析反应膜的另一端上。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述层析反应膜包括NC膜、PVDF膜或尼龙膜中的一种，优选为硝酸纤维素膜；
优选地，所述底卡为PVC底卡或PC底卡中的一种，优选为PC底卡；
优选地，所述量子点标记物结合垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
优选地，所述样品垫包括玻璃纤维膜、聚酯膜、滤血膜中的一种，优选为玻璃纤维膜；
优选地，所述吸水纸包括滤纸、玻璃纤维或滤血膜中的一种，优选滤纸。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述层析反应膜上设置有检测线和质控线；
所述检测线包括IgA检测线、IgG检测线、IgM检测线中的至少一条，其中，IgA检测线含有抗人IgA；IgG检测线含有抗人IgG；IgM检测线含有抗人IgM；
所述质控线含有羊抗兔IgG抗体；
优选地，所述检测线包括IgA检测线和IgG检测线。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述IgA检测线中抗人IgA的浓度为0.2～1mg/ml；
优选地，所述IgG检测线中抗人IgG的浓度为0.2～1mg/ml；
优选地，所述IgM检测线中抗人IgM的浓度为0.2～1mg/ml；
更优选地，所述抗人IgA包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体中的任意一种；
更优选地，所述抗人IgG包括羊抗人IgG多克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体中的任意一种；
更优选地，所述抗人IgM包括羊抗人IgM多克隆抗体、鼠抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体、兔抗人IgM多克隆抗体中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂条，其特征在于，所述量子点标记物结合垫中量子点特异性蛋白复合物的浓度为0.01～0.1mg/ml。
8.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～7任一项所述的新型冠状病毒检测试剂条。
9.根据权利要求8所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条、特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S1-RBD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条中的至少一个；
优选地，所述试剂盒中包括特异性蛋白为新型冠状病毒N蛋白的新型冠状病毒检测试剂条和特异性蛋白为新型冠状病毒S2-ECD蛋白的新型冠状病毒检测试剂条。
10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒检测试剂盒还包括紫外照射装置。
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